CN115089637A - 吴茱萸醇提物和/或吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用 - Google Patents

吴茱萸醇提物和/或吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种吴茱萸次碱的新应用，主要涉及吴茱萸次碱在制备抗冠状病毒药物中的应用。与传统技术方案相比，本发明具备如下优势效果：本发明的发明人经过大量的筛选，发现吴茱萸次碱具有较强的抑制冠状病毒感染和抗新冠病毒的功效，将其制备成抗冠状病毒的药物，能为预防或/治疗冠状病毒提供有效手段。

Description

吴茱萸醇提物和/或吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物 中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及吴茱萸醇提物或/和吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。国际病毒分类委员会将此种新病原体命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2号(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。
人感染了新冠病毒(SARS-CoV-2)后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。因此，寻找有效抑制新冠病毒的候选药物是亟待解决的技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
基于此，本发明实施例的目的包括提供吴茱萸次碱的新应用，主要是吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用。
本发明实施例的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明实施例提供吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱中的一种或者多种在制备抗新型冠状病毒药物中的应用；
所述吴茱萸醇提物的制备步骤包括：
用乙醇水溶液对吴茱萸进行提取处理，收集提取液；
去除所述提取液中的溶剂，制备吴茱萸醇提物。
在本发明的一些实施方式中，所述吴茱萸醇提物的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
所述乙醇水溶液中乙醇的体积占比为85％-95％；
提取处理的方式包括加热回流提取；以及，
所述溶剂的去除方式包括旋转蒸发。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2号、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或者蝙蝠SARS样冠状病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述药物包含吴茱萸次碱以及药学上可以接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为膏剂或者贴剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为溶液剂或者混悬剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为乳剂或者霜剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为喷雾剂、滴剂或者冲剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂或者丸剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为茶剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为管饲制剂。
与传统技术方案相比，本发明具备如下优势效果：
本发明的发明人经过大量的筛选，发现吴茱萸次碱具有较强的抑制冠状病毒感染和抗新冠病毒的功效，将其制备成抗冠状病毒药物，能为预防或/治疗冠状病毒提供一种有效手段。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中吴茱萸不同化学成分对SARS-CoV-2Spike假型病毒的抑制作用的结果；
图2为实施例3中不同浓度吴茱萸醇提物抑制假病毒作用的结果；
图3为实施例3中不同浓度吴茱萸次碱抑制假病毒作用的结果；
图4为实施例4中不同浓度吴茱萸醇提物抑制刺蛋白的结果；
图5为实施例4中不同浓度吴茱萸次碱抑制刺蛋白的结果；
图6为实施例5中不同浓度吴茱萸醇提物抑制3CL蛋白酶结果；
图7为实施例5中不同浓度吴茱萸次碱抑制3CL蛋白酶的结果；
图8为实施例6中分子对接技术显示吴茱萸次碱与刺蛋白的RBD部位结合。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本发明所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本发明中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本发明中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
