WO2023113083A1 - 생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법 - Google Patents

생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법 Download PDF

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WO2023113083A1
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real
cell tracking
organ
chip
derived cells
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안광성
권도혜
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주식회사 피디젠
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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics

Definitions

  • the present invention relates to a real-time cell tracking system using a biomimetic organ-on-a-chip and a method for implementing the same.
  • Tracking and analysis of cellular activity plays an important role in understanding complex biological processes such as tumor metastasis, viral invasion, wound repair, and cell division. From the cell video obtained through a microscope capable of time-lapse photography, tasks such as investigating the correlation of cells in the front and back frames, recognizing new cells, and confirming cell division should be performed.
  • the cell region segmentation and tracking technology in the cell video obtained through a microscope capable of time-lapse photography is a key technology for simple analysis of cell activity, it is necessary to develop a simpler real-time cell tracking system and a method for implementing the same.
  • the present invention is to provide a real-time cell tracking system using a biomimetic organ-on-a-chip and a method for implementing the same.
  • the real-time cell tracking system is produced by collecting human tissue-derived cells
  • the organ-on-a-chip and organ-on-a-chip are placed inside, and the temperature, humidity, and carbon concentration are continuously maintained on the organ-on-a-chip, and it is connected to a microincubator that cultivates human tissue-derived cells and a microincubator, which is connected to the human tissue-derived cells.
  • It may include a cell tracking device located at the top and an analysis unit that analyzes information input from the cell tracking device in real time.
  • the analysis unit may further include a prediction unit that predicts a similar drug based on the analysis result of the human tissue-derived cells.
  • it may further include a toxicity evaluation unit that evaluates toxicity by integrating the genome result according to the analysis result and the side effect data set transmitted from public data, and may include an algorithm for liquid biopsy on human tissue-derived cells.
  • the cell tracking device may include a camera that records changes in human tissue-derived cells in real time and an image analysis unit that pre-processes labeling image information about the movement and area change of human tissue-derived cells from the image transmitted from the camera.
  • Human tissue-derived cells may include at least one of the group consisting of blood-derived cells, keloid tissue-derived cells, adipose tissue-derived cells, brain tissue-derived cells, and intestinal tissue-derived cells.
  • the analysis unit may be analyzed using one or more methods from the group consisting of AutoKeras, Extra tree classifier, and Mask-RCNN.
  • a third step of analyzing cell characteristics through a tracking device may be included.
  • the present invention is to provide a cell tracking method using a biomimetic organ-on-a-chip.
  • FIG. 1 is a block diagram of a real-time cell tracking system according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph showing an example of similar drug prediction of the analysis unit shown in FIG. 1 .
  • Figure 3 is a photograph showing the toxicity evaluation algorithm of the analysis unit shown in Figure 1.
  • FIG. 4 is a photograph showing a liquid biopsy algorithm of the analysis unit shown in FIG. 1 .
  • Figure 5 is a photograph showing the cells measured with the cell tracking equipment shown in Figure 1.
  • FIG. 6 is a photograph of cells shown in FIG. 5 after labeling pretreatment.
  • FIG. 7 is a photograph confirming area values for the cells shown in FIG. 5 .
  • FIG. 8 is a photograph showing labeling and cell site recognition according to cell types for the cells shown in FIG. 5 .
  • FIG. 9 is a photograph showing a first example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • FIG. 10 is a photograph showing a second example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • FIG. 11 is a photograph showing a third example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • FIG. 12 is a photograph showing a fourth example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • FIG. 13 is a photograph showing cell migration over time in the organ-on-a-chip fabricated according to FIG. 1 .
  • FIG. 14 is a photograph showing cell migration of the organ-on-a-chip fabricated according to FIG. 1 through real-time cell tracking equipment.
  • FIG. 15 is a photograph showing analysis of cell images of the organ-on-a-chip fabricated according to FIG. 1 through real-time cell tracking equipment.
  • 16 is a flowchart of a real-time cell tracking method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a block diagram of a real-time cell tracking system according to an embodiment of the present invention.
  • an organ on a chip 11 manufactured by collecting human tissue-derived cells an organ on a chip is placed inside, and the organ on a chip has a temperature
  • a microincubator (10) that continuously maintains humidity and carbon concentration and cultivates human tissue-derived cells a cell tracking device (20) connected to the microincubator and located on top of the human tissue-derived cells, and information input from the cell tracking device It may include an analysis unit 30 that analyzes in real time.
  • the organ-on-a-chip 11 manufactured by collecting human tissue-derived cells may be manufactured using polydimethylsiloxane (PDMS), which is an optically transparent and highly durable polymer, and slide glass.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PDMS is a soft, stretchable material and transparent, it is easy to observe under a microscope, and it is easy to culture cells because it transmits oxygen and carbon dioxide well.
  • PDMS is used as a mold, and an etching process of soft lithography or a process of manufacturing a pattern by photopolymerization lithography may be used.
  • the flexible lithography method is a transfer method that uses a flexible organic material to create a pattern or structure without using a complicated device used in conventional photolithography.
  • PDMS-based flexible lithography etching process it is relatively inexpensive, easy to manufacture molds, and can make devices that are easily bonded to surfaces of other materials by changing a hydrophobic surface into a hydrophilic one. easy to
  • Flexible lithography is a method of transferring a pattern to a desired substrate using a polymer coating, and can be largely divided into printing and molding depending on the method.
  • Representative flexible lithography methods include microcontact printing ( ⁇ CP) and decal transfer microtransfer Printing methods such as microlithography (DTM), light stamp, replica molding, capillary force lithography, micromolding in capillaries (MIMIC), and microtransfer molding , ⁇ TM), nanoimprinting, and liquid-bridge-mediated nanotransfer molding (LB-nTM).
  • devices made through PDMS-based photopolymerization lithography have high resolution and good biocompatibility, so they are preferred over three-dimensional lithography (3D printing) and can be used to manufacture organ-on-a-chip 11.
  • 3D printing three-dimensional lithography
  • the organ-on-a-chip 11 can be manufactured using PDMS in this way, the pattern manufacturing process technology is not particularly limited thereto.
  • Organ-on-a-chip Human tissue-derived cells used in the organ-on-a-chip (11) manufactured by collecting human tissue-derived cells can be sampled from various organs such as blood, keloid, fat, brain, intestine, liver, lung, and spleen tissue, Organ-on-a-chip can be fabricated using one or more multi-organ tissues. For example, an organ-on-a-chip that connects stomach-intestine-liver tissue can be fabricated. Organ-on-a-chip is fabricated by adding chambers corresponding to different organs, and metabolites between the stomach and intestine are transferred to other tissues. effects can be studied.
  • tissue cells from multiple organs are simultaneously cultured in one organ-on-a-chip 11 and changes in indicators related to metabolism are measured, the similarity with the human body can be increased, thereby increasing the reliability of research.
  • the human tissue-derived cells are composed of cells constituting an organ to be copied, have a specific structure of an organ, or reproduce a specific function of an organ, they are not particularly limited to the tissue cells of the listed organs.
  • intestinal tissue-derived cells can be generated through self-organization of cells generated by proliferation and differentiation of intestinal stem cells, and include intestinal epithelial cells (Enterocytes), goblet cells (Goblet cells), intestinal It is composed of cells constituting the intestinal epithelium, such as enteroendocrine cells and intestinal stem cells, and mimics the histological characteristics of villi and follicles.
  • intestinal epithelium such as enteroendocrine cells and intestinal stem cells
  • functional characteristics of the intestine such as nutrient absorption and water exchange, can also be reproduced.
