CN117860820A

CN117860820A - 药物组合物以及包含其的抗冠状病毒药物

Info

Publication number: CN117860820A
Application number: CN202311610213.1A
Authority: CN
Inventors: 詹华强; 董婷霞; 林盛颖; 梁嘉荣; 段然
Original assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Current assignee: Hong Kong University of Science and Technology HKUST
Priority date: 2023-11-29
Filing date: 2023-11-29
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本申请属于生物医学技术领域，特别涉及一种药物组合物以及包含其的抗冠状病毒药物。本申请提供的药物组合物包括质量比为(1‑3)：(1‑3)的吴茱萸提取物和粉防己提取物，或者，摩尔质量比为(1‑5)：(1‑5)的吴茱萸次碱和粉防己碱，具有较强的抑制冠状病毒感染和抗新冠病毒的功效，并且各成分表现出协同的抑制作用，将其制备成抗冠状病毒的药物，能为预防或/治疗冠状病毒提供有效手段。

Description

药物组合物以及包含其的抗冠状病毒药物

技术领域

本申请属于生物医学技术领域，特别涉及一种药物组合物以及包含其的抗冠状病毒药物。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。国际病毒分类委员会将此种新病原体命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2号(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。

根据世界卫生组织于2021年10月的声明，“长新冠”症状大多会在新冠病毒患者染疫以后的3个月内出现并会持续至少2个月，其症状亦难以通过其他诊断方式进行医学解释。“长新冠”的病症包括极度困倦、记忆力和注意力涣散(“脑雾”)、味觉和嗅觉的变化，及气短、胸痛或紧绷等一系列的症状，对新冠病毒患者及已康复者带来长远的不便及不适。因此，寻找有效抑制新冠病毒的候选药物仍然是亟待解决的技术问题。

发明内容

基于此，本申请一个或者多个实施例提供一种药物组合物以及包含其的抗冠状病毒药物。

本申请实施例的第一方面，提供一种药物组合物，其包括刺蛋白抑制剂和TPC2蛋白抑制剂；其中，

所述刺蛋白抑制剂包括吴茱萸提取物，所述TPC2蛋白抑制剂包括粉防己提取物，所述吴茱萸提取物和所述粉防己提取物的质量比为(1-3)：(1-3)；或者，

所述刺蛋白抑制剂包括吴茱萸次碱，所述TPC2蛋白抑制剂包括粉防己碱，所述吴茱萸次碱和所述粉防己碱的摩尔质量比为(1-5)：(1-5)。

在本申请的一些实施方式中，所述的药物组合物，其满足如下条件中的一个或者多个：

(1)所述吴茱萸提取物包括吴茱萸醇提物；以及，

(2)所述粉防己提取物包括粉防己醇提物。

在本申请的一些实施方式中，所述吴茱萸醇提物包括吴茱萸的乙醇提取物；所述粉防己醇提物包括粉防己的乙醇提取物。

在本申请的一些实施方式中，所述吴茱萸的乙醇提取物包括吴茱萸的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物；所述粉防己的乙醇提取物包括粉防己的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物。

本申请实施例的第二方面，提供第一方面中所述的药物组合物在制备抗冠状病毒药物中的应用。

在本申请的一些实施方式中，所述抗冠状病毒药物包括抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2号药物、抗严重急性呼吸综合征冠状病毒药物、抗中东呼吸综合征冠状病毒药物或者抗蝙蝠SARS样冠状病毒药物。

在本申请的一些实施方式中，所述抗冠状病毒药物包括所述药物组合物以及药学上可以接受的辅料。

在本申请的一些实施方式中，所述抗冠状病毒药物的剂型包括膏剂、贴剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、茶剂或者管饲制剂。

本申请实施例的第三方面，提供一种抗冠状病毒药物，其包括第一方面中所述的药物组合物以及药学上可以接受的辅料。

与传统技术方案相比，本申请具备如下优势效果：

本申请的申请人经过大量的筛选，发现吴茱萸提取物联合粉防己提取物或者吴茱萸次碱联合粉防己碱在抑制新型冠状病毒中展现良好的协同作用，将其制备成抗冠状病毒药物，能为预防或/治疗冠状病毒提供一种有效手段。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中，经过ACE2免疫染色法的验证，HEK293T假病毒系统中含有有效的ACE2受体蛋白；

