KR102314731B1 - Recombinant endolysin ClyC with potential bacteriocidal activity against Staphylococcus aureus - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 황색포도상구균에 대한 높은 사멸 능력을 가진 재조합 엔도라이신 ClyC에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기존의 엔도라이신에 비해 다양한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 향상된 균사멸능과 황색포도상구균의 생물막 제거능을 가지는 재조합 엔도라이신 ClyC에 관한 것이다.The present invention relates to recombinant endolysin ClyC having a high killing ability against Staphylococcus aureus, and more particularly, to Staphylococcus aureus compared to conventional endolysin. It relates to a recombinant endolysin ClyC having a biofilm removal ability.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 그람 양성의 통성혐기성 세균으로 인간이나 동물의 피부, 분변, 소화관에 상재하는 포도상 구균의 하나이다. 황색포도상구균은 군집을 이루는 균의 모양이 포도 송이를 닮아 붙여졌으며 균이 덩어리져 있는 상태인 생물막(biofilm)을 쉽게 형성한다고 알려져 있다. 황색포도상구균이 내열성인 외독소(TSST-1, EF, 알파, 베타, 델타 독소)를 생산할 경우 심각한 식중독을 일으키기도 하며, 식세포를 죽이는 독소, 응고효소, 용혈소 등을 분비하여 감염 숙주세포의 면역 시스템에 저항하여 화농성 감염증을 일으킨다. 이로 인해 균혈증이나 패혈증 등의 심각한 질병을 유도하기도 한다. Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) is a Gram-positive facultative anaerobic bacterium, one of the staphylococci that resides in the skin, feces, and digestive tract of humans or animals. Staphylococcus aureus is known to easily form a biofilm, which is a cluster of bacteria, which resembles a grape cluster. When Staphylococcus aureus produces heat-resistant exotoxins (TSST-1, EF, alpha, beta, and delta toxins), it can cause severe food poisoning, and it secretes toxins, coagulase, and hemolysis that kill phagocytes, and the immune system of the infected host cell. resistance to purulent infections. This can lead to serious diseases such as bacteremia or sepsis.
상기와 같은 특징이 있는 황색포도상구균을 제어하기 위해, 현재까지는 항생제가 주로 사용되어 왔다. 하지만, 항생제의 광범위한 사용으로 인해 메티실린 저항성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus), 반코마이신 저항성 황색포도상구균(Vancomycin-resistant S. aureus)의 발병이 최근 증가하고 있다. 따라서 기존 합성항생제와는 완전히 다른, 새로운 기작의 항생물질이 요구되고 있으며 박테리오파지 유래의 단백질인 엔도라이신이 최근 대안으로 떠오르고 있다.In order to control Staphylococcus aureus having the above characteristics, antibiotics have been mainly used until now. However, due to the widespread use of antibiotics, the incidence of methicillin-resistant S. aureus and vancomycin-resistant S. aureus has recently increased. Therefore, antibiotics with a new mechanism, completely different from existing synthetic antibiotics, are required, and endolysin, a protein derived from bacteriophage, is emerging as an alternative recently.
엔도라이신(리신)은 세균을 죽이는 생물체인 박테리오파지가 세균을 사멸시킬 때 작용하는 일종의 효소로서, 그람 양성균의 밖에서 처리하였을 때 세균의 세포벽 내의 펩티도글리칸(peptidoglycan layer)의 특정 연결부위(linkage)를 전달하는 역할을 한다. 따라서 엔도라이신은 기존의 항생제가 가진 멸균 기작(저해하는 방식의 bacteriostatic)이 아닌 새로운 멸균 기작으로 항생제 내성 문제를 근본적으로 해결하면서 낮은 농도로 세균을 빠르게 사멸시키는 항생제 대체 물질로 각광받고 있다.Endolysin (lysine) is a kind of enzyme that acts when bacteriophage, an organism that kills bacteria, kills bacteria. When treated outside of gram-positive bacteria, a specific linkage of peptidoglycan layer in the bacterial cell wall serves to convey Therefore, endolysin is in the spotlight as an antibiotic replacement material that rapidly kills bacteria at a low concentration while fundamentally solving the problem of antibiotic resistance as a new sterilization mechanism rather than the sterilization mechanism of the existing antibiotics (bacteriostatic inhibition).
기존에 존재하는 황색포도상구균을 죽이는 엔도라이신은 몇가지 문제점을 가지고 있다. 황색포도상구균을 목표로 하는 엔도라이신의 도메인 성분(domain composition)에 따라 5개의 그룹으로 나뉘는데, 각 그룹내 아미노산 서열 상동성이 90% 이상으로 높아 새로운 엔도라이신에 대한 발견이 어렵다. 또한, 천연에서 발견된 엔도라이신의 경우 대장균 내에서 과발현하여 대량 생산하는 것이 어렵고, 생산되더라도 용해도(solubility)가 낮아 실제 활용에 어려움이 있다. 따라서 황색포도상구균에 대한 제어 효능이 좋은 새로운 엔도라이신의 개발이 필요한 실정이다.Endolysin, which kills the existing Staphylococcus aureus, has several problems. It is divided into five groups according to the domain composition of endolysin targeting Staphylococcus aureus, and the amino acid sequence homology in each group is higher than 90%, making it difficult to discover new endolysins. In addition, in the case of endolysin found in nature, it is difficult to mass-produce it because it is overexpressed in E. coli, and even if it is produced, its solubility is low, so it is difficult to use it in practice. Therefore, there is a need for the development of a new endolysin with good control efficacy against Staphylococcus aureus.
본 발명은 기존의 엔도라이신에 비해 다양한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 향상된 균사멸능과 황색포도상구균의 생물막 제거능을 가지는 신규한 재조합 엔도라이신 ClyC을 제공하고자 한다.The present invention is to provide a novel recombinant endo-lysine ClyC with improved bacteria killing ability and yellow Biofilm Removal of Staphylococcus aureus against different S. aureus (Staphylococcus aureus), compared to traditional endo-lysine.
본 발명은 황색포도상구균 용혈능 및 황색포도상구균 생물막 제어능이 있는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 제공한다.The present invention provides an endolysin ClyC composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having Staphylococcus aureus hemolytic ability and Staphylococcus aureus biofilm control ability.
