KR20230096421A

KR20230096421A - 공심채 추출물을 포함하는 신경 퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230096421A
Application number: KR1020210185888A
Authority: KR
Inventors: 최상윤; 허진영; 김윤숙; 최지원; 유귀재; 이현희; 박희진; 이창준
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-06-30

Abstract

본 발명은 공심채 (Ipomoea aquatica) 추출물; 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 공심채 추출물은 BV2 신경세포의 보호에 우수한 효과를 나타내는 바, 뇌의 염증 또는 뇌의 퇴행성 질환의 개선, 예방 또는 치료에 유용한 식품 조성물 또는 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.

Description

공심채 추출물을 포함하는 신경 퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물{Composition of improving, preventing or treating neuro degenerative disease comprising Ipomoea aquatica extract}

본 발명은 공심채 (Ipomoea aquatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물, 및 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

우리나라는 지난 2000년 65세 이상 인구가 총 인구에서 차지하는 비중이 7.2 %에 이르러 고령화 사회에 들어섰으며, 2019년에는 이 비율이 14 %를 넘어 고령 사회에 진입하였다. 이와 같이 최근 고령화 문제가 사회적인 이슈로 대두됨에 따라 고령인구의 특성이나, 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지 등에 대한 국민의 관심이 높아지고, 이에 대한 통계 수요도 늘어나고 있다. 이러한 변화의 핵심은 노령화 인구의 증가로 인해서 지난 50여년 간 사망의 주된 원인이 되었던 급성 전염성 질환보다는 만성 퇴행성 질환이 더욱 큰 문제로 대두되고 있다는 점이다. 특히, 만성 퇴행성 질환 중에서 뇌신경 퇴행성 질환에 의한 사망은 단일질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환이다. 이러한 질환의 예방 및 치료를 위하여, 국내의 경우 다수의 천연물질이 뇌신경 퇴행성 질환의 예방에 효과가 있는 건강식품으로 시판되고 있으나, 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며, 오히려 건강식품의 남용이 건강에 해가 되기도 하여 사회적이 문제가 되고 있다.

신경 퇴행성 질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 신경 퇴행성 질환은 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사 (necrosis)나 아폽토시스 (apoptosis)에 의한 신경 세포의 사멸로 특징 지어진다. 따라서 신경세포의 사멸기전에 대한 이해는 중추신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위하여 반드시 이루어져야 한다.

중추신경계는 신경세포와 신경 교세포로 이루어져 있다. 신경 교세포는 뇌 속에 가장 많이 분포되어 있는 세포로서 전체 뇌세포의 90 %, 부피로는 뇌 전체의 50 %를 차지하고 있다. 이 세포들은 그 자체로는 신경충격을 생성시키지 못하지만 신경원들이 고유의 기능을 수행하는데 도움을 주며, 뇌 조직이 손상되었을 때 이를 회복시키는데도 매우 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포 (astrocytes), 미세 아교세포 (microglia) 및 희소돌기아교세포 (oligodendrocytes)의 세 종류로 구성되어 있다. 이들 중에서 미세아교세포 (microglia)는 미세교세포, 또는 소교세포로도 불리며 중추신경계 (Central Nervous System, CNS)에 상재하는 면역세포로서 전체 뇌 세포의 5 내지 10 %를 차지한다.

특히, 미세아교세포는 중추신경계에서 일차 방어라인으로서 기능한다. 미세아교세포는 중추 신경계에서 염증 매개자의 주요 세포 내공급원이다. 미세아교세포는 일산화질소 (NO), 반응성 산소종 (reactiveoxygen species, ROS), 전염증성 사이토카인 및 프로스타글란딘을 생산함으로써 신경염증에 관여한다. 활성화된 미세아교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하여 미생물 및 세포 파편 (cell debris)을 포식하고 파괴한다.

그러나 염증세포로서의 미세아교세포의 역할은 항상 유익한 것만은 아니다. 조절되지 않은 미세교세포의 활성화와 지속적인 과도한 신경염증은 퇴행성 신경질환 (neurodegenerative diseases)을 포함하는 다양한 중추신경계 병리의 원인으로 여겨지고 있다. 즉, 기능적으로 활성화된 미세아교세포는 염증매개물질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 미세아교세포의 활성화는 다양한 종류의 퇴행성 신경질환과 관련이 있다. 예를 들어, 알츠하이머 질환의 경우에도 노용균반점 (senile plague)의 형성에 소교세포가 중요한 역할을 한다는 것은 매우 잘 알려져 있다. 이브프로펜 등과 같은 소염제가 노용균 반점의 형성을 억제하며 치매 발병을 예방할 수 있다는 것이 중요한 예이다.

뇌신경 퇴행성 질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차원적인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 질환으로는 파킨슨 질환 (Parkinson's disease), 기억장애 또는 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease) 등이 있다.

