KR20230092708A - 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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이윤미
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Abstract

본 발명은 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암 또는 염증 예방 또는 개선용 건강기능성 식품에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER OR INFLAMMATORY DISEASE}
본 발명은 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 비정상적인 세포의 과잉으로 인하여 발생하는 비제어적이고 무질서한 세포 증식의 산물로서, 악성 종양(malignant tumor)은 원발부를 떠나 다른 조직으로 침윤되어 빠르게 성장하는 특성을 가져 생명을 위협한다.
암을 치료하기 위해서, 다양한 항암제를 이용한 화학요법, 방사선요법, 암과 관련된 특정생체 내 분자를 표적으로 하는 항체요법 등 다양한 치료적 접근법이 시도되고 있다. 그러나 화학요법이나 방사선요법의 경우 정상 세포에도 영향을 주기 때문에 부작용이 심각하며, 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득하여, 치료에 실패하거나 재발하는 경우가 빈번하다.
최근 연구 보고에 따르면 세포외 소포체가 세포 간 신호 전달 및 폐기 관리와 같은 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되어 있어, 최근 임상 적용에 대한 관심이 증가하고 있다. 특정 세포외 소포체와 표적세포 세포막의 특성을 이용하면 다른 정상 세포에 대한 부작용을 예방하고 암세포를 비롯한 질환 세포만을 특이적으로 치료할 수 있는 치료제의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
한편, 면역력 강화 등 체내 유익한 작용을 하는 프로바이오틱스 (probiotics)와 면역 관문 억제제의 병용요법 효과에 대한 연구가 파마바이오틱스 (pharmabiotics) 차원에서 그 중요성이 강조되고 있으나, 지금까지 다양한 암종에서의 이와 관련된 연구는 아직 미비한 실정이다.
KR 10-2019-0129739 A KR 10-2307603 B
본 발명은 상술한 기술적 과제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 하나의 목적은 파마바이오틱스 유래의 세포외 소포체를 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물 또는 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 파마바이오틱스 유래의 세포외 소포체에 의해서 환자의 면역 체계를 활성화시킴으로써 환자의 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은,
아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 아커만시아 속 균주는 아커만시아 뮤시니필라 (Akkermansia miciniphila) 균주이고, 바람직하게 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 (KCTC13765BP)일 수 있다.
본 발명의 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 화학항암제 또는 면역항암제와 같은 암 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역항암제는 anti-PD1, anti-PDL1, anti-CTLA, anti-Tim3 및 anti-LAG3으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)와 화학항암제 또는 면역항암제는 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 또는 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은, 대상체에게 치료 유효량의 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체(EV)를 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은, 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 양상은 신규한 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 (KCTC13765BP)에 관한 것이다.
본 발명의 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 전이를 예방하거나, 혈관신생을 예방하여, 효과적인 항암제로 개발될 수 있을 것이다.
본 발명의 아커만시아 속 균주를 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 단독으로 투여 시에 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 화학항암제 또는 면역항암제와 병용투여 시에, 항암제의 부작용은 줄이고 효능은 더욱 활성화되어, 이들을 단독으로 투여하는 것과 비교하여 더욱 우수한 항암효과를 갖는다.
본 발명의 약학적 조성물은 염증 유발 사이토카인 유전자들인 TNF-α, IL-6 및 IL-8의 발현을 억제하는 효과가 우수하여, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주(KCTC13765BP)와 표준균주(type strain)인 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 균주의 현미경 관찰 결과이다.
도 2는 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주와 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 균주의 PCR 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주와 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 균주의 게놈 DNA의 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 분석 결과이다.
도 4는 16S rRNA 서열을 기반으로 한 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 계통도이다.
도 5는 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주와 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 균주의 용혈활성 보유 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6(a) 및 (b)는 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래 세포외 소포체(EV)의 항암 활성을 확인하기 위한 실시예 4 및 실시예 5의 동물 실험 과정을 설명하기 위한 모식도이다.
도 7 및 도 8은 종양을 동종이식한 마우스에서 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주와 anti-PD1 병용 투여 시의 종양 형성 억제 효과를 나타내는 도면으로, 동종이식 항암 동물 모델에서 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 4에서 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주와 anti-PD1 병용 투여 시의 암 발생 억제 효과를 측정하기 위해 동종이식 항암 동물 모델에서, 20일간 각각의 실험군의 마우스의 종양 크기를 비교한 사진이다.
도 10은 실시예 5에서 시험 물질 투여에 따른 종양 내 CD4, Foxp3, CD8의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 실시예 5에서 종양 내 CD4, Foxp3 및 CD8에 대한 면역조직화학염색에 대한 그래프이다.
도 12는 동종이식 항암 동물 모델에 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래 세포외 소포체와 anti-PD1을 함께 투여한 경우 및 anti-PD1만을 투여한 경우의, 25일 동안 종양의 무게 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 도 12의 각 실험군의 마우스의 종양 크기를 비교한 사진이다.
도 14는 실시예 6에서 시험 물질 투여에 따른 종양 내 CD4, Foxp3, CD8의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 15는 실시예 6에서 종양 내 CD4, Foxp3 및 CD8에 대한 면역조직화학염색에 대한 그래프이다.
도 16은 실시예 7에서 흑색종을 이용한 동종이식 마우스 동물 모델에서 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 생균 또는 EV에 의한 단독 항암 효과 비교 실험의 투여 일정을 나타낸 도면이다.
도 17은 실시예 7에서 시험물질 농도에 따른 B16-F10 종양 성장 곡선이다.
도 18은 실시예 7에서 시험 물질 투여에 따른 종양 무게를 나타낸 그래프이다.
도 19는 실시예 7에서 시험물질 투여에 따른 종양의 사진이다.
도 20은 실시예 8에서 시험 물질 투여에 따른 종양 내 CD4, Foxp3, CD8의 면역조직화학염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 21은 실시예 8에서 종양 내 CD4, Foxp3 및 CD8에 대한 면역조직화학염색에 대한 그래프이다.
도 22a 및 도 22b는 HT29 세포에서 상처 치유 분석법을 이용한 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래 세포외 소포체의 항암활성 평가 결과를 나타낸다.
도 23은 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래 세포외 소포체(EB-AMDK39 EV)의 항염증 효과를 측정하기 위해 염증전 사이토카인인 IL-8 mRNA의 발현을 비교한 사진이다.
이하에서 첨부 도면을 참조하여 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 '포함한다'고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본 발명의 약학적 조성물이 암의 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는, 인간 또는 비-인간을 포함한 임의의 유기체를 의미한다. 전형적 대상체는 인간이고, 이외에도 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 사슴, 비-인간 영장류를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료하다", "치료" 등의 용어들은 일시적 또는 영구적으로 증상을 완화하거나, 증상의 원인을 제거하거나, 또는 질병이나 병태의 증상의 발현을 방지하거나 늦추는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암 또는 염증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "개선"은 비정상적인 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제점 또는 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체(예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 조성물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는데, 이들 단백질들은 면역반응을 억제하고, T 림프구가 암세포를 살상하는 것을 방지한다. "면역 관문 억제제"로 현재까지 잘 알려진 것은 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2 등이 존재한다.
본원에 사용된 용어 "병용 요법"은 대상체가 2종 이상의 치료법 (예를 들어, 2종 이상의 치료제)에 동시에 노출되는 것인 임상적 개입을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2종 이상의 치료법은 동시에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 2종 이상의 치료법은 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 2종 이상의 치료법은 중첩 투약 요법으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 병용 요법의 2종 이상의 치료제들은 대상체에게 별도로, 예를 들어 별도의 조성물로, 별도의 투여 경로를 통해 (예를 들어, 한 작용제는 경구로 및 또 다른 작용제는 정맥내로), 및/또는 상이한 시점에서 투여된다. 일부 구현예에서, 2종 이상의 치료제들은 조합 조성물로, 동일한 투여 경로를 통하거나 동일한 시점에서 투여될 수 있다.
