KR20230088787A - 신규 생물활성 펩티드 조합 및 이의 용도 - Google Patents

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마티아스 뫼르겔린
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콜직스 에이비
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Abstract

본 발명은 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 폴리펩티드의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 발명의 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 제공된다. 관련된 양태는 발명의 조성물과 연관된 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 이에 사용하기 위한 물질, 및 이의 제조 방법을 제공한다. 또한 세균 감염의 치료 및/또는 예방 및 상처 케어에서의 방법 및 조성물의 용도, 및 시험관내에서 미생물을 사멸하는 방법이 제공된다.

Description

신규 생물활성 펩티드 조합 및 이의 용도
본 발명은 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 이를 포함하는 키트와 조합하여 콜라겐 VI 폴리펩티드 및 이의 유도체를 포함하는 생물활성 펩티드 조합; 및 이의 용도 및 의학적 용도에 관한 것이다.
피부는 미생물의 침입과 외부 환경의 악영향으로부터 우리의 신체 내부 구조를 보호하는 것을 책임지는 우리의 주요 외부 방어 시스템이다. 성인 피부는 주로 각질 세포로 구성된 표피 또는 각질층; 콜라겐과 엘라스틴이 풍부한 결합 조직인 진피; 및 지방 조직으로 구성된 하피 또는 피하층의 세 층으로 구성되며, 이는 신체에 열적 단리 및 기계적 보호를 제공한다[1]. 상처는 물리화학적 또는 열적 손상으로 인해 형성될 수 있는 피부 내의 표면적 또는 깊은 손상이다. 급성 상처는 8-12주에 걸친 치유 기간이 필요한 손상된 조직으로 정의된다(예를 들어, 화상, 화학적 손상, 자상). 대조적으로, 만성 상처는 정맥 또는 동맥 혈관 기능부전, 압력 괴사, 암 및 당뇨병과 같은 질병의 부산물이다[2,3]. 그것은 더 긴 치유 시간(수주-수개월에서 수년)을 필요로 하고 종종 정상적인 건강 상태에 도달하지 못하여 염증화의 병리학적 상태를 지속한다[4]. 따라서, 지연되거나 손상된 상처 치유는 치료 비용 및 폐기물 생산의 관점에서 전 세계 환자 및 건강 관리 시스템에 상당한 사회-경제적 부담을 안겨준다[5].
손상 후 조직 재생은 실활된 세포 및 조직 구조가 대체되는 복잡한 과정이다[6]. 피부 복구 동안 활성화되는 신중하게 조정된 생화학 및 세포 이벤트에 대한 통찰력은 적절한 상처 드레싱을 설계하는데 중요하다[1,7,8]. 그것은 세포 반응뿐만 아니라 세포외 기질(ECM) 조성에서 광범위한 변화를 포함한다. 일반적으로, 상처 복구는 지혈, 염증화, 증식에 이어 반흔 조직의 성숙 및 재조절 같은 서로 다른 예측가능하고 중첩하는 단계로 분할된다[9-11]. 지혈은 상처 부위에서 피브린 천을 일시적인 장벽으로 사용하여 혈액 손실을 중단하기 위한 손상에 대한 신체의 즉각적인 반응이다[12]. 염증화(24시간 내지 4-6일)는 호중구와 대식세포에 의해 매개되며[13], 이는 이물질과 조직 파편으로부터 상처 부위를 청소한다. 사이토카인과 효소가 방출되어 섬유아세포와 근섬유아세포 대식세포를 자극하는 반면[14], 상처 삼출물은 회복을 위한 필수 수분을 제공한다. 증식 단계에서 상피화가 일어나고 새로 형성된 육아 조직이 상처 부위를 채우기 시작하여 새로운 ECM을 생성한다. 마지막으로, 리모델링 단계 동안 콜라겐-기반 가교-연결은 단단한 3D 네트워크 형성을 담당하여 새로운 조직의 인장 강도를 증가시킨다[12]. 중요하기로는 세포와 그 주변 구조 사이의 친밀한 관계가 일반적으로 재생 과정을 조절하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 간주된다. 따라서, 우수한 상처 치유 특성을 보장하기 위해 생체분자가 광범위하게 장입되는 적절한 생체물질을 만드는 것이 중추적이다.
상처 치유의 처음 두 단계에 이어서 증식 단계라고 하는 복구하는 단계가 있다. 그것은 부상 3일 후 시작되어 2주 동안 지속된다. 손상 후, 섬유아세포 및 근섬유아세포는 국소 상처 환경에서 증식하고 TGFβ 및 PDGF에 의해 자극되어 3일째에 손상의 부위로 이동하여 그곳에서 풍부하게 증식한다. 섬유아세포는 히알루로난, 피브로넥틴, 프로테오글리칸 및 유형 I/III/V 콜라겐으로 구성된 확장된 원섬유 네트워크인 매트릭스 단백질의 세포외 매트릭스에 있다. 이 매트릭스는 세포 이동 및 복구 과정을 지원하는데 도움이 된다. 상처 가장자리를 근사화하는 중요한 회복 과정인 상처 수축은 섬유아세포가 제거된 후에 발생한다[15].
콜라겐은 조직에 기계적 강도를 제공하고 세포-부착 및 증식을 자극하는 가장 풍부한 포유류 단백질이다[16,17]. 폴리펩티드 서열의 삼중-나선 3차 구조를 나타내는 약 30가지 상이한 유형의 콜라겐이 식별되었지만, 콜라겐-기반 생체물질의 생산에는 소수만이 사용된다.
콜라겐 유형 VI은 대부분의 결합 조직에서 복잡하고 광범위한 구슬형의 미세원섬유 네트워크를 형성한다. 콜라겐 유형 VI의 우세한 형태는 3중 나선형 단량체를 형성하는 α1(VI), α2(VI) 및 α3(VI)인 3가지 별개의 폴리펩티드 사슬로 구성된다(즉, 단량체는 별도의 생성물로 존재하지 않는다; 천연 생성물은 대신 이들 3중 나선형 단량체로 형성된다). 세포 내부에서 단량체는 세포외 공간으로 분비되는 이량체 및 사량체로 조립된다. 거기에서 사량체는 말단-상-말단으로 응집하여 확장된 초분자 매트릭스 어셈블리의 일부가 되는 마이크로피브릴을 형성한다. 보다 최근에는, 일부 조직에서 α3-사슬을 대체할 수 있는 3개의 추가 사슬(α4, α5 및 α6)이 발견되었다[30, 31]. 구조의 관점에서 각 α-사슬은 폰 빌레브란트 인자 유형 A 도메인(VWA)과 상동성을 공유하는 2개의 큰 N- 및 C-말단 구형 영역에 의해 측접된 짧고 확장된 3중-나선 영역을 특징으로 한다[32-34]. VWA는 또한 ECM에서 단백질-단백질 상호작용을 담당하다[32-35]. 콜라겐 유형 VI의 α1(VI) 및 α2(VI) 사슬은 1개의 N-말단(N1) 및 2개의 C-말단(C1 및 C2) VWA 도메인을 함유하는 반면 α3(VI)는 훨씬 더 크고 약 10개의 N-말단(N10-N1) VWA 도메인 및 2개의 C-말단 VWA 도메인을 포함한다. 부가적으로, α3(VI) 사슬은 침샘 단백질, 피브로넥틴 유형 III 반복 및 세린 프로테아제 억제제의 쿠니츠 계열과 상동성을 공유하는 3개의 C-말단 도메인(C3-C5)을 갖는다[36]. 그 고유한 설정으로 콜라겐 유형 VI은 광범위한 조직에 강도, 무결성 및 구조를 제공한다. 그것은 또한 세포자멸사, 자가포식, 혈관신생, 섬유증 및 조직 복구와 같은 다른 중요한 생물학적 과정에도 관여한다[37].
본 발명자들은 이전에 콜라겐 VI 펩티드 및 이의 유도체가 상처 치유를 적극적으로 촉진하고 항미생물 특성을 가지고 있음을 보여주었고(WO 2017/125585 참조, 그 내용은 참조로 본 명세서에 포함됨), 그것은 치유하기 어려운 상처의 치료와 관련된 응용분야에 대해 유용하게 하고 동시에 MRSA와 같은 통상의 항생제에 대한 내성이 생긴 박테리아를 죽이거나 성장을 억제한다. 그들은 또한 예를 들어 의료 장치의 표면에 코팅되거나 의료 장치 또는 다른 그러한 물질에 통합될 때 오염된 상처에서 신속한 상처 봉합의 자극 및 미생물 감염의 치료에 유용하다.
내인성 콜라게나아제에 의한 높은 생체적합성과 생분해성은 콜라겐을 생의학 응용분야에 이상적으로 만든다[18,19]. 상처가 치유되는 동안, 섬유모세포는 10-500nm의 범위인 직경을 갖는 피브릴을 형성하기 위해 응집하는 콜라겐 분자를 생성한다. 이 섬유 네트워크는 상처 부위로의 세포 전이를 촉진하여 조직 복구를 적극적으로 지원한다[20]. 단백질 구조의 손쉬운 화학적 기능화 덕분에 다양한 드레싱 아키텍처가 활용되었다. 콜라겐-기반 상처 드레싱은 하이드로겔, 전기방사 섬유 또는 나노결정-함유 스캐폴드의 형태에서 화상 상처를 덮고, 궤양을 치료하고[21-24], 조직 수축과 흉터를 줄이고, 상피화 속도를 증가시키기 위해[25] 적용되었다. 콜라겐 스폰지와 섬유성 막은 연조직을 봉합하고 새로운 조직 성장을 위한 템플릿을 제공하도록 허용하는 그 습윤 강도에 기인하여 특히 유망한 것으로 밝혀졌다. 다기능 플랫폼은 세포 증식에 유리한 지형을 유지하면서 항균 및 항염 특성을 나타냈고, 따라서 치유 및 상처 봉합을 가속화했다. 스캐폴드 설계를 위한 생체물질로 그의 다소 광범위한 용법에도 불구하고, 콜라겐 스캐폴드는 아직 탐구되지 않은 높은 엔지니어링 잠재력을 가진 지속가능한 물질로 남아 있다[26,27].
피부 상처 치유 과정과 관련된 다중 세포 메커니즘과 여러 외부 요인의 상호작용을 고려할 때, 적합한 드레싱 물질의 선택이 요구되고 있다. 특히, 생분해성 천연 물질의 경우, 그 분해가 상처 복구의 역학을 따라야 하며, 이는 생리적 치유 진화를 보장하고 필요할 때 활성 성분을 방출해야 한다[6]. 이 문제를 해결하기 위해 여러 상처 드레싱이 고유의 세포외 기질 생물학적 및 물리화학적 특징을 요약함에 의해 최고 수준의 생체모방을 달성하도록 설계되었다. 특히, 천연 콜라겐 네트워크에 기반한 생물학적 드레싱은 상처 미세환경을 개선하고 따라서 새로운 조직의 재생을 유리하도록 하는데 사용된다. 이들 물질을 사용하는 근거는 고유한 천연 세포-인식 도메인을 제시하고 따라서 상처 부위에서 섬유아세포와 각질세포 부착 및 증식을 자극한다는 접근방식이다[28]. 부가하여, 이러한 천연 원섬유 콜라겐 스캐폴드는 침입하는 세포에 대한 가이드 능선을 제공하고 따라서 구조화된 진피 상처 치유를 촉진할 수 있는 것으로 생각된다.
생의학 응용분야에 대한 소 콜라겐은 전형적으로 소 피부와 힘줄을 처리하고 정제하는 것으로부터 유래된다. 천연 콜라겐 피브릴로 구성된 생성된 콜라겐 분산물은 구조화된 상처 치유를 촉진하는 높은 정도로 구조적으로 및 기능적으로 진피에 유사하다[43, 44]. 이들 콜라겐은 또한 상이한 종 간에 고도로 보존되어 있으며[45, 46], 예를 들어, 인간과 소 콜라겐 I 사이의 서열 상관관계는 88%이다. 이는 안정적인 콜라겐 3중 나선 구조가 구조와 기능의 중추적인 손실 없이 일차 아미노산 서열에서 변이를 거의 허용하지 않는다는 사실과 일치한다[47]. 따라서, 종 사이의 분자 서열 변이는 고도로 보존되어 소 콜라겐을 인간에 사용하기에 적합하게 만든다.
콜라겐-함유 상처 드레싱은 고체 콜라겐 겔로 상처 부위 안으로 통합될 수 있다. 이 겔은 상처 치유 동안 분비되는 체액에 존재하는 단백질분해 효소에 의해 부분적으로 소모될 수 있다. 따라서, 상처의 치유를 수행할 때 새로운 콜라겐 드레싱을 나머지 드레싱의 상단에 얹을 수 있다. 따라서, 콜라겐은 상처 안으로 "공급"되고 점차적으로 뒤집어지고 인간 진피에 의해 대체된다.
의료 장치, 임플란트, 상처 치유 생성물 및 이에 사용하기 위한 물질과 같은 생체물질에서 생물활성 콜라겐 VI 펩티드와 같이 개선된 상처 치유 및 항균 활성을 달성할 수 있는 개선된 생물활성 펩티드의 개발에 대한 요구가 남아 있다.
여기서, 발명자들은 콜라겐 VI의 알파-3 사슬로부터 2개의 생물활성 펩티드의 조합이 비교할만한 용량에서도 개별 펩티드 단독에 비하여 상처 치유 및 항균 활성을 크게 증강시킨다는 것을 처음으로 보여주었다. "비교할만한 용량"으로는 본 발명자들은 개별적으로 테스트된 펩티드가 2개의 결합된 펩티드와 동일한 용량임을 의미하며; 예를 들어 펩티드는 3μM의 농도에서 단독으로 테스트되었지만, 총 3μM의 펩티드 투여에 대해 각각 1.5μM의 농도에서 2개의 펩티드로 조합되었다는 것을 의미한다. 이 효과는 조직 재생 및 흉터 리모델링을 촉진하면서 감염 및 염증화의 발현을 능동적으로 대조할 수 있는 다목적, 다기능 및 적절한 세포외 환경을 제공하는 현저한 잠재력을 초래하고, 결과적으로 생체적합성에서의 원하는 증강을 제공할 것이다.
더욱이, Punjataewakupt et al., 2019에 기술된 바와 같이, 많은 알려진 방부제가 세포 독성 효과와 그에 대해 전개되는 세균 내성으로 인해 어려움을 겪고 있다. 대조적으로, 발명의 펩티드는 합성 항생제보다 제한된/감소된 세포 독성 및 다중약물 내성의 고유한 낮은 수준의 전개를 나타낸다. 일 실시형태에서 본 명세서에 기술된 펩티드는 무 세포독성을 나타낸다.
흥미롭게도, 2가지 생물활성 펩티드의 조합은 비-감염된 및 감염된 상처 치유 시나리오에서 유의하게 개선된다. 이것은 펩티드 조합의 개선된 상처 치유 및 항균 활성이 근본적인 감염을 감소시키거나 예방하는 것에 의존하지 않는다는 것을 입증한다.
발명의 제1 양태는 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 폴리펩티드의 조합을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 조성물은 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 이의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성되고, 상처 치유를 촉진할 수 있는 주요 활성을 갖는 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드(즉, 제1 폴리펩티드); 및
(b) 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 이의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성되고, 항균 효과를 발휘할 수 있는 주요 활성을 갖는 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드(즉, 제2 폴리펩티드).
따라서, 일 실시형태에서, 조성물은 다음을 포함한다:
(a) 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 이의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성된 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드(즉, 제1 폴리펩티드)로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 상처 치유를 촉진할 수 있는, 폴리펩티드; 및
(b) 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 이의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성된 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드(즉, 제2 폴리펩티드)로서, 여기서 제2 폴리펩티드는 항균 효과를 발휘할 수 있는, 폴리펩티드.
따라서, 일 실시형태에서 조성물은 상처 치유를 촉진할 수 있고 또한 항균 효과를 발휘할 수 있는 이중 효과를 갖는다.
그러한 효과가 상승적일 수 있다는 것 - 즉 폴리펩티드의 조합의 효과가 2개의 폴리펩티드를 조합하는 부가적 효과보다 더 클 수 있음을 당업자는 인지할 것이다.
콜라겐 유형 VI이 인간 또는 비-인간 공급원으로부터의 것일 수 있음을 당업계의 통상인은 인지할 것이다. 예를 들어, 콜라겐 유형 VI은 유인원(예를 들어, 침팬지, 보노보, 고릴라, 긴팔원숭이 및 오랑우탄), 원숭이(예를 들어, 짧은꼬리원숭이, 개코원숭이 및 콜로부스), 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트) 또는 유제류(예를 들어, 돼지, 말 및 소)에서 (직접적으로 또는 간접적으로) 유래될 수 있다. 콜라겐 VI은 또한 새, 예를 들어 닭(갈루스 갈루스)에서 유래될 수 있다.
따라서, "콜라겐 유형 VI"(또한 "콜라겐 VI")에 의해 본 발명자들은 자연적으로 발생하는 인간 콜라겐 유형 VI, 콜라겐 유형 VI 단량체, 이량체 및 사량체, 콜라겐 유형 VI 마이크로피브릴 및 이의 상동체, 예컨대 소 콜라겐 유형 VI을 포함한다. 본 발명자들은 또한 인간 및/또는 비-인간 유전자 서열로부터 발현된 분자가 생성될 수 있는 인간 콜라겐 VI 및/또는 이의 일부의 재조합 발현을 포함한다. 이러한 발현은 박테리아 및/또는 인간 및/또는 비-인간 세포 발현 시스템(예를 들어, 효모 발현 시스템)을 사용할 수 있다. 본 발명자들은 또한 합성 세포 발현 시스템을 포함한다. 본 발명자들은 또한 콜라겐 VI 및/또는 이의 일부로부터 단백질 서열의 합성적 화학 합성을 포함한다.
콜라겐 유형 VI은 전형적으로 3개의 콜라겐 VI 펩티드 사슬(α1(VI), α2(VI) 및 α3(VI))의 각각으로 구성된다. 일부 경우에 α3(VI) 사슬은 α4(VI), α5(VI) 또는 α6(VI) 사슬에 대해 대체될 수 있다.
다양한 콜라겐 VI 알파 사슬의 서열은 UniProt(https://www.uniprot.org/)에서와 같이 공개적으로 이용가능하다. 각 알파 사슬에 대한 UniProt ID와 UniProt에서 개별 페이지에 대한 세부사항은 다음과 같는다:
알파-1: https://www.uniprot.org/uniprot/P12109
알파-2: https://www.uniprot.org/uniprot/P12110
알파-3: https://www.uniprot.org/uniprot/P12111
알파-4: https://www.uniprot.org/uniprot/A2AX52
알파-5: https://www.uniprot.org/uniprot/A8TX70
알파-6: https://www.uniprot.org/uniprot/A6NMZ7
따라서, 특정 실시형태에서, 발명의 조성물의 콜라겐 VI은 α1(VI), α2(VI), α3(VI), α4(VI), α5(VI) 및 α6(VI)으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 3개의 아미노산 사슬을 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서 콜라겐 VI은 α1(VI) 사슬, α2(VI) 사슬 및/또는 α3(VI) 사슬을 포함하거나 이로 구성된다.
일 실시형태에서, 제1 양태의 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬이거나 그로부터 유래된다.
일 실시형태에서, 제1 양태의 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 VI α3(VI) 사슬이거나 그로부터 유래된다.
또 다른 실시형태에서, 콜라겐 VI은 하나의 α1(VI) 사슬, 하나의 α2(VI) 사슬을 포함할 수 있고, α3, α4, α5 또는 α6 사슬인 제3 사슬을 더 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 콜라겐 VI은 인간 콜라겐 VI이거나 그로부터 유래된 펩티드이다. 대안적인 실시형태에서, 콜라겐 VI은 소 콜라겐 VI이거나 또는 그로부터 유래된 펩티드이다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 그의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성되고, 콜라겐 VI α3 사슬로부터 유래되고, 선택적으로 폴리펩티드는 상이한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 폴리펩티드의 아미노산 서열은 중첩하거나 비-중첩할 수 있다.
"폴리펩티드 중 적어도 하나"로는 본 발명자들은 제1 폴리펩티드, 또는 제2 폴리펩티드, 또는 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 모두를 의미한다.
일 실시형태에서, 콜라겐 유형 VI로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 그의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드는 α1(VI), α2(VI) 및 α3(VI)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 구성된다.
일 실시형태에서, 조성물은 콜라겐 VI, 콜라겐 VI α1 사슬, 콜라겐 VI α2 사슬, 콜라겐 VI α3 사슬, GVR28, FYL25, FFL25, VTT30 및 SFV33으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
"폴리펩티드"는 본 명세서에서 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 다른 펩티도미메틱의 화합물을 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서 용어 "폴리펩티드"는 짧은 펩티드 서열 및 또한 더 긴 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 D 또는 L 광학 이성체 둘 모두, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬 "로부터 유래된" 아미노산 서열로는 본 발명자들은 자연적으로 발생하는 콜라겐 유형 VI 단백질 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬의 아미노산 서열 내에서 발견되는 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 본 발명자들은 자연적으로 발생하는 콜라겐 유형 VI의 서열 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬로부터 적어도 5개의 인접하는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 아미노산 서열은 콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬로부터의 적어도 5개의 인접하는 아미노산, 예를 들어 콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬로부터의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 인접하는 아미노산을 함유할 수 있다. 따라서, 콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬로부터 유래된 아미노산 서열은 콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬의 단편에 상응한다. 따라서 일 실시형태에서, 콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬로부터 유래된 아미노산 서열은 콜라겐 유형 VI의 전체-길이 서열 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬의 전체-길이 서열이 아니다. 대안적으로 또는 추가로, 아미노산 서열은 콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬의 전체 길이로부터 인접하는 아미노산의 서열을 함유하지 않을 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열은 콜라겐 유형 VI 및/또는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 인접하는 아미노산을 함유하지 않을 수 있다.
제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드와 제2 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드가 상이한 폴리펩티드인 것, 즉 상처 치유를 촉진하는 제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드는 항균 효과를 발휘하는 제2 유형 VI 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드인 것이 당업자에게 명백할 것이다. "상이한 폴리펩티드"로 본 발명자들은 상이한 아미노산 서열 및/또는 상이한 길이의 서열을 갖는 것, 즉 펩티드가 동일한 서열을 갖지 않는다는 의미를 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물의 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드(또는 콜라겐 VI의 단편, 변이체, 융합체 또는 이의 유도체) 중 적어도 하나는 항균 효과를 발휘할 수 있다. 따라서 일 실시형태에서 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 미생물의 성장을 사멸시키거나 약화시킬 수 있다.
콜라겐 VI 및 GVR28, FYL25, FFL25, VTT30 및 SFV33과 같은 콜라겐 VI으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 항균 특성은 WO 2017/125585에 기술되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
"미생물의 성장을 사멸시키거나 약화시킬 수 있는"으로 본 발명자들은 항균 활성을 갖는 콜라겐 VI과 폴리펩티드를 포함한다. 항균 활성은 전체적이거나 부분적일 수 있고 용량 의존적일 수 있다. 이는 예를 들어 방사형 확산 검정에 의해 입증될 수 있다.
발명의 폴리펩티드가 효과적인 미생물은 박테리아, 마이코플라즈마, 효모, 진균 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 항균 효과를 발휘할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 양태의 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 미생물의 막에 결합할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 음으로 하전된 표면, 예를 들어 박테리아 막에 대해 친화성을 가질 수 있다. 이 친화성은 예를 들어 헤파린에 대한 친화성에 의해 테스트될 수 있으며, 여기서 헤파린에 대한 친화성이 높을수록 음으로 하전된 표면에 대한 친화성이 높다는 것을 나타낸다.
유리하게는, 폴리펩티드 중 적어도 하나의 친화성 또는 결합 능력은 LL-37의 것과 비슷하거나 더 크다. 따라서, 일 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37(즉, LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES; 서열번호: 24)의 것보다 크거나 동등한 항균 효과를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 양호한 항균 효과, 또는 이들 특정된 백분율 사이에서 선택된 범위(예를 들어, 5-100%, 10-20%, 20-60% 등)를 나타낼 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37보다 적어도 10% 더 양호한 항균 효과를 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37의 항균 효과보다 10-20%의 범위에서 더 양호한 항균 효과를 나타낼 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37(즉, LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES; 서열번호: 24)의 것보다 크거나 동등한 상처 치유 효과를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 더 양호한 상처 치유 효과, 또는 이들 특정된 백분율 사이에서 선택된 범위(예를 들어, 5-100%, 10-20%, 20-60% 등)를 나타낼 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37보다 적어도 15% 더 양호한 상처 치유 효과를 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서 폴리펩티드 중 적어도 하나는 LL-37의 상처 치유 효과보다 15-25%의 범위에서 더 양호한 상처 치유 효과를 나타낼 수 있다.
일 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예를 들어 세포질 성분의 막 교란, 수포 또는 삼출을 포함하는 미생물에 대한 구조적 변경을 야기할 수 있다.
따라서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 미생물의 막의 파괴를 야기할 수 있다. 예를 들어, 이것은 미생물에 의한 형광 분자의 흡수를 연구하는 전자 현미경 또는 형광 현미경과 같은 현미경 연구를 통해 정량화될 수 있다.
추가 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 상처 봉합 및/또는 상처 치유를 촉진할 수 있다.
"상처 봉합 촉진" 및/또는 "상처 치유 촉진"으로 본 발명자들은 예를 들어 치유를 가속화함에 의해 상처의 치유 과정을 돕는 것을 포함한다. 예를 들어, 상처 케어 생성물은 상피 재생 및/또는 상처 상피 및/또는 상처 간질의 치유를 증강시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 상처 케어 생성물은 비-용리성 메카니즘을 통해 상피 및/또는 간질 세포의 증식을 증강시킬 수 있다. 상처 봉합 능력은 예를 들어 뮤어라인 또는 돼지 모델에서 세포 스크래치 실험 및 생체내 실험에 의해 정량화될 수 있다. "상피 재생을 증강시키는 것"으로 본 발명자들은 표피 재생의 증강, 즉 표피의 재생의 증강을 포함한다. "상처 상피의 치유를 증강시키는 것"으로 본 발명자들은 표피 치유의 증강, 즉 표피(예를 들어, 상처입은 표피)의 치유의 증강을 포함한다. "상처 간질의 치유를 증강시키는 것"으로 본 발명자들은 진피 치유의 증강, 즉 진피(예를 들어, 상처입은 진피)의 치유의 증강을 포함한다.
따라서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 상처 봉합/치유를 촉진하고/하거나 상처의 감염을 예방함에 의해 상처 케어에서 역할을 가질 수 있다.
추가 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 항균 활성을 가질 수 있고 폴리펩티드 중 적어도 하나(동일하거나 상이한 폴리펩티드)는 상처 치유를 촉진할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 항균 활성을 가질 수 있지만 단독으로 상처 치유를 촉진하지는 않는다. 대안적으로 또는 추가로, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 상처 치유를 촉진할 수 있지만 단독으로는 항균 활성을 갖지는 않는다. 따라서, 폴리펩티드의 특성은 조성물 내 폴리펩티드에 상호 배타적일 수 있다. 폴리펩티드가 두 가지 활성일 수 있는 경우, 상기 폴리펩티드의 활성 중 하나는 그의 일차 활성으로 간주될 수 있고 다른 속성은 그의 이차 활성으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 중 적어도 하나의 일차 활성은 항균 활성일 수 있고 이차 활성은 상처 치유의 촉진일 수 있다. 대안적으로 폴리펩티드는 일차 활성만을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리펩티드는 상처 치유 및 항균 특성(예를 들어, GVR28)을 갖고, 제2 폴리펩티드는 상처 치유 특성을 갖지 않지만 항균 특성(예를 들어, SFV33)을 가지며, 선택적으로 여기서 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드보다 양호한 항균 특성을 갖는다.