图2为实施例2中，经过TPC2免疫染色法的验证，HEK293T假病毒系统中含有有效的TPC2蛋白；

图3为实施例2中，经过筛选和检测得出吴茱萸醇提物(EVF)与粉防己醇提物(STS)重量比例为1：1以及吴茱萸次碱(Ru)与粉防己碱(Te)摩尔质量浓度比例为1：1时抗病毒活性优于其它比例组合；

图4为实施例2中，假病毒通道测试得出吴茱萸醇提物(EVF_EtOH)与粉防己醇提物(STS_EtOH)复合物可有效抑制野生型以及奥密克戎型的新冠病毒入侵宿主细胞；

图5为实施例3中，经过Compusyn计算，吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物针对野生型和奥密克戎型新冠病毒均可表达出具有协同的抑制效果；

图6为实施例4中，假病毒通道测试得出吴茱萸次碱(Ru)与粉防己碱(Te)复合物可有效抑制野生型以及奥密克戎型的新冠病毒入侵宿主细胞；

图7为实施例5中，经过Compusyn计算，吴茱萸次碱联合粉防己碱针对野生型和奥密克戎型新冠病毒均可表达出具有协同的抑制效果；

图8为实施例6中，经过分子对接技术分析得出，吴茱萸次碱可有效击中野生型和奥密克戎型病毒刺蛋白而粉防己碱也可有效击中TPC2蛋白。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本申请中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

已有多项研究探明关于新冠病毒入侵细胞的机理，包括ACE2、病毒刺蛋白S-protein、3CL蛋白酶、TPC2等蛋白均为病毒入侵宿主细胞的关键蛋白。因此，针对这些蛋白的抑制剂将有望作为抑制新冠病毒的治疗方案。前期研究中，本申请已经发现吴茱萸以及吴茱萸次碱能通过抑制病毒刺蛋白与ACE2结合从而抑制新冠病毒进入宿主细胞，并已经在国际知名期刊发表科研文章(参考文献1)以及向国家知识产权局申请专利。此外，根据已有的研究文献，粉防己以及粉防己碱均为有效的TPC2蛋白抑制剂(参考文献2-3)。有鉴于此，本申请提出了刺蛋白抑制剂与TPC2抑制剂联合使用抑制新冠病毒的假设，并且经过层层筛选和检测，发现吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物或者吴茱萸次碱联合粉防己碱能达到针对新冠病毒的协同抑制作用。吴茱萸中药材和粉防己中药材均为中药领域的知名药材，而吴茱萸次碱和粉防己碱也同样应用于临床领域。综上所述，本申请实施例可将已知的临床药物有机结合在一起，并大大减少从研究成果到临床抗病毒应用的进程。

[1].Lin S；Wang X；Guo H；Dai N；Tang RWL.；Lee HC；Leung KW；Dong TTX；WebbSE；Miller AL,Tsim KWK.The Ethanol Extract of Evodiae Fructus and ItsIngredient,Rutaecarpine,Inhibit Infection of SARS-CoV-2and InflammatoryResponses.Int.J.Mol.Sci.2023,24,762,https://doi.org/10.3390/ijms24010762.

[2].Jin X；Zhang Y；Alharbi A；Hanbashi A；Alhoshani A；ParringtonJ.Targeting Two-Pore Channels:Current Progress and Future Challenges.Trendsin Pharmacological Sciences,2020,41,582.

[3].Moccia1 F；Negri1 S；Faris1 P；Perna A；De Luca A；Soda T；Berra-RomaniR；Guerra G.Targeting Endolysosomal Two-Pore Channels to Treat CardiovascularDisorders in the Novel COronaVIrus Disease 2019.Front.Physiol.,2021,12,https://doi.org/10.3389/fphys.2021.629119.

