KR20230089139A - 봉독을 포함하는 식물병 방제용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)로부터 수득된 봉독 또는 멜리틴(melittin)을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 대한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 봉독 및 멜리틴은 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대하여 우수한 항균 활성을 보인 바, 상기 균주에 대한 항균용 조성물 및 상기 균주에 의한 식물병인 과수가지검은마름병 방제용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 봉독 및 이로부터 분리한 유용성분의 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균성을 기반으로 한, 봉독 또는 멜리틴(melittin)을 포함하는 식물병 방제용 조성물에 대한 것이다.
식물병 원인균을 방제하여 식물병을 예방 또는 치료하기 위해, 국내에서는 합성농약이 96.5%, 생물농약이 0.5%, 그리고 친환경농자재가 3.0%씩 작물보호제로 이용되고 있다.
이에 있어 상기 합성농약은 그 독성이 매우 강하여 생산자나 사용자가 이를 취급함에 상당한 주의를 필요로 하며, 이러한 주의에도 불구하고 사용자에게 치명적인 약해를 줄 수 있다. 나아가, 농약에 오염된 농산물을 섭취하는 소비자와 가축에 큰 피해를 줄 뿐 아니라 국민건강도 크게 위협하며, 화학농약의 살포로 인한 수질과 토양의 오염으로 인해 생태계 파괴 등의 심각한 문제가 대두되고 있으며, 저항성 병해충 또한 증가하고 있다. 또한, 친환경농자재의 경우에도 성분 및 약효 발현 정도를 전혀 알 수 없는 것들이 많아 이로 인한 농민의 피해가 증가하고 있다.
따라서 최근에는 자연계에 존재하는 물질, 생물체 및 이로부터 유래한 소재를 이용하여 농작물 생산 및 보존에 피해를 미치는 병원균, 해충 및 잡초 등을 방제하는 생물농약이 각광받고 있다. 상기 생물농약은 사람 및 환경에 대한 안정성이 탁월하고, 시설, 원예, 수도 및 토양 병해충 방제뿐 아니라 저항성 병원균 및 해충의 방제에 대하여 지속적인 효과를 지녀 선진국을 중심으로 친환경 농업에 관심 갖고 있다.
세계 생물농약 시장은 2005년 전체 농약시장의 약 2.5% 수준에 머물었지만, 최근 연평균 증가율이 9.9%로 계속해서 고성장세를 기록하고 있다. 전세계 약 110개 회사에서 생물농약 사업을 추진하고 있으며, 대표적으로 Agra Quest, Verdera OY, 및 Certis USA, 상기 세 회사가 생물농약 시장의 약 5%씩을 차지하고 있다.
그러나 생물농약에 대한 국내의 연구 현황은 미비한 실정이며 특히 미생물 자체를 이용하거나, 미생물이 생산하는 생리활성물질에 대한 연구 및 개발은 외국에 비해 30~50년 뒤늦은 1980년대부터 시작되었다. 그래도 연구 역사에 비해 연구 수준은 많은 발전을 이루어, 1985년부터 현재까지 국가연구기관 및 대학의 병리학자를 주축으로 담배 모자이크병, 세균성 마름병, 오이의 시들음병, 고추의 역병, 딸기의 시들음병, 눈마름병, 사탕무우의 입고병, 벼의 도열병, 문고병 등에 대한 병해방제용 미생물 연구가 보고되고 있다.
하지만 아직 방제와 치료보다는 예방제로 많이 소개되어 있고 실제 작물에 병해가 나타나면 소비자는 결국 속효성인 화학농약을 사용하는 것을 더 선호하여 상용화에 있어서 극복해야 하는 문제점이 존재하고 있다.
특히 환경친화적인 방제용 생물농약의 개발은 기술집약적 농업 측면과 환경 생태계의 보호에 있어 핵심사항으로 부각되고 있다. 따라서 국내에서 경쟁력이 있는 생물농약 제품을 개발하지 못할 경우 선진국으로부터 생물농약을 수입할 수 밖에 없으며, 이는 국내 생물농약산업의 선진국 종속화 결과를 초래할 수 있다.
따라서 우수한 효과의 경쟁력이 높은 환경친화적인 방제용 생물농약을 개발하여 그에 대한 원천기술을 확보하는 것이 시급히 요구되고 있다.