  • the organ-on-a-chip 11 is seated inside, and the microincubator 10, which helps to cultivate the organ-on-a-chip 11, includes a function to continuously maintain the temperature, humidity, and carbon concentration required for cell culture, , a three-dimensional cell culture process can be used.
  • 3D cell culture refers to an artificially created growth environment in which cells can interact with or grow in a 3D environment. Unlike the two-dimensional environment, cell growth in the three-dimensional environment allows cells to grow in all directions in vitro, which is more similar to the cell environment in vivo.
  • 3D cell culture is usually done in bioreactors or small capsules capable of growing cells into spheroids, and approximately 300 spheroids can be cultured per bioreactor.
  • Cell-to-cell contact occurs three-dimensionally, and as the resultant interaction and cell secretion diffuse, signal transduction occurs, and the drug can enter the cell due to diffusion and permeation by transport proteins present in the cell membrane.
  • the cell culture model used while culturing the organ-on-a-chip 11 in the microincubator 10 can be used without particular limitation to the scaffold method and the scaffold-free method.
  • the scaffold-free method allows cells to grow together without an extracellular matrix, and the scaffold method cultivates cells in the space of an extracellular matrix in three dimensions.
  • static suspension culture which is an anti-adhesion method that prevents cell adhesion by coating the bottom or flowing the culture medium
  • spinner/rotational chamber culture nano pattern culture
  • magnetic levitation culture One or more culture methods from the group consisting of may be used.
  • the static suspension method is the most common cell culture model. It is a three-dimensional cell culture model in which cells are floated and grown together with agar or anti-adhesion coating to prevent cell attachment to the bottom of a dish or well.
  • the spinner/rotation chamber method is a three-dimensional cell culture model in which cells cannot attach to the bottom by constantly moving cells using a spinner or rotational chamber, so they float on the culture medium and grow together. It is a 3D cell culture model that does not attach to the bottom of the well but floats and grows in the form of a lump.
  • the magnetic levitation method is a three-dimensional cell culture model that uses magnetic particles to float cells from the bottom of a well to grow cells in the form of a lump.
  • cells are gathered by the force of gravity to form single spheroids, which can be divided into hang in drop culture, U or V shape well culture, etc.
  • the scaffold method can also be used as a method for culturing organ-on-a-chip (11).
  • the scaffold method is divided into various ways according to the method of using artificial polymer solid-scaffold or hydrogel as the extracellular matrix, and structurally divided into the method of forming the extracellular matrix into wells, microchannels, and micropillars.
  • FIG. 2 is a photograph showing an example of similar drug prediction of the analysis unit shown in FIG. 1 .
  • an ADR to be interested in can be selected in advance.
  • CLUE offers a similar service.
  • Figure 3 is a photograph showing the toxicity evaluation algorithm of the analysis unit shown in Figure 1.
  • the analysis unit may include an algorithm capable of evaluating toxicity.
  • gene expression data and siders of CLUE's drugs, FDA Adeverse Event Reporting System, drug.com, etc. are used to integrate genomic results and side effect datasets.
  • the y value becomes multi label classification because the number of side effects is 301.
  • two methods can be used: a method of transforming data to fit an algorithm (Problem Transformation Method) and a method of changing an algorithm to fit data (Algorithm Adaption Method).
  • Problem Transformation Method a method of transforming data to fit an algorithm
  • Algorithm Adaption Method Algorithm Adaption Method
  • Figure 4 is a photograph showing the liquid biopsy algorithm of the analysis unit shown in Figure 1
  • the analysis unit may include an algorithm capable of performing a liquid biopsy.
  • CTC circulating tumor cells
  • cfDNA cell-free DNA
  • a CTC separation platform was selected by comparing the performance of circulating tumor cell (CTC) between the previously approved CTC capture platform of CellsearchTM and an inhouse customized platform.
  • CTC circulating tumor cell
  • cfDNA Cell-free DNA
  • Figure 5 is a photograph showing the cells measured with the cell tracking equipment shown in Figure 1
  • Figure 6 is a photograph of pre-labeling treatment for the cells shown in Figure 5
  • the cell tracking device may further include a camera for capturing cells in real time and an image analysis unit for analyzing images transmitted from the camera.
  • a camera is positioned on top of the cell to photograph the cell in real time, and a total of 704 cell images were captured by the camera for 4 days (see FIG. 5) of the real-time cell tracking system.
  • train is composed of 17 photos by selecting one at intervals of 39 to 42 photos, and among them, one by one is selected at intervals of 116 to 118 photos, and val is composed of 6 photos, of which 77 to 79 photos By selecting one at a photo interval, the test was composed of 9 photos and analyzed.
  • VGG image annotation may be used for cell image labeling preprocessing.
  • the area to recognize the cell is registered under Polygon labels as it is labeled or as the name given to the label, and it is registered with various label names by picking the edges with polygons, learning it in the code, and when the test data comes out, only one label (class name) is found. If there is no relevant class name, it does not appear on the result picture, so you can add any class name in meaningless parts and then add the class name to annotate.
  • cell change algorithm can be developed through Mask-RCNN, and MACK RCNN Import and cell image can be set.
  • FIG. 9 is a photograph showing a first example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • Mask-RCNN an artificial neural network designed with inspiration from the neurophysiology of the human brain, shows very high accuracy in recent image processing.
  • 1U-net Neural network which is a technique designed to specialize in convolution neural network for image processing.
  • 2 MLP neural network which is a neural network with one or more intermediate layers between the input layer and the output layer.
  • 3 Single Image SuperResulution a technique that recovers pixel information from a single low-resolution (LR) input image to the details of the original high-resolution (HR) image. 4
  • You can try the Mask-RCNN method which is an algorithm devised by adding CNN technology that masks each pixel as an object or not.
  • Mask-RCNN In the case of cell images, an algorithm is built using Mask-RCNN as a part that needs to recognize an object within an object.
  • Mask-RCNN uses ResNet-101 as a backbone, and it is said that the performance is good when the image input size is 800 to 1024 in the ResNet network. It resizes using bilinear interpolation, and bilinear interpolation is one of several interpolation techniques.
  • FIG. 10 is a photograph showing a second example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • the toxicity evaluation algorithm created by integrating the genome result and the side effect data set may be an extra tree classifier.
  • Problem Transformation Methods there are three representative ones.
  • 1 Binary Relevance which is a method of predicting whether a classifier belongs to a category by training a classifier for each label.
  • 2 A chain classifier that creates a learner for each label, but uses the predicted value of the previous classifier as a variable for learning the next classifier, like the chain rule.
  • 3 Label Powerset which is a method of considering each label combination as one classification.
  • FIG. 11 is a photograph showing a third example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • the similar drug prediction algorithm may be AutoKeras.
  • traditional machine learning model development is resource intensive, which can require significant domain knowledge and time to create and compare dozens of models.
  • Automated Machine Learning makes it very easy and efficient to reduce the time it takes to obtain production-ready ML models.
  • AutoKeras is based on NASNet, which finds structures through reinforcement learning through RNN controllers and convolutional cells. Normal NASNet takes a lot of time with a single GPU, but AutoKeras is an AutoML methodology that efficiently implements it.
  • a similar drug prediction algorithm was built based on the RNA-seq results of drug-treated cells. Utilizing the similarity of drugs derived from this model, it can be used for drug repurposing and biosimilar efficacy evaluation.
  • FIG. 12 is a photograph showing a fourth example of an algorithm applied to the cell tracking device shown in FIG. 5 .
  • an example of constructing an anti-cancer drug screening pipeline capable of utilizing CTCs is shown. Since CTCs do not have normal cells, somatic variant calling must be performed in a tumor only mode. Among tools capable of somatic variant calling in unpaired tissue samples, you can try GATK3's Mutect2, GATK4's Mutect2, and SomVarIUS. Among them, GATK4, which showed the highest sensitivity, can build a pipeline by selecting Mutect2.
