KR20230089487A - 주름 개선 및 피부상처회복 효능 갖는 발효작약 exosome을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주름 개선 및 피부상처회복 효능 갖는 발효작약 exosome을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 통해 발효 된 발효작약 유래 엑소좀은 주름 개선, 피부상처치유, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
본 발명으로부터 제공되는 신규한 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 통해 발효 된 발효작약 유래 엑소좀은 주름 개선, 피부상처치유, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 주름 개선 및 피부상처회복 효능을 갖는 발효작약 exosome을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부 미백과 주름 방지는 아름다움의 상징으로써 꾸준한 관심의 대상이 되어 왔다. 이러한 관심으로 피부 미백과 주름 방지용 제품에 대한 수요는 꾸준히 증가하고 있고, 관련 화장품 산업은 고부가 가치 산업으로 성장하고 있다.
한편, 사람의 피부는 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하조직(subcutis)의 3층 구조로 이루어져 있다. 표피층에는 각질층(stratum corneum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum), 기저층(basal layer)이 존재한다.
주름과 가장 밀접하게 연관되어 있는 것은 피부 세포의 노화이다. 일반적으로 피부 노화의 원인은 고령화에 따라 나타나는 자연 노화와 외부환경에 의해 나타나는 내적인 노화로 분류될 수 있다. 자연 노화는 유전자적 요인 등이 많이 관여되기 때문에 제어가 어렵다. 따라서 자외선,산화,건조 등과 같은 환경적 요인을 제어하기 위해 많은 연구가 진행되고 있다.
환경적 요인은 주로 진피층에 포함된 콜라겐 단백질, 엘라스틴(elastin) 단백질 등을 파괴하거나 변성을 일으켜 주름을 유발한다. 특히, 태양의 자외선은 피부세포(섬유아세포)를 산화시키고 엘라스틴의 생성저하 및 파괴를 일으키는데, 자외선 등에 의해 피부 내에 엘라스틴 분해효소(elastase)가 발현되며 이 효소가 피부 내의 정상적인 엘라스틴을 분해하여 피부 탄력 저하를 가져 온다.
또한, 환경적 요인에 의해 양산된 활성 산소는 산화 작용에 의해 피부 세포 내의 단백질 파괴, 당의 산화, 유전자 변형 등을 일으켜 피부에 노화 및 주름을 유발할 수 있다.
이에 따라, 상기의 부작용은 최소화하면서도 피부 미백과 산화 방지 및 주름 방지 효과를 모두 극대화할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 또한, 피부 자극, 세포 독성 등의 위해 요소가 적어 함량의 제한 없이 사용할 수 있는 화장료 조성물에 대한 요구도 증가하고 있다.
한편, 엑소좀이란 미생물에서부터 인간에 이르는 모든 세포에서 세포 밖으로 분비되는 세포간 의사소통 물질로서 세포밖 소포체(extracellular vesicles) 중 50~200nm 나노 크기의 물질이다. 이러한 나노 크기의 엑소좀은 물에 녹지 않는 막 단백질을 수송할 수 있다. 막 단백질이란 인지질 이중막에 있는 단백질로 소수성이기 때문에 기본적으로는 혈액에 의한 세포간 전달이 어렵다. 이에 반해 엑소좀은 인지질 이중막으로 이루어져 있어 막 단백질을 수송할 수 있다. 인지질 이중막으로 내용물을 둘러쌈으로서 엑소좀은 외부의 분해 물질로부터 그 내용물을 보호할 수 있는 것이다. 대표적인 예로 RNA 수송 기전을 들 수 있다. 세포 밖에 존재하는 RNA는 분해되는 반면에 엑소좀 안에 존재하는 RNA는 이들 물질로부터 보호되어 표적 세포로 원활하게 전달될 수 있다. 또한, 엑소좀은 국소적으로 높은 농도를 유지할 수 있다. 세포는 단순히 적은 단백질을 신호로 인지하지 않고, 일정 수준 이상의양을 가진 단백질이 한번에 전달되어야 신호로 인지한다. 해당 신호 전달을 용이하게 하기 위하여 세포는 엑소좀을 이용하여 해당 단백질을 한정된 공간에 모아 한번에 수송함으로써, 표적 세포에 신호전달을 효율적으로 할 수 있게 된다. 호르몬류와 같이 혈류 전체를 다 순환해야만 특정 세포에 전달되는 방식이 아니라, 엑소좀 내용물은 포장되어 특정 목표에만 제한적으로 수송이 될 수 있기 때문에 적은 양의 내용물만으로도 효율적인 전달이 가능하다. 또한, 엑소좀은 관련된 물질을 한번에 수송함으로써 복합적으로 신호를 전달할 수 있다. 세포 성장을 위해서 한 종류의 단백질을 전달하는 것보다는 서로 시너지 효과를 낼 수 있는 단백질 집단이나 다른 물질(핵산, 지질)을 한꺼번에 수송함으로써 신호를 효율적으로 전달할 수 있다.