본 발명의 하나의 양상은, 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
파마바이오틱스 (pharmabiotics)는 건강 또는 질병에 대하여 검증된 약학적 역할(pharmacological role)을 갖는 사람 유래의 세균 또는 그의 산물들로 정의된다 ('Probiotics and pharmabiotics,' Bioeng Bugs. 2010 Mar-Apr; 1(2): 79-84.). 본 발명의 약학적 조성물은 파마바이오틱스 성분을 주성분으로 하여, 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있다.
상기 아커만시아 속 균주는 아커만시아 뮤시니필라 (Akkermansia miciniphila) 균주일 수 있다. 구체적으로 상기 아커만시아 속 균주는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 (KCTC13765BP)일 수 있다.
세포외 소포체(extracellular vesicles, EV)는 세포들로부터 분비되는 20~300 nm 크기의 나노소포체로, 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직 적합체(main histocompatibility complex, MHC)와 열 충격 단백질(heat shock protein)을 포함하여 강력한 항종양 면역 반응을 유도하며, 항염증성의 마이크로 RNA(microRNA)와 콜라겐(collagen)의 축적을 조절하는 마이크로 RNA(microRNA)를 포함한다.
본 발명의 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)는 암세포 증식 억제, 암세포 이동성 저하 및 신혈관 생성 억제 효과를 동시에 나타내어 우수한 항암제로 활용될 수 있으며, 기존의 화학항암제 또는 면역항암제와 병용투여될 수 있다.
본 발명의 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)는 상기 화학항암제 또는 면역항암제와 하나의 제제로 동시에 투여되거나, 또는 별개의 제제로 동시에 또는 순차로 투여될 수 있다.
본 발명에서 세포외 소포체를 분리하는 방법에는 제한이 없으며, 예를 들면 배양액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동, 폴리머를 이용한 분리 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 분리할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리/초원심분리에 의해 분리할 수 있다. 이때, 원심분리/초원심분리는, 100~300,000g, 바람직하게 150~150,000g에서 순차적으로 원심분리를 수행하여 세포찌꺼기, 비-세포외 소포체 분획, 죽은 세포 등을 제거할 수 있다.
분획 원심 분리: 세포외 소포체의 가장 바람직한 방법은 분획 원심 분리이다. 이 방법은 몇 개의 단계로 구성되며, 바람직하게는 약 4℃에서 수행되고 적어도 이하의 단계 1) 내지 단계 3)을 포함한다:
단계 1) 세포 및 세포 잔여 쓰레기를 제거하기 위한 저속 원심 분리,
단계 2) 100 nm 초과의 큰 소포를 제거하기 위한 고속 스핀, 및
단계 3) 세포외 소포체를 펠릿화하는 고속 원심 분리.
밀도 구배 원심분리 :이 접근법은 초원심 분리와 자당 밀도 구배를 조합한다. 보다 구체적으로는 밀도 구배 원심 분리를 사용하여, 비소포성 입자, 예를 들면 단백질 및 단백질/RNA 응집체에서 세포외 소포체를 분리한다. 따라서 이 방법은 다른 밀도의 입자에서 소포를 분리한다.
사이즈 배제 크로마토그래피: 사이즈 배제 크로마토그래피는 분자량이 아니고 크기에 기반하여 거대 분자를 분리하기 위해 사용된다. 이 기술은 복수의 세공 및 터널을 포함한 다공질 폴리머 비즈를 충전한 컬럼을 적용한다. 분자는 그 직경에 따라 비즈를 통과한다. 작은 반경의 분자가 컬럼의 세공을 통해 이동하려면 보다 시간이 소요되는 이 거대분자는 컬럼에서 더욱 빨리 용출된다. 사이즈 배제 크로마토그래피는 대분자와 소분자의 정확한 분리를 가능하게 한다.
여과: 한외 여과막을 세포외 소포체의 단리에 사용할 수도 있다. 미세소포의 크기에 의존하여 이 방법은 단백질 및 기타 거대 분자로부터의 세포외 소포체의 분리를 가능하게 한다.
폴리머 기반의 침전: 폴리머 기반의 침전법은 일반적으로 생체액과 폴리머 함유 침전액과의 혼합, 4℃에서의 인큐베이션 및 저속에서의 원심 분리를 포함한다. 폴리머 기반의 침전에 사용되는 가장 일반적인 폴리머의 하나는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다. 이 폴리머에 의한 침전은 단리 세포외 소포체에 대한 온화한 영향 및 중성 pH 사용을 포함한 많은 이점을 가진다.
체가름에 의한 단리: 이 기술은 막을 통해 생체액에서 세포외 소포체를 체가름하고 그리고 압력 또는 전기영동에 의해 여과를 함으로써 세포외 소포체를 단리한다.
본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료에 우수한 효과를 가진다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 아래의 특성들 가운데 하나 이상의 특성을 만족할 수 있다:
(a) 종양 내 CD8+ T 세포 수준을 증가시킴;
(b) 종양 내 조절 T 세포 수준을 감소시킴;
(c) 종양 내 대식세포 수준을 증가시킴;
구체적으로, 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(이하 'EB-AMDK39 EV'로 약칭함)는 암세포로 흡수되며, EMT 작용을 억제하고 면역시스템을 활성화하여 암세포의 침투 및 전이를 억제한다. EB-AMDK39 EV는 T 세포를 조절하여 선천적 및 후천적 면역시스템이 활성화 시키는 데 중요한 역할을 한다. 더불어 Foxp3의 발현을 특징으로 하는 조절 T 세포 (Treg)는 항암 면역을 억제하여 종양의 보호 면역 감시를 방해하고 효과적인 항종양 면역 반응을 반대하는 것으로 알려져 있는데, EB-AMDK39 EV는 T 헬퍼 세포를 활성화하여 세포독성 T 세포 (세포독성 T 세포)를 활성화하고, Treg 세포를 억제함으로써 항암 효과를 나타낼 것으로 추정된다. 이에 따라 본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방, 치료 및 전이 억제에 우수한 효과를 가진다.
본 발명에서 사용되는 경우에 '암(cancer)'이라는 용어는 종양, 네오플라시아스 (neoplasias), 및 악성 조직 또는 세포를 포함하는 의미이다. 상기 암은 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종과 같은 암 또는 이들 암들의 하나 이상의 조합을 포함한다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 본 발명에 따른 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체(EV)는, 20~300 nm 크기의 갖는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 단독의 항암 요법으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상황에 따라 필요하다면 방사선 또는 화학항암제 또는 면역항암제와 동시, 분리 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 병용 요법은 암 치료에서 종양 크기를 감소시키거나 종양 성장을 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 병용 요법은 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 감소시키거나, 전이를 예방하거나, 혈관신생을 예방하는 것 중 적어도 하나에서 사용하기 위한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 방사선 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 방사선 치료 또는 항암 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 단일 또는 다중 투여될 수 있으며, 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다
일부 실시예에서, 암 치료제는 면역항암제이다. 면역요법은 대상체의 면역계를 사용하여 암을 치료하는 치료법, 예를 들어 관문 억제제, 암 백신, 사이토카인, 세포 요법, CAR-T 세포 및 수지상 세포 요법을 지칭한다. 면역요법의 비-제한적인 예는 면역 관문 억제제로서 니볼루맙(BMS, anti-PD1-1), 펨브롤리주맙(Merck, anti-PD1-1), 이필리무맙(BMS, 항-CTLA-4), MEDI4736(AstraZeneca, anti-PD1-L1), 및 MPDL3280A(Roche, anti-PD1-L1)를 포함한다. 다른 면역요법은 종양 백신, 예컨대 Gardail, Cervarix, BCG, 시풀렌셀(sipulencel)-T, Gp100:209-217, AGS-003, DCVax-L, 알젠판투셀(Algenpantucel)-L, 터겐판투셀 (Tergenpantucel)-L, TG4010, ProstAtak, Prostvac-V/RTRICOM, 린도페피물 (Rindopepimul), E75 펩타이드 아세테이트, IMA901, POL-103A, 벨라겐푸마투셀 (Belagenpumatucel)-L, GSK1572932A, MDX-1279, GV1001, 및 테세모티드 (Tecemotide)일 수 있다. 면역요법은 주사를 통해 (예를 들어, 정맥내, 종양내, 피하 또는 림프절로) 투여될 수 있지만, 경구, 국소 또는 에어로졸을 통해 투여될 수도 있다. 면역요법은 사이토카인과 같은 아주반트를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 면역요법제는 면역 관문 억제제이다. 면역 관문 억제는 암 세포가 면역 반응을 예방 또는 하향조절하기 위해 생성할 수 있는 관문을 억제하는 것을 광범위하게 지칭한다. 면역 관문 단백질의 예는 CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, KIR, LAG3, TIM-3 또는 VISTA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 면역 관문 억제제는 면역 관문 단백질에 결합하여 면역 관문 단백질을 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 면역 관문 억제제의 예는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, AMP-224, AMP-514, STI-A1110, TSR-042, RG-7446, BMS-936559, MEDI-4736, MSB-0020718C, AUR-012 및 STI-A1010을 포함하지만, 반드시 이들로 제한되지 않는다.
