KR20230087582A - 유전자 치료 완제 의약품의 효능을 측정하는 분석법 - Google Patents

유전자 치료 완제 의약품의 효능을 측정하는 분석법 Download PDF

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Abstract

트랜스진을 발현하는 재조합 바이러스 벡터의 효능을 결정하기 위한 세포 기반 분석법이 본원에 개시되어 있다.

Description

유전자 치료 완제 의약품의 효능을 측정하는 분석법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 15일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/092,189의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 참고로 본원에 포함된다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
본원에 전자적으로 제출된 다음과 같은 텍스트 파일의 내용이 전체적으로 본원에 참조로 포함된다: 컴퓨터 판독 가능한 형식의 서열 목록 사본(파일명: PRVL_017_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록 일자: 2021년 10월 15일, 파일 크기 ~7,474 바이트).
기술 분야
본 발명은 일반적으로 유전자 치료 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 트랜스진을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 조성물들의 효능을 분석하는 세포 기반 분석법을 제공한다.
배경
글루코세레브로시다제(GCase; GBA1 유전자에 의해 인코딩됨)를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터들은 파킨슨병 및 고셔병과 같은 장애의 치료에 유용하다. 유전자 치료에 사용하고자 하는 의도로 GCase를 전달하는 재조합 바이러스 조성물의 상대 효능을 측정하는 분석법이 필요하다.
요약
본원은 글루코세레브로시다제(GCase)를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제1 재조합 바이러스를 포함하는 테스트 샘플의 상대 효능을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 테스트 샘플을 복수의 제1 세포에 형질도입하는 단계; b) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제1 세포를 인큐베이션하는 단계; c) 형질도입된 복수의 제1 세포로부터 제1 세포 용해물을 수확하는 단계; d) 제1 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계; e) 제1 세포 용해물을 이미지화하여 제1 형광 판독값을 얻는 단계; f) GCase를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 재조합 바이러스를 포함하는 참조 표준을 복수의 제2 세포에 형질도입하는 단계; g) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제2 세포를 인큐베이션하는 단계; h) 형질도입된 복수의 제2 세포로부터 제2 세포 용해물을 수확하는 단계; i) 제2 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계; j) 제2 세포 용해물을 이미지화하여 제2 형광 판독값을 얻는 단계; 및 k) 평행선 분석을 사용하여 제1 형광 판독값을 제2 형광 판독값과 비교하여 테스트 샘플의 상대 효능을 계산하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 제1 재조합 바이러스 및 제2 재조합 바이러스는 GCase를 인코딩하는 동일한 트랜스진을 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 제1 재조합 바이러스 및/또는 제2 재조합 바이러스는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질, 또는 이들 캡시드 단백질 중 어느 하나의 변이체를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, GCase는 서열 번호 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, GCase를 인코딩하는 트랜스진은 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2를 포함한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 HEK-293T 또는 HEK-293 세포이다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 약 1.25 mM 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드가 제1 세포 용해물 및/또는 제2 세포 용해물과 조합된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 멀티 웰 플레이트에 시딩된다. 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 웰 당 약 20,000개의 세포로 시딩된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 테스트 샘플 및/또는 참조 표준은 형질도입 전에 연속 희석된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 세포 용해물 수확 전 약 68시간 내지 약 81시간 동안 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 형질도입 후 세포 용해물 수확 전 약 66시간 내지 약 78시간 동안 인큐베이션된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 감염 다중도(MOI)의 제1 재조합 바이러스 테스트 샘플을 복수의 제1 세포에 형질도입한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 감염 다중도(MOI)의 제2 재조합 바이러스 참조 표준을 복수의 제2 세포에 형질도입한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 제1 형광 판독값 및/또는 제2 형광 판독값은 GCase 활성의 측정을 반영한다. 일부 실시형태에서, GCase 활성의 측정은 상대 형광 단위(RFU)/시간이다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 비교 단계(k)는 재조합 바이러스 양 및 RFU/시간의 로그 변환을 수행하고 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대한 재조합 바이러스 양의 로그 대 RFU/시간의 로그의 표준 곡선을 플롯하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대해 재조합 바이러스 양의 로그 대 RFU/시간의 로그의 선형 회귀를 계산함으로써, 테스트 샘플 기울기 및 참조 표준 기울기를 유도하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대해 얻어진 선형 회귀를 사용하여 공통 기울기로 선형 회귀를 계산하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상대 효능은 다음 식을 사용하여 계산된다: 상대 효능(%) = 10 ^ ((b - b참조)/A) x 100. 일부 실시형태에서, 공통 기울기에 대한 테스트 샘플 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40이다. 일부 실시형태에서, 공통 기울기에 대한 참조 표준 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 테스트 샘플 및 참조 표준의 선형 회귀에 대한 R2 값을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 테스트 샘플 및 참조 표준에 대한 R2 값은 0.9 이상이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 rAAV 효능 분석을 위한 PCR 플레이트 맵의 다이어그램이다. “RS”는 “참조 표준”을 지칭한다. “TS”는 “테스트 샘플”을 지칭한다.