즉, 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 동물의 줄기세포에서 분리되는 엑소좀은 포함된 인자가 목적 이외의 효과를 나타낼 수 있으며, 엑소좀의 분리에 있어 줄기세포가 포함될 수 있다는 점에서 안전성의 문제가 될 수도 있다. 그러나, 동물세포 유래 엑소좀의 안전성 문제는 식물세포의 엑소좀을 이용하는 것으로 해결될 수 있다. 이에, 식물세포의 엑소좀에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직 미진한 상태이다.
본 발명자들은 작약 유래 엑소좀의 다양한 활성을 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 주름 개선, 피부상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 갖는 발효작약 유래 엑소좀을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀의 효능활성이 극대화 되게 균주를 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효작약의 제조방법 및 이로부터 유래된 분리된 엑소좀을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 발효 작약 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 주름 개선, 상처회복효과 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 갖는 발효 작약 유래 엑소좀을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기에 사용된 작약은 인체 피부 유래 유산균을 이용하여 발효 시킨 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 효능활성이 극대화 되게 작약에 접종하고, 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 작약 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)로 발효된 작약으로부터 추출된 엑소좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 한다.
본 발명으로부터 제공되는 발효작약 유래 엑소좀은 주름 개선, 피부상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과가 우수하기 때문에, 이를 유효 성분으로 화장료 베이스에 적용하였을 때 화장료 조성물로서의 효과가 우수하다.
이에, 본 발명에서는 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)(이하 ‘YoungBiome2’로 약칭함)를 이용하여 발효작약을 제조하였다.
이때, 상기 YoungBiome2 균주는 20대 여성 피부 유래한 것을 특징으로 한다.
또한, 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 효능활성이 극대화 되게 작약에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효작약 제조방법에 관한 것이다.
상기 배양에 사용되는 작약은 Maltose와 작약을 포함하는 것을 특징으로 한다. 그 중에서도 MRS 배지(proteose peptone No.3 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, dextrose 20g, Polyoxyethylene sorbitan monooleate 1g, ammonium citrate 2g, maganessium sulfate 0.1g, manganesse selfate 0.05g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g/L, pH 6.5)을 기본으로하여 Maltose 0.5g/L, 작약 300g/L를 추가시킨 배지를 사용하여 발효 된 것이 발효물의 수율을 가장 효과적으로 향상 시키고 주름 개선 및 피부상처회복 효과를 극대화 시킬 수 있는 측면에서 바람직하다.
상기 YoungBiome2 균주를 Maltose 및 작약이 첨가 된 MRS 액체배지에 1.0x107 내지 1.0x109의 세균수가 되도록 하여 1~3% 수준으로 접종하고, 배양하는 단계는 혐기성 조건에서 정치 배양을 32 ~ 37℃에서 90 ~ 130시간 동안 수행되는 것을 특징으로 한다. 만일, 배양 온도 및 시간이 상기 범위를 벗어날 경우에는 발효균주의 배양조건이 맞지 않아 충분한 주름 개선, 피부 상처 회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 나타낼 수 없을 뿐만 아니라, 균주 증식이 되지 않기 때문에 바람직하지 않다.
또한, 본 발명에서는 상기 제조된 발효작약 유래 엑소좀을 제조하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발효작약으로부터 엑소좀을 분리하는 단계는, (a)발효 작약에 정제수를 가하여 저온에서 추출하고 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액만을 취하여 추출액을 분리 및 제거하는 단계; (b)상등 추출액액 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 잔여물을 분리 및 제거하는 단계; (c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계; (d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계; 및 (e)펠렛층을 PBS에 재부유시켜 추출액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하는 것이 순도 및 오염 방지 측면에서 바람직하다.
상기와 같이,(d)공정에서 매우 높은 중력가속도(100,000~150,000g)로 원심분리 하기 전에, (a)공정에서 가장 낮은 중력가속도(1,500~2,000g)로 분리하고, (b)공정에서 낮은 중력가속도(10,000~15,000g)로 분리한 다음, (c)공정에서 여과하는 과정을 수행하여 잔여물을 걸러내어 엑소좀의 순도를 높이는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명 발효작약 유래의 엑소좀은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과가 있어 화장료 조성물로서의 효과가 매우 우수하다.
따라서, 본 발명은 발효작약유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 상처 회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것일 수 있다.