이 중, 알츠하이머 질환은 노인성 치매의 가장 흔한 원인으로 알려져 있다. 치매 환자의 약 70 %는 알츠하이머성 치매 환자로 알려져 있으며, 수많은 연구들이 진행되면서 알츠하이머 질환에 관여하는 단백질들이 발견되고는 있으나 그 발병 원인은 아직 명확히 알려지지는 않은 상태이다. 이 질환에 소모되는 비용은 전 세계 GDP의 1 %를 차지할 정도로 사회 경제적 소모비용이 크며, 이는 꾸준히 증가할 전망이다. 그러나 수십 년간 지속된 연구에도 불구하고, 여전히 알츠하이머 질환을 일으키는 분자 유전학적 원인은 명확하게 규명되지 않고 있다. 알츠하이머 질환은 신경섬유매듭 (neurofibrilary tangle)의 축적이 점진적으로 뇌 전체에 확산되는 것이 특징이며, 이는 노인성 치매의 중증도와 밀접한 연관성이 있다.

종래 알츠하이머 치매의 인지증상 개선을 위한 약물로서 콜린 분해효소 억제제, 메만틴 및 항산화물질이 사용되고 있으며, 콜린 분해효소 억제제는 콜린 분해효소를 억제함으로써 시냅스에서 가용한 아세틸콜린의 양을 증가시키는 기전으로 작용하는데 환자의 인지증상 호전에 어느 정도 도움이 되는 것으로 알려져 있고, 메만틴은 뇌 피질과 해마의 신경세포들의 주된 흥분성 아미노산 신경 전달물질인 글루타메이트는 NMDA 수용체를 활성화시키며 학습과 기억 기능에 관여하고 경증보다는 중증의 알츠하이머에 효능을 보이는 것으로 알려져 있다. 그러나, 항산화물질에 대해 단가아민 산화효소 억제제인 셀레길린(selegiline)이나 비타민 E (tocopherol)의 항산화 효과가 알츠하이머 치매 환자의 악화를 막는 데에 도움이 되는가를 보기 위한 연구들이 수행되었으나, 그 결과는 일관성 있는 결론을 내리기 어려웠다.

한편, 임상시험 근거가 미약하지만 현실적으로 사용되고 있는 약물로서는 에스트로겐, 항염증 약물 등이 있다. 이 중 항염증 약물은 아밀로이드가 염증 반응을 유발하고, 미세아교세포를 활성화시키며, 사이토카인 분비를 촉진시킨다고 알려져 연구되었으며, 비스테로이드성 항염증 약물 복용시 알츠하이머 치매 발병위험을 낮춘다는 역학 연구들도 있었다.

그러나 임상시험 결과 아스피린을 포함한 여러가지 항염증 약물들이 알츠하이머 치매의 인지 저하를 막지 못하는 데다가, 약물 부작용이 더 흔하고, Cox-2 억제제의 경우 심혈관계 부작용의 위험성마저 있어 항염증 약물은 알츠하이머 치매의 예방이나 치료에 적합하지 않음을 확인할 수 있다.

특히, 알츠하이머와 같은 신경 퇴행성 뇌질환에서 나타나는 문제는 신경세포사멸에 의한 인지기능 저하 등이 있으며, 약물 처치에 의한 신경세포보호작용을 통한 인지기능 향상은 매우 중요한 이슈이다. 알츠하이머와 같은 신경 퇴행성 뇌질환의 치료에 있어서 신경세포 보호작용, 염증억제, 항산화 등의 효과를 갖는 신약의 개발뿐만 아니라 이미 알려진 약물들의 사용을 재해석하는 치료제 사용가능성 등에 대한 연구들도 활발히 진행되고 있다. 하지만, 현재까지 신경세포사멸의 억제를 위해 연구된 약물들은 글루타민산 수용체 길항제, 항산화제, 칼슘 혹은 나트륨 등의 이온 채널 차단제, 항염증제 등을 사용한 것이 대부분이며, 효과적인 약물이 개발되지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 부작용을 최소화하기 위해 천연 물질을 사용한 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 공심채 (Ipomoea aquatica)는 잎채소로 자라는 반수생적 열대 실물이다. 옹채, 죽협채, 통심채 또는 등채라고도 한다. 줄기 가운데가 비어 있기 때문에 공심채라는 이름이 붙었다. 아열대 기후 식물이며, 칼로리가 적어 다이어트 식품으로도 좋고, 빈혈에 좋은 철분이 많이 함유되어 있으며, 그 외에 무기질을 함유하고 있다. 또한, 항산화 효과가 있는 물질 (예를 들어, 비타민 A, 비타민 C, 폴리페놀, 클로로필 등)을 많이 포함하고 있다.