도 2는 GCase를 발현하는 여러 rAAV 샘플의 선 그래프 및 상대 효능의 계산을 도시한다.
상세한 설명
본 발명은 글루코세레브로시다제(예를 들어, 인간 글루코세레브로시다제)를 인코딩하는 트랜스진을 전달하는 재조합 바이러스 조성물의 상대 효능을 측정하기 위한 세포 기반 형질도입 분석법에 관한 것이다. 글루코세레브로시다아제(베타-글루코세레브로시다아제, 리소좀 산 β-글루코세레브로시다아제, GCase 및 GBA라고도 함)는 GBA1 유전자에 의해 인코딩된다. GBA1의 하나의 대립유전자에만 돌연변이가 있는 대상체는 파킨슨병의 위험이 매우 증가한다. GBA1의 두 사본 모두에 돌연변이가 있는 대상체는 고셔병을 앓고 있다. GCase를 인코딩하는 트랜스진을 전달하는 바이러스 조성물은 파킨슨병(예를 들어, GBA1 돌연변이를 갖는 파킨슨병) 및 고셔병에 대한 유전자 요법에 유용하다.
일부 실시형태에서, GCase를 인코딩하는 재조합 바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터이다.
본원에 개시된 방법은 형광 기질 레조루핀-β-D-글루코피라노사이드를 이용하며, 이는 GCase의 존재하에 촉매화되어 형광 생성물 레조루핀을 형성한다. 산물 형성 속도를 계산하기 위해 반응이 진행됨에 따라 레조루핀 생산을 직접 모니터링한다. 과량의 레조루핀-β-D-글루코피라노사이드 기질의 존재 및 분석 조건 하에서, 산물 형성 속도는 GCase 단백질의 양에 선형으로 비례한다.
용어 “재조합 바이러스”는 예를 들어, 바이러스 입자에 이종 핵산 구조체를 추가하거나 삽입함으로써 유전적으로 변경되어 있는 바이러스를 지칭한다.
“이종”이라는 용어는 본원에서 “외인성”이라는 용어와 상호교환적으로 사용되며, 본래의 공급원이 아닌 일부 공급원으로부터 유래하는 물질을 지칭한다. 예를 들어, 용어 “외인성 단백질” 또는 “외인성 유전자”는 AAV 게놈 또는 AAV 입자에 인공적으로 도입되어 있는 비-AAV 공급원으로부터의 얻은 단백질 또는 유전자를 지칭한다.
용어 “재조합 아데노 연관 바이러스” 또는 “rAAV”는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 rAAV 벡터를 포함하는 AAV 입자 또는 AAV 비리온을 지칭한다.
용어 “rAAV 벡터”는 AAV 5' 역위 말단 반복(ITR) 서열 및, AAV 바이러스 게놈, 예를 들어, 하나 이상의 프로모터 및/또는 인핸서 그리고, 선택적으로 폴리아데닐화 서열 및/또는 단백질 코딩 서열의 엑손들 사이에 삽입된 하나 이상의 인트론에 대해 이종인 전사 조절 요소들에 작동 가능하게 연결된 단백질 코딩 서열에 측접하는(flanking) AAV 3' ITR을 갖는, 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산을 지칭한다.
용어 “IU”는 감염 단위를 지칭한다.
용어 “TCID50”은 50% 세포 배양물 감염 용량을 지칭한다.
용어 “USP”는 미국 약전을 지칭한다.
용어 “테스트 샘플”은 그 효능이 알려져 있지 않고 본원에 기술된 방법을 사용하여 결정될 외인성 관심 단백질(예를 들어, GCase)을 인코딩하는 서열을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 샘플을 지칭한다.
“참조 표준”이라는 용어는 효능이 공지되어 있는 외인성 관심 단백질(예를 들어, GCase)을 인코딩하는 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 지칭한다.
일부 양상들에서, 본원은 글루코세레브로시다제(GCase)를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제1 재조합 바이러스를 포함하는 테스트 샘플의 상대 효능을 측정하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 테스트 샘플을 복수의 제1 세포에 형질도입하는 단계; b) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제1 세포를 인큐베이션하는 단계; c) 형질도입된 복수의 제1 세포로부터 제1 세포 용해물을 수확하는 단계; d) 제1 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계; e) 제1 세포 용해물을 이미지화하여 제1 형광 판독값을 얻는 단계; f) GCase를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 재조합 바이러스를 포함하는 참조 표준을 복수의 제2 세포에 형질도입하는 단계; g) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제2 세포를 인큐베이션하는 단계; h) 형질도입된 복수의 제2 세포로부터 제2 세포 용해물을 수확하는 단계; i) 제2 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계; j) 제2 세포 용해물을 이미지화하여 제2 형광 판독값을 얻는 단계; 및 k) 평행선 분석을 사용하여 제1 형광 판독값을 제2 형광 판독값과 비교하여 테스트 샘플의 상대 효능을 계산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 재조합 바이러스 및 제2 재조합 바이러스는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 재조합 바이러스 및 제2 재조합 바이러스는 동일하지 않다. 일부 실시형태에서, 제1 재조합 바이러스 및 제2 재조합 바이러스는 GCase를 인코딩하는 동일한 트랜스진을 포함하지만 상이한 제조 로트 또는 생산 로트로부터 유래한다. 일부 실시형태들에서, GCase는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 HEK-293T 또는 HEK-293 세포이다.
