CN117500936A - 用于简单样品提取的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于核酸提取和纯化的组合物和方法。

Description

用于简单样品提取的组合物和方法
本申请要求于2021年5月6日提交的美国临时专利申请序号63/184,857的优先权，该美国临时专利申请通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明部分涉及核酸提取和纯化的新的组合物和方法。
背景技术
大多数的核酸提取系统遵循某些基本的步骤。这些系统必须裂解生物样品和释放核酸，使核酸结合一些类型的表面，去除污染物，并且优选地以更浓缩的形式洗脱核酸。一些系统使用固体基质例如玻璃纤维或过滤器来结合核酸，其他系统使用磁性颗粒。一些不需要高水平的敏感性的系统可能有更简单的过程，但全部都必须有将核酸靶标呈给可以鉴定它的测定的方法。也使用预加载的筒来简化自动化。使用预加载的系统，仪器就不需要精细的泵送机制和移液机制来移动流体。然而，预加载的筒本身是复杂的设备，制造成本高，并且可能仍需要步骤例如机械混合。
发明内容
根据本公开内容的一方面，提供了用于从生物样品中提取和分离核酸的多层组合物，该多层组合物包含：a)反应容器，在该反应容器中组装多层组合物的层；b)反应容器内的最上层，其包括浓缩的半固体裂解糊剂；c)中间层，其包含低温可熔化的蜡；和d)较低的洗涤层，其包含水性凝胶。在一些方面，反应容器包含基本上为环状横截面的管，该管具有顶部和底部。在一些方面，将管的顶部和底部可逆地密封。在某些方面，管为J形或U形。在一些方面，生物样品是液体生物样品。在一些方面，液体生物样品是血清样品、血液样品、血浆样品、唾液样品或其他类型的生物样品。在一些方面，低温可熔化的蜡在室温下是固体。在一些方面，低温可熔化的蜡在高于50-55摄氏度的温度下开始转变为液体。在某些方面，多层组合物进一步包含邻近层，其包含与洗涤层流体连通的洗脱缓冲液。在一些方面，洗脱缓冲液是低离子强度的洗脱缓冲液。在一些方面，低离子强度的洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液。在一些方面，中间层包含多个低温可熔化的蜡层，其中多个低温可熔化的蜡层的每层都通过插入密封层来分隔。在一些方面，分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的插入密封层包含较低温可熔化的蜡，与紧靠其下的层相比，所述较低温可熔化的蜡在更低的温度下熔化。在一些方面，分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的插入密封层包含矿物油。在某些方面，分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的插入密封层包含琼脂糖。在一些方面，将多个低温可熔化的蜡层成层使得，在使用中，多个低温可熔化的蜡层的每层从最上面到最下面顺序地熔化。在一些方面，中间层进一步包含内部对照。在一些方面，浓缩的半固体裂解糊剂包含GITC、Tris-HCl、Tris碱和Tween-20。在一些方面，浓缩的半固体裂解糊剂具有少于10％的残留水分并且不流动。在一些方面，浓缩的半固体裂解糊剂具有少于5％的残留水分。在一些方面，水性凝胶包括琼脂糖或聚丙烯酰胺。在一些方面，要素b)的最上层进一步包含多个金属氧化物包覆的磁性颗粒。在一些方面，多个金属氧化物包覆的颗粒以相对于计算的存在于生物样品中的核酸的量，预计代表摩尔过量的量存在。在一些方面，金属氧化物包覆的颗粒是钛氧化物颗粒。在一些方面，钛氧化物包覆的颗粒是铜钛(CuTi)包覆的颗粒。
根据本公开内容的另一方面，提供用于从生物样品中提取和纯化核酸的方法，该方法包括：a)提供用于从生物样品中提取和分离核酸的多层组合物，该多层组合物包含：i)反应容器，在该反应容器中组装多层组合物的层；ii)反应容器内的最上层，其包含浓缩的半固体裂解糊剂；iii)中间层，其包含低温可熔化的蜡；和iv)较低的洗涤层，其包含水性凝胶；b)将生物样品在最上层上面成层，从而形成溶解的裂解糊剂，其中溶解的裂解糊剂进一步包含多个金属氧化物包覆的磁性颗粒；c)加热反应容器以启动中间层的熔化，这导致密度反转，其特征为中间层熔化并且上升穿过溶解的浓缩的半固体糊剂，从而将生物样品、溶解的浓缩的半固体裂解糊剂以及多个金属氧化物包覆的磁性颗粒进行混合，从而导致生物样品内的核酸与金属氧化物包覆的颗粒的结合；c)在反应容器周围或邻近放置磁体，从而吸引金属氧化物包覆的颗粒和结合的核酸；和d)移动磁体，从而驱动所吸引的金属氧化物包覆的颗粒和结合的核酸至少部分迁移穿过水性凝胶，从而去除提取污染物。在一些方面，低温可熔化的蜡在室温下为固体。在一些方面，低温可熔化的蜡在高于50-55摄氏度的温度下开始转变为液体。在某些方面，多层组合物进一步包含与洗涤层流体连通的洗脱缓冲液，和移动磁体，从而驱动所吸引的金属氧化物包覆的颗粒和结合的核酸迁移穿过水性凝胶以及进入洗脱缓冲液。在一些方面，洗脱缓冲液是低离子强度的洗脱缓冲液，任选地进一步其中低离子强度的洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液。在一些方面，多层组合物的中间层包含多个低温可熔化的蜡层，其中多个低温可熔化的蜡层的每层都通过插入密封层来分隔。在一些方面，分离多个低温可熔化的蜡层的每层的多层组合物的插入密封层包含较低温可熔化的蜡，与紧靠其下的层相比，所述较低温可熔化的蜡在更低的温度下熔化。在其他方面，分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的多层组合物的插入密封层包含矿物油。在一些方面，分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的多层组合物的插入密封层包含琼脂糖。在一些方面，将多个低温可熔化的蜡层成层使得，在使用中，随着反应容器被加热，多个低温可熔化的蜡层的每层从最上面到最下面顺序地熔化。在一些方面，多个金属氧化物包覆的颗粒是钛氧化物颗粒。在一些方面，钛氧化物颗粒是铜钛(CuTi)包覆的颗粒。在某些方面，在提供要素a)的多层组合物之后提供多个金属氧化物包覆的颗粒。
附图说明
图1A-D显示蜡完整性测试的示意图和显微照相图像。图1A-C显示使用25％石蜡/75％Chill-outTM液体蜡的蜡混合物的完整性测试。图1A的左图显示交替的蜡层和琼脂糖层的示意图，如在右图在管中所示。图1B的左图显示琼脂糖层和蜡层的示意图，如在右图在管中所示。图1C的左图显示蜡层和琼脂糖层的示意图，如在右图在管中所示。图1D显示使用微晶蜡和重质矿物油的蜡混合物的完整性测试。左图显示琼脂糖层和蜡层的示意图，如在右图在管中所示。
图2A-B显示本公开内容的实施方案的图示和示意图。图2A显示本公开内容的实施方案的图示。数字标记指示如下：(1)提取管或反应容器；(2)浓缩的半固体裂解糊剂(“裂解糊剂”)；(3)中间层的低温可熔化的蜡层；(4)中间层的插入密封层；(5)琼脂糖凝胶洗涤层；(6)任选的蜡塞和/或任选的盖。随着颗粒被磁性吸引穿过凝胶洗涤层，该层从颗粒中去除污染物和裂解试剂。图2B的示意图说明了本公开内容的实施方案，其中中间层包含低温可熔化的蜡层(25％石蜡/75％矿物油；熔化温度50-55℃)，其通过较低温可熔化的蜡(5％石蜡/95％矿物油；熔化温度45-50℃；“蜡IL”)的插入密封层来分隔。
图3A-E显示制备的提取管的示意图和使用本公开内容的组合物和方法提取的样品中测试的HIV RNA和内部对照的实时PCR(RT-PCR)结果的图像。图3A显示说明本公开内容的实施方案的示意图。将在低温可熔化的蜡层中包含HIV内部对照表示为“o”。图3B-C显示实验中在两个阳性样品中使用的HIV RNA的RT-PCR结果。图3D-E显示实验中使用的全部六个样品中内部对照的RT-PCR结果。
图4A-G显示在使用本公开内容的组合物和方法提取的样品中测试的HIV RNA和内部对照的实时PCR(RT-PCR)结果的图像和绘图。图4A-B显示阳性样品中使用的HIV RNA的RT-PCR结果。图4C-D显示全部实验样品中使用的内部对照的RT-PCR结果。图4E-G显示图4A-D的结果的拟合组分析(fit group analyses)的图像。图4E显示样品的HIV CT的单因素分析。图4F显示样品的IC CT的单因素分析。图4G显示样品的log cp/ml的单因素分析。
图5A-C显示实施例3中说明的本公开内容的实施方案的示意图，以及使用本公开内容的组合物和方法提取的样品中测试的HIV RNA阳性对照和阴性对照和内部对照的实时PCR(RT-PCR)结果的图像和绘图。图5A显示本公开内容的实施方案的示意图，其中中间层包含五个可熔化的蜡层(“五层”)或六个可熔化的蜡层(“六层”)。在五层和六层的实施方案中，各自的中间层都包含低温可熔化的蜡层(15％石蜡/85％矿物油；“15％蜡”)以及插入密封层包含较低温可熔化的蜡(5％石蜡/95％矿物油；“5％石蜡IL”)。图5B-C显示对如实施例3中所述提取的样品进行的HIV RT-PCR反应的结果。图5B显示靶标扩增的结果(阳性对照样品)。图5C显示在全部样品中内部对照扩增的结果。
具体实施方式
本公开内容提供用于从生物样品中提取和分离核酸的新的组合物和方法。本公开内容的方面部分基于包含简单试剂的组合物和方法，该简单试剂可以容易地组装却体现复杂的设计。浓缩的半固体裂解糊剂含有用于裂解和捕获的所有组分并且依赖于用于再水合成为可流动液体的样品添加。较不致密的蜡层熔化时漂浮到致密的裂解物的表面，并且在不需要机械混合的情况下通过反转密度混合的方式混合裂解反应。在整个过程中水性凝胶洗涤层维持它的完整性并且防止裂解物污染洗出液。将磁性捕获的颗粒吸引穿过凝胶，这在不需要额外洗涤的情况下去除裂解污染物，并且可以将该颗粒吸到洗脱缓冲液中。洗脱后，可容易地将洗出液加入测定中。因此，本公开内容的实施方案使用最小数量的操作步骤，并且消除了在提取期间对复杂操作、批量试剂、分配泵和机械混合的需求，从而极大地简化了核酸提取。此外，蜡在冷却后密封提取管并且消除了液体废物的处置。
在一些方面，本公开内容的组合物和方法组合提取和纯化步骤，使得同时或以降低或消除传统洗涤和机械步骤的方式进行该提取和纯化步骤。在一些方面，本公开内容的组合物和方法包含独立的(self-contained)、热激活的单元，其仅需要液体生物样品的添加、加热和颗粒的磁性移动来进行核酸提取。