면역 관문 억제제 (immune checkpoint inhibitors)는 세포를 직접적으로 사멸시키는 기존의 화학항암요법과는 달리 암 환자들의 삶의 질을 저하시키는 탈모, 빈혈, 골수 기능 억제 등 항암화학요법에 의한 부작용이 적은 차세대 항암제로 각광받고 있다. 하지만, 면역관문억제제는 일부 암(예컨대, 위암, 대장암, 난소암, 췌장암 등)의 경우 반응률이 매우 낮고, 장염, 간염, 폐렴, 갑상선기능저하증, 뇌하수체염과 같은 면역 관련 중증 이상반응을 유발하는 것으로도 알려져 있다. 면역 관문 억제제 사용 시의 부작용은 대부분 경미한 부작용으로 나타나지만, 드물게 신경계통이나 심장계통에 발생 시 심각하고 치명적인 것으로 보고되고 있다. 본 발명의 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체를 포함하는 약학적 조성물은 면역 관문 억제제의 반응률 한계점을 극복하고, 부작용은 최소화하며 항암 효능을 강화할 수 있을 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 염증 및 알레르기에 관여하는 사이토카인(IL-8)의 분비가 억제되어, 염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에서 염증성 질환은 부종, 피부염, 알레르기, 결막염, 치주염, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 만성 및 급성 위염, 크론병, 대장염, 만성 및 급성 장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스염, 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 급성 및 만성 간염, 방광염, 급성 및 만성 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 만성 및 급성 비염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 관절염, 호지킨병, 췌장염, 홍채염, 공막염, 포도막염 및 습진으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 기탁번호 KCTC13765BP의 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) EB-AMDK39 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 유전자를 갖는다. 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 16S rRNA 서열과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 또는 97% 동일한 16S rRNA 서열을 갖는 박테리아 균주와 같은 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 밀접하게 관련된 균주도 치료 조합의 일부로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 건강한 한국인의 분변에서 분리되었고, 0.5-1 ㎛ 크기의 타원형 세포로 단구균 또는 쌍구균이며, 혐기성 세균이고, 운동성이 없으며, 그램-음성이고, 내생포자를 형성하지 않는, 점액-분해성 세균 (mucin-degrading bacteria)이다. 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 몇 가지 점액분해효소를 생성하여 점액을 탄소 및 질소 공급원으로 사용할 수 있고, 글루코스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민 및 락토스를 포함하여 다양한 탄소원을 대사할 수 있으며, 프로피온산과 아세트산 같은 단쇄지방산을 주요 대사물질로 생성한다.
본 발명의 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주를 더 포함할 수 있다. 상기 균주는 균주의 균체, 균체의 파쇄물, 균주의 배양물, 균주의 배양물에서 균체를 제거한 배양액, 균주의 균체 추출물, 균주의 배양물의 추출물, 또는 균주의 배양물에서 균체를 제거한 배양액의 추출물 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 배양되고, 원심분리와 같은 분리 과정으로 회수되며, 건조, 예컨대, 동결건조에 의해 생균제 형태로 제조하여 이용될 수 있다. 아커만시아 뮤시니필라 균주의 저온살균은 50℃ 이상 100℃ 미만의 온도에서 10분 이상 가열하는 것을 의미한다. 예를 들어, 70℃에서 30분간 저온살균할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래의 세포외 소포체를 포함하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
일부 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 수성 액체 분산액, 자기 유화 분산액, 고체 용액, 리포솜 분산액, 에어로졸, 고체 체형, 분말, 즉시 방출 제제, 제어 방출 제제, 고속 용융 제제, 정제, 캡슐, 환제, 지연 방출 제제, 서방형 제제, 맥동 방출 제제, 다중 미립자 제제, 및 혼합 즉시 및 제어 방출 제제를 포함하지만, 반드시 이들로 제한되지는 않는다.
정맥 내, 종양 내 또는 비강 내 투여를 위해 약리학적으로 적합성 분산제 및/또는 습윤제를 함유하는 수성 현탁액, 등장 생리 식염수 용액, 또는 멸균, 주사 가능한 용액이 사용될 수 있다. 부형제로서 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤, 식물유 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 장내 또는 경구 투여용 제품으로 제형화될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 세포외 소포체(EV)가 신속하게 장내에 방출되도록 장용 코팅되어 제품화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 제약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 함께 제제화될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로오스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에서 사용가능한 부형제는 수크로스, 락토오스, 만니톨, 글루코오스 등과 같은 설탕 및 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분, 부분적으로 전젤란틴화된 전분 등의 전분을 포함한다. 바인더는 덱스트린, 소듐알지네이트, 카라지난, 구아검, 아카시아, 아가 등의 폴라사카라이드, 트라가칸트, 젤라틴, 글루텐 등의 천연-발생 거대분자 물질, 히드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시프로필에틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스소듐 등의 셀룰로스 유도체 및 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산 및 비닐아세테이트 수지 등의 고분자를 포함한다.
본 발명에서 사용가능한 분해제로는 카복시메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스칼슘, 저치환 히드록시프로필셀룰로스 등의 셀룰로스 유도체 및 소듐카복시메틸 전분, 히드록시프로필 전분, 옥수수 전분, 감자 전분, 쌀 전분 및 부분적으로 전젤라틴화된 전분 등의 전분을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 윤활제의 예들은 활석, 스테아르산, 칼슘스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 콜로이드성 실리카, 히드로스실리콘 다이옥사이드, 다양한 종류의 왁스 및 히드로게네이티드 오일 등을 포함한다.
코팅제로는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-클로로트리메틸암모늄에틸메타크릴레이트 공중합체, 에틸셀룰로스 등의 수불용성 중합체, 메타크릴산-에틸아크릴레이트 공중합체, 히드록시프로필메틸셀룰로스프탈레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로스아세테이트석시네이트 등의 장성 중합체 및 메틸셀룰로스, 히드록시 프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜 등의 수용성 중합체를 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에서 유효성분인 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체의 투여량은 다양한 질병의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 환자의 의학적 상태, 상태의 중증도, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 따라서 용량 요법은 광범위하게 변할 수 있지만, 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 표준 방법을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체(EV)를 포함하는 건강기능성 식품에 관한 것이다. 상기 세포외 소포체는 바람직하게 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래의 세포외 소포체이다. 본 발명의 건강기능성 식품은, 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선에 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능성 식품은 기능성 식품(neutraceutical food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강기능성 식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함한다.