본원에 개시된 방법은 다중-웰 플레이트에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 96-웰 플레이트에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 멀티 웰 플레이트에 시딩된다. 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각으로 형질도입되기 전에 웰 당 약 20,000개 세포로 시딩된다. 일부 실시형태에서, 세포들을 37℃및 5% CO2에서 밤새 부착시킨다.
일부 실시형태에서, 형질도입은 세포가 시딩된 후 약 24시간 후에 일어난다.
일부 실시형태에서, 테스트 샘플 및/또는 참조 표준은 형질도입 전에 연속 희석된다. 일부 실시형태들에서, 테스트 샘플은 참조 표준의 50%, 100%, 및 200%로 희석된다. 일부 실시형태들에서, 연속 희석은 웰 당 다음과 같은 양의 총 벡터(vg)을 생성한다: 5.00E+10 vg/웰, 3.33E+10 vg/웰, 2.22E+10 vg/웰, 1.48E+10 vg/웰, 9.88E+9 vg/웰, 및 6.58E+9 vg/웰.
일부 실시형태들에서, 정제된 재조합 GCase(rGBA, 0 내지 333 ng/ml, R&D 카탈로그 번호 7410-GHB-020, >95% 순도)의 표준 곡선은 테스트 샘플과 동시에 실행된다.
일부 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 감염 다중도(MOI)의 제1 재조합 바이러스 테스트 샘플을 복수의 제1 세포에 형질도입한다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 상이한 MOI의 제2 재조합 바이러스 참조 표준을 복수의 제2 세포에 형질도입한다.
일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 형질도입 후 세포 용해물 수확 전 약 68시간 내지 약 81시간 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 회복 배지(예를 들어, 10% FBS/DMEM/1μM Hoechst 33342)가 세포에 첨가되기 전 약 2 내지 약 2.5시간 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 형질도입 후 세포 용해물 수확 전 약 72 시간 ± 6 시간(예를 들어, 약 66 시간 내지 약 78 시간) 인큐베이션된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 37℃및 5% CO2에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 약 1.25 mM 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드는 조합 단계 (d)에서 제1 세포 용해물 및/또는 조합 단계 (i)에서 제2 세포 용해물과 조합된다.
일부 실시형태에서, 이미지화 단계 (e) 및/또는 (j)는 플레이트 판독기로 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 형광 판독값 및/또는 제2 형광 판독값은 GCase 활성의 측정을 반영한다. 일부 실시형태에서, GCase 활성의 측정은 상대 형광 단위(RFU)/시간이다.
일부 실시형태에서, 비교 단계(k)는 재조합 바이러스 양 및 RFU/시간의 로그 변환을 수행하고 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대한 재조합 바이러스 양의 로그 대 RFU/시간의 로그의 표준 곡선을 플롯하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대해 재조합 바이러스 양의 로그 대 RFU/시간의 로그의 선형 회귀를 계산함으로써, 테스트 샘플 기울기 및 참조 표준 기울기를 유도하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대해 얻어진 선형 회귀를 사용하여 공통 기울기로 선형 회귀를 계산하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 테스트 샘플의 상대 효능은 다음 식을 사용하여 계산된다: 상대 효능(%) = 10 ^ ((b - b참조)/A) x 100.일부 실시형태에서, 공통 기울기에 대한 테스트 샘플 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40이다. 일부 실시형태들에서, 공통 기울기에 대한 참조 표준 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40이다.
일부 실시형태에서, 테스트 샘플의 상대 효능을 측정하기 위한 방법은 테스트 샘플 및 참조 표준의 선형 회귀에 대한 R2 값을 계산하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 테스트 샘플 및 참조 표준에 대한 R2 값은 0.9 이상이다. 일부 실시형태에서, 테스트 샘플 및 참조 표준에 대한 R2 값은 0.96 이상이다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 상대 역가는 참조 표준에 비해 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130% 또는 적어도 140%이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 상대 효능은 참조 표준에 비해 적어도 90%이다.