本公开内容的组合物和方法的方面建立在提取的较早概念上(US 9,803,230,其公开内容通过引用并入本文)，其中在液体裂解缓冲液中捕获核酸之后，随着磁性颗粒被磁性移动穿过凝胶，使用水性凝胶以从磁性颗粒中去除裂解缓冲液污染物。穿过凝胶的移动“洗涤”了颗粒并且从颗粒中去除了高水平的含GITC的缓冲液。将颗粒转移至缓冲液，这随后使核酸从颗粒中释放。然而，所述系统需要在提取之前立即单独添加裂解缓冲液、样品、金属氧化物包覆的磁性颗粒和洗脱缓冲液。此外，不能预加载所述方法，因为裂解缓冲液的高盐水平将扩散进入凝胶中，这使得凝胶洗涤无效。相反，本公开内容的方面使用浓缩的半固体裂解糊剂、金属氧化物包覆的磁性颗粒和低离子强度的洗脱缓冲液，并且最显著地，通过单一管内可熔化的蜡层的方式来对提取组分划区。蜡层不仅将裂解糊剂与水性层分隔，还在裂解孵育期间蜡层熔化时混合裂解反应。在本公开内容的实施方案中，金属氧化物包覆的磁性颗粒是钛氧化物颗粒。在一些实施方案中，钛氧化物颗粒是铜钛(CuTi)包覆的颗粒(US10,392,613，其公开内容通过引用并入本文)。
在一些方面，本公开内容的组合物和方法比起常规的二氧化硅提取方法具有几个优点。本领域技术人员将认识到，一个优点是操作的简单性，在一些实施方案中，该操作包括添加样品至预加载的提取管，加热管，在提取管的侧面上收集磁性颗粒，并且将它们移动进入洗脱缓冲液室内。在一些实施方案中，试剂的移取不是必需的。在提取期间不需要机械混合裂解物。提取管也易于制造，其仅需要分配凝胶、蜡层和裂解糊剂进入提取管中而不是精细的商品制造。在一些实施方案中，使用最少的试剂和塑料制品，并且极大地减少塑料和液体废物。本领域技术人员将认识到，步骤的减少还加速了提取过程。这些优点极大地减少了自动化所需的仪器。本公开内容的组合物和方法代表对现有核酸提取方法的实质性改进，并且可能对样品的现场即时检测和高通量处理很重要，对包括但不限于血液建库和移植等目的很重要。
在各方面，本公开内容涉及用于从生物样品中提取和分离核酸的多层组合物。如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者、从细胞、组织或其他生物来源获得的样品。生物样品可以是天然存在的，可以是细胞或组织或其片段在缓冲液中的浓缩物或悬浮液，可以是细胞或组织的产物，或可以是合成的核酸。生物样品的非限制性实例包括血液、骨髓、组织、手术样本、活检样本、液体活检样本、组织外植体、器官培养物或任何其他组织或细胞制备物、或其部分或其衍生物或从中分离的等。在本公开内容的方面，生物样品包含或被制备为包含残留水分。例如，尽管不旨在限制，具有0.2ml的液体的样品将在55℃下溶解1g的裂解糊剂而具有0.3ml的液体的样品将在室温下溶解1g的裂解糊剂。
在本公开内容的方面，生物样品是液体生物样品。液体生物样品的非限制性实例包括全血、血清、血浆、淋巴、玻璃体液、房水、粘液、脑脊液、唾液、尿液、乳、腹水、滑液、腹膜液、羊水、发酵液、细胞培养产物、核酸合成产物或其他生物流体等。在本公开内容的实施方案中，可以从任何生物样品获得核酸，所述生物样品包括例如原代细胞、细胞系、新鲜分离的细胞或组织、冷冻的细胞或组织、石蜡包被的细胞或组织、固定的细胞或组织和/或激光解剖的细胞或组织。在一些实施方案中，从中分离核酸用于本发明的方法的样品是对照样品。根据本领域已知的方法可以从受试者、细胞或其他来源中分离核酸。本领域技术人员将会理解如何使用本领域已知的方法来获得和制备生物样品和液体生物样品，该方法包括但不限于由血液制备血浆、从生物流体中分离细胞、均质化组织、破碎细胞或病毒颗粒、由固体材料制备液体、稀释粘性流体、过滤液体、蒸馏液体、浓缩液体、使干扰组分失活、添加试剂、纯化核酸等等。
如本文所用，术语“受试者”可以指人或非人动物，包括哺乳动物和非哺乳动物，脊椎动物和无脊椎动物，并且也可能是指任何多细胞生物或单细胞生物例如真核生物(包括植物和藻类)或原核生物、古生菌(archaeon)、微生物(例如细菌、古细菌(archaea)、真菌、原生生物、病毒)和水生浮游生物。受试者可被视为正常受试者或可以是已知患有或疑似患有病症、疾病或病况的受试者。疾病或病况的非限制性实例包括传染病，例如人体免疫缺陷病毒(HIV)和甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒；单基因遗传病症，例如镰状细胞性贫血、血友病、囊性纤维化、泰萨病、亨廷顿舞蹈症和脆性X综合征；染色体病症，例如唐氏综合征和特纳综合征；多基因遗传病症例如阿尔茨海默病、心脏病、糖尿病等；结构性病症例如缺失、插入和重复扩增；和癌症。
细胞、组织或其他来源或样品可以包括单细胞、多种细胞或细胞器。将要理解的是，细胞样品包含多个细胞。如本文所用，术语“多个”意为多于一个。在一些例子中，多个细胞是至少1、10、100、1,000、10,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000个或更多个细胞。从中分离核酸用于本公开内容的组合物和方法的多个细胞可以是细胞群。多个细胞可以包括属于相同细胞类型的细胞。在一些实施方案中，从中分离核酸用于本公开内容的方法的细胞是健康的正常细胞，已知该细胞不具有疾病、病症或异常病况。在一些实施方案中，从中分离核酸用于本公开内容的方法的多个细胞包括患有已知的或疑似的疾病或病况或其他异常的细胞，例如，从诊断为患有病症、疾病或病况的受试者中获得的细胞，其包括但不限于感染病毒的细胞、退行性细胞、患有神经疾病的细胞、疾病或病况的细胞模型、损伤的细胞等。在一些实施方案中，细胞是从已知包含病症、疾病或病况的细胞培养物、细胞系中获得的异常细胞，该病症、疾病或病况包括本文别处所述的病症、疾病或病况的非限制性实例。在本发明的一些实施方案中，多个细胞是混合的细胞群，意为不是所有细胞都属于相同的细胞类型。在一些实施方案中，从中分离核酸用于本发明的方法的细胞是对照细胞。
通过在容器(container)或反应容器(reaction vessel)(本文别处也称为“实验管”)中各层的顺序组装来形成本主题公开内容的多层组合物。只要材料决不干扰所公开的用于从生物样品中提取和分离核酸的方法的各方面，制成反应容器的材料不是很关键。例如，如下文将要讨论的，将磁场用于吸引磁性颗粒的目的。由于磁场的重要性，应当避免磁性金属的使用。该需要不是排除全部金属，因为例如奥氏体不锈钢结构不会是磁性的。具有铁素体或马氏体结构的不锈钢会是磁性的并且应当被避免。优选玻璃和聚合物制剂(例如聚苯乙烯和聚乙烯)用于反应容器的形成。
反应容器可以包含基本上为环状横截面的管，其具有顶部和底部。优选基本上为环状横截面(但不要求)，这是基于化学和生命科学行业中在使用和消费的材料中该横截面的典型储备可获得性和流行。可以使用的管的非限制性实例包括但不限于5ml试管、5ml移液器吸头、1ml移液器吸头或定制设计用于仪器中的反应容器。在本公开内容的一些实施方案中，将管的顶部和底部可逆地密封。在一些实施方案中，仅将管的顶部或底部可逆地密封。可以用来密封管的顶部和底部的材料的非限制性实例包括可熔化的疏水蜡、可熔化的可聚合材料或可移除的塑料尖端。在一些实施方案中，可以将管的顶部和/或底部通过可刺穿的密封来可逆地密封。本领域技术人员将理解如何选择适用于特定工作条件组的密封类型。
在一些实施方案中，本公开内容的多层组合物可以在反应容器中手动成层。在其他实施方案中，可以制造与自动化分子诊断分析仪器一起一次性使用的反应容器。反应容器的尺寸可以根据体积、长度和配置(取决于如何进行提取，例如，但不限于，以手动台式形式，与自动化分析仪器一起，或其组合)和初始样品体积而变化。作为非限制性实例，用于手动台式使用的反应容器可以具有至少1ml、2ml、5ml、10ml或更多的总体体积。与自动化分析仪器一起使用的反应容器可以具有较小的体积和/或长度，例如但不限于至少0.25ml、0.5ml、1ml或更多。在某些实施方案中，管可以是垂直定向的，使得顶部和底部的开口直接对齐。在一些实施方案中，可以将管的部分配置为包含弯曲部，以最大化自动化分析仪器中的效率。在一些实施方案中，配置管使得管的整体形状像“J”或“U”。将结合方法更详细讨论所述对直的、垂直定向的反应容器的替代，在该方法中将金属氧化物包覆的磁性颗粒和结合的核酸吸引穿过在反应容器的非垂直定向部分内的凝胶洗涤层。
尽管可以以台式形式手动地实践所公开的组合物和方法，但在实例中，将选择专门与自动化分析仪器一起使用的反应容器。例如，Abbott Alinity m(Abbott，AbbottPark，IL)是完全集成的和自动化的分子诊断分析仪器，其具有例如聚合酶链式反应测定的应用。
为讨论的目的，考虑本公开内容的多层组合物，其中反应容器是具有约20mm的内径的聚乙烯移液管。为本公开内容的目的，反应容器将为垂直定向的，其具有顶部和底部开口。多层组合物的形成将包括从顶部向反应容器内倒入层。因此，将底部可逆地密封。
在所讨论的管状实例中，最底层(即要倒入的第一层)是包含水性凝胶的洗涤层。在一些实施方案中，水性凝胶包含琼脂糖或聚丙烯酰胺。水性凝胶可以包含至少0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.75％、0.8％、0.9％、1％或1.5％(w/v)琼脂糖或至少0.5％、1％、5％或15％(w/v)聚丙烯酰胺。本领域技术人员将理解，在提取过程期间水性凝胶必须有足够支撑样品层、裂解层和蜡层但仍允许将颗粒吸引穿过凝胶的浓度。可以使用水性缓冲液来制备水性凝胶，该水性缓冲液与要在用本公开内容的组合物和方法分离的核酸上进行的下游核酸分析兼容。作为非限制性实例，如果将使用Alinity m仪器分析所分离的核酸，则可以使用System Diluent(Abbott,AbbottPark,IL)或其他低盐不含磷酸盐的缓冲系统来制备水性凝胶。本公开内容的多层组合物中构成洗涤层的比例(根据反应容器内的体积或反应容器内的线性深度)可以基于反应容器的体积和/或深度而变化。洗涤层可以占反应容器的体积和/或深度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。本领域技术人员仅使用常规实验，可以容易地确定所需的凝胶深度，当将颗粒从上面的提取混合物中吸引进入洗涤层时，所述凝胶深度提供足够的磁性颗粒的“洗涤”，该磁性颗粒包含所提取的来自样品的结合核酸。
一旦凝胶洗涤层已经凝固，将包含低温可熔化的蜡的中间层倒到凝胶洗涤层的顶部并且允许其凝固。低温可熔化的蜡层在浓缩的半固体裂解糊剂和凝胶洗涤层之间形成密封，从而防止来自水性凝胶的水分接触裂解糊剂并且将裂解反应与水性组分隔开，使得裂解反应使用仅来源于生物样品的水分进行。在实例中，低温可熔化的蜡层可以是单一均质的低温可熔化的蜡层。
蜡是通常特征为存在脂肪族烷基链的烃。天然的蜡包括植物蜡和动物蜡和衍生物。合成蜡包括石油衍生的蜡(例如石蜡和微晶蜡)。
在实施方案中，低温可熔化的蜡层包含石蜡层或其衍生物。石蜡典型地具有在50至70摄氏度范围内的熔点。石蜡的熔点可以通过添加例如矿物油来降低。如本文所用，低温可熔化的蜡是指在商业运输温度(例如，4-45摄氏度)下是固体但在石蜡熔点范围的下端(例如，50至55摄氏度)转变为液体的蜡。尽管本领域技术人员可以调节中间层的熔化温度以在高于优选的50至55摄氏度的范围下熔化，但在能量输入方面，这将逐渐增加测定的成本。另外，从生物样品及其组分的完整性的角度来说，所述温度的增加不是优选的。尽管有这些缺点，但只要中间层如本文所述熔化并且参与密度反转，具有包含在高于55摄氏度下熔化的可熔化蜡层的中间层的多层组合物就落在本公开内容的范围内。