상기 유형의 건강기능성 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 일반 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품, 어류, 육류 및 그 가공식품, 빵류 및 면류, 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품, 식용식물 유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 소스 등에 아커만시아 속 EB-AMDK39 균주 유래의 세포외 소포체를 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 아커만시아 속 균주 유래의 세포외 소포체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물에 관한 것이다. 여기서 동물은 특별히 제한되지 않는데, 예컨대, 개, 고양이, 기니피그, 햄스터, 래트, 마우스, 페렛, 토끼 등과 같은 애완동물을 가리킬 수 있다. 상기 수의학적 조성물은 수의학용 약물 또는 사료첨가제일 수 있다.
본 발명은 신규한 아커만시아 속 EB-AMDK39 (Akkermansia sp. EB-AMDK39) 균주를 제공한다. 상기 균주는 2018년 12월 05일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC13765BP로 기탁되었다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 분리 및 동정
1.1. 균주의 분리 및 동정
건강한 한국인(여성, 7세, BMI 19.9)의 분변으로부터 아커만시아 속 균주를 분리하기 위하여, Derrien의 방법에 따라 혐기성 챔버를 이용해서 엄격한 무산소 조건 (5% H2, 15% CO2 및 80% N2) 하에서, 뮤신 배지 (0.4 g/L, 일산 일 칼륨, 0.53 g/L 이염화 인산나트륨, 0.3 g/L 염화나트륨, 0.3 g/L 염화알루미늄, 0.1 g/L 염화마그네슘, 0.11 g/L 염화칼슘, 4.0 g/L 중탄산나트륨, 1 ㎖ 산 미량 원소 용액, 1 ㎖ 알칼리성 미량 원소 용액, 1 ㎖ 비타민 용액, 2.5 g/L 돼지 위 점액 (Type III)), 및 0.25 g/L 황화나트륨 구수화물)를 이용하여 균주를 선별 배양한 후 분리하였다. (Derrien et al., 2004).
1.2. 현미경 관찰
분리된 균주가 아커만시아 속 균주인지 여부를 확인하기 위해서, 분리된 균주를 현미경으로 관찰하였다. 도 1에서 A는 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 표준균주이고, B는 아커만시아 속 EB-AMDK39 균주를 1,000배의 배율로 확대한 현미경 사진이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 표준균주인 아커만시아 뮤시니필라 ACTC BAA-835 표준균주(A)와 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주(B)를 1000배의 배율로 확대해서 관찰한 결과, 균주의 모양이 모두 곧은 또는 굽은 막대형 세포로 유사한 형상인 것을 확인하였다.
1.3. PCR 분석
아커만시아 속 균주인지 여부를 확인하기 위해서, 분리된 균주를 하기 표 1의 AM-특이성 프라이머(서열번호 2 및 서열번호 3)를 사용하여 PCR 분석을 실시하여, 그 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2에서 레인 M은 DNA 사이즈 마커이고, 레인 1은 양성 대조군 (ATCC BAA-835)이며, 레인 2는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주이고, 레인 3은 음성 대조군 (증류수)의 결과이다.
도 2와 같이 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 아커만시아 뮤시니필라 ACTC BAA-835 표준균주와 유사한 밴드로 결과값이 나온 것을 확인할 수 있었다.
Designation Direction Sequence (5'→3') Amplicon size 서열번호
AM1 Forward CAG CAC GTG AAG GTG GGG AC 329 bp 서열번호 2
AM2 Reverse CCT TGC GGT TGG CTT CAG AT 서열번호 3
1.4. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 분석
상기와 같이 분리된 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주와 이미 보고된 동종의 아커만시아 뮤시니필라 ACTC BAA-835 표준균주의 유사성을 검증하기 위하여, 분자 타이핑의 일종인 RAPD를 실시하였다. 이를 위해 균체로부터 추출한 게놈 DNA를 대상으로 하기 표 2의 범용 프라이머를 이용하여 DNA를 증폭한 후 1% 아가로스 겔에서 1시간 30분 동안 전기영동하고, UV 천공기 상에서 DNA 분절 패턴을 비교하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
Designation 방향 서열 (5'→3') 서열번호
ERIC-1 Forward ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C 서열번호 4
ERIC-2 Reverse AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G 서열번호 5
도 3을 통해서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 아커만시아 뮤시니필라 ACTC BAA-835 표준균주와 비교할 때, 상이한 RAPD 밴드 패턴을 보였다. 아커만시아 뮤시니필라의 RAPD 밴드 패턴은 종(species)이 상이할 경우에 RAPD 밴드 패턴이 상이한 것으로 알려져 있어, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 아커만시아 뮤시니필라 ACTC BAA-835 표준균주와 동일한 종에 속하지만, 상이한 균주인 것을 확인하였다.
1.5. 전장 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 계통수(phylogenetic tree) 분석
상기와 같이 분리된 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 전장(full-length) 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 위하여, 하기 표 3의 27F 및 1541R 프라이머를 이용하여 16S rRNA 유전자를 증폭한 후 3730xl DNA분석기를 이용하여 염기서열을 결정하였다. 이와 같이 얻은 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 EB-AMDK39 균주 및 이미 공표된 아커만시아 속의 다른 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초하여 계통도를 분석하였다. 계통도(Phylogenetic) 분석은 MEGA-X를 이용하여 수행하였으며, 1000개의 bootstraps을 이용한 이웃 접합 방법(neighbor-joining method)을 통해 계통수를 구성하여 도 4(A)에 나타내었다. 평균 뉴클레오티드 신원(ANI) 값은 -m ANIb 설정을 갖는 pyani v0.2.7 프로그램을 적용하여 진화 거리를 평가하였다. 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 균주 (accession: GCF_000020225.1), 아커만시아 뮤시니필라 CBA5201 균주 (accession: GCF_004104435.1), 아커만시아 뮤시니필라 JCM30893 균주 (accession: GCF_009731575.1), 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주 (accession: GCF_004015105.1), 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK27 균주 (accession: GCF_010223015.1) 및 아커만시아 글라이카니필라 PytT 균주 (accession: GCF_900097105.1) 전체 또는 드래프트 게놈 서열은 NCBI 게놈 데이터베이스로(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)부터 다운받아 사용하였다. 동종의 다른 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 이용하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하여 도 4(B)에 나타내었다.
Designation Direction Sequence (5'→3') Amplicon size 서열번호
27F Forward AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 1,505 bp 서열번호 6
1541R Reverse AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 1,505 bp 서열번호 7
도 4(a) 및 도 4(b)에 도시된 바와 같이, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해서 진화학적 유연관계를 계통수 (phylogenetic tree)를 분석한 결과 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 유전학적으로 아커만시아 뮤시니필라에 속하는 균주임을 확인하였다.
사람의 분변에서 분리한 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주를 아커만시아 뮤시니필라 (ACTC BAA-835)를 대조군으로 한 생화학적 방법 (API) 및 분자생물학적 방법 (16S rRNA 서열분석, 16S rRNA BLAST 분석, RAPD)을 통해 동정하였고, 후술하는 항생제 내성 검사를 통해서 프로바이오틱스의 기능을 가질 수 있는 안전한 균주임을 확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 분리된 아커만시아 뮤시니필라 균주를 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주로 명명하고, 한국생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC13765BP를 부여받았다.
