KR20230087110A - 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 아우레오바시디움 풀루란스 mhau2101 균주 및 이의 용도 - Google Patents
식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 아우레오바시디움 풀루란스 mhau2101 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양여액을 포함하는 식물병 방제용 농약 제제, 비료 조성물, 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주 화상병균 및 가지검은마름병균 모두에 항균 활성을 나타내므로, 식물병 방제를 위한 미생물 제제로 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양여액을 포함하는 식물병 방제용 농약 제제, 비료 조성물, 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.
1995년 강원도 춘천에서 처음으로 가지검은마름병(Erwinia pyrifoliae)이 발견된 이후 근절되지 않고 있는 사과, 배 등 장미과 과수산업에 지대한 영향을 주는 법정전염병이다. 과수가지검은마름병은 우리나라 및 유럽 일부 국가에서 발생하는 것으로, 화상병과 매우 흡사하여 사과·배 수출입에 많은 문제를 유발하고 있다.
또한, 화상병(Erwinia amylovora)은 나무가 불에 탄 것처럼 말라 죽는 병으로, 처음 발견된 이후 100년이 넘도록 원인이 밝혀지지 않다가, 1800년대 후반 병원균을 확인하면서 지금의 화상병(Fire blight)이라는 병명이 붙여지게 되었다. 우리나라의 경우, 2015년 안성, 천안, 제천 등에서 처음으로 확인되었으며, 충북지역에서 많이 발생하여 확산되고 있다. 날씨가 따뜻해지는 4-5월 개화기에 주로 발병하며, 이 시기에 과수 농가의 각별한 주의가 요구된다.
가지검은마름병과 화상병은 발생 증상만으로는 구분하기 쉽지 않으며, 심지어 화상병 간이검사 진단키트에서도 둘다 양성반응을 보이는 경우가 있어, DNA를 이용한 2차 검사를 통해서만 2종의 병을 명확히 구분할 수 있다. 하지만, 화상병균 및 가지검은마름병균은 엄연히 다른 병원균이 유발하는 식물병으로, 화상병균은 31℃가 넘는 고온에서도 병원균이 생장을 지속하지만, 가지검은마름병균은 26~27℃에서 병원균 생장이 급격하게 멈추는 게 차이점이다.
화상병균 및 가지검은마름병균은 모두 전염성이 강하여 한번 발생하면 나무 전체가 고사될 수 있는 무서운 병으로, 국내 사과나무와 배나무에 화상병 및 가지검은마름병이 발생하여 폐원하는 과수원이 증가하고 있다. 현재까지, 화상병 및 가지검은마름병에 대한 확실한 치료 방법이 존재하지 않아, 해당 식물병균에 대한 방제용 조성물 개발이 필요한 실정이다.
T.N.Temple et al. Plant Disease, 104:121-128 (2020). Floral colonization --- Aureobasidium pullulans strains used to suppress fire blight of pome fruit
전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullalans) MHAU2101 균주(KACC93372P)를 발굴하고, 이의 화상병균 및 가지검은마름병균에 대한 항균 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주(KACC93372P), 이를 포함하는 식물병 방제용 농약 제제, 비료 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주(KACC93372P)를 제공한다.
상기 용어 “아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullalans)”는 통칭 흑효모 (black yeast)라고도 하며, 토양, 공기 중에서 발견되는 미생물 중 하나로 환경 적응력이 매우 뛰어나다. 상기 균주는 낮은 습도, 고온, 높은 태양광 조사, 심지어 방사성 핵종 (radionuclides)이 있는 환경에서도 생존, 생장할 수 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 아우레오바시디움 속 균주 중에서도 화상병균 및 가지검은마름병균 모두에 항균 활성을 나타내는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주를 분리하였으며, 이를 하기와 같이 규명하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 배나무 꽃으로부터 신규한 효모 균주를 분리 및 선별하였으며, 선별된 효모를 계통수 분석 및 형태적 분류 동정한 결과 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)임을 확인하였으며, 이를 MHAU2101 균주로 명명하였다. 상기 균주는 2021년 10월 1일자로 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하여, 2021년 10월 18일자로 수탁번호 KACC93372P를 부여받았다. 또한 상기 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 28S rRNA를 포함하는 것을 확인하였다.
상기 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주는 식물 병원균, 즉, 토양 오염성 병원균에 대해 현저한 항균 활성을 가짐을 확인하였다.