  • Mutect2 of GATK4 is a tool that calls somatic SNVs and indels using local assembly of haplotypes, so when searching for somatic variants from tumor DNA-seq data, if there is no matched normal, use MuTect2's tumor only mode to call SNVs (Single nucleotide varint ) and small indels to create VCF-type files.
  • FIG. 13 is a photograph showing cell migration over time in the organ-on-a-chip fabricated according to FIG. 1 .
  • the organ on a chip 11 was inserted into the microincubator 10 and cell migration was observed for up to 3 hours. Immediately after insertion, the number of cells located in the channel was 104, but after 3 hours, the number of cells increased to 121. Judging from the location of the cells, it is determined that the cells migrated in the direction in which the attractant was injected. The thus-manufactured cell organ-on-a-chip 11 can be observed with the naked eye, and after loading the cells, the number of moving cells can be confirmed according to the change in time.
  • cell migration can be observed with the naked eye while growing cells in the microincubator 10 . Given that cells are always negative, this can be enhanced by coating the cell surface with some kind of cationic type.
  • cells can be immobilized based on their size, and membrane porous polymers such as hydrogels can be used to encapsulate cells.
  • the chip is fabricated and prepared by sterilization. Fibronectin (fibronectin) is coated over 5 ⁇ g/cm 2 30 minutes. 10 5 cells/ml of cells are loaded and the cells are attached overnight. Inject media and attractant into both wells at the same time using a multichannel pipette of 80 ⁇ l each. After the injection, the organ-on-a-chip is inserted into a micro-incubator where temperature and CO 2 concentration can be controlled. Cell migration was observed while filming videos in the microincubator for 24 hours.
  • Fibronectin fibronectin
  • Example 1 the mobility in Matrigel was not as active as in the Huvec cell, but it showed a movement towards the attractant.
  • TNF- ⁇ when TNF- ⁇ was injected, cells seemed to migrate in the opposite direction of injection, and cells that were clumped together were scattered and dying cells were often found.
  • FIG. 14 is a photograph showing cell migration of the organ-on-a-chip fabricated according to FIG. 1 through real-time cell tracking equipment.
  • An organ-on-a-chip was fabricated by attaching slide glass after securing a space for culturing cells and a space for storing a culture medium by making two hole chambers in a PDMS mold. After filling the two chambers with the cell culture medium and confirming that there are no air bubbles, the cells were seeded in only one chamber and cultured in a microincubator.
  • Example 2 After starting the culture in the microincubator 10, the seeded cells stay in a chamber with a wide space, and as the population increases, the nutrients in the culture chamber gradually decrease. While CO 2 also increases, the culture medium in the other chamber where the cells are not seeded maintains relatively good conditions for culturing the cells, and the cells move to the opposite chamber where the culture conditions are relatively good.
  • the movement of the cells can be observed through the real-time cell tracking equipment 30 in the real-time cell tracking system while culturing in the microincubator 10 .
  • the real-time cell tracking method of the present invention may further include obtaining cell change image information by time.
  • Example 3 As a result of Example 3 according to the present invention, reference can be made to FIG. 4 .
  • FIG. 15 is a photograph showing analysis of cell images of the organ-on-a-chip fabricated according to FIG. 1 through real-time cell tracking equipment.
  • Daunorubicin is a substance used as a major antibiotic for the treatment of acute lymphocytic leukemia and acute myeloid leukemia. It is an anticancer drug belonging to a class called anthracycline antitumor drugs. Since anticancer drugs act to stop cell division, the death of cancer cells can be observed by injecting the drug.
  • Doxorubicin as a drug used for cancer treatment, when 50 ⁇ M Doxorubicin was injected and observed using the cell tracking device 30, it was confirmed that more than 50% of the cells died before almost 12 hours.
  • the analysis unit 40 that analyzes the cell characteristics based on the data obtained through the real-time cell tracking device 30, one or more methods from the group consisting of a SNP analysis algorithm, a GSA (Gene Set Analysis) algorithm, and a somatic mutation calling algorithm can be analyzed.
  • SNP refers to the case of having different bases in a specific region of the DNA chain as a difference that occurs in the nucleotide sequence between individuals. Most of the methods developed and used so far mainly analyze a limited number of SNPs for several samples based on the PCR method, but a method for simultaneously analyzing several SMPs for one sample using DNA arrays is also being developed. there is.
  • the main SNP analysis methods based on PCR are SSCP (Single Stand Conformation Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNAs), AS-PCR (Allele-Specific PCR), Tm-shift genotyping using GC-tail primers, and Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH).
  • SSCP Single Stand Conformation Polymorphism
  • AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
  • RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • RAPD Random Amplified Polymorphic DNAs
  • AS-PCR Allele-Specific PCR
  • Tm-shift genotyping using GC-tail primers and Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH).
  • DASH Dynamic Allele-Specific Hybridization
  • Gene group analysis is an analysis method that analyzes gene groups with the same biological pathway or chromosomal location to find groups significant to disease occurrence. By grouping tens of thousands of genes into several groups with common functions, the number of test subjects It has the advantage of facilitating multiple testing by reducing .
  • Somatic mutation calling algorithms such as MuTect, Strelka, and VarScan2
  • genetic mutations that cause human diseases include germline mutation and somatic mutation.
  • somatic mutation is an important and common mechanism that can change gene function in cancer. This is a very important step.
  • 16 is a flowchart of a real-time cell tracking method according to an embodiment of the present invention.
  • the real-time cell tracking method includes the steps of manufacturing human tissue-derived cells into organ-on-a-chip (S10), culturing organ-on-a-chip in a microincubator (S20), It may include analyzing cell characteristics through real-time cell tracking equipment (S30).
  • PK Pharmacokinetic
  • Pharmacokinetic modeling is a modeling technique for mathematically simulating a process from administration of a drug to an animal or human body to removal from the body through absorption and metabolism reactions. If the pharmacokinetic modeling technique is appropriately modified and applied to organ-on-a-chip, it is possible to interpret and predict how the drug reacts and is eliminated after administration to organ-on-a-chip.
  • a biosensor In the step of culturing the organ-on-a-chip in a microincubator (S20), a biosensor can be used to clearly observe the tracking, movement, and observation of cells in real time.
  • FET Field Effect Transistor
  • nanoparticles and MEM (Micro Electro Mechanical) can be used as the base of the biosensor, and it can be made in a way that detects using an antibody or chemical reaction of an enzyme.
  • drug efficacy and cytotoxicity can be analyzed based on the data obtained through the cell tracking equipment.
  • anticancer drugs or newly developed new drugs are injected into cultured human tissue-derived cells, the cells are observed for a certain period of time, and the effects of the anticancer drugs or newly developed drugs can be predicted through cell death or migration.
  • WST-1 assay WST-1 assay
  • MTT assay MTT assay
  • CCK-8 assay neutral dye method
  • a technique for observing and analyzing cell movement based on human tissue-derived cells is provided.

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법은, 인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩, 오간온어칩이 내부에 안착되며 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터, 마이크로인큐베이터에 연결되며 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비, 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부를 포함하는 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법에 관한 것이다. 상기 구성에 의한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법은 인체조직유래세포를 기반으로 세포의 이동을 관찰하고 분석하는 기술을 제공한다.

Description

생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법
본 발명은 생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법에 관한 것이다.
