KR20230091030A - Use of recombinant anti-bacterial protein killing Clostridium difficile - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 단백질의 용도에 관한 것으로, 상세하게는, 항균 활성을 가지는 엔도리신 LysSAP26의 C-말단부위 162∼251번 아미노산 서열이 결실된 재조합 단백질(CHAP-161LysSAP26)의 용도에 대한 것이다.The present invention relates to the use of a recombinant antibacterial protein that effectively kills Clostridium difficile bacteria, and in detail, the amino acid sequence at positions 162 to 251 of the C-terminal region of LysSAP26, an endolysin having antibacterial activity, is deleted. It relates to the use of a recombinant protein (CHAP-161 LysSAP26 ).
항균제 오남용으로 인한 병원성 세균들의 다약제 항균제 내성이 증가함에 따라, 항생제로 치료가 되지 않는 사례가 크게 증가하여 위중한 보건문제가 되고 있으며 이에 대응하는 새로운 항균제제의 개발이 시급한 실정이다.As the multi-drug antimicrobial resistance of pathogenic bacteria increases due to the misuse of antibiotics, the number of cases that cannot be treated with antibiotics increases significantly, becoming a serious public health problem.
박테리오파지는 세균의 바이러스로써 그 생물학적 생활사에 따라 숙주인 세균을 감염하여 파지를 다량 재생산하고, 숙주 세균의 세포 속 다량의 파지에 의해서 사멸하는 과정에서 세균의 세포벽을 뚫거나 분해하는 단백질들을 만드는 데, 이들 단백질들은 펩티도글리칸으로 구성되는 세포벽을 분해하여 세포벽을 와해시키고 이로써 세균이 죽게 된다.Bacteriophage is a bacterial virus, which infects the host bacterium according to its biological life cycle, reproduces a large amount of phage, and makes proteins that break through or decompose the cell wall of the bacterium in the process of being killed by a large number of phages in the cell of the host bacterium. The proteins break down the cell wall made of peptidoglycan, disintegrating the cell wall and killing the bacteria.
클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)은 그람 양성균으로 포자를 형성하는 혐기성 간균이다. 항생제나 약제 사용으로 장내 세균총이 파괴되면 클로스트리듐 디피실에 의해 집락화되고 분비독소 A 또는 B에 의해 염증으로 진행된다. 분비독소(장독소)가 많을수록 장염은 심화된다. 미국의 경우 클로스트리듐 디피실에 의한 장질환 발병율이 증가 추세에 있으며 특히 65세 이상 고령층의 발생률과 사망률이 급격히 증가하고 있다. 클로스트리듐 디피실에 의한 장질환 치료는 경구 메트리니다졸 또는 반코마이신 처치를 하며 최근에는 건강한 사람의 대변이식으로 좋은 효과를 보고하고 있지만, 약제 내성과 항생제 처치로 인한 부작용, 그리고 이식할 대변의 품질 관리(quality control)가 문제로 대두되고 있다.Clostridium difficile is an anaerobic bacillus that forms spores as a Gram-positive bacterium. When the intestinal flora is destroyed by the use of antibiotics or drugs, it is colonized by Clostridium difficile and progresses to inflammation by secreted toxin A or B. The more secreted toxin (enterotoxin), the more severe enteritis. In the United States, the incidence of intestinal diseases caused by Clostridium difficile is on the rise, and in particular, the incidence and mortality rates of the elderly over 65 are rapidly increasing. The treatment of intestinal diseases caused by Clostridium difficile is oral metrinidazole or vancomycin treatment, and recently good effects have been reported with stool transplantation in healthy people, but drug resistance and side effects due to antibiotic treatment and Quality control is emerging as a problem.
본 발명의 목적은 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 감염성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Clostridium difficile infectious diseases comprising CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 사멸용 항생제를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide an antibiotic for killing Clostridium difficile containing CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises a CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient Clostridium difficile ( Clostridium difficile ) A pharmaceutical composition for preventing or treating infectious diseases provides
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 사멸용 항생제를 제공한다.In addition, the present invention provides an antibiotic for killing Clostridium difficile comprising the CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
본 발명은 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 세균을 효과적으로 사멸시키는 재조합 항균 단백질의 용도에 관한 것으로, 상세하게는, 항균 활성을 가지는 엔도리신 LysSAP26의 C-말단부위 162∼251번 아미노산 서열이 결실된 재조합 단백질(CHAP-161LysSAP26)의 용도에 대한 것이다. 본 발명의 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질은 클로스트리듐 디피실에 사멸능을 나타내어 이 세균에 의해 유발되는 감염성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 특히, 상기 CHAP-161LysSAP26은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 기질로 사용하여 펩티도글리칸 분해로 인한 세균 사멸능을 나타내고, 펩티도글리칸은 세균에만 존재하고 사람이나 동물에는 존재하지 않는 바, 본 발명의 CHAP-161LysSAP26은 사람과 동물에 영향을 미치지 않아 안전하다.The present invention relates to the use of a recombinant antibacterial protein that effectively kills Clostridium difficile bacteria, and in detail, the amino acid sequence at positions 162 to 251 of the C-terminal region of LysSAP26, an endolysin having antibacterial activity, is deleted. It relates to the use of a recombinant protein (CHAP-161 LysSAP26 ). The CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein of the present invention exhibits the ability to kill Clostridium difficile and can prevent or treat infectious diseases caused by this bacterium. In particular, the CHAP-161 LysSAP26 uses peptidoglycan, a component of the cell wall of bacteria, as a substrate to show the ability to kill bacteria by decomposing peptidoglycan, and peptidoglycan exists only in bacteria and does not exist in humans or animals However, CHAP-161 LysSAP26 of the present invention is safe because it does not affect humans and animals.