rAAV 벡터의 감염 역가(기능적 역가라고도 지칭됨)는 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자의 농도이다. 일부 실시형태에서, 세포 형질도입 분석을 사용하여 감염 역가를 결정한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 감염 역가는 실시예 1에 제공된 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 감염 역가는 약 8.0E+9 IU/mL 내지 약 1.2E+10 IU/mL이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 감염 역가는 약 8.0E+9 IU/mL, 약 8.15E+9 IU/mL, 약 8.5E+9 IU/mL, 약 9.0E+9 IU/mL, 약 9.5E+9 IU/mL, 약 9.99E+9 IU/mL, 약 1E+10 IU/mL, 약 1.12E+10 IU/mL 또는 약 1.2E+10 IU/mL이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 TCID50은 약 4,500 vg/IU 내지 약 10,000 vg/IU이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 조성물의 TCID50은 약 4,500 vg/IU, 약 5,000 vg/IU, 약 5,500 vg/IU, 약 6,000 vg/IU, 약 6,290 vg/IU, 약 6,500 vg/IU, 약 7,000 vg/IU, 약 7,500 vg/IU, 약 8,000 vg/IU, 약 8,500 vg/IU, 약 9,000 vg/IU, 약 9,500 vg/IU, 약 9,980 vg/IU 또는 약 10,000 vg/IU이다.
본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 적합한 rAAV 벡터의 예는 WO2019/070891, WO2019/070893, WO2019/070894, 및 WO2019/084068에 개시되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 다음 중 하나 이상을 추가로 포함한다: 치킨 베타 액틴(CBA) 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서; 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE); 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리; 인공 인트론; 인공 엑손; 및 프로모터 영역의 다음 전사 조절 활성화 부위: TATA, RBS 및 YY1 중 하나 이상(Francois 외, (2005) J. Virol. 79(17):11082-11094). TATA, RBS 및 YY1 전사 조절 활성화 부위는 프로모터 영역의 5' 말단에 위치할 수 있다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 제1 AAV 역위 말단 반복부(ITR) 및 관심 유전자 산물 및 관련 조절 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 측접하는 제2 ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 ITR은 야생형 AAV2 ITR(서열 번호 3)이다. 일부 실시형태에서, 각각의 ITR은 야생형 AAV2 ITR로부터 유도된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 순차적으로 제1 AAV 역위 말단 반복부(ITR), 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, 닭 베타 액틴(CBA) 프로모터, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 우드척 간염바이러스 전사후 조절요소(WPRE), 소 성장 호르몬 폴리A 신호 꼬리 및 제2 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 최적화된 코돈이다(예를 들어, 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈). 일부 실시형태에서, 인간 GCase 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열 번호 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자는 “PR001”로 지칭된다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, rAAV 벡터는 자기-상보적 재조합 아데노 연관 바이러스(scAAV) 벡터이다. scAAV 벡터는 예를 들어 McCarty 외, Gene Ther. 2001; 8(16):1248-54에 기재되어 있다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는 AAV이다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질, 또는 이들 캡시드 단백질 중 어느 하나의 변이체를 포함한다.
모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 그 전문이 참조 문헌으로 인용된다.
하기 실시예는 본원에 기재되고 청구범위에 기재된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 제조되고 평가되고 의도되는지에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된다. 순전히 예시적인 것으로 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 글루코세레브로시다제를 인코딩하는 rAAV에 대한 시험관 내 효소 효능 분석.
본 분석의 목적은 세포 기반 분석을 사용하여 글루코세레브로시다제(GCase; GBA1 유전자에 의해 인코딩됨)를 인코딩하는 AAV(예를 들어, AAV9) 캡슐화 벡터의 시험관 내 상대 효능을 측정하는 것이다.
실험실 테스트 방법
이 방법의 목적은 세포 기반 기능 분석을 사용하여 시험관 내에서 글루코세레브로시다제(GCase; GBA1 유전자에 의해 인코딩됨)를 인코딩하는 AAV 캡슐화 벡터의 용량 반응을 측정하는 것이다. 이 테스트 방법은 연구 목적을 위해, 예를 들어, 다른 AAV 유전자 치료 산물 로트의 반응을 비교하기 위해 사용될 수 있다.
표 1: 정의
Figure pct00001
표 2: 재료 및 장비
Figure pct00002
방법의 배경/이론: PR001은 GBA1을 발현하는 예시적인 rAAV이다. 형질도입 분석은 HEK293T 세포에 PR001을 도입하여 GCase 효소를 발현시킨다. GCase 촉매 작용에 의해 형광 산물 레조루핀을 생성하는 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노사이드를 사용하여 세포 용해물에서 형질도입으로부터 유도된 효소 활성을 분석하였다. 2개 이상의 rAAV 사이의 상대 효능은 평행선 분석을 사용하여 상이한 양의 PR001에서 형질도입으로 인해 생성된 효소 활성으로부터 계산되었다.
표 3: 시약/희석제/배지
Figure pct00003
절차: HEK293T 세포를 96-웰 플레이트에 20,000개 세포/웰로 플레이팅하고 37℃및 5% CO2에서 밤새 부착시켰다. AAV의 연속 희석액들을 표 4에 나타낸 바와 같이 그 부형제에서 제조하였다.
표 4:
Figure pct00004
10 μL의 AAV 희석액 또는 비히클을 도 1의 플레이트 맵에 따라 웰들로 옮겼다. 생성된 총 vg가 달성되었다(표 5).