종양의 전이, 바이러스의 침입, 상처회복, 세포분열과 같은 복잡한 생물학적 과정을 이해하는데 있어 세포활동의 추적 및 분석은 중요한 역할을 한다. 저속 촬영이 가능한 현미경을 통해 얻어진 세포동영상으로부터 전후 프레임 내 세포들의 상관관계를 조사하고 새로운 세포의 인식 및 세포분열의 확인과 같은 작업들이 수행되어야 한다.
세포영상의 분석을 통해 바이오 연구 및 응용 분야와 관련된 중요한 정보를 얻을 수 있기 때문에 중요한 과정 중에 하나이다.
하지만, 기존의 세포영상 분석 및 비교작업은 대부분 전문가들의 수작업을 통해 이루어지고 있으며, 많은 시간과 노동력을 요구한다. 또한 영상 데이터베이스가 방대 해지며 세포영상 분석의 간편화는 연구의 효율화를 위해 필수적인 요소이다.
특히 저속촬영이 가능한 현미경을 통해 얻어진 세포동영상에서의 세포영역 분할 및 추적기술은 세포활동의 간편 분석을 위한 핵심적인 기술이기 때문에 보다 더 간편한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법의 개발이 필요하다.
상기와 같은 기술적 배경을 바탕으로 안출된 것으로, 본 발명은 생체모방 오간온어칩을 이용한 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법은, 인체조직유래세포를 통해 질병을 예측하는 실시간세포추적시스템에 있어서, 실시간세포추적시스템은, 인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩, 오간온어칩이 내부에 안착되며, 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터, 마이크로인큐베이터에 연결되며, 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비 및 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부를 포함할 수 있다.
분석부는 인체조직유래세포의 분석결과를 바탕으로 유사약물을 예측하는 예측부를 더 포함할 수 있다. 또한 분석결과에 따른 유전체 결과물과 공공데이터로부터 전송받는 부작용 데이터세트를 통합하여 독성평가를 하는 독성평가부를 더 포함할 수 있으며 인체조직유래세포에 대해 액체생체검사 진행을 위한 알고리즘을 포함할 수 있다.
세포추적장비는 실시간으로 인체조직유래세포의 변화를 기록하는 카메라 및 카메라로부터 전송된 영상을 인체조직유래세포의 이동 및 면적 변화에 대한 이미지정보를 라벨링 전처리를 하는 영상분석부를 포함할 수 있다.
인체조직유래세포는, 혈액 유래, 켈로이드 조직 유래, 지방 조직 유래, 뇌 조직 유래, 장 조직 유래세포로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하여 진행할 수 있다.
분석부는, AutoKeras, Extra tree classifier, Mask-RCNN으로 이루어진 군 중 하나 이상의 방법을 이용하여 분석될 수 있다.
인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 제1 단계, 제1 단계를 기반으로 제작된 오간온어칩을 마이크로인큐베이터에서 배양하는 제2 단계, 제2 단계를 기반으로 배양된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 제3 단계를 포함할 수 있다.
상기와 같은 기술적 배경을 바탕으로 안출된 것으로, 본 발명은 생체모방 오간온어칩을 이용한 세포추적방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템의 블록도이다.
도 2는 도 1에 나타낸 분석부의 유사약물예측에 대한 예시를 나타낸 사진이다.
도 3은 도 1에 나타낸 분석부의 독성평가 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 4는 도 1에 나타낸 분석부의 액체생체검사 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 5는 도 1에 나타낸 세포추적장비로 측정한 세포를 나타낸 사진이다.
도 6은 도 5에 나타낸 세포에 대해 라벨링 전처리를 한 사진이다.
도 7은 도 5에 나타낸 세포에 대해 면적값을 확인한 사진이다.
도 8은 도 5에 나타낸 세포에 대해 세포 종류에 따른 라벨링 및 세포부위 인식을 나타낸 사진이다.
도 9는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제1 예시를 나타낸 사진이다.
도 10은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제2 예시를 나나타낸 사진이다.
도 11은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제3 예시를 나타낸 사진이다.
도 12는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제4 예시를 나타낸 사진이다.
도 13은 도 1에 따라 제작된 오간온어칩에서 시간의 흐름에 따른 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 14는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 관찰한 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 15는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 이미지의 분석을 나타낸 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적방법의 순서도이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참고부호를 붙였다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "위에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 위에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다. 반대로 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "아래에" 있다고 할 경우, 이는 다른 부분 "바로 아래에" 있는 경우뿐만 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템의 블록도이다.
도 1을 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적시스템은, 인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩(11), 오간온어칩이 내부에 안착되며 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터(10), 마이크로인큐베이터에 연결되며 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비(20), 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부(30)를 포함할 수 있다.
인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩(11)은 광학적으로 투명하며 내구성이 강한 중합체인 PDMS(Polydimethylsiloxane)와 슬라이드 글라스를 이용하여 제작될 수 있다.
PDMS는 부드럽고 신축성 있는 재질이면서 투명하기 때문에 현미경으로 관찰이 용이하고, 산소와 이산화탄소를 잘 투과시키기 때문에 세포를 배양하기에 용이하다.
PDMS를 몰드로 사용하며, 연성 리소그래피(Soft lithography)의 식각 공정이나 광중합 리소그래피로 패턴을 제작하는 공정을 이용할 수 있다.
연성 리소그래피 방법은 유연한 유기물질을 사용하여 기존의 포토 리소그래피에서 사용하는 복잡한 장치를 사용하지 않고 패턴이나 구조물을 만드는 전사법이다. PDMS 기반 연성 리소그래피의 식각 공정을 사용하면 상대적으로 저렴하고, 주형제작이 용이하며 소수성 표면을 친수성으로 바꾸어 다른 재질의 표면에 접합하기 쉬운 소자를 만들 수 있으며 나노 또는 마이크로 단위의 형상과 구조물을 제작하기에 용이하다.
연성 리소그래피는 고분자 도장을 이용하여 원하는 기판에 패턴을 전사하는 방식으로 방법에 따라 크게 프린팅과 몰딩으로 나눌 수 있는데, 대표적인 연성 리소그래피 방법으로는 미세접촉프린팅(μCP), decal transfer 미세전사법(decal transfer microlithography, DTM), 광 스탬프(light stamp)등의 프린팅 방법과 레플리카몰딩(replica molding), 모세관 힘 리소그래피(capillary force lithography), 모세관-미세몰딩(micromolding in capillaries, MIMIC), 미세전사몰딩(microtransfer molding, μTM), 나노임프린팅(nanoimprinting), 액체중재전사몰딩(liquid-bridge- mediated nanotransfer molding, LB-nTM)등의 몰딩법이 있다.
이 외에도 PDMS 기반 광중합 리소그래피를 통해 만든 소자는 해상도가 높고, 생체적합성이 좋기 때문에 입체 리소그래피(3D 프린팅) 보다 선호되고 있어 오간온어칩(11)을 제작하는데 이용할 수 있다. 하지만 이와 같이 PDMS를 사용하여 오간온어칩(11)이 제작될 수 있다면 패턴 제작 공정 기술은 이에 특별히 한정하는 것은 아니다.
인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩(11)에 사용되는 인체 조직유래세포는 혈액, 켈로이드, 지방, 뇌, 장, 간, 폐, 비장 조직 등 다양한 장기에서 검체를 채취할 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 다중 장기 조직을 이용해서 오간온어칩을 제작할 수 있다. 예를 들어, 위-장-간 조직을 연결한 오간온어칩을 제작할 수 있는데, 각기 다른 장기에 해당하는 챔버를 추가하여 오간온어칩을 제작한 뒤, 위-장-간의 대사산물이 다른 조직에 미치는 영향에 대해서 연구할 수 있다.
