KR20230090927A

KR20230090927A - 세포내 스트레스 과립 형성 기전에 기초한 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료제 및 이의 병용 제제

Info

Publication number: KR20230090927A
Application number: KR1020210180128A
Authority: KR
Inventors: 박승범; 변완기
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-06-22

Abstract

본 발명은 벤조피라닐피라졸계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 함유하는 코로나바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 세포내 스트레스 과립 형성을 유발하여 숙주의 선천성 항바이러스 면역반응을 활성화시키므로, 변이 바이러스를 비롯하여 광범위한 코로나바이러스과 바이러스의 감염을 예방 또는 치료하기 위한 유효성분으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

세포내 스트레스 과립 형성 기전에 기초한 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료제 및 이의 병용 제제 {Agents for Treating or Preventing Coronavirus Infection Based on Cellular Stress Granules Formation Mechanism and Combination Preparation with the Same}

본 발명은 세포내 스트레스 과립 형성 기전에 기초한 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료제 및 이의 병용 제제에 관한 것이다.

코로나바이러스 감염증-19 (COVID-19)은 2019년 12월 중국에서 처음 발생한 후 전세계로 확산된 중증 급성 호흡기 질환으로서 WHO 는 2020년 3월에 COVID-19에 대해 "세계적 대유행 (Pandemic)"으로 선포하였다. COVID-19의 병원체는 국제바이러스분류위원회(ICTV)로부터 "사스-코로나바이러스-2 (SARS-CoV-2, Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus-2)"로 명명되었으며, MERS-CoV, SARS-CoV와 마찬가지로 COVID-19 역시 코로나바이러스에 속하는 것으로 보고 있다.

코로나-19에 대한 백신이 현재 개발 및 승인이 완료되어 접종이 시행 중이나 각종 변이 바이러스의 출현과 이러한 변이 바이러스에 의한 돌파 감염이 속출하고 있다. 더욱이 현재까지 알려진 변이도 10여종에 이르므로 백신 접종만으로는 변이 바이러스 대응에 한계가 있는 상황이다. 이에 따라 코로나-19 바이러스를 표적하는 치료제로서 변이 바이러스에까지도 효과가 있는 치료제의 개발이 시급하다. 그러나, 코로나-19에 특이적인 치료나 감염 억제에 대한 효과가 입증된 치료제는 아직 개발되지 않은 상태이다.

본 발명에서는 변이 바이러스에 대해서도 효과적으로 사용될 수 있는, 신규한 작용 기전에 기초한 광범위한 코로나바이러스 예방 또는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명에서는 전술한 신규한 작용 기전에 기초한 광범위한 코로나바이러스 예방 또는 치료제를 이와 상이한 작용 기전에 기초한 다른 약물과 조합한, 코로나 바이러스의 예방 또는 치료용 병용 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 코로나바이러스과 바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서

L₁ 은 단일 결합, 탄소수 1 내지 6의 알킬렌기, 탄소수 2 내지 6의 알케닐렌기, -NH-, 또는 -NH-L₂ 이고, L₂ 은 탄소수 1 내지 6의 알킬렌기이고,

R₁ 은 4-트리플루오로메틸페닐 또는 시클로펜틸이고,

R 는 탄소수 2 내지 6의 알케닐렌기, 페닐, 싸이오펜일, 또는 시클로헥실이고,

단, R₁ 이 시클로펜틸인 경우, R 는 싸이오펜일이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 코로나바이러스과 바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 제2형 중증 급성 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 세포내 스트레스 과립 형성의 유도를 통한 항바이러스 면역 반응의 활성화제가 제공된다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 코로나 바이러스과 바이러스의 감염에 대한 다른 예방 또는 치료제와 조합한, 코로나 바이러스과 바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 병용 제제가 제공된다.

스트레스 과립은 바이러스 감염을 포함한 외부 스트레스에 반응하여 일시적으로 형성되는 비막성 세포소기관으로, 세포 내 전반적인 번역과정의 억제를 통해 바이러스의 복제를 저해하고 제1형 인터페론 반응을 활성화시키는 선천성 항바이러스 면역반응의 중심지 역할을 한다. 본 발명은 기존의 바이러스 단백질을 표적하는 항바이러스 전략과는 다르게 바이러스 이중가닥 RNA에 의존적으로 스트레스 과립의 형성을 촉진하는 숙주 기반의 항바이러스 전략이라는 점이 핵심이다. 이러한 전략은 변이나 새로운 종의 바이러스들에 대해서도 효과적일 수 있는 혁신적인 광범위 항바이러스 전략이다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 코로나바이러스가 감염된 세포에서 바이러스 이중가닥 RNA에 의존적으로 스트레스 과립 형성을 유발하고 숙주 세포의 선천성 항바이러스 면역반응을 활성화하여 항바이러스 효능을 나 나타내었으며, 이는 바이러스 단백질을 표적하는 기존의 항바이러스제들과는 다르게 변이바이러스나 다른 종에 대해서도 효과적일 수 있는 광범위 항바이러스제이다. 나아가, 본 물질은 기존의 바이러스 단백질을 표적하는 로피나비르와 같은 항바이러스제와의 약물혼합을 통해 괄목하게 개선된 효능을 보였다.