通常用于珠宝定制的微晶蜡也可应用于本公开内容。与石蜡相比，微晶蜡含有更高百分比的异链烷烃的(支链的)烃和环烷烃(napthenic hydrocarbon)。与石蜡相比，微晶蜡一般颜色更深、更粘、更致密、更黏和更有弹性。微晶蜡的熔点可以通过例如矿物油的添加来降低。
作为单一均质的低温可熔化蜡层的替代，中间层可以包含多个低温可熔化的蜡层，其中多个低温可熔化的蜡层的每层都通过起一种或多种功能的插入密封层来分隔。在施加足以熔化低温可熔化的蜡层的热量之后，一个或多个插入密封层有助于多个低温可熔化的蜡层的分阶段释放。多个低温可熔化的蜡层的分阶段释放的一个优点是促进了裂解反应的额外的混合。另外，一个或多个插入密封层可以提供增强的疏水密封，从而进一步将裂解糊剂与存在于洗涤层中的液体隔绝。
如下文将要更详细讨论的，在用生物样品进行裂解糊剂的初始水合之后，向反应容器外部施加热量以熔化低温可熔化的蜡层和插入密封层(在其中插入密封层是固体或半固体，例如较低温可熔化的蜡的实施方案中)。经由加热元件可以向整个反应容器同时施加热量或可以仅向反应容器的部分施加热量。在一些实施方案中，设计加热元件以与仪器相适应，该仪器包括但不限于自动化分析仪器。在一些实施方案中，可以将加热元件永久固定在仪器内，或可以是可移除的。在一些实施方案中，加热元件是配置有孔以接收一个或多个反应容器的加热块，尽管考虑到其他的加热元件配置例如线圈或空气。在一些实施方案中，孔延伸了加热块的整体深度，使得反应容器突出穿过加热块的底部。在一些实施方案中，可以手动操作加热块并且可以用热板或实验室烘箱来加热加热块。可以由任何保留和转移热量的材料制造加热块，该材料包括但不限于金属(例如铝)。
在单一低温可熔化的蜡层的情况下，熔化倾向于在反应容器的内表面发生，并且一旦已发生足够的熔化，则释放剩余的低温可熔化的蜡塞，并且通过密度反转，释放的塞上升穿过更高密度的溶解的浓缩半固体裂解糊剂，从而混合裂解反应，其包含液体生物样品、溶解的浓缩的半固体裂解糊剂和多个金属氧化物包覆的磁性颗粒。在相关测定的进行中该混合能够消除对机械搅动的需求。混合的裂解反应下沉到熔化的蜡下面并且停留在凝胶洗涤层的顶部，与凝胶洗涤层流体连通。
在其中中间层包含多个低温可熔化的蜡层的实例中，原理相同，但由多个低温可熔化的蜡层的每层的熔化和释放导致的多个塞的每个的释放在顺序上是分阶段的，以有利于多轮混合并且提供在储存期间裂解糊剂与水性凝胶的增强的隔绝。在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，多个低温可熔化的蜡层的每层通过插入密封层来分隔。如本文别处所述，插入密封层通过物理上分隔低温可熔化的蜡层，有助于低温可熔化的蜡层的分阶段的顺序熔化。这种物理的分隔倾向于隔绝中间层内邻近的低温可熔化的蜡层。因此，当从顶部向反应容器施加热量时，最顶上的低温可熔化的蜡层将首先释放并且混合裂解反应，其包含如所述的生物样品、溶解的浓缩的半固体裂解糊剂和多个金属氧化物包覆的磁性颗粒。混合的裂解反应下沉到熔化的蜡下面以停留在凝胶洗涤层的顶部，与凝胶洗涤层流体连通。插入密封层倾向于隔绝邻接的最低的低温可熔化的蜡层，使得它不会与最顶上的低温可熔化的蜡层同时释放。本领域技术人员将理解的是，仅使用常规实验，调节每个低温可熔化的蜡层和/或每个插入密封层的体积和/或厚度可以用于控制速度，熔化以及因此密度反转驱动的裂解反应的混合以该速度发生。
尽管层的顺序熔化(如前面段落中所述)提供了某些优点，但本领域技术人员将认识到，如果沿着一个或多个反应容器均匀地施加热量，则多个低温可熔化的蜡层和插入密封层的每层将倾向于几乎同时熔化和释放(即，反转)。将认识到的是，多层的同时释放和反转将提供有效的混合。实施例3涉及这种实施方案。
对可以使用的低温可熔化的蜡层和对应的插入密封层的数量没有理论的限制。仅使用常规实验，本领域技术人员将理解，低温可熔化的蜡层和对应的插入密封层的数量可受限于物理因素，该物理因素包括但不限于反应容器的体积和/或深度、凝胶洗涤层的体积和/或深度、预计要施用的生物样品的体积和裂解反应所需的整体时间长度。在优选的实施方案中，多个低温可熔化的蜡层中至少一个与凝胶洗涤层接触并且多个低温可熔化的蜡层中至少一个与裂解糊剂层接触。在另一实施方案中，多个插入密封层中至少一个与凝胶洗涤层接触并且多个低温可熔化的蜡层中至少一个与裂解糊剂层接触。在另一实施方案中，多个插入密封层中至少一个与凝胶洗涤层接触并且多个插入密封层中至少一个与裂解糊剂层接触。在一些实施方案中，琼脂糖凝胶可以用作插入密封层，尽管这种材料将不会倾向于使从凝胶洗涤层到裂解糊剂层的水分迁移最小化，如本文别处所述。尽管配制为在55℃范围内熔化的低温可熔化的石蜡层显示了从反应容器的侧壁的最小收缩(如以下实施例部分所表明)，但甚至最小收缩都可允许来自水性凝胶层的水分通过反应容器的侧壁与收缩的低温可熔化的蜡层之间。该水分转移是不期望的，因为在施用生物样品之前，与半固体裂解糊剂层的任何水分接触都可部分地溶解裂解糊剂层。部分溶解的裂解糊剂可潜在地干扰多层组合物待用于从样品中可靠地提取核酸的能力，潜在地模糊从生物样品中获得的实验结果或临床结果。因此，使用疏水材料作为插入密封层也可以通过将裂解糊剂与洗涤层中存在的液体进一步隔绝来为水分迁移问题提供解决方案。在优选的实施方案中，所述插入疏水密封层特别选择为蜡，其在低于多个低温可熔化的蜡层的熔化温度但高于标准的商品运输温度的温度下熔化。在一些实施方案中，多个低温可熔化的蜡层包含两个通过在较低的温度下熔化的插入疏水密封层所分隔的低温可熔化的蜡层。在一些实施方案中，多个低温可熔化的蜡层包含三个低温可熔化的蜡层，其通过两个在较低的温度下熔化的插入疏水密封层所分隔(如图2A所说明的)。在一些实施方案中，多个低温可熔化的蜡层包含四个低温可熔化的蜡层，其通过三个在较低的温度下熔化的插入疏水密封层所分隔。例如，但不旨在限制，在一个实施方案中(如图2B所说明的)，中间层包含三个低温可熔化的蜡层，其每个都在55℃下熔化(0.3ml，25％石蜡/75％矿物油)，和两个插入较低温可熔化的蜡层，其每个都在45-50℃下熔化(0.3ml，5％石蜡/95％矿物油)。在一些实施方案中，多个低温可熔化的蜡层包含三个低温可熔化的蜡层，其通过两个在较低的温度下熔化的插入疏水密封层所分隔，并且通过在较低温度下熔化的插入疏水密封层进一步将其与凝胶洗涤层分隔。在实施方案的其他非限制性实例中(如图5A所说明的)，中间层包含三个低温可熔化的蜡层，其每个都在55℃下熔化(0.3ml或0.4ml，15％石蜡/85％矿物油)，以及两个插入较低温可熔化的蜡层，其每个都在45-50℃下熔化(0.3ml，5％石蜡/95％矿物油)；或者，中间层包含三个低温可熔化的蜡层，其每个都在55℃下熔化(0.3ml或0.4ml，15％石蜡/85％矿物油)，以及三个插入较低温可熔化的蜡层，其每个都在45-50℃下熔化(0.3ml，5％石蜡/95％矿物油)。
本领域技术人员将认识到，可以配制多种蜡共混物以起到插入疏水密封层的功能，与相邻的低温可熔化的蜡层相比，其在较低的温度下熔化。例如，Chill-outTM液体蜡在冷却至低于10摄氏度时凝固，并且如本文别处所述，可以用于稀释石蜡以产生具有低于未稀释石蜡的熔化温度的熔化温度的石蜡共混物。如本文别处所述，可以用降低石蜡的熔化温度的矿物油(也称为石蜡油)来稀释石蜡或微晶蜡。仅使用常规实验，本领域技术人员将能配制用于在规定温度下熔化的插入疏水密封层的蜡共混物。两种前述替代都倾向于使从洗涤层到裂解糊剂层的水分迁移最小化。备选地，在优选的实施方案中，矿物油层可以起插入疏水密封层的作用。
另外，本领域技术人员将理解，选择材料或插入密封层的材料，特别是插入疏水密封层的材料可以至少部分地受到预期的反应容器的一个或多个特性的影响。预期的反应容器的非限制性特性包括尺寸、形状、化学组成(例如玻璃或聚合物组成)和热传导性。仅使用常规实验，本领域技术人员将能够确定针对预期的反应容器形成密封的疏水材料，该密封在所需的条件组下足以防止水分的迁移。
本公开内容的组合物和方法的实施方案中使用的密封材料有几个重要的特性。优选地密封材料提供基本上不可渗透的密封，如本文所用，这意味着当与苛性物质(非限制的实例包括酸和碱)接触或在低于所需熔化温度的温度下，包括在低于室温的温度下，甚至例如在4℃下时，密封材料优选地不破裂或收缩。如果为固体或半固体，密封材料优选地也具有可预测的熔化温度，其与裂解反应的温度范围兼容，例如，该密封材料至少在50-55℃或更高的温度下开始熔化。另外，熔化的密封材料必须具有低于半固体裂解糊剂的密度，这允许熔化的密封材料上升并且促进裂解反应的混合，并允许裂解物下沉。此外，密封材料可不结合或以其他方式干扰裂解反应的组分或来自液体生物样品的核酸。本领域技术人员将能够确定满足这些条件的聚合物或其它类型的材料。
本公开内容的多层组合物的最上层包含浓缩的半固体裂解糊剂(本文也称为“裂解糊剂”)。在公开的实施方案中，裂解糊剂包含硫氰酸胍(GITC)、Tris-HCl、Tris碱和-20。本领域技术人员将认识到在裂解糊剂中可使用其他还原剂和变性剂来补充或代替GITC。可从ThermoFisher Scientific商购获得所述替代的还原剂和变性剂。也可以使用对液体洗涤剂-20的替代。本领域技术人员将认识到，SDS和Triton X-100是替代液体洗涤剂的示例。同样地，可以采用替代的缓冲系统来代替Tris-HCl、Tris碱。本领域技术人员将认识到，关于缓冲液的选择，所覆盖的pH范围不是唯一的考虑。
本公开内容的浓缩的半固体裂解糊剂与先前描述的裂解缓冲液(US 6,936,414B2，其公开内容通过引用并入本文)相比有多个显著的差异。所有常规的裂解缓冲液都是水性液体，这意味着它们的组分已经溶解于水中。作为水性液体，因此通过移液器、泵或其他流体管理系统来分配常规裂解缓冲液。然而，本公开内容的浓缩的半固体裂解糊剂不是基于水的。与常规裂解缓冲液相反，浓缩的半固体裂解糊剂使用与液体洗涤剂混合的粉末状固体化学组分，其产生为具有非常小的气泡的致密泡沫和/或稠浆的混合物。因此，浓缩的半固体裂解糊剂是稳定的，不流动，不从反应容器中泄露，并且可以使用熟知的和用于半固体材料(例如粘土、聚合物和食品)的常见糊剂挤出方法进行分配。糊剂挤出方法的非限制性实例包括饼干挤压器和大口径注射器。
