KR20230090811A - 생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법 - Google Patents
생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법은, 인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩, 오간온어칩이 내부에 안착되며 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터, 마이크로인큐베이터에 연결되며 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비, 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부를 포함하는 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법에 관한 것이다.
상기 구성에 의한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법은 인체조직유래세포를 기반으로 세포의 이동을 관찰하고 분석하는 기술을 제공한다.
상기 구성에 의한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법은 인체조직유래세포를 기반으로 세포의 이동을 관찰하고 분석하는 기술을 제공한다.
Description
본 발명은 생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법에 관한 것이다.
종양의 전이, 바이러스의 침입, 상처회복, 세포분열과 같은 복잡한 생물학적 과정을 이해하는데 있어 세포활동의 추적 및 분석은 중요한 역할을 한다. 저속 촬영이 가능한 현미경을 통해 얻어진 세포동영상으로부터 전후 프레임 내 세포들의 상관관계를 조사하고 새로운 세포의 인식 및 세포분열의 확인과 같은 작업들이 수행되어야 한다.
세포영상의 분석을 통해 바이오 연구 및 응용 분야와 관련된 중요한 정보를 얻을 수 있기 때문에 중요한 과정 중에 하나이다.
하지만, 기존의 세포영상 분석 및 비교작업은 대부분 전문가들의 수작업을 통해 이루어지고 있으며, 많은 시간과 노동력을 요구한다. 또한 영상 데이터베이스가 방대 해지며 세포영상 분석의 간편화는 연구의 효율화를 위해 필수적인 요소이다.
특히 저속촬영이 가능한 현미경을 통해 얻어진 세포동영상에서의 세포영역 분할 및 추적기술은 세포활동의 간편 분석을 위한 핵심적인 기술이기 때문에 보다 더 간편한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법의 개발이 필요하다.
상기와 같은 기술적 배경을 바탕으로 안출된 것으로, 본 발명은 생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법은, 인체조직유래세포를 통해 질병을 예측하는 실시간세포추적시스템에 있어서, 실시간세포추적시스템은, 인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩, 오간온어칩이 내부에 안착되며, 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터, 마이크로인큐베이터에 연결되며, 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비 및 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부를 포함할 수 있다.
분석부는 인체조직유래세포의 분석결과를 바탕으로 유사약물을 예측하는 예측부를 더 포함할 수 있다. 또한 분석결과에 따른 유전체 결과물과 공공데이터로부터 전송받는 부작용 데이터세트를 통합하여 독성평가를 하는 독성평가부를 더 포함할 수 있으며 인체조직유래세포에 대해 액체생체검사 진행을 위한 알고리즘을 포함할 수 있다.
세포추적장비는 실시간으로 인체조직유래세포의 변화를 기록하는 카메라 및 카메라로부터 전송된 영상을 인체조직유래세포의 이동 및 면적 변화에 대한 이미지정보를 라벨링 전처리를 하는 영상분석부를 포함할 수 있다.
인체조직유래세포는, 혈액 유래, 켈로이드 조직 유래, 지방 조직 유래, 뇌 조직 유래, 장 조직 유래세포로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하여 진행할 수 있다.
분석부는, AutoKeras, Extra tree classifier, Mask-RCNN으로 이루어진 군 중 하나 이상의 방법을 이용하여 분석될 수 있다.
인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 제1 단계, 제1 단계를 기반으로 제작된 오간온어칩을 마이크로인큐베이터에서 배양하는 제2 단계, 제2 단계를 기반으로 배양된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 제3 단계를 포함할 수 있다.
상기와 같은 기술적 배경을 바탕으로 안출된 것으로, 본 발명은 생체모방 오간온어칩을 이용한 세포추적방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템의 블록도이다.
도 2는 도 1에 나타낸 분석부의 유사약물예측에 대한 예시를 나타낸 사진이다.
도 3은 도 1에 나타낸 분석부의 독성평가 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 4는 도 1에 나타낸 분석부의 액체생체검사 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 5는 도 1에 나타낸 세포추적장비로 측정한 세포를 나타낸 사진이다.
도 6은 도 5에 나타낸 세포에 대해 라벨링 전처리를 한 사진이다.
도 7은 도 5에 나타낸 세포에 대해 면적값을 확인한 사진이다.
도 8은 도 5에 나타낸 세포에 대해 세포 종류에 따른 라벨링 및 세포부위 인식을 나타낸 사진이다.
도 9는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제1 예시를 나타낸 사진이다.
도 10은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제2 예시를 나나타낸 사진이다.
도 11은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제3 예시를 나타낸 사진이다.
도 12는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제4 예시를 나타낸 사진이다.
도 13은 도 1에 따라 제작된 오간온어칩에서 시간의 흐름에 따른 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 14는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 관찰한 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 15는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 이미지의 분석을 나타낸 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적방법의 순서도이다.
도 2는 도 1에 나타낸 분석부의 유사약물예측에 대한 예시를 나타낸 사진이다.