본 발명의 주름 개선, 피부 상처 회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 주름 개선 및 피부 상처 회복용 화장료 조성물에서, 상기 발효물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 90 중량% 함유되어 있을 수 있고, 바람직하게는 3 내지 15 중량% 함유되어 있을 수 있으나, 바람직한 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1>
Lactobacillus plantrum
YoungBiome2를 이용한 발효작약 엑소좀 제조
YoungBiome2 균주의 발효물을 제조하기 위해 MRS 배지에 Maltose 0.5g/L, 작약 300g/L를 첨가하여 제조한 후 YoungBiome2 균주를 1.0x109의 균수가 되도록 하여 1% 접종하였다. 접종 후 혐기상태가 유지되도록 산소공급은 없으며, 정치배양을 37℃에서 120시간 동안 실시하였다. 배양을 마치고 pH가 4.0(오차 0.2)으로 형성되는지 확인한 뒤 배양을 마치고 0.2㎛필터(밀리포어) 제균을 실시하였다. 필터가 완료되면 작약에 정제수를 가하여 상온에서 1주간 추출하여 발효작약추출물을 제조하였다.
상기 발효작약 추출물은 (a) 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액만을 취하여 추출액을 분리 및 제거하는 단계;
(b)상등 추출액액 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 잔여물을 분리 및 제거하는 단계;
(c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계;
(d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉힌 후 재분산하는 단계;를 거쳐 엑소좀을 분리하였다.
<비교예 1> 일반작약 엑소좀 제조
작약에 정제수를 가하여 상온에서 1주간 추출하여 일반작약추출물을 제조한 것을 제외하면 <실시예 1>과 동일한 방법으로 비교예 1을 제조하였다.
<비고예 2> 공시균주를 이용한 발효작약 엑소좀 제조
분리된 YoungBiome2 균주가 아닌 type strain 공시균주 (Lactobacillus plantarum Type strain KACC14917를 사용한 것을 제외하면 <실시예 1>과 동일한 방법으로 비교예 2을 제조하였다.
<실험예 1> 항주름 효능 시험 : MMP-1 억제 및 PIP Assay
실시예 및 비교예의 발효물을 이용하여 MMP-1(콜라겐분해효소) 억제와 PIP(Procollagen type 1 C-Peptide) 생성 정도를 평가하였다.
(1) MMP-1 억제
실시예 및 비교예를 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 주름 억제 활성을 확인하기 위하여, MMP-1에 대한 assay 실험을 진행하였다. UVA의 조사에 의하여 발현되는 MMP-1의 억제 활성을 Real-time PCR을 통하여 확인 하였으며, 샘플 처리 농도 별로 조제하여 처리함으로써 MMP-1의 억제 활성에 영향을 주는지 확인하였다.
구분 | MMP-1 저해 활성(%) |
Control | - |
양성 대조군 (EGCG) | 77.52±0.63 |
실시예 (발효작약 엑소좀) | 69.24±0.51 |
비교예 1 | 22.16±0.65 |
비교예 2 | 47.89±0.82 |
(2) Procollagen Type Ⅰ C-peptide(PIP) Assay
실시예 및 비교예 시료가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하였다. 실시예 및 비교예의 시료를 각각 50(㎍/㎖)의 농도로 희석하여 처리하고 24시간 배양 후 Procollagen TypeⅠ C-peptide(PIP) kit인 96well plate에 각각 농도별로 처리한 배양액을 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 2시간동안 반응시켜 주었다. 그리고 D-PBS로 세척해준 뒤, antibody-POD conjugate solution을 각각 100㎕씩 분주해주고 37℃ incubator에 넣고 1시간동안 반응시켜주었다. 다시 D-PBS로 세척해준 뒤, substrate solution (3,3',5,5'- Tetrametylbenzidine)을 각각 100㎕씩 분주해주고 상온에서 15분간 반응시켜주었다. 15분 뒤, multi-reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
구분 | PIP 생성(%) |
Control | 100±0.3 |
양성 대조군 (EGCG) | 165±3.9 |
실시예 (발효작약 엑소좀) | 155±4.4 |
비교예 1 | 111±3.3 |
비교예 2 | 139±2.3 |
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 실시예는 비교예 대비 MMP-1 저해 활성과 콜라겐 생성 활성이 우수한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 발효 과정 시 첨가되는 물질에 의하여 균주의 생장량의 차이 및 유효 postbiotics의 생성량이 달라지는 것에 기인한 효과로 판단 되었다.
<실험예 2> 상처 치유 효능 시험 : Wound healing assay
실시예 및 비교예를 이용하여 피부의 상처 치유효과를 확인하기 위하여 Wound healing assay를 수행하였다.
섬유아세포(Human fibroblast)를 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 12well plate dish에 배양하여 세포가 plate에 80% 이상 되도록 하였다. Tip을 이용하여 plate 바닥을 그어 균일한 너비로 선을 만들었다. PBS로 세척한 후 실시예 및 비교예를 포함한 세포 배양배지를 처리하였다. 상처 치유 시험은 현미경 배율 x100으로 12, 24, 48시간에서 세포의 이동성을 통하여 양단간 간격을 측정하여 확인하였다.