본 발명자들은 환경친화적인 방제용 생물농약에 대해 연구하던 중 과수가지검은마름병을 야기하는 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대하여 봉독 또는 이로부터 유래된 멜리틴(melittin)이 우수한 항균 활성을 보임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명의 다른 목적은 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 목적은 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 봉독을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
더불어 본 발명은 멜리틴(melittin)을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 봉독 및 멜리틴(melittin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 식물의 종자 및 토양으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 봉독을 포함하는 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
더불어 본 발명은 멜리틴(melittin)을 포함하는 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명은 봉독 또는 멜리틴의 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균 활성을 확인한 것으로, 본 발명에 따르면, 서양종꿀벌(Apis mellifera L.) 일벌 유래 봉독 및 이로부터 분리된 멜리틴은 과수가지검은마름병을 야기하는 에르위니아 파이리폴리애에 대해 우수한 항균 활성을 보인 바, 상기 균주에 대한 항균용 조성물 및 상기 균주에 의한 식물병인 과수가지검은마름병 방제용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 서양종꿀벌의 일령에 따른 독낭을 액체크로마토그래피 분석하여 독낭 내의 봉독 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 일령별 서양종꿀벌로부터 수득한 봉독과 봉독 표준품과의 성분을 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 서양종꿀벌 유래 봉독 및 이로부터 분리된 유용성분의 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 서양종꿀벌 유래 봉독 및 이로부터 분리된 유용성분을 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 처리하고, 시간별 생존 균수를 확인한 타임-킬 분석(Time-kill assay) 결과이다.
도 2는 일령별 서양종꿀벌로부터 수득한 봉독과 봉독 표준품과의 성분을 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 서양종꿀벌 유래 봉독 및 이로부터 분리된 유용성분의 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 서양종꿀벌 유래 봉독 및 이로부터 분리된 유용성분을 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 처리하고, 시간별 생존 균수를 확인한 타임-킬 분석(Time-kill assay) 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 봉독을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 멜리틴(melittin)을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 “봉독”은 벌의 독낭에 들어있는 것으로, 약 40여 가지의 물질로 이루어져 있으며 기원전부터 인체의 질병치료에 이용되어 왔다. 봉독은 벌의 종류에 따라 그 성분에 차이를 보이며, 동일한 벌이라도 일령에 따라 성분의 차이가 발생한다. 현재 봉독 성분에 따른 작용과 기전, 봉독의 과민성과 독성, 면역요법 및 관절염, 단순포진, 다발성 경화증, 종양 등의 질병 치료 등에 대한 연구가 보고되고 있으며 특히 항균작용과 세포 손상개선효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)로부터 수득된 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)의 독낭에서 분리된 봉독일 수 있다.
더불어 본 발명의 봉독 또는 멜리틴은 봉독 또는 멜리틴 자체, 당분야에 알려진 용매로 추출한 추출물, 당분야에 알려진 용매로 희석한 희석액, 공지의 방법에 의하여 농축된 농축액, 공지의 방법에 의하여 건조된 건조물 또는 공지의 방법에 의하여 제조된 정제물로서 제공될 수 있다.
상기 공지의 농축 방법은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 침전농축, 증발농축, 감압농축, 한외여과법, 역삼투법 또는 원심분리법을 이용하여 농축할 수 있다. 상기 공지의 건조 방법은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 동결 건조, 분무 건조 또는 열풍건조를 이용하여 건조할 수 있다. 또한 필요에 따라 분말화 과정을 추가적으로 더 포함할 수 있다. 또는 공지의 여과 방법에 의하여 제조될 수 있으며 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 여과망 또는 마이크로필터를 이용한 여과, 원심분리 또는 분액깔때기를 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 봉독에 있어서, 보다 더 바람직하게는 당류와 휘발성 물질이 제거된 정제봉독일 수 있다. 또한 본 발명의 봉독은 멜리틴을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 1시간 이내의 일벌, 3~8일령의 일벌, 9~14일령의 일벌, 15일령 이상된 일벌에서 봉독을 수득하고 정제하여 각 일령별 꿀벌의 독낭 내의 봉독 함량을 확인해 본 바, 15일령 이상된 일벌의 독낭에 순수한 봉독이 가장 많이 함유되어 있음을 확인하였다.
더불어 상기 15일령 이상된 서양종꿀벌 일벌로부터 수득한 봉독의 성분이 봉독 표준품의 성분과 동일함을 확인하였다.
따라서 본 발명에 있어서, 상기 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)은 15일령 이상의 일벌인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 멜리틴은 봉독에서 분리한 26개의 아미노산으로 구성된 단백질로, 본 발명의 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)로부터 수득된 봉독에서 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 일실시예에 따르면 봉독 및 이로부터 분리된 유용성분인 멜리틴, 포스포리파아제 2(phospholipase 2) 및 아파민(apamin)의 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균성을 확인한 결과, 봉독 및 멜리틴은 우수한 항균 활성을 나타내었으나, 포스포리파아제 2 및 아파민은 항균 활성을 나타내지 않음을 확인하였다.