도 1에서 (a)는 스트레스 과립 형성 및 항바이러스 기능의 개략도이고, (b)는 폴리(I:C)에 의한 선천적 항바이러스 반응 활성화을 나타내고, (c)는 폴리(I:C)에 의한 스트레스 과립 형성을 나타낸다. 10㎍/mL의 폴리(I:C)를 처리하한 것이며, 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 2는 G3BP1-GFP-발현된 U2OS 세포를 사용하여 2종의 공지된 스트레스 과립 촉진제, 소듐 아르세나이트(sodium arsenite)(NaAs) 및 타프시가긴(thapsigargin)(Tg)으로 처리했을 때 시간 경과에 따른 스트레스 과립 모니터링 결과를 나타낸다.
도 3에서 (a)는 시간 경과에 따른 스트레스 과립 모니터링 결과를 나타내고(1.25 μg/mL poly(I:C) 감염후 10 μM 화합물이 처리되었음), (b)는 구조-활성 관계 연구에서 1.25 μg/mL poly(I:C) 감염후 5 μM 화합물이 처리한 결과를 나타내며, (c)는 히트 후보의 코어 구조 및 최적화된 히트의 화학 구조를 나타내며, (d)는 Calu-3 세포에서 C01 의 처리시 면역형광 분석 결과를 나타내고, (e)는 C01의 스트레스 과립 형성의 poly(I:C) 의존적 유도를 보여준다.
도 4에서 (a)는 히트 화합물의 화학적 구조를 나타내고 (b)는 시간 경과에 따른 스트레스 과립 스크리닝 결과를 나타낸다 (데이터는 두 상이한 영역에서 얻어진 이미지의 평균값을 나타냄).
도 5에서 (a)는 항바이러스 반응의 poly(I:C)-특이적인 용량 의존적 활성화를 나타내고 (2.5 μg/mL의 poly(I:C)로 처리), (b)는 항바이러스 반응의 poly(I:C) 의존적 활성화를 나타내고, (c)와 (d)는 각각, IFNBI 및 ISG56 의 qPCR 정량화 결과를 나타낸다.
도 6에서 (a)는 Calu-3 및 Vero 세포에서 SARS-CoV-2 에 대한 C01의 용량 의존적 곡선을 나타내고, (b)는 바이러스성 N 단백질 및 G3BP1 항체를 사용한 C01 및 NI02 (네거티브 대조군)의 면역형광 분석 결과를 나타내고, (c)는 로피나비르(lipinavir)와 C01의 공동 투여에 의한 약물 병용 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 Calu-3 세포에서 스트레스 과립의 용량 의존적 유도를 보여주는 것으로서, (a) 는 2.5 μg/mL 폴리(I:C)의 형질감염 후 5시간 후 G3BP1의 대표적인 면역형광 이미지이고, (b)는 결과 이미지의 정량화 데이터이다.
도 8은 Calu-3 세포에서 C01-C04에 대한 세포 생존력 분석 결과를 나타낸다 (완전한 부착 후, 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 화합물로 처리하였음).
도 9는 스트레스 과립 형성의 폴리(I:C) 의존적 유도를 보여주며 (a)는 Vero 세포에서 G3BP1에 대한 면역형광의 대표적인 이미지이고 (b) 는 Calu-3 및 Vero 세포에서 면역형광 분석의 정량화 데이터이다 (2.5㎍/mL의 폴리(I:C)를 사용).
도 10은 Calu-3 및 Vero 세포에서 테스트된 화합물의 용량-반응 곡선(DRC)이다. 10점 DRC가 생성되었다. Calu-3 및 Vero 세포는 각각 0.2 및 0.0125의 감염 다중도(MOI)에서 SARS-CoV-2에 감염되었다. 그 다음, 다양한 농도의 화합물을 첨가하였다. 감염 24시간 후, SARS-CoV-2 N 단백질 및 숙주 핵의 면역형광 검출을 수행하여 바이러스 감염 억제 및 세포 생존력을 정량적으로 측정하였다. 파란색 선은 SARS-CoV-2 감염 억제를 나타내고 빨간색 선은 세포 생존력을 나타낸다.
도 11은 Vero 세포에서 공동 면역형광 분석 결과이다. 여기서 세포는 5 MOI 또는 모의에서 SARS-CoV-2로 감염되었고, 고정 전에 1시간 동안 250 μM의 나트륨 아르세나이트(NaAs)으로 처리하였다. 그런 다음 핵, SARS-CoV-2 N 단백질 및 G3BP1의 면역형광 검출을 수행했다. G3BP1 이미지의 반점은 신호 포화로 인해 흰색으로 표시되었다. NaAs의 존재 하에서 스트레스 과립 형성의 향상을 명확하게 관찰할 수 있었다. 그러나 NaAs로 유발된 스트레스 과립 형성은 SARS-CoV-2 감염에 의해 크게 감소했다.
도 12는 Vero 세포에서 공동 면역형광 분석 결과이다. 여기서 세포는 5 MOI 또는 모의에서 SARS-CoV-2로 감염되었고, 고정 전에 5 시간 동안 5.93 μM의 화합물로 처리하였다. 그 다음, 핵, SARS-CoV-2 N 단백질 및 G3BP1 의 면역형광 검출이 수행되었다.
도 13는 Vero 세포에서 약물 병용 분석한 결과이다. (a)은 로피나비르(LPV)를 사용한 CO2의 공동 치료 결과이고 (b)는 약물 조합 분석에서 얻은 값이다. 여기서 10점 DRC가 생성되었다. 간단히 말해서, Vero 세포를 0.0125의 감염 다중도(MOI)에서 SARS-CoV-2로 감염시킨 다음, 로피나비르(10 또는 15μM)의 부재 또는 존재 하에 다양한 농도의 화합물을 첨가했다. 감염 24시간 후, SARS-CoV-2 N 단백질과 숙주 핵의 면역형광 검출을 수행하여 바이러스 감염 억제 및 세포 생존력을 정량적으로 측정했다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다, "함유"한다, "가지다"라고 할 때, 이는 특별히 달리 정의되지 않는 한, 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적으로 유효한 양"은 목적하는 생물학적 반응이나, 증상 또는 징후의 발전이나 경감을 나타내기에 충분한 화합물의 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 본 발명의 방법에 의해 화합물이 투여될 개체를 의미하며, 인간 뿐만 아니라 동물도 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료”는 대상체에게 바람직한 치료 효과가 구현되는 것이며, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 증상의 경감, 병태의 개선, 및 병태의 치유를 포함한다. 또한, 용어 “예방”은 아직 병이 발병되지 않았으나 발병 위험이 있는 대상체에 대한 사용을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "할로겐"은 F, Cl, Br, 및 I 를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬렌"은 분지형 및 직쇄형 알킬렌, 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 이소프로필렌, 부틸렌, 이소부틸렌, t-부틸렌 등을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "알케닐렌"은 분지형 및 직쇄형 알케닐렌, 예를 들어 비닐렌, 알릴렌, 이소프로페닐렌 등을 포함한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서

R₁ 은 4-트리플루오로메틸페닐 또는 시클로펜틸이고,

단, R₁ 이 시클로펜틸인 경우, R 는 싸이오펜일이다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물에 대한 구체적 예로는 하기 화합물로 이루어진 군에 포함되는 것들을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다:

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기“약학적으로 허용 가능한 염”은 모 화합물의 약물학적 활성을 유지하는 화합물 염을 의미하는 것으로서, 예를 들어 (i) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 및 인산과 같은 무기산과 형성된 염; (ii) 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르빈산, 팔미트산, 말레인산, 하이드록시말레인산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산 및 톨루엔설폰산과 같은 유기산과 형성되는 염; (iii) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 교체될 때 형성되는 염; (iv) 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민과 같은 유기 염기와의 배위체; 또는 (v) 알기네이트와 같은 아미노산의 염일 수 있다.본 발명의 전술한 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 공지의 방법으로 제조될 수 있으며 그 구체적 예는 후술하는 실시예에 기재한 바를 참고한다.