이에, 본 발명자들은 신경 퇴행성 질환에 효과가 있는 천연 추출물에 관한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명자들은 신경 퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 공심채 추출물이 신경 퇴행성 질환에 효과를 나타낸다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 공심채 추출물; 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 공심채 추출물; 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 공심채 추출물; 또는 이의 분획물의 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 공심채 추출물; 또는 이의 분획물의 신경 퇴행성 질환 개선, 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 공심채 (Ipomoea aquatica) 추출물; 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 명세서 상 “공심채”는 잎채소로 자라는 반수생적 열대 식물이다. 옹채,　죽협채,　통심채,　등채라고도 한다. 꽃은 작은 나팔꽃 모양이며, 잎은 심장형의 모습을 띠고, 줄기는 속이 빈 줄기의 형태를 지녔다. 중국 남부에서 동남아시아에 분포한다. 1년생 초본으로 물을 좋아하여 수생하여 줄기가 비게 되었는데 지금은 주로 물에서 가꾸지만 물가에서도 잘 자란다. 고온 다습한 조건을 좋아하여 생육에 적합한 온도는 25 내지 32 ℃ 정도이고, 일조량이 풍부한 곳이 좋다. 참흙에 다습한 토양조건이 좋으며, pH는 5.5 내지 6.5 범위이며, 땅이 건조하면 줄기가 거칠어져서 품질과 수량이 크게 떨어진다. 공심채 줄기가 30 내지 40 cm가량 자랐을 때, 줄기 밑동을 5 내지 6 마디 남기고 수확한다. 남겨진 5 내지 6 마디에서 새순이 재생하여 자라므로 가을 서리 올 때까지 5회 이상 수확이 가능하다. 씨를 직접 뿌릴 경우는 6월 중하순부터 서리오기전까지 수확이 가능하다. 공심채는 비타민A, B, C, E와 철분, 칼륨 등의 미네랄이 풍부해서 피로회복과 빈혈 예방에 도움이 된다. 살균 효과가 있는 테르펜도 함유하고 있어 염증을 예방한다.

본 발명에 있어서 공심채는 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 잎인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 “추출물”은 용매 조추출물을 포함하며, 상기 공심채 추출물은 용액, 농축물 또는 분말 상태일 수 있다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 용매로 알코올 함량이 10 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 95 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 85 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 75 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 95 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 85 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 75 %(v/v) 미만, 30 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 30 %(v/v) 이상 내지 95 %(v/v) 미만, 30 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 30 %(v/v) 이상 내지 85 %(v/v) 미만, 30 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 30 %(v/v) 이상 내지 75 %(v/v) 미만, 40 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 40 %(v/v) 이상 내지 95 %(v/v) 미만, 40 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 40 %(v/v) 이상 내지 85 %(v/v) 미만, 40 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 40 %(v/v) 이상 내지 75 %(v/v) 미만, 50 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 50 %(v/v) 이상 내지 95 %(v/v) 미만, 50 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 50 %(v/v) 이상 내지 85 %(v/v) 미만, 50 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 50 %(v/v) 이상 내지 75 %(v/v) 미만, 60 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 60 %(v/v) 이상 내지 95 %(v/v) 미만, 60 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 60 %(v/v) 이상 내지 85 %(v/v) 미만, 60 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 60 %(v/v) 이상 내지 75 %(v/v) 미만, 70 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 70 %(v/v) 이상 내지 95 %(v/v) 미만, 70 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 70 %(v/v) 이상 내지 85 %(v/v) 미만, 70 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 70 %(v/v) 이상 내지 75 %(v/v) 미만, 예를 들어, 70 %(v/v)의 알코올 수용액으로 추출하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 알코올 수용액은 메탄올 (methanol) 수용액, 에탄올(ethanol) 수용액, 이소프로판올 (isopropanol) 수용액, 프로판올 (propanol) 수용액 및 부탄올 (butanol) 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 용매로 무수 알코올로 추출하여 얻어진 추출물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 분획물은 에틸아세테이트, 에틸에테르 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분획한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 신경 퇴행성 질환은 예를 들어, 뇌신경 퇴행성 질환인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매 (Vascular dementia), 루이바디성 치매 (Lewy body dementia), 전두측두엽성 치매 (Frontotemporal dementia), 피질 기저 퇴행증 (Corticobassal degeneration), 파킨슨병, 다계통 위축증 (Multiple system atrophy), 헌팅턴병 (Huntington's chorea), 진핵성 핵상마비 (Progressive supranuclear palsy), 근위축성측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 원발성측삭경화증 (Primary laterial sclerosis), 척수근육위축 (Spinal muscular atrophy), 뇌염증 (Brain Inflammation) 및 뇌신경세포 사멸 (Neuronal cell death)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 양태는 신경 퇴행성 질환의 개선, 억제, 예방 또는 치료 활성을 갖는 공심채 추출물; 또는 이의 분획물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서 공심채는 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 잎인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 용매로 알코올 함량이 10 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만의 알코올 수용액, 예를 들어, 70 %(v/v) 알코올 수용액으로 추출하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 공심채 추출물의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:

공심채를 채취하여 물로 세척하여 협착물을 제거하고 건조하는 건조 단계;

상기 공심채를 파쇄 후 용매로 추출하는 추출물 추출 단계;

상기 추출물을 감압 농축하여 농축물을 제조하는 농축 단계; 및

상기 농축물을 동결 건조하여 분말을 모으는 건조 단계.