제1 양태의 조성물에 의해 치료되는 상처는 체외(즉, 피부 및 하부 조직의 표면 상처) 및/또는 체내(예컨대 장기 이식 또는 조직/장기의 일부의 제거, 예를 들어 대장 수술로 인한 내부 상처)일 수 있다.
제1 양태의 조성물이 그람-양성 및/또는 그람-음성 박테리아에 대해 항균 효과를 발휘할 수 있다는 것이 당업계의 통상인에 의해 인지될 것이다. 예를 들어, 미생물은 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리키아 콜라이, 그룹 A 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 피요게네스), 그룹 B 스트렙토코커스, 예를 들어 스트렙토코커스 아갈락티애), 그룹 C 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 디스갈락티애), 그룹 D 스트렙토코커스(예를 들어, 엔테로-코커스 패칼리스), 그룹 F 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 안기노서스), 그룹 G 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 디스갈락티애 이퀴시밀리스), 알파-용혈성 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 비리단스, 스트렙토코커스 뉴모니애), 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 안기노서스, 스트렙토코커스 상귀니스, 스트렙토코커스 수이스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 모락셀라 카타랄리스, 비-피막형 헤모필루스 인플루엔자(NTHi), 헤모필루스 인플루엔자 b (Hib), 액티노마이세스 내슬룬디, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 프레보텔라 인터미디어, 클렙시엘라 뉴모니애, 엔테로코커스 클로아캐, 엔테로코커스 패칼리스, 스타필로코커스 에피더미디스, 다중약물-내성 슈도모나스 에어루기노사(MRPA), 다중약물-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA), 다중약물-내성 에스케리키아 콜라이(MREC), 다중약물-내성 스타필로코커스 에피더미디스(MRSE), 다중약물-내성 클렙시엘라 뉴모니애(MRKP), 다중약물-내성 엔테로코커스 패시움(MREF), 다중약물-내성 아시네토박터 바우만니이(MRAB) 및 다중약물-내성 엔테로박터 spp.(MRE)로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아일 수 있다.
일 실시형태에서 미생물은 하나 이상의 통상적인 항생제에 내성인 박테리아이다.
"통상적인 항생제"로 본 발명자들은 미생물의 성장을 사멸시키고/시키거나 약화시킬 수 있는 공지된 제제, 예를 들어 천연 및 합성 페니실린 및 세팔로스포린, 술폰아미드, 에리트로마이신, 카노마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 리팜피신 및 젠타마이신 포함, 암피실린, 벤지페니실린, 베네타민 페니실린, 벤자틴 페니실린, 페네티실린, 페녹시-메틸 페니실린, 프로카인 페니실린, 클록사실린, 플루클록사실린, 메티실린 나트륨, 아목시실린, 바캄피실린 염산염, 시클라실린, 메즐로실린, 피밤피실린, 탈람피실린 염산염, 카르페실린 나트륨, 피페라실린, 티카르실린, 메실리남, 피르메실리난, 세파클로르, 세파드록실, 세포탁심, 세포시틴, 세프술로딘 나트륨, 세프타지딤, 세프티족심, 세푸록심, 세팔렉신, 세팔로틴, 세파만돌, 세파졸린, 세프라딘, 라타목세프 디나트륨, 아즈트레오남, 클로르테트라사이클린 염산염, 클로모사이클린 나트륨, 데메클로시딘 염산염, 독시사이클린, 리메사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 아미카신, 프라마이세틴 황산염, 네오마이신 황산염, 네틸마이신, 토브라마이신, 콜리스틴, 나트륨 푸시데이트, 폴리믹신 B 황산염, 스펙티노마이신, 반코마이신, 칼슘 설파록세이트, 설파메토피라진, 설파디아진, 설파디미딘, 설파구아니딘, 설파우레아, 카프레오마이신, 메트로니다졸, 티니다졸, 시녹사신, 시프로플록사신, 니트로푸란토인, 헥사민, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 콜리스티메테이트, 폴리믹신 B, 푸라졸리돈, 날리딕스산, 트리메토프림-설파메톡스-아졸, 클린다마이신, 린코마이신, 사이클로세린, 이소니아지드, 에탐부톨, 에티온아미드, 피라진아미드 등; 항진균제, 예를 들어 미코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 암포테리신, 플루시토신, 그리세오풀빈, 나타마이신, 니스타틴 등; 및 항바이러스제 예컨대 아시클로비르, AZT, ddI, 아만타딘 염산염, 이노신 프라노벡스, 비다라빈 등을 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 미생물은 다중약물-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)(메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스), 다중약물-내성 슈도모나스 에어루기노사(MRPA), 다중약물-내성 에스케리키아 콜라이(MREC), 다중약물-내성 스타필로코커스 에피더미디스(MRSE) 및 다중약물-내성 클렙시엘라 뉴모니애(MRKP)로 구성된 군으로부터 선택된다.
유리하게는, 발명의 제1 양태에 따른 조성물은 미생물 제제에 대해 선택적 독성을 나타낸다. '선택적'으로는 본 발명자들은 조성물의 폴리펩티드가 포유류, 예를 들어 인간, 숙주 세포에 비해 하나 이상의 미생물(예컨대 박테리아, 마이코플라스마, 효모, 진균 및/또는 바이러스)에 우선적으로 독성이 있음을 의미한다. 예를 들어, 표적 미생물에 대한 조성물의 폴리펩티드의 독성은 포유류 세포에 대한 그 조성물의 독성보다 적어도 2-배 초과, 보다 바람직하게는 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 8-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배 또는 적어도 20-배이다.
편리하게는, 제1 양태의 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 포유류, 예를 들어 인간, 세포에 실질적으로 비-독성이다. 일부 실시형태에서, 항균 효과는 그람-양성 및/또는 그람-음성 박테리아에 특이적이고 다른 유기체(예를 들어, 마이코플라스마, 효모, 진균 및/또는 바이러스)에 대해 비활성이다.
예를 들어, 제1 양태의 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 박테리아와 같은 미생물을 사멸하는데 사용될 수 있는 농도에서 적혈구 또는 단핵구에 세포독성을 나타내지 않을 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 최대 30μM의 농도 또는 대안적으로 최대 50μM의 농도에서 세포독성을 나타내지 않는다.
이 방식으로, 예를 들어, 화합물이 미생물 감염을 치료하기 위해 사용될 때, 미생물 세포가 건강한 숙주 조직에 대한 손상을 최소화하면서 파괴되도록 복용량 섭생이 선택될 수 있다. 따라서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 '치료 윈도우'를 나타낼 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 항-내독소 효과를 발휘할 수 있다.
"항-내독소 효과"로 본 발명자들은 내독소에 의해 유도된 효과에 대응하는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 아질산염의 LPS 유도를 적어도 부분적으로 억제할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 VWA 도메인, 예를 들어 구형 VWA 도메인으로부터 유래되거나 이에 대한 아미노산 서열 상동성을 나타낸다. 따라서, 조성물의 폴리펩티드는 VWA 도메인의 적어도 5개(예를 들어, 적어도 10, 15, 20개 이상)의 인접하는 아미노산에 상응하는 아미노산 서열, 또는 이러한 서열과 적어도 70%(예를 들어, 적어도 80%, 90% 또는 95%) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
추가 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드는 무손상 VWA 도메인을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
"VWA 도메인"으로 본 발명자들은 폰 빌레브란트 인자의 유형 A 도메인, 및 폰 빌레브란트 인자의 유형 A 도메인에 상동성을 보이는 도메인뿐만 아니라 VWA-도메인 함유 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α3 사슬로부터 유래된다. 따라서, 조성물의 폴리펩티드는 α3N 또는 α3C 영역으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α3 사슬의 N2, N3 또는 C1 도메인일 수 있거나 그로부터 유래될 수 있다.
대안적 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α4 사슬로부터 유래된다.
또 다른 대체 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α5 사슬로부터 유래된다.
추가의 대체 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α6 사슬로부터 유래된다.
또 다른 대안적 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α2 사슬, 예를 들어 α2N 영역으로부터 유래된다.
제1 양태의 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 그 표면 상에 양이온성 잔기 또는 그 안에 양이온성 서열 모티프를 가질 수 있다는 것이 당업계의 통상인에 의해 인지될 것이다.
따라서, 일 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 순 양전하를 갖는다. 예를 들어, 폴리펩티드는 +2에서 +9 사이의 범위인 전하를 가질 수 있다.
추가 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 적어도 30% 소수성 잔기를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 양친매성 구조를 가질 수 있다.
발명의 제1 양태의 조성물의 예시적인 콜라겐 VI 폴리펩티드는 서열번호: 1 내지 23(하기 표 1에 나타낸 바와 같음) 중 임의의 하나의 아미노산 서열 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 서열번호:1 내지 23 중 임의의 하나의 항균 활성을 보유하는 상기 단편의 융합체, 그의 변이체 또는 유도체를 포함하거나 이로 구성된다. 서열번호:1 내지 23의 각각은 조성물에서 서열번호:1 내지 23 중 임의의 하나 이상과 조합될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드 및 서열번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및/또는 23의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 서열번호: 5의 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드 및 서열번호:1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및/또는 23의 아미노산을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드로 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 6이 아니다.
하기 표 1은 발명의 조성물의 다양한 폴리펩티드를 나타낸다. 이들 중 상처 치유 데이터는 서열번호: 1 내지 6에 대해 이용가능하고, GVR28, FYL25, FFL25 및 VTT30(서열번호: 1 내지 4)은 상처 치유 특성을 갖는다. 상처 치유 데이터는 서열번호: 7 내지 23에 대해서는 이용가능하지 않다. 서열번호 1 내지 5 및 7 내지 23은 모두 항균 활성을 갖는다. 따라서, 서열번호 1 내지 4(GVR28, FYL25, FFL25 및 VTT30)는 이중 활성을 갖는다 - 즉, 이들은 상처 치유 효과를 발휘하고 항균 효과를 발휘할 수 있다.
표 1. 발명의 조성물의 예시적인 폴리펩티드
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일부 실시형태에서, 항균 특성을 갖는 폴리펩티드는 GVR28, SFV33, FYL25, FFL25, VTT30, KPE20, GFA20, AAA76, YDR20, EQN20, VVH20, LRL20, FTK20, RDA20 및 TKR20으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항균 특성을 갖는 폴리펩티드는 AAK20, KGF20, QAP20, RKV20, TSS36, TTK20, VAA20 또는 DVN32가 아니다.
일부 실시형태에서, 상처 치유 특성을 갖는 폴리펩티드는 GVR28, SFV33, FYL25 및 FFL25로 구성된 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 발명의 조성물의 폴리펩티드는 서열번호: 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열:
"GVR28: GVRPDGFAHIRDFVSRIVRRLNIGPSKV [서열번호: 1]
"FYL25"; FYLKTYRSQAPVLDAIRRLRLRGGS [서열번호: 2]
"FFL25": FFLKDFSTKRQIIDAINKVVYKGGR [서열번호: 3]
"VTT30": VTTEIRFADSKRKSVLLDKIKNLQVALTSK [서열번호: 4]
"SFV33": SFVARNTFKRVRNGFLMRKVAVFFSNTPTRASP [서열번호: 5]
또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 서열번호: 1 내지 5 중 임의의 하나의 항균 활성을 보유하거나, 또는 서열번호: 1 내지 4 중 임의의 하나의 상처 치유 촉진 활성을 보유하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 또는 유도체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서 본 발명의 조성물은 서열번호: 1(즉, GVR28)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체 및 서열번호: 1의 상처 치유 활성을 유지하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 및 유도체를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 서열번호: 5(즉, SFV33)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 및 서열번호: 5의 항균 활성을 유지하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 및 유도체를 포함한다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 서열번호: 1(GVR28)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드(즉, 제1 폴리펩티드), 및 서열번호: 5(SFV33)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드(즉, 제2 폴리펩티드), 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 각각 서열번호: 1 또는 5 중 어느 하나의 항균 활성을 유지하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 또는 유도체를 포함한다.
이러한 조성물에서 GVR28(서열번호: 1)의 일차 작용은 상처 치유를 촉진하는 것이고 SFV33(서열번호: 5)의 일차 작용은 항균 효과를 제공/발현하는 것이다.
따라서, 일 실시형태에서 본 발명의 조성물은 하기를 포함하거나 이로 구성된다:
(a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 제1 폴리펩티드; 및
(b) 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 제2 폴리펩티드.
그러한 펩티드는 또한 이차적 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, GVR28은 상처 치유를 촉진하는 일차 작용을 가지고 있지만, GVR28은 또한 펩티드가 항균 효과를 발휘할 수 있는 이차 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 조성물은 서열번호: 1 내지 23에 따른 2개 이상의 폴리펩티드를 동일한 용량, 예를 들어 1:1의 비율로 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 대안적으로, 조성물 내 각각의 폴리펩티드는 상이한 용량, 예를 들어 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 0.5:1, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1 또는 1:1(GVR28:SFV33 또는 SFV33:GVR28로서)의 비율로 제1 폴리펩티드가 GVR28(서열번호: 1)이고 제2 폴리펩티드가 SFV33(서열번호: 5)인 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 각각 1:0.9의 비율로 제1 폴리펩티드가 GVR28이고 제2 폴리펩티드가 SFV28인 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 1:1의 비율로 제1 폴리펩티드는 GVR28이고 제2 폴리펩티드는 SFV28인 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 서열번호: 6이 아니다.
본 발명의 예시적인 조성물은 대조군 치료와 비교하여, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드가 존재하지 않는 담체 단독 대조군과 비교하여 개선된 상처 치유를 갖는다. 예를 들어, 조성물의 폴리펩티드의 상처 치유는 담체 단독 대조군의 상처 치유보다 적어도 2-배 더 클 수 있고, 보다 바람직하게는 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 8-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배 또는 적어도 20-배 개선될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "아미노산"은 유전적으로-인코딩된 표준 20개 아미노산 및 (천연 'L' 형태와 비교하여) 'D' 형태인 그의 상응하는 입체이성질체, 오메가-아미노산 기타 자연적으로-발생하는 아미노산, 비통상적 아미노산(예를 들어, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산 등) 및 화학적으로 유도된 아미노산(아래 참조)을 포함한다는 것이 당업계의 통상인에 의해 인지될 것이다.
'알라닌' 또는 'Ala' 또는 'A'와 같이 아미노산이 구체적으로 열거되는 경우, 달리 명시되지 않는 한 이 용어는 L-알라닌과 D-알라닌 둘 모두를 지칭한다. 원하는 기능적 특성이 폴리펩티드에 의해 유지되는 한 다른 비통상적인 아미노산도 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 성분일 수 있다. 제시된 펩티드의 경우, 각각의 인코딩된 아미노산 잔기는 적절한 경우 통상의 아미노산의 관용명에 해당하는 단일 문자 지정에 의해 표시된다.
일 실시형태에서, 제1 양태의 조성물의 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 폴리펩티드 중 적어도 하나는 L-아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
폴리펩티드 중 적어도 하나가 참조 서열(예를 들어, 서열번호: 1 내지 23)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 경우, 그것은 참조 서열의 것을 넘어 그 N- 및/또는 C-말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 그 N-말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드 중 적어도 하나가 참조 서열에 따른 아미노산 서열의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 경우, 그것은 그 N- 및/또는 C-말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있다.
부가하여, 조성물이 콜라겐 유형 VI을 포함하는 경우, 하나 이상의 콜라겐 유형 VI α 사슬은 그 N- 및/또는 C-말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있으며, 예를 들어 폴리펩티드는 그 N-말단에 추가 아미노산을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 참조 서열에 따른 아미노산 서열의 단편(예를 들어, 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나의 단편)을 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 참조 서열의 적어도 5개 인접 아미노산, 예를 들어 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나의, 예를 들어 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 또는 75개 인접하는 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 단편은 서열번호: 6의 단편이 아니다.
제1 양태의 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 참조 서열에 따른 아미노산 서열의 변이체(예를 들어, 임의의 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나의 변이체), 또는 상기 변이체의 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있다는 것이 당업계의 통상인에 의해 인지될 것이다. 이러한 변이체는 비-자연적으로 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체는 서열번호: 6의 변이체가 아니다.
폴리펩티드의 "변이체"로 본 발명자들은 보존적이든 비-보존적이든 삽입, 결실 및 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 치환은 동일한 일반 클래스 내의 아미노산(예를 들어, 산성 아미노산, 염기성 아미노산, 비-극성 아미노산, 극성 아미노산 또는 방향족 아미노산)의 동일한 클래스 내의 다른 아미노산에 의한 치환을 지칭한다. 따라서, 보존적 아미노산 치환 및 비-보존적 아미노산 치환의 의미는 당업계에 잘 알려져 있다. 특히, 본 발명자들은 항균 활성을 나타내고/내거나 상처 치유를 촉진하는 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 상처 치유 (및/또는 항균 활성)를 촉진하는 일차 기능을 갖는 폴리펩티드의 변이체는 상처 치유 (및/또는 항균 활성)를 촉진하는 일차 기능을 유지하는 변이체일 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 변이체가 유래하는 폴리펩티드와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변이체는 변이체가 유래하는 폴리펩티드와 비교하여 증가된 활성을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 변이체는 참조 서열(예를 들어, 서열번호: 1 내지 23)에 따른 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 50% 동일성, 예를 들어 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
조성물 내 임의의 하나 이상의 폴리펩티드는 변이체일 수 있다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드는 서열번호: 1 내지 23에 따른 서열에 상응할 수 있고, 제2 또는 추가 폴리펩티드는 서열번호: 1 내지 23에 따른 서열의 변이체에 상응할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 서열번호: 6 또는 이의 변이체가 아니다.
2개의 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성은 적절한 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 위스콘신 대학 유전자 컴퓨팅 그룹의 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있고 퍼센트 동일성은 그의 서열이 최적으로 정렬된 폴리펩티드와 관련하여 계산된다는 것이 인지될 것이다.
정렬은 대안적으로 Clustal W 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다(본 명세서에 참고로 포함된, Thompson et al., 1994, Nuc. Acid Res. 22:4673-4680에 기술된 바와 같음).
사용되는 매개변수는 다음과 같을 수 있다:
빠른 쌍별 정렬 매개변수: K-튜플(단어) 크기; 1, 윈도우 크기; 5, 갭 페널티; 3, 상단 대각선의 수; 5. 채점 방법: x퍼센트.
다중 정렬 매개변수: 갭 개방 페널티; 10, 갭 확장 페널티; 0.05.
채점 매트릭스: BLOSUM.
대안적으로, BESTFIT 프로그램을 사용하여 국소 서열 정렬을 결정할 수 있다.
예를 들어, 일 실시형태에서, 상기 참조 서열로부터의 아미노산은 예를 들어 I,F에서 W로 변형에 의해 폴리펩티드의 단백질분해적 분해를 감소시키기 위해 돌연변이될 수 있다(본 명세서에 참고로 포함된, Stromstedt et al, Antimicrobial Agents Chemother 2009, 53, 593 참조).
변이체는 재조합 폴리뉴클레오티드를 사용하여 당업계에 잘 알려진 단백질 조작 및 부위-지향된 돌연변이유발의 방법을 사용하여 만들어 질 수 있다(예시로 본 명세서에 참고로 포함된, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edition, Sambrook & Russell, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조).
추가의 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 상기 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호: 1 내지 23) 중 임의의 하나의 종 상동체인 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. "종 상동체"로 본 발명자들은 폴리펩티드가 비-인간 종으로부터의 등가 단백질 내의 동일한 아미노산 서열에 상응한다는 것, 즉 폴리펩티드가 (예를 들어, GAP 또는 BLAST 서열 비교에 의해 측정된 바와 같이) 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나와 최대 서열 동일성을 나타낸다는 것을 포함한다. 전형적으로, 종 상동체 폴리펩티드는 인간 참조 서열(즉, 서열번호: 1 내지 23)과 동일한 길이일 것이다.
또 다른 실시형태에서, 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 융합 단백질을 포함하거나 이로 구성된다.
폴리펩티드의 "융합"으로 본 발명자들은 임의의 다른 폴리펩티드에 융합된 참조 서열(예를 들어, 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나 또는 이의 단편 또는 변이체)에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하기 위해 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 또는 단백질 A와 같은 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이러한 융합의 예는 당업계의 통상인에게 잘 알려져 있다. 유사하게, 상기 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드는 His6과 같은 올리고-히스티딘 태그 또는 잘 알려진 Myc 태그 에피토프와 같은 항체에 의해 인식되는 에피토프에 융합될 수 있다. 부가하여, 소수성 올리고펩티드 말단-태그를 포함하는 융합체가 사용될 수 있다. 상기 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드의 임의의 변이체 또는 유도체에 대한 융합도 또한 발명의 범주에 포함된다. 부가적으로, 발명의 제1 폴리펩티드는 본 발명의 제2 폴리펩티드에 융합될 수 있으며, 선택적으로 여기서 각 폴리펩티드 사이에 링커가 융합된다. 따라서, 예를 들어, 서열번호: 1(또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체)을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드는 서열번호: 5(또는 이의 변이체, 단편 또는 유도체)를 포함하거나 이로 구성된 폴리펩티드에 융합될 수 있거나, 또는 그 반대도 가능하며, 선택적으로 링커는 2개의 폴리펩티드 사이에 존재한다. 항균 활성 및/또는 상처 치유의 촉진과 같은 바람직한 특성을 유지하는 융합(또는 이의 변이체 또는 유도체)이 바람직하다는 것이 인지될 것이다.
융합은 또한 서열번호:1 내지 23 중 임의의 하나 이상에 따른 임의의 다른 하나 이상의 폴리펩티드에 융합된 서열번호:1 내지 23 중 임의의 하나에 따른 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 선택적으로 폴리펩티드는 링커를 통해 융합된다. 일부 실시형태에서, 융합은 다중 폴리펩티드의 것일 수 있지만 콜라겐 VI의 전체 α3 사슬을 초래하지는 않는다. 예를 들어, 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나 이상의 융합 폴리펩티드는 콜라겐 VI의 전체 α3 사슬의 것보다 적은 아미노산 길이의 것일 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 콜라겐 유형 VI의 α3 사슬로부터 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 인접하는 아미노산을 함유하지 않을 수 있다.
융합은 발명의 조성물의 상기 폴리펩티드 중 적어도 하나에 바람직한 특징을 부여하는 추가 부분을 포함할 수 있으며; 예를 들어, 부분은 폴리펩티드 중 적어도 하나를 검출 또는 단리하거나, 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 세포 흡수를 촉진하는데 유용할 수 있다. 부분은 예를 들어 비오틴 모이어티, 스트렙타비딘 모이어티, 방사활성 모이어티, 형광 모이어티, 예를 들어 작은 형광단 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 형광단일 수 있으며, 또한 당업자에게 잘 알려져 있다. 모이어티는 당업자에게 공지된 바와 같은 면역원성 태그, 예를 들어 Myc 태그일 수 있거나, 당업자에게 공지된 바와 같은 폴리펩티드의 세포 흡수를 촉진할 수 있는 친유성 분자 또는 폴리펩티드 도메인일 수 있다.
조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 예를 들어 PEG화, 아미드화, 에스테르화, 아실화, 아세틸화 및/또는 알킬화에 의해 변형되거나 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다는 것이 당업계의 통상인에 의해 인지될 것이다. 모이어티는 FLAG 태그, His 태그, GST 태그, MBP 태그, Trx 태그, NusA 태그, SUMO 태그, SET 태그, DsbC 태그, Skp 태그, T7PK 태그, GB1 태그, ZZ태그, Streptag II, HA 태그, Softag 1, Softag 3, T7 태그, S 태그 및 mCherry 태그로 구성된 군으로부터 선택된 태그일 수 있다.
당업계에서 인식되는 바와 같이, 페길화된 단백질은 감소된 신장 청소율 및 단백질분해, 감소된 독성, 감소된 면역원성 및 증가된 용해도를 나타낼 수 있다[Veronese, F.M. and J.M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 453-6., Chapman, A.P., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 531-45] (본 명세서에 참고로 포함됨). 페길화는 제1 페길화된 분자 아스파라기나제 및 아데노신 데아미나제를 포함한 여러 단백질-기반 약물에 이용되었다[Veronese, F.M. and J.M. Harris, Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 453-6., Veronese, F.M. and G. Pasut, Drug Discov Today, 2005. 10(21): p. 1451-8] (본 명세서에 참고로 포함됨).
최대로 증가된 반감기 및 유지된 생물학적 활성을 갖는, 성공적으로 페길화된 단백질을 수득하기 위해, 결과에 영향을 미칠 수 있는 여러 매개변수가 중요하고 고려되어야 한다. PEG 분자는 다를 수 있고, 단백질의 페길화에 사용된 PEG 변이체는 PEG 및 모노메톡시-PEG를 포함한다. 부가하여, 이들은 선형이거나 분지형일 수 있다[Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70] (본 명세서에 참고로 포함됨). 사용된 PEG 분자의 크기는 다양할 수 있고 1 내지 40kDa 크기 범위인 PEG 모이어티는 단백질에 연결되어 있다[Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70., Sato, H., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 487-504, Bowen, S., et al., Exp Hematol, 1999. 27(3): p. 425-32, Chapman, A.P., et al., Nat Biotechnol, 1999. 17(8): p. 780-3] (본 명세서에 참고로 포함됨). 부가하여, 단백질에 부착된 PEG 모이어티의 수는 다양할 수 있고, 단백질에 부착된 1 내지 6개 PEG 단위의 예가 보고되었다[Wang, Y.S., et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 547-70., Bowen, S., et al., Exp Hematol, 1999. 27(3): p. 425-32] (본 명세서에 참고로 포함됨). 더욱이, 접합을 위한 다양한 반응성기뿐만 아니라 PEG 사이의 링커의 존재 또는 부재가 활용되었다. 따라서, PEG는 N-말단 아미노기, 또는 반응성 아미노 또는 하이드록실기(Lys, His, Ser, Thr 및 Tyr)를 갖는 아미노산 잔기에 직접적으로 또는 γ-아미노 부티르산을 링커로 사용함에 의해 연결될 수 있다. 부가하여, PEG는 카복실(Asp, Glu, C-말단) 또는 설프하이드릴(Cys) 기에 커플링될 수 있다. 마지막으로, Gln 잔기는 PEG의 효소 트랜스글루타미나제 및 알킬아민 유도체를 사용하여 특이적으로 페길화될 수 있다는 것이 기술되었다[Sato, H., Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(4): p. 487-504] (본 명세서에 참고로 포함됨).
페길화의 정도를 증가시키는 것은 증가된 생체내 반감기를 초래하는 것으로 나타났다. 그러나, 페길화 공정은 개별적으로 특정 단백질에 대해 최적화될 필요가 있을 것임이 당업자에 의해 인지될 것이다.