도 1은 CHAP-161LysSAP26를 포함하여 LysSAP26과 CHAP-139LysSAP26 단백질 정제 후 SDS-PAGE 분석사진(A)이며, 각 단백질의 C-말단 6개의 히스티딘 아미노산 서열을 인식하는 특이항체를 사용하여 웨스턴 분석을 수행하여 CHAP-161LysSAP26, LysSAP26, 그리고 CHAP-139LysSAP26 을 확인한 것(B)이다.
도 2는 CHAP-161LysSAP26, LysSAP26, 그리고 CHAP-139LysSAP26의 Acinetobacter baumanii ATCC 17978(A)과 Staphylococcus aureus ATCC 25923(B)을 대상으로 20시간 항균능을 흡광도를 측정하여 결정한 것이다.
도 3은 CHAP-161LysSAP26 와 LysSAP26의 단백질 안정성과 관련하여 각 단백질 정제 15일 후의 수용액 상의 단백질 침전물을 관찰한 사진이다.
도 4는 CHAP-161LysSAP26에 의한 클로스트리듐 디피실 표준균주(ATCC 9689) 1 주와 임상분리주 3 주 (PO3654, PO3780, PO3783)에 대한 최소억제농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC)와 최소사멸농도 (Minimum bactericidal concentration, MBC)를 확인한 실험결과이다.
도 5는 클로스트리듐 디피실 감염 동물 모델에 대한 CHAP-161LysSAP26의 질병 치료 효과 in vivo 실험 모식도를 나타낸다.
도 6은 클로스트리듐 디피실 ATCC 9689 감염 시험군(그룹 4-6)에 대한 14일간 생존율 변화 결과를 나타낸다.
도 7은 클로스트리듐 디피실 CD-M-5 감염 시험군(그룹 7-9)에 대한 14일간 14일간 생존율 변화 결과를 나타낸다.
도 8은 클로스트리듐 디피실 CD-H-7 감염 시험군(그룹 10-12)에 대한 14일간 생존율 변화 결과를 나타낸다.
도 9는 클로스트리듐 디피실 ATCC 9689 감염 시험군(그룹 4-6)에 대한 14일간 마우스 몸무게 변화 결과를 나타낸다.
도 10은 클로스트리듐 디피실 CD-M-5 감염 시험군(그룹 7-9)에 대한 14일간 마우스 몸무게 변화 결과를 나타낸다.
도 11은 클로스트리듐 디피실 CD-H-7 감염 시험군(그룹 10-12)에 대한 14일간 마우스 몸무게 변화 결과를 나타낸다.Figure 1 is an SDS-PAGE analysis photograph (A) after purification of LysSAP26 and CHAP-139 LysSAP26 proteins, including CHAP-161 LysSAP26 , and Western analysis using specific antibodies recognizing the C-
Figure 2 is CHAP-161 LysSAP26 , LysSAP26, and CHAP-139 LysSAP26 of Acinetobacter baumanii ATCC 17978 (A) and Staphylococcus aureus ATCC 25923 (B) for 20 hours antibacterial activity was determined by measuring the absorbance.
Figure 3 is CHAP-161 LysSAP26 This is a photograph of protein precipitates in an aqueous solution after 15 days of each protein purification in relation to protein stability of and LysSAP26.
Figure 4 is the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum killing concentration for 1 week and 3 weeks (PO3654, PO3780, PO3783) of Clostridium difficile standard strain (ATCC 9689) by CHAP-161 LysSAP26 and clinical isolates (Minimum bactericidal concentration, MBC) was confirmed as an experimental result.
5 shows a schematic diagram of an in vivo experiment for the treatment effect of CHAP-161 LysSAP26 on an animal model infected with Clostridium difficile.
Figure 6 shows the results of the 14-day survival rate change for the Clostridium difficile ATCC 9689 infection test group (groups 4-6).
Figure 7 shows the results of changes in survival rate for 14 days and 14 days for Clostridium difficile CD-M-5 infection test groups (groups 7-9).
Figure 8 shows the results of the 14-day survival rate change for the Clostridium difficile CD-H-7 infection test group (groups 10-12).
Figure 9 shows the results of changes in the body weight of mice for 14 days for Clostridium difficile ATCC 9689 infection test groups (groups 4-6).
Figure 10 shows the results of changes in the body weight of mice for 14 days for Clostridium difficile CD-M-5 infection test groups (groups 7-9).
Figure 11 shows the results of changes in the body weight of mice for 14 days for the test group infected with Clostridium difficile CD-H-7 (groups 10-12).