일반적으로 질환은 개별적인 장기의 반응보다는 장기들 사이에서 상호작용을 통한 종합적인 반응이 중요하다. 따라서 여러 장기의 조직 세포를 한 개의 오간온어칩(11)에서 동시에 배양하고 대사와 관련된 지표의 변화를 측정한다면 인체와의 유사성이 높아져 연구의 신뢰도를 높일 수 있다. 하지만 인체조직유래세포가 모사하고자 하는 장기를 이루는 세포로 구성되거나, 장기의 특이적 구조를 갖추거나, 장기의 특이적 기능을 재현한 것이라면 나열한 장기들의 조직 세포로 특별히 한정하는 것은 아니다.
예를 들어 장 조직 유래세포는, 장 줄기세포가 증식, 분화하여 생성된 세포의 자기 조직화(Self-organization)을 통해 생성될 수 있으며, 장 상피세포(Enterocyte), 술잔 세포(Goblet cell), 장내분비세포(Enteroendocrine cell), 장 줄기세포(Intestinal stem cell) 등과 같은 장 상피를 구성하는 세포들로 구성되어 있으며 융모와 움의 조직학적 특성을 모사한다. 이러한 세포 구성과 구조적 모사 외에도 영양분의 흡수와 수분 교환 등과 같은 장의 기능적 특성 또한 재현할 수 있다.
오간온어칩(11)이 내부에 안착되며, 오간온어칩(11)의 배양에 도움을 주는 마이크로인큐베이터(10)는 세포 배양에 요구되는 온도, 습도, 탄소 농도를 지속적으로 유지하는 기능을 포함하며, 3차원 세포 배양 공정을 이용할 수 있다.
3차원 세포 배양은 세포가 3차원 환경과 상호작용하거나 성장할 수 있도록 인위적으로 만들어진 성장환경을 의미한다. 2차원 환경과 달리 3차원 환경의 세포 성장은 세포로 하여금 생체 외(in vitro)에서 모든 방향으로 성장할 수 있도록 하며, 이는 생체 내(in vivo)에서의 세포 환경과 더욱 유사하다.
예를 들면, 3차원 세포배양은 일반적으로 bioreactor나 cell을 spheroids로 자라나게 할 수 있는 작은 캡슐에서 이루어지며, bioreactor 하나 당 대략 300개의 spheroids가 배양될 수 있다. 3차원적으로 세포와 세포간의 접촉이 일어나고 그에 따른 상호작용과 세포 분비물이 확산되면서 신호전달이 일어나고 세포막에 존재하는 수송단백질에 의해 약물이 확산, 투과로 인해 세포로 들어갈 수 있다. 이러한 특성은 2차원 세포배양에는 없고, 3차원 배양에서만 일어나는 특성으로 이를 통해 실제 생체에서 일어나는 약물대사과정이 2차원 배양에 비해 잘 일어난다.
또한, 오간온어칩(11)을 마이크로인큐베이터(10)에서 배양하며 사용되는 세포배양모델은 Scaffold 방식과 Scaffold-free 방식에 특별히 한정하지 않고 이용할 수 있다.
Scaffold-free 방식은 세포외기질 없이 세포와 세포를 뭉쳐서 자라게하고, Scaffold 방식은 세포외기질 공간 안에 세포를 3차원으로 배양한다.
예를 들면 Scaffold-free 방식 중, 바닥을 코팅하거나 배양액을 유동시켜 세포의 부착을 방지하는 anti-adhesion 방식인 Static suspension 배양, Spinner/rotational chamber 배양, Nano pattern 배양, 자기부상(magnetic levitation) 배양으로 이루어진 군 중에서 하나 이상의 배양 방법이 이용될 수 있다.
Static suspension 방식은 가장 일반적인 세포배양모델로 디쉬(dish)나 well의 바닥에 세포의 부착을 방지하는 아가 또는 anti-adhesion 코팅을 하여 세포가 떠서 서로 뭉쳐서 자라는 3차원 세포배양모델이다.
Spinner/rotation chamber 방식은 spinner 또는 rotational chamber를 이용하여 세포를 끊임없이 움직여 바닥에 세포가 부착하지 못하여 배양액 상에서 떠서 뭉쳐 자라는 3차원 세포배양모델이며, Nano pattern 방식은 well의 바닥에 미세 패턴을 만들어 세포가 well 바닥에 부착되지 않고 떠서 덩어리 형태로 자라는 3차원 세포배양모델이다.
또한 자기부상 방식은 자석 입자를 이용해 세포를 well 바닥으로부터 띄워 세포를 덩어리 형태로 자라게 하는 3차원 세포배양모델이다.
부착방지 방식 이 외에도 중력의 힘으로 세포를 모아서 단일 spheroids를 형성하는 방식으로 Hang in drop 배양, U 또는 V shape well 배양 등으로도 구분될 수 있다.
또한 Scaffold 방식도 오간온어칩(11)의 배양방법으로 사용할 수 있다. Scaffold 방식은 세포외기질로 인공 폴리머인 Solid-scaffold나 hydrogel을 쓰는 방식에 따라서 다양하게 나뉘어 지며, 구조적으로는 세포외기질을 well, 마이크로채널, 마이크로 필라 등에 형성하는 방식으로 나뉜다.
하지만, 오간온어칩(11)을 통해 spheroids 형태의 세포 배양 형성을 확인할 수 있다면 이는 나열한 배양방법들에 특별히 한정하는 것은 아니다.
도 2는 도 1에 나타낸 분석부의 유사약물예측에 대한 예시를 나타낸 사진이다.
도 2를 참고하면, 신약개발 시 이미 ADR이 알려진 약물과 비슷한 작용을 하여 그 약물을 정확히 예측할 수 있다면 관심 있게 볼 ADR을 미리 선정할 수 있다. 예를 들면, CLUE에서 비슷한 서비스를 제공하고 있다. 이를 바탕으로 CLUE에 있는 약물 처리된 세포의 gene expression data를 이용해 drug similarity 예측 모델을 만들었다. multi-class classification이며 Deep learning의 AutoKeras의 Architecture search를 사용할 수 있으며 micro AUC = 0.94 수준의 성능을 보였다. 또한 이 모델을 통해 나온 확률로 유전자 기반 약물 유사도 계산을 통한 약물의 추천이 가능할 수 있다.
도 3은 도 1에 나타낸 분석부의 독성평가 알고리즘을 나타낸 사진이다.
도 3을 참고하면, 분석부는 독성평가를 할 수 있는 알고리즘을 포함할 수 있다. 예를 들면, CLUE의 약물을 투여한 gene expression data와 sider, FDA Adeverse Event Reporting System, Drug.com등의 부작용 database를 사용하여 유전체 결과물과 부작용 데이터세트를 통합하게 된다. 인공지능 모델에 이 데이터를 넣을 때 y값은 부작용의 개수가 301개 이기 때문에 multi label classification이 된다. Machine learning에서 이를 처리하기 위해 데이터를 알고리즘에 맞게 변형시키는 방법(Problem Transformation Method)와 알고리즘을 데이터에 맞게 바꾸는 방법(Algorithm Adaption Method) 두가지를 사용할 수 있다. 결과적으로 Extra-Trees의 모델의 micro auc 0.757로 가장 좋았으므로 해당 모델을 선택하였다. 이에 따라feature selection과 hyper parameter tuning을 진행해 micro auc 0.763수준의 모델을 구축할 수 있었다.