在公开内容的方面，提供GITC、Tris-HCl和Tris碱作为固体组分并且在与洗涤剂混合之前将其精细地粉末化和筛分。在一些实施方案中，洗涤剂是-20(聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯)。在一些实施方案中，可以将20以至少10％、至少15％、至少16％或至少20％(w/w)的水平用于与固体组分一起混合。在一些实施方案中，将-20以16％加入至固体组分中。在一些实施方案中，计算GITC、Tris-HCl、Tris碱和-20的混合物以在按1:1w/v与样品混合时得到3.8M GITC、100mM Tris(pH 7.8)和8％(w/w)-20。在一些实施方案中，浓缩的半固体裂解糊剂具有少于10％的残留水分并且不流动。在某些实施方案中，浓缩的半固体裂解糊剂不流动，并且具有约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的残留水分。在一些实施方案中，裂解糊剂在加热时不分离并且在室温下稳定达至少一年。
在本公开内容的方面，裂解糊剂包含多个磁性颗粒，其包含在从生物样品中提取和纯化核酸期间结合核酸的金属氧化物。金属氧化物通过将核酸磷酸基团结合至金属氧化物来结合核酸。
美国专利号6,936,414(“414专利”)(其公开内容通过引用并入本文)，公开了核酸与金属氧化物载体材料的可逆结合。公开的载体材料包括“颗粒”。相对于常规样品制备方法，使用金属氧化物载体颗粒，如‘414专利中所教导的，提供了几个重要优点。例如，金属氧化物对核酸序列具有高亲和力并且因此使样品对样品的污染最小化，因为能够将核酸可控地结合到金属氧化物颗粒而不会逃到不期望的区域。另外，金属氧化物载体提供了在测试样品中核酸的更定量的纯化，并且因此甚至收集到测试样品中可能存在的少量所需核酸。此外，可以采用金属氧化物颗粒以从具有低有机溶剂浓度(或者，显著地，不使用有机溶剂)的测试样品中分离核酸，该有机溶剂例如醇、苯酚或氯仿，其根据其他样品制备方法常用但造成显著的处置顾虑。此外，可使用与扩增反应完全兼容的缓冲液从金属氧化物颗粒上洗脱核酸。换言之，以本文所提供的方式从测试样品中分离的核酸可直接用于扩增反应，而不需要用与扩增反应兼容的缓冲液来更换洗脱缓冲液。
另外，所公开的金属氧化物颗粒可用于从单一测试样品中分离DNA和各种形式的RNA两者。因此，利用金属氧化物颗粒的方法可用于从同一测试样品中的各种不同的细胞和/或生物体中分离核酸，使得随后可检测该核酸。
一般来说，本公开内容描述了将测试样品(即，生物样品)与提取缓冲液中的多个金属氧化物颗粒接触。在存在提取缓冲液的情况下，测试样品中含有的全部类型的核酸(例如DNA和各种形式的RNA)都结合金属氧化物颗粒。然后可从测试样品中分离金属氧化物颗粒和任何与其结合的核酸。
如本文所用，术语“金属氧化物”是指处于它们各种价态中的任何一种的金属元素的氧化物和氢氧化物。因此，例如，铝、镁、钛、锆、铁、硅、镍、铬、锌的氧化物以及前述的组合是金属氧化物。在一些实施方案中，金属或金属氧化物为AlTi、CaTi、CoTi、Fe2Ti、Fe3Ti、MgTi、MnTi、NiTi、SnTi、ZnTi、Fe2O3、Fe3O4、Mg、Mn、Sn、Ti或Zn(例如酸酐形式或水合形式)，如别处所述(US 10,526,596，其公开内容通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，磁性颗粒是铜钛氧化物包覆的(CuTi)磁性颗粒，如别处所述(US10,392,613，其公开内容通过引用并入本文)。本公开内容不限于特定量的铜和钛。在一些实施方案中，CuTi以约2:1Cu与Ti的比率而存在(例如，3:1、2:1、1:1、1:2、1:3等)。在一些实施方案中，颗粒具有0.5至50μm(例如，0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、5.0μm、10.0μm、20.0μm、30.0μm、40.0μm、50.0μm等)的直径。在一些实施方案中，颗粒和/或固体表面包含有机聚合物，该有机聚合物例如聚苯乙烯及其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物或聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物。在一些实施方案中，颗粒是多糖，特别是水凝胶例如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、Sephadex、Sephacryl、壳聚糖，无机材料例如玻璃或其他金属氧化物和类金属氧化物(特别是式MeO的氧化物，其中Me选自例如Al、Ti、Zr、Si、B，特别是Al2O3、TiO2、二氧化硅和氧化硼)或金属表面，例如金。在一些实施方案中，颗粒是磁性的(例如，顺磁性、亚铁磁性、铁磁性或超顺磁性)。在一些实施方案中，颗粒可以具有平面、针状、立方体、管状、纤维状、柱状或无定形的形状，尽管特别地考虑到其他几何形状。在一些实施方案中，可商购获得的颗粒(例如，从ISK Magnetics，Valparaiso，IN；Qiagen，Venlo，The Netherlands；Promega Corporation，Madison，WI；LifeTechnologies，Carlsbad，CA；Ademtech，New York，NY；和Sperotech，Lake Forest，IL获得的)。
在本公开内容的方面，结合核酸包括将裂解糊剂内被裂解的生物样品与多个金属氧化物包覆的磁性颗粒接触的步骤。在一些实施方案中，将多个金属氧化物包覆的磁性颗粒加入至具有最少的流体的半固体裂解糊剂中。在本公开内容的组合物和方法的方面，相对于生物样品成层，将多个金属氧化物颗粒加入裂解糊剂中的顺序可取决于多种因素，其包括但不限于要裂解的样品的组成，和要进行的实验是否将在台面或者在自动化分析仪器中进行。在一些实施方案中，在制备糊剂时，在将糊剂加入至反应容器作为最上层之前，将多个金属氧化物颗粒加入裂解糊剂中。在一些实施方案中，在已经将糊剂加入反应容器中之后但在生物样品在糊剂上面的成层之前，或者在生物样品在糊剂上面的成层之后，将金属氧化物颗粒单独地加入裂解糊剂中。在一些实施方案中，在生物样品在裂解糊剂上面成层之前，将多个金属氧化物颗粒加入生物样品中。在优选的自动化实施方案中，多个金属氧化物颗粒批量装载在自动化分析仪器上并且被自动地添加。
在一些实施方案中，多个金属氧化物颗粒以相对于计算的存在于生物样品中的核酸的量，经计算而代表摩尔过量的量存在。在一些实施方案中，可以将多个金属氧化物颗粒加入具有最少流体的裂解糊剂中以得到1mg颗粒每0.5g裂解糊剂。在一些实施方案中，将金属氧化物颗粒以15％颗粒的悬浮液来添加。在一些实施方案中，多个金属氧化物颗粒是钛氧化物颗粒，以及在一些实施方案中，钛氧化物颗粒是铜钛(CuTi)包覆的颗粒。
当将生物样品加入裂解糊剂中时，随着样品中的水分溶解糊剂，裂解反应开始，在糊剂内释放小气泡，该小气泡的移动开始混合糊剂、样品和磁性颗粒。如本文别处所述，生物样品可以是天然存在的液体生物样品，其非限制性实例包括血液、血浆和唾液，或者可以是另外制备以便使用的生物样品，使得它包含水分，其非限制性实例包括细胞悬浮液或在缓冲液中均质化的组织和细胞培养物的上清液。如本文别处所述，较低密度的可熔化的蜡层随着它们熔化的上升进一步有助于混合糊剂、样品和磁性颗粒，从而消除对机械搅动的需求。随着样品裂解的进行，洗涤剂破坏细胞膜，这释放出核酸进入反应中，其中在存在离液试剂GITC的情况下它们被金属氧化物磁性颗粒接触和结合。离液试剂是本领域熟知的并且包括降解或溶解蛋白质的实体。示例性离液试剂包括但不限于异硫氰酸胍(GITC)、盐酸胍、碘化钾、尿素等等。一旦中间层的所有层都已经熔化并上升穿过裂解糊剂并在其上方，裂解反应将会下沉穿过反应容器使得它随后停留在洗涤层上面并与之接触。在一些实施方案中，将向反应容器施加热量达至少额外的1、2、3、4、5、10或15分钟以确保裂解反应进行至完成。一旦裂解反应完成，如本文别处所述施加磁力以将金属氧化物磁性颗粒与结合的核酸吸引穿过洗涤层的水性凝胶，以从裂解反应中去除污染物。
如本文所用的术语“核酸(nucleic acid)”或“核酸(nucleic acids)”是指包含多个核苷酸单体的聚合物。如本文所用的术语“核苷酸”包括核苷(核酸(DNA或RNA)的基本结构单元)的磷酸酯。核酸可以是单链的，或双链的，其中每条链都有5’端和3’端。核酸可以是RNA、DNA(包括但不限于cDNA或基因组DNA)或杂合聚合物(例如，DNA/RNA)。术语“核酸(nucleic acid)”和“核酸(nucleic acids)”不是指任何特定长度的聚合物。本公开内容的组合物和方法的实施方案中使用的核酸的长度可以为至少1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000或2000kb或更长。本文关于核酸使用的术语“序列”是指通过共价键例如磷酸二酯键连接的一系列连续核苷酸。核酸可以是化学合成的或生物化学合成的，或者可以是从包含或被认为包含核酸序列，包括但不限于RNA、mRNA和DNA的受试者、细胞、组织或其他生物样品或来源分离的。使用本公开内容的组合物富集、分离或纯化的核酸可以用于本领域普通技术人员已知的任何常规分子测定或方法中，因为核酸不会以任何可能对它们的后续使用有害的方式被改变。例如，可以通过PCR将核酸测序、扩增、可以将核酸用于表达载体中等。在这方面，可以将核酸在通过洗涤层之后与酶例如DNA聚合酶或反转录酶接触。此外，本公开内容考虑在不稀释的情况下在固体基质上对核酸测序。此外，本公开内容考虑将结合固体基质的核酸在通过洗涤层之后与亚硫酸氢盐接触，使得未甲基化的胞嘧啶脱氨基。此外，本公开内容考虑核酸中至少一个核碱基具有表观遗传修饰。
在一些实施方案中，中间层包含内部对照。内部对照是已知的核酸序列，已经用其对后续测定，例如反转录PCR(RT-PCR)、实时RT-PCR(rRT PCR)或定量RT-PCR(qRT-PCR)的表现进行了测试和确认。本领域技术人员将知道如何基于要使用的样品类型、要进行的一种或多种测定、要测定的一种或多种核酸类型和要测定的核酸序列来选择适当的内部对照。
用于结合和分离核酸的常规二氧化硅制备组合物和方法依赖于将核酸盐析到二氧化硅表面上，并且需要用高水平的乙醇或其他醇类洗涤来去除裂解缓冲液污染物。由于在基于PCR的测试中醇类的抑制性质，还必须在洗脱前通过干燥去除那些醇类。与常规的二氧化硅组合物和方法相反，金属氧化物包覆的磁性颗粒(包括CuTi颗粒)在非常低的离子强度条件下保留核酸，其允许用水洗涤它们以去除污染物而不洗脱结合的核酸。此外，金属氧化物颗粒(包括CuTi颗粒)在洗脱之前不需要醇用于样品处理洗涤和不需要任何干燥步骤。因此，这些特性允许通过将金属氧化物颗粒(包括CuTi颗粒)经磁性吸引穿过低离子强度的水性凝胶来洗涤以去除裂解污染物，如别处所述(US 9,803,230，其公开内容通过引用并入本文)。常规二氧化硅方法使用水或低离子强度的缓冲液来洗脱核酸，并且因此不能使用低离子强度的水性凝胶来去除污染物。金属氧化物颗粒(包括CuTi颗粒)使用低离子强度的磷酸盐缓冲液(例如，5mM磷酸盐缓冲液)来洗脱核酸；所述缓冲液对可以使用所洗脱的核酸的后续反应，包括但不限于PCR，不是抑制性的。