한편, 본 발명의 엔도라이신 ClyC에 있어서, 상기 황색포도상구균은, 일 예로 메티실린 저항성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)을 포함하는 것일 수 있다.On the other hand, in the endolysin ClyC of the present invention, the Staphylococcus aureus may include, for example, methicillin-resistant S. aureus (MRSA).
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a food composition comprising the endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 황색포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Staphylococcus aureus infection comprising endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
한편, 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 황색포도상구균은, 일 예로 메티실린 저항성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)을 포함하는 것일 수 있다.Meanwhile, in the composition of the present invention, the Staphylococcus aureus may include, for example, Methicillin-resistant S. aureus (MRSA).
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a feed composition comprising endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 세정제 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cleaning composition comprising the endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명은 기존의 모체 엔도라이신에 비해 다양한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 향상된 균사멸능과 황색포도상구균의 생물막 제거능을 가지는 신규한 재조합 엔도라이신 ClyC을 제공할 수 있다. 또한, 모체 엔도라이신과 달리 약간의 열에도 최대 활성의 95%의 안정적인 항균활성을 나타내 식품, 의약 및 제약 산업에도 활용할 수 있다.The present invention can provide a novel recombinant endo-lysine ClyC with improved bacteria killing ability and yellow Biofilm Removal of Staphylococcus aureus against different S. aureus compared to conventional matrix endo-lysine (Staphylococcus aureus). In addition, unlike the parent endolysin, it exhibits stable antibacterial activity of 95% of its maximum activity even with a slight heat, so it can be used in food, medicine and pharmaceutical industries.
도 1은 Domain shuffling 방법을 활용한 재조합 엔도라이신 라이브러리를 구축하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 2는 항균활성이 우수한 엔도라이신 ClyC 선별을 나타낸 도식이다.
도 3은 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 도메인 분석(A) 및 단백질 정제 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 숙주세포 용균 효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 최적 pH 및 온도 조건에 대한 항균 활성을 나타낸 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 황색포도상구균 생물막 제거능을 나타낸 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 기본 버퍼인 Tris-HCl 내에서의 항균 활성을 나타낸 결과 그래프이다. 비교를 위해 모체의 엔도라이신 LysSA12를 사용하였다.
도 8은 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 유제품(우유)(A) 및 동물의 혈액(B)과 혈청(C) 내 사멸 능력을 나타낸 결과 그래프이다. 비교를 위해 모체의 엔도라이신 LysSA12를 사용하였다.1 is a diagram showing the process of constructing a recombinant endolysin library using the domain shuffling method.
2 is a schematic diagram showing the selection of endolysin ClyC with excellent antibacterial activity.
Figure 3 shows the domain analysis (A) and protein purification results (B) of the recombinant endolysin ClyC of the present invention.
4 is a graph showing the host cell lysis effect of recombinant endolysin ClyC of the present invention.
5 is a graph showing the antibacterial activity of the recombinant endolysin ClyC of the present invention for optimal pH and temperature conditions.
Figure 6 is a graph showing the results of the Staphylococcus aureus biofilm removal ability of the recombinant endolysin ClyC of the present invention.
7 is a graph showing the antibacterial activity in Tris-HCl, which is a basic buffer of recombinant endolysin ClyC of the present invention. For comparison, the parental endolysin LysSA12 was used.
8 is a graph showing the killing ability of recombinant endolysin ClyC in dairy products (milk) (A) and animal blood (B) and serum (C) of the present invention. For comparison, the parental endolysin LysSA12 was used.
본 발명은 황색포도상구균 용혈능 및 황색포도상구균 생물막 제어능이 있는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 제공한다.The present invention provides an endolysin ClyC composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having Staphylococcus aureus hemolytic ability and Staphylococcus aureus biofilm control ability.
본 발명은 도메인 셔플링(domain shuffling) 기법을 활용하여 다양한 조합의 도메인들을 연결하여 재조합 엔도라이신 라이브러리를 구축하고(도 1), 신속 검출 시스템을 활용하여 우수한 항균 능력이 있는 엔도라이신을 선별하였다(도 2). 이를 통해 LysSA12의 CHAP(Cysteine-and Histidine- dependent Aminohydrolase Peptidase) 도메인과 LysPALS2의 CBD(Cell wall Binding Domain) 도메인으로 구성되어 있는 재조합 엔도라이신 ClyC를 얻을 수 있었다.The present invention builds a recombinant endolysin library by linking various combinations of domains using a domain shuffling technique (FIG. 1), and selects endolysin with excellent antibacterial ability using a rapid detection system ( 2). Through this, it was possible to obtain recombinant endolysin ClyC composed of the Cysteine-and Histidine-dependent Aminohydrolase Peptidase (CHAP) domain of LysSA12 and the Cell Wall Binding Domain (CBD) domain of LysPALS2.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 황색포도상구균은, 일 예로 메티실린 저항성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에서는 황색포도상구균을 숙주로 하여 수행한 용균 활성 실험에서 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC가 모체가 되는 엔도라이신보다 병원균 황색포도상구균 종에 대해 향상된 균 사멸능을 나타내는 것을 확인하였다.Meanwhile, in the present invention, the Staphylococcus aureus may include, for example, methicillin-resistant S. aureus (MRSA). In the present invention, in the lytic activity experiment performed using Staphylococcus aureus as a host, it was confirmed that the recombinant endolysin ClyC of the present invention exhibited improved mycelial killing ability against the pathogen Staphylococcus aureus species than the parent endolysin.
한편, 생물막이란 미생물이 주된 구성 요소가 되어 생성된 막을 일컬으며, 황색포도상구균에 의해서도 폴리스티렌에 형성되게 된다. 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC는 모체가 되는 엔도라이신보다 황색포도상구균의 생물막에 대한 제거 효과도 뛰어남을 확인하였다. On the other hand, the biofilm refers to a film produced by microorganisms as the main component, and is also formed on polystyrene by Staphylococcus aureus. It was confirmed that the recombinant endolysin ClyC of the present invention has an excellent removal effect on the biofilm of Staphylococcus aureus than the parent endolysin.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 황색포도상구균 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 황색포도상구균은, 일 예로 메티실린 저항성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)을 포함하는 것일 수 있다. In addition, the present invention provides a food composition comprising the endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Staphylococcus aureus infection comprising endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In this case, the Staphylococcus aureus may include, for example, methicillin-resistant S. aureus (MRSA).