상기 추출 단계는 액체 또는 고체 원료 중에 포함되어 있는 유용한 가용성 성분을 용매에 녹여 분리하는 방법으로, 상온 추출, 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 증기 추출, 환류 냉각 추출, 감압 또는 가압 추출을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 환류 추출을 사용할 수 있다. 환류 추출은 추출 용기 윗부분에 냉각 장치가 부착되어 있어, 증발하는 용매를 냉각 및 응축시켜 용액에서 증발하는 용매의 양을 최소화 할 수 있다.

본 발명에 있어서 추출 단계는 공심채의 중량에 대하여 약 0.1 내지 1000 부피배, 바람직하게는 10 부피배의 용매로 추출물을 추출하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 추출 단계는 공심채를 30 내지 100 ℃, 30 내지 95 ℃, 30 내지 90 ℃, 30 내지 85 ℃, 30 내지 80 ℃, 30 내지 75 ℃, 30 내지 70 ℃, 30 내지 65 ℃, 30 내지 60 ℃, 30 내지 55 ℃, 30 내지 50℃, 35 내지 100 ℃, 35 내지 95 ℃, 35 내지 90 ℃, 35 내지 85 ℃, 35 내지 80 ℃, 35 내지 75 ℃, 35 내지 70 ℃, 35 내지 65 ℃, 35 내지 60 ℃, 35 내지 55 ℃, 35 내지 50℃, 40 내지 100 ℃, 40 내지 95 ℃, 40 내지 90 ℃, 40 내지 85 ℃, 40 내지 80 ℃, 40 내지 75 ℃, 40 내지 70 ℃, 40 내지 65 ℃, 40 내지 60 ℃, 40 내지 55 ℃, 30 내지 50℃, 45 내지 100 ℃, 45 내지 95 ℃, 45 내지 90 ℃, 45 내지 85 ℃, 45 내지 80 ℃, 45 내지 75 ℃, 45 내지 70 ℃, 45 내지 65 ℃, 45 내지 60 ℃, 45 내지 55 ℃, 45 내지 50 ℃, 예를 들어, 50 ℃의 온도 조건으로 추출하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 추출 단계는 공심채를 30분 내지 5시간, 30분 내지 4시간 30분, 30분 내지 4시간, 30분 내지 3시간 30분, 30분 내지 3시간, 1시간 내지 5시간, 1시간 내지 4시간 30분, 1시간 내지 4시간, 1시간 내지 3시간 30분, 1시간 내지 3시간, 1시간 30분 내지 5시간, 1시간 30분 내지 4시간 30분, 1시간 30분 내지 4시간, 1시간 30분 내지 4시간, 1시간 30분 내지 3시간 30분, 1시간 30분 내지 3시간, 2시간 내지 5시간, 2시간 내지 4시간 30분, 2시간 내지 4시간, 2시간 내지 3시간 30분, 2시간 내지 3시간, 2시간 30분 내지 5시간, 2시간 30분 내지 4시간 30분, 2시간 30분 내지 4시간, 2시간 30분 내지 3시간 30분, 2시간 30분 내지 3시간, 예를 들어, 3시간 동안 추출하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 농축 단계는 액체 함량이 높은 액상 물질의 액체를 제거하여 고형물의 농도를 높이는 것으로, 감압 농축법을 사용하였다.

상기 감압 농축법은 감압하여 용매의 끓는점을 내려 용매를 빠르게 증발시켜 용액의 용질 농도를 높이는 것이다.

상기 건조 단계는 열풍 건조 (AD), 냉풍 건조, 진공 건조 (VacuuM Dry, VD), 분무 건조 (Spray Dry, SD) 및 동결 건조 (Freeze Dry, FD)로 수행할 수 있으며, 바람직하게는 동결 건조를 사용할 수 있다. 동결 건조는 물질을 동결 시키고, 수증기의 부분압을 낮춰 얼음을 직접 증기로 승화시킴으로써, 용매를 제거하는 방법이다. 동결 건조 방법은 열에 민감한 물질의 손상을 최소화하고, 비활성화 하며, 수분의 침투가 용이하고 부스러지기 쉬운 구조이며, 정밀하고 깨끗한 충진이 가능하며, 빠르고 완벽한 재수화 (Rehydration)가 가능하다는 장점이 있다.

본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예를 들어, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 초음파 추출법, 용출법 또는 압착법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출 방법으로 추출된 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 추출 방법으로 추출된 추출물은 통상의 정제방법을 사용하여 정제될 수 있다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 상기 추출 방법으로 추출된 추출물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조의 추가과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물의 제조방법은 다음과 같은 분획 단계를 포함하는 것일 수 있다:

공심채 추출물을 용매로 분획하는 분획 단계.

본 발명에 있어서 분획 단계는 에틸아세테이트, 에틸에테르 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분획하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 에틸아세테이트로 분획하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 분획 단계는 감압 농축 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 분획 단계는 동결 건조 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 상기 추출 방법으로 추출된 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피 (Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (High performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

본 발명에 있어서 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 공심채 추출물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예를 들어, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 음료는 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 총 조성물 대비 0.001 내지 20.0 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서 식품 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다.