根据本公开内容的“洗脱缓冲液”可以是任何试剂或试剂组，其将结合的核酸与CuTi颗粒或其他金属氧化物磁性颗粒的金属氧化物分离。在一些方面，本公开内容的组合物和方法包含作为与凝胶洗涤层邻近并且流体连通的层的洗脱缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液是使用磷酸盐反离子来洗脱核酸的低离子强度的洗脱缓冲液。在一些实施方案中，低离子强度的洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如5mM磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，低离子强度洗脱缓冲液包含有机磷酸盐例如磷酸丝氨酸。在优选的实施方案中，低离子强度洗脱缓冲液是无机磷酸盐。
在本公开内容的组合物和方法的一些实施方案中，洗脱缓冲液可以在反应容器中的水性凝胶洗涤层下面。在一些实施方案中，可以通过低温可熔化的蜡层将洗脱缓冲液与水性凝胶洗涤层分隔。在某些实施方案中，洗脱缓冲液可以与水性凝胶洗涤层相邻。在一些实施方案中，洗脱缓冲液可以包含于单独的室或管内，反应容器可以插入其中，使得可以将金属氧化物颗粒(包括CuTi颗粒)与结合的核酸，经磁性吸引穿过水性凝胶洗涤层，直接进入单独的室或管内的洗脱缓冲液中。在某些实施方案中，可以用可熔化的塞(例如，但不限于，可熔化的蜡塞)将反应容器的底部可逆地密封，该可熔化的塞可以在洗脱阶段熔化，其允许将金属氧化物颗粒经磁性吸引进入洗脱室内。然后可将反应容器从洗脱室中取出，并且随后可将包含所洗脱的核酸的洗出液转移到测定中或为后续使用而储存。在一些实施方案中，可以将金属氧化物颗粒与结合的核酸直接转移到测定中。
一旦完成了本公开内容的多层组合物，它就准备好立即使用。备选地，可以将反应容器的顶端密封，并且可以为后续使用而储存多层组合物。多层组合物的设计中的重要考虑是保质期。多层组合物应当稳定达至少6个月，并且优选地达多年。标准的商业储存温度和运输温度高于本文所述的凝胶洗涤层的凝固点并且低于本文所述的低温熔化的蜡组合物的熔点。例如，但不旨在限制，优选地包装商业货物使得运输期间的最大温度不超过45℃，并且运输期间的最小温度不降至低于4℃。为了保护洗涤层的完整性，可以单独提供水性缓冲液(例如洗脱缓冲液)并且在制造时可以不密封在反应容器内。
在各方面，本公开内容提供用于从生物样品中提取和纯化核酸的方法，该方法使用如本文别处所述的多层组合物。该方法的多层组合物包含反应容器，在该反应容器中组装层；反应容器中的最上层，其包含浓缩的半固体裂解糊剂和多个金属氧化物包覆的磁性颗粒，其非限制性实例包括CuTi颗粒；中间层，其包含低温可熔化的蜡；和较低的洗涤层，其包含水性凝胶。
在实施方案中，如上文所述在反应容器中组装该方法的多层组合物，该组装从较低的凝胶洗涤层开始，接着是中间层，以及然后是包含裂解糊剂的最上层。如本文别处所述，进一步为裂解糊剂提供多个金属氧化物磁性颗粒。在一些实施方案中，在生物样品在裂解糊剂上面的成层之前，或在生物样品的成层之后，在制备糊剂时，将多个金属氧化物颗粒加入裂解糊剂中。在一些实施方案中，将多个金属氧化物颗粒加入生物样品中。在一些实施方案中，在较低的凝胶洗涤层的添加之前，例如用低温可熔化的蜡，将反应容器的底部可逆地密封。可以手动地组装多层组合物，例如通过将每层移液或倾倒进入反应容器中。备选地，多层组合物的组装可以是自动化的，例如，但不旨在限制，该组装使用液体处理机器人或糊剂挤出器。该方法的多层组合物的自动化组装可以有利于生产一次性筒，该筒用于自动化分析仪器中，用于从生物样品中快速和/或大规模提取、分离和分析核酸。
在本文别处所述的实施方案中，反应容器具有基本上为环状的横截面，并且可以根据预期其用于台式使用还是与自动化分析仪器一起使用而在尺寸上变化。环状横截面不是对全部实施方案的要求。在一些实施方案中，反应容器可以是垂直排列的管。在一些实施方案中，其内形成凝胶洗涤层的反应容器部分包括弯曲部，使得反应容器的整体形状像“J”或“U”。所述形状在自动化分析仪器的背景下可能有利，因为基于特定自动化仪器内的可获得的空间，以及自动化仪器如何可以能够在特定空间内物理地执行该方法的步骤并随后处理被吸引穿过凝胶洗涤层的金属氧化物磁性颗粒，它们可以实现更快和更有效的工作流程。例如，但不旨在限制，可以考虑与自动分析仪器一起使用的“U”形的反应容器，其中“U”的第一臂含有中间层和裂解糊剂，和“U”的弯曲部和第二臂含有凝胶洗涤层，该凝胶洗涤层进一步与在凝胶洗涤层上面成层的洗脱缓冲液流体连通。在所述配置中，生物样品在裂解糊剂层上面成层，加热反应容器并且发生反转的密度混合，并且将金属氧化物磁性颗粒和结合的核酸吸引穿过弯曲部的凝胶洗涤层，其可以包括将其水平地或以其他方式非垂直地吸引，到“U”的第二臂上，并进入洗脱缓冲液中。在此配置中，洗脱缓冲液可以容易地进入自动化分析仪器中的机器，该仪器将洗脱出的核酸转移到后续的分子测定中。在一些实施方案中，可以将金属氧化物颗粒沿着不同的路径，经磁性吸引穿过延长的凝胶洗涤层，并且可以将其吸引进入不同的室或筒中，用于后续的核酸扩增和/或检测。
在实施方案中，如上文所述，生物样品在裂解糊剂的最上层上面成层。如本文别处所述，生物样品可以是天然存在的，可以是细胞或组织或其片段在缓冲液中的浓缩物或悬浮液，可以是细胞或组织的产物，可以是合成的核酸，或者可以是液体生物样品。生物样品的成层启动裂解反应，因为来自生物样品的水分溶解裂解糊剂，将它从稠浆或泡沫转变为液体，并释放出陷入糊剂中的气泡，其有助于混合溶解的糊剂与生物样品。进一步包含生物样品和金属氧化物颗粒的溶解的裂解糊剂在本文中也称为裂解反应。如本文别处所述，裂解反应内的洗涤剂破坏生物样品中的细胞膜和核膜以及任何其他组织组分，这释放出核酸。从生物样品中释放的核酸随后可用于接触和结合裂解反应中的多个金属氧化物颗粒。
如本文别处所述，中间层包含低温可熔化的蜡，并且将较低的水性凝胶洗涤层与最上面的裂解糊剂层分隔。在一些实施方案中，中间层可以包含单一层的低温可熔化的蜡。在一些实施方案中，中间层包含多个低温可熔化的蜡层，其中多个低温可熔化的蜡层的每层都通过插入密封层来分隔，与紧靠其下的层相比，所述插入密封层在更低的温度下熔化。在一些实施方案中，插入密封层是较低温可熔化的蜡或矿物油。本领域技术人员仅使用常规实验将能够确定用于特定用途的低温可熔化的蜡层和插入密封层的最佳数量、排列和组成。
在本公开内容的方法的实施方案中，向反应容器的外部施加热量以启动中间层的熔化，这导致密度反转，其特征为中间层熔化并且上升穿过裂解反应，从而混合裂解反应。如上文所述，可以使用多种类型的加热元件，其包括但不限于加热块、加热线圈或热空气。加热反应容器可以包括但不要求加热元件与反应容器之间的直接接触。施加热量使得中间层从最上面到最下面顺序地熔化—即，使得最初与裂解反应接触的中间层的部分首先熔化和上升，以及然后每个后续的插入层或低温熔化的蜡层顺序地熔化和上升。本领域技术人员将理解，将需要在足以熔化中间层但没有高到足以损坏生物样品或干扰裂解反应的温度下来施加热量。本领域技术人员仅用常规实验，将能够确定适当的温度和持续时间。随着密度低于裂解反应的熔化蜡上升，由密度反转导致的混合现象有利于台式应用和自动化应用这二者，因为它使得机械混合步骤不是必需的，从而减少整体的工作流程时间。当构成中间层的全部层、全部低温可熔化的蜡层和全部插入密封层已经熔化和上升穿过裂解反应到反应容器的顶部，从而密封反应容器的顶部时，密度反转完成。作为完成的密度反转的结果，裂解反应停留在凝胶洗涤层上并且与其流体连通。如本文别处所述，在完成的密度反转之后可以向反应容器施加额外时间段的热量，以确保驱动裂解反应至完成。
一旦裂解反应停留在凝胶洗涤层上，通过在反应容器周围或邻近放置磁体可以吸引多个金属氧化物颗粒和结合的核酸。磁力的施加将金属氧化物颗粒吸引到反应容器的壁上。可以使用多种磁体形状，其包括但不限于条形磁体、环形磁体或电磁体。如果是在台面上手动地进行该方法则可以手持磁体，或者磁体可以是自动化仪器的可编程组件。本领域技术人员将能够选择最适用于预期应用的磁体。磁体的移动驱动所吸引的金属氧化物颗粒和结合的核酸至少部分迁移穿过洗涤层，从而去除提取污染物。在一些实施方案中，在已经将金属氧化物颗粒和结合的核酸吸引穿过凝胶洗涤层之后，可以使用磁力的进一步施加来驱动金属氧化物颗粒和结合的核酸迁移进入洗脱缓冲液中。如上文所述，洗脱缓冲液可以与凝胶洗涤层流体连通，或可以是在单独的容器内。洗脱缓冲液可以是低离子强度的缓冲液并且进一步可以是磷酸盐缓冲液。可以将一些或全部的洗脱出的核酸手动地转移至测定中或可以用机器人转移作为通过自动化分子分析仪器进行的自动化测定的一部分。如上文所讨论的，分离的核酸可以用于后续的分子测定，其包括但不限于PCR、qPCR和RT-PCR。在一些实施方案中，为了在未来的应用中使用，可以储存部分或全部洗脱出的核酸。在一些实施方案中，考虑结合金属氧化物颗粒的核酸的直接扩增或测序，其中在已经将金属氧化物颗粒和结合的核酸吸引穿过凝胶洗涤层以后，可以使用磁力的进一步施加来将颗粒和结合的核酸直接吸引进入分子测定中。
实施例
概述
下文在实施例1、2、3和4中描述用于从液体生物样品中提取核酸的组合物和方法的开发和测试。开发了新的核酸提取系统，其提供了需要最小数量的步骤和消除了目前提取核酸需要的许多复杂操作的简单操作。这些要素一起创建了复杂的和有效的系统，其将纯化步骤以这样的方式组合，使得它们同时进行或以减少或消除机械步骤的方式进行。
总之，在实施例1中描述了低水分含量的裂解糊剂。在实施例2、3和4中，描述了分层组合物的组装和使用。在聚丙烯管和聚苯乙烯管中组装组合物。本文有时将这种类型的管称为反应容器。分层组合物的最上层是实施例1中描述的裂解糊剂。在使用中，从分层组合物的顶部加入液体生物样品，从而溶解裂解糊剂。因为分层组合物预期在组装之后有延长的保质期，并且因为分层组合物中至少另外一层是水性层(下文在实施例2中描述的水性凝胶洗涤层)，重要的是，在将分层组合物用于检测核酸之前，在水性凝胶层和裂解糊剂层之间没有水性连通(即，浸出)。
下文在实施例2和3中描述一个或多个低温可熔化的蜡层的组装和使用，所述低温可熔化的蜡层在分层组合物中紧靠在裂解糊剂层之下。此低温可熔化的蜡层起到在水性凝胶层和裂解糊剂层之间的屏障的作用，从而防止在水性凝胶层和裂解糊剂层之间的水性连通(即，浸出)。
在使用中，将液体生物样品加入实施例2和3中描述的管内所含有的分层组合物中。液体生物样品溶解裂解糊剂，这导致生物样品所含有的细胞的裂解。裂解糊剂还含有用金属氧化物包覆的颗粒，在这种情况下，金属氧化物包含铜和钛。其中将包含铜和钛金属氧化物的包覆的颗粒称为CuTi颗粒。存在于溶解的裂解糊剂中的核酸，主要是从生物样品内裂解的细胞中释放的核酸，结合CuTi颗粒从而形成CuTi颗粒/核酸复合物，其受到磁场的吸引力。