吴茱萸是芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实，又名辣子、气辣子、茶辣等等。《中国药典》记载其功效主治包括：温中、止痛、理气、燥湿以及湿疹等功效。现代研究表明，吴茱萸的成分有吴茱萸次碱、吴茱萸碱、吴茱萸因碱、吴茱萸内酯和羟基吴茱萸碱等等。同时，研究发现吴茱萸提取物对皮肤真菌具有不同程度的抑制作用。此外，吴茱萸次碱化合物在研究中展现了抗高血压、抗心律不齐和兴奋子宫的作用。
发明人在中药研究过程中，利用模拟新冠病毒SARS-CoV-2感染的假病毒为模型、对新冠病毒外壳(SARS-COV-2)的刺突蛋白(Spike protein)与血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合的抑制作用模型、针对3CL蛋白酶以及分子对接技术等四个模型，筛选了200多种中药及其化学成分，发现吴茱萸次碱能够抑制新冠病毒假病毒的入侵、减少刺突蛋白与血管紧张素转化酶2的结合、抑制3CL蛋白酶等作用，从而可以起到抑制冠状病毒的作用。基于该发现，本发明将吴茱萸次碱用于制备抗冠状病毒感染的药物，为冠状病毒感染的控制提供新的解决方案。
本发明的第一方面
本发明提供吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用；
所述吴茱萸醇提物的制备步骤包括：
用乙醇水溶液对吴茱萸进行提取处理，收集提取液；
去除所述提取液中的溶剂，制备吴茱萸醇提物。吴茱萸次碱的分子结构式如下：
Figure BDA0003724080350000051
在本发明中，“抗”包括预防、治疗、辅助治疗等方面。如本文所用，如本文所用，“防治”是指减轻、延缓进展、衰减、预防，或维持现有疾病或病症。“防治”还包括将疾病或病症的一个或多个症状治愈、预防其发展或减轻到某种程度。
在本发明中，“药物”包括在体内或体外提供生理和/或药理作用的任何药剂、化合物、组合物或混合物，且往往提供的是有益效果。“药物”在体内产生生理和/或药理作用的范围没有特别限制，可以为全身效果，也可以只在局部产生效果。所述“药物”的活性没有特别限制，可以为能与其它物质发生相互作用的活性物质，也可以为不发生相互作用的惰性物质。
在本发明中，“药物”中包含有效量的吴茱萸次碱。
在本发明中，“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解特定疾病、病症和/或症状的剂量，本发明中，如无特别限定，指实现治疗、预防、减轻和/或缓解高血脂疾病、病症和/或症状的剂量。
在本发明中，“治疗有效量”是指针对疾病、病症和/或症状，将引起个体的生物学或医学响应的药物活性成分的量，例如为个体带来生理和/或药理上积极效果的本发明化合物的量，所述生理和/或药理上积极效果包括但不限于降低或抑制酶或蛋白质活性或改善症状、缓解病症、减缓或延迟疾病进程或预防疾病等。
在本发明的一些实施方式中，所述吴茱萸醇提物的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
所述乙醇水溶液中乙醇的体积占比为85％-95％；
提取处理的方式包括加热回流提取；以及，
所述溶剂的去除方式包括旋转蒸发。本发明中，所述的乙醇水溶液中乙醇的体积占比例如为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％。
在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2号、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或者蝙蝠SARS样冠状病毒。
在本发明的一些实施方式中，所述药物包含吴茱萸次碱以及药学上可以接受的辅料。
本发明的所述辅料可以选自，包括但不限于如下种类中的一种或者多种：稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂。所述稀释剂可以选自，包括但不限于：淀粉类、糖类、纤维素类、无机盐类。所述润湿剂可以选自，包括但不限于：水、乙醇。所述黏合剂可以选自，包括但不限于：淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮、聚乙二醇。所述崩解剂可以选自，包括但不限于：淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂。所述润滑剂可以选自，包括但不限于：滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇。所述色香味调节剂可以选自，包括但不限于：色素、香料、甜味剂、胶浆剂、矫臭剂。所述溶剂可以选自，包括但不限于：水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油、乙酸乙酯。所述增溶剂可以选自，包括但不限于：吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物。所述助溶剂可以选自，包括但不限于：有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油。所述乳化剂可以选自，包括但不限于：司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅、皂土。所述助悬剂可以选自，包括但不限于：甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇、触变胶。所述抗氧剂可以选自，包括但不限于：亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类。所述金属络合剂可以选自，包括但不限于：乙二胺四乙酸二钠、多羧酸化合物；所述惰性气体可以选自，包括但不限于：氮气、二氧化碳中。所述防腐剂可以选自，包括但不限于：尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油。