본 발명에 있어서 식품 조성물은 “건강기능성식품 조성물”인 것일 수 있으며, 건강기능성식품 조성물은 건강기능성식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 건강기능성식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형 할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

특히, 본 발명의 조성물을 인체에 투여하는 경우 천연추출물의 일반적 특성에 비추어 볼 때 다른 합성 의약품에 비해 부작용의 염려가 없을 것으로 사료되며, 실제로 규격화된 생약 조성물에 대한 독성 시험 결과 생체에 아무런 영향이 없는 것으로 판명되었다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 공심채 (Ipomoea aquatica) 추출물; 또는 이의분획물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 용매로 알코올 함량이 10 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 예를 들어, 70 %(v/v)의 알코올 수용액으로 추출하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 공심채 추출물은 용매로 무수 알코올로 추출하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매 (Vascular dementia), 루이바디성 치매 (Lewy body dementia), 전두측두엽성 치매 (Frontotemporal dementia), 피질 기저 퇴행증 (Corticobassal degeneration), 파킨슨병, 다계통 위축증 (Multiple system atrophy), 헌팅턴병 (Huntington's chorea), 진핵성 핵상마비 (Progressive supranuclear palsy), 근위축성측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 원발성측삭경화증 (Primary laterial sclerosis), 척수근육위축 (Spinal muscular atrophy), 뇌염증 (Brain Inflammation) 및 뇌신경세포 사멸 (Neuronal cell death)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 공심채 추출물의 약학적 유효량 및/또는 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 명세서상의 용어 “약학적 유효량”은 상술한 공심채 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 사용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 혼합 추출물 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calciuM carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 연고제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 제제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 생약 추출물 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 생약 추출물 함유 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제 (예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔 (witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유 (apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있다.

본 발명의 공심채 추출물 포함 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명의 공심채 추출물 함유 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예를 들어, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.001 내지 2 g/kg, 바람직하게는 0.5 내지 500 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.

본 발명의 공심채 추출물 함유 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 (Ipomoea aquatica) 추출물 (70% EtOH) 및 공심채 에틸아세테이트 분획물 (EA)을 농도별로 처리한 BV2 세포의 세포 생존율 (%)을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 70% 에탄올 추출물 및 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리한 BV2 세포의 세포 내 일산화질소 농도을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 70% 에탄올 추출물 및 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리한 BV2 세포의 iNOS의 발현양을 비교하여 보여주는 사진이다.
도 4는 발명의 일 실시예에 따른 공심채 70% 에탄올 추출물 및 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리한 BV2 세포의 iNOS의 발현양을 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리한 BV 세포의 COX-2 및 IL-1ß의 발현양을 비교하여 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리한 BV2 세포의 COX-2/ß-actin의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리한 BV2 세포의 IL-1ß/ß-actin의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 70% 에탄올 추출물을 처리한 BV2 세포의 p-ERK/ERK의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 공심채 추출물을 처리한 BV2 세포의 p-p38/p38의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 공심채 추출물을 처리한 BV2 세포의 p-JNK/JNK의 비율을 보여주는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 공심채 추출물을 처리한 BV2 세포의 p-65/p65의 비율을 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 공심채 지상부의 에탄올 추출물의 제조

공심채 지상부 (부위; 잎, 줄기)는 2021년 4월 경기도 안산시에서 채취하였다. 구체적으로, 공심채 지상부 3 kg을 건조 후 파쇄하여, 70 %(v/v) 에탄올 30 L에 넣고, 50 ℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출 과정은 총 2회 반복하였다.

얻어진 상등액을 No.2 정성 여과지 (8 uM, Whatman사)로 여과하여 에탄올 추출액을 얻었다. 수득한 에탄올 추출액은 회전감압농축기 (Rotary Evaporator, N-1000, Eyela사, Tokyo, Japan)를 사용하여 45 ℃에서 감압 농축 후 동결 건조하여 제조된 고형 추출물을 -20 ℃에 보관하였다.

제조예 2. 공심채 에틸아세테이트 분획물의 제조

동결 건조된 공심채 70% 에탄올 추출물 200 mg을 증류수 200 mL에 녹였다. 그 다음, 에틸아세테이트 200 mL을 가하여 분획을 하였다. 분획 후 얻어진 에틸아세테이트 분획물은 감압 농축 및 동결 건조하여 -20 ℃에 보관하였다.

제조예 3. BV2 세포의 배양

마우스 BV2 세포는 경희대학교 의과대학 생리학 교실에서 분양 받았다. 분양받은 BV2 세포는 10 % 가열-불활성화된 소태아혈청 (heat-inactivated Fefal Bovine SeruM, Highclone사, Logan, UT)이 첨가된 DMEM 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's MediuM, 10 units/mL penicillin 및 10 ug/mL streptomycin 포함, Gibco사, Rockville, MD, USA)에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양하였다.