如上文所指出，一个或多个低温可熔化的蜡层防止在水性凝胶洗涤层和裂解糊剂层之间的水性连通，从而在使用前的储存期间维持裂解糊剂的低水分含量特性。在使用中，将一个或多个蜡层的低温熔化特性用于混合溶解的裂解糊剂的目的，所述裂解糊剂通过液体生物样品的添加来溶解。更具体而言，加热分层组合物至导致低温可熔化的蜡熔化的温度。一旦通过熔化从管(在其内组装分层组合物)的壁上释放，发生密度反转并且低温可熔化的蜡层上升穿过溶解的裂解糊剂，从而混合其组分。
如果分层组合物仅包含单一低温可熔化的蜡层，该层的熔化和反转也在溶解的裂解糊剂(含有CuTi颗粒/核酸复合物)和水性凝胶层之间建立水性连通。通过在反应容器(即，实施例2和3的聚丙烯管和聚苯乙烯管)邻近放置磁体来引入磁场。然后将CuTi颗粒/核酸复合物从溶解的裂解糊剂中吸引到水性凝胶层中，从而从CuTi颗粒/核酸复合物中去除裂解糊剂组分。可以将CuTi颗粒/核酸复合物从水性凝胶层中吸引到洗脱缓冲液中，用于从复合物中释放核酸用于进一步的分析。
实施例1.浓缩的半固体裂解糊剂的制备
开发具有高水平的离液盐和洗涤剂以及最少水分的浓缩的半固体裂解糊剂(此后“裂解糊剂”)试剂，用于核酸提取。
材料
将干燥的硫氰酸胍(GITC)、Tris-HCl和Tris碱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)粉末化并且通过200微米的过滤器筛分，而不是液体裂解试剂。将-20(聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯，CAS 9005-64-5，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以16％w/w加入经筛分的干燥试剂中以产生稠浆。计算试剂的混合物以在与样品按1:1w/v混合时得到3.8M GITC、100mM Tris(pH 7.8)和8％(w/w)-20。添加具有最少流体的CuTi颗粒(AbbottMolecular，Abbott Park，IL)以得到1mg颗粒每0.5g裂解糊剂。
结果
通过将-20加入经筛分的干燥试剂中来产生稠浆。浆液是具有非常小的气泡的泡沫，其有助于裂解糊剂被液体样品溶解。裂解糊剂含有<5％的残留水分并且加热时不分离。裂解糊剂在室温下稳定持续超过12个月并且在53℃下稳定持续至少12小时。裂解糊剂不流动，并且甚至在反向的撞击和长时间的倒置之后还保留在裂解孔和其他密封容器(containment vessel)中(如图1C中，右图所示)。
实施例2.核酸提取系统的组件和方法的测试和实验验证
材料
浓缩半固体裂解糊剂
如实施例1中所述制备含有CuTi颗粒的裂解糊剂试剂。
蜡组合物
如下文所述制备和测试蜡组合物。
水性凝胶
通过混合100ml水和1g琼脂糖并在热板上加热混合物直至沸腾和直至琼脂糖彻底溶解，来制备1％琼脂糖凝胶。
数据分析
使用专有的Abbott软件和用JMP软件(SAS Institute，Cary，NC)进行数据分析。
实验和结果
测试疏水蜡组合物
为了防止最少水分的裂解糊剂与用于“洗涤”磁性颗粒的水性凝胶接触，对疏水蜡组合物作为能够在裂解糊剂和水性凝胶层之间形成密封的材料进行了测试，该密封冷却后不会收缩，在室温下和在标准运输温度下是不可渗透的，并且在已知温度下熔化。对多种蜡组合物进行了测试，以测定它们维持这些特性的能力。
测试石蜡/Chill-outTM蜡溶液
石蜡(熔点>65℃；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和Chill-outTM液体蜡(BioRad，Hercules，CA)的1:1(w/w)混合物通过各加热50g直到石蜡熔化并与Chill-outTM蜡彻底混合来制备。为了测试蜡组合物和密封的完整性，用水、乙酸和氢氧化钠来制备实验管。
将pH条带的指示区域切割出来，放入RV管的底部，并用2.5ml的1％琼脂糖覆盖。300ul的1：1蜡混合物在冷却的琼脂糖顶部成层并冷却。将1ml的水、1M乙酸或1M NaOH在蜡上方加入每个管并且将管放置过夜。在1M乙酸管中显示蜡已经从管的壁上分离，但在水管和1M NaOH管中显示蜡是完整的。
还制备了石蜡和Chill-outTM蜡的25％(w/w)混合物，以测定较软的蜡混合物是否也会形成对管壁的完整的密封。通过熔化24g的50％蜡与24g的Chill-outTM蜡来制备25％的蜡。将5ml移液器吸头用作提取管。在System Diluent中制备0.4％琼脂糖，50ml具有0.2g琼脂糖，以及使其冷却但不硬化。将熔化的25％蜡保持在～75℃下，并且通过浸入蜡中以及使蜡硬化来密封移液器吸头的底部。添加75μl洗脱缓冲液，并且在洗脱缓冲液上面添加少量蜡以密封它。接下来，添加0.75ml的琼脂糖并且允许其冷却和凝固。添加0.2ml的25％蜡层并允许其冷却，添加17μl HIV内部对照，以及添加另外的0.2ml的25％蜡层并允许其凝固。向顶部加入0.5g裂解糊剂并将管以直立位储存。
持续的完整性测试
制备用于蜡完整性测试的分层管(图1A-C)。如图1A所示，通过将三层的含有嵌入的pH条带(ColorpHast pH 5.0-10.0，EMD MilliporeSigma，Burlington，MA)的0.75％琼脂糖与三层的25％蜡(25％石蜡/75％Chill-outTM蜡)交替来制备聚丙烯管和聚苯乙烯管这二者。在最终的蜡层顶部添加0.5g裂解糊剂。在室温下将管放置至少一年并且周期性地检查收缩和密封完整性。如果收缩或其他密封完整性的损失发生，使得裂解糊剂能够扩散并且与一个或多个琼脂糖层进行接触，则预计会有一个或多个pH条带的颜色变化。通过对蜡层的目视检查或者通过pH条带的颜色变化，都没有观察到收缩或密封完整性的损失。
用不同的蜡层配置来制备额外的管(图1B-C)，同样在聚丙烯管和聚苯乙烯管两者中，以及同样具有嵌入0.75％琼脂糖中的pH条带。如图1B所示，准备了在琼脂糖层和25％蜡层之间具有液体Chill-outTM(BioRad)蜡层的扩散测试，并且如图1C所示，在25％蜡层之间放置液体Chill-outTM蜡层。将管在室温下放置至少一年并且周期性地检查收缩和密封完整性。没有观察到收缩或密封完整性的损失，并且纯Chill-outTM蜡层没有对密封完整性造成明显的差异。
测试石蜡-矿物油组合物和微晶蜡-矿物油组合物
观察到石蜡在冷却后收缩，这可造成有缺陷的密封。因此，测试石蜡-矿物油混合物。测试了两种类型的石蜡，一种在58-62℃下熔化(Paraffin Wax MP 58-62C，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，以及一种在>65℃下熔化(Paraffin Wax MP>65C，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。测试每种与轻质矿物油(Mineral Oil Light，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或重质矿物油(Mineral Oil Heavy，Avantor Performance Materials，Radnor，PA)混合的石蜡。
为了比较性能，以不同比例的蜡和油制备50克的蜡-油组合(表1)。在实验室烘箱中在大于80℃下熔化蜡-矿物油组合。将约3ml的蜡混合物加入5ml的反应容器中并允许其在室温下冷却。将反应容器放置在恒温混匀仪(Thermomixer)中(不混合)并通过调节恒温混匀仪上的设置逐渐升高温度。含有约3ml的水的管也与温度计一起放置在恒温混匀仪中。在温度升高达到平稳状态且不再升高之后记录温度。然后记录反应容器中蜡的特征。然后将设置上调并重复该过程。每种蜡-油组合的熔化温度(Tm)是蜡在反应容器中明显熔化并自由地流动的温度。用在每个反应容器中约3ml的蜡制备每个组合的几个反应容器。将一些反应容器放置在冰上以观察蜡在较低温度下的行为，并且以测试密封完整性，其通过观察到的从反应容器壁上的收缩来测量。将25％石蜡/重质矿物油的组合用于一些后续实验。结果如表1所示。
表1.石蜡-矿物油组合物熔化和在冰上冷却
进行进一步的类似测试以测定额外的微晶蜡-矿物油组合的熔化行为、熔化温度和完整性。将CastaldoWax-Green(Castaldo，Staffordshire，UK)与适量的重质白色矿物油(Mineral Oil White，重质；Avantor Performance Materials，Radnor，PA)混合以制备按重量计5％、7.5％、10％、20％和25％的蜡溶液并在75-80℃下加热。为了测试熔化行为，每个百分比制备三管，每管具有2.5ml蜡溶液。将所有的管都放置在加热块中并且逐渐增加加热块的温度。熔化行为和熔化温度如表2所示。将蜡组合物的外观没有变化记录为“固体的”。如果蜡组合物变清澈但不流动，则将它记录为“软的”。如果蜡组合物仅非常缓慢地流动，则将它记录为“粘性的”。如果蜡组合物自由地流动，则将它记录为“熔化的”。然后将所有的管都在4℃下放置几分钟直到凝固；没有观察到任何溶液从管的侧面脱离。
表2.微晶蜡-矿物油组合物熔化和冷却
位移测试
为了熔化温度的更有代表性的测试，和为了更准确地模仿溶解的裂解糊剂和中间层的蜡层之间的相互作用，对一系列的蜡组合物进行了位移测试。在蜡的顶上添加裂解缓冲液层(4.7M GITC在水中)，并且测定了裂解缓冲液层将下沉到软化的和熔化的蜡层下面的温度。每个容器用3.25ml的蜡组合物来制备反应容器，其中在每个容器中的凝固的蜡上面添加0.8ml的裂解缓冲液。结果如表3和表4所示。如果裂解缓冲液保留在熔化的蜡层顶上，则将它记为“漂浮”；如果裂解缓冲液下沉到熔化的蜡层下面，则将它记为“下沉”。
表3.位移测试
重复的研究
温度 18％ 20％ 25％
60 漂浮 漂浮 漂浮
63.3 漂浮 漂浮 漂浮
64.5 下沉 漂浮 漂浮
65.3 下沉 下沉 漂浮
66.2 下沉 下沉 漂浮
67.3 下沉 下沉 下沉
为了测试green wax/重质矿物油溶液的完整性，用交替的5％蜡溶液的层和18％蜡溶液的层来制备反应容器，如图1D所示。将容器在4℃下放置几分钟直到凝固并将其加热至60℃并允许其冷却。在4℃下没有观察到收缩，并且在加热至60℃之后没有观察到泄漏或间隙。如图1D所示，蜡层顶上的裂解糊剂保留在原位，并且蜡层下面的琼脂糖中嵌入的pH条带显示无变化。然而，在一小块蜡与裂解糊剂一起储存的期间，一些颜料浸出，这表明蜡中的绿色颜料对与浓缩的裂解缓冲液一起的长期储存而言可能有问题。因此，进一步的工作和实验限于石蜡组合物。
石蜡/矿物油、棕榈蜡/矿物油和石蜡/棕榈蜡/矿物油的组合物的位移测试的结果如表4中所示。如上文所述对wax-green/矿物油的组合物进行了这些位移测试。棕榈蜡的组合物被评价为微晶蜡(wax-green)的替代，并进行测试以确定收缩量是否与石蜡的收缩量不同，但由于它们的高熔化温度没有进行进一步研究。
表4.位移测试
将蜡组合物测试的总体结果总结在表5中。
表5.