본 발명에 따른 화합물은 세포내 스트레스 과립의 형성을 유도함으로써 코로나바이러스과 바이러스 감염을 억제, 치료, 또는 예방할 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 세포내 스트레스 과립 형성의 유도를 통한 항바이러스 면역 반응의 활성화제가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 코로나바이러스과 바이러스에 대한 항바이러스제가 제공될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 코로나바이러스과 바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 코로나바이러스과 바이러스의 감염에 의해 야기되는 질환 또는 증상에 대한 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 제공될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "코로나바이러스과 바이러스"는 코로나바이러스과(영어:　Coronaviridae)의　코로나바이러스아과(Coronavirinae)에 속하는　RNA 바이러스로서, 예를 들어 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63), 인간 코로나바이러스 HKU1 (HCoV-HKU1), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 및 제2형 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2)를 들 수 있으며, 다만, 이에 한정되지는 않으며 전술한 바이러스의 다양한 변종도 모두 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면, "코로나바이러스과 바이러스의 감염"은 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63), 인간 코로나바이러스 HKU1 (HCoV-HKU1), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 및 제2형 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 바이러스에 의해 야기되는 것일 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "코로나바이러스과 바이러스에 의해 야기되는 질환"은 전술한 바이러스에 의한 호흡기 질환을 포함하는 것으로서, 예를 들어 감기, 중증 급성 호흡기 증후군, 중동 호흡기 증후군, 제2형 중증 급성 호흡기 증후군 뿐만 아니라 바이러스성 폐렴, 바이러스성 기관지염 등이나 전술한 질환에 수반되는 합병증을 포함할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "코로나바이러스과 바이러스에 의해 야기되는 증상"은 바이러스 감염에 의해 동반되는 각종 신체적 증상, 예를 들어 열, 기침, 호흡 곤란, 오한, 근육통, 두통, 인후통, 후각 상실, 미각 상실, 콧물, 설사, 오심, 구토 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 화학식 1의 화합물을 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 함유할 수 있다. 상기“약학적으로 허용 가능한 염”은 앞서 정의한 바와 같다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물의 이성질체, 용매화물, 또는 프로드러그(prodrug)을 함유할 수 있다. 여기서 “이성질체”는 디아스테레오머 및 에난티오머를 비롯한 모든 가능한 입체화학적 이성질체를 포함한다. 본 발명의 화합물은 모든 가능한 입체화학적 이성질체 형태의 혼합물을 지칭하는 것으로 이해할 수 있다. 또한, 용어“용매화물”은 용질 (예를 들어 화학식 1의 화합물)과 용매의 복합체를 가리키는 것으로서, 용매가 물인 경우 상기 용매화물은 수화물로 지칭될 수 있다. 용어 “프로드러그”는 생체내에 투여된 후에 생체 흡수 및 대사에 의하여 약효를 갖는 활성 화합물로 변환되는 화합물을 가리킨다. 상기 프로드러그는 그 자체로 비활성이거나 활성 화합물보다 활성이 덜한 화합물이며, 다만, 취급, 투여, 또는 대사에 유리한 특성을 제공할 수 있다. 상기 프로드러그는 활성 화합물의 에스테르 형태 (예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한 대사적으로 불안정한 에스테르)이거나 당 유도체의 형태, 또는 아미노산 에스테르 유도체의 형태일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 추가하여 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 더 포함할 수도 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약제학 분야에서 통상적으로 사용되는 것일 수 있으며, 부형제 (예를 들어, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 락토스, 소르비톨, 만니톨, 셀룰로오스 등) 또는 희석제 (예를 들어, 생리식염수, 정제수 등)일 수 있다.

또한, 필요에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 이외의 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예를 들어, 결합제, 붕해제, 활택제, 제피제, 필름 코팅 기제, 장용성 필름 코팅 기제, 연질 캡슐 기제, 용해보조제, 유화제, 현탁화제, 안정화제, 완충제, 항산화제, 계면활성제, 감미제, 교미제, 보존제, 점증제, 방향제, 또는 착색제를 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구의 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 본 발명의 조성물은 고체 또는 액제 제형의 형태로 제형화될 수 있다. 고체 제형은 예를 들어, 정제, 캡슐제(연질 & 경질 캡슐제), 산제, 과립제, 환제, 트로키제 등일 수 있으며, 액체 제형은 예를 들어, 엘릭서, 현탁액제, 유액제, 용액제, 시럽제, 리모나아데제 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 환자의 중증도, 상태, 불활성율, 및 병용되는 약물을 고려하여 결정할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 당업계에 공지된 임의의 다른 약물, 예를 들어 로피나비르, 렘데시비르와 같이 코로나 바이러스과 바이러스의 감염에 효과가 있을 것으로 알려진 임의 약물이나, 코로나바이러스의 감염에 의해 야기되는 증상, 예컨대 기침을 완화시키기 위한 임의 약물 등과 조합하여 사용될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 양태에 따르면 전술한 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을, 코로나 바이러스과 바이러스의 기타 예방 또는 치료제와 조합하여 함유하는 병용 제제가 제공된다. 또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면 전술한 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과, 코로나 바이러스과 바이러스의 감염에 대한 예방 또는 치료 효과가 있는 기타 약물을 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스과 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 요법이 제공된다. 여기서 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 임의 약물은 본 발명의 화합물과 동시에 투여되거나 시간 간격으로 두고 순차적으로 투여되어도 된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[합성예] 벤조피라질피라졸의 합성

아래의 [반응식 1]에 도시한 바에 따라 화합물들을 합성하였다.

[반응식 1]

(a) 단계: KNO₃, H₂SO₄, 0℃, 2 h; (b) Cbz-피페라진, 아세토니트릴, 40℃, 하룻밤동안; (c) HC(OEt)₃, BF₃·OEt₂, DIPEA, 디클로로메탄, -78℃ 내지 실온, 2 h; (d) I₂, 아세톤, 35℃, 하룻밤동안; (e) 치환된 히드라진, AcOH, 35℃; (f) 40% KOH, 테트라히드로푸란, EtOH 또는 Me₂S, BF₃·OEt₂, 디클로로메탄; (g) 화학적 개질, i) 카르복실산, DIC, DIPEA, DMAP, 디클로로에탄 또는 ii) 이소시아네이트, 디클로로에탄, 또는 iii) 이소티오시아네이트, 디클로로에탄 또는 iv) 술포닐 클로라이드, 피리딘/디클로로에탄 = 1/2; (h) 벤조피라닐피라졸 7, 디메틸포름아미드, 24 h; (i) 디메틸포름아미드 중 2 M SnCl₂·(H₂O)₂; (j) 카르복실산, PyBOP, DMAP, 디메틸포름아미드 중 3% NMM, 24 h 또는 이소시아네이트, TEA, 디클로로에탄, 24 h, 또는 술포닐 클로라이드, 피리딘 /DCE = 1/2, 24 h; (k) 디클로로메탄 중 50% TFA, 1 h.