상기 “식물 병원균”은 식물에 기생생활을 하는 균류(기생균), 식물에 살생생활을 하는 균(살생균), 특정한 식물에 기생하는 조건적 기생균 등 식물의 병을 유발하는 균류를 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 식물 병원균은 화상병균(Erwinia amylovora) 및 가지검은마름병균(Erwinia pyrifoliae)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주는 화상병균 및 가지검은마름병균 모두에 대해 현저한 항균 활성을 가짐을 확인하였다. 구체적으로, 배 미숙과 및 사과 미숙과에 화상병균 및 가지검은마름병균을 각각 접종하고, 멸균수를 처리한 대조군과 비교하여 아오레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주를 접종한 경우, 병반이 발생되지 않음을 확인하였다.
다른 양상은 일 양상에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 농약 제제를 제공한다.
상기 균주에 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 균주에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 균주에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
상기 용어, “농약”이란 작물의 보호와 생장에 사용되는 약제를 의미한다. 구체적으로 농작물의 재배, 저장 중 발생하는 병, 해충, 잡초, 병균, 선충, 응애 등을 방제하기 위해 사용하기 위한 제제뿐만 아니라 농작물의 생리기능을 증진 또는 억제하는데 사용하기 위한 생장조절제, 약효를 증진시키는 보조제를 모두 포함할 수 있다.
상기 용어, "방제"란, 작물에 피해를 주는 각종 병해충을 예방하고 구제하는 것을 의미한다.
상기 “배양액”은 균주를 배양하여 얻은 것일 수 있고, 상기 “배양여액”은 균주를 배양한 배양액을 물리적으로 여과여 얻은 것일 수 있다. 상기 배양여액은 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 또는 이들의 조합을 의미하는 것일 수 있다.
상기 “식물병”은 세균성 병 또는 바이러스 병일 수 있으며, 바람직하게는 화상병균(Erwinia amylovora) 및 가지검은마름병균(Erwinia pyrifoliae)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 균주에 의한 병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 식물병은 화상병, 가지검은마름병, 역병, 더뎅이병, 무름병, 시들음병, 잿빛곰팡이병, 마름병, 흰곰팡이병, 뿌리 썩음병, 고추역병 및 탄저병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물병 방제용 농약 제제는 상기 언급된 균주와 같은 유효성분 이외에, 당업계에 공지된 식물병 방제 활성을 갖는 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 식물병 방제용 농약 제제는 농약분야에 공지된 다양한 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제형화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제 또는 도포제의 형태로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물병 방제용 농약 제제는 제형화를 위해 다양한 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 액체 담체, 고체 담체, 계면활성제 또는 보조제 등이 포함될 수 있다.
상기 액체 담체로는 물(water), 식물유(vegetable oil), 에탄올(ethanol) 등이 사용될 수 있으며, 상기 식물유에는 대두유, 유채씨기름, 야자유, 팜핵유, 미강유, 옥수수유, 팜유, 올리브유 등이 포함되고, 이에 제한되지 않는다. 상기 고체 담체로는 광물 분말, 젤라틴, 알긴산 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 광물 분말로는 양이온 점토(cation clay), 벤토나이트(bentonite), 카올린(kaolin), 탈크(Talc), 규조토(diatomaceous earth) 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 계면활성제로는 에틸렌옥사이드(Ethyleneoxide)계, 다이에탄올아민(Diethanolamine)계, 솔비톨(Sorbitol)계, 글리세린(Glycerine)계 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 보조제로는 증량제, 부동액, 용제, 증점제, 전착제 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물병 방제용 농약 제제에 포함되는 유효성분의 농도는 식물체의 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 조절할 수 있다.
상기 식물병 방제용 농약 제제는 관주용, 침지용, 엽면 살포용, 종자 소독용 또는 농기구 소독용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 양상은 일 양상에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 비료 조성물을 제공한다.
상기 균주, 균주의 배양물 등에 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 균주, 배양물 등에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 균주, 배양물 등에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
상기 용어 "비료"란 거름이라고도 불리며, 토지를 기름지게 하고 초목의 생육을 촉진시키는 영양물질을 의미한다. 본 발명의 조성물을 포함하는 비료는 파종 전 토양과 혼화하여 간편하게 사용할 수 있으며, 농약 등의 살포시 함께 시비할 수 있다.