为了25％石蜡/75％矿物油层和5％石蜡/95％矿物油层的完整性测试，制备反应容器如下并如图2B所示。在System Diluent(Abbott，Abbott Park，IL)中制备3.5ml的0.7％琼脂糖并在热板上熔化。反应容器底部用Alinity m反应管底部(50μl；Abbott，Abbott Park，IL)封盖。将指示条带放入反应容器中；添加琼脂糖并使其凝固。如图2B所示，在琼脂糖层上面顺序地添加蜡层，将0.3ml低温可熔化的蜡(25％石蜡/75％矿物油)与0.3ml较低温可熔化的蜡(5％石蜡/95％矿物油)交替。在添加下一个之前允许每个蜡层凝固。最后，0.5g含有CuTi颗粒的裂解糊剂在最后一个蜡层的顶上成层。将反应容器在室温下储存达一年并周期性地检查蜡的收缩和泄漏。没有观察到收缩或泄漏，这表明5％石蜡蜡层没有从反应容器壁上收缩，以及表明它能起到将裂解缓冲液与水性琼脂糖层隔绝的作用。
提取管的组装和测试
使用5ml移液器吸头(VWR，Radnor，PA)作为提取管，准备了基本的提取管设计来测试熔化过程。根据图3A中所示的示意图来制备管，其具有通过琼脂糖层分隔的两个蜡层。制备熔化的25％蜡溶液(25％石蜡/75％Chill-outTM液体蜡)并将其保持在约75℃下。在System Diluent(Abbott，Abbott Park，IL)中通过加热至沸腾来制备100ml的0.5％琼脂糖并允许其冷却但不凝固。在琼脂糖冷却的同时，用Alinity m反应容器底部(Abbott，AbbottPark，IL)来密封提取管的下端。然后将冷却但仍是液体的琼脂糖加入提取管中，形成水性凝胶层，并允许其凝固。接下来，添加0.4ml冷却的25％蜡，在琼脂糖凝胶层上面形成蜡层。在25％蜡凝固之后，添加0.4ml冷却的0.5％琼脂糖并允许其凝固，在25％蜡层上面形成琼脂糖凝胶层。然后在第二个琼脂糖凝胶层上面添加0.3ml 25％蜡并允许其凝固。添加17μl的HIV内部对照(IC)，接下来是另外的0.3ml 25％蜡。最后，在最后凝固的蜡层上面添加0.5g含有CuTi颗粒的裂解糊剂。
将具有两端都开口的孔的加热块保持在75-80℃下。设置加热块使得块的下侧暴露。将管放入块中使得较低的琼脂糖层从块的下侧伸出，这允许该区域比所加热的上面区域保持更凉。
作为初始的测试样品，将0.5ml水加入裂解糊剂中，这溶解裂解糊剂并且在糊剂内释放气泡。然后将管放入加热块中几分钟以确定中间蜡层是否熔化。如下文所述熔化在五分钟内完成。蜡层顺序地熔化，其中顶层首先熔化，然后是第二层。每一次，蜡漂浮至裂解糊剂层的顶部，这混合了裂解糊剂-样品-颗粒混合物并且无需机械混合。当冷却时，蜡密封管的顶部，从而没有来自样品的液体废料。较低的琼脂糖凝胶层不熔化并且保留在管中，这密封底部。
提取系统的测试
进行了实验以测试简单提取系统。根据图3A所示的示意图和如本文前面所述制备了六个提取管。所测试的6个样品中，两个是HIV样品以及四个是对照样品(没有HIV的基础基质(纯化的人血浆))。制备了熔化的25％蜡溶液(25％石蜡/75％Chill-outTM液体蜡)并保持在约75℃下。制备了1ml的0.5％琼脂糖并允许其冷却但不硬化。在琼脂糖冷却的同时，用Alinity m反应容器底部(Abbott，Abbott Park，IL)密封提取管的下端。然后将冷却的琼脂糖加入提取管中，形成水性凝胶层，并允许其凝固。接下来，添加0.4ml冷却的25％蜡，在琼脂糖凝胶层上面形成蜡层。在25％蜡凝固之后，添加0.4ml冷却但仍为液体的琼脂糖并允许其凝固，在25％蜡层上面形成琼脂糖凝胶层。然后在第二个琼脂糖凝胶层上面添加另一个25％蜡层(0.3ml)并允许其凝固。添加17μl的HIV内部对照(IC)，接下来是另一个0.3ml25％蜡层。最后，在最后凝固的蜡层上面添加0.5g裂解糊剂。
如下进行样品提取。将加热块维持在75-80℃下。将0.5ml样品加入每个提取管中，并将管放置在加热块中五分钟，这是足以熔化所有蜡层的时间。加热块仅加热管的蜡层和裂解反应；未加热较低的琼脂糖洗涤层。为了裂解反应继续进行至完成，将管在加热块中孵育额外的10-15分钟。施加磁力以捕获裂解物内的CuTi颗粒，将颗粒牵引到管的侧面，并穿过水性琼脂糖凝胶层。将提取管的下端解封，将提取管放入空的200μl MicroAmp管中(Applied Biosystems，Waltham，MA)，并将CuTi颗粒磁性牵引到microamp管中。为了洗脱结合CuTi颗粒的核酸，将100μl洗脱缓冲液加入microamp管中，并且在不混合的情况下将反应在75℃下孵育10分钟。然后磁性地捕获颗粒，并将50μl的洗出液加载到HIV RT-PCR测定中。
用HIV RT-PCR测定来测试洗出液以确定是否从样品中成功地提取了HIV RNA(程序0.6ml HIV-1RNA版本7.00，Alinity m2000RT-PCR系统，Abbott，Abbott Park，IL)。将271μl激活物和941μl寡核苷酸(oligo)混合物加入每个聚合酶瓶中。向每个扩增板的孔中加入50μl主混合物和50μl样品。如图3B和图3C所示，从两个阳性样品中成功地提取了HIV RNA，并且如图3D和图3E所示，全部六个样品中内部对照都有效。这些结果证明了提取系统有效，以及可以将内部对照成功地嵌入蜡层中并在提取过程期间回收。
使用相同的试剂并在相同的条件下进行了第二组测试，其使用24个管。如本文前面所述和如图3A所示制备了提取管。将四个加热块维持在75-80℃下，并且每个加热块孵育六个管。用于提取的样品如表6中所示。
表6.使用的样品
如本文前面所述，将裂解物内的CuTi颗粒磁性地捕获并牵引穿过水性琼脂糖凝胶层进入MicroAmp管中。使用75μl洗脱缓冲液以及在75℃下的10分钟孵育从CuTi颗粒上洗脱核酸。磁性地捕获CuTi颗粒并在加载了剩余的测定试剂后将50μl的每种洗出液转移到测定板上。如表7中所示排列测定样品。如图4A-G和表7-10所示，核酸提取是成功的。
表7.