위 방법에 따라 얻어진 화합물의 NMR, 질량 또는 HPLC 데이터는 다음과 같다.

화합물 C01:¹H NMR (600 MHz, CD₃OD/CDCl₃ = 1/1) δ 7.90-7.87 (m, 2H), 7.83-7.81 (m, 2H), 7.73-7.70 (m, 2H), 7.61-7.56 (m, 3H), 7.53-7.49 (m, 2H), 6.89 (s, 1H), 3.36-3.33 (m, 4H), 3.21-3.16 (m, 4H), 1.69 (s, 6H); ¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD/CDCl₃ = 1/1) δ 166.6, 162.9 (q, ² J _C,F = 35.3 Hz), 151.4, 145.1, 143.1, 135.5, 134.6, 133.1, 132.6, 131.4 (q, ² J _C,F = 32.7 Hz), 129.3, 127.4 (q, ³ J _C,F = 3.8 Hz), 127.4, 126.8, 126.1, 124.4 (q, ¹ J _C,F = 270.4 Hz), 124.2, 118.5, 117.3 (q, ¹ J _C,F = 291.0 Hz), 112.0, 110.9, 78.1, 49.1, 44.4, 28.7; HRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₃₀H₂₉F₃N₅O₂ [M+H]⁺: 548.2268, found: 548.2264; HPLC purity = 95.76%.

화합물 C02: ¹H NMR (600 MHz, CD₃OD/CDCl₃ = 4/1) δ 7.91 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.24-7.19 (m, 2H), 7.18-7.12 (m, 3H), 6.75 (s, 1H), 3.23-3.18 (m, 4H), 2.97-2.88 (m, 6H), 2.60 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.64 (s, 6H);¹³C NMR (150 MHz, CD₃OD/CDCl₃ = 4/1) δ 172.9, 163.0 (q, ² J _C,F = 34.6 Hz), 151.9, 146.1, 143.8, 142.0, 136.1, 133.6, 131.7 (q, ² J _C,F = 32.7 Hz), 129.3, 129.3, 127.8 (q, ³ J _C,F = 3.8 Hz), 127.4, 127.1, 125.9, 125.0 (q, ¹ J _C,F = 270.2 Hz), 124.6, 119.8, 118.0 (q, ¹ J _C,F = 285.9 Hz), 111.8, 110.7, 78.4, 49.1, 44.5, 39.2, 32.4, 28.7; HRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₃₂H₃₃F₃N₅O₂ [M+H]⁺: 576.2581, found: 576.2573; HPLC purity =96.54%.

화합물 C03: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD/CDCl₃ = 1/1) δ 7.88 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.73-7.68 (m, 3H), 7.58 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.43 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 7.09 (dd, J = 5.2, 3.7 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.54 (d, J = 14.5 Hz, 1H), 3.38 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 3.14 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 1.68 (s, 6H); LRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₃₀H₂₉F₃N₅O₂S [M+H]⁺: 580.20, found: 580.20; HPLC purity = 94.01%.

화합물 C04: ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD/CDCl₃ = 1/1) ) δ 7.86 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.57 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 3.36-3.35 (m, 4H), 3.11 (t, J = 5.1 Hz, 4H), 2.31-2.24 (m, 1H), 1.85-1.78 (m, 2H), 1.78-1.70 (m, 4H), 1.67 (s, 6H), 1.49-1.33 (m, 4H); LRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₃₀H₃₅F₃N₅O₂ [M+H]⁺: 554.27, found: 554.30; HPLC purity = 92.30%.

화합물 NI02: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.62 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.32-7.28 (m, 2H), 7.24-7.20 (m, 3H), 6.60 (s, 1H), 3.80 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.55 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 3.04 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.02-2.97 (m, 2H), 2.89 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 2.66 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 1.70 (s, 6H); LRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₃₂H₃₁F₃N₅O₄ [M+H]⁺: 606.23, found: 606.20; HPLC purity = 93.30%.

화합물 C05: LRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₂₈H₃₁F₃N₅O₂ [M+H]⁺: 526.24, found: 526.25; HPLC purity = 75.86%.

화합물 C08: LRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₃₀H₃₆F₃N₆O₂ [M+H]⁺: 569.28, found: 569.30; HPLC purity = 86.04%.

화합물 F03: LRMS(ESI⁺) m/z calculated for C₂₈H₃₄N₅O₂S [M+H]⁺: 504.24, found: 504.25; HPLC purity = 85.46%.

[실험예] 합성된 화합물을 이용한 일반적 실험 절차

화합물 또는 이를 함유하는 조성물을 이용한 일반적 실험 절차는 다음과 같다.

세포 배양 및 형질 감염

G3BP1-GFP 발현 U2OS 인간육종 상피세포는 한남대학교 이진아 교수로부터 제공받았다. Calu-3 인간 기도 상피 세포와 아프리카 녹색원숭이의 Vero 신장 상피 세포는 한국세포주은행[KCLB](각각 KCLB No.30055 및 No.10081)에서 입수하였다. G3BP1-GFP 발현 U2OS, Calu-3 및 Vero 세포는 10% 열불활성화 소태아혈청(FBS)[Gibco], 1% 항생제-항진균 용액[Gibco]이 보충된 DMEM 배지[Welgene]에서 유지되었다. 37°C에서 5% CO2 대기 완전한 접착 후, 세포는 미리 복잡한 poly(I:C)(HMW)/LyoVecTM 시약[InvivoGen]을 사용하여 형질감염되었다. 실제 SARS-CoV-2 실험을 위해 본 연구에 사용된 Calu-3는 클론 분리주로, American Type Culture Collection[ATCC][ATCC HTB-55]에서 얻은 부모 Calu-3에 비해 더 높은 성장률을 보였다. Calu-3는 20% 열 불활성화 FBS, 1% MEM 비필수 아미노산 용액[Gibco] 및 2% 항생제-항진균 용액[Gibco]이 보충된 EMEM[ATCC]에서 5% CO2로 37°C에서 유지되었다. Vero 세포는 American Type Culture Collection[ATCC](각각 ATCC CCL-81 및 C1008)에서 얻었고 10% 열 비활성화 FBS 및 2% 항생제-항진균제 용액 [Gibco]가 보충된 DMEM[Welgene]에서 5% CO2로 37°C에서 유지되었다.