本申请实施例的第一方面

本申请实施例提供一种药物组合物，其包括刺蛋白抑制剂和TPC2蛋白抑制剂；其中，

所述刺蛋白抑制剂包括吴茱萸提取物，所述TPC2蛋白抑制剂包括粉防己提取物，所述吴茱萸提取物和所述粉防己提取物的质量比为(1-3)：(1-3)(例如1：1，1：2，2：1，1：3，3：1等等)；或者，

所述刺蛋白抑制剂包括吴茱萸次碱，所述TPC2蛋白抑制剂包括粉防己碱，所述吴茱萸次碱和所述粉防己碱的摩尔质量比为(1-5)：(1-5)(例如1：1，1：2，2：1，1：3，3：1，1：4，4：1，1：5，5：1等等)。

“提取物”是以植物为原料，按照对提取的最终产品的用途的需要，经过物理化学提取分离过程，定向获取和浓集植物中的多种有效成分。本申请中的提取物是经提取得到的多种化学成分的混合物。

吴茱萸次碱化学结构式如下：

粉防己碱化学结构式如下：

可选地，所述的药物组合物，其满足如下条件中的一个或者多个：

(1)所述吴茱萸提取物包括吴茱萸醇提物；以及，

(2)所述粉防己提取物包括粉防己醇提物。

进一步地可选地，所述吴茱萸醇提物包括吴茱萸的乙醇提取物；所述粉防己醇提物包括粉防己的乙醇提取物。

更进一步地可选地，所述吴茱萸的乙醇提取物包括吴茱萸的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物；所述粉防己的乙醇提取物包括粉防己的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物。

本申请实施例中，所述吴茱萸的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物的制备步骤包括：以乙醇体积百分比为85％-95％(例如为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％)的乙醇溶液为提取溶剂，对吴茱萸进行提取，收集提取液；以及，去除所述提取液中的溶剂，制备吴茱萸的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物。

可选地，所述提取溶剂的质量为所述吴茱萸质量的8倍-12倍(例如为8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12倍)。

可选地，提取前先擦用所述提取溶剂对所述吴茱萸进行浸泡。进一步可选地，浸泡时间为0.3小时-0.7小时(例如为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7小时)。

可选地，提取的方式包括加热回流提取。进一步可选地，加热回流提取的时间为0.8小时-1.2小时(例如为0.8、0.9、1.0、1.1、1.2小时)。

可选地，去除所述溶剂的方法包括旋转蒸发。

本申请实施例中，所述粉防己的乙醇提取物包括粉防己的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物的制备步骤包括：

以乙醇体积百分比为85％-95％(例如为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％)的乙醇溶液为提取溶剂，对粉防己进行提取，收集提取液；以及，去除所述提取液中的溶剂，制备吴粉防己的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物。

可选地，所述提取溶剂的质量为所述粉防己质量的8倍-12倍(例如为8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12倍)。

可选地，提取前先擦用所述提取溶剂对所述粉防己进行浸泡。进一步可选地，浸泡时间为0.3小时-0.7小时(例如为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7小时)。

可选地，去除所述溶剂的方法包括旋转蒸发。

本申请实施例的第二方面

本申请实施例提供第一方面中所述的药物组合物在制备抗冠状病毒药物中的应用。

在一些示例中，所述抗冠状病毒药物包括抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2号药物、抗严重急性呼吸综合征冠状病毒药物、抗中东呼吸综合征冠状病毒药物或者抗蝙蝠SARS样冠状病毒药物。

可选地，所述抗冠状病毒药物包括所述药物组合物以及药学上可以接受的辅料。

本申请实施例对抗冠状病毒药物的剂型不做特别限定，可以根据临床需求选择相应的辅料制备相应的剂型，例如膏剂、贴剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、茶剂或者管饲制剂等。