도 4는 도 1에 나타낸 분석부의 액체생체검사 알고리즘을 나타낸 사진이다
도 4를 참고하면, 분석부는 액체생체검사를 할 수 있는 알고리즘을 포함할수 있다. 액체생체검사의 진행을 위한 실험 플랫폼 구축을 위하여 최근의 digial genomic sequencing 기술의 발달로 적은 양의 DNA에 암세포의 체세포 돌연변이를 관찰할 수 있는 여지가 늘어났다. 액체 생체 검사는 circulating tumor cell (CTC)와 cell-free DNA (cfDNA) 가 원료 시료가 될 수 있다. Circulating tumor cell (CTC)을 기존에 승인된 cellsearchTM 의 CTC capture platform과 inhouse customized platform 중 성능을 비교하여 CTC 분리 플랫폼을 선정하였다. Cell-free DNA (cfDNA)를 환자의 혈액 샘플에서 채취하여 이를 적은 양의 DNA로부터 linear하게 DNA를 증폭하는 기술을 in-house 구축하였다. 이에 따라, Variant (Filter: AO>=5, ExAC AF<=0.05, AF>=0.055) ctDNA 조건에 만족하는 Variant 1건 VHS-062/TP53, AO: Total number of reads that support the alternate allele. ExAC AF The frequency of the allele called at this locus, from ExAC global population. AF: The allele fraction (AF) of the reads that support the alternative allele Highlight: Filter 조건 만족 1건 (Filter: AO>=5, ExAC AF<=0.05, AF>=0.055) Filter확장: AO>=5, ExAC AF<=0.05, AF>=0.0055 와 같은 결과를 얻을 수 있었다.
도 5는 도 1에 나타낸 세포추적장비로 측정한 세포를 나타낸 사진이고, 도 6은 도 5에 나타낸 세포에 대해 라벨링 전처리를 한 사진이고, 도 7은 도 5에 나타낸 세포에 대해 면적 값을 확인한 사진이고, 도 8은 도 5에 나타낸 세포에 대해 세포 종류에 따른 라벨링 및 세포부위 인식을 나타낸 사진이다.
도 5 내지 도 8을 참고하면, 세포추적장비는 세포를 실시간으로 촬영하는 카메라와 상기 카메라로부터 전송된 이미지를 분석하는 영상분석부를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 카메라는 세포의 상단에 위치하여 세포를 실시간으로 촬영하게 되며, 실시간세포추적시스템 4일동안 촬영한 세포(도5 참조)는 카메라에 의해 총 704장의 세포 이미지가 촬영되었다. 이 중 39~42장 사진 간격으로 한 개씩 선별하여 train은 17개 사진으로 구성하고, 이 중 116~118장 사진 간격으로 한 개씩 선별하여 val은 6개 사진으로 구성하고, 이 중 77~79장 사진 간격으로 한 개씩 선별하여 test는 9개 사진으로 구성하여 분석하였다.
train, val, test 폴더 별로 안에 있는 사진들은 다른 폴더 사진과 서로 중복되지 않았다.
영상분석부를 통해 라벨링 천저리가 가능할 수 있다. 예를 들면, 세포 영상 이미지 라벨링 전처리는, VGG image annotation(VIA)이용할 수 있다. 세포를 인식하고자 하는 부위가 자신이 레이블한대로, 또 레이블해준 이름대로 Polygon labels밑에 등록 및 polygons로 가장자리를 따서 여러가지 label명으로 등록하고 코드에서 학습시키고 test데이터 나올 때 레이블(클래스명)이 한 개밖에 없으한 해당 클래스명이 결과사진 위로 뜨질 않아서 의미없는 부위의 아무 클래스명이나 추가후 클래스명 추가하여 어노테이션 할 수 있다. 또한, Mask-RCNN을 통한 세포 변화 알고리즘 개발하고, MACK RCNN Import 및 세포이미지 설정할 수 있다.
도 9는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제1 예시를 나타낸 사진이다.
도 9를 참고하면, Mask-RCNN은 인간의 뇌 신경생리학에서 영감을 얻어 고안된 인공신경망은 최근 이미지 처리에서 매우 높은 정확도를 보이고 있다. 다양한 인공신경망 방법들 중 ①합성곱 신경망(Convolution neural network)을 이미지처리에 특화되도록 고안한 기법인 U-net Neural network. ②입력층과 출력층 사이에 하나 이상의 중간층이 존재하는 신경망인 MLP neural network. ③단일 저해상도(LR) 입력 이미지로부터 원본 고해상도(HR) 이미지의 세부정보까지 픽셀 정보를 복구하는 기술인 단일 이미지 SuperResulution. ④각 픽셀을 객체인지 아닌지를 masking하는 CNN기술을 추가 고안된 알고리즘인 Mask-RCNN 방법들을 시도할 수 있다. 세포 영상의 경우 객체안에서의 객체를 인식해야 하는 부분으로 Mask-RCNN을 활용하여 알고리즘을 구축함. Mask-RCNN은 backbone으로 ResNet-101을 사용하는데 ResNet 네트워크에서는 이미지 input size가 800~1024일때 성능이 좋다고 함.　bilinear interpolation을 사용하여 resize해주며, bilinear interpolation은 여러 interpolation기법 중 하나로 동작 과정은 2 x 2의 이미지를 4 x 4로 Upsampling을 한다면 2 x 2에 있던 pixel value가 각각 P1, P2, P3, P4로 대응되며 총 16개 중 4개의 pixel만 값이 대응되고 나머지 12개는 값이 아직 채워지지 않았는데, 이를 bilinear interpolation으로 값을 채워주는 방식으로 고안될 수 있다. CNN의 추가적인 구조로 1)Fast R-CNN의 classification, localization (bounding box regression) branch에 새롭게 mask branch. 2)RPN 전에 FPN (feature pyramid network). 3)Image segmentation의 masking을 위해 RoI align이 RoI pooling을 대신하여 구성될 수 있다.
도 10은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제2 예시를 나타낸 사진이다.
도 10을 참고하면, 유전체 결과물과 부작용 데이터 세트를 통합하여 만든 독성평가 알고리즘은 Extra tree classifier일 수 있다. 예를 들면, multi-label classification 문제를 해결하기 위한 다양한 머신러닝 알고리즘을 탐색할 수 있다데이터를 알고리즘에 맞게 변형시키는 방법(Problem Transformation Method)과 알고리즘을 데이터에 맞게 바꾸는 방법(Algorithm Adaption Method) 두 가지가 있었고 각각에 속하는 다양한 알고리즘을 시도해볼 수 있었다. Problem Transformation Method 중에는 대표적인 3가지가 있다. ①각 라벨마다 분류기를 학습시켜 해당 분류에 속하는지 속하지 않는지 예측하는 방법인 Binary Relevance. ②각각 라벨에 대해 학습기를 생성하는 것은 같지만, Chain rule과 같이 이전 분류기 예측 값을 다음 분류기 학습에 변수로 사용하는 Chain Classifier. ③각각의 라벨 조합을 하나의 분류로 여기는 방법인 Label Powerset. Algorithm Adaption Method 중에서는 트리기반의 모델인 ①Random-Forest, ②Decision-Tree, ③Extra-Trees를 사용하였다. Problem Transformation Method 세가지와 Algorithm Adaption Method 세가지를 다양한 방법과 조합으로 시도 후 가장 성능이 높았던 모델 Extra tree classifier을 골라 약물 처리된 세포의 RNA-seq 결과를 바탕으로 독성평가 알고리즘을 구축할 수 있었다. 이 모델을 통해 나온 ADR결과를 활용하여 신약 스크리닝과 신약이 유발할 수 있는 ADR을 미리 예측해 볼 수 있다.
도 11은 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제3 예시를 나타낸 사진이다.