실시예 1. 세포 생존율 측정

BV2 세포를 96-well plate에 3×10⁴ cells/well로 분주하여 세포 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 다음, 상등액을 모두 제거하고 대식세포를 자극할 때 사용하는 물질인 LPS (Lipopolysaccharide, 그람 음성균 표면에 있는 지질 다당체) 0.1 ug/mL과 각각의 공심채 70% 에탄올 추출물 10, 50 및 100 ug/mL 및 공심채 에틸아세테이트 분획물 10, 50 및 100 ug/mL를 처리하여 추가로 24시간 동안 배양하였다. 실험의 대조군은 BV2 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군 1과 LPS 0.1 ug/mL만 처리한 대조군 2를 함께 비교하였다. 다만, 공심채 70% 에탄올 추출물을 200 ug/mL 농도로 처리한 군에서 세포 독성이 나타나서 200 ug/mL 농도로 공심채 70% 에탄올 추출물을 처리한 군은 제외하고 실험을 수행하였다.

각각의 공심채 70% 에탄올 추출물 및 공심채 에틸아세테이트 추출물을 처리한 군에 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliuM bromide, Sigma-Aldrich 사, St. Louis, MO, USA) 시약 0.1 mg/mL을 처리하여 3시간 동안 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양한 후, 동량의 DMSO (Dimethylsulfoxide)에 녹여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기와 같은 계산식을 사용하여 세포 생존율을 계산하고, 그 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

[계산식 1]

세포 생존율(%)=(시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도) X 100

		세포 생존율 (%)
대조군 1		100
대조군 2		100
공심채 70% 에탄올 추출물	10 ug/mL	98.8
	50 ug/mL	98.5
	100 ug/mL	97.2
공심채 에틸아세테이트 분획물	10 ug/mL	96.6
	50 ug/mL	94.6
	100 ug/mL	53.6

표 1 및 도 1에서 확인할 수 있듯이, 대조군 1 (아무것도 처리하지 않은 정상군)을 100 %를 나타내었고, 대조군 2는 세포가 사멸되면 NO가 세포에서 생성되지 않기 때문에, LPS 처리시 세포사멸이 일어나지 않을 정도의 농도에서 실험하였으며, 세포 생존율은 100 %를 나타내었다.

공심채 70 % 에탄올 추출물 10, 50, 100 ㎍/㎖과 대조군 2를 동시에 처리한 군의 세포생존율은 각각 98.8 %, 98.5 %, 97.2 %를 나타내었다. 그리고 공심채 에틸아세테이트 추출물 10, 50, 100 ㎍/㎖과 대조군 2를 동시에 처리한 군의 세포생존율은 각각 96.6 %, 94.6 %, 53.6 %를 나타내었다. 다만, 공심채 에틸아세테이트 추출물 100 ㎍/㎖는 세포 독성이 있는 것으로 확인되어 평가에서 제외하였다.

실시예 2. 일산화 질소 생성량 측정

BV2 세포를 96-well plate에 3×10⁴ cells/well로 분주하여 세포 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 다음, 상등액을 모두 제거하고 대식세포를 자극할 때 사용하는 물질인 LPS (Lipopolysaccharide, 그람 음성균 표면에 있는 지질 다당체) 0.1 ug/mL과 각각의 공심채 70% 에탄올 추출물 10, 50 및 100 ug/mL 및 공심채 에틸아세테이트 분획물 10, 50 및 100 ug/mL를 처리하여 추가로 24시간 동안 배양하였다. 실험의 대조군은 BV2 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군 1과 LPS 0.1 ug/mL만 처리한 대조군 2를 함께 비교하였다.

일산화 질소 (Nitric Oxide, NO)의 생성량을 측정하기 위해 상등액과 Griess 시약 (Griess reagent, Sinma-Aldrich사, St.Loios, MO, USA)를 1:1 비율로 15분간 암실에서 반응시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 스탠다드로 NaNO₂ 표준 곡선을 산출하였으며, 그 결과를 비교하여 표 2 및 도 2에 나타내었다.

		일산화질소 (단위: μM)
대조군 1		0.70
대조군 2		15.1
공심채 70% 에탄올 추출물	10 ug/mL	13.9
	50 ug/mL	6.5
	100 ug/mL	1.87
공심채 에틸아세테이트 분획물	10 ug/mL	12.1
	50 ug/mL	0.65
	100 ug/mL	2.01

표 2 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, BV2 cell에서 대조군 1 (아무것도 처리 하지 않은 대조군)은 일산화질소 농도가 0.70 μM이 였으며, 대조군 1에 비해 대조군 2 (LPS 0.1 ug/mL만 처리한 대조군)는 일산화질소 생성량이 15.1 μM로 증가하였다. 또한, BV2 cell에 공심채 70 % 에탄올 추출물을 50 ㎍/㎖ 농도 처리 시 일산화질소 농도는 6.5 μM, BV2 cell에 공심채 에틸아세테이트 분획물을 50 ㎍/㎖ 농도 처리 시 일산화질소 농도는 0.65 μM로 나타났다.

또한, BV2 cell에 공심채 70 % 에탄올 추출물을 100 ㎍/㎖로 처리시, 일산화질소 농도는 1.87 μM로 감소되었다. 반면, BV2 cell에 공심채 에틸아세테이트 추출물은 100 ㎍/㎖로 처리시 일산화질소 농도는 2.01 μM로 감소하였으며, 세포 생존율에서 독성이 나타났으므로 100 ㎍/㎖는 평가에서 제외하였다.