本申请实施例的所述辅料可以选自，包括但不限于如下种类中的一种或者多种：稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、pH调节剂、等渗或等张调节剂。所述稀释剂可以选自，包括但不限于：淀粉类、糖类、纤维素类、无机盐类。所述润湿剂可以选自，包括但不限于：水、乙醇。所述黏合剂可以选自，包括但不限于：淀粉浆、糊精、糖、纤维素衍生物、明胶、聚维酮、聚乙二醇。所述崩解剂可以选自，包括但不限于：淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、表面活性剂、泡腾崩解剂。所述润滑剂可以选自，包括但不限于：滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、十二烷基硫酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇。所述色香味调节剂可以选自，包括但不限于：色素、香料、甜味剂、胶浆剂、矫臭剂。所述溶剂可以选自，包括但不限于：水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、二甲基亚砜、液体石蜡、脂肪油、乙酸乙酯。所述增溶剂可以选自，包括但不限于：吐温类、卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、肥皂类、硫酸化物、磺酸化物。所述助溶剂可以选自，包括但不限于：有机酸及其盐类、酰胺及胺类化合物、无机盐、聚乙二醇、聚维酮、甘油。所述乳化剂可以选自，包括但不限于：司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、甘油脂肪酸酯、高级脂肪酸盐、硫酸化物、磺酸化物、阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶、果胶、磷脂、琼脂、海藻酸钠、氢氧化物、二氧化硅、皂土。所述助悬剂可以选自，包括但不限于：甘油、糖浆、阿拉伯胶、西黄耆胶、琼脂、海藻酸钠、纤维素衍生物、聚维酮、卡波普、聚乙烯醇、触变胶。所述抗氧剂可以选自，包括但不限于：亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、抗坏血酸、没食子酸及其酯类。所述金属络合剂可以选自，包括但不限于：乙二胺四乙酸二钠、多羧酸化合物；所述惰性气体可以选自，包括但不限于：氮气、二氧化碳中。所述防腐剂可以选自，包括但不限于：尼泊金类、有机酸及其盐、季铵类化合物、醋酸氯己定、醇类、酚类、挥发油。所述局部止痛剂可以选自，包括但不限于：苯甲醇、三氯叔丁醇、利多卡因、普鲁卡因。所述pH调节剂可以选自，包括但不限于：盐酸、硫酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、醋酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、乙二胺、葡甲胺、磷酸盐、醋酸盐、枸橼酸盐。所述等渗或等张调节剂可以选自，包括但不限于：葡萄糖、氯化钠、枸橼酸钠、山梨醇、木糖醇。

在本申请实施例中，“抗”包括预防、治疗、辅助治疗等方面。如本文所用，“防治”是指减轻、延缓进展、衰减、预防，或维持现有疾病或病症。“防治”还包括将疾病或病症的一个或多个症状治愈、预防其发展或减轻到某种程度。

在本申请实施例中，“药物”包括在体内或体外提供生理和/或药理作用的任何药剂、化合物、组合物或混合物，且往往提供的是有益效果。“药物”在体内产生生理和/或药理作用的范围没有特别限制，可以为全身效果，也可以只在局部产生效果。所述“药物”的活性没有特别限制，可以为能与其它物质发生相互作用的活性物质，也可以为不发生相互作用的惰性物质。

在本申请实施例中，“抗冠状病毒药物”中包含有效量的第一方面中所述的药物组合物。

在本申请实施例中，“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解特定疾病、病症和/或症状的剂量，本申请中，如无特别限定，指实现治疗、预防、减轻和/或缓解冠状病毒感染、病症和/或症状的剂量。

在本申请中，“治疗有效量”是指针对疾病、病症和/或症状，将引起个体的生物学或医学响应的药物活性成分的量，例如为个体带来生理和/或药理上积极效果的本申请化合物的量，所述生理和/或药理上积极效果包括但不限于降低或抑制酶或蛋白质活性或改善症状、缓解病症、减缓或延迟疾病进程或预防疾病等。