본 발명의 식품 조성물은 바람직하게 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 초콜릿, 빵류, 스낵류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제 및 그 밖의 건강보조식품류 중 선택되는 어느 하나에 첨가되는 것이 좋으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 엔도라이신 ClyC는 바람직하게 식품 첨가제 대비 0.1~20중량% 포함되는 것이 좋다. 0.1중량% 미만일 경우에는 그 효과가 미비하고, 20중량%를 초과하는 경우에는 사용량 대비 효과 증가가 미미하여 비경제적이다.The food composition of the present invention is preferably meat, grain, caffeinated beverage, general beverage, chocolate, bread, snack, confectionery, pizza, jelly, noodles, gum, ice cream, alcoholic beverage, alcohol, vitamin complex and other health supplements. It is preferably added to any one selected from, but is not necessarily limited thereto. Endolysin ClyC of the present invention is preferably contained in 0.1 to 20% by weight compared to food additives. When it is less than 0.1% by weight, the effect is insignificant, and when it exceeds 20% by weight, the increase in the effect is insignificant compared to the amount used, which is uneconomical.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 엔도라이신 ClyC는 상술한 바와 같이 황색포도상구균을 특이적으로 사멸시키고 그것에 의해 형성된 생물막을 효과적으로 제거할 수 있어, 황색포도상구균에 의해 유발되고 그것이 형성한 생물막으로 인해 만성화된 다양한 질환, 예컨대 유방염, 피부염, 패혈증, 화농성 질환, 식중독, 폐렴, 골수염, 농가진, 균혈증, 심내막염, 및 장염 등에 관한 치료에 효과적일 수 있다. 다만, 이러한 목적의 조성물에는 추가적 치료의 효과를 얻기 위하여 이미 황색포도상구균에 대해 항균 활성이 입증된 다른 성분이 추가로 포함될 수 있다.Endolysin ClyC contained in the pharmaceutical composition of the present invention can specifically kill Staphylococcus aureus and effectively remove the biofilm formed thereby, as described above, caused by Staphylococcus aureus and chronic due to the biofilm it formed It can be effective in treating various diseases such as mastitis, dermatitis, sepsis, purulent disease, food poisoning, pneumonia, osteomyelitis, impetigo, bacteremia, endocarditis, and enteritis. However, in order to obtain an additional therapeutic effect, the composition for this purpose may additionally contain other ingredients that have already demonstrated antibacterial activity against Staphylococcus aureus.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 엔도라이신 ClyC의 함량은, 사용방법, 복용자의 상태에 따라 바람직하게 조절하는 것이 좋다. 본 발명의 약학조성물에서 엔도라이신 ClyC의 함량은 약학조성물 대비 0.000001~5중량%일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물류가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제일 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가로 포함될 수 있다.The content of endolysin ClyC contained in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably adjusted according to the method of use and the condition of the user. The content of endolysin ClyC in the pharmaceutical composition of the present invention may be 0.000001 to 5% by weight compared to the pharmaceutical composition, but is not necessarily limited thereto. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient in addition to the active ingredient. Usable carriers, excipients or diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium sulfate, cellulose, methyl cellulose. , microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and minerals, and one or more of these may be used. In addition, when the prophylactic and therapeutic agents are pharmaceuticals, fillers, anti-aggregants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, or preservatives may be additionally included.
한편, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제 (PLASTERS), 과립제 (GRANULES), 로션제 (LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제 (LEMONADES), 방향수제 (AROMATIC WATERS), 산제 (POWDERS), 시럽제 (SYRUPS), 안연고제 (OPHTHALMIC OINTMENTS), 액제 (LIQUIDS FORMULATIONS), 에어로솔제 (AEROSOLS), 엑스제 (EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제 (OINTMENTS), 유동엑스제 (FLUIDEXTRACTS), 유제 (EMULSIONS), 현탁제 (SUSPENSIONS), 전제 (DECOCTIONS), 침제 (INFUSIONS), 점안제 (EYE DROPS), 정제 (TABLETS), 좌제 (SUPPOSITORIES), 주사제 (INJECTIONS), 주정제 (SPIRITS), 카타플라스마제 (CATAPLASMA), 캅셀제 (CAPSULES), 크림제 (CREAMS), 트로키제 (TROCOES), 팅크제 (TINCTURES), 파스타제 (PASTES), 환제 (PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.On the other hand, the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be in a preferred form depending on the method of use, particularly by adopting a method known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal. It is good to formulate. Examples of specific formulations include warning agents (PLASTERS), granules (GRANULES), lotions (LOTIONS), liniments (LINIMENTS), limonades (LEMONADES), fragrances (AROMATIC WATERS), powders (POWDERS), syrups ( SYRUPS), OPHTHALMIC OINTMENTS, LIQUIDS FORMULATIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, ELIXIRS, ointment (OINTMENTS), fluid extract (FLUIDEXTRACTS), emulsion (EMULSIONS) , Suspension (SUSPENSIONS), Prescription (DECOCTIONS), Injecting (INFUSIONS), Eye Drops (EYE DROPS), Tablets (TABLETS), Suppositories (SUPPOSITORIES), Injections (INJECTIONS), Alcoholic Tablets (SPIRITS), Cataplasma Agents (CATAPLASMA) , capsules (CAPSULES), creams (CREAMS), troches (TROCOES), tinctures (TINCTURES), pastas (PASTES), pills (PILLS), may be any one selected from soft or hard gelatin capsules.
한편, 본 발명 약학조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 약학조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.001~100mg/kg (체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 의해 변화될 수 있다.On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably determined in consideration of the administration method, the age, sex and weight of the user. For example, the pharmaceutical composition can be administered at least once per day at 0.001 to 100 mg/kg (body weight) based on the active ingredient. However, the above dosage is only an example for illustration, and may be changed depending on the state of the user.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 사료 조성물을 제공한다. 상기 사료 조성물은 총 중량에 대하여 상기 엔도라이신 ClyC를 0.000001~10중량% 함유할 수 있다. 본 발명의 상기 사료 조성물은 통상의 배합사료에 섞어서 경구투여의 방법으로 급여하며, 계속 투여 또는 과다 투여시에도 면역저하 등의 내성이나 부작용의 문제가 거의 없다.In addition, the present invention provides a feed composition comprising endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The feed composition may contain 0.000001 to 10% by weight of the endolysin ClyC based on the total weight. The feed composition of the present invention is mixed with a conventional feed composition and fed by oral administration, and there is almost no problem of tolerance or side effects such as immunosuppression even when continuously administered or overdosed.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 엔도라이신 ClyC을 포함하는 세정제 조성물을 제공한다. 본 발명의 세정제 조성물은 세정제 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가로 더 포함할 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.In addition, the present invention provides a cleaning composition comprising the endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The cleaning composition of the present invention may further include components commonly used in cleaning compositions, for example, conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers and fragrances, and carriers.