도 3은 도 1에 나타낸 분석부의 독성평가 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 4는 도 1에 나타낸 분석부의 액체생체검사 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 5는 도 1에 나타낸 세포추적장비로 측정한 세포를 나타낸 사진이다.
도 6은 도 5에 나타낸 세포에 대해 라벨링 전처리를 한 사진이다.
도 7은 도 5에 나타낸 세포에 대해 면적값을 확인한 사진이다.
도 8은 도 5에 나타낸 세포에 대해 세포 종류에 따른 라벨링 및 세포부위 인식을 나타낸 사진이다.
도 9는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제1 예시를 나타낸 사진이다.
도 10은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제2 예시를 나나타낸 사진이다.
도 11은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제3 예시를 나타낸 사진이다.
도 12는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제4 예시를 나타낸 사진이다.
도 13은 도 1에 따라 제작된 오간온어칩에서 시간의 흐름에 따른 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 14는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 관찰한 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 15는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 이미지의 분석을 나타낸 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적방법의 순서도이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참고부호를 붙였다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "위에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "아래에" 있다고 할
경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템의 블록도이다.
도 1을 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템은, 인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩(11), 오간온어칩이 내부에 안착되며 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터(10), 마이크로인큐베이터에 연결되며 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비(20), 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부(30)를 포함할 수 있다.
인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩(11)은 광학적으로 투명하며 내구성이 강한 중합체인 PDMS(Polydimethylsiloxane)와 슬라이드 글라스를 이용하여 제작될 수 있다.
PDMS는 부드럽고 신축성 있는 재질이면서 투명하기 때문에 현미경으로 관찰이 용이하고, 산소와 이산화탄소를 잘 투과시키기 때문에 세포를 배양하기에 용이하다.
PDMS를 몰드로 사용하며, 연성 리소그래피(Soft lithography)의 식각 공정이나 광중합 리소그래피로 패턴을 제작하는 공정을 이용할 수 있다.
연성 리소그래피 방법은 유연한 유기물질을 사용하여 기존의 포토 리소그래피에서 사용하는 복잡한 장치를 사용하지 않고 패턴이나 구조물을 만드는 전사법이다. PDMS 기반 연성 리소그래피의 식각 공정을 사용하면 상대적으로 저렴하고, 주형제작이 용이하며 소수성 표면을 친수성으로 바꾸어 다른 재질의 표면에 접합하기 쉬운 소자를 만들 수 있으며 나노 또는 마이크로 단위의 형상과 구조물을 제작하기에 용이하다.
연성 리소그래피는 고분자 도장을 이용하여 원하는 기판에 패턴을 전사하는 방식으로 방법에 따라 크게 프린팅과 몰딩으로 나눌 수 있는데, 대표적인 연성 리소그래피 방법으로는 미세접촉프린팅(μCP), decal transfer 미세전사법(decal transfer microlithography, DTM), 광 스탬프(light stamp)등의 프린팅 방법과 레플리카몰딩(replica molding), 모세관 힘 리소그래피(capillary force lithography), 모세관-미세몰딩(micromolding in capillaries, MIMIC), 미세전사몰딩(microtransfer molding, μTM), 나노임프린팅(nanoimprinting), 액체중재전사몰딩(liquid-bridge- mediated nanotransfer molding, LB-nTM)등의 몰딩법이 있다.
이 외에도 PDMS 기반 광중합 리소그래피를 통해 만든 소자는 해상도가 높고, 생체적합성이 좋기 때문에 입체 리소그래피(3D 프린팅) 보다 선호되고 있어 오간온어칩(11)을 제작하는데 이용할 수 있다. 하지만 이와 같이 PDMS를 사용하여 오간온어칩(11)이 제작될 수 있다면 패턴 제작 공정 기술은 이에 특별히 한정하는 것은 아니다.
인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩(11)에 사용되는 인체 조직유래세포는 혈액, 켈로이드, 지방, 뇌, 장, 간, 폐, 비장 조직 등 다양한 장기에서 검체를 채취할 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 다중 장기 조직을 이용해서 오간온어칩을 제작할 수 있다. 예를 들어, 위-장-간 조직을 연결한 오간온어칩을 제작할 수 있는데, 각기 다른 장기에 해당하는 챔버를 추가하여 오간온어칩을 제작한 뒤, 위-장-간의 대사산물이 다른 조직에 미치는 영향에 대해서 연구할 수 있다.
일반적으로 질환은 개별적인 장기의 반응보다는 장기들 사이에서 상호작용을 통한 종합적인 반응이 중요하다. 따라서 여러 장기의 조직 세포를 한 개의 오간온어칩(11)에서 동시에 배양하고 대사와 관련된 지표의 변화를 측정한다면 인체와의 유사성이 높아져 연구의 신뢰도를 높일 수 있다. 하지만 인체조직유래세포가 모사하고자 하는 장기를 이루는 세포로 구성되거나, 장기의 특이적 구조를 갖추거나, 장기의 특이적 기능을 재현한 것이라면 나열한 장기들의 조직 세포로 특별히 한정하는 것은 아니다.