도 11은, 약물 처리된 세포의 RNA-seq 결과를 바탕으로 유사약물예측 알고리즘은 AutoKeras일 수 있다. 예를 들면, 기존의 기계 학습 모델 개발은 리소스를 많이 사용하므로 수십 개의 모델을 생성하고 비교하는 데 상당한 도메인 지식과 시간이 필요할 수 있다. 자동화된 Machine Learning을 사용하면 프로덕션 준비 ML 모델을 매우 쉽고 효율적으로 얻는 데 걸리는 시간을 단축할 수 있다. 그 중 AutoKeras는 RNN 컨트롤러와 Convolutional Cells을 통한 강화학습을 통해 구조를 찾는 NASNet를 기반으로 한다. 일반적인 NASNet은 단일 GPU로는 상당한 시간이 걸리지만 AutoKeras는 이를 효율적으로 구현한 AutoML 방법론이다. 이를 사용해 약물 처리된 세포의 RNA-seq 결과를 바탕으로 유사 약물 예측 알고리즘을 구축하였다. 이 모델을 통해 나온 약물의 유사도를 활용하여 drug repurposing과 바이오시밀러 효용성 평가에 사용 가능할 수 있다.
도 12는 도 5에 나타낸 세포추적장치에 적용되는 알고리즘의 제4 예시를 나타낸 사진이다.
도 12를 참고하면, CTC를 활용할 수 있는 항암제 선별 파이프 라인 구축에 대한 예를 나타낸다. CTC는 정상 세포가 없기 때문에 tumor only mode로 somatic variant calling을 해야 한다. unpaired tissue samples에서 somatic variant calling이 가능한 tool들 중에서 GATK3의 Mutect2, GATK4의 Mutect2, SomVarIUS를 시도할 수 있다. 그 중 가장 sensitivity가 높게 나왔던 GATK4이 Mutect2를 선택하여 파이프라인을 구축할 수 있다. GATK4의 Mutect2는 local assembly of haplotypes를 사용하여 somatic SNVs 와 indels를 calling하는 tool이므로 Tumor DNA-seq 데이터로부터 somatic variant를 찾을 때, matched normal이 없을 경우 MuTect2의 tumor only mode를 이용하여 SNV (Single nucleotide varint) 와 small indel을 발굴하여 VCF 형태의 파일을 생성할 수 있다.
도 13은 도 1에 따라 제작된 오간온어칩에서 시간의 흐름에 따른 세포 이동을 나타낸 사진이다.
오간온어칩(11)을 마이크로인큐베이터(10)에서 배양하면서 오간온어칩(11)에서의 세포 이동을 일정 시간 동안 관찰할 수 있다.
도 13을 참고하면, 마이크로인큐베이터(10) 내에 오간온어칩(11)을 삽입하고 3 시간까지의 세포 이동을 관찰할 수 있었다. 삽입 직 후, 채널에 위치한 세포의 수가 104개였으나, 3 시간 후 세포의 수가 121개로 증가하였다. 이는 세포의 위치로 보아 유인제가 주입된 방향으로 세포가 이동한 것으로 판단된다. 이와 같이 제작된 세포 오간온어칩(11)을 육안으로 관찰하고 세포 로딩 후, 시간의 변화에 따라서 세포의 이동 한 개체 수를 확인할 수 있다.
또한 마이크로인큐베이터(10)에서 세포를 성장시키면서도 세포 이동을 육안으로 관찰할 수 있다. 세포는 항상 음극임을 감안하여 세포 표면을 일부 양이온 종류로 코팅하여 향상시킬 수 있다. 추가로 세포의 크기에 근거하여 세포를 고정할 수 있으며 세포의 피막화에 하이드로겔 등 막공성 폴리머 들이 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통해 오간온어칩(11)으로 제작된 세포 이동 관찰 방법 대해 더 상세하게 기술한다.
실시예 1
칩을 제작하고 멸균하여 준비한다. 피브로넥틴(fibronectin)을 5μg/cm2 30분에 걸쳐 코팅한다. 105개/ml의 cell을 로딩하고 overnight으로 cell을 부착시킨다. 양쪽 well에 각각 media와 attractant를 동시에 각 80 ul씩 multichannel pipette을 사용하여 주입한다. 주입이 끝나면, 온도와 CO2 농도 및 제어가 가능한 마이크로 인큐베이터에 오간온어칩을 삽입한다. 24시간동안 마이크로인큐베이터에서 동영상을 촬영하며 세포 이동을 관찰한다.
본 발명에 따른 실시예 1의 결과에 따르면, Matrigel에서의 이동성이 Huvec cell에 비해 활발하지 않지만 attractant 쪽으로의 이동을 보였다. 또한 TNF-α 주입 시, 주입 반대 방향으로 cell이 이동함을 보이는 듯하고, 뭉쳐 있던 세포가 흩어지며 죽는 세포가 종종 발견되었다.
이와 같이 마이크로인큐베이터(10)에서 세포 배양을 진행하면서도 세포 이동을 관찰할 수 있다는 것을 확인하였다.
도 14는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 관찰한 세포 이동을 나타낸 사진이다.
도 14를 참고하면, 로딩된 세포가 시간이 지남에 따라서 이동이 된 흔적을 관찰할 수 있다.
이하 실시예를 통해 세포 이동 관찰 방법 대해 더 상세하게 기술한다.
실시예 2
PDMS 몰드에 두 개의 구멍인 챔버를 만들어 세포가 배양될 수 있는 공간과 배양액을 보관하는 공간을 확보한 뒤, 슬라이드 글라스를 접합하여 오간온어칩을 제작하였다. 두 개의 챔버에 세포 배양액을 채우고 기포가 없음을 확인한 후, 한쪽 챔버에만 세포를 파종하여 마이크로인큐베이터에서 배양하였다.
본 발명에 따른 실시예 2의 결과에 따르면 마이크로인큐베이터(10)에서 배양을 시작한 후, 파종된 세포는 넓은 공간이 확보된 챔버에 머물러 있다가 개체수가 많아 짐에 따라 점차 배양 챔버의 영양분이 감소하게 되고, CO2 또한 증가하는 반면 세포가 파종되지 않은 다른 챔버의 배양액은 상대적으로 세포가 배양되기 좋은 조건을 유지하게 되며, 세포는 상대적으로 배양 조건이 양호한 반대편 챔버로 이동하게 된다.
이와 같이, 세포의 이동은 마이크로인큐베이터(10)에서 배양을 하는 동시에 실시간세포추적시스템에서 실시간 세포추적장비(30)를 통해서도 관찰이 가능하다.
실시예 1 내지 2와 같이 본 발명의 실시간 세포추적방법에는 시간 별 세포 변화 이미지 정보를 확보하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통해 실시간세포추적시스템에서 세포추적장비(30)를 통해 세포 이미지를 분석 방법 대해 더 상세하게 기술한다.
실시예 3
Glass에 가공된 PDMS 칩을 부착한다. 관찰 대상 cell을 칩에 로딩 한 후, 24시간을 마이크로 인큐베이터에서 배양한다. IC50의 drug를 주입하고 실시간 세포 추적 장비에서 세포를 측정하고 관찰한다.
본 발명에 따른 실시예 3의 결과로, 도 4를 참고할 수 있다.
도 15는 도 1에 따라 제작된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 이미지의 분석을 나타낸 사진이다.
도 15를 참고하면, 0.8μM Daunorubicin의 경우 사멸되는 세포가 24시간후 약 50%를 보이는 것을 확인할 수 있었다.
Daunorubicin은 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 주요 항생물질로 사용되는 물질이다. 안트라사이클린계 항종양제로 불리는 계열에 속하는 항암제인데, 항암제는 세포분열을 멈추게 하는 작용을 하기 때문에 해당 약물을 주입함으로써 암세포의 사멸을 관찰할 수 있다.