在本申请实施例的第三方面

本申请实施例提供一种抗冠状病毒药物，其包括第一方面中所述的药物组合物以及药学上可以接受的辅料。

术语“抗”、“抗冠状病毒药物”、“药物”、“有效量”、“治疗有效量”的定义参照第二方面。同样地，对辅料、剂型的限定也参照第二方面。

本申请的第四方面

本申请提供一种冠状病毒感染的治疗方法，包括给予受试者有效量的所述抗冠状病毒药物。

在一些实施方式中，药物的施用方式包括但不限于：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)注射、和局部给药、吸入。

在其中一些实施例中，药物可通过口服、灌肠或肠胃外的形式给药。

在其中一些实施例中，药物的给药周期可为间歇给药、周期性给药、持续给药或长期给药。

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

前期研究中，申请人团队经过一系列的筛选和检测发现吴茱萸醇提取物以及吴茱萸次碱可通过抑制新冠病毒刺蛋白来有效抑制病毒入侵宿主细胞，因此被认定为有效的刺蛋白抑制剂。与此同时，根据文献记载，TPC2蛋白是新冠病毒通过粘膜融合进入细胞的重要成分之一，因此也成为抗病毒入侵的靶点蛋白之一。团队认为，刺蛋白-ACE2通路与TPC2蛋白均在病毒入侵通道中扮演了重要角色，而刺蛋白抑制剂与TPC2抑制剂的结合将有可能通过多靶点联合机制抑制病毒通道以达到抗病毒的协同作用并大大降低抑制剂复合物的半数有效率(IC₅₀)。已有多项文献记载，粉防己以及粉防己碱对TPC2蛋白可展现良好抑制效果，是有效的TPC2抑制剂。

发明人在中药研究过程中，建立了新冠病毒SARS-CoV-2感染的假病毒模型、新冠病毒外壳(SARS-COV-2)的刺突蛋白(Spike protein)与血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合的抑制作用模型、分子对接模型、Compusyn分析协同效应等四个模型，深入探讨吴茱萸提取物联合粉防己提取物或者吴茱萸次碱联合粉防己碱两种组合物在抑制新冠病毒入侵的协同效应。结果表明，两种组合物，即吴茱萸提取物联合粉防己提取物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱，可有效抑制新冠病毒的入侵通道，且抑制效果比单个药物(即吴茱萸提取物、吴茱萸次碱、粉防己、粉防己碱分别单独使用)更优，也就是说两种组合物在抑制新冠病毒方面展现了良好协同效应。基于该发现，本申请实施例将吴茱萸提取物联合粉防己提取物或者吴茱萸次碱联合粉防己碱两种组合物制备抗冠状病毒感染的药物，以期为冠状病毒感染的控制提供新的解决方案。

实施例1、吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物的组合物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱的组合物的制备

吴茱萸90％醇提物以及粉防己90％醇提物的制备方法包括如下步骤：

(1)取药材，置250mL圆底烧瓶，加入10倍质量的90％(v/v)乙醇水溶液浸泡半小时，回流加热1小时，之后隔药渣，将药液滤出；

(2)药液用旋转蒸发器蒸发至干，分别制备吴茱萸90％醇提物和粉防己90％醇提物。

(3)收集提取后的吴茱萸醇提物和粉防己醇提物按照一定的比例进行混合配成组合物，吴茱萸醇提物和粉防己醇提物的质量比例，包括：1：1，1：2，2：1，1：3，3：1等等。

吴茱萸次碱联合粉防己碱的组合物的制备包括如下步骤：

吴茱萸次碱和粉防己碱纯度均为95％以上，按照一定的比例进行混合配成组合物，吴茱萸次碱和粉防己碱的摩尔质量浓度比例，包括：1：1，1：2，2：1，1：3，3：1，1：4，4：1，1：5，5：1等等。

实施例2、吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物对SARS-CoV-2Spike假型病毒的协同抑制作用

(1)实验原理

假病毒是一类嵌合型病毒颗粒，是在一种复制缺陷型病毒(病毒载体)的表面上表达另一种病毒的重组糖蛋白的嵌合病毒颗粒。用新冠病毒S蛋白替代病毒载体中的包膜糖蛋白，形成模拟新冠病毒SARS-CoV-2感染的假病毒。其中，S蛋白包括野生型(wildtype)以及奥密克戎型(Omicron)。如果组合物能抑制假病毒的入侵和感染，这代表该组合物能抑制野生型以及奥密克戎型新冠病毒入侵宿主细胞。