예를 들어 장 조직 유래세포는, 장 줄기세포가 증식, 분화하여 생성된 세포의 자기 조직화(Self-organization)을 통해 생성될 수 있으며, 장 상피세포(Enterocyte), 술잔 세포(Goblet cell), 장내분비세포(Enteroendocrine cell), 장 줄기세포(Intestinal stem cell) 등과 같은 장 상피를 구성하는 세포들로 구성되어 있으며 융모와 움의 조직학적 특성을 모사한다. 이러한 세포 구성과 구조적 모사 외에도 영양분의 흡수와 수분 교환 등과 같은 장의 기능적 특성 또한 재현할 수 있다.
오간온어칩(11)이 내부에 안착되며, 오간온어칩(11)의 배양에 도움을 주는 마이크로인큐베이터(10)는 세포 배양에 요구되는 온도, 습도, 탄소 농도를 지속적으로 유지하는 기능을 포함하며, 3차원 세포 배양 공정을 이용할 수 있다.
3차원 세포 배양은 세포가 3차원 환경과 상호작용하거나 성장할 수 있도록 인위적으로 만들어진 성장환경을 의미한다. 2차원 환경과 달리 3차원 환경의 세포 성장은 세포로 하여금 생체 외(in vitro)에서 모든 방향으로 성장할 수 있도록 하며, 이는 생체 내(in vivo)에서의 세포 환경과 더욱 유사하다.
예를 들면, 3차원 세포배양은 일반적으로 bioreactor나 cell을 spheroids로 자라나게 할 수 있는 작은 캡슐에서 이루어지며, bioreactor 하나 당 대략 300개의 spheroids가 배양될 수 있다. 3차원적으로 세포와 세포간의 접촉이 일어나고 그에 따른 상호작용과 세포 분비물이 확산되면서 신호전달이 일어나고 세포막에 존재하는 수송단백질에 의해 약물이 확산, 투과로 인해 세포로 들어갈 수 있다. 이러한 특성은 2차원 세포배양에는 없고, 3차원 배양에서만 일어나는 특성으로 이를 통해 실제 생체에서 일어나는 약물대사과정이 2차원 배양에 비해 잘 일어난다.
또한, 오간온어칩(11)을 마이크로인큐베이터(10)에서 배양하며 사용되는 세포배양모델은 Scaffold 방식과 Scaffold-free 방식에 특별히 한정하지 않고 이용할 수 있다.
Scaffold-free 방식은 세포외기질 없이 세포와 세포를 뭉쳐서 자라게하고, Scaffold 방식은 세포외기질 공간 안에 세포를 3차원으로 배양한다.
예를 들면 Scaffold-free 방식 중, 바닥을 코팅하거나 배양액을 유동시켜 세포의 부착을 방지하는 anti-adhesion 방식인 Static suspension 배양, Spinner/rotational chamber 배양, Nano pattern 배양, 자기부상(magnetic levitation) 배양으로 이루어진 군 중에서 하나 이상의 배양 방법이 이용될 수 있다.
Static suspension 방식은 가장 일반적인 세포배양모델로 디쉬(dish)나 well의 바닥에 세포의 부착을 방지하는 아가 또는 anti-adhesion 코팅을 하여 세포가 떠서 서로 뭉쳐서 자라는 3차원 세포배양모델이다.
Spinner/rotation chamber 방식은 spinner 또는 rotational chamber를 이용하여 세포를 끊임없이 움직여 바닥에 세포가 부착하지 못하여 배양액 상에서 떠서 뭉쳐 자라는 3차원 세포배양모델이며, Nano pattern 방식은 well의 바닥에 미세 패턴을 만들어 세포가 well 바닥에 부착되지 않고 떠서 덩어리 형태로 자라는 3차원 세포배양모델이다.
또한 자기부상 방식은 자석 입자를 이용해 세포를 well 바닥으로부터 띄워 세포를 덩어리 형태로 자라게 하는 3차원 세포배양모델이다.
부착방지 방식 이 외에도 중력의 힘으로 세포를 모아서 단일 spheroids를 형성하는 방식으로 Hang in drop 배양, U 또는 V shape well 배양 등으로도 구분될 수 있다.
또한 Scaffold 방식도 오간온어칩(11)의 배양방법으로 사용할 수 있다. Scaffold 방식은 세포외기질로 인공 폴리머인 Solid-scaffold나 hydrogel을 쓰는 방식에 따라서 다양하게 나뉘어 지며, 구조적으로는 세포외기질을 well, 마이크로채널, 마이크로 필라 등에 형성하는 방식으로 나뉜다.
하지만, 오간온어칩(11)을 통해 spheroids 형태의 세포 배양 형성을 확인할 수 있다면 이는 나열한 배양방법들에 특별히 한정하는 것은 아니다.