이에, 본 발명의 발명자들은 엔도리신 LysSAP26을 암호화하는 DNA를 기반으로 결실 돌연변이를 제조하여 CHAP-161LysSAP26 발현벡터를 만들었으며, 이를 대장균에 형질전환하여 단백질을 발현시켰다. 상기 단백질이 클로스트리듐 디피실 사멸능을 나타내었으며 특히 야생형(wild type) LysSAP26 보다 단백질 생산성이 높고, 분자량이 작고 안정적이며, 클로스트리듐 디피실 세균에 대해 보다 우수한 항균 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the inventors of the present invention made a CHAP-161 LysSAP26 expression vector by preparing a deletion mutant based on DNA encoding endolysin LysSAP26, and transformed it into E. coli to express the protein. The protein showed the ability to kill Clostridium difficile, in particular, has higher protein productivity than wild type LysSAP26, has a small molecular weight and is stable, and has a better antibacterial effect against Clostridium difficile bacteria, thereby confirming the present invention. completed.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of Clostridium difficile infectious diseases comprising the CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
상세하게는, 상기 LysSAP26 단백질은 시포비리대 과(Siphoviridae)의 박테리오파지 SAP26(KCTC 11665BP) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명자들은 황색포도상구균 임상분리주에서 신규한 박테리오파지를 유도, 분리하였고, 분리된 박테리오파지를 한국생명공학연구원의 유전자은행에 2010년 3월 11일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC 11665BP).Specifically, the LysSAP26 protein may be derived from bacteriophage SAP26 (KCTC 11665BP) of Siphoviridae, but is not limited thereto. The present inventors induced and isolated a novel bacteriophage from a clinical isolate of Staphylococcus aureus, and deposited the isolated bacteriophage in the gene bank of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology on March 11, 2010 (accession number KCTC 11665BP).
상세하게는, 상기 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, the gene encoding the CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein may consist of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
상세하게는, 상기 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 감염성 질환은 심내막염, 설사, 장염, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 가막성 대장염, 중독성거대결장, 위장관 천공 또는 패혈증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, the Clostridium difficile infectious disease may be endocarditis, diarrhea, enteritis, inflammatory bowel disease (IBD), pseudomembranous colitis, toxic megacolon, gastrointestinal perforation or sepsis, It is not limited thereto.
본 발명의 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질은 세균의 세포벽 성분인 펩티도글리칸을 기질로 하여 세포벽을 분해하고 와해시켜 세균을 사멸시킨다. 상기 펩티도글리칸은 세균에만 존재하고 사람이나 동물에는 존재하지 않는 바, 본 발명의 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질은 사람과 동물에 영향을 미치지 않아 안전하면서도 의약산업, 식품산업, 생명공학 등에 응용이 가능할 뿐 아니라, 다약제 항균제 내성에 대한 문제점 없이 세균을 목표장소 또는 목표물질에서 효과적으로 사멸시킬 수 있는 이점이 있다.The CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein of the present invention uses peptidoglycan, a bacterial cell wall component, as a substrate to decompose and disintegrate the cell wall to kill bacteria. Since the peptidoglycan exists only in bacteria and not in humans or animals, the CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein of the present invention does not affect humans and animals, so it is safe and can be applied to the pharmaceutical industry, food industry, and biotechnology. In addition to being possible, there is an advantage in that bacteria can be effectively killed at the target site or target substance without problems with multi-drug antimicrobial resistance.
본 명세서에서 사용된 용어 '치료'는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)에 의해 유발되는 감염성 질환의 예방, 억제 및 경감을 의미한다.As used herein, the term 'treatment' refers to the prevention, suppression and alleviation of infectious diseases caused by Clostridium difficile .
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.When the composition of the present invention is a pharmaceutical composition, it may contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the above-described active ingredients for administration. The carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or sterile injection solutions according to conventional methods. . Specifically, when formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. Such a solid preparation may be prepared by mixing at least one or more excipients, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc., in addition to the active ingredient. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. It may be prepared by adding various excipients, for example, wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives, in addition to liquids and liquid paraffin for oral use. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and tablets. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents. As a base for suppositories, Witepsol, Macrosol, Tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.A suitable dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the drug type, and the time, but can be appropriately selected by a person skilled in the art, and the daily dose of the composition is preferably It is 0.001 mg/kg to 50 mg/kg, and it can be divided and administered once a day to several times as needed.
또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 사멸용 항생제를 제공한다. In addition, the present invention provides an antibiotic for killing Clostridium difficile comprising the CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
본 명세서에서 사용된 "항생제"라는 용어는 의약용 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭한다.As used herein, the term "antibiotic" is a generic term for preservatives, bactericides and antibacterial agents for medical use.
본 발명의 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질은 종래 항균제에 비하여 탁월한 선택적 세균 사멸능을 가진다. 상기 단백질을 항균제로 활용하면 종래 항균제와 달리, 세균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는다는 이점을 가지기 때문에 종래의 항생 물질에 비하여 제품 수명(life cycling)이 긴 항생 물질을 제공할 수 있다. 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용 범위가 줄어드는데 반해, 본 발명의 단백질을 유효성분으로 포함하는 항균제는 항균제 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있으며, 이에 따라 항균제로서의 제품 수명을 증가시킬 수 있다.The CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein of the present invention has excellent selective bacterial killing ability compared to conventional antibacterial agents. When the protein is used as an antimicrobial agent, unlike conventional antibacterial agents, it has the advantage of not inducing resistance or resistance of bacteria, so it is possible to provide an antibiotic material with a longer life cycle than conventional antibiotic agents. While most antibiotics have a decreasing range of use as they face increased resistance, the antimicrobial agent containing the protein of the present invention as an active ingredient can fundamentally solve the problem of antimicrobial resistance, thereby increasing the product lifespan as an antimicrobial agent. can
따라서, 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)에 대한 특이적 사멸능을 가지는 본 발명의 CHAP-161LysSAP26 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the antibiotic containing the CHAP-161 LysSAP26 recombinant protein of the present invention having a specific killing activity for Clostridium difficile as an active ingredient is useful as an antibiotic with excellent antibacterial, bactericidal and antiseptic effects can be used
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for explaining the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
<실시예 1> LysSAP26 엔도리신과 LysSAP26 C-말단 결실 돌연변이 재조합 단백질 CHAP-139<Example 1> LysSAP26 endolysin and LysSAP26 C-terminal deletion mutant recombinant protein CHAP-139 LysSAP26LysSAP26 , CHAP-161, CHAP-161 LysSAP26LysSAP26 의 생산 및 정제production and purification of
LysSAP26 엔도리신과 LysSAP26 C-말단 결실 돌연변이 재조합 단백질 CHAP-139LysSAP26, CHAP-161LysSAP26을 발현하는 플라스미드 벡터 pLysSAP26 (6.12 Kbp), pCHAP139 (5.78 Kbp), pCHAP161 (5.89 Kbp)의 제조방법은 아래와 같다. Plasmid vectors pLysSAP26 (6.12 Kbp), pCHAP139 (5.78 Kbp), and pCHAP161 (5.89 Kbp) expressing LysSAP26 endolysin and LysSAP26 C-terminal deletion mutant recombinant proteins CHAP-139 LysSAP26 and CHAP-161 LysSAP26 are prepared as follows.