웨스턴 블롯

Calu-3 세포를 12웰 플레이트에 3.5 x 10⁵세포/웰의 밀도로 시딩했다. 완전한 부착 후, 세포를 PBS로 세척하고 RIPA 완충액 (50mM Tris-HCl, pH 7.8, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜레이트, 5mM NaF, 2mM Na3VO4, 1x 프로테아제 억제제 칵테일 [Roche])을 사용하여 용리하고, 총 단백질 농도는 Pierce BCA protein assay kit[ThermoFisher Scientific]로 측정하였다. 단백질을 SDS-PAGE로 분해하고 PVDF 막 [Bio-Rad]으로 옮기고 Tween20(TBST)[Sigma]을 포함하는 Tris 완충 식염수에서 2% 소 혈청 알부민(BSA)[MP Biomedicals]으로 차단했다. 멤브레인은 단백질 특이적 항체 (PKR, Santa Cruz #sc-6282; phospho-PKR, Abcam #ab32036; eIF2α, Santa Cruz #sc-133132; phopho-eIF2α, Abcam #ab32157; IRF3, Cell Signaling Technology #4302S)로 프로브되었다; phospho-IRF3, Abcam #ab76493, puromycin, Merck Millipore #MABE343, GAPDH, Cell Signaling Technology #2118S).

면역형광에 의한 스트레스 과립 이미징

Calu-3 세포를 4 × 10⁴ 세포/웰의 밀도로 96웰 흑색면의 투명한 바닥 플레이트에 접종했다. Vero 세포를 1 × 104 cells/well의 밀도로 96-웰 검은색 면의 투명한 바닥 플레이트에 접종했다. Poly(I:C)는 화합물 처리 전에 5시간 동안 처리되었다. PBS로 세척한 후, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드(PFA)로 실온에서 20분 동안 고정하고 0.5% Triton X-100으로 4℃ 에서 20분 동안 투과화시켰다. 그런 다음 세포를 PBS로 3회 세척하고 PBS 중 3% BSA로 1시간 동안 블로킹하고 4℃ 에서 밤새 항-G3BP1 1차 항체로 처리했다(Santa Cruz, #sc-81940). PBS로 세척한 후 세포에 Alexa 488-conjugated 항-마우스 이차항체(Abcam, #ab150113)를 적용하고, 핵을 PBS(1:5000)에서 Hoechst 33342로 30분간 염색하였다. IN Cell Analyzer 2000 또는 IN Cell Analyzer 2500[GE Healthcare]을 사용하여 세포를 촬영했다. 소프트웨어[GE Healthcare]를 사용하여 세포당 스트레스 과립 점을 정량화하기 위해 이미지를 분석했다. 평균적으로 Calu-3 세포주에 대해 6,042개 세포 및 Vero 세포주에 대해 1,761개 세포가 각 기술 복제에 대해 분석되었다. 모든 데이터는 각각 최소 2개의 기술 복제로 구성된 2개의 독립적인 생물학적 복제의 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시한다.

G3BP1-GFP 발현 U2OS 세포주를 이용한 스트레스 과립 모니터링 및 화합물 스크리닝

G3BP1-GFP 발현 U2OS 세포를 24시간 동안 1.0 × 104 세포/웰의 밀도로 96웰 흑색면의 투명한 바닥 플레이트에 접종했다. 세포를 웰 이미징의 순서로 1.25㎍/mL 폴리(I:C)(HMW)/LyoVecTM으로 형질감염시켰다. 5시간 배양 후, 핵은 중간 희석된 Hoechst 33342 [ThermoFisher]로 30분 동안 염색되었습니다. IN Cell Analyzer 2000 [GE Healthcare]에서 Venus 형광의 경우 λex/λem = 490/525 nm(FITC 채널의 경우) 및 핵의 경우 λex/λem = 350/455 nm(DAPI 채널의 경우)에서 플레이트를 스캔했다. 그런 다음, 464-멤버 pDOS 라이브러리 화합물을 이미지 획득 순서대로 다중 채널 피펫(10μM 농도, 0.5% DMSO)을 사용하여 처리했다. 화합물을 첨가한 후 40, 100, 160, 220 및 280분 후에 플레이트를 스캔했다. 세포 형태와 화합물 응집체를 확인하기 위해 명시야 이미지도 촬영했다. 소프트웨어[GE Healthcare]를 사용하여 세포당 스트레스 과립의 총 수를 정량화하기 위해 이미지를 분석했다. 평균적으로 각 화합물에 대해 2개의 서로 다른 분야에서 610개의 세포가 분석되었다. 세포에 대한 총 스트레스 과립의 각 값은 0분 및 DMSO 대조군의 값으로 정규화되었다. OriginPro 8.5[OriginLab]를 이용하여 시간과 화합물에 따른 스트레스 과립의 수 변화를 그래프로 나타내었다.

세포 생존력 분석

세포를 4 × 10⁴ cells/well의 밀도로 96웰 플레이트에 접종하고 밤새 성장시켰다. 완전한 부착 후 세포는 다양한 농도의 C01-C04로 처리되었다. 24시간 후, 배지를 수용성 테트라졸륨(WST) [DoGen] 함유 배지로 교환하고 플레이트를 37°C의 가습된 5% CO₂ 분위기에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 455 nm에서의 흡광도는 BioTek Synergy HTX Microplate 판독기에 의해 기록하였다. 생존율의 백분율은 다음 방정식을 사용하여 계산되었다. 생존율(%) = (처리된 웰의 흡광도)/(대조 웰의 흡광도) × 100. 배경 흡광도 값을 뺐다.

RNA 추출 및 정량 실시간 PCR

Calu-3 세포를 12웰 플레이트에 3.5 x 10⁵세포/웰의 밀도로 시딩했다. Poly(I:C)는 화합물 처리 전에 5시간 동안 처리되었다. 총 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트[Qiagen]를 사용하여 추출되었다. cDNA는 제조사의 프로토콜에 따라 AccuPower CycleScript RT PreMix dT20 [Bioneer]로 준비되었다. qRT-PCR 실험은 KAPA SYBR FAST ABI Prism qPCR Master Mix[KAPA Biosystems]를 사용하여 수행되었다. 데이터를 비교 Ct 방법으로 분석하고 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화했다. 모든 데이터는 최소 2개의 독립적인 생물학적 복제에서 평균 ± 표준 편차로 표시된다.