본 발명의 세정제 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the detergent composition of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide, etc. This can be used.
본 발명의 세정제 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.When the formulation of the cleaning composition of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene Glycol, 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid ester of sorbitan may be used.
본 발명의 세정제 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the detergent composition of the present invention is a suspension, as a carrier component, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester , microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar, or tracanth may be used.
본 발명의 세정제 조성물의 제형이 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the cleaning composition of the present invention is a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohydrocarbon, propellants such as propane/butane or dimethyl ether.
본 발명의 세정제 조성물의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the detergent composition of the present invention is surfactant-containing cleansing, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, Fatty acid amide ether sulfate, alkylamidobetaine, fatty alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative or ethoxylated glycerol fatty acid ester and the like can be used.
의료용 세정제로 사용될 경우에는 스프레이 형태로 바이오필름 형성을 막고자 하는 부분, 즉 인공관절, 도뇨관 표면, 내시경 또는 상처에 뿌리는 방법이 가능하다. 또한, 손을 사용한 세척은 물론이고 초음파 세척기 및 자동 세척기를 이용할 수도 있다. 또, 의료용 장치를 의료용세정제에 담구는 방법도 가능하다.When used as a medical cleaner, it is possible to spray it on the part to prevent biofilm formation in the form of a spray, that is, an artificial joint, the surface of a catheter, an endoscope, or a wound. In addition, as well as washing by hand, an ultrasonic washing machine and an automatic washing machine may be used. In addition, a method of immersing the medical device in a medical cleaning agent is also possible.
본 발명의 세정제 조성물은 조리 장소 및 조리 설비의 소독제로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 의료용 세정제에서의 엔도라이신 ClyC의 유효 용량은 보통으로 숙련된 당업자에 의해서 간단한 사전 조사를 거쳐 용이하게 결정될 수 있다. 특정 용량은 응용하고자 하는 분야 및 적용방법에 의해 좌우될 것이다. 본 발명의 조성물은 엔도라이신의 경우 0.001%(w/v)~0.1%(w/v), 바람직하게는 0.002%(w/v)~0.01%(w/v), 가장 바람직하게는 0.005%(w/v)를 포함한다. The cleaning composition of the present invention can be usefully used as a disinfectant for cooking places and cooking equipment. The effective dose of endolysin ClyC in the medical detergent used in the present invention can be easily determined by a person skilled in the art through simple preliminary investigation. The specific dosage will depend on the field and method of application in which it is intended. In the case of endolysin, the composition of the present invention is 0.001% (w/v) to 0.1% (w/v), preferably 0.002% (w/v) to 0.01% (w/v), most preferably 0.005% (w/v).
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예 및 실험예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail through the following examples and experimental examples. However, the scope of the present invention is not limited only to the following examples and experimental examples, and includes modifications of technical ideas equivalent thereto.
[실시예 1: 본 발명의 신규한 재조합 엔도라이신 ClyC 제조][Example 1: Preparation of novel recombinant endolysin ClyC of the present invention]
1) 도메인 셔플링(Domain shuffling) 방법을 활용한 재조합 엔도라이신 라이브러리 구축1) Recombinant endolysin library construction using domain shuffling method
본 발명은 단백질 공학 기술 중에 도메인 셔플링(Domain shuffling) 기법을 활용하여 만들어졌다. 자연의 엔도라이신은 EAD(Enzymatically active domain) 도메인과 CBD(Cell wall Binding Domain)으로 이루어져 있다. 여기서 EAD는 실제 세포벽(펩티도글리칸)의 bond를 자르는 역할을 하며, CBD는 특정한 세균에 대한 인식 및 접촉에 관련이 있다고 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 다양한 엔도라이신의 도메인끼리 다양하게 재조합시킴으로서 더 향상된 특징을 갖는 엔도라이신을 개발하고자 하였다.The present invention was made by utilizing a domain shuffling technique among protein engineering techniques. Natural endolysin consists of EAD (Enzymatically Active Domain) domain and CBD (Cell Wall Binding Domain). Here, EAD plays a role in cutting bonds of the actual cell wall (peptidoglycan), and CBD is known to be involved in the recognition and contact of specific bacteria. Therefore, in the present invention, it was attempted to develop endolysin having more improved characteristics by variously recombination between various domains of endolysin.
먼저, 도 1과 같이 황색포도상구균에 작용하는 다양한 종류의 엔도라이신을 고르고 BLAST, HMMER 등의 프로그램을 이용하여 해당 엔도라이신들의 도메인의 위치를 파악하였다. 그 후 유전자 재조합 기술을 통해 다양한 조합의 도메인들을 연결하여 재조합 엔도라이신 라이브러리를 구축하였다. First, as shown in FIG. 1, various types of endolysins acting on Staphylococcus aureus were selected and the positions of the domains of the corresponding endolysins were identified using programs such as BLAST and HMMER. Thereafter, a recombinant endolysin library was constructed by linking domains of various combinations through genetic recombination technology.
(2) 신속 검출 시스템을 이용한 항균활성이 우수한 엔도라이신 ClyC 선별(2) Selection of endolysin ClyC with excellent antibacterial activity using a rapid detection system
상기 재조합 엔도라이신 라이브러리를 구축한 후, 신속 검출 시스템을 활용하여 우수한 항균 능력이 있는 엔도라이신을 선별하였다. 도 2와 같이, 엔도라이신의 발현을 위해 2가지 종류의 프로모터를 갖는 벡터를 활용하였다. After constructing the recombinant endolysin library, endolysin with excellent antibacterial ability was selected using a rapid detection system. As shown in FIG. 2, vectors having two types of promoters were used for the expression of endolysin.