표 5:
Figure pct00005
세포를 2 내지 2.5시간 동안 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL의 회복 배지를 세포/형질도입 배지에 추가하여 총 부피 150 μL가 되게 하였다. 바이러스 유래 GCase 발현을 허용하기 위해 세포를 37°C 및 5% CO2에서 72 + 6시간 동안 인큐베이션하였다.
세포 용해물을 수확하였다. GCase 활성은 10μL의 1.25mM 레조루핀-β-D 글루코피라노사이드 실험 용액을 투명한 편평 바닥이 있는 검은색 플레이트에 추가한 다음 40μL의 세포 용해물을 추가하여 측정했다. 플레이트는 37°C에서 Varioskan 플레이트 리더에서 즉시 판독되었다.
분석: 상대 효능을 계산하기 위한 데이터의 병렬 분석을 다음과 같이 수행했다:
1. 각 vg/웰 포인트에 대한 CV%를 계산한다, 이는 ≤ 30%여야 한다. 필요한 경우 이를 달성하기 위해 vg/웰 포인트당 최대 하나의 반복실험을 폐기할 수 있다.
2. 바이러스 양과 GCase 활성(상대 형광 단위(RFU)/hr)의 로그 변환을 수행한다.
3. 로그(RFU/hr) 대 로그(바이러스)로 반응을 플롯한다.
4. 각 샘플에 대해 선형 회귀를 수행한다.
5. 공통 기울기 “A”(Y= AX + b)를 사용하여 새로운 선형 회귀를 수행한다.
6. 5단계에서 얻은 매개변수를 사용하여 다음 식을 사용하여 상대 효능을 계산한다:
상대 효능(%) = 10 ^ ((b - b참조)/A) x 100.
7. 참조 표준에 상대적인 결과를 소수점 없이 백분율로 보고한다(예를 들어, 결과가 100.50이면 101%가 될 것임).
표 6: 분석 시스템 적합성 및 샘플 기준
Figure pct00006
테스트 방법 적격성평가 프로토콜
목적: 이 검증 계획의 목적은 세포 기반 분석을 사용하여 시험관 내에서 PR001의 상대적 역가를 측정하기 위한 테스트 방법을 정의하는 것이다. 이 프로토콜은 이 방법이 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하며 연구 및 공정 개발 목적(비 GXP)을 위한 AAV 샘플 분석에 적합함을 보여준다.
표 7: 적격성평가 재료
Figure pct00007
검증 계획: 밸리데이션(validation)은 국제 의약품 규제 조화 위원회(ICH) Q2(R1), USP<1032> 및 USP<1033>에 설명된 절차인 분석 테스트 방법의 밸리데이션에 따라 수행될 것이다. 밸리데이션 테스트는 50%, 100% 및 200% 상대 효능 수준에서의 AAV9-GBA DP 및 특이성 테스트로 구성될 것이다. 방법의 선형성, 정확도 및 정밀도(반복성 및 중간 정밀도)를 평가하기 위해 각 수준은 두 명의 분석자가 테스트한다. 각 분석의 상대 효능은 독립적이며 단일 분석 결정으로 간주된다. 각 플레이트에는 하나의 참조 표준과 최대 2개의 테스트 샘플이 포함될 것이다. 하나의 플레이트에서 시스템 적합성이 실패하면, 해당 플레이트가 반복될 것이다. 하나의 샘플에 대한 시스템 적합성이 실패하면, 실패한 샘플만 반복될 것이다. 모든 샘플은 상기 방법에 정의된 분석 허용 기준과 이 프로토콜에 정의된 밸리데이션 기준을 충족해야 한다. 특이성 결정은 또한 GBA1을 보유하지 않는 관련 없는 AAV 제품을 사용하여 수행될 것이다. 검출 및 정량 한계는 USP<1032>에 설명된 상대 효능을 보고하는 방법과 관련이 없기 때문에 포함되지 않았다. 표 8에는 상기 법의 성능을 평가하는 데 사용되는 밸리데이션 절차와 허용 기준이 요약되어 있다.
표 8: 밸리데이션 절차 및 적격성평가 허용 기준의 요약
Figure pct00008
Figure pct00009
선형성: AAV9-GBA 테스트 샘플은 참조 표준의 50%, 100% 및 200%로 희석되고 두 명의 분석자가 7가지 분석으로 테스트할 것이다. 평균(측정된) 상대 효능을 예상 상대 효능에 대해 플롯하고 선형 회귀를 사용하여 분석할 것이다. 생성된 선형성 식 및 결정 계수(R2)가 보고될 것이다. 시스템 적합성에 실패한 분석 플레이트는 분석에 사용되지 않는다.
정확도: 정확성을 평가하기 위해 선형성 데이터가 평가될 것이다. 평균 회복%는 각 수준에서 다음 식을 사용하여 계산될 것이다:
Figure pct00010
각 수준의 회복 값% 가 보고될 것이다.
반복성: 선형성 데이터는 반복성을 평가하기 위해 평가될 것이다. 백분율 상대 표준 편차(RSD%)는 각 분석에 대해 각 수준에서 계산되어(즉, 동일한 분석자 및 동일한 주차) 보고될 것이다.