所述局部止痛剂可以选自，包括但不限于：苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因、普鲁卡因。所述pH调节剂可以选自，包括但不限于：盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸盐。所述等渗或等张调节剂可以选自，包括但不限于：葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为膏剂或者贴剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为溶液剂或者混悬剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为乳剂或者霜剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为喷雾剂、滴剂或者冲剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂或者丸剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为茶剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为管饲制剂。
本发明的第二方面
本发明提供一种冠状病毒感染的治疗方法，包括给予受试者有效量的含有吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱中的一种或者多种的药物。
“吴茱萸醇提物”、“药物”、“治疗”、“有效量”、可参考本发明第一方面定义。
在一些实施方式中，药物的施用方式包括但不限于：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)注射、和局部给药、吸入。
在其中一些实施例中，药物可通过口服、灌肠或肠胃外的形式给药。
在其中一些实施例中，药物的给药周期可为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1、吴茱萸的90％醇提物的制备
吴茱萸90％醇提物的制备方法包括如下步骤：
(1)取药材，置250mL圆底烧瓶，加入10倍质量的90％(v/v)乙醇水溶液浸泡半小时，回流加热1小时，之后隔药渣，将药液滤出；
(2)用旋转蒸发器蒸发至干，制备吴茱萸90％醇提物。
实施例2、吴茱萸不同化学成分对SARS-CoV-2Spike假型病毒的抑制作用
(1)实验原理
假病毒是一类嵌合型病毒颗粒，是在一种复制缺陷型病毒(病毒载体)的表面上表达另一种病毒的重组糖蛋白的嵌合病毒颗粒。用新冠病毒S蛋白替代病毒载体中的包膜糖蛋白，形成模拟新冠病毒SARS-CoV-2感染的假病毒。如果中药提取物能抑制假病毒的入侵和感染，这代表该中药提取物也能抑制新冠病毒入侵。
(2)实验材料
高糖Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)购自Gibco(UK)。胎牛血清(FBS)购自Gibco(巴西)。青霉素和链霉素(Pen/Strep)购自Gibco。胰蛋白酶-EDTA(1x)购自Gibco。萤光素酶检测系统购自Promega。Protein Assay Dye Reagent Concentration购自Bio-Rad。牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma。酶标仪购自Thermo Scientific。MicroplateLuminometer购自GLOMAX。
(3)实验步骤
细胞培养：HEK293T细胞在含有10％(v/v)小牛血清(FBS)和1％(w/w)Pen/Strep的高葡萄糖Dullbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。通过用pcDNA3.1-hACE2质粒转染进行ACE-2过表达的HEK293T细胞系。
SARS-CoV-2假病毒的产生与采集：HEK293T细胞与质粒NR-52514、NR-52516、NR-52517、NR-52518、NR-52519共转染，产生SARS-CoV-2Spike假型病毒颗粒。转染后48小时收集上清液中的假病毒，用孔径为0.45μm的过滤器过滤并储存在-80℃。
表1.建立SARS-CoV-2Spike假型病毒模型共转染的质粒类型和作用
质体类型 嵌入 BEI Resources产品编号
Viral Entry Protein Spike Glycoprotein NR-52514
Lentiviral Backbone Luc2；ZsGreen NR-52516
Helper Plasmid Gag；pol NR-52517
Helper Plasmid Tat1b NR-52518
Helper Plasmid Rev1b NR-52519
假病毒入侵试验：ACE-2过表达的HEK293T细胞已接种在48孔板中，每孔加入100μL假病毒(同时加入检测样品)和400μL培养基，孵育过夜。将培养基换成DMEM、FBS和Pen/Strep的混合物，培养48小时后，用1×PBS洗涤，然后进行荧光素酶活性测定。
以中和抗体(A19215)为阳性对照，溶剂空白和无假病毒组为阴性对照。检测样品为吴茱萸次碱以及吴茱萸内酯。检测样品吴茱萸次碱和吴茱萸内酯最终浓度控制为1μM以及100μM两个水平。用溶剂空白的荧光素酶活性检测数据标化荧光素酶活性，计算样品抑制病毒的百分比。每个样品加三个孔，取平均值，实验重复三次。
(4)实验结果
在实验中，以中和抗体A19215溶液为阳性对照。结果如图1所示。
在2个浓度的吴茱萸次碱以及吴茱萸内酯中，只有100μM的吴茱萸次碱有明显抑制假型病毒的作用，抑制率约80％。1μM及100μM的吴茱萸内酯和1μM的吴茱萸次碱都不能有效抑制假型病毒。因此，选择吴茱萸次碱为吴茱萸抗新冠的有效成分进行下一步的实验。