바이러스

SARS-CoV-2(βCoV/KOR/KCDC03/2020)는 질병관리본부(KDCA)에서 제공했으며 Vero E6 세포에서 전파되었다. 바이러스 역가는 Vero 세포에서 플라크 분석에 의해 결정되었다. SARS-CoV-2를 사용한 모든 실험은 한국파스퇴르연구소(KNIH) 지침에 따라 한국 질병관리본부(KDCA)에서 사용이 승인된 실험실에서 BSL-3(Enhanced Biosafety Level 3) 격리 절차를 사용하여 한국파스퇴르연구소에서 수행되었다.

면역형광법에 의한 항바이러스 시험 및 용량-반응 곡선(DRC) 분석

Vero 세포는 검정, 384웰, μClear 플레이트[Greiner Bio-One]에 2% 열 불활성화 FBS 및 2% 항생제-항진균 용액[Gibco]이 보충된 DMEM[Welgene]으로 웰당 1.2 × 104개의 세포로 시딩되었다. 실험 전 24시간 동안 Calu-3 세포는 20% 열 비활성화 FBS, 1% MEM 비필수 아미노산 용액[Gibco] 및 2% 항생제-항진균 용액[Gibco]이 보충된 EMEM[ATCC]으로 웰당 2.0 × 104 세포로 시딩되었다. 실험 전 24시간 동안 검정, 384웰, μClear 플레이트 [Greiner Bio-One]에서. 10점 DRC는 0.1~50μM 범위의 화합물 농도로 2배 희석하여 생성되었다. 바이러스 감염의 경우 플레이트를 BSL-3 격리 시설로 옮기고 SARS-CoV-2를 Vero 세포의 경우 0.0125, Calu-3 세포의 경우 0.2의 감염 다중도(MOI)로 추가했다. 플레이트를 37ºC에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 세포는 0.25% Triton X-100 용액으로 투과화된 4% PFA로 감염 후 24시간(hpi)에 고정하였다. Anti-SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드(N) 1차 항체(Sino Biological, #40143-T62), Alexa 488-접합 염소 항토끼 IgG 2차 항체(Molecular Probes, #MOP-A-11034), Hoechst 33342 [ Molecular Probes]를 면역형광을 위해 시험된 세포에 처리하였다. Operetta 고처리량 이미징 장치[Perkin Elmer]로 획득한 이미지를 Columbus 소프트웨어[Perkin Elmer]를 사용하여 분석하여 세포 수와 감염 비율을 정량화했다. 각 웰의 감염률은 감염 대조군의 평균 감염률(0.5% DMSO)과 비감염 대조군(Mock)의 평균 감염률을 각각 0% 및 100% 감염 억제로 설정하여 정규화하였다. 용량 반응 곡선(DRC)은 Prism7 소프트웨어[GraphPad]를 사용하여 생성되었다. XLfit 4 소프트웨어를 사용하여 최대 억제 농도의 절반(IC50) 값을 계산했다. 모든 IC50 및 50% 세포독성 농도(CC50) 값은 이중으로 측정되었고, 각 분석의 품질은 Z'-인자 및 퍼센트 변동 계수(%CV)에 의해 제어되었다.

공동 면역 형광

Vero 세포는 실험 24시간 전에 96웰 플레이트, μClear 플레이트[Greiner Bio-One]에 웰당 3.5 x 104 세포의 밀도로 시딩되었다. 화합물을 각 웰의 세포에 첨가했다. 이어서, 세포를 5 MOI에서 SARS-CoV-2로 감염시켰다. 5 hpi에서 세포를 4% PFA로 고정하고 0.25% Triton X-100 용액으로 투과화한 다음 G3BP1(Santa Cruz, #sc-81940)에 대한 마우스 단일클론 항체 및 SARS-CoV-2 N에 대한 토끼 다중클론 항체를 사용하여 염색했다. (Sino Biological, #40143-T62). 그런 다음 Alexa 488이 결합된 염소 항토끼 IgG 2차 항체(Molecular Probes, #MOP-A-11034), Alexa Fluor Plus 647이 결합된 염소 항마우스 IgG 2차 항체(Invitrogen, #A32728) 및 Hoechst 33342 [Molecular Probes] 세포를 처리하였다. 세포는 Operetta 고처리량 이미징 장치[Perkin Elmer]로 이미지화되었다.

약물 병용 분석

Vero 세포는 검정, 384웰, μClear 플레이트[Greiner Bio-One]에 2% 열 불활성화 FBS 및 2% 항생제-항진균 용액 [Gibco]이 보충된 DMEM [Welgene]으로 웰당 1.2 × 104개의 세포로 시딩되었다. 실험 24시간 전. 10점 DRC는 0.78~30μM 범위의 화합물 농도로 2/3배 연속 희석으로 생성되었다. 최종 10 및 15μM의 로피나비르 또는 DMSO를 추가했다. 바이러스 감염의 경우 플레이트를 BSL-3 격리 시설로 옮기고 SARS-CoV-2를 0.0125 MOI로 추가했다. 플레이트를 37℃ 에서 24시간 동안 인큐베이션했다. 세포를 4% PFA로 24hpi로 고정하고 0.25% Triton X-100 용액으로 투과시켰다. Anti-SARS-CoV-2 N 1차 항체(Sino Biological, #40143-T62), Alexa 488-conjugated goat anti-rabbit IgG 2차 항체(Molecular Probes, #MOP-A-11034), Hoechst 33342를 처리하였다. 면역형광 세포. Operetta 고처리량 이미징 장치 [Perkin Elmer]로 획득한 이미지를 Columbus 소프트웨어[Perkin Elmer]를 사용하여 분석하여 세포 수와 감염 비율을 정량화했다. 각 웰의 감염률은 감염 대조군의 평균 감염률(1% DMSO)과 비감염 대조군(Mock)의 평균 감염률을 각각 0% 및 100% 감염 억제로 설정하여 정규화하였다. DRC는 Prism7 소프트웨어(GraphPad)를 사용하여 생성되었다. IC50 값은 XLfit4 소프트웨어를 사용하여 Y = 하단 + (상단 - 하단)/(1 + (IC50/X)Hillslope) 등식을 사용하여 계산되었다. 모든 IC₅₀ 및 CC₅₀ 값은 이중으로 측정되었다.