중간 정밀도: 선형성 데이터는 반복성을 평가하기 위해 평가될 것이다. 각 수준에서 전체 RSD%가 계산되고 보고될 것이다.
범위: 선형성, 정확도 및 정밀도 실험에 대한 기준을 충족하는 테스트된 최저 및 최고 효능이 상기 방법 범위를 결정하는 데 사용될 것이며 보고될 것이다.
특이성: 대체 분자(특이성 샘플)는 한 명의 분석자가 하나의 분석에서 테스트할 것이다. 특이성 샘플은 AAV9-GBA 테스트 샘플에서와 같이 분석에 희석될 것이다. 특이성 샘플은 대체 분자(AM): PR006이다.
데이터 처리 및 보고: 원시 데이터는 SkanIt RE 5.0 소프트웨어에 의해 수집될 것이며 평행선 분석은 위의 테스트 방법에 표시된 대로 수행될 것이다. 이 데이터는 추가 분석 매개변수(예를 들어, 정확도 및 정밀도)를 계산하기 위해 스프레드시트로 출력될 것이다. 재료, 시약, 사용된 장비 및 테스트 조건과 같은 실험들의 세부 사항을 포함한 모든 결과 데이터가 기록될 것이며 두 번째 분석자가 검토할 것이다.
모든 유효한 분석 실행의 결과와 참조 표준 바이러스 및 연구 바이러스의 모든 유효한 농도에 기반하여, 상기 적격성평가로부터 얻은 모든 실행에 대한 전체 평균 상대 효능은 추가 검정 실행들에서 사용하기 위한 이러한 샘플들에 대한 공칭 RP 값을 설정하는 데 사용될 것이다.
여러 PR001 샘플의 효능 분석 데이터의 예가 도 2에 도시되어 있다.
표 9: 서열 표
Figure pct00011
실시형태
첨부된 청구범위에도 불구하고, 본 발명은 다음과 같이 번호가 매겨진 실시형태들을 제시한다:
1. 글루코세레브로시다제(GCase)를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제1 재조합 바이러스를 포함하는 테스트 샘플의 상대 효능을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은:
a) 테스트 샘플을 복수의 제1 세포에 형질도입하는 단계;
b) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제1 세포를 인큐베이션하는 단계;
c) 형질도입된 복수의 제1 세포로부터 제1 세포 용해물을 수확하는 단계;
d) 제1 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계;
e) 제1 세포 용해물을 이미지화하여 제1 형광 판독값을 얻는 단계;
f) GCase를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 재조합 바이러스를 포함하는 참조 표준을 복수의 제2 세포에 형질도입하는 단계;
g) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제2 세포를 인큐베이션하는 단계;
h) 형질도입된 복수의 제2 세포로부터 제2 세포 용해물을 수확하는 단계;
i) 제2 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계;
j) 제2 세포 용해물을 이미지화하여 제2 형광 판독값을 얻는 단계; 및
k) 평행선 분석을 사용하여 제1 형광 판독값을 제2 형광 판독값과 비교하여 테스트 샘플의 상대 효능을 계산하는 단계.
2. 실시형태 1에 있어서, 제1 재조합 바이러스 및 제2 재조합 바이러스는 GCase를 인코딩하는 동일한 트랜스진을 포함하는, 방법.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 제1 재조합 바이러스 및/또는 제2 재조합 바이러스는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)인, 방법.
4. 실시형태 3에 있어서, rAAV는 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
5. 실시형태 3에 있어서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질, 또는 이들 캡시드 단백질 중 어느 하나의 변이체를 포함하는, 방법.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, GCase는 서열 번호 1을 포함하는, 방법.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, GCase를 인코딩하는 트랜스진은 코돈-최적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
8. 실시형태 7에 있어서, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2를 포함하는, 방법.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 HEK-293T 또는 HEK-293 세포인, 방법.
10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 약 1.25 mM 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드가 제1 세포 용해물 및/또는 제2 세포 용해물과 조합되는, 방법.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 멀티 웰 플레이트에 시딩되는, 방법.
12. 실시형태 11에 있어서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 웰 당 약 20,000개의 세포로 시딩되는, 방법.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 테스트 샘플 및/또는 참조 표준은 형질도입 전에 연속 희석되는, 방법.
14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 세포 용해물 수확 전 약 68시간 내지 약 81시간 동안 인큐베이션되는, 방법.
15. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 형질도입 후 세포 용해물 수확 전 약 66시간 내지 약 78시간 동안 인큐베이션되는, 방법.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제1 세포는 적어도 2개의 상이한 감염 다중도(MOI)의 제1 재조합 바이러스 테스트 샘플에 의해 형질도입되는, 방법.
17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 복수의 제2 세포는 적어도 2개의 상이한 감염 다중도(MOI)의 제2 재조합 바이러스 참조 표준에 의해 형질도입되는, 방법.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 제1 형광 판독값 및/또는 제2 형광 판독값은 GCase 활성의 측정을 반영하는, 방법.