实施例3、吴茱萸90％醇提物以及吴茱萸次碱对SARS-CoV-2Spike假型病毒的抑制作用
(1)实验原理
同实施例2。
(2)实验材料
同实施例2
(3)实验步骤
同实施例2。
以中和抗体(A19215)为阳性对照，溶剂空白和无假病毒组为阴性对照。检测样品为吴茱萸醇提物以及吴茱萸次碱。检测样品吴茱萸醇提物最终浓度控制在1μg/mL至100μg/mL，而吴茱萸次碱最终浓度控制在1μM至100μM。用溶剂空白的荧光素酶活性检测数据标化荧光素酶活性，计算样品抑制病毒的百分比。每个样品加三个孔，取平均值，实验重复三次。
(4)实验结果
在实验中，以中和抗体A19215溶液为阳性对照。结果如图2和图3所示。
如图2所示，吴茱萸醇提物对假病毒的抑制作用呈剂量依赖方式，当浓度为25μg/mL以上时，吴茱萸醇提物对假病毒抑制率高于40％。
如图3所示，吴茱萸次碱对假病毒的抑制作用呈剂量依赖方式，当浓度达到100μM时，吴茱萸次碱对假病毒抑制率高于80％。
结合吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱对假病毒的抑制作用，数据显示：吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱均表现出显著的抗新冠病毒(SARS-CoV-2)作用。
表2.不同浓度吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱抑制假病毒作用的结果
Figure BDA0003724080350000091
Figure BDA0003724080350000101
实施例4、检测吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱对新冠病毒外壳(SARS-COV-2)的刺突蛋白(Spike protein)与血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合的抑制作用
(1)实验原理
通过检测吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱样品对新冠病毒外壳(SARS-COV-2)的刺突蛋白(Spike protein)与血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合的抑制作用，来表示检测样品的抗病毒功效。当刺突蛋白被检测样品抑制时，其与人类受体——血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合就会降低。刺突蛋白与ACE2的结合越少，则检测样品抑制冠状病毒的功效越强。该方法是目前测试药物抗新冠病毒(SARS-CoV-2)功效的一种有效的体外检测手段。
(2)实验材料
吴茱萸醇提物以及吴茱萸次碱稀释至6个不同浓度，利用SARS-CoV-2Spike:ACE2Inhibitor Screening Assay Kit(购自BPS Bioscience公司)进行抗新冠病毒(SARS-CoV-2)测试。
(3)实验步骤
将浓度为1μg/mL的刺突蛋白溶液加入特制的96孔板中，每孔加50μL，4℃过夜孵育。孵育完成后，倒去上清液，用100μL封闭液A清洗3次。拍干液体，每孔加入100μL封闭液B，室温振荡1小时。拍干液体后，每孔加入20μL封闭液A，阳性对照孔和阴性对照孔中分别加入10μL 5％(v/v)的DMSO水溶液，样品孔加入10μL样品溶液(含有5％DMSO)，室温振荡1小时。
阳性对照以中和抗体A19215作为模拟实验最高抑制率的情况，阴性对照孔和样品孔中分别加入20μL浓度为2.5ng/μL的ACE2-His溶液，室温振荡反应1小时。反应完成后拍干液体，用100μL封闭液A清洗3次。拍干液体，每孔加入100μL封闭液B，室温培养10分钟。培养结束后拍干液体，每孔加入10μL Anti-His-HRP溶液，室温振摇培养1小时。先用100μL封闭液A清洗3次，紧接着每孔加入100μL封闭液B，室温培养10分钟。最后，拍干液体，每孔加入100μL ELISA ECL substrate A和B(1:1)的混合液，测定化学荧光强度。
(4)实验结果
在实验中，以中和抗体A19215溶液为阳性对照；以不加任何抑制剂的溶液为阴性对照。
不同浓度吴茱萸醇提物结果如图4所示，吴茱萸醇提物对刺蛋白与ACE2结合的抑制作用呈剂量依赖方式，当浓度为0.1mg/mL以上时，吴茱萸醇提物抑制率高于90％。
不同浓度吴茱萸次碱结果如图5所示，吴茱萸次碱对刺蛋白与ACE2结合的抑制作用呈剂量依赖方式，当浓度达到100μM时，吴茱萸次碱抑制率达到52％。
表3.不同浓度吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱抑制假刺蛋白的结果
Figure BDA0003724080350000111
实施例5、检测吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱对新冠病毒3CL样蛋白酶的抑制作用
(1)实验原理
3CL样蛋白酶为新冠病毒的组成部分，并在病毒侵入宿主细胞后的复制中起到至关重要的作用。当该蛋白酶被检测样品抑制的时候，病毒于宿主细胞的复制将会受到显着抑制，从而抑制病毒的致病作用。