상기 비료 조성물은 천연물로부터 유래된 성분을 포함하는 친환경적인 조성물로서, 사람이나 가축 및 토양에 무해하므로 화학비료보다 안전하게 병해를 방지할 수 있다. 상기 비료 조성물을 사용할 수 있는 작물로는 화상병, 가지검은마름병 또는 이들의 조합이 발병되는 식물이라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구체예에 있어서, 상기 비료 조성물은 사과, 배 및 장미과에 속한 식물 중 적어도 어느 하나의 식물에 대해 화상병을 방제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 비료 조성물은 사과, 배로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 식물에 대해 가지검은마름병을 방제하는 것일 수 있다.
상기 비료 조성물은 첨가제로서 질소, 인, 칼륨, 규산소다, 키토산, 목초액, 칼슘, 마그네슘, 철, 망간, 붕소, 황, 아연, 구리, 몰리브덴 및 염소를 첨가할 수 있으며, 작물의 종류, 비료성분의 길항작용 및 상조작용을 참고로 첨가할 수 있다.
상기 첨가제 중 질소, 인산 및 칼륨은 작물에 필수적인 비료의 3요소이다. 상기 인은 식물의 세포핵 분열조직 및 포스폴리라제와 같은 식물의 생리상 중요한 요소의 구성요소이며 뿌리의 발육을 촉진하는 역할을 한다. 상기 규산소다는 작물의 생산량 및 품질을 향상시키고, 스트레스 저항성을 높여 주며, 각종 유해 성분을 중화하는 역할을 한다. 토양 중에 존재하는 규산은 가용성 규산 형태로 작물의 뿌리에 흡수되면 잎이나 줄기의 표피세포 중에 침적되어 식물체의 병충해 등에 대한 저항성을 향상시킨다. 또한, 규산은 냉해에 대한 저항성 증가, 이로 인한 시비효율 증진, 토양 비옥도 증진 및 병충해 경감 등의 작용으로 인해 생산비를 절감하는 효과가 있다. 상기 키토산은 게, 새우 등의 갑각류 껍데기에 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 물질로서, 작물의 생산량을 증대시키고, 우수한 항균 활성을 나타내 작물의 내병성을 증진시키는 역할을 한다. 사용될 수 있는 키토산의 예로는 수용성 키토산 또는 이들의 유도체를 들 수 있으며, 구체적으로 키토산 유도체로서 카르복시메틸 키토산(carboxymethyl chitosan) 또는 설페이티드 키토산(sulfated chitosan), 바람직하게는 카르복시메틸 키토산이 이용될 수 있다. 상기 목초액은 다량의 초산을 함유하고 있어 해충에 대한 기피 작용을 하며 몇몇 병원성 세균에 대해서 높은 저항성을 부여한다. 상기 칼슘은 세포막의 구성요소이며, 단백질의 합성에 관여하고 질소의 흡수 및 이용을 돕는다. 또한, 체내의 유해한 유기산을 중화하고 알루미늄의 과잉흡수를 억제하며 그 독성을 줄여준다. 또한, 상기 마그네슘은 광합성 작용과 인산대사에 관여하는 효소의 활성을 높이고 종자내의 지방질의 집적을 돕는다. 상기 철은 호흡효소의 구성성분이다. 또한, 상기 망간은 각종 효소의 활성을 높이고 동화물질의 합성분해, 호흡 작용, 광합성 등에 관여한다. 상기 붕소는 촉매 또는 반응조절물질로 작용하며, 석회결핍의 영향을 줄여준다. 상기 황은 결핍되면 전체적인 생장이 저해된다. 상기 아연은 결핍되면 황화작용이 일어나고 잎이 작아진다. 상기 구리는 결핍되면 새잎의 선단부터 황백화되고 작물이 시들게 된다. 상기 몰리브덴은 결핍되면 질산염의 환원장애를 유발한다. 상기 염소는 결핍되면 새싹 또는 새눈이 황화되고 작물의 품질이 나빠진다.
또 다른 양상은 일 양상에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 균주 및 식물병 등에 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 균주 및 식물병 등에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 균주 및 식물병 등에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
상기 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
상기 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 상기 방제 방법 가운데 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리계의 토양 내로의 살포 (액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다.