PEG는 본 명세서에 참고로 포함된 WO 2005/007197에 기술된 바와 같이 자연적으로 발생하는 이황화 결합에서 커플링될 수 있다. 이황화 결합은 단백질의 3차 구조를 손상시키지 않는 화학적 가교의 첨가를 통해 안정화될 수 있다. 이것은 이황화 결합을 포함하는 2개 황의 공액 티올 선택성이 PEG의 부위-특이적 부착을 위한 가교를 생성하는데 활용되도록 허용한다. 이에 의해 표적 분자에 대한 부착을 위해 잔류물을 펩티드 안으로 조작할 필요성이 회피된다.
다양한 대안적인 블록 공중합체는 또한 본 명세서에 참고로 포함된 WO 2003/059973에 기재된 바와 같이 공유적으로 접합될 수 있다. 치료적 중합체 접합체는 개선된 열적 특성, 결정화, 접합, 팽윤, 코팅, pH 의존적 형태 및 생체분포를 나타낼 수 있다. 더욱이, 이들은 피노사이토시스에 의한 접합체의 세포 흡수 후 이차 리소좀의 단백질분해 및 산성 환경에서 생물활성물질의 장기간 순환, 방출, 및 큰 분자의 특성(예를 들어, 생물학적 유체에서 증가된 약물 용해도)에 기인한 보다 유리한 물리화학적 특성을 달성할 수 있다. 친수성 및 소수성 블록을 포함하는 블록 공중합체는 용액에서 중합체 미셀을 형성한다. 미셀 해리 시 개별 블록 공중합체 분자는 안전하게 배설된다.
하나 이상의 아미노산의 화학적 유도체는 또한 기능적 측면 기와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유도체화된 분자는 예를 들어 자유 아미노기가 유도체화되어 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 술포닐기, 카르복시벤족시기, t-부틸옥시카르보닐기, 클로로아세틸기 또는 포르밀기를 형성한 이들 분자를 포함한다. 유리 카르복실기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 다른 유형의 에스테르 및 히드라지드를 형성할 수 있다. 유리 하이드록실기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 20가지 표준 아미노산의 자연적으로 발생하는 아미노산 유도체를 함유하는 이들 펩티드도 화학 유도체로 포함된다. 예를 들어: 4-하이드록시프롤린은 프롤린에 대해 치환된 수 있고; 5-하이드록시라이신은 라이신에 대해 치환된 수 있고; 3-메틸히스티딘은 히스티딘에 대해 치환된 수 있고; 호모세린은 세린에 대해 오르니틴은 라이신에 대해 치환된 수 있다. 유도체는 또한 필수 활성이 유지되는 한 하나 이상의 첨가 또는 결실을 함유하는 펩티드를 포함한다. 다른 포함된 변형은 아미드화, 아미노 말단 아실화(예를 들어, 아세틸화 또는 티오글리콜산 아미드화), 말단 카르복실아미드화(예를 들어, 암모니아 또는 메틸아민에 의함) 및 유사 말단 변형이다.
펩티도미메틱 화합물이 또한 유용할 수 있다는 것이 당업계의 통상인에 의해 추가로 인지될 것이다. 따라서, "콜라겐 유형 VI 폴리펩티드"로 본 발명자들은 항균 활성을 갖고/갖거나 상처 치유를 촉진할 수 있는 펩티도미메틱 화합물을 포함한다. 용어 "펩티도미메틱"은 치료제로서 특정 펩티드의 형태 및 바람직한 특징을 모방하는 화합물을 지칭한다.
예를 들어, 발명의 폴리펩티드는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 결합에 의해 연결된 분자뿐만 아니라 펩티드 결합이 역전된 분자도 포함한다. 이러한 레트로-인버소 펩티도미메틱은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된 Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237에 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 이 접근법은 측쇄의 방향이 아니라 백본과 관련된 변화를 함유하는 슈도펩티드를 만드는 것을 포함한다. CO-NH 펩티드 결합 대신 NH-CO 결합을 함유하는 레트로-인버스 펩티드는 단백질 분해에 훨씬 더 저항성이 있다. 대안적으로, 발명의 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 통상적인 아미드 연결 대신에 -y(CH2NH)- 결합에 의해 연결된 펩티도미메틱 화합물일 수 있다.
추가의 대안에서, 아미노산 잔기의 탄소 원자 사이의 이격을 유지하는 적절한 링커 모이어티가 사용된다면 펩티드 결합은 함께 분배될 수 있다; 링커 모이어티가 펩티드 결합과 실질적으로 동일한 전하 분포 및 실질적으로 동일한 평면성을 갖는 것이 유리할 수 있다.
폴리펩티드 중 적어도 하나가 단백질외분해 단리에 대한 감수성을 감소시키는 것을 돕기 위해 그 N- 또는 C-말단 영역에서 편리하게 차단될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
D-아미노산 및 N-메틸 아미노산과 같은 다양한 코딩되지 않은 또는 변형된 아미노산이 또한 포유류 펩티드를 변형시키는데 사용되었다. 부가하여, 추정되는 생물활성 형태는 고리화와 같은 공유 변형에 의해 또는 락탐 또는 다른 유형의 가교의 혼입에 의해 안정화될 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된, Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 및 Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166을 참고한다.
많은 합성 전략 중 공통된 주제는 펩티드-기반된 프레임워크 안으로 일부 고리 모이어티의 도입이었다. 고리 모이어티는 펩티드 구조의 구조적 공간을 제한하고 이는 종종 특정 생물학적 수용체에 대한 펩티드의 증가된 특이성을 초래한다. 이 전략의 추가된 이점은 펩티드 안으로 고리형 모이어티의 도입이 또한 세포 펩티다제에 대한 감소된 민감도를 갖는 펩티드를 초래할 수 있다는 것이다.
따라서, 제1 양태의 조성물의 예시적인 폴리펩티드는 말단 시스테인 아미노산을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 말단 시스테인 아미노산에서 메르캅티드기의 디설파이드 결합 형성에 의해 헤테로데틱 사이클릭 형태로 존재하거나 말단 아미노산 사이의 아미드 펩티드 결합 형성에 의해 호모데틱 형태로 존재할 수 있다. 상기에 지적된 바와 같이, N- 및 C-말단 영역 시스테인 사이의 디설파이드 또는 아미드 결합을 통해 작은 펩티드를 고리화하는 것은 단백질 분해를 감소시키고 또한 구조의 강성을 증가시킴에 의해 선형 펩티드에서 때때로 관찰되는 특이성 및 반감기의 문제를 피할 수 있으며, 이는 더 높은 특이성 화합물을 생성할 수 있다. 이황화 결합에 의해 고리화된 폴리펩티드는 여전히 단백질 분해에 취약할 수 있는 유리 아미노 및 카르복시-말단을 가지는 반면, N-말단 아민과 C-말단 카르복실 사이의 아미드 결합의 형성에 의해 고리화된 펩티드는 따라서 더 이상 유리 아미노 또는 카르복시 말단을 함유하지 않는다. 따라서, 본 발명의 조성물의 펩티드는 C-N 연결 또는 이황화 연결에 의해 연결될 수 있다.
본 발명은 펩티드의 고리화의 방법에 의해 어떤 식으로든 제한되지 않지만, 그의 고리 구조가 임의의 적합한 합성 방법에 의해 달성될 수 있는 펩티드를 포괄한다. 따라서, 헤테로데틱 연결은 디설파이드, 알킬렌 또는 설파이드 가교를 통한 형성을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 디설파이드, 설파이드 및 알킬렌 가교를 포함하는 사이클릭 호모데틱 펩티드 및 사이클릭 헤테로데틱 펩티드의 합성 방법은 본 명세서에 참고로 포함된 US 5,643,872에 개시되어 있다. 고리화 방법의 다른 예는 클릭 화학, 에폭사이드, 알데하이드-아민 반응을 통한 고리화 뿐만 아니라 본 명세서에 참고로 포함된 US 6,008,058에 개시된 방법을 포함한다.
사이클릭 안정화된 펩티도미메틱 화합물의 합성에 대한 추가 접근법은 폐환 복분해(RCM)이다. 이 방법은 펩티드 전구체를 합성하고 그것을 RCM 촉매와 접촉시켜 형태적으로 제한된 펩티드를 생성하는 단계를 포함한다. 적합한 펩티드 전구체는 2개 이상의 불포화된 C-C 결합을 함유할 수 있다. 방법은 고체-상-펩티드-합성 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이 실시형태에서, 고형 지지체에 고정된 전구체는 RCM 촉매와 접촉되고 그 다음 생성물이 고형 지지체로부터 절단되어 형태적으로 제한된 펩티드를 생성한다.
본 명세서에 참고로 포함된 D. H. Rich in Protease Inhibitors, Barrett and Selveson, eds., Elsevier (1986)에 의해 개시된 또 다른 접근법은 효소 억제제 설계에서 전이 상태 유사체 개념의 적용을 통해 펩티드 모방체를 설계하는 것이었다. 예를 들어, 스탈린의 2차 알코올은 펩신 기질의 자를 수 있는 아미드 결합의 사면체 전이 상태를 모방하는 것으로 알려져 있다.
요약하면, 말단 변형은 잘 알려진 바와 같이 프로테아제 단리에 의한 감수성을 감소시키고 따라서 용액, 특히 프로테아제가 존재할 수 있는 생물학적 유체에서 펩티드의 반감기를 연장하는데 유용하다. 폴리펩티드 고리화는 또한 고리화에 의해 형성된 안정한 구조 때문에 그리고 고리형 펩티드에 대해 관찰된 생물학적 활성의 관점에서 유용한 변형이다.
따라서, 일 실시형태에서 발명의 제1 양태의 조성물의 폴리펩티드 중 적어도 하나는 선형이다. 그러나, 대안적인 실시형태에서, 폴리펩티드는 고리형이다.
발명의 조성물의 폴리펩티드는 다양한 길이의 것일 수 있다는 것이 당업계의 통상인에 의해 인지될 것이다. 그러나, 전형적으로 폴리펩티드는 길이가 10 내지 200개 아미노산, 예를 들어 길이가 10 내지 150개, 15 내지 100개, 15 내지 50개, 20 내지 40개, 25 내지 35개, 또는 28 내지 33개 아미노산이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 길이가 적어도 20개 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드 중 적어도 하나는 길이가 적어도 28개 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드 중 적어도 하나는 길이가 최대 76개 아미노산, 예를 들어 길이가 최대 36개 또는 33개 아미노산일 수 있다.
따라서, 발명의 일 실시형태에서, 발명의 조성물의 폴리펩티드는 더 긴 아미노산 서열의 일부로서 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나의 특정 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 길이가 최대 25, 28, 30, 33, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 아미노산인 아미노산 서열의 일부로서 서열번호: 1 내지 23(또는 이의 변이체 또는 단편) 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 추가의 예에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 서열번호: 1 내지 23(또는 이의 변이체 또는 단편) 중 임의의 하나를 포함할 수 있으며, 여기서 폴리펩티드는 길이가 10 내지 200개 아미노산, 예를 들어 길이가 20 내지 200개, 28 내지 200개, 33 내지 200개, 28 내지 150개, 33 내지 150개, 28 내지 100개, 33 내지 100개, 28 내지 50개, 33 내지 50개, 28 내지 40개, 33 내지 40개, 또는 28 내지 33개 아미노산이다.
일 실시형태에서, 조성물의 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나는 재조합 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 이러한 재조합 폴리펩티드의 생산에 적합한 방법은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서의 발현과 같이 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어 Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York을 참고하며, 그 문서에 관련된 개시내용은 참고로 본 명세서에 포함된다).
발명의 조성물의 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드는 또한 토끼 망상적혈구 용리물 또는 밀배아 용리물(Promega로부터 이용가능)과 같은 상업적으로 이용가능한 시험관내 번역 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 바람직하게는, 번역 시스템은 토끼 망상적혈구 용리물이다. 편리하게, 번역 시스템은 TNT 전사-번역 시스템(Promega)과 같은 전사 시스템에 커플링될 수 있다. 이 시스템은 번역과 동일한 반응에서 인코딩 DNA 폴리뉴클레오티드로부터 적합한 mRNA 전사물을 생산하는 이점을 갖는다.
발명의 조성물의 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드는 대안적으로 예를 들어 잘 알려진 액체-상 또는 고체 상 합성 기술(예컨대 t-Boc 또는 Fmoc 고체-상 펩티드 합성)을 사용하여 인공적으로 합성될 수 있다는 것이 당업계에서 통상인에 의해 인지될 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 본 명세서에 참고로 포함된 Solid-Phase Peptide Synthesis (1997) Fields, Abelson & Simon (Eds), Academic Press (ISBN: 0-12-182190-0)에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다.
일 실시형태에서, 조성물은 폴리라이신을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 폴리라이신을 포함하지 않는다. 적합한 폴리라이신 성분은 PCT/EP2020/068047에 추가로 정의되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "폴리라이신"은 바람직하게는 펩티드 결합에 의해 조합된 라이신 단량체 단위의 중합체인 임의의 화합물을 포함한다. 예를 들어, 폴리라이신은 ε 또는 α 탄소 위치에서 중합화에 의해 함께 조합된 3개 이상의 라이신 잔기를 포함하거나 이들로 구성된 임의의 화합물을 포함할 수 있다.
"중합체"로 본 발명자들은 화학 결합에 의해 함께 조합된 다중 단량체 단위로 구성된 물질을 의미한다. 중합체는 중합되는 분자의 유형과 중합의 위치에 따라 분자의 선형 사슬 또는 3차원 네트워크를 형성할 수 있다.
"중합"으로 본 발명자들은 다중 단량체 단위가 화학 결합을 형성하여 선형 중합체 사슬 또는 분자의 3-차원 네트워크의 형성을 초래하는 중합체를 형성하는데 사용되는 과정을 지칭한다. 본 명세서에 기술된 라이신과 같은 아미노산의 중합의 경우에, 중합은 아미노기와 카르복실산기의 반응에 의해 아미노산 단량체 사이의 펩티드 결합의 형성을 수반한다. 펩티드 결합의 형성은 당업계에 잘 알려진 과정이다.
폴리라이신은 사용된 라이신의 거울상이성질체(즉, L 또는 D 라이신)와 중합의 탄소 위치(즉, α 또는 ε) 둘 모두에서 상이할 수 있다.
라이신은 L- 및 D-형으로 명명되는 키랄 중심 주변의 R-기의 배열에서 상이한 2가지 다른 거울상이성질체로 발견된다. 거울상이성질체를 명명하는 다른 형태가 당업계에서 사용되지만(예를 들어 R 및 S 표기법, 여기서 S-라이신은 L-라이신에 해당하고 R-라이신은 D-라이신에 해당함), L/D 표기법은 아미노산과 관련하여 가장 일반적으로 사용되고 있다. L- 및 D-아미노산 사이의 차이는 당업계에 잘 알려져 있다.
발명의 폴리라이신은 L-라이신 및 D-라이신 단량체 단위 둘 모두를 포함하거나 이로 구성된 중합체를 포함할 수 있거나, 단지 L-라이신 또는 단지 D-라이신 단량체 단위를 포함하거나 이로 구성될 수 있으며 이 경우에 중합체는 폴리-L-라이신(PLL) 및 폴리-D-라이신(PDL)으로 각각 명명된다.
일 실시형태에서 폴리라이신은 폴리-L-라이신(PDL) 및/또는 폴리-D-라이신(PLL)을 포함하거나 이로 구성된다.
PLL/PDL과 같은 광학 이성질체는 평면-편광(단일 평면에서 이동하는 광)에 대해 서로 다른 영향을 미친다. 일 이성질체는 이 평면-편광의 평면을 시계 방향으로 회전할 것이고 다른 이성질체는 반시계 방향으로 회전할 것이다. 이것이 이성체를 서로 구별할 수 있는 방법이다.
추가의 실시형태에서, 폴리라이신은 폴리-L-라이신을 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 여기서 폴리라이신을 구성하는 단량체 단위의 100%는 L-라이신이다.
또 다른 실시형태에서, 폴리라이신은 폴리-D-라이신을 포함하거나 이로 구성되며, 선택적으로 여기서 폴리라이신을 구성하는 단량체 단위의 100%는 D-라이신이다.
PLL과 PDL의 호환성은 그들 둘 모두 동일한 전하-관련된 특성을 갖기 때문에 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Banker, G. and Goslin, K., Culturing Nerve Cells, MIT Press, Cambridge, p. 65 (1991)를 참고한다.
일 실시형태에서, 폴리라이신은 L-라이신 및 D-라이신 단량체 단위의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 라이신 단량체의 50%는 L-라이신일 수 있고 50%는 D-라이신일 수 있거나, D-라이신:L-라이신의 대안적인 비율, 예를 들어: 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50; 40:60; 30:70; 20:80; 10:90이 사용될 수 있다.
라이신의 R-기는 또한 아미노기(CH2CH2CH2CH2NH2)를 함유하므로, α 탄소 또는 ε 탄소를 수반하는 2가지 가능한 중합 위치가 있다. "α 탄소"로 본 발명자들은 아민 및 카르복실산기 둘 모두가 부착된 아미노산의 백본에서의 탄소 원자를 의미한다. 그런 다음 라이신 R 기에서 탄소 원자는 순차적으로 표지된다(즉, α 탄소에 부착된 R 기의 첫 번째 탄소는 β 탄소로 명명되며, 탄소 사슬에서 각각 γ 탄소, δ 탄소 및 ε 탄소 원자가 뒤따른다). 따라서 "ε 탄소"로 본 발명자들은 아민기가 부착된 라이신 R 기의 말단 탄소를 의미한다.
일 실시형태에서, 발명의 조성물의 폴리라이신은 ε 탄소 위치에서 중합된다. 대안적인 실시형태에서, 폴리라이신은 α 탄소 위치에서 중합된다.
일 실시형태에서, 중합의 100%가 ε 탄소 위치에서 일어난다. 대안적인 실시형태에서, 폴리라이신은 동일한 분자 내의 α 및 ε 위치 둘 모두에서 중합된 라이신 단량체 단위를 포함하며, 예를 들어 중합의 50%는 라이신 단량체 단위의 α 위치에서 일어날 수 있고 중합의 50%는 ε 위치에서 일어날 수 있다. α 또는 ε 위치에서의 중합은 다른 비율, 예를 들어 다음 비율의 α:ε 중합 위치: 100:0; 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50; 40:60; 30:70; 20:80; 10:90; 0:100에서 발생할 수도 있다.
조성물의 폴리라이신은 상이한 유형의 폴리라이신의 혼합물일 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 다음 중 임의의 하나의 조합을 포함할 수 있다: ε 폴리-L-라이신; α 폴리-L-라이신; ε 폴리-D-라이신; α 폴리-D-라이신. 상이한 형태의 폴리라이신은 조성물 내에서 상이한 비율로 발견될 수 있으며, 이는 해당 표면에 대한 폴리펩티드의 최적 결합을 달성하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 조성물은 50% ε 폴리-L-라이신 및 50% ε 폴리-D-라이신을 포함할 수 있다. 조성물은 폴리라이신의 모든 4가지 변이체를 동일하거나 동일하지 않은 양으로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 폴리라이신은 폴리-L-라이신(PLL)이고 라이신 단량체의 ε 위치에서 중합된다.
특정 실시형태에서 폴리라이신은 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리라이신을 구성하는 어느 하나의 라이신 단량체는 중합 이전에 변형될 수 있거나 폴리라이신 자체는 중합 후에 변형될 수 있다.
폴리라이신 분자는 그 분자량이 다를 수 있는 중합체이다. 상업적으로 이용가능한 형태의 폴리라이신은 종종 단일 분자량보다는 분자량의 범위의 중합체를 포함하는 조성물로 발견된다. 전형적으로, 중합체의 분자량의 이 범위는 30,000Da 내지 300,000Da이다.
특정 실시형태에서, 발명의 조성물의 폴리라이신은 30,000Da 내지 300,000Da 범위인 분자량을 갖는다. 다른 실시형태에서, 폴리라이신은 50,000-250,000Da; 70,000-200,000Da; 또는 100,000-150,000Da 범위인 분자량을 갖는다. 일 실시형태에서, 폴리라이신 분자는 30,000 내지 70,000Da 범위인 분자량을 갖는다. 일 실시형태에서, 폴리라이신은 폴리-L-라이신이고 폴리-L-라이신 분자는 30,000 내지 70,000Da 범위인 분자량을 갖는다.
폴리라이신은 또한 함께 중합되는 라이신 단량체 단위의 수의 관점에서 분류될 수 있다. 라이신의 분자량은 대략적으로 146Da이므로, 분자량 범위 30,000Da 내지 300,000Da인 폴리라이신의 중합체는 대략적으로 200 내지 2054개 라이신 단량체 단위로 구성된다. 따라서 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 폴리라이신은 200 내지 2054개 라이신 단량체 단위로 구성된다. 다른 실시형태에서, 폴리라이신은 폴리-L-라이신이고 분자는 200 내지 2054개 L-라이신 단량체 단위로 구성된다.
조성물에서 폴리라이신 분자의 분자량의 범위를 변화시키면 각각의 중합체 분자를 구성하는 라이신 잔기의 수가 변경된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물의 폴리라이신 분자는 342-1712개 라이신 단량체; 479-1369개 라이신 단량체 단위; 684-1027개 라이신 단량체 단위로 구성된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 폴리라이신 분자는 30,000 내지 70,000Da의 분자량 범위에 상응하는 200 내지 480개 라이신 단량체 단위로 구성된다. 다른 실시형태에서, 폴리라이신은 폴리-L-라이신이고 분자는 200 내지 480개 라이신 단량체 단위로 구성된다.
추가 실시형태에서, 조성물은 생물학적 및/또는 생분해성 물질과 같은 스캐폴드 물질을 추가로 포함할 수 있다. 스캐폴드 물질은 콜라겐, 예를 들어 콜라겐 I을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 콜라겐은 다른 단백질, 다당류 및/또는 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 소 콜라겐 I로부터 제조된다. 일부 실시형태에서, 스캐폴드는 폴리라이신을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서 스캐폴드 물질은 소 천연 콜라겐 I 원섬유를 포함한다.
스캐폴드를 포함하는 조성물은 그 자체로 스캐폴드로 해석될 수 있다. 따라서, 추가 실시형태에서, 조성물을 포함하는 스캐폴드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 용도를 위한 것일 수 있다. 이러한 스캐폴드는 의료 장치일 수 있다. 스캐폴드는 본 발명의 이펙터 분자(즉, 펩티드)에 대한 담체일 수 있다.
본 명세서에 기술된 조성물은 임상 의학 및/또는 수의학에 사용하기 위해 제형화될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
따라서, 본 발명의 제2 양태는 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 담체, 완충제 또는 보조제와 함께 발명의 제1 양태에 따른 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 추가의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 개별 펩티드는 서로에 대해 순차적으로, 후속적으로 및/또는 동시에 공동-투여를 위한 별개의 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적 조성물"은 미생물 및 세균의 감염과 연관된 장애 및 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료학적으로 효과적인 제형을 의미한다.
다른 펩티드, 저분자량 면역조절제, 수용체 작용제 및 길항제, 및 항균제와 같은 추가 화합물이 또한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 다른 예는 EDTA, 시트레이트, EGTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제를 포함한다.
약학적 조성물은 충분하게 저장 안정성이 있고 인간 및 동물에 대한 투여에 적합한 당업계에 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약학적 조성물은 예를 들어 동결 건조, 분무 건조, 분무 냉각을 통해, 또는 초임계 입자 형성으로부터 입자 형성의 사용을 통해 동결건조될 수 있다.
"약학적으로 허용가능한"으로 본 발명자들은 활성 성분, 즉 조성물의 항균성 폴리펩티드(들)의 생물학적 활성의 유효성을 감소시키지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 이러한 약학적으로 허용가능한 완충제, 담체 또는 부형제는 당업계에 잘 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) 및 handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)를 참조하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).
용어 "완충제"는 pH를 안정화할 목적으로 산-염기 혼합물을 함유하는 수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 완충제의 예는 Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글리신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제"는 약학적 제제에서 펩티드를 희석할 목적으로 수성 또는 비-수성 용액을 의미하는 것으로 의도된다. 희석제는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예컨대 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름) 중 하나 이상일 수 있다.
용어 "보조제"는 조성물의 펩티드의 생물학적 효과를 증가시키기 위해 제형에 첨가되는 임의의 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 보조제는 하나 이상의 콜로이드성 은, 또는 아연, 상이한 음이온을 갖는 구리 또는 은 염, 예를 들어, 비제한적으로, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 티오시아네이트, 설파이트, 하이드록사이드, 포스페이트, 카보네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 시트ㅡ레이트, 보레이트, 타르트레이트 및 다른 아실 조성의 아세테이트일 수 있다. 보조제는 또한 양이온성 중합체 예컨대 PHMB, 양이온성 셀룰로스 에테르, 양이온성 셀룰로스 에스테르, 탈아세틸화된 히알루론산, 키토산, 양이온성 덴드리머, 양이온성 합성 중합체 예컨대 폴리(비닐 이미다졸), 및 양이온성 폴리펩티드 예컨대 폴리히스티딘, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 및 이들 아미노산을 함유하는 펩티드일 수 있다.
부형제는 탄수화물, 중합체, 지질 및 미네랄 중 하나 이상일 수 있다. 탄수화물의 예는, 예를 들어, 동결건조를 용이하게 하기 위해 조성물에 첨가되는, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 사이클로덱스트린을 포함한다. 중합체의 예는 전분, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 프로필 셀룰로오스, 알기네이트, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리술포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알콜/폴리비닐아세테이트, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 또는 다양한 조성을 갖는 이의 공중합체, 및 폴리비닐피롤리돈으로, 모두 상이한 분자량의 것이며 이는, 예를 들어 점도 조절을 위해, 생체접착을 달성하기 위해 또는 활성 성분(A-C에도 적용)을 화학적 및 단백질분해적 분해로부터 보호하기 위해 조성물에 첨가된다. 지질의 예는 지방산, 인지질, 모노-, 디- 및 트리글리세리드, 세라마이드, 스핑고지질 및 당지질로, 모두는 상이한 아실 사슬 길이 및 포화도를 가짐, 계란 레시틴, 대두 레시틴, 경화 계란 및 대두 레시틴이며, 이는 중합체에 대한 것과 유사한 이유로 조성에 첨가된다. 미네랄의 예는 활석, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티타늄이며, 이는 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 이점을 얻기 위해 조성물에 첨가된다.
약학적 조성물은 또한 하나 이상의 단당류 또는 이당류 예컨대 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 락티올, 이소말트, 말티톨 또는 자일로시드, 및/또는 모노아실글리세롤 예컨대 모노라우린을 함유할 수 있다. 담체의 특성은 투여의 경로에 의존한다. 투여의 일 경로는 국소 투여이다. 예를 들어, 국소 투여의 경우 바람직한 담체는 활성 펩티드를 포함하는 유화 크림이지만 특정 바셀린/미네랄-기반 및 식물성-기반 연고와 같은 다른 일반적인 담체뿐만 아니라 중합체 겔, 액정상 및 마이크로에멀젼이 사용될 수 있다.