실시예 2: 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 균학적 특성 및 안전성 분석
2.1. 분리된 아커만시아 속 ( Akkermansia sp.) 균주의 당 이용성 확인
상기에서 분리된 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 당 이용성을 파악하기 위하여 API50CH 키트(Biomerieux, France)를 응용하여 배양한 후, 각 당을 이용한 생장 여부를 아커만시아 뮤시니필라 표준균주 (ATCC BAA-835)와 비교하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
No Carbohydrates ATCC BAA-835 EB-AMDK39 No Carbohydrates ATCC BAA-835 EB-AMDK39
0 Negative control - - 25 Esculine - -
1 Glycerol - - 26 Salicine - -
2 Erythritol - - 27 D-세포obiose - -
3 D-Arabinose w w 28 D-Maltose - -
4 L-Arabinose w w 29 D-Lactose (bovine origin) + -
5 Ribose + w 30 D-Melibiose - -
6 D-Xylose w w 31 D-Saccharose (sucrose) - -
7 L-Xylose w w 32 D-Trehalose - -
8 Adonitol - - 33 Inuline - -
9 β-Methyl-xyloside - - 34 D-Melezitose - -
10 D-Galactose w - 35 D-Raffinose - -
11 D-Glucose + Mucin + + 36 Amidon (starch) - -
12 D-Fructose w - 37 Glycogene - -
13 D-Mannose + - 38 Xylitol - -
14 L-Sorbose - - 39 Gentiobiose - -
15 L-Rhamnose - - 40 D-Turanose - -
16 Dulcitol - - 41 D-Lyxose w w
17 Inositol - - 42 D-Tagatose - -
18 D-Mannitol - - 43 D-Fucose - -
19 D-Sorbitol - - 44 L-Fucose + w
20 Methyl-α D-mannopyranoside - - 45 D-Arabitol - -
21 Methyl-α D-glucopyranoside - - 46 L-Arabitol - -
22 N-Acetylglucosamine + + 47 Potassium Gluconate - -
23 Amygdaline - - 48 Potassium 2-Ketogluconate - -
24 Arbutine - - 49 Potassium 5-Ketogluconate w w
+ : growth, w : weak growth, - : no growth,
상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 아커만시아 뮤시니필라 표준균주 (ATCC BAA-835)와 비교할 때, 리보스, D-갈락토스, D-프럭토스, D-만노스, D-락토스 및 L-푸코스의 이용능력에 있어서 차이가 있음을 확인하였다.
2.2. 분리된 균주의 항균제 감수성 확인
상기와 같이 분리된 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK19 균주의 항균제 감수성을 파악하기 위하여 Clinical & Laboratory Standard Institute (CLSI) 가이드라인의 broth microdilution 방법에 따라 혐기성 세균용 항균제 (피페라실린 -타조박탐(PTZ), 세프티독심(CTZ), 클로람페니콜(CHL), 클린다마이신(CLI), 메로페넴(MEM), 목시플록사신(MXF), 메트로니다졸(MTZ), 시프로플록사신(CIP))에 대한 최소저지농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)를 결정하고(CLSI, 2017), 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
항생제 MICa Breakpoints (μg/㎖) QC 시험 균주
S I R ATCC 29741b ATCC BAA-835 EB-AMDK39
PTZ ≤32/4 64/4 ≥128/4 8/4 ≤0.5/4 (S) ≤0.5/4 (S)
CTZ ≤32 64 ≥128 16 2 (S) 256 (R)
CHL ≤8 16 ≥32 8 4 (S) 8 (S)
CLI ≤2 4 ≥8 4 ≤0.125 (S) >64 (R)
MEM ≤4 8 ≥16 0.5 1 (S) 4 (S)
MXF ≤2 4 ≥8 8 >32 (R) >32 (R)
MTZ ≤8 16 ≥32 2 ≤0.25 (S) 1 (S)
CIP ≤1 2 ≥4 >32 >32 (R) >32 (R)
PTZ : Piperacillin-tazobactam, CTZ : ceftizoxime (3rd gen), CHL : chloramphenicol,
CLI : clindamycin, MEM : meropenem, MXF : moxifloxacin (4th gen),
MTZ : metronidazole, CIP : ciprofloxacin (2nd gen),
aMIC : minimal inhibitory concentration, b Bacteroides thetiotaomicron ATCC 29741
표 5에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 세프티족심, 클린다마이신, 플루오로퀴놀론 계열의 항생제인 목시프록사신과 시프로플록사신에 내성을 나타냈으며, 이를 제외한 항균제에는 감수성을 나타내었다. 표준균주와 비교할 때, 항균제 내성 패턴에 다소 차이가 있었다. 플루오로퀴놀론 계열의 항생제에 대한 내성은 같은 아커만시아 뮤시니필라에 동일하게 존재하는 내성으로 내재적인 특징 (intrinsic resistance)으로 판단된다.
추가로, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 완전한 전장 유전체에 대해 생물정보학 (bioinformatics) 기반 PlasmidFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/), PHASTER(https://phaster.ca/), Mobile Element Finder (cge.cbs.dtu.dk/services/MobileElementFinder) 프로그램을 적용하여 획득성/내재성 여부를 확인한 결과, 아커만시아 속 EB-AMDK39 균주에서 플라스미드는 존재하지 않았으며, 획득성/내재성 항생제 내성 관련 유전자는 전혀 검출되지 않았다. 따라서 본 발명에 의한 아커만시아 속 EB-AMDK39 균주는 안전한 균주임을 확인할 수 있다.
2.3. 분리된 균주의 용혈활성 (hemolytic activity) 및 병독성 인자 분석
상기와 같이 분리된 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 안전성 검증을 위해 용혈활성 보유 여부를 평가하였다. 이를 위하여 트립틱 소이 아가 (17.0 g/L 카제인의 췌장 소화물, 3.0 g/L 대두콩의 췌장 소화물, 2.5 g/L 덱스트로오즈, 5.0 g/L 염화나트륨, 2.5 g/L 인산칼륨, 15 g/L 아가)에 5% w/v defibrinated sheep blood를 첨가하여 제조한 혈액 한천 배지를 이용하여 균주를 배양하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 병원성과 관계된 β-hemolysis (콜로니 주변의 완전히 투명한 부분)는 나타나지 않았다.
병원성 균주 데이터베이스인 VFDB (reference 데이터베이스 for bacterial virulence factors, http://www.mgc.ac.cn/VFs)를 기반으로 하여 병독성 인자를 코딩하는 유전자를 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 전장 유전체 상에서 조사하였다. 분석의 경우 단백질 동일성이 최소 80%이고 커버리지 최소 80%이며 정렬 길이가 최소 50bp의 분석 조건으로 수행하였다. 분석 결과, 아커만시아 속 EB-AMDK39 균종에서 독성 인자는 검출되지 않았다. 이를 통해 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주가 인체 내에서 무해함을 알 수 있다.
2.4. 아커만시아 뮤시니필라 균주의 단쇄지방산 (SCFAs) 생성 능력 확인
부티레이트, 아세테이트, 프로피로네이트와 같은 단쇄지방산 (short chain fatty acids, SCFAs)은 장내 세균에 의해 생성되는 대사산물로, 숙주의 에너지 대사에서 중요한 역할을 하며 G 단백질 연결 수용체 (G protein-coupled receptor, GPR41과 GPR43)에 작용하는 신호전달 매개체로서 에너지 균형에 관여한다.
단쇄지방산 (SCFAs)은 위장 내분비 세포 (enteroendocrine 세포)에서 GPR41을 통해 장 운동성 감소 및 장 이동 속도를 증가시킨다. 이를 통해 PYY (peptide YY) 분비를 유도하여 에너지 섭취를 감소시키고 비만을 예방한다. 또한, 단쇄지방산에 의한 GPR43은 GPL-1 (Glucagon-like peptide 1)을 유발하여 인슐린 감수성 증가를 통해 포만감을 증가시키고, GPR43의 활성은 지방조직에서 인슐린 신호 전달을 억제하여 지방 축적을 예방한다. 단쇄지방산 (SCFAs)은 포도당 대사를 향상시키고, 장-뇌 신경 회로를 통해 음식물 섭취를 줄일 수 있는 IGN (intestinal gluconeogenesis)을 활성화시킬 수 있다. 추가적으로, 비타민 B12는 균주의 단쇄지방산 생성능에 영향을 미친다. 구체적으로는, 숙신산으로부터의 프로피온산으로의 전환을 촉매하는 조효소로 작용할 수 있다. 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 균주의 경우 비타민 B12를 보자인자로 하여 숙신산으로부터의 프로피온산의 전환을 촉매하는 메틸말로닐-coA 뮤타제를 가지고 있다.