E.coli 세포 안에서 용해(lysis)시키는 단백질인 SPN1S를 나타내는 유전자가 발현 pBAD33 벡터에 들어가 있으며 재조합된 엔도라이신은 발현 pET28a 벡터에 들어가 있다. 따라서 SPN1S 유전자가 발현되면 E.coli가 깨뜨리면서 세포 내에서 발현된 엔도라이신이 밖으로 나오게 되고, 그 후 재조합 엔도라이신이 포함된 균 사멸물을 황색포도상구균이 도포된 고체 배지에 도팅(dotting)하게 되면, 투명한 형태의 용해 존(lysis zone)이 관찰되는데 이 크기와 선명도에 따라 다양한 엔도라이신의 항균 능력을 비교 및 대조할 수 있다. 본 발명에서는 600개 이상의 클론(clone)을 대상으로 스크리닝을 진행하여 신규 엔도라이신 ClyC을 선별하였다. The gene expressing SPN1S, a protein that lyses in E. coli cells, is contained in the expression pBAD33 vector, and the recombinant endolysin is contained in the expression pET28a vector. Therefore, when the SPN1S gene is expressed, the endolysin expressed in the cell is released as E. coli is broken, and then the mycelium containing the recombinant endolysin is dotted on the solid medium coated with Staphylococcus aureus. Then, a transparent lysis zone is observed, and the antibacterial ability of various endolysins can be compared and contrasted according to this size and clarity. In the present invention, a novel endolysin ClyC was selected by screening more than 600 clones.
(3) 본 발명의 엔도라이신 ClyC의 서열 확인, 정제 및 분리(3) Sequence confirmation, purification and isolation of endolysin ClyC of the present invention
선별된 엔도라이신 ClyC는 pET28a 벡터 내에 클로닝되어 있기 때문에 0.5Mm IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 20시간의 발현 이후 Tris-Cl (pH 6.8, 300 Mm NaCl, 30% 글리세롤(glycerol)) buffer에 희석하여 세포벽을 깼다. 깨진 대장균을 원심분리함으로써 단백질을 분리하고 니켈 친화 크로마토그래피(Nickel affinity chromatography) 방법을 이용해 순수한 엔도라이신 ClyC를 얻을 수 있었다. 재조합 엔도라이신 ClyC는 도 3의 A와 같이 LysSA12의 CHAP(Cysteine-and Histidine- dependent Aminohydrolase Peptidase) 도메인과 LysPALS2의 CBD(Cell wall Binding Domain) 도메인으로 구성되어 있으며, 도 3의 B와 같이 단백질 정제 결과를 통해 약 34.7 kDa의 크기를 가짐을 확인하였다. 재조합 엔도라이신 ClyC는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 2의 핵산서열에 의해 암호화되어 있다. 상기 정제된 엔도라이신의 특성 및 항균 능력 검정은 하기에서 수행하였다. Since the selected endolysin ClyC was cloned into the pET28a vector, 0.5Mm IPTG was added to induce expression. After 20 hours of expression, the cell wall was broken by diluting in Tris-Cl (pH 6.8, 300 Mm NaCl, 30% glycerol) buffer. Proteins were isolated by centrifuging the broken E. coli, and pure endolysin ClyC was obtained using nickel affinity chromatography. Recombinant endolysin ClyC is composed of a Cysteine-and Histidine-dependent Aminohydrolase Peptidase (CHAP) domain of LysSA12 and a Cell Wall Binding Domain (CBD) domain of LysPALS2 as shown in FIG. It was confirmed that it has a size of about 34.7 kDa. Recombinant endolysin ClyC is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and is encoded by the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2. Characteristics and antibacterial ability assays of the purified endolysin were performed below.
[실시예 2: 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 항균 능력 및 생화학적 특성 분석][Example 2: Analysis of antibacterial ability and biochemical properties of recombinant endolysin ClyC of the present invention]
(1) 엔도라이신 ClyC의 황색포도상구균에 대한 숙주 세포 용해 능력(1) Host cell lysis ability of endolysin ClyC against Staphylococcus aureus
배양된 황색포도상구균 RN4220을 기존 버퍼(control)와 엔도라이신 ClyC를 처리하고 비교함으로서 세균의 용해 정도를 흡광도로 파악할 수 있었다. 도 4의 A와 같이 재조합 엔도라이신 ClyC의 경우 100 nM과 300 nM을 처리했을 경우, 각각 control(엔도라이신 처리 없이 기존 버퍼만 들어간 황색포도상구균)에 비해 흡광도가 현저히 빠르게 감소했음을 관찰할 수 있었다. 반면, 도 4의 B를 보면 모체 엔도라이신인 LysSA12의 경우 동일 양을 처리하였을 때 용균 효과가 훨씬 떨어짐을 알 수 있다. 따라서, 재조합 엔도라이신 ClyC는 황색포도상구균을 더 빠르고 많이 용균시킴으로서 모체 엔도라이신에 비해 더 효과적으로 균주를 제어한다고 판단할 수 있다. By treating and comparing the cultured Staphylococcus aureus RN4220 with the existing buffer (control) and endolysin ClyC, it was possible to determine the degree of bacterial lysis by absorbance. As shown in FIG. 4A, in the case of recombinant endolysin ClyC, when 100 nM and 300 nM were treated, it was observed that the absorbance decreased significantly faster than the control (Staphylococcus aureus containing only the existing buffer without endolysin treatment), respectively. On the other hand, looking at B of FIG. 4, it can be seen that the lytic effect is much lower when the same amount of LysSA12, which is the parent endolysin, is treated. Therefore, it can be determined that the recombinant endolysin ClyC controls the strain more effectively than the parental endolysin by lysing Staphylococcus aureus faster and more.
(2) 엔도라이신 ClyC의 최적 활성 pH 및 온도에 대한 실험(2) Experiment on the optimal active pH and temperature of endolysin ClyC
재조합 엔도라이신 ClyC의 황색포도상구균에 대한 항균 활성은 도 5의 A와 같이 pH 8~9에서 최적으로 나타났다. 또한 도 5의 B와 같이, 모체 엔도라이신은 37도 조건에서 활성이 많이 떨어진 것에 비해 재조합 엔도라이신 ClyC는 약간의 열(45 ℃)을 가했을 때도 최대 활성의 95 %의 안정적인 항균 활성을 보이기 때문에 내열성이 좋다고 판단하였다. The antibacterial activity of recombinant endolysin ClyC against Staphylococcus aureus was optimal at pH 8-9 as shown in FIG. 5A . In addition, as shown in FIG. 5B , compared to the parent endolysin, the activity of the parent endolysin decreased significantly at 37°C, whereas the recombinant endolysin ClyC showed stable antibacterial activity of 95% of the maximum activity even when a slight heat (45°C) was applied. was judged to be good.