综上所述，本发明利用模拟新冠病毒SARS-CoV-2感染的假病毒为模型和对新冠病毒外壳(SARS-COV-2)的刺突蛋白(Spike protein)与血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合的抑制作用两个模型，验证吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱能够抑制新冠病毒假病毒的入侵，减少刺突蛋白与血管紧张素转化酶2的结合，以及抑制3CL样蛋白酶从而可以起到抑制冠状病毒生长和复制的作用，为冠状病毒感染的控制提供新的解决方案。本实验采用3C样蛋白酶免疫测定(3CL protease 3CLpro)分析吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱对新冠病毒复制的抑制效果。
(2)实验材料
吴茱萸醇提物稀释至8个不同浓度以及吴茱萸次碱稀释至6个不同浓度，利用SensoLyte SARS-CoV-2 3CL Protease Activity assay kit(AnaSpec公司)进行抗新冠病毒(SARS-CoV-2)测试。
(3)实验步骤
吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱稀释至不同浓度，并与3CL蛋白酶一起添加到微孔板中。检测样品会与3CL蛋白酶竞争结合，形成后来的荧光底物。3CL蛋白酶会与荧光底物结合，并以460nm的波长发射由360nm波长激发之荧光。如果中药提取物能够抑制3CL蛋白酶与荧光底物的结合，则不会发出荧光。带有荧光灯的微孔板可以通过荧光微孔板读取器读取。
(4)实验结果
不同浓度吴茱萸醇提物结果如图6所示，吴茱萸醇提物对3CL样蛋白酶的抑制作用呈剂量依赖方式，当浓度为1mg/mL时，吴茱萸醇提物抑制率高于40％。
不同浓度吴茱萸次碱结果如图7所示，吴茱萸次碱对3CL样蛋白酶有着明显的抑制作用，当浓度达到10μM时，吴茱萸次碱抑制率达到70％。
表4.不同浓度吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱抑制3CL蛋白酶的结果
Figure BDA0003724080350000121
实施例6、利用分子对接技术分析吴茱萸次碱与刺蛋白(Spike-protein)的亲和力
(1)实验原理
RBD是病毒的刺突蛋白和人体细胞ACE2结合的地方，如果化学成分能与RBD结合就能减少病毒与人体ACE2结合的机会，从而预防人体感染新冠病毒，计算该化学成分与RBD的结合能量，结合能量的数值越负化表结合越强，抑制新冠病毒的功效越高。
(2)实验操作与结果
利用SEESAR软件，选择刺蛋白(PDB码：6LZG)中的RBD(residues 438-506)为靶点，进而检测吴茱萸次碱与该靶点的亲和力。已知的SARS-COV-1抑制剂K22为用为对照品。
结果如图8显示，吴茱萸次碱能够与氨基酸SER469和LYS458建立氢键，并有效击中刺蛋白的RBD部位。从结合能量来看，该化合物与RBD结合能力为-12.7KJ/mol，略优于K22的-10.7KJ/mol，证明吴茱萸次碱可与刺蛋白有效结合，从而抑制新冠病毒与ACE2受体的结合进而阻止其攻击宿主细胞。
实施例7
本实施例涉及吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为冲剂。
实施例8
本实施例涉及吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为颗粒剂。
实施例9
本实施例涉及吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为胶囊剂。
实施例10
本实施例涉及吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为片剂。
实施例11
本实施例涉及吴茱萸次碱在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为茶剂。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.吴茱萸醇提物和吴茱萸次碱中的一种或者多种在制备抗新型冠状病毒药物中的应用；
所述吴茱萸醇提物的制备步骤包括：
用乙醇水溶液对吴茱萸进行提取处理，收集提取液；
去除所述提取液中的溶剂，制备吴茱萸醇提物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述吴茱萸醇提物的制备步骤满足如下条件中的一个或者多个：
所述乙醇水溶液中乙醇的体积占比为85％-95％；
提取处理的方式包括加热回流提取；以及，
所述溶剂的去除方式包括旋转蒸发。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2号、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒或者蝙蝠SARS样冠状病毒。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含吴茱萸次碱以及药学上可以接受的辅料。
5.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为膏剂或者贴剂。
6.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为溶液剂或者混悬剂。
7.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为乳剂或者霜剂。
8.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为喷雾剂、滴剂或者冲剂。
9.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂或者丸剂。
10.根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为茶剂或者管饲制剂。
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