SAP26 파지에서 게놈을 추출하여 이를 주형으로 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머는 아래 표 1과 같다.The genome was extracted from the SAP26 phage and subjected to polymerase chain reaction (PCR) using this as a template, and the primers used at this time are shown in Table 1 below.
표 1에서 언급한 프라이머를 사용하여 생산된 PCR 단편은 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 밴드를 용리하여 수득하였다.PCR fragments produced using the primers mentioned in Table 1 were obtained by performing electrophoresis on an agarose gel and then eluting the band.
상기 PCR 단편은 각각 제한효소 NdeI 및 XhoI를 처리하여 절단한 후, 동일한 효소로 절단된 발현 벡터(pET21a)와 각각 라이게이션(ligation)하였다. 대장균 BL21(DE3)을 상기 제작된 벡터로 각각 형질전환 시킨 후, 100 ㎍/ml의 암피실린(ampicilin)이 첨가된 LB 액체 배지에서 세균의 흡광도가 0.6(600 nm 파장)이 될 때 까지 배양하였다. 다음으로 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 18℃에서 16시간 동안 배양하여 각 단백질이 발현될 수 있도록 유도하였다. The PCR fragments were digested with restriction enzymes NdeI and XhoI, respectively, and then ligated with the expression vector (pET21a) digested with the same enzymes. After transforming E. coli BL21 (DE3) with the above-constructed vectors, they were cultured in LB liquid medium supplemented with 100 μg/ml ampicillin until the absorbance of the bacteria reached 0.6 (600 nm wavelength). Next, IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) was added to a final concentration of 0.1 mM and incubated at 18 ° C for 16 hours to induce expression of each protein.
이후, 세균을 수확한 후, 용해 버퍼[50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 200 mM NaCl] 및 초음파 파쇄기로 세균을 파쇄하였다. 파쇄된 세균 용해물을 원심분리하여 상등액을 취하고, Ni-NTA 컬럼에 주입하였으며, 용출 버퍼[500 mM 이미다졸(imidazole), 50 mM Tris-Cl(pH 8.0), 200 mM NaCl]를 이용하여 C-말단에 6개의 히스티딘(histidine)이 태그된 LysSAP26, CHAP-139LysSAP26, CHAP-161LysSAP26 단백질을 정제하였다.Then, after harvesting the bacteria, the bacteria were disrupted using a lysis buffer [50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 200 mM NaCl] and an ultrasonicator. The supernatant was collected by centrifugation of the disrupted bacterial lysate, injected into a Ni-NTA column, and C using an elution buffer [500 mM imidazole, 50 mM Tris-Cl (pH 8.0), 200 mM NaCl]. -LysSAP26, CHAP-139 LysSAP26 , and CHAP-161 LysSAP26 proteins tagged with six histidines at the end were purified.
상기 정제된 각 단백질을 확인하기 위하여, SDS-PAGE (12%)를 수행한 후, 쿠마씨 블루(coomassie blue) 염색한 결과, 도 1과 같이 LysSAP26, CHAP-139LysSAP26, CHAP-161LysSAP26 단백질이 각각 약 30, 17.4, 그리고 20 kD 부위에서 확인되었으며 anti-6xHis monoclonal antibody를 사용하여 웨스턴 분석을 한 결과, 6×His 태그된 각 단백질이 발현되었음을 확인하였다.In order to identify each of the purified proteins, after performing SDS-PAGE (12%), as a result of coomassie blue staining, as shown in FIG. 1, LysSAP26, CHAP-139 LysSAP26 , and CHAP-161 LysSAP26 proteins It was identified at about 30, 17.4, and 20 kD regions, respectively, and as a result of Western analysis using an anti-6xHis monoclonal antibody, it was confirmed that each 6xHis tagged protein was expressed.
도 1A에서 M은 단백질 크기 마커, 각 젤 사진의 번호는 각 단백질 정제 분획 번호이며, 도 1B는 RKR 단백질에 대한 anti-6×His monoclonal antibody를 사용한 웨스턴 시험결과이다.In FIG. 1A, M is a protein size marker, the number of each gel picture is the number of each protein purification fraction, and FIG. 1B is a Western test result using an anti-6×His monoclonal antibody against RKR protein.