도 2는 도 1에 나타낸 분석부의 유사약물예측에 대한 예시를 나타낸 사진이다.
도 2를 참고하면, 신약개발 시 이미 ADR이 알려진 약물과 비슷한 작용을 하여 그 약물을 정확히 예측할 수 있다면 관심 있게 볼 ADR을 미리 선정할 수 있다. 예를 들면, CLUE에서 비슷한 서비스를 제공하고 있다. 이를 바탕으로 CLUE에 있는 약물 처리된 세포의 gene expression data를 이용해 drug similarity 예측 모델을 만들었다. multi-class classification이며 Deep learning의 AutoKeras의 Architecture search를 사용할 수 있으며 micro AUC = 0.94 수준의 성능을 보였다. 또한 이 모델을 통해 나온 확률로 유전자 기반 약물 유사도 계산을 통한 약물의 추천이 가능할 수 있다.
도 3은 도 1에 나타낸 분석부의 독성평가 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 3을 참고하면, 분석부는 독성평가를 할 수 있는 알고리즘을 포함할 수 있다. 예를 들면, CLUE의 약물을 투여한 gene expression data와 sider, FDA Adeverse Event Reporting System, Drug.com등의 부작용 database를 사용하여 유전체 결과물과 부작용 데이터세트를 통합하게 된다. 인공지능 모델에 이 데이터를 넣을 때 y값은 부작용의 개수가 301개 이기 때문에 multi label classification이 된다. Machine learning에서 이를 처리하기 위해 데이터를 알고리즘에 맞게 변형시키는 방법(Problem Transformation Method)와 알고리즘을 데이터에 맞게 바꾸는 방법(Algorithm Adaption Method) 두가지를 사용할 수 있다. 결과적으로 Extra-Trees의 모델의 micro auc 0.757로 가장 좋았으므로 해당 모델을 선택하였다. 이에 따라feature selection과 hyper parameter tuning을 진행해 micro auc 0.763수준의 모델을 구축할 수 있었다.
도 4는 도 1에 나타낸 분석부의 액체생체검사 알고리즘을 나타낸 사진이다
도 4를 참고하면, 분석부는 액체생체검사를 할 수 있는 알고리즘을 포함할수 있다. 액체생체검사의 진행을 위한 실험 플랫폼 구축을 위하여 최근의 digial genomic sequencing 기술의 발달로 적은 양의 DNA에 암세포의 체세포 돌연변이를 관찰할 수 있는 여지가 늘어났다. 액체 생체 검사는 circulating tumor cell (CTC)와 cell-free DNA (cfDNA) 가 원료 시료가 될 수 있다. Circulating tumor cell (CTC)을 기존에 승인된 cellsearchTM 의 CTC capture platform과 inhouse customized platform 중 성능을 비교하여 CTC 분리 플랫폼을 선정하였다. Cell-free DNA (cfDNA)를 환자의 혈액 샘플에서 채취하여 이를 적은 양의 DNA로부터 linear하게 DNA를 증폭하는 기술을 in-house 구축하였다. 이에 따라, Variant (Filter: AO>=5, ExAC AF<=0.05, AF>=0.055) ctDNA 조건에 만족하는 Variant 1건 VHS-062/TP53, AO: Total number of reads that support the alternate allele. ExAC AF The frequency of the allele called at this locus, from ExAC global population. AF: The allele fraction (AF) of the reads that support the alternative allele Highlight: Filter 조건 만족 1건 (Filter: AO>=5, ExAC AF<=0.05, AF>=0.055) Filter확장: AO>=5, ExAC AF<=0.05, AF>=0.0055 와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
도 5는 도 1에 나타낸 세포추적장비로 측정한 세포를 나타낸 사진이고, 도 6은 도 5에 나타낸 세포에 대해 라벨링 전처리를 한 사진이고, 도 7은 도 5에 나타낸 세포에 대해 면적 값을 확인한 사진이고, 도 8은 도 5에 나타낸 세포에 대해 세포 종류에 따른 라벨링 및 세포부위 인식을 나타낸 사진이다.
도 5 내지 도 8을 참고하면, 세포추적장비는 세포를 실시간으로 촬여하는 카메라와 상기 카메라로부터 전송된 이미지를 분석하는 영상분석부를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 카메라는 세포의 상단에 위치하여 세포를 실시간으로 촬영하게 되며, 실시간세포추적시스템 4일동안 촬영한 세포(도5 참조)는 카메라에 의해 총 704장의 세포 이미지가 촬영되었다. 이 중 39~42장 사진 간격으로 한 개씩 선별하여 train은 17개 사진으로 구성하고, 이 중 116~118장 사진 간격으로 한 개씩 선별하여 val은 6개 사진으로 구성하고, 이 중 77~79장 사진 간격으로 한 개씩 선별하여 test는 9개 사진으로 구성하여 분석하였다.
train, val, test 폴더 별로 안에 있는 사진들은 다른 폴더 사진과 서로 중복되지 않았다.