약학적 조성물은 제1 양태의 조성물의 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 상이한 펩티드 및/또는 상기 펩티드의 상이한 단편, 변이체 또는 유도체를 포함할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 제1 양태의 조성물은 서열번호:1 내지 23 중 임의의 하나에 따른 폴리펩티드, 및 상기 서열번호:1 내지 23의 폴리펩티드 단편, 변이체 및/또는 유도체를 포함할 수 있다. 다른 펩티드의 조합을 사용함에 의해, 상처 치유의 촉진 및/또는 항균 효과가 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호: 6에 상응하는 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
상기 논의된 바와 같이, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 염, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 브롬화수소산, 인산, 과염소산, 티오시안산, 붕산 등과 같은 무기산과의 산 부가물, 또는 포름산, 아세트산, 할로아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 글루콘산, 락트산, 말론산, 푸마르산, 안트라닐산, 벤조산, 신남산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산, 술파닐산 등과 같은 유기산과의 산 부가물로서 제공될 수 있다. 1가 나트륨, 칼륨 또는 2가 아연, 마그네슘, 구리 칼슘과 같은 무기염은 모두 상응하는 음이온을 가지며, 항균제 조성물의 생물학적 활성을 개선하기 위해 첨가될 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 또한 폴리펩티드가, 다른 약학적으로 허용가능한 담체에 부가하여, 미셀, 불용성 단층 및 액정으로서 응집된 형태로 존재하는 지질과 같은 양친매성 제제와 조합된 리포솜의 형태일 수 있다. 리포솜 제형에 적합한 지질은 제한 없이 모노글리세리드, 디글리세리드, 술파티드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 적합한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 연장하기 위해 극성 헤드기에서 폴리(에틸렌 글리콜)에 의해 변형된 상기 지질을 포함한다. 이러한 리포좀 제형의 제조는 예를 들어 본 명세서에 참고로 포함된 US 4,235,871에서 찾아볼 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 또한 생분해성 마이크로스피어의 형태일 수 있다. 폴리(락트산)(PLA), 폴리(글리콜산)(PGA), PLA와 PGA의 공중합체(PLGA) 또는 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리무수물과 같은 지방족 폴리에스테르가 마이크로스피어의 생산에서 생분해성 중합체로 널리 사용되어 왔다. 이러한 마이크로스피어의 제조는 본 명세서에 참고로 포함된 US 5,851,451 및 EP 213 303에서 찾아볼 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 또한 계면활성제 및 블록 공중합체, 바람직하게는 혈류 순환 시간을 연장하기 위한 폴리(에틸렌 옥사이드) 모이어티를 함유하는 것들에 의해 형성된 미셀 시스템으로 제형화될 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 또한 중합체 겔의 형태일 수 있으며, 여기서 중합체 예컨대 전분, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 프로필 셀룰로스, 알기네이트, 키토산, 카라기난, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글리콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌-옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트, 및 폴리비닐피롤리돈이 펩티드를 함유하는 용액을 증점시키는데 사용된다. 중합체는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
대안적으로, 조성물의 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올 또는 오일(예를 들어 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참기름), 트래거캔스 검, 및 /또는 다양한 완충액에 용해될 수 있다.
약학적 조성물은 또한 항균성 폴리펩티드의 작용 강화 및/또는 상처 치유 폴리펩티드의 작용 강화를 위한 이온 및 정의된 pH를 포함할 수 있다.
발명의 상기 조성물은 멸균과 같은 통상적인 약학적 활동에 적용될 수 있고/있거나 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에 개시된 바와 같이 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 완충제, 충전제 등과 같은 통상적인 보조제를 함유할 수 있다.
발명의 약학적 조성물이 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다는 것이 당업계에서 통상인에 의해 인지될 것이다. 투여의 경로는 국소(예를 들어, 안과), 안구, 비강, 폐, 협측, 비경구(정맥내, 피하 및 근육내), 경구, 질 및 직장을 포함한다. 또한, 임플란트로부터 투여가 가능하다. 적합한 제제 형태는, 예를 들어 과립, 분말, 정제, 코팅된 정제, (마이크로) 캡슐, 좌약, 시럽, 에멀젼, 마이크로에멀젼으로, 물, 오일 및 계면활성제로 구성된 광학적으로 등방성 열역학적으로 안정한 시스템으로 정의되는 것, 액정상으로, 짧은-범위의 무질서이지만 긴-범위 질서를 특징으로 하는 시스템(예는 라멜라, 육각형 및 입방체 상, 물- 또는 오일 연속을 포함함)으로 정의되는 것, 또는 그의 분산된 대응물, 겔, 연고, 분산액, 현탁액, 크림, 에어로졸, 액적 또는 앰플 형태인 주사가능한 용액 및 또한 활성 화합물의 장기간 방출을 갖는 제제이며, 그의 제제에서 부형제, 희석제, 보조제 또는 담체는 통상적으로 상기에 기재된 바와 같이 사용된다. 약학적 조성물은 또한 붕대, 고약 또는 봉합사 등에 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 경구 투여, 비경구 투여 또는 국소 투여에 적합하다. 예를 들어, 약학적 조성물은 국소 투여(예를 들어, 스프레이, 로션, 페이스트 또는 점적제 등의 형태의 안과 투여)에 적합할 수 있다.
약학적 조성물은 약학적으로 유효한 용량에서 환자에게 투여될 것이다. "약학적으로 유효한 용량"은 그것이 투여되는 병태와 관련하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 용량을 의미한다. 정확한 용량은 화합물의 활성, 투여의 방식, 장애의 특성 및 중증도, 다른 용량이 요구될 수 있는 환자의 연령 및 체중에 의존한다. 용량의 투여는 개별 용량 단위 또는 여러 개의 더 작은 용량 단위의 형태에서 단일 투여 및 특정 간격으로 세분된 용량의 다중 투여 둘 모두에 의해 수행될 수 있다.
발명의 약학적 조성물은 단독으로 또는 추가의 항생제, 항-염증제, 면역억제제, 혈관작용제 및/또는 방부제(예컨대 항-박테리아제, 항-진균제, 항-바이러스제, 및 항-기생충제)와 같은 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 적합한 추가 항생제의 예는 페니실린, 세팔로스포린, 카르바세펨, 세파마이신, 카르바페넴, 모노박탐, 아미노글리코시드, 글리코펩티드, 퀴놀론, 테트라사이클린, 마크로라이드 및 플루오로퀴놀론을 포함한다. 방부제는 요오드, 은, 구리, 클로르헥시딘, 폴리헥사니드 및 기타 비구아니드, 키토산, 아세트산 및 과산화수소를 포함한다. 마찬가지로, 약학적 조성물은 또한 스테로이드 및 마크로락탐 유도체와 같은 항-염증 약물을 함유할 수 있다.
이러한 추가의 치료제는 동일한 약학적 조성물의 일부로 포함될 수 있거나 별도로 투여될 수 있다. 추가의 치료제는 제2 양태의 약학적 조성물의 투여 전, 후 또는 도중에 동시에, 순차적으로 및/또는 별도로 투여될 수 있다.
발명의 조성물 또는 이의 약학적 조성물은 미생물 제제에 의한 감염의 위험과 연관하여 인간 또는 동물 신체에 이식 또는 적용되는 의료 장치 및 기타 생성물에 적용될 수 있고/있거나 발명의 조성물 또는 이의 약학적 조성물은 상처 치유를 촉진할 필요성과 연관하여 인간 또는 동물 신체에 이식 또는 적용되는 의료 장치 및 기타 생성물에 적용될 수 있다는 것이 당업계에서 통상인에 의해 인지될 것이다.
따라서, 발명의 제3 양태는 발명의 제1 양태에 따른 조성물 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물로 코팅되거나, 함침되거나, 혼합되거나, 그렇지 않으면 회합되는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제공한다.
이러한 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 인체 또는 이의 구성요소(예를 들어, 혈액)와 접촉할 수 있다.
일 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 바이-패스 수술, 체외 순환, 상처 케어 및/또는 투석에 사용하기 위한 것이다.
조성물은 봉합사, 보철물, 임플란트, 상처 드레싱, 카테터, 렌즈, 피부 이식편, 피부 대용물, 피브린 글루 또는 붕대 등으로 코팅, 도장, 분무되거나 또는 그렇지 않으면 적용되거나 혼합될 수 있다. 그렇게 함으로, 조성물은 장치 또는 물질에 개선된 항균 및/또는 상처 치유 특성을 부여할 수 있다.
"임플란트"로 본 발명자들은 하기를 포함한다:
(a) 카테터(예를 들어, 혈관내 또는 요로용);
(b) 스텐트(예를 들어, 관상동맥 스텐트);
(c) 단락(예를 들어, 뇌척수 단락);
(d) 삽관 또는 기관절개관;
(e) 안과용 장치(예를 들어, 콘택트 렌즈, 공막 버클 및 안내 렌즈);
(f) 관절 보철물(예를 들어, 관절성형술 및 기타 정형외과 장치의 임플란트);
(g) 인공 심장 판막;
(h) 유방 삽입물;
(i) 이식가능한 약물 전달 장치(예를 들어, 능동 펌프 및 수동 고형 임플란트).
일부 바람직한 실시형태에서, 임플란트는 보철물 또는 기타 정형외과 장치이다. 일부 바람직한 실시형태에서, 보철물은 무릎 관절 보철물이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 보철물은 고관절 보철물이다. 이러한 임플란트의 추가 예는 당업계에 잘 알려져 있다. 추가의 바람직한 실시형태에서 임플란트는 티타늄 또는 티타늄 합금 및/또는 하나 이상의 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성된 보철물 또는 기타 정형외과 장치이다. 일 실시형태에서, 보철물 또는 기타 정형외과 장치는 티타늄 또는 티타늄 합금, 및/또는 하나 이상의 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성되고, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 조성물 또는 약학적 조성물로 코팅된다.
다른 실시형태에서, 임플란트는 뼈 대체 장치, 뼈 고정화 장치, 골판, 인공 고관절의 스템, 인공 장기, 인공 추간판, 척추 막대, 악안면 판, 스텐트 이식편, 경피 장치 및 심박조율기로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 이들 임플란트는 티타늄 또는 티타늄 합금, 및/또는 하나 이상의 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성된다. 추가 실시형태에서, 임플란트는 티타늄 또는 티타늄 합금, 및/또는 하나 이상의 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성되고, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 조성물 또는 약학적 조성물로 코팅된다.
일 실시형태에서, 장치 또는 물질은 발명의 조성물 또는 약학적 조성물(또는 이의 폴리펩티드 성분 중 적어도 하나)로 코팅된다. '코팅된'으로 본 발명자들은 조성물 또는 약학적 조성물이 장치 또는 물질의 표면에 적용됨을 의미한다. 따라서, 장치 또는 물질은 발명의 조성물 또는 약학적 조성물(또는 이의 폴리펩티드 중 적어도 하나)을 포함하는 용액으로 도장되거나 분무될 수 있다. 대안적으로, 장치 또는 물질은 발명의 조성물 또는 약학적 조성물을 포함하는 용액의 저장소에 침지될 수 있다.
일 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 본 명세서에 정의된 바와 같은 조성물 또는 약학적 조성물로 코팅된다.
대안적인 실시형태에서, 장치 또는 물질은 발명의 약학적 조성물(또는 콜라겐 VI 또는 이의 폴리펩티드 중 적어도 하나)로 함침된다. '함침'으로 본 발명자들은 약학적 조성물이 전체에 분포되도록 장치 또는 물질과 통합되거나 그렇지 않으면 혼합되는 것을 의미한다.
예를 들어, 장치 또는 물질은 발명의 조성물 또는 약학적 조성물을 포함하는 용액에서 4℃에서 밤새 인큐베이션될 수 있다. 대안적으로, 발명의 조성물 또는 약학적 조성물은 증발에 의해 또는 실온에서 인큐베이션에 의해 장치 또는 물질 표면 상에 고정화될 수 있다. 추가의 대안으로서, 발명의 조성물 또는 약학적 조성물(또는, 실제로 폴리펩티드)은 장치 또는 물질 표면 상에 고정화될 수 있는 반면 추가 조성물 또는 약학적 조성물은 그렇지 않다. 조성물, 약학적 조성물 및/또는 폴리펩티드가 별도로 투여되는 경우(예를 들어, 하나는 고정화되고 다른 하나는 아님), 이들의 투여는 각각(또는 2개 초과인 경우 모두)을 숙주 생체접합물질 계면에 공동으로 노출시키는 방식일 수 있다.
추가의 대안적인 실시형태에서, 발명의 조성물의 폴리펩티드는 장치 또는 물질, 예를 들어 장치 또는 물질의 외부 표면에 공유적으로 연결된다. 따라서, 공유 결합은 폴리펩티드의 적절한 관능기와 장치 또는 물질 상의 관능기 사이에 형성된다. 예를 들어, 중합체 지지체에 대한 폴리펩티드의 공유 결합을 위한 방법은 펩티드 연결의 형성에 의한, 결합 단백질 상의 페놀, 아민 및 설프하이드릴 기의 알킬화에 의한, 다관능성 중간체, 예를 들어 글루타르디알데히드를 사용함에 의한 디아조늄 중간체를 통한 공유 연결, 및 기타 여러가지 방법 예를 들어, 디알콕시실란과 트리알콕시실란의 반응이 많은 상이한 관능기를 갖는 유리 표면의 유도체화를 허용하는 실릴화된 유리 또는 석영을 사용하는 것을 포함한다. 자세한 내용은 참고로 본 명세서에 포함된 Enzyme immobilisation by Griffin, M., Hammonds, E.J. and Leach, C.K. (1993) In Technological Applications of Biocatalysts (BIOTOL SERIES), pp. 75-118, Butterworth-Heinemann을 참고한다. 또한 본 명세서에 참고로 포함된, 'Biomaterials in Tissue Engineering' by Hubbell, J.A. (1995) Science 13:565-576이라는 표제의 리뷰 기사도 참조한다.
일 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 물질은 중합체를 포함하거나 이로 구성된다. 적합한 중합체는 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락트산, 폴리글리콜산 또는 다양한 조성의 폴리락트산-글리콜산 공중합체), 폴리오르소에스테르, 폴리아세탈, 폴리우레아, 폴리카보네이트, 폴리우레탄, 폴리아미드) 및 다당류 물질(예를 들어, 가교된 알기네이트, 히알루론산, 카라기난, 젤라틴, 전분, 셀룰로오스 유도체)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 물질은 금속(예를 들어, 티타늄, 스테인리스 스틸, 금, 티타늄), 금속 산화물(산화규소, 산화티타늄) 및/또는 세라믹(인회석, 하이드록시아파타이트) 또는 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다
일 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 티타늄을 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 하나 이상의 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성된다.
"티타늄을 포함하거나 이로 구성된다"로 본 발명자들은 순수 티타늄으로만 만들어진 물질과 또한 다른 요소와 조합하여 티타늄을 포함하는 물질을 포함한다. 예를 들어, "티타늄을 포함하거나 이로 구성된다"로 본 발명자들은 또한 티타늄 합금(예를 들어, 티타늄과 니켈, 바나듐 및/또는 알루미늄의 합금)이거나 이를 포함하는 물질을 포함한다. 본 발명자들은 또한 티타늄 및/또는 하나 이상의 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된 적어도 하나의 성분을 갖는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 물질을 포함한다. 본 발명자들은 또한 티타늄을 포함하거나 이로 구성된 코팅, 예를 들어 티타늄 또는 질화티타늄을 포함하거나 이로 구성된 코팅을 갖는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 이에 사용하기 위한 물질을 포함한다. 따라서 본 명세서에서 티타늄의 언급은 또한 티타늄 합금에 대한 언급을 포함하는 것으로 의도된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
따라서, 일 실시형태에서 티타늄은 상업적으로 순수한 티타늄(CP Ti)이다. 대안적으로, 특정 실시형태에서 티타늄은 합금, 예를 들어 Ti6Al4V 합금 또는 니켈-티타늄 합금(니티놀)이다.
"하나 이상의 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성된다"로 본 발명자들은 세라믹 복합재로만 만들어진 물질과 또한 다른 요소와 조합하여 세라믹 복합재를 포함하는 물질을 포함한다. 본 발명자들은 또한 하나 이상의 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성되는 적어도 하나의 성분을 갖는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 이에 사용하기 위한 물질을 포함한다. 본 발명자들은 또한 하나 이상의 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성된 코팅을 갖는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 이에 사용하기 위한 물질을 포함한다.
일 실시형태에서 세라믹 복합재는 인산칼슘, 수산화인회석, 황산칼슘 이수화물, 지르코니아, 산화알루미늄, 근청석, 포스테라이트, 질화규소, 파이로스타트, 스테아타이트 및 슈퍼파이로스타트로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
그러한 물질은 화학적으로 또는 물리화학적으로 가교된 겔, 다공성 물질 또는 입자로서 거시적 고체/모놀리스의 형태일 수 있다.
발명의 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 물질은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, 발명의 제1 양태의 조성물은 콜라겐 스캐폴드, 예를 들어 콜라겐 I 스캐폴드와 같은 생물학적 스캐폴드 상에 코팅된다. 일 실시형태에서 콜라겐 스캐폴드는 의료 장치, 임플란트 또는 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질로서 직접적으로 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 콜라겐 스캐폴드는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질의 성분이다. 예를 들어, 콜라겐 스캐폴드는 이러한 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질의 표면 상에 코팅될 수 있다.
특정 실시형태에서, 스캐폴드는 콜라겐 I 스캐폴드와 같은 콜라겐 스캐폴드이다. 조성물이 폴리라이신을 추가로 포함하는 특정 실시형태에서, 폴리라이신은 스캐폴드와 콜라겐 VI 폴리펩티드 사이에 중간층을 형성한다.
특정 실시형태에서 콜라겐 스캐폴드는 주요 성분으로서 콜라겐 I 및/또는 III 및/또는 V 및/또는 VI를 포함하는 소 피브린 콜라겐 스캐폴드일 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드의 80-85%는 유형 I 콜라겐 섬유일 수 있고/있거나 8-11%는 유형 III 콜라겐 섬유일 수 있고 나머지는 콜라겐 V 및/또는 VI일 수 있다. 바람직하게는, 스캐폴드는 동결-건조된 소 콜라겐 I/III/V 스캐폴드이다.
발명의 제1 양태의 조성물의 콜라겐 VI 펩티드와 혼합된 콜라겐 I/III/V 스캐폴드(예컨대 실시예에서 WOUNDCOM으로 언급된 생성물)는 상처에 중간 장벽 기능을 제공하고 함유된 습윤 상처 미세환경을 확립한다. 이 미세환경은 재-상피화 및 재-혈관화를 촉진하고 따라서 상처 치유를 가속화한다[48].
용어 "스캐폴드" 및 용어 "담체" 또는 "WOUNDCOM 담체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 스캐폴드의 모든 정의는 담체 또는 WOUNDCOM 담체에도 적용된다. 따라서 일 실시형태에서, 담체 또는 WOUNDCOM 담체는 콜라겐 I 단백질과 같은 콜라겐 단백질이다. 특정 실시형태에서 담체는 주요 성분으로서 콜라겐 I 및/또는 III 및/또는 V 및/또는 VI을 포함하는 소 원섬유 콜라겐 담체와 같은 원섬유 콜라겐 담체일 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드의 80-85%는 유형 I 콜라겐 섬유일 수 있고/있거나 8-11%는 유형 III 콜라겐 섬유일 수 있고 나머지는 콜라겐 V 및/또는 VI일 수 있다. 바람직하게는 담체는 동결-건조된 소 콜라겐 I/III/V 담체이다.
WOUNDCOM 생성물은 WOUNDCOM 담체와 WOUNDCOM 이펙터 - 예컨대 생물활성 펩티드(예컨대 GVR28 및 SFV33)가 함침된 콜라겐 I 스캐폴드의 조합이다. 따라서 일 실시형태에서 WOUNDCOM은 GVR28 및 SFV33 펩티드의 조합이 함침된 콜라겐 I 상처 매트릭스이다.
추가로, 콜라겐 스캐폴드가 존재하는 콜라겐 기반 상처 케어 장치(예컨대 WOUNDCOM)에서 고도로 정렬된 콜라겐 섬유는 천연 진피의 천연 구조를 모방하는 평행한 콜라겐 섬유 다발을 갖는 적절한 다공성 구조를 나타낸다. 따라서, 상처 기저부에서 콜라겐 스캐폴드 기반 상처 케어 장치의 중심적 역할은 천연 콜라겐 피브릴에 의해 3-차원 분자 안내 능선을 제공함에 의해 상처 안으로 세포 유입 및 이동을 지시하고 안내하는 것이다. 따라서, 콜라겐 스캐폴드 기반 상처 케어 장치(예컨대 WOUNDCOM)는 구조화된 상처 치유를 촉진하여 상처 기저부에 새로 형성된 콜라겐 섬유 및 기타 조직 성분의 침착을 조직화하고 정렬함에 의해 새로운 조직 성장을 초래한다[43].
더욱이, 발명의 제1 양태의 조성물에 적용된 콜라겐 VI-펩티드는 신체 자체의 상처 치유 효과를 증강시킨다. 이것은 물리적 막 불안정화에 의해 병원체에 작용하여 세포질 삼출, 세포 용리를 유발하고 이에 의해 병원체 성장의 억제 및 생물막 형성을 야기하는 그의 천연 항균 특성에 의해 달성된다[49]. 펩티드는 또한 상처 치유 과정에 유익한 피부 세포와 면역 세포의 효율적인 모집, 생존 및 증식을 위한 추가의 구조적 및 기능적 요소를 제공함에 의해 상처 치유 과정을 더욱 가속화한다.
다른 실시형태에서, 발명의 제1 양태의 조성물은 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질의 표면 상에 직접적으로 코팅되며, 여기서 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서 코팅된 티타늄 표면은 의료 장치, 임플란트 또는 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질로 직접적으로 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 코팅된 티타늄 표면은 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질의 성분이다.
조성물이 폴리라이신을 추가로 포함하는 특정 실시형태에서, 폴리라이신은 티타늄 표면과 콜라겐 VI 폴리펩티드 사이에 중간층을 형성한다.
일부 실시형태에서 코팅된 티타늄 표면은 예를 들어 관절 보철물 또는 다른 정형외과 장치로서, 예를 들어 무릎 관절 보철물 또는 고관절 보철물로 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된 임플란트로서 직접적으로 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 코팅된 티타늄 표면은, 예를 들어 뼈 대체 장치, 뼈 고정화 장치, 골판, 인공 고관절의 스템, 인공 장기, 인공 추간판, 척추 막대, 악안면 판, 스텐트 이식편, 경피 장치 및 심박조율기로, 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된 임플란트로서 직접적으로 사용될 수 있다.
"티타늄 표면"으로 본 발명자들은 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된 표면을 갖는 모든 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 포함한다.
다른 실시형태에서, 발명의 제1 양태의 조성물은 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질의 표면 상에 직접적으로 코팅되며, 여기서 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 하나 이상의 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서 코팅된 세라믹 복합재 표면은 의료 장치, 임플란트 또는 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질로 직접적으로 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 코팅된 세라믹 복합재 표면은 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질의 성분이다.
조성물이 폴리라이신을 추가로 포함하는 특정 실시형태에서, 폴리라이신은 세라믹 복합재 표면과 콜라겐 VI 폴리펩티드 사이에 중간층을 형성한다.
일부 실시형태에서 코팅된 세라믹 복합재 표면은, 예를 들어 관절 보철물 또는 기타 정형외과 장치로, 예를 들어 무릎 관절 보철물 또는 고관절 보철물로 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성된 임플란트로서 직접적으로 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 코팅된 세라믹 복합재 표면은, 예를 들어 뼈 대체 장치, 뼈 고정화 장치, 골판, 인공 고관절의 스템, 인공 장기, 인공 추간판, 척추 막대, 악안면 판, 스텐트 이식편, 경피 장치 및 심박조율기로, 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성된 임플란트로서 직접적으로 사용될 수 있다.
"세라믹 복합재 표면"으로 본 발명자들은 하나 이상의 세라믹 복합재를 포함하거나 이로 구성된 표면을 갖는 모든 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 포함한다.
발명의 임의의 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 물질은 본 명세서에 개시된 임의의 의료 용도에 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
일 실시형태에서 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은, 조성물 또는 약학적 조성물이 상기 물질의 표면에 적용되도록, 제1 양태에서 정의된 바와 같은 조성물로 코팅되어, 물질의 표면에 대한 조성물의 폴리펩티드의 결합을 초래한다.
당업자는 펩티드의 방사성 표지화와 같이 물질의 표면에 대한 조성물의 폴리펩티드 성분의 결합 수준을 결정하기 위해 당업계에서 이용가능한 기술을 알고 있을 것이다. 이의 예는 라이신 또는 티로신 잔기를 표지함에 의해 요오드의 방사성 동위원소(예를 들어, 요오드 131)로 표지하는 것과 달성된 결합 수준에 비례하는 코팅된 물질에 의해 생성된 방사능의 수준을 측정하는 것이다. 상이한 생체분자의 코팅 효율은 γ-카운터에서 cpm 값으로 방사능을 결정함에 의해 물질과 회합된 결합된 131-요오드 방사능과 유리 131-요오드 방사능 사이의 비율을 결정함에 의해 평가될 수 있으며, 즉 100% 결합의 측정에서는 검출할 수 없는 양의 방사성 요오드 131이 물질의 표면에 결합되지 않는다.
표면에 대한 펩티드 또는 단백질의 결합 백분율을 측정하기 위한 다른 기술은: 분광 검정; 방사능 기반 결합 검정; 엘립소메트리; 단일-진동 수정 박막 두께 모니터링; 형광 기반 결합 검정; 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 원자력 현미경(AFM)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 실시형태에서 의료 장치, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 습기가 있는 경우 부드러워지거나 성형가능할 수 있다. 수분은 상처 자체에서 유래할 수 있고/있거나 수분은 외부 공급원(예를 들어, 예컨대 의료 장치, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질에 적용되는 식염수)에서 유래할 수 있다. 일 실시형태에서 의료 장치, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 2차 드레싱 및/또는 압박 덮개를 사용하여 제자리에 고정될 수 있다.
발명의 제4 양태는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제1 또는 제2 양태에 기재된 조성물 또는 약학적 조성물로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계를 포함하는, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법을 제공한다.
당업자는 상기 기재된 코팅, 함침 및 혼합하는 일반적인 방법이 발명의 이 양태에 따라 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법에도 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
발명의 제5 양태는 다음 단계를 포함하는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법을 제공한다:
(i) 제1 양태에 정의된 바와 같은 2개 이상의 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제조하는 단계; 및
(ii) 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 단계 (i)에서 제조된 조성물로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계.
따라서, 본 명세서에서 사용하기 위한 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 물질은 제1 양태의 조성물의 폴리펩티드 둘 모두를 포함하는 단일 조성물을 활용함에 의해 발명의 제1 양태의 조성물로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합될 수 있다. 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 바람직하게는 이러한 조성물로 코팅될 수 있다.
일 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 티타늄 표면을 포함하거나 이로 구성된다.
일 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질은 세라믹 복합체 표면을 포함하거나 이로 구성된다.
발명의 제6 양태는 다음 단계를 포함하는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법을 제공한다:
(i) 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계; 및
(ii) 단계 (i)에서 생산된 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제2 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계;
선택적으로 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질을 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리라이신으로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계를 포함함.
일 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 동시적으로 (예를 들어, 융합으로서 또는 혼합물로서) 코팅된다. 대안적으로, 폴리펩티드는 임의의 순서로 순차적으로 코팅될 수 있다.
발명의 제6 양태에 대한 변경은 다음 단계를 포함하는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법을 제공한다:
(i) 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리라이신으로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계;
(ii) 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계; 및
(iii) 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제2 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계;
선택적으로 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드는 동시적으로 (예를 들어, 융합으로서) 또는 순차적으로 코팅된다.