19. 실시형태 18에 있어서, GCase 활성의 측정은 상대 형광 단위(RFU)/시간인, 방법.
20. 실시형태 19에 있어서, 비교 단계(k)는 재조합 바이러스 양 및 RFU/시간의 로그 변환을 수행하고 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대한 재조합 바이러스 양의 로그 대 RFU/시간의 로그의 표준 곡선을 플롯하는 것을 포함하는, 방법.
21. 실시형태 20에 있어서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대해 재조합 바이러스 양의 로그 대 RFU/시간의 로그의 선형 회귀를 계산함으로써, 테스트 샘플 기울기 및 참조 표준 기울기를 유도하는 것을 포함하는, 방법.
22. 실시형태 21에 있어서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대해 얻어진 선형 회귀를 사용하여 공통 기울기로 선형 회귀를 계산하는 것을 포함하는, 방법.
23. 실시형태 22에 있어서, 상대 효능은 다음 식을 사용하여 계산되는, 방법: 상대 효능(%) = 10 ^ ((b - b참조)/A) x 100.
24. 실시형태 22 또는 23에 있어서, 공통 기울기에 대한 테스트 샘플 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40인, 방법.
25. 실시형태 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 공통 기울기에 대한 참조 표준 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40인, 방법.
26. 실시형태 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 테스트 샘플 및 참조 표준의 선형 회귀에 대한 R2 값을 계산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
27. 실시형태 26에 있어서, 테스트 샘플 및 참조 표준에 대한 R2 값은 0.9 이상인, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Prevail Therapeutics, Inc. <120> ASSAY FOR MEASURING POTENCY OF GENE THERAPY DRUG PRODUCT <130> PRVL-017/01WO 334806-2133 <150> US 63/092,189 <151> 2020-10-15 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 536 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser 1 5 10 15 Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln 20 25 30 Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe 35 40 45 Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser 50 55 60 Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu 65 70 75 80 Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln 85 90 95 Ala Asn His Thr Gly Thr Gly Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln 100 105 110 Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu 130 135 140 Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val 145 150 155 160 Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp 165 170 175 Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp 180 185 190 Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln 195 200 205 Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu 210 215 220 Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro 225 230 235 240 Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu 245 250 255 Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu 260 265 270 Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu 275 280 285 Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly 290 295 300 Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu 305 310 315 320 Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr 325 330 335 Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr 340 345 350 Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg 355 360 365 Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser 370 375 380 Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met 385 390 395 400 Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly 405 410 415 Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp 420 425 430 Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp 435 440 445 Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys 450 455 460 Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys 465 470 475 480 Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val 485 490 495 Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys 500 505 510 Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile 515 520 525 His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln 530 535 <210> 2 <211> 1608 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized Glucocerebrosidase <400> 2 atggaattca gcagccccag cagagaggaa tgccccaagc ctctgagccg ggtgtcaatc 60 atggccggat ctctgacagg actgctgctg cttcaggccg tgtcttgggc ttctggcgct 120 agaccttgca tccccaagag cttcggctac agcagcgtcg tgtgcgtgtg caatgccacc 180 tactgcgaca gcttcgaccc tcctaccttt cctgctctgg gcaccttcag cagatacgag 240 agcaccagat ccggcagacg gatggaactg agcatgggac ccatccaggc caatcacaca 300 ggcactggcc tgctgctgac actgcagcct gagcagaaat tccagaaagt gaaaggcttc 360 ggcggagcca tgacagatgc cgccgctctg aatatcctgg ctctgtctcc accagctcag 420 aacctgctgc tcaagagcta cttcagcgag gaaggcatcg gctacaacat catcagagtg 480 cccatggcca gctgcgactt cagcatcagg acctacacct acgccgacac acccgacgat 540 ttccagctgc acaacttcag cctgcctgaa gaggacacca agctgaagat ccctctgatc 600 cacagagccc tgcagctggc acaaagaccc gtgtcactgc tggcctctcc atggacatct 660 cccacctggc tgaaaacaaa tggcgccgtg aatggcaagg gcagcctgaa aggccaacct 720 ggcgacatct accaccagac ctgggccaga tacttcgtga agttcctgga cgcctatgcc 780 gagcacaagc tgcagttttg ggccgtgaca gccgagaacg