영상분석부를 통해 라벨링 천저리가 가능할 수 있다. 예를 들면, 세포 영상 이미지 라벨링 전처리는, VGG image annotation(VIA)이용할 수 있다. 세포를 인식하고자 하는 부위가 자신이 레이블한대로, 또 레이블해준 이름대로 Polygon labels밑에 등록 및 polygons로 가장자리를 따서 여러가지 label명으로 등록하고 코드에서 학습시키고 test데이터 나올 때 레이블(클래스명)이 한 개밖에 없으한 해당 클래스명이 결과사진 위로 뜨질 않아서 의미없는 부위의 아무 클래스명이나 추가후 클래스명 추가하여 어노테이션 할 수 있다. 또한, Mask-RCNN을 통한 세포 변화 알고리즘 개발하고, MACK RCNN Import 및 세포이미지 설정할 수 있다.
도 9는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제1 예시를 나타낸 사진이다.
도 9를 참고하면, Mask-RCNN은 인간의 뇌 신경생리학에서 영감을 얻어 고안된 인공신경망은 최근 이미지 처리에서 매우 높은 정확도를 보이고 있다. 다양한 인공신경망 방법들 중 ①합성곱 신경망(Convolution neural network)을 이미지처리에 특화되도록 고안한 기법인 U-net Neural network. ②입력층과 출력층 사이에 하나 이상의 중간층이 존재하는 신경망인 MLP neural network. ③단일 저해상도(LR) 입력 이미지로부터 원본 고해상도(HR) 이미지의 세부정보까지 픽셀 정보를 복구하는 기술인 단일 이미지 SuperResulution. ④각 픽셀을 객체인지 아닌지를 masking하는 CNN기술을 추가 고안된 알고리즘인 Mask-RCNN 방법들을 시도할 수 있다. 세포 영상의 경우 객체안에서의 객체를 인식해야 하는 부분으로 Mask-RCNN을 활용하여 알고리즘을 구축함. Mask-RCNN은 backbone으로 ResNet-101을 사용하는데 ResNet 네트워크에서는 이미지 input size가 800~1024일때 성능이 좋다고 함. bilinear interpolation을 사용하여 resize해주며, bilinear interpolation은 여러 interpolation기법 중 하나로 동작 과정은 2 x 2의 이미지를 4 x 4로 Upsampling을 한다면 2 x 2에 있던 pixel value가 각각 P1, P2, P3, P4로 대응되며 총 16개 중 4개의 pixel만 값이 대응되고 나머지 12개는 값이 아직 채워지지 않았는데, 이를 bilinear interpolation으로 값을 채워주는 방식으로 고안될 수 있다. CNN의 추가적인 구조로 1)Fast R-CNN의 classification, localization (bounding box regression) branch에 새롭게 mask branch. 2)RPN 전에 FPN (feature pyramid network). 3)Image segmentation의 masking을 위해 RoI align이 RoI pooling을 대신하여 구성될 수 있다.
도 10은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제2 예시를 나타낸 사진이다.
도 10을 참고하면, 유전체 결과물과 부작용 데이터 세트를 통합하여 만든 독성평가 알고리즘은 Extra tree classifier일 수 있다. 예를 들면, multi-label classification 문제를 해결하기 위한 다양한 머신러닝 알고리즘을 탐색할 수 있다데이터를 알고리즘에 맞게 변형시키는 방법(Problem Transformation Method)과 알고리즘을 데이터에 맞게 바꾸는 방법(Algorithm Adaption Method) 두 가지가 있었고 각각에 속하는 다양한 알고리즘을 시도해볼 수 있었다. Problem Transformation Method 중에는 대표적인 3가지가 있다. ①각 라벨마다 분류기를 학습시켜 해당 분류에 속하는지 속하지 않는지 예측하는 방법인 Binary Relevance. ②각각 라벨에 대해 학습기를 생성하는 것은 같지만, Chain rule과 같이 이전 분류기 예측 값을 다음 분류기 학습에 변수로 사용하는 Chain Classifier. ③각각의 라벨 조합을 하나의 분류로 여기는 방법인 Label Powerset. Algorithm Adaption Method 중에서는 트리기반의 모델인 ①Random-Forest, ②Decision-Tree, ③Extra-Trees를 사용하였다. Problem Transformation Method 세가지와 Algorithm Adaption Method 세가지를 다양한 방법과 조합으로 시도 후 가장 성능이 높았던 모델 Extra tree classifier을 골라 약물 처리된 세포의 RNA-seq 결과를 바탕으로 독성평가 알고리즘을 구축할 수 있었다. 이 모델을 통해 나온 ADR결과를 활용하여 신약 스크리닝과 신약이 유발할 수 있는 ADR을 미리 예측해 볼 수 있다.