상기 실시예에서 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주에 특이적으로 존재하는 비타민 B12 합성에 직접적인 역할을 수행하는 유전자 구성을 확인함에 따라 배양시 비타민 B12 유무에 따른 아커만시아 뮤시니필라 균주들의 기능성 대사체 변화를 확인하기 위해 시험관에서 배양한 후 배양액에 함유된 단쇄지방산 (SCFA)의 함량을 Gas Chromatography (GC)로 분석하였다. 이를 위하여 배양액을 12,000 xg 에서 5분간 원심분리하여 상층액을 회수하였으며, 상층액은 0.2 ㎛ syringe filter를 이용하여 여과한 뒤 분석에 사용하였다. FFAP column (30 m × 0.320 mm, 0.25 ㎛ phase)이 장착된 gas chromatography (Agilent 7890N)를 이용하였으며, 조건은 표 6과 같이 설정하였고, 분석 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
Flow H2: 40 ㎖/min, Air: 350 ㎖/min
Injector temp. 240℃
Detector temp. 250℃
Oven temp. 40℃ (hold 2 min)→ 65℃/10 min (hold 2 min)→ 240℃/10 min (hold 5 min)
Injection vol. 2 ㎕
Split ratio 20:1
균주 비타민 B12
첨가		 단쇄지방산 생성량 (μg/㎖)
Acetate Propionate Succinate
ATCC BAA-835 None 280.64 ± 32.21 32.44 ± 14.25 785.09 ± 32.41
0.1 mg/L 653.4 ± 78.84 1415.97 ± 145.01 7.23 ± 6.98
EB-AMDK39 None 618.14 ± 79.15 1433.01 ± 211.19 20.84 ± 28.41
0.1 mg/L 606.09 ± 75.30 1429.03 ± 165.42 10.20 ± 28.50
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 (표준균주)와 상이한 단쇄지방산 생성 능력을 나타내었다. 세부적으로는, 배양 배지에 비타민 B12를 첨가하지 않은 경우 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835의 주요한 단쇄지방산은 아세트산(Acetate)과 숙신산(Succinate)인 반면, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 비타민 B12의 유무에 상관없이 아세트산과 프로피온산 (propionate)이 주요 단쇄지방산으로 특히, 프로피온산의 생성량이 표준균주 대비 약 40배 이상 높은 것으로 확인되었다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주는 아커만시아 뮤시니필라 ATCC BAA-835 표준균주와는 비타민 B12 유무에 따라 명백한 단쇄지방산 생성능의 차이를 가지고 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 아커만시아 뮤시니필라 균주의 세포외 소포체 분리
아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 세포외 소포체 (Extracellular vesicles, EVs)를 얻기 위하여, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주의 배양액을 10,000 xg, 4℃의 조건에서 20분 동안 고속 원심분리한 후 상층액을 회수하고, 상층액은 0.45 ㎛ 필터와 0.22 ㎛ 필터로 여과를 수행하였다. 여과된 상층액은 150,000 xg, 4℃의 조건에서 2시간 동안 초고속 원심분리를 수행하여 펠렛을 얻은 후, 멸균 생리식염수 (PBS)로 녹여 단백질 정량 후 효능 시험에 사용하였다.
실시예 4: 흑색종을 이용한 동종이식 마우스 동물 모델에서 aPD-1 면역항암제와 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 생균 병용투여에 의한 항암 효과
4.1. 균주 시료
본 실험에 사용한 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 (KCTC13765BP) 생균은 1x108 CFU/150㎕ PBS (25% 글리세롤, 0.05% 시스테인/PBS) 농도로 제조하였다.
4.2. 동물 실험
동물실험은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 Animal use and Care Protocol을 준수하여 진행하였다. 암 유도를 위해 8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 구입하여 일주일 동안 적응기간을 가진 후, 5주간 사육하였다. 사육환경은 일정한 온도(22℃)와 상대습도 (40~60%)를 유지하며 12시간 주기로 명암을 조절하면서 사육하였다.
동종이식 마우스(syngeneic mouse) 항암 동물 모델 제작을 위하여, 마우스 유래 흑색종 세포 (B16-F10)를 이용하였다. 동종이식 모델(Syngeneic model)은, 생체내(in vitro)에서 키운 마우스의 세포주를 실제 마우스에 이식하여 자라게 하는 기법으로 동일한 숙주와 세포주 균주는 종양 거부(tumor rejection)가 발생하지 않는다.
1 주일간의 순화가 끝난 마우스에 1주일 동안, 하기 표 8에 나타낸 항생제를 이용하여 항생제 전처리를 행하였다.
항생제 농도
암피실린 (Sigma-A0166) 1g/L
반코마이신 (Sigma SBR00001) 0.5g/L
메트로니다졸 (Sigma M1547) 1g/L
네오마이신 (Sigma N6386) 1g/L
암포테리시니 B (Sigma PHR1662) 0.1g/L
이어서 B16-F10 세포, 2×104 개의 세포를 100 ㎕ Matrigel과 함께 마우스의 허벅다리 위에 피하 주사하였다(SC, subcutaneous injection).
4.3. 시료 투여 및 실험군 설정
하기 표 9에 나타낸 각각의 약물을 5주간 매일 마우스에 경구투여하였다. 양성대조군으로 anti-PD1 항체를 250 ㎍/100 ㎕/head씩 경구투여하였다.
6일 되는 날부터 암세포가 올라왔는데, 이 시점부터, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주를 108 CFU로 매일 경구투여하였다. 6일되는 날부터 aPD-1 항체 250 ㎍을 4일 간격으로 복강 주사를 실시하였다. 이때, aPD-1 항체는 BioX세포 회사의 InVivoMab anti-mouse PD-1(RMP1-14), catalog #BE0146을 사용하였으며, InVivoPure pH 7.0 Dilution Buffer, catalog #IP0070을 사용하여, 250 ㎍/100 ㎕ 농도로 희석하여 사용하였다.
종양이 성장하는 동안 일주일에 두 번씩 생쥐의 무게를 측정하고 매일 모니터링하였으며, 암세포가 올라온 6일되는 날부터, 컴퓨터화된 캘리퍼스를 이용하여 이틀에 한 번씩 종양 크기를 모니터링하였다 (도 6a 참조)
종양 부피(tumor volume)는 각각의 종양의 장직경과 단직경의 두 직경을 측정하여 다음 식에 따라 계산하였다.
[수식 1]
종양 부피(㎣) = [장직경×단직경2]/2
그룹 실험군 투여 약물
I 정상 대조군 PBS 투여
II 양성 대조군(Anti-PD1 투여군) 250 ㎍/100 ㎕/head
III Anti-PD1+A.m. EB-AMDK39 균주 투여군 EB-AMDK39 생균, 1x108 CFU +
anti-PD1 (250 ㎍/100 ㎕/head)
도 7 내지 도 9를 참조하면, B16-F10 세포를 동종이식한 대조군과 비교하여, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 생균을 경구 투여한 그룹에서 종양 크기가 현저하게 작아짐을 확인하였다. 정상 대조군의 종양 크기는 452.4±69.7 ㎣와 비교하여, aPD-1 투여군의 종양크기는 274.7±50.7 ㎣, (p<0.05) (80% 감소), aPD-1과 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 병용 투여군에서는 91.5±15.19 ㎣, (P<0.001) (39% 감소)로 현저하게 감소함을 보였다. 특히 aPD-1 투여군과 비교해서 aPD-1과 EB-AMDK39 병용 투여군에서 약 67%의 유의적인 종양 억제 효과를 나타내었다 (p<0.05).