상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물에 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등)에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
상기 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 일 양상에 따른 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
상기 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 일 양상에 따른 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미리 확보하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 일 양상에 따른 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 일 양상에 따른 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함할 수 있다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
상기 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주는 식물 병원균, 구체적으로 화상병 및 가지검은마름병에 대해 항균 활성을 나타낸다. 이는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주가 식물병 방제를 위한 미생물 제제로 이용될 수 있음을 의미하는 바, 식물병 방제 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 PDA 배지에서 14일간 배양한 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주를 나타낸 사진이다.
도 2는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 28S rRNA 유전자 염기서열 계통수를 나타낸 도면이다.
도 3은 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 ITS 유전자 염기서열 계통수를 나타낸 도면이다.
도 4는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 균사 및 포자 형태를 확인한 현미경 사진이다.
도 5는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 포자 출아 모습을 관찰한 현미경 사진이다.
도 6은 배 미숙과에 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101(+) 또는 멸균수(-)를 처리한 후, 화상병균 및 가지검은마름병균을 접종하여 병반 발생 여부를 비교한 사진이다.
도 7은 사과 미숙과에 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101(+) 또는 멸균수(-)를 처리한 후, 화상병균을 접종하여 병반 발생 여부를 비교한 사진이다.
도 8는 사과 미숙과에 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101(+) 또는 멸균수(-)를 처리한 후, 가지검은마름병균을 접종하여 병반 발생 여부를 비교한 사진이다.
도 2는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 28S rRNA 유전자 염기서열 계통수를 나타낸 도면이다.
도 3은 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 ITS 유전자 염기서열 계통수를 나타낸 도면이다.
도 4는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 균사 및 포자 형태를 확인한 현미경 사진이다.
도 5는 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101의 포자 출아 모습을 관찰한 현미경 사진이다.
도 6은 배 미숙과에 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101(+) 또는 멸균수(-)를 처리한 후, 화상병균 및 가지검은마름병균을 접종하여 병반 발생 여부를 비교한 사진이다.
도 7은 사과 미숙과에 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101(+) 또는 멸균수(-)를 처리한 후, 화상병균을 접종하여 병반 발생 여부를 비교한 사진이다.
도 8는 사과 미숙과에 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101(+) 또는 멸균수(-)를 처리한 후, 가지검은마름병균을 접종하여 병반 발생 여부를 비교한 사진이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 배나무 꽃에서 아우레오바시디움(
Aureobasidium
) 속 효모균 분리 및 계통수 분석
1-1.
배나무 꽃으로부터 효모균 분리
배나무 포장에서 배나무 꽃눈이 포함된 가지를 수집하였다. 배나무 꽃의 암술머리 시료를 채취하여 살균수 100㎕에 넣고 볼텍싱한 후 30분간 침출시켰다. 침출 후 시료를 마쇄하여 마쇄액 10㎕를 TSA 배지에 획선 도말하여 2일간 27℃에서 배양하여 아우레오바시디움 속의 효모균을 분리하였다. 효모균을 따서 PDA 배지에 중앙에 치상하여 14일간 배양하였다. PDA에서 14일간 배양한 효모균 사진을 도 1에 나타내었다.
1-2.
분리된 효모균의 분류 동정
배양한 아우레오바시디움속의 효모균으로부터 현미경상에서 단포자를 멸균한 스틱으로 분리하여 PDA 배지의 중앙에 치상하여 14일간 배양하였다. 배양한 아우레오바시디움속 효모균으로부터 핵산을 추출(Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication Kit, Promega AS1600)하여 28S rRNA와 ITS 영역의 염기서열 분석을 통해 계통수를 작성하였다.
계통수는 BioEdit 7에서 염기서열 파일을 Fasta (*.fas, *.fst, *.fsa)로 설정한 후, MEGA version 7.0.26에서 Maximum Likelihood Tree로 Bootstrap 횟수를 1000반복으로 설정하고 Juke-Cantor model으로 선택하여 계통수를 작성하였다. 계통수 분석결과 배나무 꽃에서 분리한 효모균은 아우레오바시디움 풀루란스로 동정되었다. 구체적으로, 분리한 효모균의 28s rRNA 유전자 염기 서열 및 ITS 유전자 염기 서열은 하기 표 1에 나타내었고, 각 유전자의 염기서열 계통수는 도 2 및 3에 나타내었다.