CHAP-161LysSAP26의 아미노산 서열과 수는 히스티딘 태그 포함 169개의 아미노산(서열번호 1)으로 구성되며, 이론상 단백질 크기가 18.6 kDa이다. 히스티딘 태그가 제외된 유전자 암호화 서열은 483 bp이다(서열번호 2).The amino acid sequence and number of CHAP-161 LysSAP26 is composed of 169 amino acids (SEQ ID NO: 1) including a histidine tag, and the theoretical protein size is 18.6 kDa. The gene coding sequence excluding the histidine tag is 483 bp (SEQ ID NO: 2).
<실시예 2> LysSAP26 엔도리신과 LysSAP26 C-말단 결실 돌연변이 재조합 단백질 CHAP-139<Example 2> LysSAP26 endolysin and LysSAP26 C-terminal deletion mutant recombinant protein CHAP-139 LysSAP26LysSAP26 , CHAP-161, CHAP-161 LysSAP26LysSAP26 의 항균활성 비교 시험Antibacterial activity comparison test of
LysSAP26, CHAP-139LysSAP26, CHAP-161LysSAP26의 항균활성을 조사하기 위하여, 아시네토박터 바우마니 ATCC 17978과 황색포도상구균 ATCC 25923을 대상균주로 하여 다음과 같이 항균능을 측정하였다. 각 균을 Blood Agar Plate 배지에 배양하여 37℃에서 18시간 배양한 후, 멸균한 Mueller Hinton Broth 배지를 이용하여 약 104 CFU/mL까지 희석하였다. 희석된 세균 배양액 100 μL와 선택된 단백질 100 μL (최종농도 5, 12.5, 25, 50, 75 μg/mL)를 96 well plate에서 혼합한 후, 혼합액을 약 37℃에서 20시간 배양하고 각각 항균 활성을 Optical Density 600 nm에서 96 well plate reader를 사용하여 흡광도를 측정하고, 수치는 Control을 기준값 100%으로 하여 백분율로 나타내었다(도 2). 흡광도의 값이 낮을수록 항균능 또는 항균율이 높다.LysSAP26, CHAP-139 LysSAP26 , CHAP-161 In order to investigate the antibacterial activity of LysSAP26 , Acinetobacter baumani ATCC 17978 and Staphylococcus aureus ATCC 25923 were used as target strains and the antibacterial activity was measured as follows. Each bacteria was cultured on a Blood Agar Plate medium and cultured at 37° C. for 18 hours, and then diluted to about 10 4 CFU/mL using a sterilized Mueller Hinton Broth medium. After mixing 100 μL of the diluted bacterial culture medium and 100 μL of the selected protein (final concentrations of 5, 12.5, 25, 50, and 75 μg/mL) in a 96-well plate, the mixture was incubated at about 37°C for 20 hours, and each antibacterial activity was measured. The absorbance was measured using a 96 well plate reader at
시험 결과 CHAP-161LysSAP26이 25 μg/mL와 그 이상 농도에서 LysSAP26과 같이 아시네토박터 바우마니 균을 거의 완전히 사멸(95% 이상의 항균율)하였으며, 5와 12. 5 μg/mL 농도에서는 CHAP-161LysSAP26(약 80, 82% 항균율)이 LysSAP26(약 15, 42% 항균율)보다 좋은 항균활성을 나타내었다. CHAP-139LysSAP26는 시험한 모든 농도에서 CHAP-161LysSAP26보다 낮은 항균율을 보였다(5, 12.5, 25, 50 μg/mL에서 각각 약 45, 50, 55, 65% 항균율)(도 2A). 황색포도상구균에 대한 항균시험 결과 25, 50, 75 μg/mL의 농도구간에서는 CHAP-161LysSAP26(각각 65%, 95%, 95% 이상)이 LysSAP26(각각 55%, 95%, 95% 이상)과 CHAP-139LysSAP26(각각 35%, 45%)보다 항균율이 높았다(도 2B). CHAP-139LysSAP26는 단백질의 수득율 문제로 75 μg/mL 농도에서 시험을 수행할 수 없었다.As a result of the test, CHAP-161 LysSAP26 almost completely killed Acinetobacter baumani bacteria (95% or more antibacterial rate) like LysSAP26 at 25 μg/mL and higher concentrations, and at concentrations of 5 and 12.5 μg/mL, CHAP-161 LysSAP26 161 LysSAP26 (about 80, 82% antibacterial rate) showed better antibacterial activity than LysSAP26 (about 15, 42% antibacterial rate). CHAP-139 LysSAP26 showed lower antimicrobial rates than CHAP-161 LysSAP26 at all concentrations tested (about 45, 50, 55, and 65% antibacterial rates at 5, 12.5, 25, and 50 μg/mL, respectively) (FIG. 2A). As a result of the antimicrobial test against Staphylococcus aureus, CHAP-161 LysSAP26 (65%, 95%, and 95% or more) in the concentration range of 25, 50, and 75 μg/mL, respectively, LysSAP26 (55%, 95%, and 95% or more, respectively) and CHAP-139 had higher antibacterial rates than LysSAP26 (35% and 45%, respectively) (Fig. 2B). CHAP-139 LysSAP26 could not be tested at a concentration of 75 μg/mL due to protein yield problems.