[실험예 1] 스트레스 과립 형성의 유도

스트레스 과립이 가역적이고 동적이므로, 살아있는 세포 내에서 스트레스 과립을 시간에 따라 관찰하는 것이 유익할 수 있다. 이에, 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 스트레스 과립의 마커 단백질인 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)로 태그된 G3BP1 을 안정적으로 발현하는 U2OS 인간 골육종 상피 세포를 이용하였다. 살아있는 세포 내에서 고정화하지 않고 세포질 G3BP1 부점을 간단히 카운팅(counting)하여 상이한 시간대별로 히트(hit) 화합물을 대용량 고속 처리 방식으로 발견할 수 있었다 (도 1의 (c)). 분석 시스템이 96웰 플레이트에서 스트레스 과립의 동적 변화를 모니터링할 수 있는지를 확인하기 위해, GFP-G3BP1 발현된 U2OS 세포를 다양한 농도의 2종의 공지된 스트레스 과립 촉진제, 소듐 아르세나이트(sodium arsenite) 및 타프시가긴(thapsigargin) 로 처리하여 모니터링하였고, 이로부터 스트레스 과립이 용량 의존적으로 유도된다는 점이 명확히 관찰되었다 (도 2). 스트레스 과립의 수는 두 촉진제를 처리한지 2시간 후에 최대였고, 그 후에는 점진적으로 감소하였다. 소듐 아르세나이트로 처리된 세포에서, 최대 스트레스 과립에 이르는 시간은 농도가 감소함에 따라 지연되었다.

후보 화합물은 바이러스로 감염된 세포에서 스트레스 과립 형성을 유도할 수 있어야 하므로, 바이러스로 감염된 세포를 모방하기 위해 합성 dsRNA 유사체인 폴리이노신산:폴리시티딜산 (poly(I:C))를 사용하였다. poly(I:C) 은 PKR에 의해 바이러스성 dsRNA 를 인지했을 때 스트레스 과립 형성을 유도하고 선천적인 항바이러스성 반응을 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 실제로 인간 기도 상피 세포 Calu-3 에 poly(I:C)로 감염시켰을 때 PKR-elF2α-IRF3 경로를 활성화하고 전반적인 번역을 정지시켰으며, 이는 면역블롯 분석에서 확인되었다 (도 1의 (b)). 또한, G3BP1의 면역형광 검출을 통해, poly(I:C) 감염이 스트레스 과립의 수를 시간 의존적으로 증가시킬 수 있다는 것이 밝혀졌으며, 이는 poly(I:C)이 적당한 바이러스성 dsRNA 모방체라는 것을 의미한다 (도 1의 (c)).

[실험예 2] 시간 경과에 따른 세포내 스트레스 과립 형성 모니터링

바이러스로 감염된 세포에서 스트레스 과립을 형성시키는 소분자 촉진제를 밝히기 위해 시간 경과에 따른 세포내 스트레스 과립을 모니터링하였다. 간단히 설명하면, poly(I:C) 로 U2OS 리포터 세포를 감염시키고, 이를 개별 화합물로 처리하고, 5개의 상이한 시간에 세포내 스트레스 과립의 변화를 이미지에 기반하여 모니터링하였다 (도 3의 (a)). 네거티브 대조군에 비해 세포 당 스트레스 과립 수를 표준 편차의 >3 배 만큼 촉진시킨 화합물을 히트 화합물로 선택하였다 (도 3의 (b)). 이미지에 기반한 시간에 따른 분석법(image-based time-course assay)을 사용하여 스트레스 과립 촉진제로서 벤조피라닐피라졸 코어의 화합물 (도 3의 (c)) 및 타목시펜(tamoxifen) 유도체 (도 4)를 확인하였고, 특히 몇몇 히트 화합물의 경우 상이한 시작 시간에 최대 스트레스 과립을 나타내었고, 단지 3시간 후에도 현저한 스트레스 과립 촉진을 나타낸다는 것이 관찰되었다.

[실험예 3] 구조-활성 관계(structure-activity relationship, SAR) 연구

초기 히트의 효능을 개선하기 위해, 타목시펜 유도체와 비교했을 때 활성이 더 우수한 신규한 코어 구조를 갖는 벤조피라닐피라졸-코어의 화합물에 대한 구조-활성 관계(structure-activity relationship, SAR) 연구를 실시하였다. 치환된 벤조피라닐 β-케토 알데히드와 다양한 아릴히드라진을 조합하였고 96웰 플레이트에서 이미지에 기반한 시간에 따른 분석법으로 평가하였다. 몇몇 화합물이 3시간 후에 스트레스 과립 형성 유도를 일관되게 나타내었다. 도 3의 (b)에 나타내었듯이, R₃ 위치에 파라(para)-CF₃-페닐 치환기를 포함하는 벤조피라닐피라졸이 poly(I:C)의 존재 하에 세포내 스트레스 과립의 촉진을 위한 핵심 요소였으며, 아미드, 우레아, 티오우레아, 술폰아미드 연결부가 있는 다양한 치환기를 포함하는 유사체 (C01-C11)이 일반적으로 양호한 스트레스 과립 촉진 활성을 나타내었다. R₃ 위치에 다양한 치환체를 가진 대부분의 유사체는 5 μM 농도에서 활성을 나타내지 않았으며, 오르토(ortho) 또는 메타(meta) 위치에 트리플루오로메틸 기를 포함하는 유사체는 스트레스 과립 형성을 유도하지 않았다. R₃ 위치에 피페라진의 2급 아민기의 개질은 스트레스 과립을 촉진하는데 실패하였으며 용해도를 현저히 감소시켰다 (도 3의 (c), NI01-NI11). SAR 시험에 기반하였을 때 C01 내지 C04 는 poly(I:C) 의 존재 하에 세포내 스트레스 과립을 효과적으로 촉진한다는 결론을 내렸다. 화합물이 폐 상피 세포에서의 스트레스 과립 형성을 유도하는지 여부를 검증하기 위해, Calu-3 인간 상피 세포에서 G3BP1 에 대해 면역 형광 분석을 수행하였다. C01, C02 및 C04은 총 스트레스 과립 수를 증가시켰으며, 반면에 C03 은 스트레스 과립 형성을 약하게 유도하였다 (도 3의 (d), (e), 및 도 7). Calu-3 세포를 이용한 테트라졸륨계 활성 검증에 있어서, C01-C03 (CC₅₀ > 60 μM)에 비해, C04 는 더 많은 세포독성 효과 (CC₅₀ = 37.5 μM)를 나타내었다. 또한, C01 및 C02 는, COVID-19 항바이러스 실험에 통상 사용되는 아프리카 녹색 원숭이의 Vero 신장 상피 세포, 특히 poly(I:C) 감염된 세포에서 스트레스 과립 어셈블리를 유도하였다 (도 9의 (a)). 특히, C01 은 Calu-3 및 Vero 세포 모두에서 C02 보다 더 특이적인 스트레스 과립 형성 유도를 나타내었다 (도 9의 (b)). 이러한 관찰에 기초하였을 때 후속하는 생물학적 연구에는 화합물 C01 을 선택하여 사용하였다.