도 11은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제3 예시를 나타낸 사진이다.
도 11은, 약물 처리된 세포의 RNA-seq 결과를 바탕으로 유사약물예측 알고리즘은 AutoKeras일 수 있다. 예를 들면, 기존의 기계 학습 모델 개발은 리소스를 많이 사용하므로 수십 개의 모델을 생성하고 비교하는 데 상당한 도메인 지식과 시간이 필요할 수 있다. 자동화된 Machine Learning을 사용하면 프로덕션 준비 ML 모델을 매우 쉽고 효율적으로 얻는 데 걸리는 시간을 단축할 수 있다. 그 중 AutoKeras는 RNN 컨트롤러와 Convolutional Cells을 통한 강화학습을 통해 구조를 찾는 NASNet를 기반으로 한다. 일반적인 NASNet은 단일 GPU로는 상당한 시간이 걸리지만 AutoKeras는 이를 효율적으로 구현한 AutoML 방법론이다. 이를 사용해 약물 처리된 세포의 RNA-seq 결과를 바탕으로 유사 약물 예측 알고리즘을 구축하였다. 이 모델을 통해 나온 약물의 유사도를 활용하여 drug repurposing과 바이오시밀러 효용성 평가에 사용 가능할 수 있다.
도 12는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제4 예시를 나타낸 사진이다.
도 12를 참고하면, CTC를 활용할 수 있는 항암제 선별 파이프 라인 구축에 대한 예를 나타낸다. CTC는 정상 세포가 없기 때문에 tumor only mode로 somatic variant calling을 해야 한다. unpaired tissue samples에서 somatic variant calling이 가능한 tool들 중에서 GATK3의 Mutect2, GATK4의 Mutect2, SomVarIUS를 시도할 수 있다. 그 중 가장 sensitivity가 높게 나왔던 GATK4이 Mutect2를 선택하여 파이프라인을 구축할 수 있다. GATK4의 Mutect2는 local assembly of haplotypes를 사용하여 somatic SNVs 와 indels를 calling하는 tool이므로 Tumor DNA-seq 데이터로부터 somatic variant를 찾을 때, matched normal이 없을 경우 MuTect2의 tumor only mode를 이용하여 SNV (Single nucleotide varint) 와 small indel을 발굴하여 VCF 형태의 파일을 생성할 수 있다.
도 13은 도 1에 따라 제작된 오간온어칩에서 시간의 흐름에 따른 세포 이동을 나타낸 사진이다.
오간온어칩(11)을 마이크로인큐베이터(10)에서 배양하면서 오간온어칩(11)에서의 세포 이동을 일정 시간 동안 관찰할 수 있다.
도 13을 참고하면, 마이크로인큐베이터(10) 내에 오간온어칩(11)을 삽입하고 3 시간까지의 세포 이동을 관찰할 수 있었다. 삽입 직 후, 채널에 위치한 세포의 수가 104개였으나, 3 시간 후 세포의 수가 121개로 증가하였다. 이는 세포의 위치로 보아 유인제가 주입된 방향으로 세포가 이동한 것으로 판단된다. 이와 같이 제작된 세포 오간온어칩(11)을 육안으로 관찰하고 세포 로딩 후, 시간의 변화에 따라서 세포의 이동 한 개체 수를 확인할 수 있다.
또한 마이크로인큐베이터(10)에서 세포를 성장시키면서도 세포 이동을 육안으로 관찰할 수 있다. 세포는 항상 음극임을 감안하여 세포 표면을 일부 양이온 종류로 코팅하여 향상시킬 수 있다. 추가로 세포의 크기에 근거하여 세포를 고정할 수 있으며 세포의 피막화에 하이드로겔 등 막공성 폴리머 들이 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통해 오간온어칩(11)으로 제작된 세포 이동 관찰 방법 대해 더 상세하게 기술한다.
실시예 1
칩을 제작하고 멸균하여 준비한다. 피브로넥틴(fibronectin)을 5μg/cm2 30분에 걸쳐 코팅한다. 105개/ml의 cell을 로딩하고 overnight으로 cell을 부착시킨다. 양쪽 well에 각각 media와 attractant를 동시에 각 80 ul씩 multichannel pipette을 사용하여 주입한다. 주입이 끝나면, 온도와 CO2 농도 및 제어가 가능한 마이크로 인큐베이터에 오간온어칩을 삽입한다. 24시간동안 마이크로인큐베이터에서 동영상을 촬영하며 세포 이동을 관찰한다.
본 발명에 따른 실시예 1의 결과에 따르면, Matrigel에서의 이동성이 Huvec cell에 비해 활발하지 않지만 attractant 쪽으로의 이동을 보였다. 또한 TNF-α 주입 시, 주입 반대 방향으로 cell이 이동함을 보이는 듯하고, 뭉쳐 있던 세포가 흩어지며 죽는 세포가 종종 발견되었다.