이를 통해, 공심채 에틸아세테이트 추출물이 공심채 70 % 에탄올 추출물보다 일산화질소 생성을 더 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. iNOS, COX-2 및 IL-1β 단백질 발현 측정

염증 반응 시 염증 매개인자인 iNOS (inducible nitric oxide synthase), COX-2 (cyclooxygenase-2) 및 IL-1β (Interleutkin 1 beta)는 발현이 증가한다. BV2 세포의 생존율에 유의적 변화 없이 염증만 유발할 수 있는 LPS 0.1 ug/mL을 처리하고, 공심채 추출물 또는 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리하였을 때의 단백질 발현양의 변화 (단백질 발현양/ß-actin 발현양)를 웨스턴 블롯 (Western Blot)으로 확인하였다. ß-actin은 세포 골격을 이루는 사이토스켈레톤 (cytoskeleton)의 구성요소로 대부분의 세포에서 고르게 발현하고 외부조건에 잘 변하지 않고 일정정도의 높은 발현값을 보이므로 각 단백질의 발현양을 ß-actin의 발현양과 비교하여 비율을 산출하였다. 구체적인 실험은, BV2 세포를 96-well plate에 3×10⁴ cells/well로 분주하여 세포 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 다음, 상등액을 모두 제거하고 대식세포를 자극할 때 사용하는 물질인 LPS (Lipopolysaccharide, 그람 음성균 표면에 있는 지질 다당체) 0.1 ug/mL과 각각의 공심채 70% 에탄올 추출물 50 ug/mL 및 공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL를 처리하여 추가로 24시간 동안 배양하였다. 실험의 대조군은 BV2 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군 1과 LPS 0.1 ug/mL만 처리한 대조군 2를 함께 비교하였다.

배양한 세포를 PBS로 1회 세척하고 스크레이퍼를 사용하여 세포를 회수 하여 5000 rpm에서 15분간 원심 분리를 하였다. 그 다음, 상등액은 제거하고 세포에 Pro-prep (iNtRON biotechnology사, 성남, 한국)을 사용하여 용해 (lysis)한 뒤, 얼음에 30분간 두었다. 그 다음, 13000 rpm에서 20분간 원심 분리를 하여, 분리된 상층액을 취하여 총 단백질을 얻었다. 그 다음, 총 단백질은 브레드-포드 방법 (Brad-ford assay, Bio-Rad Laboratories사, Hercules, California, USA)을 사용하여 정량하였다. 그 다음, 총 단백질과 LDS 샘플 버퍼 (2x)를 섞은 후, 10 % SDS-PAGE에 전기 영동 한 후, 5 % 스킴 밀크 (skim milk, PBST (0.1 % Tween-20을 포함하는 PBS))로 1시간 동안 블록킹 (blocking)을 하였다. 대조군인 β-actin 1:3000 (sc-47778)과 측정하고자 하는 단백질인 iNOS 1:3000 (13120s), COX-2 1:3000 (12282s) 및 IL-1β (ab9722) 1차 항체를 4 ℃에서 오버나잇 (overnight) 하였다. 그 다음, TBST (1X Tris-Buffered Saline containing 0.1 % Tween-20)에 희석한 2차 항체를 상온에서 60분간 반응 후, TBST로 세척하여 ECL 웨스턴 블롯팅 기질 (ECL Western Blotting Substrate)과 반응시키고, 이미지 어날라이저 (image analyzer, ChemiDocXRS+imaging system, Bio-Rad사, Ca, USA)에서 단백질을 검출하였으며, 이미지 J 소프트웨어 (NIH, MD, USA)를 사용하여 단백질 발현양을 측정하여 그 결과를 하기 표 3 및 도 3 내지 7에 나타내었다.

비율 (%)	대조군 1	대조군 2	공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL	공심채 추출물 50 ug/mL
iNOS/β-actin	1.0	3.94	0.16	0.68
COX-2/β-actin	1.0	17.1	0.48	-
IL-1β/β-actin	1.0	1.24	0.4	-

표 3 및 도 3 내지 7에서 확인할 수 있듯이, iNOS는 대조군 1 (아무것도 처리하지 않은 군)에 비해 대조군 2 (LPS 처리한 군)에서 약 3.94배 단백질 발현량이 증가하였으며, 공심채 에틸아세테이트 추출물 50 ㎍/㎖을 처리 시 약 0.16배 단백질 발현량이 감소되었다. 반면, 공심채 추출물 50 ㎍/㎖을 처리 시 약 0.68배 단백질 발현량이 감소되었다.

COX-2의 발현양은 대조군 1 (아무것도 처리하지 않은 군)에 비해 대조군 2 (LPS를 0.1 ug/mL 처리한 군)에서 약 17.1 배 단백질 발현양이 증가하였다. 반면, COX-2의 발현양은 대조군 2 대비 LPS 0.1 ug/mL과 공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL을 처리한 군에서는 약 0.48 배 감소하였다.