구분 | Wound Healing (% of control) |
Control | 31.50±0.93 |
실시예 (발효작약 엑소좀) | 87.19±0.86 |
비교예 1 | 42.54±0.93 |
비교예 2 | 55.98±0.95 |
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 실시예의 상처 치유 활성이 우수한 것이 확인되었다. 이러한 결과는 발효 작약 유래 엑소좀에 상처치유효과 있다는 것을 의미한다.
<실험예 3> 항염 효능 시험 : Nitric Oxide(NO)를 억제 활성
실시예 및 비교예를 이용하여 항염증 활성 효과를 확인하기 위해 니트릭 옥사이드(Nitric oxide)를 억제하는 정도를 측정하였다.
대식세포의 일종인 RAW 264.7 cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신 및 10% FBS(fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24Well plate에 1.0x104 cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 RAW 264.7 cell에 실시예 1~2 및 비교예 1~2를 50(㎍/㎖) 농도로 배지와 혼합 후, 각 Well에 1ml씩 첨가하고 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 반응시켰다. 이때, NO를 발현시키는 염증유발인자인 LPS(Lipo poly saccharide)를 1㎍/㎖의 농도로 같이 처리하고 37℃ 및 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 각 well의 상등액 만을 따로 취한 뒤 각 Well에 Nitric Oxide detection kit를 이용하여 배양액 중 100㎖ 를 96 Well plate에 취하고 Griess reagent A(N-1-Naphthylethylenediamine (NEDHC)) 50㎕ 및 Griess reagent B(Sulfanilamide) 50㎕를 각각 넣어준 뒤 각각 10 분 동안 반응시킨 뒤, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 NO의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.
구분 | NO 생성농도(μM) |
Control | 14.4±1.33 |
LPS 처리 | 93.1±0.63 |
실시예 (발효작약 엑소좀) | 26.6±1.01 |
비교예 1 | 32.8±0.71 |
비교예 2 | 28.2±0.89 |
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 실시예는 비교예 대비 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성농도가 낮은 것으로 확인되어 니트릭 옥사이드(Nitric oxide) 생성 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
이러한 결과는 발효 작약 유래 엑소좀에 항염 효과가 있다는 것을 의미한다.
<제조예 1> 발효작약 엑소좀을 함유하는 화장료 제조
(1) 화장수 제조
하기 표 5에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 화장수를 제조하였다.
성분 | 함량(중량%) |
발효작약 엑소좀 | 3.00 |
히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액) | 12.00 |
잔탄검(2% 수용액) | 2.00 |
1,3-부틸렌글라이콜 | 6.00 |
글리세린 | 4.00 |
히알루론산나트륨(1% 수용액) | 5.00 |
정제수 | 68.00 |
합계 | 100.00 |
(2) 로션 제조
하기 표 6에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션을 제조하였다.
성분 | 함량(중량%) |
발효작약 엑소좀 | 3.00 |
아스코르빈산-2-인산마그네슘염 | 1.00 |
수용성 콜라겐 (1% 수용액) | 1.00 |
시트르산나트륨 | 0.01 |
시트르산 | 0.05 |
1,3-부틸렌글리콜 | 3.00 |
정제수 | 91.94 |
합계 | 100.0 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 신규의 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2 균주를 이용하여 발효 된 발효작약과 발효작약유래 엑소좀의 제조 방법 및 발효작약 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부상처회복 효능을 갖는 화장료 조성물
- 제1항에 있어서, 상기 발효작약은 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)를 Maltose 0.5g/L, 작약 300g/L를 추가한 발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 발효작약 유래 엑소좀 제조 단계는
(a)발효 작약에 정제수를 가하여 저온에서 추출하고 원심분리기를 이용하여 1,500~2,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액만을 취하여 추출액을 분리 및 제거하는 단계;
(b)상등 추출액액 초고속 원심분리기를 이용하여 10,000~15,000g로 20~30분 동안 원심분리 후, 상등액을 취하여 잔여물을 분리 및 제거하는 단계;
(c)상등액을 여과하여 잔여물을 제거하는 단계;
(d)상등액을 초고속 원심분리기를 이용하여 100,000~150,000g로 2~4시간 동안 원심분리 후, 엑소좀을 펠렛층에 가라앉히는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효작약유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 제조방법
- 락토바실러스 플란타럼 YoungBiome2(Lactobacillus plantarum YoungBiome2) 균주(기탁번호:KCCM12765P)로 발효된 발효작약 유래의 엑소좀.
- 제4항의 발효작약 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 상처회복, 피부 치밀도, 피부 탄력 개선 효과용으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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