이와 같이 마이크로인큐베이터(10)에서 세포 배양을 진행하면서도 세포 이동을 관찰할 수 있다는 것을 확인하였다.
도 14는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 관찰한 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 14를 참고하면, 로딩된 세포가 시간이 지남에 따라서 이동이 된 흔적을 관찰할 수 있다.
이하 실시예를 통해 세포 이동 관찰 방법 대해 더 상세하게 기술한다.
실시예 2
PDMS 몰드에 두 개의 구멍인 챔버를 만들어 세포가 배양될 수 있는 공간과 배양액을 보관하는 공간을 확보한 뒤, 슬라이드 글라스를 접합하여 오간온어칩을 제작하였다. 두 개의 챔버에 세포 배양액을 채우고 기포가 없음을 확인한 후, 한쪽 챔버에만 세포를 파종하여 마이크로인큐베이터에서 배양하였다.
본 발명에 따른 실시예 2의 결과에 따르면 마이크로인큐베이터(10)에서 배양을 시작한 후, 파종된 세포는 넓은 공간이 확보된 챔버에 머물러 있다가 개체수가 많아 짐에 따라 점차 배양 챔버의 영양분이 감소하게 되고, CO2 또한 증가하는 반면 세포가 파종되지 않은 다른 챔버의 배양액은 상대적으로 세포가 배양되기 좋은 조건을 유지하게 되며, 세포는 상대적으로 배양 조건이 양호한 반대편 챔버로 이동하게 된다.
이와 같이, 세포의 이동은 마이크로인큐베이터(10)에서 배양을 하는 동시에 실시간세포추적시스템에서 실시간 세포추적장비(30)를 통해서도 관찰이 가능하다.
실시예 1 내지 2와 같이 본 발명의 실시간 세포추적방법에는 시간 별 세포 변화 이미지 정보를 확보하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통해 실시간세포추적시스템에서 세포추적장비(30)를 통해 세포 이미지를 분석 방법 대해 더 상세하게 기술한다.
실시예 3
Glass에 가공된 PDMS 칩을 부착한다. 관찰 대상 cell을 칩에 로딩 한 후, 24시간을 마이크로 인큐베이터에서 배양한다. IC50의 drug를 주입하고 실시간 세포 추적 장비에서 세포를 측정하고 관찰한다.
본 발명에 따른 실시예 3의 결과로, 도 4를 참고할 수 있다.
도 15는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 이미지의 분석을 나타낸 사진이다.
도 15를 참고하면, 0.8μM Daunorubicin의 경우 사멸되는 세포가 24시간후 약 50%를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
Daunorubicin은 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 주요 항생물질로 사용되는 물질이다. 안트라사이클린계 항종양제로 불리는 계열에 속하는 항암제인데, 항암제는 세포분열을 멈추게 하는 작용을 하기 때문에 해당 약물을 주입함으로써 암세포의 사멸을 관찰할 수 있다.
또한 Doxorubicin의 경우에도 암치료에 사용되는 약물로써, 50μM Doxorubicin를 주입하여 세포추적장비(30)를 이용하여 관찰하였을 때, 거의 12시간 이전에 50% 이상이 사멸함을 보여주는 것을 확인할 수 있었다.
실시간 세포추적장비(30)를 통해 얻어진 데이터를 기반으로 세포 특성을 분석하는 분석부(40)에서는, SNP 분석 알고리즘, GSA(Gene Set Analysis)알고리즘, Somatic mutation Calling algorithm으로 이루어진 군 중 하나 이상의 방법으로 분석될 수 있다.
SNP는 개인 간의 염기 배열 상에 발생하는 차이로 DNA 사슬의 특정 부위에 서로 다른 염기를 가지고 있는 경우를 말한다. 지금까지 개발되고 이용중인 대부분의 방법은 PCR 방법에 기초하여 여러 시료에 대한 한정된 수의 SNP 분석이 주를 이루고 있으나 DNA array를 이용하여 한 시료에 대한 여러 SMP를 동시에 분석할 수 있는 방법도 개발되고 있다. PCR을 기초로 한 주요 SNP 분석방법은, SSCP(Single Stand Conformation Polymorphism), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism), RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs), AS-PCR(Allele-Specific PCR), GC-tail primer를 이용한 Tm-shift genotyping, DASH(Dynamic Allele-Specific Hybridization)이 있다.
GSA 알고리즘인 유전자 집단 분석은 생물학적 경로나 염색체 위치가 같은 유전자 집단을 분석하여 질병의 발생에 유의한 집단을 찾아내는 분석방법으로, 수 만개의 유전자를 공통기능을 가진 몇 개의 집단으로 묶어 줌으로써 검정 대상 수를 줄여 다중 검정이 용이하다는 장점이 있다.