따라서, 본 명세서에서 사용하기 위한 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 물질은 물질을 제1 양태에서 정의된 바와 같은 제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로 먼저 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시킨 후, 제1 양태에서 정의된 바와 같은 제2 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드가 후속적으로 적용되는 추가 단계에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드는 코팅의 단일 단계에서 동시에 적용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 사용하기 위한 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 및 물질은 이후에 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드를 적용하기 전에 먼저 물질을 폴리라이신으로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합함에 의해 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, 폴리라이신은 물질을 제1 양태에 정의된 바와 같은 폴리펩티드 중 적어도 하나로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키기 이전에 생물학적 스캐폴드(예를 들어, 콜라겐 I과 같은 콜라겐)와 같은 스캐폴드 상에 코팅되거나, 또는 그 반대로 된다. 스캐폴드는 티타늄 표면 또는 세라믹 복합체 표면 상에 존재할 수 있다.
다른 실시형태에서, 폴리라이신은 물질을 제1 양태에서 정의된 바와 같은 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키기 이전에 스캐폴드 상에 코팅되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리라이신은 물질을 제1 양태에서 정의된 바와 같은 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키기 이전에, 표면 상에, 예를 들어 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된 표면 또는 하나 이상의 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성된 표면 상에 직접적으로 코팅된다.
다른 실시형태에서, 폴리라이신은 혼합물을 콜라겐 스캐폴드 또는 다른 표면, 예를 들어, 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된 표면 또는 하나 이상의 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성된 표면으로 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키기 이전에 제1 양태에서 정의된 바와 같은 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드와 혼합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질은 티타늄 표면을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질은 하나 이상의 세라믹 복합체 표면을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 스캐폴드, 예를 들어 콜라겐 스캐폴드를 폴리라이신의 용액으로 인큐베이션하는 단계;
(ii) 스캐폴드를 (예를 들어, 증류수에서) 세척하는 단계;
(iii) 스캐폴드를 (예를 들어, 공기 건조함에 의해) 건조하는 단계;
(iv) 스캐폴드를 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 콜라겐 VI 폴리펩티드로 (예를 들어, 콜라겐 VI 폴리펩티드(들)를 함유하는 용액 안으로 스캐폴드를 떨어뜨림에 의해) 코팅하는 단계;
(v) 콜라겐 VI 용액에서 스캐폴드를 (예를 들어, 밤새) 인큐베이션하는 단계
(vi) 스캐폴드를 (예를 들어, 공기 건조함에 의해) 건조하는 단계.
상기 방법의 특정 실시형태에서, 콜라겐 스캐폴드는 콜라겐 I 스캐폴드이다. 일 실시형태에서, 콜라겐 스캐폴드는 디스크 형상 또는 막이고, 예를 들어 동결-건조된 콜라겐 I로 구성된다.
상기 방법의 특정 실시형태에서, 단계 (i)의 폴리라이신은 폴리-L-라이신이다. 일부 실시형태에서, 폴리라이신 용액의 농도는 대략적으로 0.2mg/ml이다. 일 실시형태에서, 단계 (i)의 폴리라이신 용액은 대략적으로 0.2mg/ml 폴리-L-라이신 용액이다. 일부 실시형태에서, 콜라겐 스캐폴드는 대략적으로 60℃에서 폴리라이신의 용액에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 콜라겐 스캐폴드는 대략적으로 2시간 동안 폴리라이신 용액에서 인큐베이션된다.
상기 방법의 특정 실시형태에서, 단계 (iv)의 콜라겐 VI 펩티드 용액 내 콜라겐 VI 펩티드의 농도는 대략적으로 150mM이다. 일부 실시형태에서, 단계 (iv)의 콜라겐 VI 용액 내 콜라겐 VI 펩티드의 농도는 대략적으로 2-3mM이다. 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 (iv)의 콜라겐 VI 용액 내 콜라겐 VI 펩티드의 농도는 대략적으로 2-3μM이다. 일부 실시형태에서, 단계 (iv)의 콜라겐 VI 용액 내 콜라겐 VI 펩티드의 농도는 3μM이고, 선택적으로 1.5μM GVR28(서열번호: 1) 및 1.5μM SFV33(서열번호: 5)으로 구성된다.
특정 실시형태에서, 콜라겐 스캐폴드는 밤새, 즉 대략적으로 16시간 동안 콜라겐 VI 용액에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 콜라겐 스캐폴드는 대략적으로 4℃에서 콜라겐 VI 용액과 함께 인큐베이션된다.
상기 단계 (i)의 다른 실시형태에서 단계 (i)에서 폴리라이신은 제1 양태에서 정의된 바와 같은 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드로 물질을 코팅, 함침, 혼합 또는 그렇지 않으면 회합시키기 이전에 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질의 표면 상에 코팅된다. 일부 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질은 티타늄 표면을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질은 세라믹 복합체 표면을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질, 예를 들어, 티타늄 표면 또는 대안적으로 세라믹 복합체 표면을 폴리라이신의 용액과 인큐베이션하는 단계;
(ii) 표면을 (예를 들어, 증류수에서) 세척하는 단계;
(iii) 표면을 (예를 들어, 공기 건조함에 의해) 건조하는 단계;
(iv) 표면을 발명의 제1 양태에 정의된 바와 같은 콜라겐 VI 또는 콜라겐 VI 폴리펩티드로 (예를 들어, 콜라겐 VI 또는 콜라겐 VI 폴리펩티드를 함유하는 용액 안으로 표면을 떨어뜨림에 의해) 코팅하는 단계;
(v) 콜라겐 VI 용액에서 표면을 (예를 들어, 밤새) 인큐베이션하는 단계
(vi) 표면을 (예를 들어, 공기 건조함에 의해) 건조하는 단계.
상기 방법의 특정 실시형태에서, 단계 (i)의 폴리라이신은 폴리-L-라이신이다. 일부 실시형태에서, 폴리라이신 용액의 농도는 대략적으로 0.2mg/ml이다. 일 실시형태에서, 단계 (i)의 폴리라이신 용액은 대략적으로 0.2mg/ml 폴리-L-라이신 용액이다. 일부 실시형태에서, 표면(예를 들어, 세라믹 복합체 표면 및/또는 티타늄 표면)은 대략적으로 60℃에서 폴리라이신 용액에서 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 표면(예를 들어, 세라믹 복합체 표면 및/또는 티타늄 표면)은 대략적으로 2시간 동안 폴리라이신 용액에서 인큐베이션된다.
상기 방법의 특정 실시형태에서, 단계 (iv)의 콜라겐 VI 용액 내 콜라겐 VI의 농도는 대략적으로 150mM이다. 일부 실시형태에서, 단계 (iv)의 콜라겐 VI 용액 내 콜라겐 VI 펩티드의 농도는 대략적으로 2-3mM이다. 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 (iv)의 콜라겐 VI 용액 내 콜라겐 VI 펩티드의 농도는 대략적으로 2-3μM이다.
특정 실시형태에서, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 스캐폴드 용액(예를 들어, 콜라겐 스캐폴드)을 발명의 제1 양태에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 콜라겐 VI 폴리펩티드와 혼합하는 단계(예를 들어, 콜라겐 VI 폴리펩티드(들)를 함유하는 용액을 스캐폴드의 용액에 첨가함); 및
(ii) 스캐폴드/폴리펩티드(들) 혼합물을 (예를 들어, 공기 건조 또는 동결 건조함에 의해) 건조하는 단계.
발명의 제7 양태는 다음을 포함하는 키트를 제공한다:
(i) 발명의 임의의 제1 양태에 따른 조성물 및/또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물 또는 발명의 제3 양태에 따른 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질, 및
(ii) 사용 설명서.
키트는 선택적으로 발명의 제1 양태에 기재된 바와 같은 2개 이상의 폴리펩티드를 혼합물로 또는 사용 이전 또는 사용 시 혼합을 요하는 별도의 성분으로서 포함한다. 예를 들어, 각각의 성분은 개별적으로 또는 임의의 하나 이상의 추가 폴리펩티드와 조합하여 동결건조될 수 있고, 선택적으로 사용 이전에 폴리펩티드를 재구성 및/또는 혼합하기 위한 적합한 완충액 또는 완충액들을 키트에 포함할 수 있다.
발명의 제8 양태는 다음을 포함하는 키트를 제공한다:
(i) 발명의 제1 양태에 따라 상처 치유를 촉진할 수 있는 일차 기능을 갖는 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드;
(ii) 발명의 제1 양태에 따라 항균 효과를 발휘할 수 있는 일차 기능을 갖는 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드; 및
(iii) 사용 설명서;
선택적으로 여기서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 폴리라이신을 추가로 포함한다.
제7 및 제8 양태의 키트의 특정 실시형태에서, 키트는 생물학적 및/또는 생분해성 스캐폴드와 같은 스캐폴드 물질을 추가로 포함한다. 스캐폴드는 콜라겐, 예를 들어 콜라겐 I을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
제7 및 제8 양태의 키트의 다른 실시형태에서, 키트는 티타늄 또는 티타늄 합금을 포함하거나 이로 구성된 물질, 예를 들어 티타늄을 포함하거나 이로 구성된 의료 장치, 임플란트, 생성된 상처 케어 또는 이에 사용하기 위한 물질을 추가로 포함한다.
제7 및 제8 양태의 키트의 다른 실시형태에서, 키트는 하나 이상의 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성된 물질, 예를 들어 세라믹 복합체를 포함하거나 이로 구성된 의료 장치, 임플란트, 생성된 상처 케어 또는 이에 사용하기 위한 물질을 추가로 포함한다.
발명의 제9 양태는 의약에 사용하기 위한 발명의 제1 양태에 따른 조성물, 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
발명의 제10 양태는 세균 감염의 치유적 및/또는 예방적 치료에 사용하기 위한 발명의 제1 양태에 따른 조성물, 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
용어 '예방적'은 환자 또는 대상체에서 병태 또는 질환 상태의 가능성을 예방하거나 감소시키는 본 명세서에 기술된 조성물 또는 제형의 사용을 포괄하는데 사용된다.
"세균 감염"으로 본 발명자들은 상기에 기술된 바와 같은 미생물에 의해 야기된 감염을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 치료되는 세균 감염은 박테리아 감염이다. 치료되는 세균 감염은 급성 또는 전신 감염일 수 있다. 일 실시형태에서, 세균 감염은 하나 이상의 통상적인 항생제(상기 논의된 바와 같음)에 대해 내성이다.
일 실시형태에서, 치료되는 세균 감염은 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리키아 콜라이 및 스트렙토코커스 피요게네스로 구성된 군으로부터 선택된 미생물에 의해 야기된다.
추가 실시형태에서, 세균 감염은 다중약물-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)(메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스) 및 다중약물-내성 슈도모나스 에어루기노사(MRPA)로 구성된 군으로부터 선택된 미생물에 의해 야기된다.
발명의 조성물이 특정 질환 또는 병태의 치료를 위해 하나 이상의 공지된 또는 통상적인 제제와 조합하여 공동-투여될 수 있다는 것이 당업계에서 통상인에 의해 인지될 것이다. '공동-투여'로는 본 조성물이 환자에게 투여되어 조성물의 성분 뿐만 아니라 공동-투여된 화합물이 동시적으로, 순차적으로 및/또는 후속으로를 포함하여 화합물이 실제로 투여되는 시기에 관계없이, 동시에 환자의 신체에서(예를 들어 혈류에서) 발견될 수 있다는 것으로 의미된다.
따라서, 일 실시형태에서 조성물 또는 약학적 조성물은 상술한 통상적인 항생제와 같은 하나 이상의 추가 항균제와 조합하여 사용하기 위한 것이다. 대안적으로 또는 추가로, 추가 항균제는 LL-37 및 콜라겐 유형 VI 단백질과 같은 항균 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있거나, 예를 들어 모 단백질의 항균 활성을 적어도 부분적으로 유지하는, 데펜신, 그라미시딘 S, 마가이닌, 세크로핀, 히스타틴, 하이판신, 신나마이신, 부르포린 1, 파라신 1 및 프로타민, 및 이의 단편, 변이체 및 융합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
발명의 제11 양태는 상처 케어에 사용하기 위한(즉, 상처 치유의 촉진에 사용하기 위한) 발명의 제1 양태에 따른 조성물 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물을 제공한다.
"상처 케어"로 본 발명자들은 상처의 치료, 상처 봉합 촉진(즉, 치유), 상처 감염 및/또는 궤양을 예방 및/또는 치료하는 것을 포함하며, 여기서 상처는 체외 또는 체내일 수 있다. 따라서 상처 치유에 사용은 상처 치유 과정을 돕고(예를 들어, 그 효율을 가속화하거나 개선하고), 비정상적인 흉터 형성을 감소시키고, 및/또는 상처의 감염을 예방할 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 조성물의 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드는 상피 재생 및/또는 상처 상피 및/또는 상처 간질의 치유를 증강시킬 수 있는 크림, 겔, 연고, 드레싱 또는 플라스터와 같은 상처 케어 생성물에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 비-용리성 메카니즘을 통해 상피 및/또는 간질 세포의 증식을 증강시킬 수 있다.
상처 치유 특성을 갖는 콜라겐 VI 및 폴리펩티드는 발명의 상처 케어 생성물의 기능에서 일차적 또는 보조적 역할을 할 수 있다는 것이 인지될 것이다.
일 실시형태에서, 콜라겐 VI 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나 또는 약학적 조성물은 상기 기재된 바와 같은 추가 항균제와 조합하여 투여된다.
발명의 제12 양태는 상기 기재된 바와 같은 세균 감염의 치료용 약제의 제조에 있어서 발명의 제1 양태에 따른 조성물 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
발명의 제13 양태는 상기 기재된 바와 같은 상처의 치료용 약제의 제조에 있어서 발명의 제1 양태에 따른 조성물 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
발명의 제14 양태는 세균 감염이 있는 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 발명의 제1 양태에 따른 조성물, 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제15 양태는 개체에서 상처를 치료하는 방법을 제공을 제공하며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 발명의 제1 양태에 따른 조성물, 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
용어 '유효량'은 그 변화가 차도이든 간에 치료되는 질환 또는 병태에서 호의적인 변화, 유리한 생리학적 결과, 치료된 질환 상태 또는 병태의 역전 또는 약화, 치료된 질환 또는 병태에 따라 발생하는 병태 또는 질환 상태의 가능성에서 예방 또는 감소를 생성하기 위해 사용될 수 있는 본 발명에 따른 조성물 또는 약학적 조성물의 농도 또는 양을 기술하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 발명의 조성물 또는 약학적 조성물이 조합되어 사용되는 경우, 각각의 조성물 또는 약학적 조성물은 유효량으로 사용될 수 있으며, 여기서 유효량은 상승적 양을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 약학적 제형이 의학 및 수의학 분야 둘 모두에서 유용성을 갖는다는 것이 당업계에서 통상인에 의해 인지될 것이다. 따라서, 발명의 방법은 인간 및 비-인간 동물(예컨대 말, 개 및 고양이) 둘 모두의 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 환자는 인간이다.
수의학적 용도를 위해, 발명의 조성물은 정상적인 수의학적 관행에 따라 적절하게 허용가능한 제형으로 투여되고, 수의사는 특정 동물에 가장 적합한 복용량 섭생 및 투여의 경로를 결정할 것이다.
발명의 제16 양태는 미생물을 발명의 제1 양태에 따른 조성물 또는 발명의 제2 양태에 따른 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 시험관내에서 미생물을 사멸하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 조성물 또는 약학적 조성물은 또한 임상 환경(예를 들어, 수술실) 또는 가정 환경(예를 들어, 주방 작업대, 시트와 배갯잇과 같은 세탁물)에서와 같은 표면 또는 기재 상에서 미생물의 성장을 방지하기 위해 멸균 용액 또는 세척제의 형태로 사용될 수 있다.
일 실시형태에서 항균 화합물은 1 내지 100μg/ml의 농도로 용액에 존재할 수 있다.
일 실시형태에서 용액은 표면-활성제 또는 계면활성제를 추가로 포함한다. 적합한 계면활성제는 음이온성 계면활성제(예를 들어, 지방족 술포네이트), 양쪽성 및/또는 쯔비터이온성 계면활성제(예를 들어, 지방족 4차 암모늄, 포스포늄 및 술포늄 화합물의 유도체) 및 비이온성 계면활성제(예를 들어, 알킬렌 옥사이드를 갖는 지방족 알코올, 산, 아미드 또는 알킬 페놀)를 포함한다.
편리하게는, 표면-활성제는 0.5 내지 5 중량 퍼센트의 농도로 존재한다.
멸균 용액은 특히 병원 환경에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 멸균 용액은 수술 기구 및 수술실 표면뿐만 아니라 수술실 직원의 손과 장갑을 멸균하는데 사용될 수 있다. 부가하여, 멸균 용액은 예를 들어 노출된 뼈를 멸균하기 위해 수술 중에 사용될 수 있다. 모든 경우에, 용액은 멸균되어 지는 표면에 적용된다.
조성물 또는 약학적 조성물은 또한 혈액 및 혈액 생성물을 소독하고 박테리아 오염 또는 감염의 진단에 사용될 수 있다.
시험관내 및 생체내 사용 둘 모두에서, 약학적 조성물 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나는 바람직하게는 적어도 5분 동안 표적 미생물(또는 처리되는 표면/영역)에 노출된다. 예를 들어, 노출 시간은 적어도 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 1시간, 2시간, 3시간, 5시간, 12시간 및 24시간일 수 있다.
발명의 제9, 제10 또는 제11 양태에 따라 사용하기 위한 조성물 또는 약학적 조성물, 발명의 제12 또는 제13 양태에 따른 용도, 또는 발명의 제14, 제15 또는 제16 양태에 따른 방법의 일 실시형태에서, 조성물 또는 약학적 조성물은 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질 상에 코팅 또는 함침되거나, 혼합되거나 또는 그렇지 않으면 이와 회합된다.
본 명세서 내 명백하게 이전-공개된 문서의 목록 또는 논의는 반드시 그 문서가 최신 기술의 일부이거나 보통의 일반 지식이라고 간주되어서는 안된다.
발명의 특정 양태를 구현하는 바람직한 비-제한적인 실시예가 이제 다음 도면을 참조하여 기술될 것이다:
도 1: 비-감염된 상처에서 WOUNDCOM에서의 콜라겐 VI-유래된 펩티드의 생체내 상처 치유 효율의 정량적 평가. 뮤어라인 동물 모델 진피 피부에서 외과적으로 상처를 입혔다. 그들은 이후에 다른 콜라겐 VI 펩티드가 함침된 콜라겐 I 담체로 덮였다. 10일 기간 동안의 상처 치유를 평가하고 각각 자연 상처 치유, Puracol(콜라겐 VI 펩티드가 없는 담체) 및 Puracol Ag(은 이온이 함침된 담체)와 비교했다. Puracol(Medskin에 의해 생산됨)은 임상 성능에 최적화된 농도에서 사용되었다. 상처 감소율은 담체가 각각 3μM GVR28과 SFV33의 1:1 혼합물(즉, 총 3μM에 대해 각 폴리펩티드의 1.5μM)(도 1a), 또는 1.5μM GVR28 및 SFV33의 1:1 혼합물(총 1.5μM에 대한 각 폴리펩티드의 0.75μM)(도 1b)로 함침되는 WOUNDCOM으로 상당하게 가속화된다.
도 2: 감염된 상처에서 WOUNDCOM에서의 콜라겐 VI-유래된 펩티드의 생체내 상처 치유 효율의 정량적 평가. 뮤어라인 동물 모델 진피 피부에서 외과적으로 상처를 입히고 1 × 106 cfu 슈도모나스 에어루기노사으로 감염시켰다. 그들은 이후에 다른 콜라겐 VI 펩티드가 함침된 콜라겐 I 담체로 덮였다. 10일 기간 동안의 상처 치유를 평가하고 각각 자연 상처 치유, Puracol(콜라겐 VI 펩티드가 없는 담체) 및 Puracol Ag(은 이온이 함침된 담체)와 비교했다. 상처 감소율은 담체가 각각 3μM GVR28과 SFV33의 1:1 혼합물(즉, 총 3μM에 대해 각 폴리펩티드의 1.5μM)(도 2a), 또는 1.5μM GVR28 및 SFV33의 1:1 혼합물(총 1.5 μM에 대한 각 폴리펩티드의 0.75μM)(도 2b)로 함침되는 WOUNDCOM으로 상당하게 가속화된다.
도 3: 상처 봉합에 대한 척도로서 상처 삼출물의 분석. 상처 유체 삼출물의 양을 https://www.woundsinternational.com/resources/details/wuwhs-consensus-document-wound-exudate-effective-assessment-and-management에 기술된 채점 시스템에 따라 시간에 걸쳐서 측정했다. 상처 채점 시스템은 또한 아래 표에 요약되어 있다.
Figure pct00002

요약하면, 상처 기저부 삼출물은 상기 채점 시스템에 따라 점수를 매겼으며 추가 구분으로 결과는 다음과 같다: 1.1. 삼출물 없음, 1.2 최소 삼출물, 2.1 보통 삼출물, 2.2 보통 내지 삼출성, 3.1 삼출성 내지 매우 삼출성, 3.2 매우 삼출성. 상처는 도면에 도시된 바와 같이 다른 항목으로 치료되었다. 결과는 4마리 동물에 대한 6개의 다른 상처의 평균 ± SEM으로 표현된다. "자연 상처 치유" 조건을 제외하고 다른 모든 조건은 감염된 상처에 있었다.
도 4: 상처 치유에 대한 척도로서 상처 기저부 깊이의 분석. 상처 기저부의 깊이를 시간에 걸쳐서 측정하였다. 각 상처에서 가장 깊은 위치를 측정했다. 결과는 4마리 동물에 대한 6개 다른 상처의 평균 ± SEM으로 표현된다. "자연 상처 치유" 조건을 제외하고 다른 모든 조건은 감염된 상처에 있었다.
도 5: 상처 치유에 대한 척도로 상처 기저부 조직 유형의 분석. 상처 기저부 조직 유형은 https://www.coloplast.sg/Documents/Wound/WUWHS_POSITION%20DOCUMENT.pdf에 기술된 채점 시스템에 따라 시간에 걸쳐서 측정되었다. 요컨대, 조직 유형은: 1.1 매우 허물같음, 1.2 매우 허물같음 내지 보통으로 허물같음, 2.1 보통으로 허물같음 내지 과립화, 2.2 과립화, 3.1 과립화 내지 상피화, 3.2 상피화로 채점되었다. 상처는 도면에 도시된 바와 같이 다른 항목으로 치료되었다. 결과는 4마리 동물에 대한 6개의 다른 상처의 평균 ± SEM으로 표현된다. "자연 상처 치유" 조건을 제외하고 다른 모든 조건은 감염된 상처에 있었다.
도 6: 상처에서 박테리아 부하의 평가. 전체 두께 상처를 5×105 cfu 슈도모나스 에어루기노사으로 감염시켰다. CFU는 생존가능한 계수 검정에 의해 정량적으로 분석되었다. 상처는 도면에 도시된 바와 같이 다른 항목으로 치료되었다. 특히, 감염되지 않은 대조군 상처(흑색 선)에서 2차 감염이 4일차 내지 7일차 사이에 관찰되었다. 결과는 4마리 동물에 대한 6개의 다른 상처의 평균 ± SEM으로 표현된다.
도 7: 제조업체 A에 의해 생산된 WOUNDCOM의 내부 콜라겐 피브릴 구조에 미치는 영향. 조밀하게 충진된 콜라겐 피브릴은 교차-줄무늬 패턴(화살표)으로 볼 수 있다. WOUNDCOM 패치는 저장 수명 0개월(a), 2개월(b), 6개월(c) 및 12개월(d) 후에 평가되었다. 시간에 걸쳐서 구조적 차이는 관찰되지 않는다.
도 8: 제조업체 B에 의해 생산된 WOUNDCOM의 내부 콜라겐 피브릴 구조에 대한 저장-수명의 영향. 조밀하게 충진된 콜라겐 피브릴은 교차-줄무늬 패턴(화살표)으로 볼 수 있다. WOUNDCOM 패치는 저장 수명 0개월(a) 및 2개월(b) 후에 평가되었다. 시간에 걸쳐서 구조적 차이는 관찰되지 않는다.
도 9: 제조업체 A에 의해 생산된 WOUNDCOM의 콜라겐 스펀지 구조에 대한 저장-수명의 영향. WOUNDCOM 패치는 저장 수명 0개월(a), 2개월(b), 6개월(c) 및 12개월(d) 후에 평가되었다. 시간에 걸쳐서 구조적 차이는 관찰되지 않는다.
도 10: 제조업체 B에 의해 생산된 WOUNDCOM의 콜라겐 스펀지 구조에 대한 저장-수명의 영향. WOUNDCOM 패치는 저장 수명 0개월(a), 2개월(b) 후에 평가되었다. 시간에 걸쳐서 구조적 차이는 관찰되지 않는다.
도 11: 제조업체 A에 의해 생산된 WOUNDCOM에서 콜라겐 VI 펩티드 GVR28 분포에 대한 저장-수명의 영향. WOUNDCOM 패치는 얇은 섹션 상에 GVR28에 대한 금-표지된 항체에 의해 평가되었다. 취한 시점은 저장 수명 0개월(a), 2개월(b), 6개월(c) 및 12개월(d) 후였다. 시간에 걸쳐서 구조적 차이는 관찰되지 않는다.
도 12: 제조업체 B에 의해 생산된 WOUNDCOM에서 콜라겐 VI 펩티드 GVR28 분포에 대한 저장-수명의 영향. WOUNDCOM 패치는 얇은 섹션 상에 GVR28에 대한 금-표지된 항체에 의해 평가되었다. 취한 시점은 저장 수명 0개월(a) 및 2개월(b) 후였다. 시간에 걸쳐서 구조적 차이는 관찰되지 않는다.
도 13: 제조업체 A(a 내지 d) 또는 제조업체 B(e 및 f)에 의해 생산된 WOUNDCOM에서 콜라겐 VI 펩티드 SFV33 분포에 대한 저장 수명의 영향. WOUNDCOM 패치는 얇은 섹션 상에 SFV33에 대한 금-표지된 항체에 의해 평가되었다. 제조업체 A에 의해 생산된 WOUNDCOM의 경우, 취한 시점은 저장 수명 0개월(a), 2개월(b), 6개월(c) 및 12개월(d) 후였다. 제조업체 B에 의해 생산된 WOUNDCOM의 경우, 취한 시점은 저장 수명 0개월(e) 및 2개월(f) 후였다. 시간에 걸쳐서 구조적 차이는 관찰되지 않는다.
도 14: 시험관내 상처 치유에 대한 다양한 막의 시험관내 효과. 상처 치유에 대한 3가지 다른 막(WOUNDCOM, ProHeal 및 Whatman 셀룰로오스 여과지)의 효과는 96시간 기간에 걸쳐 섬유아세포 밀도를 측정함에 의해 평가되었다. 세포 밀도(%)는 0시간, 24시간, 48시간 및 96시간에서 측정되었다. WOUNDCOM(콜라겐 스캐폴드 및 생물활성 콜라겐 VI 펩티드 GVR28 및 SFV33 포함)은 모든 시점에서 우수한 상처 치유 효과를 나타냈다.