(2)实验材料

高糖Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)购自Gibco(UK)。胎牛血清(FBS)购自Gibco(巴西)。青霉素和链霉素(Pen/Strep)购自Gibco。胰蛋白酶-EDTA(1x)购自Gibco。萤光素酶检测系统购自Promega。Protein Assay Dye Reagent Concentration购自Bio-Rad。牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma。酶标仪购自Thermo Scientific。MicroplateLuminometer购自GLOMAX。

(3)实验步骤

细胞培养：HEK293T细胞在含有10％(v/v)小牛血清(FBS)和1％(w/w)Pen/Strep的高葡萄糖Dullbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。通过用pcDNA3.1-hACE2质粒转染进行ACE-2过表达的HEK293T细胞系。

如表1，SARS-CoV-2假病毒的产生与采集：HEK293T细胞与质粒NR-52514、NR-52516、NR-52517、NR-52518、NR-52519、179907共转染，分别产生SARS-CoV-2野生型以及奥密克戎型的Spike假型病毒颗粒。转染后48小时收集上清液中的假病毒，用孔径为0.45μm的过滤器过滤并储存在-80℃。

表1、建立SARS-CoV-2Spike假型病毒模型共转染的质粒类型和作用

质体类型	嵌入	BEI Resources产品编号
			Viral Entry Protein	Wildtype Spike Glycoprotein	NR-52514
Viral Entry Protein	Omicron Spike Glycoprotein	179907
			Lentiviral Backbone	Luc2；ZsGreen	NR-52516
Helper Plasmid	Gag；pol	NR-52517
			Helper Plasmid	Tat1b	NR-52518
Helper Plasmid	Rev1b	NR-52519

假病毒入侵试验：ACE-2过表达的HEK293T细胞已接种在48孔板中，每孔加入100μL假病毒(同时加入检测样品)和400μL培养基，孵育过夜。将培养基换成DMEM、FBS和Pen/Strep的混合物，培养48小时后，用1×PBS洗涤，然后进行荧光素酶活性测定。

以中和抗体(A19215)为阳性对照，溶剂空白和无假病毒组为阴性对照。检测样品为吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物的组合物，并与吴茱萸醇提物以及粉防己醇提物单独使用进行比较。

用溶剂空白的荧光素酶活性检测数据标化荧光素酶活性，计算样品抑制病毒的百分比。每个样品加三个孔，取平均值，实验重复三次。

(4)实验结果

首先，上述建立的细胞中经过ACE2免疫染色法和TPC2免疫染色法的验证，均含有有效的ACE2受体(图1)以及TPC2蛋白(图2)，这也为刺蛋白抑制剂(比如吴茱萸醇提物以及吴茱萸次碱)抑制刺蛋白与ACE2结合以及TPC2抑制剂(粉防己以及粉防己碱)抑制病毒通道提供证据。图1中所示，HEK293T细胞在转染ACE2受体(萤光绿色)后，经过ACE2染色分析法的验证，细胞表面含有一定量的ACE2受体，假病毒上的刺蛋白可利用该受体入侵宿主细胞。图2中所示，在TPC2染色分析法中，TPC2蛋白被染成萤光绿色，由图可知，HEK293T细胞内含有一定量的TPC2蛋白。