aaccttctgc tggactgctg 840 agcggctacc cctttcagtg cctgggcttt acacccgagc accagcggga ctttatcgcc 900 cgtgatctgg gacccacact ggccaatagc acccaccata atgtgcggct gctgatgctg 960 gacgaccaga gactgcttct gccccactgg gctaaagtgg tgctgacaga tcctgaggcc 1020 gccaaatacg tgcacggaat cgccgtgcac tggtatctgg actttctggc ccctgccaag 1080 gccacactgg gagagacaca cagactgttc cccaacacca tgctgttcgc cagcgaagcc 1140 tgtgtgggca gcaagttttg ggaacagagc gtgcggctcg gcagctggga tagaggcatg 1200 cagtacagcc acagcatcat caccaacctg ctgtaccacg tcgtcggctg gaccgactgg 1260 aatctggccc tgaatcctga aggcggccct aactgggtcc gaaacttcgt ggacagcccc 1320 atcatcgtgg acatcaccaa ggacaccttc tacaagcagc ccatgttcta ccacctggga 1380 cacttcagca agttcatccc cgagggctct cagcgcgttg gactggtggc ttcccagaag 1440 aacgatctgg acgccgtggc tctgatgcac cctgatggat ctgctgtggt ggtggtcctg 1500 aaccgcagca gcaaagatgt gcccctgacc atcaaggatc ccgccgtggg attcctggaa 1560 acaatcagcc ctggctactc catccacacc tacctgtggc gtagacag 1608 <210> 3 <211> 145 <212> DNA <213> Dependoparvovirus Adeno-associated virus 2 <400> 3 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145

Claims (27)

  1. 글루코세레브로시다제(GCase)를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제1 재조합 바이러스를 포함하는 테스트 샘플의 상대 효능을 측정하는 방법으로서, 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 테스트 샘플을 복수의 제1 세포에 형질도입하는 단계;
    b) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제1 세포를 인큐베이션하는 단계;
    c) 형질도입된 복수의 제1 세포로부터 제1 세포 용해물을 수확하는 단계;
    d) 제1 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계;
    e) 제1 세포 용해물을 이미지화하여 제1 형광 판독값을 얻는 단계;
    f) GCase를 인코딩하는 트랜스진을 포함하는 제2 재조합 바이러스를 포함하는 참조 표준을 복수의 제2 세포에 형질도입하는 단계;
    g) GCase를 발현하기에 충분한 조건하에서 형질도입된 복수의 제2 세포를 인큐베이션하는 단계;
    h) 형질도입된 복수의 제2 세포로부터 제2 세포 용해물을 수확하는 단계;
    i) 제2 세포 용해물을 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드와 조합하는 단계;
    j) 제2 세포 용해물을 이미지화하여 제2 형광 판독값을 얻는 단계; 및
    k) 평행선 분석을 사용하여 제1 형광 판독값을 제2 형광 판독값과 비교하여 테스트 샘플의 상대 효능을 계산하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 제1 재조합 바이러스 및 제2 재조합 바이러스는 GCase를 인코딩하는 동일한 트랜스진을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 재조합 바이러스 및/또는 제2 재조합 바이러스는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV)인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, rAAV는 AAV9 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
  5. 제3항에 있어서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질, 또는 이들 캡시드 단백질 중 어느 하나의 변이체를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, GCase는 서열 번호 1을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, GCase를 인코딩하는 트랜스진은 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 2를 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 HEK-293T 또는 HEK-293 세포인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1.25 mM 레조루핀-베타-D-글루코피라노사이드가 제1 세포 용해물 및/또는 제2 세포 용해물과 조합되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 멀티 웰 플레이트에 시딩되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 복수의 제1 세포 및/또는 복수의 제2 세포는 웰 당 약 20,000개의 세포로 시딩되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 테스트 샘플 및/또는 참조 표준은 형질도입 전에 연속 희석되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 세포 용해물 수확 전 약 68시간 내지 약 81시간 인큐베이션되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 제1 세포 및 복수의 제2 세포는 형질도입 후 세포 용해물 수확 전 약 66시간 내지 약 78시간 인큐베이션되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 감염 다중도(MOI)의 제1 재조합 바이러스 테스트 샘플을 복수의 제1 세포에 형질도입하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 감염 다중도(MOI)의 제2 재조합 바이러스 참조 표준을 복수의 제2 세포에 형질도입하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 형광 판독값 및/또는 제2 형광 판독값은 GCase 활성의 측정을 반영하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, GCase 활성의 측정은 상대 형광 단위(RFU)/시간인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 비교 단계(k)는 재조합 바이러스 양 및 RFU/시간의 로그 변환을 수행하고 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대한 재조합 바이러스 양의 로그값 대(versus) RFU/시간의 로그값에 관한 표준 곡선을 플롯하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대한 재조합 바이러스 양의 로그값 대 RFU/시간의 로그값의 선형 회귀를 계산함으로써, 테스트 샘플 기울기 및 참조 표준 기울기를 유도하는 것을 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 비교 단계(k)는 테스트 샘플 및 참조 표준 각각에 대해 얻은 선형 회귀를 사용하여 공통 기울기로 선형 회귀를 계산하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상대 효능은 다음 식을 사용하여 계산되는, 방법: 상대 효능(%) = 10 ^ ((b - b참조)/A) x 100.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 공통 기울기에 대한 테스트 샘플 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40인, 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 공통 기울기에 대한 참조 표준 기울기의 비율은 약 0.60 내지 약 1.40인, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 테스트 샘플 및 참조 표준의 선형 회귀에 대한 R2 값을 계산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 테스트 샘플 및 참조 표준에 대한 R2 값은 0.9 이상인, 방법.
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