또한, 봉독과 멜리틴의 에르위니아 파이리폴리애에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 및 최소살균농도(microbial bacteriocidal concentration, MBC)를 확인한 결과, 멜리틴이 봉독 대비 더 낮은 농도에서도 균 성장 억제와 사멸 효과를 보임을 확인하였다. 더불어 멜리틴이 봉독보다 항균 지속 효과가 더 우수함을 확인하였다.
따라서 본 발명에 따르면 봉독 및 멜리틴은 과수가지검은마름병을 야기하는 에르위니아 파이리폴리애에 대하여 우수한 항균 활성을 보이는 바, 본 발명의 식물병은 과수가지검은마름병인 것을 특징으로 한다.
상기 에르위니아 파이리폴리애는 그람 음성 균으로(Gram-negative bacterum), 과수가지검은마름병의 발병을 야기한다.
상기 과수가지검은마름병은 사과, 배, 모과 등 과수에 발생하는 식물병이며, 주로 5월 중순경에 발병되는 우리나라 토착병이다. 전염 속도는 약간 느린 편이나, 수확 후 폐기해야 하며 발병시 발병 지역의 해당 과일은 수출이 금지된다. 현재 효과적인 방제약제가 없어 발병시 병든 가지를 제거하고 나무 굴취, 매몰과 소각하고 있다.
따라서 과수농가에 있어 막대한 손해를 야기하는 바, 본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 과수가지검은마름병 발병 방지에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 예를 들어, 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 본 발명의 봉독 또는 멜리틴의 활성을 저해하지 않는 범주에서, 용매 및/또는 담체를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴술포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 술페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 술페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 술포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌 옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 관수용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더불어 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 작물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제와도 혼용이 가능하다.
또한 본 발명은 봉독 및 멜리틴(melittin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 식물의 종자 및 토양으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
본 발명의 식물병 방제 방법에 있어서, 본 발명의 봉독 및 멜리틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상은 액체, 분말, 정제 등 어떠한 상태로든 제한없이 처리될 수 있다. 일례로, 액체 상태로 처리되는 경우, 식물의 종자에 도포하는 처리, 식물의 종자를 침지시키는 처리, 식물의 재배 토양에 관주(灌注)하는 처리, 식물의 재배 토양 표면에 분무하는 처리, 식물의 경엽에 살포하는 처리, 및 식물의 부상부(付傷剖)에 접촉시키는 처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 처리될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 봉독을 포함하는 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
더불어 본 발명은 멜리틴(melittin)을 포함하는 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "항균" 또는 "항균 활성"이란, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물에 대해 저항하는 성질을 의미하며, 보다 상세하게는 항생물질 등이 세균의 성장 또는 증식을 억제하는 특성을 의미한다.
본 발명에 있어서, "항균용 조성물"은 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 항균용 조성물은 구성요소인 봉독 또는 멜리틴의 에르위니아 파이리폴리애에 대한 특이적 항균 활성을 기반으로 한 에르위니아 파이리폴리애의 생장을 저해하는 활성을 가진 조성물을 의미한다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 봉독 및 멜리틴 준비
1-1. 서양종꿀벌(
Apis mellifera
L.) 유래 봉독 수득 및 정제
서양종꿀벌을 봉독채집장치(청진테크, 한국)를 이용하여 봉독을 채집하되, 성충이 된 시간이 1시간 이내의 일벌, 3~8일령의 일벌, 9~14일령의 일벌, 15일령 이상된 일벌에서 각각 봉독을 별도로 채집하였다.
상기와 같이 각 일령별 서양종꿀벌 일벌의 독낭 내 봉독의 함유량을 확인한 결과 도 1과 같이, 15일령 이상된 일벌의 독낭에서 순수한 봉독의 함유량이 가장 높음을 확인하였다.
더불어 각 일령별 서양종꿀벌로부터 수득한 봉독의 성분과 봉독(honeybee venom) 표준품(시그마(sigma)에서 구입)의 성분을 비교해 본 결과 도 2와 같이, 15일령 이상된 일벌의 봉독이 표준품의 성분과 일치하는 것을 확인하였다.
15일령 이전의 봉독은 독 함량이 적고 성분이 완성되지 않아 균일하지 않으나 15일령 이상이 되면 봉독량 및 성분이 일정하게 유지되므로 15일령 이상의 일벌에서 분리한 봉독을 사용해야만 소기의 효능을 기대할 수 있다.