재조합 단백질의 아시네토박터 바우마니와 황색포도상구균에 대한 항균능 비교실험 결과는 CHAP-161LysSAP26이 가장 우수한 것으로 나타났다. 단백질의 안정성에 있어서, 단백질 정제 15일 후 LysSAP26은 수용액에서 침전하여 활성을 잃는 반면에 CHAP-161LysSAP26은 LysSAP26와 비교하여 약간의 침전이 관찰되어 단백질의 안정성 측면에서도 우수하였다(도 3).As a result of the comparison test of the antibacterial activity of the recombinant protein against Acinetobacter baumani and Staphylococcus aureus, CHAP-161 LysSAP26 was found to be the most excellent. In terms of protein stability, after 15 days of protein purification, LysSAP26 precipitated in an aqueous solution and lost its activity, whereas CHAP-161 LysSAP26 was slightly precipitated compared to LysSAP26, which was excellent in terms of protein stability (FIG. 3).
항균 활성이 있는 단백질의 수득율을 비교하였을 경우, 아래 표 2에서 보이는 바와 같이 CHAP-161LysSAP26이 1 리터의 배양액에서 17.32 mg, LysSAP26은 2.672 mg, CHAP-139LysSAP26는 2.032 mg을 얻을 수 있어서 CHAP-161LysSAP26이 항균효소의 수득율이 3종의 단백질 중에서 월등하다는 결과를 나타냈다.When comparing the yield of proteins with antibacterial activity, as shown in Table 2 below, 17.32 mg of CHAP-161 LysSAP26 , 2.672 mg of LysSAP26, and 2.032 mg of CHAP-139 LysSAP26 could be obtained in 1 liter of the culture medium. 161 LysSAP26 showed that the yield of antibacterial enzyme was superior among the three proteins.
(protein yield showing antimicrobial activity from 1 Liter culture, mg/Liter) Protein purification yield
(protein yield showing antimicrobial activity from 1 Liter culture, mg/Liter)
<실시예 3> CHAP-161<Example 3> CHAP-161 LysSAP26LysSAP26 의 클로스트리듐 디피실 세균 사멸능 시험Clostridium difficile bacterial killing ability test
클로스트리듐 디피실 세균에 대한 생장 억제 능력을 측정하기 위해, 클로스트리디듐 디피실 표준균주 Clostridium difficile ATCC 9689와 클로스트리디듐 디피실 임상균주 3주(PO3645, PO3780, PO3783)를 대상으로 CHAP-161LysSAP26의 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하였다(도 4A). To measure the growth inhibition ability of Clostridium difficile bacteria, CHAP-161 The minimum inhibitory concentration (MIC) of LysSAP26 was measured (FIG. 4A).
각 세균은 Mueller Hinton Broth(MHB)를 이용하여 5×10⁴CFU/well의 세균수가 되도록 준비하고, 여기에 정제된 CHAP-161LysSAP26을 각각 5, 10, 25, 50, 75 μg/mL가 되도록 가하여 혐기조건에서 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 다음, 세균의 생장정도를 나안으로 확인하였다. 그 결과, well plate에서 모든 대조군(-CHAP-161LysSAP26)에서는 세균의 생장이 관찰되는 반면에 시험군(+CHAP-161LysSAP26)에서는 Clostridium difficile ATCC 9689와 Clostridium difficile PO3645에서는 25 μg/mL 이상의 단백질 량에서 균의 생장이 관찰되지 않았으며, 다른 임상균주 2 주는 50 μg/mL 이상에서 생장이 확인되지 않았다. Each bacterium was prepared to a bacterial count of 5 × 10⁴CFU/well using Mueller Hinton Broth (MHB), and purified CHAP-161 LysSAP26 was added thereto to 5, 10, 25, 50, and 75 μg/mL, respectively, to anaerobically After reacting at 37 ° C. for 16 hours under the condition, the degree of bacterial growth was confirmed with the naked eye. As a result, bacterial growth was observed in all control groups (-CHAP-161 LysSAP26 ) in the well plate, whereas in the test group (+CHAP-161 LysSAP26 ), Clostridium difficile
클로스트리듐 디피실 세균에 대한 CHAP-161LysSAP26의 최소살균농도(Minimum bactericidal concentration, MBC)를 다음과 같이 측정하였다(도 4B). MIC 실험에서 확인한 각 well의 혼합액을 혐기조건에서 Mueller Hinton Agar (MHA) plate에 20μL씩 접종한 후, 37℃에서 18~24시간 배양하고 세균의 성장 여부를 확인하였다. 그 결과, CHAP-161LysSAP26 25 μg/mL와 그 이상의 농도에서 Clostridium difficile ATCC 9689와 Clostridium difficile PO3645가 사멸하였으며, 다른 임상균주 2주는 CHAP-161LysSAP26 50 μg/mL와 그 이상의 농도에서 사멸되었다 (도 4B). MIC와 MBC 실혐 결과를 토대로 CHAP-161LysSAP26는 MIC와 MBC 값이 같은 살균능(bactericidal effect)이 있음을 입증하였다. The minimum bactericidal concentration (MBC) of CHAP-161 LysSAP26 against Clostridium difficile bacteria was measured as follows (FIG. 4B). After inoculating 20 μL of the mixed solution of each well confirmed in the MIC experiment on a Mueller Hinton Agar (MHA) plate under anaerobic conditions, it was incubated at 37 ° C for 18 to 24 hours and the growth of bacteria was confirmed. As a result, CHAP-161 LysSAP26 Clostridium difficile
참고로 LysSAP26은 클로스트리디듐 디피실에 대한 MIC 및 MBC의 측정수치에 따르면 CHAP-161LysSAP26과 비교하여 50% 이하의 항균능을 보여주었다.For reference, LysSAP26 showed 50% or less antibacterial activity compared to CHAP-161 LysSAP26 according to the MIC and MBC measurements for Clostrididium difficile.