도 15: 박테리아 생존에 대한 다양한 막의 시험관내 효과. 상이한 박테리아(스타필로코커스 아우레우스 또는 슈도모나스 에어루기노사)의 생존에 대한 3가지 상이한 막(WOUNDCOM, ProHeal 및 Whatman 셀룰로오스 여과지)의 효과가 시간에 걸쳐서 평가되었다. 생존율은 0분, 30분, 60분 및 120분에 측정되었다. WOUNDCOM(콜라겐 스캐폴드 및 생물활성 콜라겐 VI 펩티드 GVR28 및 SFV33 포함)은 30, 60 및 120분에서 항균 활성을 나타냈다.
실시예
실시예 1 - 생물활성 콜라겐 VI 펩티드의 조합의 개선된 상처 치유 특성.
도입
생체물질은 인체 기능을 유지하거나 대체하기 위해 내부로 배치된다. 그것은 우수한 기계적 특성, 내식성 및 생체적합성에 기인하여 금속 합금, 세라믹, 중합체 또는 생체고분자의 다양한 조합으로 구성된다. 상처 매트릭스는 폼, 필름, 하이드로콜로이드, 하이드로겔, 스폰지, 막, 피부 대체물, 전기 방사 마이크로섬유 및 나노섬유와 같은 다양한 형태로 제조된 천연 중합체 및 합성 중합체를 포함한 다양한 물질로 된다. 생물활성 상처 매트릭스는 생물활성 화합물의 전달 또는 내인성 활성을 갖는 물질로 구성됨에 의해 상처 치유에 활성인 물질을 전달한다. 치유 성공률은 상처 치유 동안 숙주-생체물질 경계면에서 일어나는 세포 및 생리학적 과정에 의해 크게 결정된다. 구체적으로, 불리한 숙주 반응 과정은 종종 생체물질의 성능을 배제하는 캡슐화와 만성 염증화로 이어진다. 따라서, 치유를 증진시키기 위해 조직 및 세포와 같은 상처 특성에 능동적으로 작용할 수 있는 적절한 상처 치료 전략을 설계하는 것이 중요하다. 또한, 환자들은 종종 이식 부위에 심각한 감염을 일으켜 정상적인 상처 치유 과정을 방해한다. 일반적으로 스타필로콕시, 슈도모나스 또는 스트렙토콕시와 같은 무해한 박테리아는 신선한 상처에서 손상된 조직에 침투할 수 있다. 여기서 그것은 높은 병원성 잠재력을 전개하고 지속적인 감염을 일으켜 생체물질 기능을 심각하게 손상시킬 수 있다. 따라서, 항균 효과로 생체물질 표면을 촉진하는 생물활성 상처 치유를 포함한 새로운 전략이 환자에게 유익할 수 있다. 특히, 주어진 생체물질 표면에 광범위의 시너지 효과를 부여할 수 있는 상이한 생물활성 생체분자의 조합은 프리미엄 생체물질 기능과 생체적합성에 매우 중요하다.
이 목표를 달성하기 위해, 콜라겐 VI 서열(WOUNDCOM 이펙터)로부터 유래된 생물활성 펩티드 GVR28 및 SFV33의 조합으로 콜라겐 I 매트릭스를 변형하는 효과를 조사했다(WOUNDCOM 담체, 즉 Puracol). 그것은 각각 WOUNDCOM 담체 단독(Puracol), 또는 GVR28 및 SFV33 단독으로 또는 은 이온(Puracol Ag)으로 변형된 WOUNDCOM 담체와 비교되었다. 상이한 WOUNDCOM 변이체를 뮤어라인 모델에서 상이한 피부 상처에 생체내 적용했다. GVR28과 SFV33의 조합은 예상치 못한, 특히 높은 상처 치유 및 염증화 조절 효율을 나타내어 상처 봉합을 상당히 가속화했다. WOUNDCOM 담체와 WOUNDCOM 이펙터가 함께 조합되어 WOUNDCOM 생성물을 만든다.
요약하면, 이들 데이터는 WOUNDCOM 변형을 위한 생물활성 콜라겐 VI 펩티드의 시험된 조합이 특히 높은 상처 치유 효율을 나타냄을 보여준다. 따라서 그것은 다른 생체분자와 비교할 때 특히 높은 속도로 숙주-생체물질 계면에 대해 초기 및 중간 세포 이벤트를 촉진할 수 있다. 따라서, 주어진 콜라겐 I 상처 매트릭스에 결합된 콜라겐 VI 유래된 펩티드의 조합은 생물활성 숙주-생체물질 계면의 프리미엄 생체적합성 및 조직 통합에 생물학적으로 적절한 것으로 간주될 수 있다. 특히, 그것은 생체물질 삽입/적용 후 및 상처 봉합과 상처 치유의 초기 단계 동안 국소 감염으로부터 상처 기저부를 보호하고 전신 감염으로부터 환자를 보호할 수 있다. 이 치료 전략은 개선된 상처 복구를 촉진하고 비정상적인 흉터 형성을 줄일 가능성이 있어 상처 환경에 유익할 것이다.
따라서, 본 연구에서는 상이한 상업적으로 이용가능한 콜라겐 스캐폴드의 표면에서 우수한 상처 치유 특성을 촉진하기 위해 천연 콜라겐 VI-유래된 생체분자의 조합의 사용을 탐구했다. 여기서, 천연 콜라겐 VI-유래된 생체분자의 조합의 사용은 생체내 생물학적 콜라겐 스캐폴드의 상처 치유 특성을 크게 증진한다는 것이 처음으로 입증되었다. 이 효과는 조직 재생 및 흉터 리모델링을 촉진하면서 감염 및 염증화의 발현을 능동적으로 대조할 수 있는 다목적, 다기능 및 적절한 세포외 환경을 제공하는 현저한 잠재력을 초래할 것이고 결과적으로 생체적합성에서 원하는 증강을 제공할 것이다.
물질 및 방법
물질 - MDS 콜라겐 및 MDS 콜라겐 Ag(즉, 각각 Puracol 및 Puracol Ag)는 MedSkin Solutions Dr. Suwelack AG(MDS)로부터 획득했다. ε-폴리-L-라이신 하이드로브로마이드(PLL, 30 000 - 150 000g/mol)는 미국 세인트루이스 소재의 Sigma-Aldrich에서 구입했다. 콜라겐 VI 및 그의 유래된 펩티드는 [29]에 기술된 바와 같이 준비되었다.
PLL로 생체물질 표면 코팅 - 직경과 두께가 각각 5mm(두꺼운 스캐폴드) 및 1-2mm(얇은 스캐폴드)인 콜라겐 스캐폴드 디스크를 더 큰 시트(약 10cm × 10cm)에서 펀칭했다. 콜라겐 코팅 이전에 150μl 폴리-L-라이신 하이드로브로마이드 용액(0.2mg/ml)을 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션에 의해 콜라겐 스캐폴드 디스크에 적용했다. 그 후 디스크를 증류수로 두 번 세정하여 비결합된 PLL을 제거하고 공기-건조하고 실온에서 보관했다.
생물활성 콜라겐 VI 분자로 생체물질 표면 코팅 - PLL로 사전 처리 후 콜라겐 스캐폴드 디스크를 24-웰 세포 배양 플레이트(TPP, 스위스 트라사딩겐 소재)에 넣었다. 그것은 150μl 콜라겐 유형 VI 펩티드 GVR28 또는 SFV33, 또는 두 펩티드 모두의 혼합물(각각 농도 3μM 또는 1.5μM)로 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션에 의해 코팅한 후 증류수로 헹구고 공기-건조했다.
동물 및 사육 - Balb/c 마우스(암컷, 8-10주)를 Janvier Europe에서 획득했다. 마우스는 스웨덴 룬드 메디콘 빌리지에서의 동물 시설에 수용되었고, 나무 부스러기를 함유하고 표준 설치류 음식과 물이 자유롭게 공급된 폴리스티렌 케이지(유형 III 케이지, 케이지당 10마리 마우스)에서 12시간 명/암 주기로 유지되었다. 개별 마우스는 1일차에 수행된 귀 표시에 의해 식별되었다.
윤리적 허가 - 스웨덴 말뫼/룬드 소재의 지역 동물 윤리 위원회는 5490-2017 라이선스 하에서 실험을 승인했다.
생체물질 디스크 이식 - 마우스를 Isofluran으로 마취하고 면도기를 사용하여 등을 면도했다. 필요한 경우 제모 용액을 적용하여 임의의 남아있는 모발을 제거했다. 이식의 부위를 요오드 또는 70% 에탄올로 세척하고 절개를 수행하기 전에 Marcaine을 국소적으로 투여했다. 코팅된 생체물질 디스크를 피하로 삽입하고 상처를 봉합사 및/또는 수술용 접착제로 봉합했다.
종료 및 조직 수집 - 이식 후 다른 시점, 즉 1시간(표 2 및 5; 각각 비-감염 및 감염됨), 3일(표 3 및 6; 각각 비-감염 및 감염됨) 및 10일(표 4 및 7; 각각 비-감염 및 감염됨)에 동물을 종료시켰다. 종료 시, 동물을 생리 식염수 내 얼음처럼 차가운 포르말린으로 관류-고정시켰다. 임플란트는 주변 조직과 함께 수집하고, 고정액으로 옮겨 4℃에서 보관하였다. 그런 다음 그것은 표준 포매 및 면역조직화학 절차를 거쳤다[38-41].
결과
생물활성 펩티드 GVR28과 SFV33의 조합은 비-감염 및 감염된 피부 상처에서 콜라겐 I 스캐폴드의 우수한 상처 치유 효율을 매개한다.
뮤어라인 모델에서 상처 치유에 대한 생물활성 콜라겐 VI 펩티드의 가능한 효과를 평가하기 위해, 콜라겐 I 스캐폴드를 생물활성 펩티드 GVR28 및 SFV33의 상이한 조합으로 함침시켰다. GVR28 또는 SFV33 단독으로, 또는 은 이온으로 코팅, 또는 사전 코팅 없는 콜라겐 스캐폴드를 대조군으로 사용했다. 상이한 콜라겐 스캐폴드로 처리된 뮤어라인 피부 상처의 조직학적 평가로부터 결과는 그의 서로 다른 상처 치유 촉진 특성을 보여준다(도 1 및 2). GVR28과 SFV33의 조합으로 콜라겐 I 스캐폴드의 전-처리는 비-감염된 상처와 감염된 상처 둘 모두에서 대조군에 비해 생체내 상처 치유 특성을 유의하게 증진시켰다(각각 도 1 및 2). 부가하여, 상처 기저부에서 염증성 반응은 GVR28과 SFV33의 조합을 갖는 콜라겐 I 스캐폴드에 의해 가장 유익한 방식으로 조절되었다(표 2 내지 7). 특히, 이들 콜라겐 I 스캐폴드의 상처 치유 효율은 은 이온으로의 광범위하고 상업적으로 이용가능한 금 표준과 비교할 때 상당히 증진되었다.
종합하면, 도 1과 2 및 표 2 내지 7에 제시된 데이터는 콜라겐 VI 알파-3 사슬에서 유래된 생물활성 펩티드의 적절한 조합이 생체내 진피 상처 치유를 강력하게 자극한다는 것을 보여준다. GVR28 및 SFV33 조합으로 함침된 콜라겐 I 상처 매트릭스의 이 우수한 상처 치유 효과는 다른 테스트된 상처 매트릭스에 대해 상당히 덜 두드러졌다. 이들 효과는 콜라겐 VI에서 유래된 펩티드의 조합으로 코팅된 생체물질의 우수한 상처 치유 특성을 초래할 것으로 예상된다.
표 2, 3 및 4: WOUNDCOM으로 치료된 비-감염된 상처의 세포 및 조직학적 매개변수의 정량적 평가. 뮤어라인 동물 모델에서 진피 피부 상처를 외과적으로 가하였다. 그것은 이후 상이한 콜라겐 VI 펩티드로 함침된 콜라겐 I 담체로 덮였다. 10일 동안의 상처 치유를 평가하고 각각 자연 상처 치유, Puracol(콜라겐 VI 펩티드가 없는 담체) 및 Puracol Ag(은 이온이 함침된 담체)와 비교했다. 표 2: 1시간 처리; 표 3: 3일 처리; 표 4: 10일 처리. 치유 동안 상처에서 상이한 세포의 출현의 시간 경과 및 기타 상처 매개변수를 조직학적 평가에 의해 정량적으로 평가하였다. 대식세포, 호중구 및 백혈구 계수로 표시되는 염증성 반응의 수준은 WOUNDCOM으로 처리된 상처에서 유의하게 감소되며, 여기서 담체는 3μM GVR28과 SFV33의 1:1 혼합물(즉, 총 3μM에 대해 각 폴리펩티드 1.5μM)로 함침된다. 이와 동시에 조직 괴사 및 피브린 삼출의 수준이 또한 WOUNDCOM으로 치료된 상처에서 유의하게 감소되며, 여기서 담체는 3μM GVR28과 SFV33의 1:1 혼합물(즉, 총 3μM에 대해 각 폴리펩티드 1.5μM)로 함침된다.
표 5, 6 및 7: WOUNDCOM으로 치료된 감염된 상처의 세포 및 조직학적 매개변수의 정량적 평가. 뮤어라인 동물 모델에서 진피 피부 상처를 외과적으로 가하고 1 × 106 cfu 슈도모나스 에어루기노사으로 감염시켰다. 그것은 이후 상이한 콜라겐 VI 펩티드로 함침된 콜라겐 I 담체로 덮였다. 10일 동안의 상처 치유를 평가하고 각각 자연 상처 치유, Puracol(콜라겐 VI 펩티드가 없는 담체) 및 Puracol Ag(은 이온이 함침된 담체)와 비교했다. 표 5: 1시간 처리; 표 6: 3일 처리; 표 7: 10일 처리. 치유 동안 상처에서 상이한 세포의 출현의 시간 경과 및 기타 상처 매개변수를 조직학적 평가에 의해 정량적으로 평가하였다. 대식세포, 호중구 및 백혈구 계수로 표시되는 염증성 반응의 수준은 WOUNDCOM으로 처리된 상처에서 유의하게 감소되며, 여기서 담체는 3μM GVR28과 SFV33의 1:1 혼합물(즉, 총 3μM에 대해 각 폴리펩티드 1.5μM)로 함침된다. 이와 동시에 조직 괴사 및 피브린 삼출의 수준이 또한 WOUNDCOM으로 치료된 상처에서 유의하게 감소되며, 여기서 담체는 3μM GVR28과 SFV33의 1:1 혼합물(즉, 총 3μM에 대해 각 폴리펩티드 1.5μM)로 함침된다.
표 2: 1시간 처리, 비-감염된 모델.
Figure pct00003
표 3: 3일 처리, 비-감염된 모델.
Figure pct00004
표 4: 10일 처리, 비-감염된 모델.
Figure pct00005
표 5: 1시간 처리, 감염된 모델.
Figure pct00006
표 6: 3일 처리, 감염된 모델.
Figure pct00007
표 7: 10일 처리, 감염된 모델.
Figure pct00008
실시예 2 - 생체내 돼지 연구에서 생물활성 콜라겐 VI 펩티드의 조합의 개선된 상처 치유 특성.
뮤어라인 모델에서 상처 치유에 대한 생물활성 콜라겐 VI 펩티드의 긍정적인 결과에 이어, 생물활성 콜라겐 VI 펩티드가 인간에서 상처 치유와 보다 밀접하게 관련이 있는 돼지 모델에서 상처 치유에 대해 평가되었다.
평가는 다음 WOUNDCOM 구성을 사용하여 수행되었다:
ㆍWOUNDCOM 1: 3uM의 이펙터(1.5uM GVR28 + 1.5uM SFV33), PLL 없음
ㆍWOUNDCOM 2: 30uM의 이펙터(15uM GVR28 + 15uM SFV33), PLL 없음
ㆍWOUNDCOM 3: 3uM의 이펙터(1.5uM GVR28 + 1.5uM SFV33), PLL 함유
ㆍWOUNDCOM 4: 30uM의 이펙터(15uM GVR28 + 15uM SFV33), PLL 함유
상처 삼출물의 평가에 의해 측정된 상처 봉합
상처 삼출물(상처 유체 또는 상처 배액으로도 지칭됨)은 표재성 병변 또는 염증화의 부위로 빠져나가는 혈청, 피브린 및 백혈구로 구성된 물질을 지칭하고(Merriam-Webster Dictionary, 2018에 정의됨), 상처 치유에 중요한 역할을 하지만 잘못된 양, 장소 또는 조성으로 있을 때 치유를 지연시킬 수 있다. 상처 삼출물은 습한 상처 환경을 제공하고, 면역 매개체와 성장 인자가 상처 기저부를 가로질러 확산되도록 하고, 조직-복구 세포의 이동을 위한 매체로 역할을 하고, 세포 대사를 위한 필수 영양소를 공급하고, 자가분해를 촉진함에 의해 치유 과정을 지원한다.
상처 삼출물의 평가를 위한 채점 시스템은 World Union of Wound Healing Societies (WUWHS) Consensus Document, Wound exudate: effective assessment and management, Wounds International, 2019에 기술되어 있다.
따라서, 상처 치유는 도 3에서 입증된 바와 같이 World Union of Wound Healing Societies에 의한 합의 문서에 확립된 기준을 사용하여 상처 삼출물과 관련하여 평가될 수 있다.
상처 채점 시스템은 또한 아래 표에 요약되어 있다.
Figure pct00009
도 3은 폴리라이신이 없는 WOUNDCOM(실시예 1에 기술된 바와 같이 GVR28 및 SFV33 조합으로 함침된, 콜라겐 I 상처 매트릭스임)(WOUNDCOM 1+2)은 상처 삼출물에 대해 개선된 난치성 기간을 가져, 테스트된 다른 모든 조건에 비해 더 빠른 속도에서 더 개선된 속도로 점수를 보다 건강한 수준으로 감소시킴을 입증한다. 폴리라이신을 갖는 WOUNDCOM(WOUNDCOM 3+4)도 크게 개선되었지만 WOUNDCOM 1+2와 같은 수준은 전혀 아니다.
상처 깊이의 평가에 의해 측정된 상처 봉합
상처 봉합의 또 다른 평가는 상처 깊이의 측정을 포함한다. 돼지에 상처를 입히고 그 다음 그 깊이를 측정한다(예를 들어, 밀리미터 단위). 깊이의 추가 측정은 상처가 얼마나 빨리 치유되는지 평가하기 위해 규칙적인 시간 간격으로 수행되며, 여기서 깊이에서 감소는 개선된 치유와 관련된다.
도 4는 WOUNDCOM 1+2 및 3+4가 상처 깊이에서의 가장 빠른 감소(즉, 가장 빠른 상처 치유)를 제공하며, 완전한 상처 치유는 WOUNDCOM 1+2의 경우 7일에 도달한다는 것을 입증한다. 실험은 21일에 종료되었으며, 이때까지 자연 상처 치유, 감염된 상처 치유 및 콜라겐 드레싱 SoC는 상처 깊이에 의해 평가할 때 WOUNDCOM 1+2 및 3+4와 비교하여 여전히 동일한 수준의 상처 치유에 도달하지 않았다.
상처 기저부 조직 유형의 평가에 의해 측정된 상처 봉합
상처 봉합의 추가 평가는 상처 기저부 조직 유형의 측정, 특히 이전에 이용가능한 많은 상처 평가 도구를 개선하기 위해 개발된 삼각형의 상처 평가 접근법을 포함한다. 14개의 상처 평가 도구의 연구에 이어서, 각각이 상처 상태의 특정 매개변수를 기록하는 프레임워크를 제공했지만 어느 것도 최적의 상처 평가를 위한 모든 기준을 충족하지 못했고 많은 도구가 치유하고, 케어를 계획하고 중요한 개입을 결정하기 위한 목표를 설정하는 관점에서 실행을 안내하지 못했다는 것이 발견되었다(Anderson K, Hamm RL. Factors that impair wound healing. J Am Coll Clin Wound Specialists 2012; 4(4): 84-91. 11). 삼각형 접근법은 그러한 이전의 상처 평가 기준과 비교하여 개선된 평가이다.
상처 기저부 조직 유형의 평가를 위한 채점 시스템은 World Union of Wound Healing Societies (WUWHS), Florence Congress, Advances in wound care: the Triangle of Wound Assessment, Wounds International, 2016에 기술되어 있고 상기 표에 요약되어 있다.
도 5는 다시 한 번 WOUNDCOM 1+2 및 3+4가 상처 기저부 점수를 더 빠르게 개선하고 실험의 종료 때까지 전반적으로 더 높은 점수에 도달하는 다른 모든 조건을 능가한다는 것을 입증한다.
상처 기저부에서 박테리아 부하의 평가
항균 특성은 또한 병원에서 기회 감염과 연관된 그람-음성 호기성 막대 박테리아인 슈도모나스 에어루기노사로 전체 두께 상처를 감염시킴에 의해 다양한 WOUNDCOM 조건에 대해 테스트되었다. 항균 활성은 상처당 로그 콜로니 형성 단위(log CFU/상처)에 의해 측정될 때 박테리아의 수에서 감소에 의해 입증된다.
도 6은 WOUNDCOM의 모든 변형(1, 2, 3 및 4)이 제어 조건과 비교하여 개선된 항균 활성을 나타내어, WOUNDCOM 1이 가장 잘 수행하고 WOUNDCOM 2, 3 및 4도 높은 항균 특성을 나타냄을 입증한다.
결론
요약하면, 도 3-6의 데이터로부터 WOUNDCOM이 감염된 상처를 치료하는 안전하고 효과적인 수단을 제공하고 WOUNDCOM이 이펙터 분자 없는 다른 콜라겐 막과 비교하여 빠른 상처 봉합 및 상처 치유를 촉진한다는 것이 분명하다.
WOUNDCOM 1+2(PLL 없음)는 WOUNDCOM 3+4(PLL 함유)보다 더 효율적으로 상처 크기 감소를 가속화하고, 3μM 이펙터 함량(WOUNDCOM 1 및 3)과 30μM 이펙터 함량(WOUNDCOM 2 및 4) 사이에 상처 크기 감소에서 차이가 관찰되지 않았다. WOUNDCOM 1은 상처 기저부에서 가장 높은 박테리아 부하 감소 속도를 나타냈다.
종합하면, 도 3-6에 제시된 데이터는 콜라겐 VI 알파-3 사슬에서 유래된 생물활성 펩티드의 적절한 조합이 인간 상처 치유와 밀접하게 닮은 돼지 모델에서 생체내 피부 상처 치유를 강력하게 자극한다는 것을 보여준다. 뮤어라인 연구와 마찬가지로, GVR28 및 SFV33 조합(WOUNDCOM)이 함침된 콜라겐 I 상처 매트릭스의 우수한 상처 치유 효과는 다른 테스트된 상처 매트릭스에 대해 상당히 덜 두드러졌다. 이들 효과는 콜라겐 VI으로부터 유래된 펩티드의 조합으로 코팅된 생체물질의 우수한 상처 치유 특성을 초래할 것으로 예상된다. 이 코팅 전략은 개선된 상처 복구 촉진하고 비정상적인 흉터 형성을 감소시키는 가능성과 함께 상처 환경에 유익할 것이다.
실시예 3 - 콜라겐 VI 펩티드의 안정성(독립형)
콜라겐 VI 펩티드 GVR28 및 SFV33의 안정성을 평가했다. 안정성으로 본 발명자들은 특정 온도, 특히 -20℃ 또는 25℃에서 펩티드의 순도 및/또는 펩티드의 장기 안정성을 포함한다.
i. 초기 안정성 테스트
콜라겐 VI-유래된 펩티드 GVR28 및 SFV33은 펩티드 합성 공급자에 의해 비-cGMP 하에서 합성되었다.
콜라겐 VI-유래된 펩티드 GVR28 및 SFV33은 벤치 탑 조건에서 -20℃ 또는 25℃에서 3년 동안 저장되었다. 펩티드는 그 상처 치유(시험관내 스크래치 테스트를 통해) 및 항균 특성(실행가능한 계수 검정을 통해)에 대해 규칙적 간격으로 테스트되었다.
결과
시험관내 스크래치 테스트는 HaCaT 세포에 대한 펩티드의 세포독성 효과가 없으며 펩티드의 상처 치유 활성이 테스트 기간 동안 감소하지 않았음을 나타냈다. 생존가능한 계수 검정은 테스트 기간 내내 감소하지 않은 펩티드의 연속적인 광범위한 항균 활성을 보여주었다.
어느 하나의 저장 온도에서 3년의 기간 동안 이들 매개변수에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
ii. 추가 안정성 및 순도 테스트
GVR28과 SFV33 둘 모두는 비-cGMP 조건 하에서 합성되었다. 펩티드는 그 순도(크로마토그래피, LC-MS)를 평가하고 펩티드 합성 동안 생성되는 불순물/관련된 물질을 평가하기 위한 테스트 및 분석 방법을 평가 및 검증하기 위한 조사 대상이었다. 이 평가는 위험 관리의 일부로 물질 특성화에 사용된다. 배경으로, 펩티드 GVR28 및 SFV33의 합성 동안 관련된 물질로도 언급되는 소량의 불순물이 공정의 정상적인 부분으로 생성된다. 관련된 물질은 예를 들어 절삭된 펩티드 또는 변형된 아미노산을 포함하는 펩티드이다. 이 분획은 가능한 한 최소화된다. 물질 사양에 따라 최대 5%의 불순물이 허용된다. 공정 전개 동안 관련된 물질이 분석되고, 상한은 모든 물질에 대해 ≥0,50%의 농도로 한정되었다. 모든 불순물 ≥0,10%는 분석의 증명서에 보고되었다.
분석 동안 콜라겐 VI-유래된 펩티드 GVR28 및 SFV33은 정량 크로마토그래피에 의해 분석되고 불순물은 그 상대 체류 시간(RTT), 피크 면적 및 계산된 분자량에 의해 특성화되었다. 그 계산된 분자량을 기준으로 제안된 분자 구조를 가진 불순물/관련된 물질이 평가되고, 뿐만 아니라 잠재적인 생체적합성/독성 문제의 평가를 하였다.
GVR28 및 SFV33 펩티드 제제 둘 모두는 Tech 배치에서 96%의 순도로 고도로 순수하다.
각 펩티드 제제는 몇 가지 불순물/관련된 물질을 함유하며, 이는 두 그룹으로 분할될 수 있다:
(1) 아미노산이 누락된 절삭된 펩티드
절삭된 펩티드는 일반적으로 불활성인 것으로 간주된다. 이는 숙주 방어 펩티드의 활성이 펩티드 가닥을 따라 하전된 소수성 아미노산의 올바른 배열을 포함하여 그의 2차 구조에 고도로 의존한다는 사실에 기인한다[50, 51]. 흥미롭게도, 길이가 증가하는 AMP는 막에 대해 더 파괴적이어서(세포독성), 절삭된 펩티드가 원래의 전체-길이 펩티드보다 세포독성이 훨씬 적다는 것이 또한 기술되었다([50]).
(2) 아미노산 변형을 갖는 펩티드
모든 펩티드 변형은 비-독성으로 분류되고, 따라서 최종 생성물에 해를 끼치지 않는다. 이들 결과는 데이터베이스 검색(ECHA, PubChem)에 기반된다. 그러나, 독성 가상 펩티드 변형인 1,1,3,3-테트라메틸 구아니딘이라는 한 가지 예외가 있다. 중요한 것은 이 물질이 아미노산 변형으로서 폴리펩티드 사슬의 필수적인 부분이 될 것이고, 따라서 유리 화학적 형태에서 최종 생성물에 존재하지 않는다. 더욱이, 그것은 독성 농도 수준보다 훨씬 낮은, 매우 낮은 농도로 존재할 것이고, 따라서 최종 생성물에 해를 끼치지 않는다.