| 염기 서열 | 서열번호 | |
| 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주의 28S rRNA 유전자 서열 | TTTTTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAAGCTAGCCTTCGGGTTCGCATTGTAATTTGTAGAGGATGCTTTGGGTAAAACGCCAGTCTAAGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTATGTGACTGGAAATGTTAACCTATGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGAGGTAAATTTCTTCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAAAAAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCAATCAGACTTGTTTAAACTGTTCGGCCGGTCTTCTGACCGGTTTACTCAGTTTGGACAGGCCAGCATCAGTTTCGGCGGCCGGATAAAGGCTCTGGGAATGTGGCCTCCACTTCGGTGGAGGTGTTATAGCCCAGTGTGTAATACGGCCAGCCGGGACTGAGGTCCGCGCTTCGGCTAGGATGCTGGCGTAATGGTTGTAAGCGACCCGTCTTGAACAACCGGACCAA | 1 |
| 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주의 ITS 유전자 서열 | TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAAGAGTAAGGGTGCTCAGCGCCCGACCTCCAACCCTTTGTTGTTAAAACTACCTTGTTGCTTTGGCGGGACCGCTCGGTTCCGAGCCGCTGGGGATTCGTCCCAGGCGAGTGCCCGCCAGAGTTAAACCAAACTCTTGTTATTAAACCGGTCGTCTGAGTTAAAATTTTGAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACACCACTCAAGCTATGCTTGGTATTGGGTGCCGTCCTTAGTTGGGCGCGCCTTAAAGACCTCGGCGAGGCCACTCCGGCTTTAGGCGTAGTAGAATTTATTCGAACGTCTGTCAAAGGAGAGGAACTCTGCCGATTGAAACCTTTATTTTTCTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAA | 2 |
분리한 효모균의 형태적 분류 동정을 위해, 현미경 상에서 관찰하였다. 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 현미경 상에서 관찰한 결과, 자의 형태는 투명하고 매끄러운 타원형의 단세포이며 모양과 크기가 다양했다. 균사는 투명하고 매끄럽고 얇으며 격벽이 있다. 멜라닌에 의해 검게 보이는 균사도 확인할 수 있다. 구체적으로, 각각 분리한 효모균의 균사 및 포자 모습과 포자의 출아 모습을 도 4 및 도 5에 나타내었다.
실시예 2. 화상병 및 가지검은마름병에 대한 발생억제 효과 검정
2-1. 세균 균주의 배양
화상병균(Erwinia amylovora) 및 가지검은마름병균(Erwinia pyrifoliae)은 농촌진흥청에서 진단 확진용 검정 균주(TS3128/CP12327)들을 이용하였고, TSA 배지에 획선 도말하여 27℃에서 2일간 배양하였다.
2-2. 분리된 효모균 배양 및 실험재료 준비
아우레오바시디움 풀루란스를 14일간 PDA에서 배양한 후 5ml 멸균수에 넣고 30분간 충분히 교반하여 접종액을 제조하였다. 화상병균과 가지검은마름병균은 TSA 배지에서 콜로니를 따서 10mM MgSO4에 O.D600에서 0.5로 조정하여 접종액을 제조하였다.
사과 미숙과와 배 미숙과의 표면을 70% 알코올로 세척한 200㎕ 파이펫 팁으로 배 미숙과는 1cm 정도 찔러 3개의 구멍을 내었고 사과 미숙과는 1cm 정도 찔러 두 개의 구멍을 내었다.