(3) 엔도라이신 ClyC의 항균 활성 범위에 대한 실험(3) Experiment on the range of antibacterial activity of endolysin ClyC
황색포도상구균의 다양한 종에 대한 재조합 엔도라이신 ClyC의 항균 감수성을 측정하였고, 그 결과는 표 1과 같았다.Antimicrobial susceptibility of recombinant endolysin ClyC to various species of Staphylococcus aureus was measured, and the results are shown in Table 1.
그 결과, 재조합 엔도라이신 ClyC은 메티실린 저항성 황색포도상구균 균주를 포함한 다양한 황색포도상구균에 대하여 강한 항균 활성을 보였다. 특히, 황색포도상구균 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)종에 대해서는 모체의 엔도라이신보다 높은 항균 능력을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC은 황색포도상구균에 대해 모체 엔도라이신에 비해 전반적으로 더 강한 항균 활성 능력을 보유함을 확인할 수 있었다. As a result, recombinant endolysin ClyC showed strong antibacterial activity against various Staphylococcus aureus, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. In particular, Staphylococcus aureus aureus ( Staphylococcus aureus ), Staphylococcus epidermidis ( Staphylococcus epidermidis ) for the species showed a higher antibacterial ability than the parental endolysin. Therefore, it was confirmed that the recombinant endolysin ClyC of the present invention has an overall stronger antibacterial activity against Staphylococcus aureus compared to the parental endolysin.
[실시예 3: 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 황색포도상구균 생물막 제거 효과 측정][Example 3: Measurement of Staphylococcus aureus biofilm removal effect of recombinant endolysin ClyC of the present invention]
황색포도상구균은 생물막을 형성한다고 알려져 있으며 이러한 생물막으로 인해 산업 시설 및 식품 산업에서 식중독 관리에 어려움을 겪고 있다. 또한 체내에 감염되었을 경우에도 쉽게 생물막을 형성함으로 그 치료가 더 어렵다는 특징이 있다. 따라서 본 발명에서는 황색포도상구균 RN4220을 대상으로 하여 재조합 엔도라이신 ClyC가 생물막을 제거하는 활성을 얼마나 가지고 있는지 연구하였다. Staphylococcus aureus is known to form biofilms, and these biofilms make it difficult to control food poisoning in industrial facilities and food industries. In addition, even when infected in the body, it easily forms a biofilm, making it more difficult to treat. Therefore, in the present invention, Staphylococcus aureus RN4220 was studied how much the recombinant endolysin ClyC has the activity to remove the biofilm.
먼저 황색포도상구균을 0.25% D-(+)-포도당을 포함한 TSB 배지에서 12시간 배양 후, 이 배양색을 1:100로 희석하여 96 well plate에 200 ㎕씩 분주하였다. 그 후, 37℃에서 이 플레이트를 24시간 동안 정치 배양함으로서 생물막 생성을 유도하였고, 200 ㎕의 PBS 버퍼로 3회 세척하였다. 각 well에 엔도라이신을 포함한 용액과 엔도라이신을 포함하지 않는 용액을 각각 첨가하고 37℃ 조건에서 3시간 동안 처리하여 엔도라이신이 생물막에 영향이 있는지를 확인하였다. 그 후 PBS로 한번 더 세척하고 각 well을 200 ㎕의 1% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet)으로 염색하면 들어있는 생물막의 양만큼 보라색으로 염색이 된다. 마지막으로 PBS로 각 well을 3회 세척 후 33% 아세트산(acetic acid)을 풀어주면 크리스탈 바이올렛 염색약으로 염색된 생물막의 양에 따라 색깔의 농도가 달라진다. 따라서 각 well의 흡광도(OD570)를 측정하게 되면 도 6의 A와 같이 엔도라이신의 농도에 따른 생물막의 제거 효과를 확인하였다.First, Staphylococcus aureus was cultured in TSB medium containing 0.25% D-(+)-glucose for 12 hours, the culture color was diluted 1:100, and 200 μl each was dispensed into a 96 well plate. Then, biofilm formation was induced by stationary incubation of the plate at 37° C. for 24 hours, and washed three times with 200 μl of PBS buffer. A solution containing endolysin and a solution not containing endolysin were added to each well, respectively, and treated at 37°C for 3 hours to determine whether endolysin had an effect on the biofilm. After that, it is washed once more with PBS, and each well is stained with 200 μl of 1% crystal violet, and the amount of biofilm contained therein is purple. Finally, if each well is washed 3 times with PBS and then 33% acetic acid is released, the color concentration varies depending on the amount of biofilm stained with crystal violet dye. Therefore, when the absorbance (OD570) of each well was measured, the removal effect of the biofilm according to the concentration of endolysin was confirmed as shown in A of FIG. 6 .
더 나아가, 메티실린 저항성을 가지는 황색포도상구균과 병원 환자 샘플에서 채취한 다양한 종류의 황색포도상구균에 대한 생물막 제거 효과도 측정하였다. 도 6의 B와 같이 다양한 균주에서 생물막이 빠르게 형성됨을 확인하였고, 본 재조합 엔도라이신 ClyC가 생물막을 잘 형성하는 모든 균주에 효과적인 생물막 제거능이 있음을 확인하였다.Furthermore, the biofilm removal effect on Staphylococcus aureus with methicillin resistance and various types of Staphylococcus aureus collected from hospital patient samples were also measured. It was confirmed that the biofilm is rapidly formed in various strains as shown in FIG. 6B, and it was confirmed that this recombinant endolysin ClyC has an effective biofilm removal ability in all strains that form a biofilm well.