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실시예Example
4> 클로스트리듐 4> Clostridium
디피실Difficile
감염 동물 모델에 대한 CHAP- CHAP- for
1. 클로스트리듐 디피실 균주의 준비1. Preparation of Clostridium difficile strains
클로스트리듐 디피실 ATCC 9689, 임상분리주 CD-M-5와 CD-H-7의 독소 유전자 및 독소 단백질의 발현량은 아래의 표 3과 같다.The expression levels of toxin genes and toxin proteins of Clostridium difficile
2. 클로스트리듐 디피실 감염 동물모델2. Clostridium difficile infection animal model
5주령의 C57BL/6 마우스의 면역 상실 주사를 2회 투여하고 음용수에 카나마이신(kanamycin 0.4 mg/mL, Nacalai Tesque), 젠타마이신(gentamicin 0.035 mg/mL, Nacalai Tesque), 콜리스틴(colistin, 850 U/mL, Sigma-Aldrich), 메트로니다졸(metronidazole 0.215 mg/mL, Nacalai)의 및 반코마이신(vancomycin, 0.045mg/mL)을 혼합한 항생제 칵테일을 준비한 후 마우스는 5일 동안 항생제 칵테일을 먹인 다음 2일 동안 멸균된 물을 먹였다. 세균 감염일 하루 전에 clindamycin (20mg/kg)의 단일 용량을 복강 내 주사하였다.Immunodeficiency injections of 5-week-old C57BL/6 mice were administered twice and kanamycin (kanamycin 0.4 mg/mL, Nacalai Tesque), gentamicin (gentamicin 0.035 mg/mL, Nacalai Tesque), and colistin (850 U) were administered in drinking water. /mL, Sigma-Aldrich), metronidazole (0.215 mg/mL, Nacalai), and vancomycin (0.045 mg/mL) were prepared, and mice were then fed the antibiotic cocktail for 5 days, followed by 2 days. fed with sterile water. One day before bacterial infection, a single dose of clindamycin (20 mg/kg) was injected intraperitoneally.
클로스트리듐 디피실 ATCC 9689, 임상분리주 CD-M-5와 CD-H-7을 각각 경구로 투입(109 CFU/mouse)하여 감염을 유도하고 24시간 후 CHAP-161(150 μg, 300 μg), PBS(negative control)를 각각 주사 후 14일 동안 추적 관찰하였다(도 5). 마우스 실험군은 다음과 같다. Clostridium difficile
- 그룹 1. 0일과 7일에 100 μL의 PBS 주입 된 음성 대조군-
- 그룹 2. 0일과 7일에 150 μg의 CHAP-161을 주입한 안전성 테스트 그룹-
- 그룹 3. 0일과 7일에 300 μg의 CHAP-161을 주입한 안전성 테스트 그룹-
- 그룹 4. 0일과 7일에 C. difficile ATCC 9689에 감염된 대조군- Group 4. Control group infected with C. difficile
- 그룹 5. 0일과 7일에 C. difficile ATCC 9689로 감염, 그리고 각각 3시간 후 100 μg의 CHAP-161로 주사-
- 그룹 6. 0일과 7일에 C. difficile ATCC 9689로 감염, 그리고 각각 3시간 후 1일 후 150 μg의 CHAP-161로 주사-
- 그룹 7. 0일과 7일에 C. difficile 임상균주 CD-M-5에 감염된 감염 통제 그룹-
- 그룹 8. 0일과 7일에 C. difficile 임상균주 CD-M-5로 감염, 그리고 각각 3시간 후 100 μg의 CHAP-161로 주사-
- 그룹 9. 0일과 7일에 C. difficile 임상균주 CD-M-5로 감염, 그리고 각각 3시간 후 150 μg의 CHAP-161로 주사-
- 그룹 10. 0일과 7일에 C. difficile 임상균주 CD-H-7에 감염된 감염 통제 그룹-
- 그룹 11. 0일과 7일에 C. difficile 임상균주 CD-H-7로 감염, 그리고 각각 3시간 후 100 μg의 CHAP-161로 주사-
- 그룹 12. 0일과 7일에 C. difficile 임상균주 CD-H-7로 감염, 그리고 각각 3시간 후 150 μg의 CHAP-161를 주사-
매일 생존률 및 몸무게 변화를 기록하고, 총 14일 동안 확인 후 실험을 종료하였다.The survival rate and weight change were recorded every day, and the experiment was terminated after confirmation for a total of 14 days.