2-3. 배 미숙과에서 화상병 및 가지검은마름병 발생 억제 효과 검정
배 미숙과에서 화상병 및 가지검은마름병 발생 억제 효과를 검정하기 위해, 배 미숙과 구멍에 두 개에 구멍에는 아우레오바시디움 풀루란스(+)를 하나의 구멍에 멸균수(-)를 2㎕씩 각각 넣어 25℃에서 2일간 배양하였다. 이후, 화상병균과 가지검은마름병균을 모든 구멍에 2㎕씩 처리한 후 7일간 배양하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 멸균수(-)를 처리한 후 화상병균과 가지검은마름병균을 접종한 경우에는 갈색 또는 검은색의 병반이 나타나며 세균 분출액이 관찰되었다. 이와 달리, 아우레오바시디움 풀루란스(+)를 접종한 후 화상병균과 가지검은마름병균을 접종한 경우에는 병반이 나타나지 않았다. 상기 결과를 통해, 분리된 아우레바시디움 풀루란스 균주는 화상병균 및 가지검은마름병균의 발생을 동시에 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
2-4. 사과 미숙과에서 화상병 및 가지검은마름병 발생 억제 효과 검정
사과 미숙과에서 화상병 및 가지검은마름병 발생 억제 효과를 검정하기 위해, 사과 미숙과 구멍에 멸균수(-) 및 아우레오바시디움 풀루란스(+)를 2㎕씩 각각 넣어 25℃에서 2일간 배양한 후, 화상병균 및 가지검은마름병균을 2㎕씩 각각 넣어 7일간 배양하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 사과 미숙과에서 화상병 발생 억제 효과를 검정한 결과, 멸균수(-) 처리 후 화상병균을 접종한 경우에는 갈색 또는 검은색의 병반이 나타나며 세균 분출액이 분출되었으나, 아우레오바시디움 풀루란스(+) 처리 후 화상병균을 접종한 경우에는 병반이 관찰되지 않았다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 사과 미숙과에서 가지검은마름병 발생 억제 효과를 검정한 결과, 멸균수(-) 처리 후 가지검은마름병균을 접종한 경우에는 갈색 또는 검은색의 병반이 나타나며 세균 분출액이 분출되었으나, 아우레오바시디움 풀루란스(+) 처리 후 화상병균을 접종한 경우에는 병반이 관찰되지 않았다.
상기 결과로부터, 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주는 배 미숙과 및 사과 미숙과에서 화상병과 가지검은마름병에 대한 방제 효과가 있음을 확인할 수 있다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Aureobasidium pullalans MHAU2101 strain with antibacterial
activity against plant pathogens and uses thereof
<130> PD21-251
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 622
<212> RNA
<213> Aureobasidium pullulans
<400> 1
tttttgcata tcaataagcg gaggaaaaga aaccaacagg gattgcccta gtaacggcga 60
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aggatgcttt gggtaaaacg ccagtctaag ttccttggaa caggacgtca tagagggtga 180
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aagcacgtga aattgttgaa agggaagcgc ttgcaatcag acttgtttaa actgttcggc 420
cggtcttctg accggtttac tcagtttgga caggccagca tcagtttcgg cggccggata 480
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<210> 2
<211> 584
<212> RNA
<213> Aureobasidium pullulans
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tagggatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaaa 584
Claims (16)
- 수탁번호 KACC93372P로 기탁된 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullalans) MHAU2101 균주.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 28S rRNA 유전자 서열을 포함하는 것인 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 식물 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 것인 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주.
- 청구항 3에 있어서, 상기 식물 병원균은 화상병균(Erwinia amylovora), 가지검은마름병균(Erwinia pyrifoliae) 또는 이들의 조합인 것인 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 농약 제제.
- 청구항 5에 있어서, 상기 식물병은 화상병균, 가지검은마름병균 또는 이들의 조합에 의해 발병되는 것인 식물병 방제용 농약 제제.
- 청구항 5에 있어서, 사과, 배 및 장미과에 속한 식물 중 적어도 어느 하나의 식물에 대해 화상병을 방제하는 것인 식물병 방제용 농약 제제.
- 청구항 5에 있어서, 사과, 배 및 모과로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 식물에 대해 가지검은마름병을 방제하는 것인 식물병 방제용 농약 제제.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 비료 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 식물병은 화상병균, 가지검은마름병균 또는 이들의 조합에 의해 발병되는 것인 식물병 방제용 비료 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 사과, 배 및 장미과에 속한 식물 중 적어도 어느 하나의 식물에 대해 화상병을 방제하는 것인 식물병 방제용 비료 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 사과, 배 및 모과로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 식물에 대해 가지검은마름병을 방제하는 것인 식물병 방제용 비료 조성물.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 MHAU2101 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 식물병은 화상병균, 가지검은마름병균 또는 이들의 조합에 의해 발병되는 것인 식물병 방제 방법.
- 청구항 13에 있어서, 사과, 배 및 장미과에 속한 식물 중 적어도 어느 하나의 식물에 대해 화상병을 방제하는 것인 식물병 방제 방법.
- 청구항 13에 있어서, 사과, 배 및 모과로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 식물에 대해 가지검은마름병을 방제하는 것인 식물병 방제 방법.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| T.N.Temple et al. Plant Disease, 104:121-128 (2020). Floral colonization --- Aureobasidium pullulans strains used to suppress fire blight of pome fruit |
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