如图3，为探索不同质量比例的吴茱萸醇提物和粉防己醇提物的抑制作用，本申请实施例经过筛选和比较发现，当吴茱萸醇提物与粉防己醇提物之间质量比例为1：1，即15μg/mL：15μg/mL，组合物展示出优于其它比例组合的抗野生型(图3中A图)和奥密克戎型病毒(图3中B图)的活性。与此同时，当吴茱萸次碱与粉防己碱之间摩尔质量浓度比例为1：1时，即15μM：15μM时，复合物表达出更强的抑制野生型(图3C)和奥密克戎型(图3D)新冠病毒的活性。图3中所示为不同比例组合的吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱的抵抗野生型(图3中A图，图3中C图)和奥密克戎型(图3中B图、图3中D图)病毒活性。醇提物的重量比例1：1，1：2，2：1，1：3，3：1分别表示吴茱萸醇提物与粉防己醇提物重量比例为15μg/mL：15μg/mL，10μg/mL：20μg/mL，20μg/mL：10μg/mL，7.5μg/mL：22.5μg/mL，22.5μg/mL：7.5μg/mL。化合物摩尔质量浓度比例1：1，1：2，2：1，1：3，3：1分别表示吴茱萸次碱与粉防己碱比例15μM：15μM，10μM：20μM，20μM：10μM，7.5μM：22.5μM，22.5μM：7.5μM。

以吴茱萸醇提物(EVF_EtOH)与粉防己醇(STS_EtOH)提物重量比例1：1为例，结果如图4所示，其中中和抗体A19215溶液为阳性对照。图4中所示，在HKE293T假病毒系统中，以吴茱萸醇提物和粉防己醇提物重量配比1：1为例，吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物的组合物可有效抑制野生型(A)和奥密克戎型(B)新冠病毒入侵宿主细胞，并呈现良好的量效曲线。由结果可看出，在浓度1.5625μg-25μg之间，吴茱萸醇提物(EVF_EtOH)与粉防己提取物(STS_EtOH)的组合物可有效抑制野生型(图4中A图)以及奥密克戎型(图4中B图)的新冠病毒入侵宿主细胞，并且抑制效果比吴茱萸醇提物以及粉防己醇提物单独使用时更好。

实施例3、利用电脑分析软件Compusyn分析吴茱萸醇提物与粉防己醇提物组合物协同效应

(1)实验原理

Compusyn电脑模型(https://www.combosyn.com/index.html)利用【药物协同指数定理】，即下述公式计算得出合并指数。其中，D为使用剂量、而f_a则为抑制率，CI为协同指数。合并指数可以用于定义单个化合物之间的协同作用(CI<1)，相加作用(CI＝1)以及拮抗作用(CI>1)。

(2)实验结果

如图5所示，以吴茱萸醇提物与粉防己醇提物质量比例1：1为例，当吴茱萸醇提物(EVF_EtOH)与粉防己醇提物(STS_EtOH)联合使用时，CI值保持在1以下，这表明，二者可针对野生型(图5中A左图)和奥密克戎型(图5中B图)新冠病毒表达出具有协同作用的抑制效果。

实施例4、吴茱萸次碱联合粉防己碱对SARS-CoV-2Spike假型病毒的协同抑制作用

(1)实验原理

同实施例2。

(2)实验材料

同实施例2。

(3)实验步骤

同实施例2。

以中和抗体(A19215)为阳性对照，溶剂空白和无假病毒组为阴性对照。检测样品为不同摩尔质量浓度的吴茱萸次碱联合粉防己碱复合物，并与吴茱萸次碱(Rutaecarpine)以及粉防己碱(Tetrandrine)单独使用进行比较。用溶剂空白的荧光素酶活性检测数据标化荧光素酶活性，计算样品抑制病毒的百分比。每个样品加三个孔，取平均值，实验重复三次。

(4)实验结果

图6中所示为，在HKE293T假病毒系统中，以吴茱萸次碱(Rutaecarpine)和粉防己碱(Tetrandrine)摩尔质量浓度配比1：1为例，吴茱萸次碱联合粉防己碱的复合物可有效抑制野生型(A)和奥密克戎型(B)新冠病毒入侵宿主细胞，并呈现良好的量效曲线。

由图6所示，以吴茱萸次碱与粉防己碱摩尔质量浓度比例1：1为例，在浓度0.625μM-20μM之间，吴茱萸次碱与粉防己碱复合物展现出良好的抑制野生型(图6中A图)以及奥密克戎型(图6中B图)新冠病毒的作用，且该作用比吴茱萸次碱以及粉防己碱单独使用时更好。