실험 결과, 그룹 1-3은 14일간 100%의 생존율을 보였으며 그룹 4는 6일째 50%의 생존율에 8일 이후로는 25%의 생존율을 보였으나 CHAP-161을 100 μg, 150 μg을 주사한 그룹 5와 6은 100%의 생존율을 보였다. 유사한 결과로 그룹 10은 6일째 되는 날 66%의 생존율을 보이다가 9일 이후로 33%의 생존율을 보였으나 CHAP-161을 100 μg, 150 μg을 주사한 그룹 11과 12는 100%의 생존율을 보였다. 그룹 7은 클로스트리듐 디피실 감염 대조군인 그룹 4와 10과는 다르게 시험일 동안 한 마리도 치사되지 않았다. 다만, 생존한 쥐들의 몸무게의 변화 추적 결과 그룹 7은 감염 4일째부터 유의적인 몸무게의 감소가 14일까지 계속 지속되는 반면, CHAP-161을 100 μg, 150 μg을 주사한 그룹 8과 9의 치료군은 정상 마우스 대조군과 유사하게 몸무게의 꾸준한 증가를 보였다.As a result of the experiment, groups 1-3 showed a 100% survival rate for 14 days, and group 4 showed a 50% survival rate on the 6th day and a 25% survival rate after the 8th day, but CHAP-161 was injected with 100 μg or 150 μg One group, 5 and 6, had a survival rate of 100%. With similar results,
C. difficile ATCC 9689와 임상균주 CD-H-7 감염 그룹군의 생존 마우스의 몸무게 변화도 감염 대조군인 그룹 4와 그룹 10은 감염 4일 이후 꾸준한 감소의 경향을 14일까지 보이지만 치료군인 그룹 5, 6과 그룹 11, 12는 몸무게의 꾸준한 증가 또는 몸무게 유지를 14일까지 보였다. C. difficile Changes in body weight of surviving mice in the group infected with
모든 세균 감염군에서 감염 14일 동안 점차 대변의 모양이 비정형의 수분을 다량 함유한 설사를 보였으나 치료군에서는 정상 대조군의 마우스에서처럼 대변의 모양이 럭비공 모양의 전형적인 형태를 보였다(본 결과를 포함하지 않았음).In all bacterial infection groups, the shape of the stool gradually showed atypical watery diarrhea during the 14 days of infection, but in the treatment group, the shape of the stool showed a typical rugby ball shape, as in the normal control group (this result is not included. did not).
독소 A, B를 모두 발현하는 ATCC 9689 균주와 임상분리주 CD-H-7은 유사한 마우스 치사율을 보였으며, 독소 A만을 발현하는 임상균주 CD-M-5는 치사율을 보이지 않고 설사를 유발하고 몸무게를 감소시키는 영향을 보였다. 이를 통하여 CHAP-161의 클로스트리듐 디피실 유발 장염(혹은 설사)에 대한 설사 질환 및 몸무게의 정상화 효과를 확인하였다. 상기 실험 결과는 도 6 내지 도 11에서 나타냈다.The
한편, 하기에 본 발명의 단백질을 이용한 제제예를 예시하나 이는 본 발명을 이에 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다. On the other hand, examples of preparations using the protein of the present invention are exemplified below, but this is not intended to limit the present invention thereto, but is only intended to be specifically described.
[제제예 1: 산제의 제조][Formulation Example 1: Preparation of Powder]
재조합 단백질 CHAP-161LysSAP26 300 ㎎Recombinant Protein CHAP-161 LysSAP26 300 mg
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.A powder is prepared by mixing the above ingredients and filling them in an airtight bag.
[제제예 2: 정제의 제조][Formulation Example 2: Preparation of tablets]
재조합 단백질 CHAP-161LysSAP26 300 ㎎Recombinant Protein CHAP-161 LysSAP26 300 mg
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.After mixing the above ingredients, tablets are prepared by tableting according to a conventional tablet manufacturing method.
[제제예 3: 캡슐제의 제조][Formulation Example 3: Preparation of capsule formulation]
재조합 단백질 CHAP-161LysSAP26 300 ㎎Recombinant Protein CHAP-161 LysSAP26 300 mg
결정성 셀룰로오스 3 ㎎3 mg of crystalline cellulose
락토오스 14.8 ㎎Lactose 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎Magnesium stearate 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.Capsules are prepared by mixing the above ingredients and filling them into gelatin capsules according to a conventional capsule preparation method.
[제제예 4: 주사제의 제조][Formulation Example 4: Preparation of Injection]
재조합 단백질 CHAP-161LysSAP26 300 ㎎Recombinant Protein CHAP-161 LysSAP26 300 mg
만니톨 180 ㎎Mannitol 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 ㎎Sterile Distilled Water for Injection 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 ㎎Na 2 HPO 4 2H 2 O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2) 상기의 성분 함량으로 제조한다.According to the conventional method for preparing injections, it is prepared with the above ingredient content per 1 ampoule (2).
[제제예 5: 액제의 제조][Formulation Example 5: Preparation of liquid formulation]
재조합 단백질 CHAP-161LysSAP26 300 ㎎Recombinant Protein CHAP-161 LysSAP26 300 mg
이성화당 10 gIsomerized sugar 10 g
만니톨 5 g5 g mannitol
정제수 적량Appropriate amount of purified water
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.According to the conventional manufacturing method of liquid medicine, each component is dissolved in purified water, lemon flavor is added in an appropriate amount, the above components are mixed, and then purified water is added to adjust the total to 100, and then filled in a brown bottle to be sterilized. to prepare a liquid.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific parts of the present invention in detail above, it is clear that these specific techniques are only preferred embodiments for those skilled in the art, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is indicated by the following claims, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and equivalent concepts thereof should be construed as being included in the scope of the present invention.
Claims (4)
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PCT/KR2022/020105 WO2023113396A1 (en) | 2021-12-14 | 2022-12-12 | Use of recombinant antibacterial protein for effectively killing clostridium difficile bacteria |
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR102131692B1 (en) | 2018-09-11 | 2020-07-08 | 경북대학교 산학협력단 | Use of novel recombinant enzyme LysSAP26 killing pathogenic bacteria |
-
2022
- 2022-12-09 KR KR1020220171776A patent/KR20230091030A/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR102131692B1 (en) | 2018-09-11 | 2020-07-08 | 경북대학교 산학협력단 | Use of novel recombinant enzyme LysSAP26 killing pathogenic bacteria |
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