실시예 5: 흑색종을 이용한 동종이식 마우스 동물 모델에서 aPD-1 면역항암제와 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 생균 병용투여에 따른 종양 내 면역 세포의 변화
종양 조직 내 면역세포 활성을 확인하기 위하여 CD4, Foxp3 및 CD8에 대해 면역조직화학염색법 (immunohistochemistry, IHC)에 의한 분석을 수행하였다. 현미경으로 검경하여 발현 양상을 확인하였고 황갈색 내지 황적색으로 나타나는 DAB 발색 양성 영역(positive area) 측정을 위해 Image J 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였다. 각 현미경 관찰 사진에서의 양성 영역(CD4, Foxp3 및 CD8 양성 세포)를 측정 및 비교하여 도 10 및 도 11에 그래프로 나타내었다.
도 10 및 도 11을 참조하면, CD4 양성인 T 세포와 Foxp3 양성인 Treg 세포의 비율을 확인하여 종양 내 면역활성을 확인한 결과, aPD-1 + EB-AMDK39 병용 투여군에서는 FoxP3 양성인 조절 T 세포 (regulatory T cells, Treg)의 증가가 억제되어 CD4/Treg 비율이 다른 처리군에 비해 유의미하게 높은 수준으로 확인되었다. 이는 aPD-1과 EB-AMDK39의 병용 투여 시에 Treg 세포 활성을 낮추고 CD4 T 세포의 활성을 높이는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주와 항-PD-L1 항체를 병용투여하면 이들의 항종양 면역세포 활성화 효과가 더욱 증대된다는 것을 보여준다.
실시예 6: 흑색종을 이용한 동종이식 마우스 동물 모델에서 aPD-1 면역항암제와 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 유래 세포외 소포체(EV) 병용투여에 의한 항암 효과
암세포가 올라오는 6일 되는 날부터, aPD-1 항체 250 ㎍와 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래의 세포외 소포체(EV) 100 ㎍을 4일 간격으로 복강 주사를 실시하였다. 이때, aPD-1 항체는 BioX세포 회사의 InVivoMab anti-mouse PD-1(RMP1-14), catalog #BE0146을 사용하였으며, InVivoPure pH 7.0 Dilution Buffer, catalog #IP0070을 사용하여, 250 ㎍/100 ㎕ 농도로 희석하여 사용하였다.
종양이 측정되는 시점부터 2일에 한 번씩 종양 크기를 모니터링하고, 이때 종양 크기는 상기 수식 1과 같이 계산하여, 그 결과를 하기 도 12에 그래프로 나타내었다. 세포외 소포체는 마우스 종양 모델에서 단독으로 또는 anti-PD1의 존재 또는 부재 하에서 이들의 효능에 대해 시험되었다.
도 12 및 도 13을 참조하면, B16-F10 세포를 동종이식한 대조군과 비교하여, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래의 세포외 소포체(EV)를 경구 투여한 그룹에서 종양 크기가 현저하게 작아짐을 확인하였다. 정상 대조군의 종양 크기는 664.4±178.8 ㎣와 비교하여, aPD-1 투여군의 종양크기는 445.3±148.1 ㎣, 약 33%의 감소효과를 나타냈으며, PD-1과 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래의 세포외 소포체(EV) 병용 투여군에서는 150.7±37.52 ㎣, (P<0.05)로 유의적으로 약 77%의 종양 성장 억제 효과를 나타냈다.
이상과 같이 본 발명자들은 생체 내(in vivo)에서 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)와 anti-PD1 면역 관문 억제제의 암세포 생장 및 전이 억제 효과를 확인한 결과, 종양을 이식한 마우스에 아커만시아 속 균주에서 유래된 세포외 소포체(EV)와 anti-PD1 면역 관문 억제제를 주입하였을 때, 종양의 크기 및 무게가 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 12 및 도 13 참조). 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 anti-PD1 단독 투여 시와 비교하여 상당히 우수한 종양 성장 억제효능이 있으므로 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 7: 흑색종을 이용한 동종이식 마우스 동물 모델에서 aPD-1 면역항암제와 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 유래 세포외 소포체(EV) 병용투여에 따른 종양 내 면역 세포의 변화
흑색종을 이용한 동종이식 마우스 동물 모델에서 aPD-1 면역항암제와 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 유래 세포외 소포체(EV) 병용투여에 따른 종양 조직 내 면역세포 활성 변화를 확인하기 위해 면역조직화학염색을 수행하였다.
종양 조직 내 면역세포 활성을 확인하기 위하여 CD4, Foxp3 및 CD8에 대해 면역조직화학염색법 (immunohistochemistry, IHC)에 의한 분석을 수행하였다.
면역조직화학적 염색은 뮤린 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-Foxp3 항체를 이용하여 포르말린-고정된/파라핀 매립된 조직 상에서 수행되었다. 현미경으로 검경하여 발현 양상을 확인하였고 적갈색 혹은 적황색으로 나타나는 DAB 발색 양성 영역(CD4, Foxp3 및 CD8 양성 세포) 측정을 위해 Image J 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였다. 각 현미경 관찰 사진에서의 양성 영역(positive area)을 측정 및 비교하여 도 14에 그래프로 나타내었다.
도 14는 시험물질 투여 후의 종양 세포의 IHC(면역조직화학) 결과이다. 도 14에서, 황갈색 내지 황적색 점은 CD4, Foxp3 및 CD8 양성 세포이다.
도 14 및 도 15를 참조하면, CD4 양성인 T 세포와 Foxp3 양성인 Treg 세포의 비율을 확인하여 종양 내 면역활성을 확인한 결과, aPD-1과 EB-AMDK39 EV의 병용 투여군에서는 FoxP3 양성인 조절 T 세포 (Treg)의 증가가 억제되어 CD4/Treg 비율이 다른 처리군에 비해 유의미하게 높은 수준으로 확인되었다. 또한 CD8 양성 영역을 조사하여 세포독성 T 세포의 발현을 조사하였다. 이는 CD4 T 세포에 의해서도 활성화되며, CD8 양성 영역은 aPD-1과 EB-AMDK39EV를 병용투여한 그룹에서 유의하게 증가함을 확인하였다. 종양 조직에서의 CD8 증가는 종양 세포를 직접적으로 파괴하는 것을 의미한다.
실시예 8: 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 생균 또는 EV에 의한 항암 효과 확인
도 16은 흑색종을 이용한 동종이식 마우스 종양모델에서 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 생균 또는 EB-AMDK39 EV 단독 투여에 의한 항암 효과를 확인하기 위한 생체내 실험 과정을 간략히 나타낸 도면이다. 일주일의 순화가 끝난 C57BL/6 마우스(암컷, 8주령)에 일주일 동안 하기 표 10의 항생제를 구강투여하였다.
항생제 농도
Ampicillin (sigma-A0166) 1g/L
Vancomycin (sigma SBR00001) 0.5g/L
Metronidazole (sigma M1547) 1g/L
Neomycin (sigma N6386) 1g/L
Amphotericni B (sigma PHR1662) 0.1g/L
B16-F10 세포, 2×104 개의 세포를 100 ㎕ Matrigel과 함께 마우스의 허벅다리 위에, 피하주사하였다. B16F10 세포 이식 후 암세포가 올라오는 시점인 6일 되는 날부터 EB-AMDK39을 108 CFU/head/day로 매일 구강투여 또는 EB-AMDK39 EV 100 ㎍/head 격일로 주 3회 복강내로 투여하였다. 종양이 측정되는 시점부터 2일에 한 번씩 종양 크기를 캘리퍼를 이용하여 측정하고, 종양 크기(부피)를 산출하여 도 17에 그래프로 나타내었다.
도 17을 참조하면, B16-F10 세포를 동종이식한 대조군과 비교하여, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39을 경구 투여한 그룹과 EB-AMDK39 EV를 복강투여한 그룹에서 종양 크기가 현저하게 작아짐을 확인하였다. D22일의 종양 크기 비교시, 정상 대조군의 종양 크기는 1064±140.3 ㎣와 비교하여, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 투여군의 종양크기는 629±148.1 ㎣로, 약 38%의 감소효과를 나타냈었다 (P<0.05). 한편, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39의 EV 투여군에서는 568±77.71 ㎣, (P<0.05)로 유의적으로 약 43%의 종양 성장 억제 효과를 나타냈다.