表8.样品的HIV CT的单因素分析(平均值和标准差)
水平 数量 平均值 标准差 均值标准误 下限95％ 上限95％
neg 3 11.2567 21.2292 12.257 -41.48 63.993
10XLOD 9 26.1589 0.6405 0.213 25.67 26.651
LoPos 3 25.0567 1.4784 0.854 21.38 28.729
HiPos 3 18.0800 0.3223 0.186 17.28 18.881
CalA 3 23.7233 0.1401 0.081 23.38 24.071
CalB 3 13.5633 0.1222 0.071 13.26 13.867
表9.样品的内部对照CT的单因素分析(平均值和标准差)
表10.样品的logcp/ml的单因素分析(平均值和标准差)
水平 数量 平均值 标准差 均值标准误 下限95％ 上限95％
10XLOD 9 2.28111 0.189172 0.06306 2.1357 2.4265
LoPos 3 2.60667 0.441059 0.25465 1.5110 3.7023
HiPos 3 4.67333 0.098658 0.05696 4.4283 4.9184
CalA 3 3.00000 0.040000 0.02309 2.9006 3.0994
CalB 3 6.01000 0.036056 0.02082 5.9204 6.0996
实施例3.核酸提取系统组件和方法的额外的测试和验证
材料和方法
除了下文所述的，使用的材料和方法如实施例1和2中所述。
提取系统测试
进行了额外的实验以测试简单提取系统的实施方案，其中较低温可熔化的蜡层起插入疏水密封层的作用。根据图5A中所示的示意图制备两组5ml移液器吸头反应容器，一组具有5个交替的低温可熔化的蜡层和较低温可熔化的蜡层(“五层”)的中间层以及一组具有六个交替的低温可熔化的蜡层和较低温可熔化的蜡层(“六层”)的中间层。制备两种蜡溶液并将其保持在约80-85℃下，一种是低温熔化的15％蜡溶液(15％石蜡/85％矿物油)，以及另一种是较低温熔化的5％蜡溶液(5％石蜡/95％矿物油)。制备了0.5％琼脂糖并将其保持在80-85℃下直至反应容器的制备。用Alinity m反应容器底部(Abbott,Abbott Park,IL)密封了反应容器的下端；并且将2ml的0.5％琼脂糖加入反应容器中并允许其冷却和硬化，形成水性凝胶洗涤层。
如图5A所说明，通过在凝胶洗涤层上面添加交替的低温熔化的15％蜡溶液的层和较低温熔化的5％蜡溶液的层(插入疏水密封层)，来制备五层反应容器组。在添加后续的蜡层之前允许每个蜡层在室温下凝固；将0.3ml蜡用于前四层，和将0.4ml蜡用于最后层。如图5A中所另外说明的，通过在凝胶洗涤层上面添加交替的较低温熔化的5％蜡溶液的层(插入疏水密封层)和低温熔化的15％蜡溶液的层，来制备六层反应容器组。在添加后续的蜡层之前允许每个蜡层凝固；将0.3ml蜡用于前四层，和将0.4ml蜡用于最后层。最后，在最后凝固的蜡层上面添加0.5g具有CuTi颗粒的裂解糊剂。
每组测试了四个样品，两个阴性对照样品(“Neg”；HIV-1Neg Control 2G31Z(Abbott，Abbott Park，IL)和HIV内部对照(IC))和两个阳性对照样品(“Pos”；HIV-Hi PosControl 2G31X(Abbott，Abbott Park，IL)和HIV内部对照(IC))。如下进行样品提取。将加热块在实验室烘箱(Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)中维持在80℃下。对于五层反应容器和六层反应容器这二者，在每个反应容器中将17μl HIV内部对照(IC)加入裂解糊剂中，和将0.5ml的各样品加入裂解糊剂中。一次进行两份提取；将两个反应容器放在实验室烘箱的加热块中。在此布置下，反应容器中的所有层都受到基本上均匀的加热。对于五层反应容器和六层反应容器这二者，在约三分钟之后显示蜡层完全熔化并且具有颗粒的裂解反应下沉到蜡层下面并与凝胶洗涤层流体连通。五分钟之后，施加磁力以捕获裂解反应内的CuTi颗粒，将颗粒牵引到管的侧面并穿过琼脂糖凝胶洗涤层。将反应容器的下端解封并放入含有100ul洗脱缓冲液的200ul MicroAmp管(Applied Biosystems,Waltham,MA)中，并将CuTi颗粒磁性牵引到MicroAmp管中。为了洗脱结合CuTi颗粒的核酸，在不混合的情况下将反应在75℃下孵育5分钟。然后将颗粒磁性地捕获，并将50ul的洗出液加载到HIV RT-PCR测定中。
用HIV RT-PCR测定来测试洗出液以确定是否从样品中成功提取了HIV RNA(程序0.6ml HIV-1RNA版本8.00,Alinity m2000RT PCR系统,Abbott,Abbott Park,IL)。向每个聚合酶瓶中加入271ul激活物和941ul寡核苷酸混合物。向每个扩增板的孔中加入50ul主混合物和50ul样品。
结果
对于两组提取，如图5B-C和表11中所示，都从阳性样品中成功地提取了HIV RNA(靶标CT列)，并且内部对照在所有样品中都有效(IC CT列)。
表11.五层提取和六层提取的结果
使用HIV测定和HIV样品对照，已经证明了简单提取系统的实施方案有效。使用五层实施方案和六层的实施方案都成功地和有效地提取了样品，该实施方案具有包含较低温可熔化的蜡的插入密封层的中间层。在实施方案之间没有观察到有意义的差异。
实施例4.测试用于分离HBV DNA的核酸提取系统组件和方法
为了分离乙肝病毒(HBV)DNA，将浓缩的裂解溶液加载到本发明的基于可熔化的蜡的、多层的提取筒中，并通过样品再水合。在Alinity m自动化仪器上使用CuTi颗粒，在不需要泵送裂解溶液的情况下分离了HBV DNA，从而降低了自动化平台的复杂性。这些数据表明使用HBV测定和HBV样品对照，已经证明了提取系统的实施方案有效。
等价物
尽管本文已经描述和说明了本发明的几个实施方案，本领域普通技术人员将容易地设想到用于执行本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或多个本文所述的优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这种变化和/或修饰都被视为在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意为示范性的以及实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于特定的应用或使用本发明的教导的应用。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的多种等价物。因此，要理解的是，前面的实施方案仅是以实例的方式呈现，并且在所附的权利要求及其等价物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文所述的每个个别的特征、系统、制品、材料和/或方法。此外，两个或更多个所述特征、系统、制品、材料和/或方法的任何组合(如果该特征、系统、制品、材料和/或方法不是相互矛盾的)也包括在本发明的范围内。
应当理解，相对于字典定义、通过引用并入的文件中的定义，和/或所定义的术语的普通含义，以本文所定义的和使用的所有定义为准。
除非明确表示相反，如本文在说明书中和在权利要求中所用的不定冠词“一个”和“一种”应当理解为意为“至少一个/种”。如本文在说明书中和在权利要求中所用的短语“和/或”，应当理解为意为如此结合的要素的“任一个或两个”，即在一些情况下联合存在和在另一些情况下分别存在的要素。不论与那些明确确定的要素有关或无关，除了通过“和/或”条款明确确定的要素以外可以任选地存在其他要素，除非明确表示相反。
本申请中引用的或提到的所有参考文献、专利和专利申请和出版物通过引用以其整体并入本文。

Claims (38)

1.一种用于从生物样品中提取和分离核酸的多层组合物，所述多层组合物包含：
a)反应容器，在所述反应容器中组装所述多层组合物的层；
b)反应容器内的最上层，其包含浓缩的半固体裂解糊剂；
c)中间层，其包含低温可熔化的蜡；和
d)较低的洗涤层，其包含水性凝胶。
2.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述反应容器包含基本上为环状横截面的管，所述管具有顶部和底部。
3.根据权利要求2所述的多层组合物，其中将所述管的顶部和底部可逆地密封。
4.根据权利要求2所述的多层组合物，其中所述管为J形或U形。
5.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述生物样品是液体生物样品。
6.根据权利要求5所述的多层组合物，其中所述液体生物样品是血清样品、血液样品、血浆样品、唾液样品或其他类型的生物样品。
7.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述低温可熔化的蜡在室温下为固体。
8.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述低温可熔化的蜡在高于50-55摄氏度的温度下开始转变为液体。
9.根据权利要求1所述的多层组合物，其进一步包含邻近层，所述邻近层包含与洗涤层流体连通的洗脱缓冲液。
10.根据权利要求9所述的多层组合物，其中所述洗脱缓冲液是低离子强度的洗脱缓冲液。
11.根据权利要求10所述的多层组合物，其中所述低离子强度的洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液。
12.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述中间层包含多个低温可熔化的蜡层，其中所述多个低温可熔化的蜡层的每层通过插入密封层来分隔。
13.根据权利要求12所述的多层组合物，其中分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的所述插入密封层包含较低温可熔化的蜡，与紧靠其下的层相比，所述较低温可熔化的蜡在更低的温度下熔化。
14.根据权利要求12所述的多层组合物，其中分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的所述插入密封层包含矿物油。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的多层组合物，其中将多个低温可熔化的蜡层成层使得，在使用中，多个低温可熔化的蜡层的每层从最上面到最下面顺序地熔化。
16.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述中间层进一步包含内部对照。
17.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述浓缩的半固体裂解糊剂包含GITC、Tris-HCl、Tris碱和Tween-20。
18.根据权利要求17所述的多层组合物，其中所述浓缩的半固体裂解糊剂具有少于10％的残留水分并且不流动。
19.根据权利要求18所述的多层组合物，其中所述浓缩的半固体裂解糊剂具有少于5％的残留水分。
20.根据权利要求1所述的多层组合物，其中所述水性凝胶包含琼脂糖或聚丙烯酰胺。
21.根据权利要求31所述的多层组合物，其中所述多个金属氧化物包覆的颗粒以相对于计算的存在于生物样品中的核酸的量，预计代表摩尔过量的量存在。
22.一种用于从生物样品中提取和纯化核酸的方法，所述方法包括：
a)提供用于从生物样品中提取和分离核酸的多层组合物，所述多层组合物包含：
i)反应容器，在所述反应容器中组装所述多层组合物的层；
ii)反应容器内的最上层，其包含浓缩的半固体裂解糊剂；
iii)中间层，其包含低温可熔化的蜡；和
iv)较低的洗涤层，其包含水性凝胶；
b)将生物样品在最上层上面成层从而形成溶解的裂解糊剂，其中所述溶解的裂解糊剂进一步包含多个金属氧化物包覆的磁性颗粒；
c)将反应容器加热以启动中间层的熔化，所述熔化导致密度反转，其特征为中间层熔化并且上升穿过溶解的浓缩的半固体糊剂，从而将生物样品、溶解的浓缩的半固体裂解糊剂以及多个金属氧化物包覆的磁性颗粒混合，从而导致生物样品内的核酸与金属氧化物包覆的颗粒的结合；
d)在反应容器周围或邻近放置磁体，从而吸引金属氧化物包覆的颗粒和结合的核酸；
e)移动磁体从而驱动所吸引的金属氧化物包覆的颗粒和结合的核酸至少部分迁移穿过水性凝胶，从而去除提取污染物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述低温可熔化的蜡在室温下为固体。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述低温可熔化的蜡在高于50-55摄氏度的温度下开始转变为液体。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述多层组合物进一步包含与洗涤层流体连通的洗脱缓冲液，并且移动磁体，从而驱动所吸引的金属氧化物包覆的颗粒和结合的核酸迁移穿过水性凝胶并进入洗脱缓冲液中。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述洗脱缓冲液是低离子强度的洗脱缓冲液，任选地进一步其中所述低离子强度的洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述多层组合物的中间层包含多个低温可熔化的蜡层，其中多个低温可熔化的蜡层的每层通过插入密封层来分隔。
28.根据权利要求27所述的方法，其中分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的所述多层组合物的插入密封层包含较低温可熔化的蜡，与紧靠其下的层相比，所述较低温可熔化的蜡在更低的温度下熔化。
29.根据权利要求27所述的方法，其中分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的所述多层组合物的插入密封层包含矿物油。
30.根据权利要求27所述的方法，其中将所述多个低温可熔化的蜡层成层使得，在使用中，随着反应容器被加热，多个低温可熔化的蜡层的每层从最上面到最下面顺序地熔化。
31.根据权利要求1所述的多层组合物，其中要素b)的最上层进一步包含多个金属氧化物包覆的磁性颗粒。
32.根据权利要求31所述的多层组合物，其中所述金属氧化物包覆的颗粒是钛氧化物颗粒。
33.根据权利要求31所述的多层组合物，其中所述钛氧化物包覆的颗粒是铜钛(CuTi)包覆的颗粒。
34.根据权利要求22所述的方法，其中所述多个金属氧化物包覆的颗粒是钛氧化物颗粒。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述钛氧化物颗粒是铜钛(CuTi)包覆的颗粒。
36.根据权利要求22所述的方法，其中在提供要素a)的多层组合物之后提供多个金属氧化物包覆的颗粒。
37.根据权利要求12所述的多层组合物，其中分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的所述插入密封层包含琼脂糖。
38.根据权利要求27所述的方法，其中分隔多个低温可熔化的蜡层的每层的所述多层组合物的插入密封层包含琼脂糖。
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