또한, IL-1ß 발현양은 대조군 1 (아무것도 처리하지 않은 군)에 비해 대조군 2 (LPS를 0.1 ug/mL 처리한 군)에서 약 1.24 배 단백질 발현양이 증가하였다. 반면, IL-1ß의 발현양은 대조군 2 대비 LPS 0.1 ug/mL과 공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL을 처리한 군에서는 약 0.4 배 감소하였다.

실시예 4. MAPKs 관련 단백질 발현 측정

유사분열물질 단백질 인산화 효소 (Mitogen activated protein kinases; 이하, MAPKs)는 세포의 증식과 분화를 포함하는 다양한 면역반응을 조절하며, 특히 외부 감염에 의해 활성화되어 염증 매개 물질들의 생성을 유도하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. BV2 세포의 생존율에 유의적 변화 없이 염증만 유발할 수 있는 LPS 0.1 ug/mL을 처리하고, 공심채 에틸아세테이트 분획물을 처리하였을 때의 단백질 발현양의 변화 (단백질 발현양/ß-actin 발현양)를 웨스턴 블롯 (Western Blot)으로 확인하였다.

구체적인 실험방법은 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 4 및 도 8 내지 11에 나타내었다.

단위: 비율(%)	대조군 1	대조군 2	공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL
p-ERK/ERK	1	2.26	0.54
p-p38/p38	1	1.44	1.22
p-JNK/JNK	1	2.57	0.41
p-p65/p65	1	2.43	0.71

표 4 및 도 8 내지 11에서 확인할 수 있듯이, p-ERK 단백질 발현양은 아무것도 처리하지 않은 대조군 1에 비해 LPS를 0.1 ug/mL 처리한 대조군 2에서 약 2.26배 증가하였으며, 대조군 1 대비 공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL을 처리하였을 때는 약 0.54 배 단백질 발현양이 증가됨을 나타내었다.

p-p35 단백질 발현양은 대조군 1에 비해 대조군 2에서 약 1.44배 증가하였으며, 대조군 1 대비 공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL을 처리하였을 때는 약 1.22 배 단백질 발현양이 증가됨을 나타내었다.

p-JNK 단백질 발현양은 대조군 1에 비해 대조군 2에서 약 2.57배 증가하였으며, 대조군 1 대비 공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL을 처리하였을 때는 약 0.41 배 단백질 발현양이 증가됨을 나타내었다.

p-p65 단백질 발현양은 대조군 1에 비해 대조군 2에서 약 2.43배 증가하였으며, 대조군 1 대비 공심채 에틸아세테이트 분획물 50 ug/mL을 처리하였을 때는 약 0.71 배 단백질 발현양이 증가됨을 나타내었다.

이를 통해, 대조군 2 (LPS 0.1 ug/mL 처리)된 BV2 세포에서 ERK, p38, JNK 및 p65의 인산화(phosphorylation)가 전반적으로 강하게 유도되었으나, 공심채 에틸아세트테이트 추출물과 LPS 동시 처리군에서는 ERK, p38, JNK 및 p65의 인산화가 현저히 억제되는 것으로 나타났다.

Claims

공심채 (Ipomoea aquatica) 추출물;
또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 공심채는 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 공심채 추출물은 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제3항에 있어서, 상기 공심채 추출물은 용매로 알코올 함량이 10 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만의 알코올 수용액; 또는 무수 알코올로 추출하여 얻어진 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 분획물은 에틸아세테이트, 에틸에테르 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분획한 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매 (Vascular dementia), 루이바디성 치매 (Lewy body dementia), 전두측두엽성 치매 (Frontotemporal dementia), 피질 기저 퇴행증 (Corticobassal degeneration), 파킨슨병, 다계통 위축증 (Multiple system atrophy), 헌팅턴병 (Huntington's chorea), 진핵성 핵상마비 (Progressive supranuclear palsy), 근위축성측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 원발성측삭경화증 (Primary laterial sclerosis), 척수근육위축 (Spinal muscular atrophy), 뇌염증 (Brain Inflammation) 및 뇌신경세포 사멸 (Neuronal cell death)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
공심채 (Ipomoea aquatica) 추출물;
또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 공심채는 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 공심채 추출물은 물, 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 공심채 추출물은 용매로 알코올 함량이 10 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만의 알코올 수용액; 또는 무수 알코올로 추출하여 얻어진 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 분획물은 에틸아세테이트, 에틸에테르 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분획한 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 질환은 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease), 알츠하이머성 치매, 혈관성 치매 (Vascular dementia), 루이바디성 치매 (Lewy body dementia), 전두측두엽성 치매 (Frontotemporal dementia), 피질 기저 퇴행증 (Corticobassal degeneration), 파킨슨병, 다계통 위축증 (Multiple system atrophy), 헌팅턴병 (Huntington's chorea), 진핵성 핵상마비 (Progressive supranuclear palsy), 근위축성측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis), 원발성측삭경화증 (Primary laterial sclerosis), 척수근육위축 (Spinal muscular atrophy), 뇌염증 (Brain Inflammation) 및 뇌신경세포 사멸 (Neuronal cell death)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 신경 퇴행성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.