따라서, 확인된 펩티드 및 불순물은 임의의 독성 또는 생체적합성 문제를 나타내지 않았다.
ii. 추가 안정성 테스트
GVR28 및 SFV33 둘 모두는 cGMP 조건 하에서 AmbioPharm Inc.에 의해 합성되었다. 개별 펩티드 GVR28 및 SFV33(즉, WOUNDCOM 형식이 아님)은 -20℃ 및 +25℃ 둘 모두에서 지속적인 안정성 테스트에 대한 대상이다. 이들은 최대 24개월 동안 수행될 것이다.
안정성 연구는 AmbioPharm의 내부 표준 운영 절차(SOP)인; Slab 11.12-005 "Stability Study Management Procedure", 및 개별 안정성 프로토콜인; GVR28의 경우 APi3091(FP.231-3)-001, 및 SFV33의 경우 APi3092(FP.232-3)-001에 따라 수행된다.
SOP는 API에 대한 안정성 연구의 계획 및 수행에 대해 다음 적용가능한 문서를 참조하다:
ㆍ 신규 약물 물질 및 생성물의 산업 Q1A(R2) 안정성 테스트를 위한 지침
ㆍ 산업 Q1E 안정성 데이터 평가를 위한 지침
ㆍ ICH Q7 - 활성 약학적 성분에 대한 우수 제조 관행 지침, 하위 파트 11.5 "API의 안정성 모니터링"
ㆍ Eudralex 볼륨 4, 파트 II: 섹션 11.5 "API의 안정성 모니터링"
ㆍ 중국 약전(2020년 판) 볼륨 IV, 9001-활성 약학적 성분 및 완제 의약품의 안정성 테스트
결과
아래는 0일차(0D) 및 3개월에서 안정성 테스트로부터의 실험 결과이다. 표 8 및 9는 각각 -20℃ 및 25℃에서 GVR28의 저장에 대한 안정성 결과를 보여준다. 표 10 및 11은 각각 20℃ 및 25℃에서 SFV33의 저장에 대한 안정성 결과를 보여준다. 25℃는 가속된 조건을 나타내기 위해 선택되었다.
이 연구는 장기 펩티드 안정성과 잠재적 위험에 대한 유용한 정보와 징후를 제공하는 것으로 여겨진다.
표 8: -20℃에서, 0 및 3개월에 GVR28(서열번호: 1)에 대한 안정성 결과
Figure pct00010
*RRT는 근사치임
생성물 코드: FP.231-1
표 9: +25℃에서, 0, 1 및 3개월에 GVR28(서열번호: 1)에 대한 안정성 결과
Figure pct00011
*RRT는 근사치임
생성물 코드: FP.231-3
표 10: -20℃에서, 0 및 3개월에 GSFV33(서열번호: 5)에 대한 안정성 결과
Figure pct00012
생성물 코드: FP.232-3
표 11: +25℃에서, 0, 1 및 3개월에 GSFV33(서열번호: 5)에 대한 안정성 결과
Figure pct00013
생성물 코드: FP.232-3
-20℃에서 저장된 GVR28 또는 SFV33에 대해 0일차와 3개월 시점 사이에 분해는 관찰되지 않았다. 순도에서 약간의 감소가 초기 3개월 동안 25℃에서 저장된 GVR28 및 SFV33에 대해 관찰되었다. 그러나, 3개월에서 순도 수준은 허용 기준 내에 있었다.
25℃에서 저장된 SFV33의 경우 3개월에 일부 새로운 불순물이 검출되었지만 이는 순도가 감소할 때 예상되는 것이다. 물 함량은 3개월에 걸쳐서 증가했지만 여전히 허용 기준 내에 있었다.
3개월 후 실온에서 관찰되는 SFV33-불순물이 평가될 것이지만 임의의 문제를 일으키지 않고 무해한 절삭 및 비활성 서열인 것으로 예상된다.
진행 중인 장기 펩티드 안정성 테스트는 외양, 동일성, 순도/관련된 불순물 및 물 함량과 관련하여 콜라겐 VI 펩티드(GVR28 및 SFV33)의 안정성에 유의한 변화가 없음을 보여준다. 안정성 연구는 콜라겐 VI 펩티드가 상업적으로 및 임상적으로 관련된 기간 동안 그 동결-건조된 상태에서 안정할 것임을 나타낸다.
실시예 4 - 콜라겐 VI 펩티드를 포함하는 조립된 WOUNDCOM의 안정성
WOUNDCOM은 2개의 독립적인 회사에 의해 생산되었고 전자현미경에 의해 다음을 포함한 서로 다른 중요한 생성물 안정성 매개변수가 평가되었다:
(i) 장기 콜라겐 I 피브릴 및 콜라겐 I 스폰지 안정성 및 완전성(특히, 총체적 외양 및 콜라겐 스폰지 기공 크기); 및
(ii) 금 표지된 다클론 항체로 정량적 전자현미경을 통한 WOUNDCOM 매트릭스에서 장기 펩티드 안정성 및 농도.
WOUNDCOM 제조 공정
안정성을 평가하기 위해, WOUNDCOM 단위를 다음과 같이 제작했다.
소 콜라겐 I
소 콜라겐 I을 기계적 수단에 의해 수확했다. 진피를 칼로 밑에 있는 조직(지방, 근육, 뼈)과 표피(분열된 피부 생산)에서 분리했다. 힘줄은 근육과 뼈에서 기계적으로 분리했다.
TSE/BSE의 위험을 줄일뿐만 아니라 원 물질에 잔류할 수 있는 다른 미생물의 전이를 줄이기 위해, ISO 22442-시리즈 표준에 규정된 절차를 고수하여 적절한 조달, 추적성, 취급 및 제어를 보장하였다. 예를 들어, 무리는 BSE가 없고 지속적인 제어 하에 있었고, 조직 수확 방법은 중추 신경계 조직과 같이 잠재적으로 TSE-오염될 수 있는 신체 부위와의 접촉을 조심스럽게 피했다.
콜라겐 현탁액으로의 가공은 미생물이 생존하기 힘들고 생성된 콜라겐 현탁액은 기본적으로 미생물의 부하가 충분히 감소되었다. ISO 22442-3에 따른 바이러스 불활성화 연구는 가공 단계가 바이러스 부하를 충분히 감소시켰다는 것을 검증했다. 또한, 가공된 콜라겐에는 세포, 세포 파편, 지질, RNA 및 DNA가 없었다.
작업흐름은 인간 콜라겐 VI의 알파 3-사슬의 서열의 정확한 복제본인 소 콜라겐 I 인간 콜라겐 VI 펩티드 GVR28 및 SFV33의 안정적이고 재현가능한 생산을 보장했다. 펩티드는 각각 대략 3μM의 농도로 생성물에 존재했다. 이 펩티드 양은 원하는 효과를 제공하는 것으로 나타났다. 펩티드는 표준 화학 펩티드 합성에 의해 합성적으로 제작되었다. 최종 동결-건조된 물질의 펩티드 함량은 ≥70%이다. 나머지 내용물은 물과 아세테이트이다. 펩티드 내용물 중 GVR28 또는 SFV33의 순도는 각각 >95% 범위였다. 0.50%를 초과하는 임의의 단일 불순물은 기본적으로 제조업체에 의해 특성화되었다. GVR28 및 SFV33에 대해 주요 불순물이 분석 및 평가되었다. 그것은 손상된 또는 온전하지 않은 기능을 갖는 절삭되거나 변형된 펩티드로 구성된다.
이 작업흐름은 합성의 생물활성 인간 콜라겐 VI 펩티드의 안정적이고 재현가능한 생산을 보장한다.
WOUNDCOM은 다음과 같이 제작되었다:
1. 콜라겐 VI 펩티드를 화학적으로 합성한 다음 동결 건조하고 유리 바이알에 포장하고 냉동고에 보관하였다.
2. 순수한 천연 콜라겐 I 현탁액이 유도될 때까지 소 조직을 가공하였다.
3. 펩티드를 콜라겐 슬러리 안으로 기계적으로 혼합하였다.
4. 생성된 현탁액을 용기 안에 주입하고 얼린 다음 동결건조(동결-건조)했다.
5. 동결 건조와 관련하여 탈열수 가교(DHT)가 발생했다(비 화학적 가교)
6. 시트의 절단/슬라이싱 및 멸균 백 안으로 포장
7. 살균
최종 제작된 생성물은 담체(콜라겐 I)와 이펙터 분자(예를 들어, GRV28 및 SFV33)로 구성되며 - 이는 함께 WOUNDCOM 생성물을 형성한다.
WOUNDCOM 안정성 실험
WOUNDCOM 프로토타입은 제조업체 A와 제조업체 B에 의해 생산되었다. 그것은 실온 및 건조한 상태 하에서 저장되었다. 샘플은 생성물의 구조적 안정성 양태를 평가하기 위해 배송 시, 및 그 다음 상이한 시점에서 전자현미경에 의해 검사되었다.
이를 위해 상이한 WOUNDCOM 표본에서 콜라겐 피브릴 구조, 출생 및 구조 같은 매개변수를 스캐닝 및 투과 전자 현미경에 의해 샘플을 평가함에 의해 조사했다. 5개의 상이한 WOUNDCOM 패치가 5개의 상이한 영역으로 분할되었다. 각 영역으로부터, 총 125개 샘플에서 5개 상이한 샘플이 펀칭되었다(직경 2mm). 샘플은 확립된 일상적인 전자 현미경 샘플 준비를 거쳤다.
따라서, 생산 안정성 연구는 WOUNDCOM에서 주사 전자 현미경 및 투과 전자 현미경의 확립된 일상적인 방법론을 적용하도록 설계되었다. 이 기술은 WOUNDCOM 스캐폴드의 구조적 세부사항을 직접적으로 평가하는 유용한 도구로 입증되었다. 따라서, 자연 콜라겐 섬유/μm2의 밀도는 제조업체 A와 제조업체 B로부터의 WOUNDCOM 항목에서 제조 직후와 저장-수명 노화 동안 물질 품질에 대한 척도로 정량적으로 평가되었다(도 7-10).
또 다른 접근법에서, 생산 안정성 연구는 WOUNDCOM 스캐폴드 내 국소 GVR28 및 SFV33 농도 및 분포의 직접적 평가를 허용하는 WOUNDCOM에 정량적 면역 전자 현미경의 확립된 일상적인 방법론을 적용하도록 설계되었다. 상이한 WOUNDCOM 스캐폴드 전반에 걸쳐 GVR28 및 SFV33 농도 변동이 제작 후 및 저장-수명 노화 동안 평가되었다(도 11-13). 결과는 연구된 프로토타입의 품질의 지표로 역할을 하므로 제조 공정 매개변수에 관한 피드백으로 역할을 할 수 있다. 면역금 입자(검은색 점)의 수/μm2는 GVR28 및 SFV33 펩티드의 농도로 직접적으로 변환된다.
결과는 연구된 프로토타입의 품질의 지표로 역할을 하므로 제조 공정 매개변수에 관한 피드백으로 역할을 할 수 있다. 연구는 표준 절차 및 공개된 연구 프로토콜에 따라 실행되었다.
결과
제조업체 A(도 7)와 제조업체 B(도 8)인, 2개 상이한 제조업체에 의해 생산된 WOUNDCOM의 내부 콜라겐 피브릴 구조에 미치는 영향을 투과 전자 현미경을 사용하여 시간에 걸쳐서 평가했다. 검사된 모든 WOUNDCOM 표본은 약 10-12 콜라겐 피브릴/μm2의 콜라겐 피브릴 밀도를 갖는 균일한 초미세구조를 나타낸다. 콜라겐 피브릴은 63-67nm의 교차-줄무늬 주기로 고유한 것으로 보인다. 모든 WOUNDCOM 샘플은 높은 밀도의 천연 콜라겐 I 피브릴을 가진 균질한 초미세구조를 나타낸다. 콜라겐 I 템플릿의 초미세구조 특성은 제조업체와 독립적이고 테스트된 저장 수명 동안 변경되지 않았다.
제조업체 A(도 9)와 제조업체 B(도 10)인, 2개 상이한 제조업체에 의해 생산된 WOUNDCOM의 콜라겐 스폰지 구조에 미치는 영향을 주사 전자 현미경을 사용하여 시간에 걸쳐서 평가했다. 검사된 모든 WOUNDCOM 표본은 기공의 80%가 20 내지 60μm의 직경을 갖는 개방 다공성 초미세구조를 나타낸다. 제조업체 B 콜라겐 템플릿은 기공 크기 분포와 관련하여 초미세구조 외양에서 더 균일하게 나타난다. 평가된 모든 WOUNDCOM 패치는 테스트된 저장 수명 동안 그 아키텍처가 변경되지 않았다.
제조업체 A와 제조업체 B인, 콜라겐 2개 상이한 제조업체에 의해 생산된 WOUNDCOM에서 SFV33 및 GVR28 분포에 미치는 영향을 시간에 걸쳐서 평가했다(도 11-13). 5개 상이한 WOUNDCOM 패치로부터 상이한 WOUNDCOM 샘플에서 GVR28 및 SFV33의 농도는 정량적 면역 전자 현미경에 의해 시간에 걸쳐서 평가하였다(도 11-13). 면역금 입자의 수/μm2는 무작위로 선택된 영역에서 계산되었다. 선택한 실험 조건은 면역금 입자의 수/μm2를 표적 구조의 실제 농도(즉, 국지 GVR28 및 SFV33 농도)로 직접적으로 변환하도록 허용했다.
GVR28과 SFV33 둘 모두는 모든 조사된 WOUNDCOM 패치의 콜라겐 스캐폴드에 균일하게 분포되었다. 양 펩티드에 대한 국소 농도에서의 계산된 변동은 약 +/- 10%의 범위였다. 제조업체 A와 제조업체 B에의해 제작된 WOUNDCOM 간에 차이점은 발견되지 않았다.
GVR28 및 SFV33은 모든 조사된 WOUNDCOM 패치에서 균일하고 재현가능한 분포 및 농도를 분명하게 나타낸다. 따라서 WOUNDCOM은 안정적이고 재현가능한 제작 공정에 의해 생산된다.
제조업체 B와 제조업체 A에 의한 WOUNDCOM의 생산 기술이 본질적으로 동일하기 때문에 제조업체 B로부터 WOUNDCOM 장치의 장기 안정성은 제조업체 A에 의해 생산된 WOUNDCOM 장치와 12개월 후 동일한 안정성을 입증할 것임이 가정될 수 있다.
결론
평가된 상이한 시점에서 WOUNDCOM의 미세 구조 또는 펩티드 농도에서, 주사 전자 현미경 외양이나 투과 전자 현미경 수준에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
종합하면, 이들 결과는 WOUNDCOM 상처 드레싱이 강력하고 재현가능한 생산 프로필을 가지고 따라서 만성 감염된 상처의 관리에 신뢰할 수 있는 이점이 있음을 나타낸다. 더욱이, 이 평가는 또한 제조업체 A와 제조업체 B 둘 모두에서 WOUNDCOM의 동등한 생산을 보여준다.
데이터는 WOUNDCOM이 관련 환경에서 생성물의 효과적인 활용에 충분한 (예를 들어, 클리닉 또는 병원에서 제작, 유통 및 사용에 충분한 시간을 제공하는) 적어도 1년의 저장 수명을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 5 - 다른 막과 생물활성 콜라겐 VI 펩티드를 포함하는 WOUNDCOM의 상처 치유 및 항균 효과 비교
WOUNDCOM의 상처 치유 효과와 항균 활성을 ProHeal의 것과 비교했다. ProHeal은 100% 콜라겐 생성물이고 WOUNDCOM과 동일한 기본 물질을 가지고 있으므로 생물활성 콜라겐 VI 펩티드의 효과를 평가하기 위한 비교자로 작용한다. Whatman 셀룰로오스는 증가된 섬유아세포 증식에서 콜라겐 기본 물질의 기여에 대한 이해를 제공하기 위해 추가 대조군으로 사용되었다.
WOUNDCOM은 생물활성 콜라겐 VI 폴리펩티드 GVR28 및 SFV33과 조합하여 콜라겐-기반 담체를 포함한다.
i. 막의 상처 치유 효과를 평가하는 시험관내 테스트
물질 및 방법
WOUNDCOM의 멸균되지 않은 샘플은 제조업체 B에 의해 생산되었다. 멸균 ProHeal 샘플(REF 83030-001, 배치 번호 2001099)은 MedSkin Solutions에 의해 생산되었다. Whatman 셀룰로오스 여과지(REF 10 311 611, 배치 번호 G1504017)가 사용되었다.
진피 섬유아세포(Lonza #CC2511), FBM-배지(Lonza #CC3131), 시약, 기구 등은 아래에 설명된 바와 같다:
Figure pct00014
프로토콜
펀치의 준비
ㆍ 6.2에 정의된 6개 상이한 상처 패드로부터 원형 펀치는 멸균 조건 하에서 조직 8mm 생검 천공기에 의해 준비된다.
진피 섬유아세포의 전배양 및 시딩
ㆍ 진피 섬유아세포에 특이적인 Lonza의 권장사항에 따라 세포를 해동한다(회전 없음)
ㆍ 보충이 있는 FBM 배지에서 세포를 성장시킨다. 세포가 보다 컨플루언스가 됨에 따라 배지의 증가하는 부피를 사용한다(25% 컨플루언스 하에 1ml/5㎠; 25-45% 1,5ml/5㎠; >45% 2ml/5㎠).
ㆍ 세포는 시딩의 일자에 대략 60-80% 컨플루언스되어야 한다.
ㆍ 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세정한다.
ㆍ 론자 트립신을 추가한다
ㆍ 세포가 방출된 후 FBS를 갖는 두 배 부피의 배지를 추가한다.
ㆍ 300xg에서 5분 동안 회전한다
ㆍ 상등액을 흡인하고 배지에 세포를 재현탁한다
ㆍ 세포 농도를 결정하고 세포를 희석한다.
ㆍ 펀치를 제자리에 고정하기 위해 바닥에 50ul 배지를 갖는 12-웰 플레이트에 펀치를 놓는다.
ㆍ 펀치 상에 세포를 시딩한다
a. 이중으로 10.000 세포/50ul 배지(EM) 또는
b. 삼중으로 20.000 세포/50ul 배지(증식)
ㆍ 1시간 동안 세포가 펀치에 부착되도록 한다
ㆍ 1400ul 배지를 웰에 부드럽게 추가한다
ㆍ 0, 24, 48 및 96시간 동안 세포를 인큐베이션한다.
ㆍ 96시간 샘플의 경우 배지는 48시간 후에 교체된다.
전자현미경을 위한 세포의 준비
ㆍ 패드 펀치 상에 0, 24, 48 및 96시간 동안 인큐베이션된 세포는 PBS에서 1회 세정된다
ㆍ 샘플은 그 다음 EM 픽스(스폰서에 의해 제공됨)에 고정되어 스폰서에게 전달된다
동일한 양의 세포(10.000)가 3가지 샘플 유형(WOUNDCOM, ProHeal 및 Whatman 셀룰로오스 여과지)에 적용되었다. 3개 상이한 샘플의 상처 치유 효과는 주어진 샘플에 대한 세포 부착 및 증식을 평가함에 의해 시험관내에서 테스트되었다. 이것은 상기에서 설명한 방법을 사용하여 평가되었다).
결과
시험관내 연구의 결과는 도 14에 제시되어 있다. 계수된 세포의 최대 수(WOUNDCOM 96시간의 경우 119개 세포)는 y-축에서 100%로 설정되었다.
동일한 양의 세포가 3가지 샘플 유형에 적용되었다. 상이한 시작 번호는 이미 t=0부터 콜라겐 VI 펩티드(GVR28 및 SFV33)가 존재하는 물질에 세포가 부착하는 것이 더 쉬울 수 있음을 나타낸다. 이후 WOUNDCOM은 섬유아세포 세포 증식을 촉진한다. WOUNDCOM에 대해 관찰된 섬유아세포 밀도에서 증가는 ProHeal에 대해 관찰된 것의 적어도 2배, Whatman 셀룰로오스 여과지에 대해 관찰된 것의 적어도 4배였다.
요약하면, WOUNDCOM은 다른 막에 비해 월등한 상처 치유 효과를 나타낸다.
ii. 막의 항균 활성을 평가하는 시험관내 테스트
물질 및 방법
이 연구에 사용된 WOUNDOM, ProHeal 및 Whatman 셀룰로오스 섬유의 샘플은 상기의 상처 치유 실험에서 설명한 것과 동일하다.
상이한 샘플의 항균 활성은 다음 방법에 의해 주어진 막 표면에 대한 박테리아 사멸을 결정함에 의해 시험관내에서 평가되었다.
박테리아 균주
슈도모나스 에어루기노사
표 1 - 슈도모나스 에어루기노사 CCUG 56489에 관한 정보
Figure pct00015
스타필로코커스 아우레우스
표 2 - 스타필로코커스 아우레우스 CCUG 10778에 관한 정보
Figure pct00016
물질 및 시약 리스트
Figure pct00017
지시
표 9 - 사용된 장비에 관한 정보
Figure pct00018
박테리아 배양의 성장
다음 절차는 S. 아우레우스 및 P. 에어루기노사에 대해 동일하다.
실험 이전 일주일 이내에, 작은 루프의 박테리아 스톡을 비-선택적 한천 플레이트(TSA) 상에 줄무늬 도말하고 37℃±1℃에서 밤새 인큐베이션했다. 배양물을 사용 이전에 순도에 대해 육안으로 검사했다. 모든 박테리아 콜로니를 검사하여 동일한 콜로니 형태와 색상을 나타내는지 체크했다.
실험 이전 날(-1일차), TSA 플레이트로부터 작은 루프를 사용하여 20mL TSB 배지를 함유하는 2개의 멸균 50mL 삼각 플라스크에 접종했다. 플라스크를 진탕(300rpm)하면서 37℃±1℃에서 인큐베이션하였다.
실험 당일(0일차), 밤샘 배양물로부터 분취량을 TSB 배지에 10× 희석하고 OD600을 측정했다. 이전 측정에서 밤샘 배양은 대략적으로 109 CFU/mL의 밀도로 성장했다.
전자 현미경 분석을 위한 샘플 준비
테스트 항목 샘플을 멸균 24-웰 플레이트 안에 넣었다. 밤샘 배양으로부터의 분취량을 연속 희석하고 TSA 플레이트 상에 도말하여 세포 밀도를 결정하였다. 밤샘 배양으로부터의 50μL 분취량을 테스트 항목 샘플 상에 피펫팅하고 습식 챔버에서 37±1℃에서 0시간(10초), 0.5시간, 1시간 및 2시간 동안 인큐베이션했다. 각 인큐베이션 시간의 말단에서, 테스트 항목 샘플을 멸균 24-웰 플레이트에서 1mL EM 픽스에 넣고 EM 분석을 위해 스폰서에게 전달하여 활성/생존을 결정한다.
결과
시험관내 항균 활성 실험의 결과는 도 15에 제시되어 있다. 노출 30분 후 WOUNDCOM 상에서 박테리아 생존의 감소가 관찰되었다. 구체적으로, 스타필로코커스 아우레우스의 생존에서 18% 감소가 관찰되었고, 슈도모나스 에어루기노사의 25%의 생존에서 감소가 관찰되었다. 60분 후 WOUNDCOM 샘플의 표면 상의 박테리아 생존율은 S. 아우레우스의 경우 30%, P. 에어루기노사의 경우 20%였으며, 이는 각각 70% 및 80%의 박테리아 생존에서 감소를 나타낸다. 연구의 종료 시(120분) WOUNDCOM 샘플의 표면 상의 S. 아우레우스 및 P. 에어루기노사의 생존은 10% 미만이었다. 전체 연구(0 내지 120분)에 걸쳐 비교자 막은 단지 제한된(ProHeal) 또는 감지할 수 없는(셀룰로오스 여과지) 항균 효과를 나타냈다.
본 연구에서 수집된 결과는 WOUNDCOM이 스타필로코커스 아우레우스 및 슈도모나스 에어루기노사와 같은 박테리아에 대한 항균 효능을 가지고 항균 효과가 테스트된 다른 막(ProHeal 및 여과지)보다 월등하다는 것을 입증한다.
참조문헌
1. Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, Longaker MT. Wound repair and regeneration. Nature 2008;453:314-21.
2. Sen CK, Gordillo GM, Roy S, Kirsner R, Lambert L, Hunt TK, Gottrup F, Gurtner GC, Longaker MT. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen 2009;17:763-71.
3. Moura LI, Dias AM, Carvalho E, de Sousa HC. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment--a review. Acta Biomater 2013;9:7093-114.
4. Guo S, Dipietro LA. Factors affecting wound healing. J Dent Res 2010; 89:219-29.
5. Sen CK, Gordillo GM, Roy S, Kirsner R, Lambert L, Hunt TK, Gottrup F, Gurtner GC, Longaker MT. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair Regen 2009;17:763-71.
6. Shah JMY, Omar E, Pai DR, Sood S. Cellular events and biomarkers of wound healing. Indian J Plast Surg 2012;45:220-28.
7. Weller C, Sussman G. Wound dressings update. J Pharm Prac Res 2006;36: 318-24.
8. Pereira RF, Barrias CC, Granja PL, Bartolo PJ. Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair. Nanomedicine (Lond) 2013; 8:603-21.
9. Martin, P. Wound healing - aiming for perfect skin regeneration. Science 1997;276:75-81.
10. Kirby, G.T., Mills, S.J., Cowin, A.J., Smith, L.E. Stem cells for cutaneous wound healing. Biomed Res Int 2015;2015:285869.
11. Isakson M, de Blacam C, Whelan D, McArdle A, Clover AJ. Mesenchymal stem cells and cutaneous wound healing: current evidence and future potential. Stem Cells Int 2015;2015:831095.
12. Sinno H, Prakash S. Complements and the wound healing cascade: an updated review. Plast Surg Int 2013;2013:146764.
13. Wound healing: an overview. Broughton G 2nd, Janis JE, Attinger CE. Plast Reconstr Surg 2006;117(7 Suppl):1e-S-32e-S.
14. Das S, Baker AB. Biomaterials and Nanotherapeutics for Enhancing Skin Wound Healing. Front Bioeng Biotechno 2016;4:82. eCollection 2016.
15. Hunt TK. The physiology of wound healing. Ann Emerg Med 1988;17:1265-73
16. Abou Neel EA, Bozec L, Knowles JC, Syed O, Mudera V, Day R, Hyun JK. Collagen ― Emerging collagen based therapies hit the patient Adv Drug Deliv Rev 2013;65:429-56.
17. An B, Lin YS, Brodsky B. Collagen interactions: Drug design and delivery. Adv Drug Deliv Rev 2016;97:69-84.
18. Collagen-based biomaterials for tissue engineering applications. Parenteau-Bareil R., Gauvin R., Berthod F. Materials 2010;3:1863-87.
19. Chattopadhyay S, Raines RT. Review collagen-based biomaterials for wound healing. Biopolymers 2014;101:821-33.
20. Baum CL, Arpey CJ. Normal cutaneous wound healing: clinical correlation with cellular and molecular events. Dermatol Surg 2005;31:674-86.