따라서 본 발명에서는 15일령 이상된 일벌에서 채집된 봉독을 사용하기로 결정하였다. 더불어 봉독의 간이 정제방법을 통해 당류와 휘발성물질을 제거함으로써 순수한 수용성을 갖는 정제 봉독 건조물을 제조하였다. 이렇게 제조한 정제봉독 분말은 2~8℃에서 빛이 차단되도록 알루미늄 호일로 포장하여 보관하였다.
1-2. 봉독 유래 유용성분 분리
상기 1-1을 통해 수득한 15일령 이상의 서양종꿀벌 일벌의 정제봉독으로부터 멜리틴을 분리하였다. 정제봉독을 100% 증류수, 20% 에탄올, 40% 에탄올, 60% 에탄올, 80% 에탄올, 100% 에탄올에 넣어 1 mg/mL로 만들고 1분간 볼텍스(vortex)하였다. 이를 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과한 후 UPLC(High-performance liquid chromatography)로 멜리틴, 포스포리파아제 2(phospholipase 2, PLA) 및 아파민(apamin, AP)을 분리하였다.
이를 위하여 Waters(Minneapolis, MN, USA)사의 diode array detector가 장착된 UPLC I class 모델을 사용하였으며, 컬럼은 Advanced Material Technology(Wilmington, DE, USA)사의 Halo ES-C18(2.1×100 mm, 2.7 μm, )을 사용하였다. UPLC 분석조건은 유속 0.8 mL/min, 주입량 2 μL, 검출파장 220 nm, 컬럼온도 50℃이었으며, 이동상은 (A) 20 mM TFA/MeCN, (B)20mM TFA/H2O의 Apamin, phospholipase A2, Melittin을 지표로 UPLC(ultra performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다. 상기 조건은 표 1에 나타내었다.
실시예 2. 에르위니아 파이리폴리애(
Erwinia pyrifoliae
)에 대한 항균성 확인
상기 실시예 1을 통해 수득한 서양종꿀벌 유래 봉독 및 유용성분(멜리틴, 포스포리파아제 2 및 아파민)의 에르위니아 파이리폴리애에 대한 항균성을 디스크 확산법으로 확인하였다.
먼저 에르위니아 파이리폴리애 균주를 TS 배지(Trypticase soy broth, 5% 양 혈액(sheep blood) 첨가))에서 37℃로 18시간 동안 호기 조건으로 배양하고, 물에 연속희석법으로 희석하여 준비하였다.
더불어 정제봉독(1mg/paper) 및 이로부터 추출한 멜리틴(1μg/paper), 아파민(1μg/paper), PLA2(1μg/paper)을 멸균증류수에 각각을 용해하여 준비하였다. 이를 각각 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc(ф8.0mm, Advantec Co))에 흡수시킨 후, 클린벤치(clean bench)에서 휘발시켰다. 5% 말 혈청(horse serum)이 첨가된 TSA(Tripic Soy Agar) 배지에 상기 에르위니아 파이리폴리애 균주 희석액을 100 ㎕ 넣고 유리봉으로 균일하게 도말하였다. 에르위니아 파이리폴리애 고체 배양배지 위에 상기 각각의 페이퍼 디스크를 올려 놓고 37℃의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 디스크 주위의 억제 지역(inhibition zone)의 직경(mm)을 측정하였으며 그 결과를 도 3 및 하기 표 2에 나타내었다.
| 억제영역(Inhibition zone)(mm) | |
| 봉독(BV) | 12.3 |
| 멜리틴(mel) | 11.5 |
| 포스포리파아제 2(PLA) | 0 |
| 아파민(apamin) | 0 |
그 결과, 본 발명에 따른 서양종꿀벌 유래 정제봉독(도 3내 BV) 및 이로부터 분리한 멜리틴(도 3 내 mel)은 에르위니아 파이리폴리애에 대하여 우수한 항균 활성을 보인 반면, 봉독으로부터 분리한 포스포리파아제 2(도 3 내 PLA2) 및 아파민(도 3 내 Apa)은 항균 활성을 보이지 않았다.
더불어 봉독 및 멜리틴의 에르위니아 파이리폴리애에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 및 최소살균농도(microbial bacteriocidal concentration, MBC)를 확인하여 하기 표 3에 나타내었다.