[표 1] Calu-3 및 Vero 세포에서 항-SARS-CoV-2 활성

[실험예 4] 항바이러스 반응에 대한 화합물 효과

화합물 C01 은 poly(I:C)-처리된 상태에서 세포내 스트레스 과립의 형성을 용이하게 할 수 있다는 점을 발견하였으므로, 항바이러스 반응에 대한 화합물 효과를 연구하였다.

화합물 C01 단독 처리는 Calu-3 세포에서 PKR-eIF2α-IRF3 신호 전달 경로에 미미한 영향을 미쳤지만 C01은 이 항바이러스 경로를 용량 의존적으로 크게 활성화하고 poly(I;C)의 존재 하에 번역 정지를 유도했으며 이는 퓨로마이신(puromycin) 실험에서 확인되었다 (도 5의 (a)). 그러나, 스트레스 과립 형성을 강화하지 않은 음성 유사체 NI02는 항바이러스 반응을 활성화하지 않았다. 그런 다음 C01의 항바이러스 효능이 처리된 dsRNA의 양에 의해 영향을 받는지 조사하고, C01 기반 항바이러스 반응이 PKR-eIF2α-IRF3의 웨스턴 블롯팅에 의해 확인된 처리된 폴리(I:C)의 농도와 양의 상관관계가 있음을 관찰했다. 신호 전달 경로는 C01이 외부 dsRNA의 존재 하에서 선천적 항바이러스 반응을 특이적으로 상향 조절함을 나타낸다 (도 5의 (b)).

다음으로, 화합물 C01 처리가 I형 인터페론과 ISG56의 세포 생산을 유도하는지 여부를 조사하기 위해 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)을 수행했다. 도 5의 (c) 및 5의 (d)에 나타난 바와 같이, C01은 폴리(I:C) 처리된 Calu-3 세포에서 IFNB1 및 ISG56의 세포 수준을 증가시켰지만, 폴리(I:C)가 없는 경우 두 mRNA 수준 모두 유의한 변화가 없었다. NIO2 처리 시 스트레스 과립 형성에 대한 이전의 이미지 기반 관찰과 일치한다. 따라서 C01이 세포 스트레스 과립의 형성과 후속적인 선천적 항바이러스 면역 반응을 강화함으로써 바이러스 복제를 억제한다는 결론을 내렸다.

[실험예 5] SARS-CoV-2에 대한 항바이러스 효과

SARS-CoV-2에 대한 C01-C04의 항바이러스 효과를 조사했다. 간단히 말해서, Calu-3 및 Vero 세포는 각각 0.2 및 0.0125의 감염 다중도(MOI)에서 SARS-CoV-2로 감염되었다. 그 다음, 세포를 다양한 농도의 화합물로 처리하였다. 바이러스 감염 24시간 후, SARS-CoV-2 N 단백질 및 숙주 세포 핵의 면역형광 검출을 수행하여 바이러스 감염 억제 및 세포 생존력을 정량적으로 측정하였다. C01-C04가 SARS-CoV-2 복제의 용량 의존적 억제를 나타냄을 관찰했다(도 6의 (a) 및 도 10). 특히, C01은 Calu-3 세포에서 가장 높은 선택지수(S.I.)인 CC50 대 IC50의 비율을 나타내었다(표 1). 반면, 음성 유사체 NI02는 Calu-3와 Vero 세포 모두에서 SARS-CoV-2의 복제를 억제하는 데 실패했다. 화합물의 억제 메커니즘을 설명하기 위해 SARS-CoV-2에 감염된 세포에 대해 G3BP1에 대한 면역형광 분석을 수행했다. SARS-CoV-2 감염은 Vero 세포에서 약한 스트레스 과립 형성을 유발하였고, 아비산나트륨으로 유발된 스트레스 과립 형성은 SARS-CoV-2에 의해 억제되었다(도 11).

대조적으로, NI02 처리가 아닌 C01 및 C02 처리는 바이러스 감염 세포에서 스트레스 과립 형성을 유도하여 C01 및 C02에 의해 유도된 스트레스 과립이 외부 바이러스 dsRNA에 대한 선천성 면역 반응을 활성화하고 바이러스 번역을 차단함을 나타낸다(도 6의 (b) 및 도 12). 고농도에서 세포 독성에 의해 제한되는 치료 농도의 유효 윈도우을 지정하기 위해 약물 조합 분석을 수행했다. 바이러스 프로테아제를 표적으로 하는 항바이러스 시약인 로피나비르(lopinavir)(LPV)가 있는 경우 C01은 Vero에서 SARS-CoV-2에 대해 크게 향상된 항바이러스 활성 (IC₅₀ 7.64에서 < 0.78μM)과 선택적 지수(2.09에서 >17.91)를 보여주었다. NI02는 그렇지 않은 반면(도 6의 (c) 및 13). 이러한 결과는 스트레스 과립 촉진제와 작용 방식이 다른 다른 항바이러스제의 약물 조합이 COVID-19를 포함한 바이러스성 질병을 치료할 수 있음을 시사했다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 코로나바이러스과 바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서
L₁ 은 단일 결합, 탄소수 1 내지 6의 알킬렌기, 탄소수 2 내지 6의 알케닐렌기, -NH-, 또는 -NH-L₂ 이고, L₂ 은 탄소수 1 내지 6의 알킬렌기이고,
R₁ 은 4-트리플루오로메틸페닐 또는 시클로펜틸이고,
R 는 탄소수 2 내지 6의 알케닐렌기, 페닐, 싸이오펜일, 또는 시클로헥실이고,
단, R₁ 이 시클로펜틸인 경우, R 는 싸이오펜일이다.
제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물이 하기 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물:

.
제1항에 있어서,
상기 코로나바이러스과 바이러스의 감염이 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63), 인간 코로나바이러스 HKU1 (HCoV-HKU1), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 및 제2형 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 바이러스에 의해 야기되는 것인, 약제학적 조성물.
제1항에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 제2형 중증 급성 호흡기 증후군을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
제1항에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유하는, 세포내 스트레스 과립 형성의 유도를 통한 항바이러스 면역 반응의 활성화제.
제1항에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 코로나 바이러스과 바이러스의 감염에 대한 다른 예방 또는 치료제와 조합한, 코로나 바이러스과 바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 병용 제제.