[실시예 4: 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC의 시간에 따른 사멸 능력 측정][Example 4: Determination of the killing ability over time of the recombinant endolysin ClyC of the present invention]
(1) 재조합 엔도라이신 ClyC의 시간에 따른 기본 버퍼 조건 내 사멸 능력 측정(1) Measurement of the killing ability of recombinant endolysin ClyC in basic buffer conditions over time
재조합 엔도라이신 ClyC가 황색포도상구균의 수를 감소시키는 데 효과적인지 판단하기 위해 버퍼 조건에서 ClyC를 처리한 후 황색포도상구균의 수를 세어 균주에 대한 사멸 능력을 측정하였다. 흡광도를 측정한 용균 활성 능력과 달리 실제 황색포도상구균을 희석한 후 플레이트에 도팅(dotting)하여 그 수를 세면 더 정확한 항균 능력을 확인할 수 있다. To determine whether recombinant endolysin ClyC is effective in reducing the number of Staphylococcus aureus, the killing ability for the strain was measured by counting the number of Staphylococcus aureus after treatment with ClyC in buffer conditions. Unlike the lytic activity ability measured by absorbance, the antibacterial ability can be confirmed more accurately by diluting the actual Staphylococcus aureus and counting the number by dotting the plate.
먼저, 도 7의 A와 같이, 기본적으로 활용된 Tris-HCl (20mM, pH 8.0)에서의 시간에 따른 항균 효과를 측정하였다. 약 105-6 CFU/ml 의 황색포도상구균으로 오염된 버퍼에 다양한 농도의 ClyC를 처리한 결과, 1 uM의 재조합 엔도라이신 ClyC을 처리한 용액에서는 3시간 만에 모든 균이 사멸되었다. 반면, 모체의 엔도라이신은 동일 조건 하에 log 2-3 정도 죽이는 효과만 관찰되었다. 더욱이, 도 7의 B와 같이 3 uM의 재조합 엔도라이신 ClyC를 처리한 용액에서는 1시간 안에 모든 균이 죽는 결과를 확인할 수 있었다.First, as shown in A of FIG. 7 , the antibacterial effect according to time in Tris-HCl (20 mM, pH 8.0) used basically was measured. As a result of treating various concentrations of ClyC in a buffer contaminated with about 10 5-6 CFU/ml of Staphylococcus aureus, all bacteria were killed in 3 hours in a solution treated with 1 uM recombinant endolysin ClyC. On the other hand, endolysin of the mother was observed only the effect of killing about log 2-3 under the same conditions. Moreover, as shown in FIG. 7B, in the solution treated with 3 uM recombinant endolysin ClyC, it was confirmed that all bacteria were killed within 1 hour.
(2) 재조합 엔도라이신 ClyC의 시간에 따른 유제품(우유) 및 동물의 혈액 내 사멸 능력 측정(2) Determination of the killing ability of recombinant endolysin ClyC in the blood of dairy products (milk) and animals over time
황색포도상구균에 의한 식중독이 빈번하게 일어난다고 알려진 유제품(우유)에 재조합 엔도라이신 ClyC를 처리한 후 항균 능력을 측정하였다. 도 8의 A에서 알 수 있듯이, 모체 엔도라이신은 0.7 uM 뿐만 아니라 1.4 uM 처리한 용액에서도 아무런 항균 효과를 관찰할 수 없었다. 반면, 재조합 엔도라이신 ClyC를 황색포도상구균에 오염된 우유에 처리한 후 1시간 내에 0.7 uM 의 경우 log 5가 감소하는 효과가 나타났고, 1.4 uM 를 처리한 경우 1시간 내에 106-7 CFU/ml의 황색포도상구균이 모두 사멸하는 효과가 확인되었다. 이와 같이 ClyC는 유제품 및 식품 산업에서 항미생물제재로 사용될 수 있는 높은 가능성을 가짐을 확인하였다. 한편, 재조합 엔도라이신 ClyC가 제약산업에 활용될 경우에 대비하여 동물의 혈액 내에서의 항균 활성도 비교하였다. 도 8의 B에서 알 수 있듯이, 재조합 엔도라이신 ClyC를 황색포도상구균에 오염된 동물의 혈액에 처리한 경우 1시간 이내에는 log 4-5의 감소효과가, 2시간 이내에서는 log 5-6의 감소효과로 균이 모두 사멸됨을 확인할 수 있었다. 더 나아가 도 8의 C와 같이 재조합 엔도라이신 ClyC의 황색포도상구균에 오염된 동물의 혈청에서의 균 사멸능이 확인되었다. 이 경우에도 재조합 엔도라이신 ClyC는 1 uM을 처리했을 때 2시간 안에 106-7 CFU/ml의 황색포도상구균이 모두 사멸한데 반하여, 모체 엔도라이신은 동일 농도 처리 시 log 2의 효과만을 보였다.After treatment with recombinant endolysin ClyC in dairy products (milk), which is known to frequently cause food poisoning by Staphylococcus aureus, the antibacterial ability was measured. As can be seen from A of FIG. 8, the parental endolysin was not able to observe any antibacterial effect in the solution treated with 0.7 uM as well as 1.4 uM. On the other hand, after treatment with recombinant endolysin ClyC in Staphylococcus aureus-contaminated milk, 0.7 uM within 1 hour had an effect of decreasing
이상 종합하면, 본 발명의 재조합 엔도라이신 ClyC는 항생제를 대체하여 다양한 황색포도상구균과 그로 인해 형성되는 생물막까지도 효과적으로 제어할 수 있는 신규 항균 물질로 이용될 수 있다. 또한, 버퍼 조건에서뿐만 아니라 우유나 동물의 혈액, 혈청 내에서도 항균 활성이 뛰어난 것을 통해 제약 및 식품 산업 분야에서도 적용되어 효과적인 황색포도상구균 질병과 식중독을 제어할 수 있다고 판단된다.In summary, the recombinant endolysin ClyC of the present invention can be used as a novel antibacterial material that can effectively control various Staphylococcus aureus and even the biofilm formed thereby by replacing antibiotics. In addition, it is judged that it can effectively control Staphylococcus aureus disease and food poisoning by being applied in the pharmaceutical and food industries through its excellent antibacterial activity not only in buffer conditions but also in milk, animal blood, and serum.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Recombinant endolysin ClyC with potential bacteriocidal activity against Staphylococcus aureus <130> YP-20-069 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Endolysin ClyC <400> 1 Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Thr 1 5 10 15 Ser Glu Gly Lys Gln Tyr Asn Ala Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Gln Cys 20 25 30 Phe Asp Tyr Ala Asn Ala Gly Trp Gln Val Leu Phe Gly Tyr Asn Leu 35 40 45 Lys Gly Val Gly Ala Lys Asp Ile Pro Ser Ala Asn Asp Phe Asn Gly 50 55 60 Leu Ala Thr Val Tyr Gln Asn Thr Pro Asp Phe Leu Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Asp Met Val Val Phe Gly Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Tyr Gly His Val 85 90 95 Ala Trp Val Ile Glu Ala Thr Leu Asp Tyr Ile Ile Val Tyr Glu Gln 100 105 110 Asn Trp Leu Gly Gly Gly Trp Thr Asp Gly Val Gln Gln Pro Gly Ser 115 120 125 Gly Trp Glu Lys Val Thr Arg Arg Gln His Ala Tyr Asp Phe Pro Met 130 135 140 Trp Phe Ile Arg Pro Asn Phe Lys Ser Glu Thr Ala Pro Arg Ser Val 145 150 155 