봉독 및 멜리틴은 멸균 증류수로 희석한 후 무균 여과하여 액체배지 희석법에 준하여 단계적으로 희석하였다. 에르위니아 파이리폴리애는 TS 배지에서 37℃로 18시간 동안 호기 조건으로 배양한 후 시험에 사용하였다. 접종 균은 2 ×106 CFU/well가 되도록 조절하고, 다양한 농도로 희석한 봉독 또는 멜리틴 시료와 함께 18시간 동안 배양한 후, 육안 및 현미경으로 균의 성장을 관찰하였다. 더불어 흡수파장 540nm에서 흡광도를 측정하여 순수 배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 최소억제농도로 결정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| MIC(μg/ml) | MBC(μg/ml) | |
| 봉독 | 28.6 | 35.7 |
| 멜리틴 | 11.7 | 22.8 |
상기 표 3과 같이, 봉독의 에르위니아 파이리폴리애에 대한 MIC는 28.6μg/ml이었고, MBC는 35.7μg/ml임을 확인하였다. 더불어 멜리틴의 MIC는 11.7μg/ml이었고, MBC는 22.8μg/ml였다. 따라서 봉독보다 멜리틴이 에르위니아 파이리폴리애에 대하여 더 낮은 농도에서도 성장 억제 및 사멸 효과를 보임을 확인하였다.
실시예 3. 에르위니아 파이리폴리애(
Erwinia pyrifoliae
)에 대한 살균력 지속 시간 및 사멸 소요시간 확인
봉독과 멜리틴의 에르위니아 파이리폴리애에 대한 항균력 지속시간을 알아보기 위하여 PAE 분석(post antibiotic effect assay) 및 타임-킬 분석(time-kill assay)을 수행하였다.
봉독의 살균력 지속시간(PAE, post antibiotic effect)을 측정하여, 항균력에 대한 안정성을 확인하였다. 먼저, 에르위니아 피리폴리애를 2.5×105 CFU/well로 조절하여 각 MIC값 2배 농도의 봉독 또는 멜리틴 시료와 함께 1시간 동안 배양하였다. 원심분리와 배지 희석법을 사용하여 이로부터 봉독 또는 멜리틴을 제거하였다. 이후 새로운 배지로 교환하여 37℃로 배양하며 2시간 간격으로 균수를 측정하였다. 이때, PAE 수치가 클수록 항균 지속 효과가 우수하다고 할 수 있으며, PAE는 하기 수학식 1을 통해 산출하였고 그 결과는 표 4 및 도 4에 나타내었다.
[수학식 1]
PAE = T-C
상기 수학식 1에 있어서, T는 봉독을 처리한 시험군에서 1 log10 까지의 생육에 걸리는 시간이고, C는 무처리군에서 1 log10까지의 걸리는 시간이다.
| 정제봉독 | 멜리틴 | |
| PAE (hr) | 1.8 | 2.5 |
그 결과, 상기 표 4 및 도 4와 같이, 정제봉독의 PAE(hr)은 1.8이고, 멜리틴의 PAE(hr)은 2.5로 멜리틴의 항균 지속 효과가 더 우수한 것을 확인하였다. 더불어 정제봉독 및 멜리틴 모두 처리 후 24시간만에 에르위니아 피리폴리애를 전부 사멸시켰으며, 멜리틴을 처리한 실험군에서 시간별 생존 균수가 더 적음을 확인하였다.
종합적으로, 본 발명에 따른 15일령 서양종꿀벌 유래 정제봉독 및 이로부터 유래된 멜리틴은 에르위니아 파이리폴리애에 대하여 우수한 항균 활성을 보여주었고, 정제봉독보다 멜리틴이 더 낮은 농도에서 성장 억제 및 사멸 효과를 보이고, 더 우수한 항균 지속 효과를 보유함을 확인한 바, 이를 상기 균주에 대한 항균용 조성물 및 상기 균주에 의한 식물병인 과수가지검은마름병 방제용 조성물로 유용하게 활용할 수 있다.
Claims (12)
- 봉독을 포함하는 식물병 방제용 조성물.
- 멜리틴(melittin)을 포함하는 식물병 방제용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)로부터 수득된 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 봉독은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)의 독낭에서 분리한 봉독인 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 봉독은 당류와 휘발성 물질이 제거된 정제봉독인 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 봉독은 멜리틴을 포함하는 것인, 식물병 방제용 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)은 15일령 이상의 일벌인 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
- 제 2항에 있어서,
상기 멜리틴은 서양종꿀벌(Apis mellifera L.)로부터 수득된 봉독에서 분리된 단백질인 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 식물병은 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 의한 과수가지검은마름병인 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
- 봉독 및 멜리틴(melittin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 식물의 종자 및 토양으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
- 봉독을 포함하는 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균용 조성물.
- 멜리틴(melittin)을 포함하는 에르위니아 파이리폴리애(Erwinia pyrifoliae)에 대한 항균용 조성물.
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