동물 모델 실험 종료 후, 22일에 마우스를 희생한 후 종양을 적출하여 종양 무게를 측정하여 도 18에 나타내었고, 종양세포를 분리하여 촬영한 사진을 도 19에 나타내었다. 정상대조군의 종양 무게는 2.423±0.2907 g이고, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39와 EB-AMDK39 EV 투여군에서의 종양 무게는 각각 1.564±0.1844 g, 1.573±0.1517 g로 측정되었으며, 모두 유의하게 감소됨을 확인하였다. (모두 P<0.05). 도 17에 도시된 바와 같이, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 또는 EB-AMDK39 EV 단독 투여 시에, 종양 크기가 유의하게 감소하였다.
실시예 9: 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 생균 또는 EV 단독 투여에 따른 종양 내 면역 세포의 변화
흑색종을 이용한 동종이식 마우스 동물 모델에서 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 또는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래 세포외 소포체(EV) 단독 투여에 따른 종양 조직 내 면역세포 활성 변화를 확인하기 위해 면역조직화학염색을 수행하였다.
종양 조직 내 면역세포 활성을 확인하기 위하여 CD4, Foxp3 및 CD8에 대해 면역조직화학염색법 (IHC)에 의한 분석을 수행하였다.
면역조직화학적 염색은 뮤린 항-CD4 항체, 항-CD8 항체, 항-Foxp3 항체를 이용하여 포르말린-고정된/파라핀 매립된 조직 상에서 수행되었다; 현미경으로 검경하여 발현 양상을 확인하였고 적갈색 혹은 적황색으로 나타나는 DAB 발색 양성 영역(CD4, Foxp3 및 CD8 양성 세포) 측정을 위해 Image J 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 분석을 수행하였다. 각 현미경 관찰 사진에서의 양성 영역을 측정 및 비교하여 도 21에 그래프로 나타내었다.
도 20 및 도 21을 참조하면, CD4 양성인 T 세포와 Foxp3 양성인 Treg 세포의 비율을 확인하여 종양 내 면역활성을 확인한 결과, 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 또는 EB-AMDK39 EV를 단독 투여한 경우에, CD4 양성 T 세포와 Foxp3 양성 Treg 세포의 비율이 대조군 보다 약간 증가하였고, CD8 양성 T 세포를 조사하여 세포독성 T 세포를 확인한 결과, EB-AMDK39-EV에 의해 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래 세포외 소포체(EV)가 면역항암제에 의한 항암 기전의 대표적인 바이오마커인 CD8 양성 T 세포의 종양 내 침윤 증가를 통해 항암면역을 활성화하여 암 치료에 기여함을 시사한다.
실시예 10: 상처 치유 분석(wound healing assay)을 이용한 전이성 감소 확인
HT29 인간 대장암 세포를 각각 10% FBS, 1% 젠타마이신을 포함한 McCoy 배지로 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 세포 배양용 6-웰 플레이트에 HT29 대장암 세를 분주하고 confluent하게 배양한다. 그 후에 피펫 팁을 이용하여 6-웰 플레이트에 일정하게 스크래치를 내준다. 그 후에 EB-AMDK39 EV을 1, 10 ㎍/㎖로 24시간 처리하여 현미경으로 관찰하였다. Image J 프로그램을 이용하여 세포 면적을 계산하였다.
EB-AMDK39 EV의 항암활성을 알아보기 위하여 상처 치유 활성 실험을 실시하였다. HT29 인간유래 대장암세포에 상처를 형성한 다음 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 1, 10 ㎍/㎖, 24H 처리하여 암 세포의 전이(metastasis)의 정도를 알아보았다.
도 22a 및 도 22b를 참조하면, HT29 세포를 이용한 상처 치유 실험 결과, 정상 대조군을 기준으로 하여 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 각각 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖ 투여할 경우에, 각각 43.73%, 50.63%의 전이성 감소가 관찰되었다. 특히 10 ㎍/㎖을 처리한 그룹에서는 P<0.05으로 유의적인 감소가 확인되었다.
실시예 11: HT29 세포에서 항염증 효능평가
사이토카인과 다른 면역조절제들은 염증성 장질환에서 염증 반응의 조절에 관여하기 때문에, 이들 유전자의 발현이 본 발명의 균주의 투여에 의해서 영향을 받는지 조사하였다. In vitro 항염증 효능평가 실험을 위해, 인간유래 대장 상피세포인 HT-29 세포 (ATCC　 HTB-38™, USA)를 배양하였다. 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone, USA), 10 ㎍/㎖ 젠타마이신을 첨가한 McCoy's 5A 변형 배지 (Gibco, USA)를 기본 배양 배지로 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터 (NUAIRE, USA)에서 배양하였다. 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)가 HT-29 세포에서 LPS로 유도된 염증전 사이토카인인 IL-8 유전자의 발현을 억제하는지 확인하기 위해서 하기 표 11의 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 진행하였다.
TRIZOL시약 (Sigma, USA)을 이용하여 총 RNA를 추출하였고 cDNA 합성을 위해서 1 ㎍의 RNA를 M-㎖V cDNA 합성 키트 (Enzynomics, Korea)로 cDNA를 추출하였다. 실시간 PCR은 Quant Studio 3 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였다.
염증성 사이토카인의 유전자 발현은 SYBR Green TOPrealTM qPCR 2X PreMIX (Enzynomics, Korea)를 사용하였고, internal standard로는 GAPDH를 사용하였다. PCR의 조건은 pre-incubation (for UDG)은 50℃에서 4분, 95℃에서 10분, 그리고 40 사이클은 95℃에서 15초, 60℃에서 1분으로 수행하였다. 데이터는 QuantStudio Design & Analysis Software v1.4.3에 내장되어 있는 프로그램을 이용하여 delta CT 방법으로 분석하였다.
타깃 방향 프라이머 서열 서열번호
GAPDH F 5'-GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG-3' 서열번호 8
R 5'-ATA CCA GGA AAT GAG CTT GAC AAA-3' 서열번호 9
IL-8 F 5'-TTT TGC CAA GGA GTG CTA AAG A-3' 서열번호 10
R 5'-AAC CCT CTG CAC CCA GTT TTC -3' 서열번호 11
도 23을 통해서 확인되는 바와 같이, HT29 세포에 LPS 100 ng/㎖, 6시간 동안 단독 처리하였을 때, 대표적인 염증 사이토카인 IL-8의 발현이 정상군에 비해 약 3.7배 증가하였다 (P<0.001). 반면에 LPS와 본 발명의 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 1 ㎍/㎖의 농도로 같이 처리한 그룹에서는 IL-8의 발현 정도가 LPS 단독 처리군에 비하여 41% 감소함이 유의적으로 관찰되었다(P<0.001).
본 명세서에 기재된 구체적 실시예는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 다양하게 변형 및 변화되어 실시될 수 있고, 이러한 사실은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서 정해져야 하며, 상기의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 보호범위에 포함되는 것으로 의도된다.
한국생물자원센터(국외) KCTC13765BP 20181205

Claims (12)

  1. 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아커만시아 속 균주는 아커만시아 뮤시니필라 (Akkermansia miciniphila) 균주인 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아커만시아 속 균주는 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 (KCTC13765BP)인 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 유래 세포외 소포체는 평균 직경이 20~300 nm 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 화학항암제 또는 면역항암제와 같은 암 치료제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역항암제는 anti-PD1, anti-PDL1, anti-CTLA, anti-Tim3 및 anti-LAG3으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)와 화학항암제 또는 면역항암제는 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 또는 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
  11. 아커만시아 속 균주 (Akkermansia sp.)에서 유래된 세포외 소포체(EV)를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 수의학적 조성물.
  12. 아커만시아 뮤시니필라 EB-AMDK39 균주 (KCTC13765BP).

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