实施例5、利用电脑分析软件Compusyn分析吴茱萸次碱联合粉防己碱的组合物协同效应

(1)实验原理

同实施例3。

(2)实验结果

如图7所示，以吴茱萸次碱(Ru)与粉防己碱(Te)摩尔质量浓度比例1：1为例，当吴茱萸次碱与粉防己碱联合使用时，协同指数值保持在1以下，这表明，二者可针对野生型(图7中A图)和奥密克戎型(图7中B图)新冠病毒表达出具有协同作用的抑制效果。

实施例6、利用分子对接技术分析吴茱萸次碱与刺蛋白(Spike-protein)的亲和力

(1)实验原理

RBD是病毒的刺突蛋白和人体细胞ACE2结合的地方，如果化学成分能与RBD结合就能减少病毒与人体ACE2结合的机会，从而预防人体感染新冠病毒，计算该化学成分与RBD的结合能量，结合能量的数值越负化表明结合越强，抑制新冠病毒的功效越高。

(2)实验操作与结果

利用SEESAR软件(13.0Version，https://www.biosolveit.de/products/seesar/)，选择刺蛋白(PDB码：野生型6LZG；奥密克戎型7T9L)中的RBD(residues 438-506)为靶点，进而检测吴茱萸次碱与该靶点的亲和力。此外，选择TPC2配体结合域(PDB码：6NQ0)作为靶点，进一步检测粉防己碱与TPC2的结合力。

结果如图8显示，吴茱萸次碱能够有效击中野生型(图8中A图)以及奥密克戎型(图8中B图)刺蛋白的RBD部位并释放能量，证明吴茱萸次碱可与刺蛋白有效结合，从而抑制新冠病毒与ACE2受体的结合进而阻止其攻击宿主细胞。

与此同时，粉防己碱也可与TPC2配体结合域有效结合并表达有效抑制效果(图8中C图)。两种化合物分别与刺蛋白和TPC2蛋白结合，也为对应的中药材分别抑制刺蛋白与ACE2受体结合以及TPC2蛋白提供强有力证据。

实施例7

本实施例涉及吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱两种组合物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为冲剂。

实施例8

本实施例涉及吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱两种组合物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为颗粒剂。

实施例9

本实施例涉及吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱两种组合物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为胶囊剂。

实施例10

本实施例涉及吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱两种组合物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为片剂。

实施例11

本实施例涉及吴茱萸醇提物联合粉防己醇提物以及吴茱萸次碱联合粉防己碱两种组合物在制备抗新型冠状病毒药物中的应用，所述药物的剂型为茶剂。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.药物组合物，其包括刺蛋白抑制剂和TPC2蛋白抑制剂；其中，

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其满足如下条件中的一个或者多个：

(1)所述吴茱萸提取物包括吴茱萸醇提物；以及，

(2)所述粉防己提取物包括粉防己醇提物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述吴茱萸醇提物包括吴茱萸的乙醇提取物；所述粉防己醇提物包括粉防己的乙醇提取物。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述吴茱萸的乙醇提取物包括吴茱萸的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物；所述粉防己的乙醇提取物包括粉防己的乙醇体积百分比为85％-95％的乙醇溶液的提取物。

5.权利要求1至4中任一项所述的药物组合物在制备抗冠状病毒药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述抗冠状病毒药物包括抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2号药物、抗严重急性呼吸综合征冠状病毒药物、抗中东呼吸综合征冠状病毒药物或者抗蝙蝠SARS样冠状病毒药物。

7.根据权利要求5或者6所述的应用，其中，所述抗冠状病毒药物包括所述药物组合物以及药学上可以接受的辅料。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述抗冠状病毒药物的剂型包括膏剂、贴剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、茶剂或者管饲制剂。

9.一种抗冠状病毒药物，其包括权利要求1至4中任一项所述的药物组合物以及药学上可以接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的抗冠状病毒药物，其剂型包括膏剂、贴剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、冲剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、茶剂或者管饲制剂。