Somatic mutation calling algorithm은 MuTect와 Strelka, VarScan2와 같은
3가지 소프트웨어를 이용하여 확인할 수 있다. 일반적으로 인간의 질병을 일으키는 genetic mutation에는 germline mutation과 somatic mutation이 있는데, 특히 somatic mutation은 암에서 유전자 기능을 바꿀 수 있는 중요하고 공통적인 메커니즘으로 이 돌연변이의 정보를 확인하는 것은 cancer genome을 이해하는데 있어 매우 중요한 단계이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적방법의 순서도이다.
도 16을 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적방법은, 인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 단계(S10), 오간온어칩을 마이크로 인큐베이터에서 배양하는 단계(S20), 실시간 세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 단계(S30)를 포함할 수 있다.
인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 단계(S10)에서 다양한 장기의 인체조직유래세포를 통해 제작할 수 있다. 여러 종류의 인체조직유래세포를 동시에 배양하면서 배지의 영양성분이 각 세포에 분배되는 정도나, 세포들 사이에서의 이동 및 반응의 정도를 알아보기 위해 약물동력학(Pharmacokinetic, PK) 모델링을 이용할 수 있다.
약물동력학 모델링은 동물 또는 인체에서 약물이 투여된 후 흡수, 대사 반응을 거쳐 몸에서 제거되기까지의 과정을 수학적으로 모사하기 위한 모델링 기법이다. 약물동력학 모델링 기법을 적절히 변형시켜 오간온어칩에 적용하면 오간온어칩에 약물이 투여된 후에 어떻게 반응하고 제거되는지 해석하고 예측이 가능하다.
오간온어칩을 마이크로인큐베이터에서 배양하는 단계(S20)에서 세포의 추적 및 이동, 관찰을 명확하게 실시간으로 관찰하기 위해서 바이오센서를 이용할 수 있다. 예를 들면, FET(Field Effect Transistor), 나노입자, MEM(Micro Electro Mechanical)를 바이오센서의 기반으로 삼아 이용할 수 있으며 항체 또는 효소의 화학적 반응을 이용하여 감지하는 방식으로 이루어질 수 있다.
실시간 세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 단계(S30)에서는 세포추적장비를 통해 얻어진 데이터를 기반으로 하여 약물효율성 및 세포독성을 분석할 수 있다. 예를 들면, 배양된 인체조직유래세포에 항암제나 개발한 신약 등을 주입하고 일정시간 동안 세포를 관찰하며 세포의 사멸이나 이동을 통해 해당 항암제나 개발 신약의 효과에 대해서 예측할 수 있다.
또한 세포독성을 분석하기 위해 WST-1 assay, MTT assay, CCK-8 assay와 neutral dye 방법을 사용하여 세포독성을 평가할 수 있다.
본 발명의 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법에 의하면, 인체조직유래세포를 기반으로 세포의 이동을 관찰하고 분석하는 기술을 제공한다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.
Claims (8)
- 인체조직유래세포를 통해 질병을 예측하는 실시간세포추적시스템에 있어서,
상기 실시간세포추적시스템은,
인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩;
상기 오간온어칩이 내부에 안착되며, 상기 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 상기 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터;
상기 마이크로인큐베이터에 연결되며, 상기 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비; 및
상기 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부를 포함하는 실시간세포추적시스템.
- 제1 항에 있어서,
상기 분석부는,
상기 인체조직유래세포의 분석결과를 바탕으로 유사약물을 예측하는 예측부를 더 포함하는 실시간세포추적시스템.
- 제2 항에 있어서,
상기 분석부는,
상기 분석결과에 따른 유전체 결과물과 공공데이터로부터 전송받는 부작용 데이터세트를 통합하여 독성평가를 하는 독성평가부를 더 포함하는 실시간세포추적시스템.
- 제3 항에 있어서,
상기 분석부는,
상기 인체조직유래세포에 대해 액체생체검사 진행을 위한 알고리즘을 포함하는 실시간세포추적시스템.
- 제1 항에 있어서,
상기 세포추적장비는,
실시간으로 상기 인체조직유래세포의 변화를 기록하는 카메라; 및
상기 카메라로부터 전송된 영상을 상기 인체조직유래세포의 이동 및 면적 변화에 대한 이미지정보를 라벨링 전처리를 하는 영상분석부를 포함하는 실시간세포추적시스템.
- 제1 항에 있어서,
상기 인체조직유래세포는,
혈액 유래, 켈로이드 조직 유래, 지방 조직 유래, 뇌 조직 유래, 장 조직 유래세포로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하여 진행할 수 있는 실시간세포추적시스템.
- 제1 항에 있어서,
상기 분석부는,
AutoKeras, Extra tree classifier, Mask-RCNN으로 이루어진 군 중 하나 이상의 방법을 이용할 수 있는 실시간세포추적시스템.
- 인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 제1 단계;
상기 제1 단계를 기반으로 제작된 오간온어칩을 마이크로인큐베이터에서 배양하는 제2 단계; 및
상기 제2 단계를 기반으로 배양된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 제3 단계를 포함하는 실시간세포추적방법.
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