160 Gln Ser Pro Thr Gln Ala Ser Lys Lys Glu Thr Val Asp Ser Ala Ser 165 170 175 Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser Trp Lys Lys Asn Gln Tyr 180 185 190 Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Ser Ala Thr Phe Val Asn Gly Asn Gln 195 200 205 Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe Leu Asn Ala Pro Val Gly 210 215 220 Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val Tyr Asp Glu Val Cys Ile 225 230 235 240 Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Arg 245 250 255 Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly Val Pro Pro Ser His Val 260 265 270 Pro Gly Val Ala Trp Gly Thr Phe Lys 275 280 <210> 2 <211> 846 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Endolysin ClyC <400> 2 atgcaagcaa aactaactaa aaaagagttt atagagtggt tgaaaacatc tgagggaaaa 60 caatataatg cggacggatg gtatggattt caatgctttg actatgccaa tgcaggttgg 120 caagtcttat ttggctacaa cttaaaaggt gtaggtgcca aagacatccc aagtgctaat 180 gattttaacg gactagctac tgtataccaa aatacaccag acttcttagc gcaacctggc 240 gacatggttg tattcggtag taattatggt gcaggatacg gtcatgttgc atgggtaatt 300 gaagcaactt tagattatat cattgtatat gagcagaatt ggctcggcgg tggctggaca 360 gacggtgtac aacaacctgg ctctggttgg gaaaaagtta caagacgcca acacgcttac 420 gacttcccta tgtggtttat ccgtcctaac ttcaaaagcg aaacagctcc acgatcagta 480 caatctccta cgcaagcatc taaaaaggaa acggtcgaca gtgcaagtac accggcaact 540 agaccagtta caggttcttg gaaaaagaat cagtacggaa cttggtacaa accggaatcg 600 gcaacatttg ttaatggtaa ccaacctata gtaactagaa tcggttctcc attcttaaat 660 gctccagtag gaggtaactt accggcagga gctacaattg tatatgacga agtttgtatc 720 caagcaggtc atatttggat aggttataat gcttacaacg gtaacagagt atattgccct 780 gttagaactt gtcaaggtgt tccaccttca catgtacctg gagttgcctg gggaacattc 840 aagtag 846 <110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Recombinant endolysin ClyC with potential bacteriocidal activity against Staphylococcus aureus <130> YP-20-069 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Endolysin ClyC <400> 1 Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys 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Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val Tyr Asp Glu Val Cys Ile 225 230 235 240 Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Arg 245 250 255 Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly Val Pro Pro Ser His Val 260 265 270 Pro Gly Val Ala Trp Gly Thr Phe Lys 275 280 <210> 2 <211> 846 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Endolysin ClyC <400> 2 atgcaagcaa aactaactaa aaaagagttt atagagtggt tgaaaacatc tgagggaaaa 60 caatataatg cggacggatg gtatggattt caatgctttg actatgccaa tgcaggttgg 120 caagtcttat ttggctacaa cttaaaaggt gtaggtgcca aagacatccc aagtgctaat 180 gattttaacg gactagctac tgtataccaa aatacaccag acttcttagc gcaacctggc 240 gacatggttg tattcggtag taattatggt gcaggatacg gtcatgttgc atgggtaatt 300 gaagcaactt tagattatat cattgtatat gagcagaatt ggctcggcgg tggctggaca 360 gacggtgtac aacaacctgg ctctggttgg gaaaaagtta caagacgcca acacgcttac 420 gacttcccta tgtggtttat ccgtcctaac ttcaaaagcg aaacagctcc acgatcagta 480 caatctccta cgcaagcatc taaaaaggaa acggtcgaca gtgcaagtac accggcaact 540 agaccagtta caggttcttg gaaaaagaat cagtacggaa cttggtacaa accggaatcg 600 gcaacatttg ttaatggtaa ccaacctata gtaactagaa tcggttctcc attcttaaat 660 gctccagtag gaggtaactt accggcagga gctacaattg tatatgacga agtttgtatc 720 caagcaggtc atatttggat aggttataat gcttacaacg gtaacagagt atattgccct 780 gttagaactt gtcaaggtgt tccaccttca catgtacctg gagttgcctg gggaacattc 840 aagtag 846
Claims (7)
Endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having Staphylococcus aureus hemolytic ability and Staphylococcus aureus biofilm control ability.
상기 황색포도상구균은,
메티실린 저항성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔도라이신 ClyC.
According to claim 1,
The Staphylococcus aureus is
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Methicillin-resistant S. aureus , MRSA), characterized in that it contains endolysin ClyC.
Food composition comprising endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
A pharmaceutical composition for preventing or treating Staphylococcus aureus infection comprising endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 황색포도상구균은,
메티실린 저항성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. The method of claim 4,
The Staphylococcus aureus is
A composition comprising methicillin-resistant S. aureus (MRSA).
Feed composition comprising endolysin ClyC consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
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Citations (2)
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| KR102097127B1 (en) * | 2019-04-02 | 2020-04-07 | 서울대학교산학협력단 | Bacteriophage CSA13 and its endolysin LysCSA13 with removal activity for biofilm from Staphylococcus aureus |
-
2020
- 2020-07-02 KR KR1020200081693A patent/KR102314731B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 대한민국 등록특허 제10-2097127호(등록일자: 2020.03.30)에는, 황색포도상구균 유래 바이오필름 제거에 효과적인 박테리오파지 CSA13 및 그 유래의 엔도라이신 LysCSA13에 관한 것으로, 더 상세하게는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 숙주감수성을 가지고, 황색포도상구균이 생성한 바이오필름(biofilm) 제거에 효과적인 CSA13 및 엔도라이신 LysCSA13에 관해 기재되어 있다. |
| 비특허문헌 1 * |
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