또한 Doxorubicin의 경우에도 암치료에 사용되는 약물로써, 50μM Doxorubicin를 주입하여 세포추적장비(30)를 이용하여 관찰하였을 때, 거의 12시간 이전에 50% 이상이 사멸함을 보여주는 것을 확인할 수 있었다.
실시간 세포추적장비(30)를 통해 얻어진 데이터를 기반으로 세포 특성을 분석하는 분석부(40)에서는, SNP 분석 알고리즘, GSA(Gene Set Analysis)알고리즘, Somatic mutation Calling algorithm으로 이루어진 군 중 하나 이상의 방법으로 분석될 수 있다.
SNP는 개인 간의 염기 배열 상에 발생하는 차이로 DNA 사슬의 특정 부위에 서로 다른 염기를 가지고 있는 경우를 말한다. 지금까지 개발되고 이용중인 대부분의 방법은 PCR 방법에 기초하여 여러 시료에 대한 한정된 수의 SNP 분석이 주를 이루고 있으나 DNA array를 이용하여 한 시료에 대한 여러 SMP를 동시에 분석할 수 있는 방법도 개발되고 있다. PCR을 기초로 한 주요 SNP 분석방법은, SSCP(Single Stand Conformation Polymorphism), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism), RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD(Random Amplified Polymorphic DNAs), AS-PCR(Allele-Specific PCR), GC-tail primer를 이용한 Tm-shift genotyping, DASH(Dynamic Allele-Specific Hybridization)이 있다.
GSA 알고리즘인 유전자 집단 분석은 생물학적 경로나 염색체 위치가 같은 유전자 집단을 분석하여 질병의 발생에 유의한 집단을 찾아내는 분석방법으로, 수 만개의 유전자를 공통기능을 가진 몇 개의 집단으로 묶어 줌으로써 검정 대상 수를 줄여 다중 검정이 용이하다는 장점이 있다.
Somatic mutation calling algorithm은 MuTect와 Strelka, VarScan2와 같은
3가지 소프트웨어를 이용하여 확인할 수 있다. 일반적으로 인간의 질병을 일으키는 genetic mutation에는 germline mutation과 somatic mutation이 있는데, 특히 somatic mutation은 암에서 유전자 기능을 바꿀 수 있는 중요하고 공통적인 메커니즘으로 이 돌연변이의 정보를 확인하는 것은 cancer genome을 이해하는데 있어 매우 중요한 단계이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적방법의 순서도이다.
도 16을 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 실시간세포추적방법은, 인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 단계(S10), 오간온어칩을 마이크로 인큐베이터에서 배양하는 단계(S20), 실시간 세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 단계(S30)를 포함할 수 있다.
인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 단계(S10)에서 다양한 장기의 인체조직유래세포를 통해 제작할 수 있다. 여러 종류의 인체조직유래세포를 동시에 배양하면서 배지의 영양성분이 각 세포에 분배되는 정도나, 세포들 사이에서의 이동 및 반응의 정도를 알아보기 위해 약물동력학(Pharmacokinetic, PK) 모델링을 이용할 수 있다.
약물동력학 모델링은 동물 또는 인체에서 약물이 투여된 후 흡수, 대사 반응을 거쳐 몸에서 제거되기까지의 과정을 수학적으로 모사하기 위한 모델링 기법이다. 약물동력학 모델링 기법을 적절히 변형시켜 오간온어칩에 적용하면 오간온어칩에 약물이 투여된 후에 어떻게 반응하고 제거되는지 해석하고 예측이 가능하다.
오간온어칩을 마이크로인큐베이터에서 배양하는 단계(S20)에서 세포의 추적 및 이동, 관찰을 명확하게 실시간으로 관찰하기 위해서 바이오센서를 이용할 수 있다. 예를 들면, FET(Field Effect Transistor), 나노입자, MEM(Micro Electro Mechanical)를 바이오센서의 기반으로 삼아 이용할 수 있으며 항체 또는 효소의 화학적 반응을 이용하여 감지하는 방식으로 이루어질 수 있다.
실시간 세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 단계(S30)에서는 세포추적장비를 통해 얻어진 데이터를 기반으로 하여 약물효율성 및 세포독성을 분석할 수 있다. 예를 들면, 배양된 인체조직유래세포에 항암제나 개발한 신약 등을 주입하고 일정시간 동안 세포를 관찰하며 세포의 사멸이나 이동을 통해 해당 항암제나 개발 신약의 효과에 대해서 예측할 수 있다.
또한 세포독성을 분석하기 위해 WST-1 assay, MTT assay, CCK-8 assay와 neutral dye 방법을 사용하여 세포독성을 평가할 수 있다.
본 발명의 실시간세포추적시스템 및 이를 구현하는 방법에 의하면, 인체조직유래세포를 기반으로 세포의 이동을 관찰하고 분석하는 기술을 제공한다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 설명하였으나, 본 발명의 사상은 본 명세서에 제시되는 실시 예에 제한되지 아니하며, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서, 구성요소의 부가, 변경, 삭제, 추가 등에 의해서 다른 실시 예를 용이하게 제안할 수 있을 것이나, 이 또한 본 발명의 사상범위 내에 든다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 인체조직유래세포를 통해 질병을 예측하는 실시간세포추적시스템에 있어서,
    상기 실시간세포추적시스템은,
    인체조직유래세포를 채취하여 제작되는 오간온어칩;
    상기 오간온어칩이 내부에 안착되며, 상기 오간온어칩에 온도, 습도, 탄소농도를 지속적으로 유지하며 상기 인체조직유래세포를 배양하는 마이크로인큐베이터;
    상기 마이크로인큐베이터에 연결되며, 상기 인체조직유래세포의 상단에 위치한 세포추적장비; 및
    상기 세포추적장비로부터 입력되는 정보를 실시간으로 분석하는 분석부를 포함하는 실시간세포추적시스템.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 분석부는,
    상기 인체조직유래세포의 분석결과를 바탕으로 유사약물을 예측하는 예측부를 더 포함하는 실시간세포추적시스템.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 분석부는,
    상기 분석결과에 따른 유전체 결과물과 공공데이터로부터 전송받는 부작용 데이터세트를 통합하여 독성평가를 하는 독성평가부를 더 포함하는 실시간세포추적시스템.
  4. 제3 항에 있어서,
    상기 분석부는,
    상기 인체조직유래세포에 대해 액체생체검사 진행을 위한 알고리즘을 포함하는 실시간세포추적시스템.
  5. 제1 항에 있어서,
    상기 세포추적장비는,
    실시간으로 상기 인체조직유래세포의 변화를 기록하는 카메라; 및
    상기 카메라로부터 전송된 영상을 상기 인체조직유래세포의 이동 및 면적 변화에 대한 이미지정보를 라벨링 전처리를 하는 영상분석부를 포함하는 실시간세포추적시스템.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 인체조직유래세포는,
    혈액 유래, 켈로이드 조직 유래, 지방 조직 유래, 뇌 조직 유래, 장 조직 유래세포로 이루어진 군 중 하나 이상을 포함하여 진행할 수 있는 실시간세포추적시스템.
  7. 제1 항에 있어서,
    상기 분석부는,
    AutoKeras, Extra tree classifier, Mask-RCNN으로 이루어진 군 중 하나 이상의 방법을 이용할 수 있는 실시간세포추적시스템.
  8. 인체조직유래세포를 오간온어칩으로 제작하는 제1 단계;
    상기 제1 단계를 기반으로 제작된 오간온어칩을 마이크로인큐베이터에서 배양하는 제2 단계; 및
    상기 제2 단계를 기반으로 배양된 오간온어칩을 실시간세포추적장비를 통해 세포 특성을 분석하는 제3 단계를 포함하는 실시간세포추적방법.
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