21. Ghica MV, Albu Kaya MG, Dinu-Pirvu CE, Lupuleasa D, Udeanu DI. Development, Optimization and In Vitro/In Vivo Characterization of Collagen-Dextran Spongious Wound Dressings Loaded with Flufenamic Acid. Molecules 2017;22:1552.
22. Guo R, Lan Y, Xue W, Cheng B, Zhang Y, Wang C, Ramakrishna S. Collagen-cellulose nanocrystal scaffolds containing curcumin-loaded microspheres on infected full-thickness burns repair. J Tissue Eng Regen Med 2017;11:3544-55.
23. Bhowmick S., Thanusha A. V., Kumar A., Scharnweber D., Rother S., Koul V. (2018). Nanofibrous artificial skin substitute composed of mPEG-PCL grafted gelatin/hyaluronan/chondroitin sulfate/sericin for 2nd degree burn care: in vitro and in vivo study. RSC Adv 2018;8:16420-32.
24. Yoon D, Yoon D, Cha HJ, Lee JS, Chun W. Enhancement of wound healing efficiency mediated by artificial dermis functionalized with EGF or NRG1. Biomed Mater 2018;13:045007.
25. Powell HM, Supp DM, Boyce ST. Influence of electrospun collagen on wound contraction of engineered skin substitutes. Biomaterials 2008;29:834-43.
26. Hall Barrientos IJ, Paladino E, Szabo P, Brozio S, Hall PJ, Oseghale CI, Passarelli MK, Moug SJ, Black RA, Wilson CG, Zelko R, Lamprou DA. Electrospun collagen-based nanofibres: A sustainable material for improved antibiotic utilisation in tissue engineering applications. Int J Pharm 2017;531:67-79.
27. Golser A. V., Ro M., Bo H. G., Scheibel T. Engineered collagen: a redox switchable framework for tunable assembly and fabrication of biocompatible surfaces. ACS Biomater Sci Eng 2018;4:2106-14.
28. Velnar T, Bailey T, Smrkolj V. The wound healing process: an overview of the cellular and molecular mechanisms. J Int Med Res 2009;37:1528-42.
29. Abdillahi SM, Maaβ T, Kasetty G, Stromstedt AA, Baumgarten M, Tati R, Nordin SL, Walse B, Wagener R, Schmidtchen A, Morgelin M. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity J Immunol 2018;201:1007-1020.
30. Yount, N. Y., Bayer, A. S., Xiong, Y. Q., and Yeaman, M. R. (2006) Advances in antimicrobial peptide immunobiology. Biopolymers 84, 435-458
31. Teixeira, V., Feio, M. J., and Bastos, M. (2012) Role of lipids in the interaction of antimicrobial peptides with membranes. Progress in lipid research 51, 149-177
32. Specks, U., Mayer, U., Nischt, R., Spissinger, T., Mann, K., Timpl, R., Engel, J., and Chu, M. L. (1992) Structure of recombinant N-terminal globule of type VI collagen alpha 3 chain and its binding to heparin and hyaluronan. The EMBO journal 11, 4281-4290
33. Chu, M. L., Pan, T. C., Conway, D., Kuo, H. J., Glanville, R. W., Timpl, R., Mann, K., and Deutzmann, R. (1989) Sequence analysis of alpha 1(VI) and alpha 2(VI) chains of human type VI collagen reveals internal triplication of globular domains similar to the A domains of von Willebrand factor and two alpha 2(VI) chain variants that differ in the carboxy terminus. The EMBO journal 8, 1939-1946
34. Chu, M. L., Zhang, R. Z., Pan, T. C., Stokes, D., Conway, D., Kuo, H. J., Glanville, R., Mayer, U., Mann, K., Deutzmann, R., and et al. (1990) Mosaic structure of globular domains in the human type VI collagen alpha 3 chain: similarity to von Willebrand factor, fibronectin, actin, salivary proteins and aprotinin type protease inhibitors. The EMBO journal 9, 385-393
35. Chu, M. L., Pan, T. C., Conway, D., Saitta, B., Stokes, D., Kuo, H. J., Glanville, R. W., Timpl, R., Mann, K., and Deutzmann, R. (1990) The structure of type VI collagen. Annals of the New York Academy of Sciences 580, 55-63
36. Lamande, S. R., Morgelin, M., Adams, N. E., Selan, C., and Allen, J. M. (2006) The C5 domain of the collagen type VI alpha3(VI) chain is critical for extracellular microfibril formation and is present in the extracellular matrix of cultured cells. The Journal of biological chemistry 281, 16607-16614
37. Cescon, M., Gattazzo, F., Chen, P., and Bonaldo, P. (2015) Collagen VI at a glance. Journal of cell science 128, 3525-3531
38. Isenhath, S.N., Fukano, Y., Usui, M.L., Underwood, R.A., Irvin, C.A., Marshall, A.J., Hauch, K.D., Ratner, B.D., Fleckman, P., and Olerud, J.E. (2007) A mouse model to evaluate the interface between skin and a percutaneous device. J Biomedical and Material Research 83A, 915-922
39. Lin Q., Fang, D., Fang, J., Ren, X., Yang, X., Wen, F., and Su, S.B. (2011) Impaired wound healing with defective expression of chemokines and recruitment of myeloid cells in TLP3-deficient mice. Journal of Immunology 186, 3710-3717
40. Canesso, M.C.C., Vieira, A.T., Castro, T.B.R., Schirmer, B.G.A., Cisalpino, D., Martins, F.S., Rachid, M.A., Nicoli, J.R., Teixeira, M.M., and Barcelos, L.S. (2014) Skin Wound Healing Is Accelerated and Scarless in the Absence of Commensal Microbiota. Journal of Immunology 193, 5171-5180
41. Terhorst, D., Chelbi, R., Wohn, C., Malosse, C., Tamoutounour, S., Jorquera, A., Bajenoff, M., Dalod, M., Malissen, B., and Henri, S. (2015) Dynamics and Transcriptomics of Skin Dendritic Cells and Macrophages in an Imiquimod-Induced, Biphasic Mouse Model of Psoriasis. Journal of Immunology 195, 4953-4961
42. Punjataewakupt, A., Napavichayanun, S., Aramwit, P. (2019) The downside of antimicrobial agents for wound healing. Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 38(1):39-54
43. Dill V, Morgelin M (2020) Biological Dermal Templates with Native Collagen Scaffolds Provide Guiding Ridges for Invading Cells and may Promote Structured Dermal Wound Healing. Int Wound J 17 :618-30.
44. Tati R, Nordin S, Abdillahi SM, Morgelin M. (2018) Biological Wound Matrices with Native Dermis-like Collagen Efficiently Modulate Protease Activity. J Wound Care 27 :199-209.
45. Tajima S, Ting JPY, Pinnell SR, Kaufman RE. (1984) Isolation and Characterization of a Human Pro alpha 2(I) Collagen Gene Segment. J Invest Derm 82 :265-69.
46. Ricard-Blum S. (2011) The Collagen Family. Cold Spring Harb Perspect Biol 3 :a004978.
47. Buckley M (2016) Species Identification of Bovine, Ovine and Porcine Type 1 Collagen; Comparing Peptide Mass Fingerprinting and LC-based Proteomics Methods. Int J Mol Sci 17 :445.
48. Junker JPE, Kamel RA, Caterson EJ, Eriksson O. (2013) Clinical Impact upon Wound Healing and Inflammation in Moist, Wet and Dry Environments. Adv Wound Care (New Rochelle) 2 :348-56.
49. Abdillahi SM, Maaβ T, Kasetty G, Stromstedt AA, Baumgarten M, Tati R, Nordin SL, Walse B, Wagener R, Schmidtchen A, Morgelin M. (2018) Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. J Immunol 201 :1007-1020.
50. Jianbo Sun, Yuqiong Xia, Dong Li, Quan Du, Dehai Liang. Relationship between peptide structure and antimicrobial activity as studied by de novo designed peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes Volume 1838, Issue 12, December 2014, Pages 2985-2993. Doi:10.1016/j.bbamem.2014.08.018
51. Hao-Ting Lee, Chen-Che Lee, Je-Ruei Yang, Jim Z. C. Lai, Kuan Y. Chang. A Large-Scale Structural Classification of Antimicrobial Peptides. BioMed Research International 2015:1-6. Doi: 10.1155/2015/475062
SEQUENCE LISTING <110> Colzyx AB <120> NOVEL BIOACTIVE PEPTIDE COMBINATIONS AND USES THEREOF <130> COLBG/P79033PC <140> EPPCT/EP2021/078669 <141> 2021-10-15 <150> GB2016456.2 <151> 2020-10-16 <160> 24 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GVR28 <400> 1 Gly Val Arg Pro Asp Gly Phe Ala His Ile Arg Asp Phe Val Ser Arg 1 5 10 15 Ile Val Arg Arg Leu Asn Ile Gly Pro Ser Lys Val 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FYL25 <400> 2 Phe Tyr Leu Lys Thr Tyr Arg Ser Gln Ala Pro Val Leu Asp Ala Ile 1 5 10 15 Arg Arg Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ser 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FFL25 <400> 3 Phe Phe Leu Lys Asp Phe Ser Thr Lys Arg Gln Ile Ile Asp Ala Ile 1 5 10 15 Asn Lys Val Val Tyr Lys Gly Gly Arg 20 25 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VTT30 <400> 4 Val Thr Thr Glu Ile Arg Phe Ala Asp Ser Lys Arg Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Leu Asp Lys Ile Lys Asn Leu Gln Val Ala Leu Thr Ser Lys 20 25 30 <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SFV33 <400> 5 Ser Phe Val Ala Arg Asn Thr Phe Lys Arg Val Arg Asn Gly Phe Leu 1 5 10 15 Met Arg Lys Val Ala Val Phe Phe Ser Asn Thr Pro Thr Arg Ala Ser 20 25 30 Pro <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DVN32 <400> 6 Asp Val Asn Val Phe Ala Ile Gly Val Glu Asp Ala Asp Glu Gly Ala 1 5 10 15 Leu Lys Glu Ile Ala Ser Glu Pro Leu Asn Met His Met Phe Asn Leu 20 25 30 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KPE20 <400> 7 Lys Pro Glu Ile Leu Asn Leu Val Lys Arg Met Lys Ile Lys Thr Gly 1 5 10 15 Lys Ala Leu Asn 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFA20 <400> 8 Gly Phe Ala His Ile Arg Asp Phe Val Ser Arg Ile Val Arg Arg Leu 1 5 10 15 Asn Ile Gly Pro 20 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> QAP20 <400> 9 Gln Ala Pro Val Leu Asp Ala Ile Arg Arg Leu Arg Leu Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Pro Leu Asn 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KGF20 <400> 10 Lys Gly Phe Glu Ser Lys Val Asp Ala Ile Leu Asn Arg Ile Ser Gln 1 5 10 15 Met His Arg Val 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RKV20 <400> 11 Arg Lys Val Ala Val Phe Phe Ser Asn Thr Pro Thr Arg Ala Ser Pro 1 5 10 15 Gln Leu Arg Glu 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VAA20 <400> 12 Val Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Lys Met Ala Val Arg Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Val Lys Pro 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAK20 <400> 13 Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Lys Pro Glu Val Pro Arg Pro Gln Ala 1 5 10 15 Ala Lys Pro Ala 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TTK20 <400> 14 Thr Thr Lys Pro Val Thr Thr Thr Lys Pro Val Thr Thr Thr Thr Lys 1 5 10 15 Pro Val Thr Thr 20 <210> 15 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAA76 <400> 15 Ala Ala Ala Lys Pro Ala Pro Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Val 1 5 10 15 Ala Thr Lys Met Ala Thr Val Arg Pro Pro Val Ala Val Lys Pro Ala 20 25 30 Thr Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Ala Ala Val Arg Pro Pro 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr Lys Pro Glu Val Pro Arg 50 55 60 Pro Gln Ala Ala Lys Pro Ala Ala Thr Lys Pro Ala 65 70 75 <210> 16 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSS36 <400> 16 Thr Ser Ser Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Thr Thr Lys Pro Val Thr 1 5 10 15 Thr Thr Lys Pro Val Thr Thr Thr Thr Lys Pro Val Thr Thr Thr Thr 20 25 30 Lys Pro Val Thr 35 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YDR20 <400> 17 Tyr Asp Arg Leu Ile Lys Glu Ser Arg Arg Gln Lys Thr Arg Val Phe 1 5 10 15 Ala Val Val Ile 20 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EQN20 <400> 18 Glu Gln Asn Phe His Lys Ala Arg Arg Phe Val Glu Gln Val Ala Arg 1 5 10 15 Arg Leu Thr Leu 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VVH20 <400> 19 Val Val His Ala Ile Asn Ala Ile Val Arg Ser Pro Arg Gly Gly Ala 1 5 10 15 Arg Arg His Ala 20 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LRL20 <400> 20 Leu Arg Leu Lys Pro Tyr Gly Ala Leu Val Asp Lys Val Lys Ser Phe 1 5 10 15 Thr Lys Arg Phe 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FTK20 <400> 21 Phe Thr Lys Arg Phe Ile Asp Asn Leu Arg Asp Arg Tyr Tyr Arg Cys 1 5 10 15 Asp Arg Asn Leu 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RDA20 <400> 22 Arg Asp Ala Leu Lys Ser Ser Val Asp Ala Val Lys Tyr Phe Gly Lys 1 5 10 15 Gly Thr Tyr Thr 20 <210> 23 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TKR20 <400> 23 Thr Lys Arg Phe Ala Lys Arg Leu Ala Glu Arg Phe Leu Thr Ala Gly 1 5 10 15 Arg Thr Asp Pro 20 <210> 24 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Polypeptide <400> 24 Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30 Pro Arg Thr Glu Ser 35

Claims (67)

  1. 다음을 포함하는 조성물:
    (a) 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 이의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로서, 여기서 제1 폴리펩티드는 상처 치유를 촉진할 수 있는 일차 활성을 갖는, 제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드; 및
    (b) 콜라겐 유형 VI으로부터 유래된 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 또는 상기 단편의 융합체, 이의 유도체의 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 제2 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로서, 여기서 제2 폴리펩티드는 항균 효과를 발휘할 수 있는 일차 활성을 갖는, 제2 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체는 미생물의 성장을 사멸시키거나 약화시킬 수 있는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 미생물은 박테리아, 마이코플라즈마, 효모, 진균 및 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 미생물의 막에 결합할 수 있는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 미생물의 막 파괴를 야기할 수 있는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체는 상처 봉합을 촉진할 수 있는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는:
    (a) 상피(표피 포함) 재생을 증강시킬 수 있고/있거나
    (b) 상처 상피(표피 포함)의 치유를 증강시킬 수 있고/있거나
    (c) 상처 간질(진피 포함)의 치유를 증강시킬 수 있는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 LL-37의 것보다 크거나 동등한 항균 효과를 나타낼 수 있는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항균 효과는 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아인 미생물에 대한 것인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 미생물은 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리키아 콜라이, 그룹 A 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 피요게네스), 그룹 B 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 아갈락티애), 그룹 C 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 디스갈락티애), 그룹 D 스트렙토코커스(예를 들어, 엔테로코커스 패칼리스), 그룹 F 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 안기노서스), 그룹 G 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 디스갈락티애 이퀴시밀리스), 알파-용혈성 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 비리단스, 스트렙토코커스 뉴모니애), 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 안기노서스, 스트렙토코커스 상귀니스, 스트렙토코커스 수이스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 모락셀라 카타랄리스, 비-피막형 헤모필루스 인플루엔자(NTHi), 헤모필루스 인플루엔자 b (Hib), 액티노마이세스 내슬룬디, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 프레보텔라 인터미디어, 클렙시엘라 뉴모니애, 엔테로코커스 클로아캐, 엔테로코커스 패칼리스, 스타필로코커스 에피더미디스, 다중약물-내성 슈도모나스 에어루기노사(MRPA), 다중약물-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA), 다중약물-내성 에스케리키아 콜라이(MREC), 다중약물-내성 스타필로코커스 에피더미디스(MRSE), 다중약물-내성 클렙시엘라 뉴모니애(MRKP), 다중약물-내성 엔테로코커스 패시움(MREF), 다중약물-내성 아시네토박터 바우만니이(MRAB) 및 다중약물-내성 엔테로박터 spp.(MRE)로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 하나 이상의 통상적인 항생제에 대해 내성이 있는 박테리아인, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 미생물은 다중약물-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA), 다중약물-내성 슈도모나스 에어루기노사(MRPA), 다중약물-내성 에스케리키아 콜라이(MREC), 다중약물-내성 스타필로코커스 에피더미디스(MRSE) 및 다중약물-내성 클렙시엘라 뉴모니애(MRKP)로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 포유류 세포에 실질적으로 비-독성인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 항-내독소 효과를 발휘할 수 있는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 폰 빌레브란트 인자 유형 A 도메인으로부터 유래되는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α1, α2 및/또는 α3 사슬이거나 그로부터 유래되는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α3 사슬이거나 그로부터 유래되는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 콜라겐 유형 VI의 α3 사슬의 N2, N3 또는 C1 도메인이거나 그로부터 유래되는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 순 양전하를 갖는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 상의 전하는 +2 내지 +9의 범위이고, 선택적으로 전하는 상이하거나 동일한, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 적어도 30% 소수성 잔기를 갖는, 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 서열번호: 1 내지 23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 및 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 및 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나의 항균 활성을 보유하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 및 유도체를 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 서열번호: 1 내지 5:
    "GVR28": GVRPDGFAHIRDFVSRIVRRLNIGPSKV [서열번호: 1]
    "FYL25": FYLKTYRSQAPVLDAIRRLRLRGGS [서열번호: 2]
    "FFL25": FFLKDFSTKRQIIDAINKVVYKGGR [서열번호: 3]
    "VTT30": VTTEIRFADSKRKSVLLDKIKNLQVALTSK [서열번호: 4]
    "SFV33": SFVARNTFKRVRNGFLMRKVAVFFSNTPTRASP [서열번호: 5]
    로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 및 서열번호: 1 내지 5 중 임의의 하나의 항균 활성을 보유하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 및 유도체를 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 폴리펩티드 중 적어도 하나는 서열번호: 1 내지 5로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 서열번호: 1 내지 23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열의 변이체를 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 변이체는 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성, 예를 들어 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는, 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는:
    (a) 길이가 10 내지 200개 아미노산, 예를 들어 길이가 10 내지 150, 15 내지 100, 15 내지 50, 20 내지 40, 25 내지 35, 또는 28 내지 33개 아미노산;
    (b) 더 긴 아미노산 서열의 일부, 여기서 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 길이가 최대 25, 28, 30, 33, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개 아미노산인 아미노산 서열의 일부임; 및/또는
    (c) 더 긴 아미노산 서열의 일부, 여기서 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 길이가 20 내지 200개, 28 내지 200개, 33 내지 200개, 28 내지 150개, 33 내지 150개, 28 내지 100개, 33 내지 100개, 28 내지 50개, 33 내지 50개, 28 내지 40개, 33 내지 40개, 또는 28 내지 33개 아미노산인 아미노산 서열의 일부인, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 폴리펩티드는 길이가 적어도 20개 아미노산, 바람직하게는 길이가 적어도 28개 아미노산인, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체는 변형되거나 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 PEG화, 아미드화, 에스테르화, 아실화, 아세틸화 및/또는 알킬화에 의해 변형되거나 유도체화되는, 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드인, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 적어도 2개의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 서열번호: 1 내지 23의 아미노산 서열, 및 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 및 서열번호: 1 내지 23 중 임의의 하나의 항균 활성을 보유하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 및 유도체를 포함하거나 이로 구성되며, 여기서 적어도 2개의 폴리펩티드는 상이한 서열인, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 제1 폴리펩티드는 서열번호: 1에 따른 아미노산 서열(즉, GVR28), 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체 및 서열번호: 1의 상처 치유 활성을 보유하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 및 유도체를 포함하거나 이로 구성되고/되거나
    (b) 제2 폴리펩티드는 서열번호: 5에 따른 아미노산 서열(즉, SFV33), 또는 이의 단편, 변이체, 융합체 또는 유도체, 및 서열번호: 5의 항균 활성을 보유하는 상기 단편의 융합체, 이의 변이체 및 유도체를 포함하거나 이로 구성되는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 적어도 0.5:1; 예를 들어, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1 또는 1:1의 비율로 조성물에 존재하거나; 또는
    제2 및 제1 폴리펩티드는 적어도 0.5:1; 예를 들어, 0.6:1, 0.7:1, 0.8:1, 0.9:1 또는 1:1의 비율로 조성물에 존재하는, 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 스캐폴드 물질을 추가로 포함하는, 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 스캐폴드 물질은 콜라겐 단백질이고, 선택적으로 스캐폴드는 콜라겐 I인, 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 담체, 완충제 또는 어쥬번트와 함께 포함하는 약학적 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 약학적 조성물로 코팅, 함침, 혼합되거나 또는 그렇지 않으면 이와 회합된 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질.
  39. 제38항에 있어서, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제37항에 따른 약학적 조성물로 코팅된, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 물질은 바이-패스 수술, 체외 순환, 상처 케어 및/또는 투석에 사용하기 위한, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 봉합사, 보철물, 임플란트, 상처 드레싱, 카테터, 렌즈, 피부 이식, 피부 대체물, 피브린 접착제 또는 붕대에 코팅, 페인팅, 분무되거나 그렇지 않으면 적용되는, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체, 금속, 금속 산화물 및/또는 세라믹을 포함하거나 이로 구성된, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질.
  43. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 약학적 조성물로 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 코팅, 함침, 혼합하거나 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계를 포함하는, 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법.
  44. 다음 단계:
    (i) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 제1 및/또는 제2 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제조하는 단계; 및
    (ii) 단계 (i)에서 제조된 조성물로 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 코팅, 함침, 혼합하거나 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계;
    를 포함하는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법으로서,
    선택적으로 폴리라이신으로 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질을 코팅, 함침, 혼합하거나 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계를 포함하는 방법.
  45. 다음 단계:
    (i) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 제1 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질을 코팅, 함침, 혼합하거나 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계; 및
    (ii) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 제2 콜라겐 유형 VI 폴리펩티드로 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 코팅, 함침, 혼합하거나 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계;
    를 포함하는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법으로서,
    선택적으로 폴리라이신으로 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물, 또는 이에 사용하기 위한 물질을 코팅, 함침, 혼합하거나 또는 그렇지 않으면 회합시키는 단계를 포함하는 방법.
  46. 다음 단계를 포함하는 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질을 제조하는 방법:
    (i) 스캐폴드 용액을 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 적어도 하나의 콜라겐 VI 폴리펩티드와 혼합하는 단계; 및
    (ii) 스캐폴드와 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 의해 정의된 적어도 하나의 콜라겐 VI 폴리펩티드의 혼합물을 건조시키는 단계로서, 선택적으로 건조는 공기 건조 또는 동결 건조에 의한 것인 단계.
  47. (i) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제37항에 따른 약학적 조성물 또는 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질, 및
    (ii) 사용 설명서;
    를 포함하며, 선택적으로 폴리라이신을 추가로 포함하는 키트.
  48. 의약에 사용하기 위한, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물.
  49. 세균 감염의 치유적 및/또는 예방적 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 세균 감염은 전신 감염인, 조성물 또는 약학적 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 세균 감염은 하나 이상의 통상적인 항생제에 대해 내성인, 조성물 또는 약학적 조성물.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 감염은 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리키아 콜라이, 그룹 A 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 피요게네스), 그룹 B 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 아갈락티애), 그룹 C 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 디스갈락티애), 그룹 D 스트렙토코커스(예를 들어, 엔테로-코커스 패칼리스), 그룹 F 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 안기노서스), 그룹 G 스트렙토코커스(예를 들어 스트렙토코커스 디스갈락티애 이퀴시밀리스), 알파-용혈성 스트렙토코커스(예를 들어, 스트렙토코커스 비리단스, 스트렙토코커스 뉴모니애), 스트렙토코커스 보비스, 스트렙토코커스 미티스, 스트렙토코커스 안기노서스, 스트렙토코커스 상귀니스, 스트렙토코커스 수이스, 스트렙토코커스 뮤탄스, 모락셀라 카타랄리스, 비-피막형 헤모필루스 인플루엔자(NTHi), 헤모필루스 인플루엔자 b (Hib), 액티노마이세스 내슬룬디, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 프레보텔라 인터미디어, 클렙시엘라 뉴모니애, 엔테로코커스 클로아캐, 엔테로코커스 패칼리스, 스타필로코커스 에피더미디스, 다중약물-내성 슈도모나스 에어루기노사(MRPA), 다중약물-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA), 다중약물-내성 에스케리키아 콜라이(MREC), 다중약물-내성 스타필로코커스 에피더미디스(MRSE), 다중약물-내성 클렙시엘라 뉴모니애(MRKP), 다중약물-내성 엔테로코커스 패시움(MREF), 다중약물-내성 아시네토박터 바우만니이(MRAB) 및 다중약물-내성 엔테로박터 spp.(MRE).다중약물-내성으로 구성된 군으로부터 선택된 미생물에 의해 야기되는, 조성물 또는 약학적 조성물.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 감염은 다중약물-내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA) 및 다중약물-내성 슈도모나스 에어루기노사(MRPA)로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물에 의해 야기되는, 조성물 또는 약학적 조성물.
  54. 하나 이상의 추가 항균제와 조합하여 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 조성물 또는 약학적 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 하나 이상의 추가 항균제는 항균 폴리펩티드 및 항생제로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물 또는 약학적 조성물.
  56. 상처 케어에 사용하기 위한, 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물.
  57. 세균 감염의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물의 용도.
  58. 상처의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물의 용도.
  59. 세균 감염이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  60. 개체에서 상처를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물의 유효량을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 미생물을 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 조성물 또는 제37항에 정의된 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는 시험관내에서 미생물을 사멸하는 방법.
  62. 제48항 내지 제56항, 제57항 또는 제58항, 또는 제59항 내지 제61항에 있어서, 조성물 또는 약학적 조성물은 의료 장치, 임플란트, 상처 케어 생성물 또는 이에 사용하기 위한 물질 상에 코팅 또는 함침되거나, 또는 이와 혼합되거나 또는 그렇지 않으면 회합되는, 조성물 또는 약학적 조성물, 용도 또는 방법.
  63. 다음을 포함하는 상처 케어 생성물:
    (a) 스캐폴드 물질로서, 여기서 스캐폴드는 콜라겐 I인, 스캐폴드 물질;
    (b) GVR28의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 제1 폴리펩티드:
    "GVR28": GVRPDGFAHIRDFVSRIVRRLNIGPSKV [서열번호 1]; 및
    (c) SFV33의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 제2 폴리펩티드:
    "SFV33": SFVARNTFKRVRNGFLMRKVAVFFSNTPTRASP [서열번호: 5].
    [청구항 63]
    설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 조성물.
  64. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은, 의료 임플란트 또는 장치, 또는 이에 사용하기 위한 생체물질.
  65. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 용도.
  66. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  67. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 상처를 치료하는 방법.
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GB0131112D0 (en) 2001-12-31 2002-02-13 Univ London Pharmacy Block copolymers
GB0316294D0 (en) 2003-07-11 2003-08-13 Polytherics Ltd Conjugated biological molecules and their preparation
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