KR20230085439A - 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)에 의해 유발되는 비결핵 항산균 감염 질환을 예방하거나 개선 또는 치료할 수 있는 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 마이코박테리움 압세수스 야생형 균주, 이의 임상 분리주 또는 이의 클라리스로마이신(clarithromycin)-내성 균주에 대해 우수한 성장 억제능을 가지고, 거친 형(rough type) 또는 매끄러운 형(smooth type)의 콜로니(colony)를 보이는 마이코박테리움 압세수스 모두에 대해 효과적으로 성장 억제 활성을 가진다.
또한, 상기 조성물은 호기성 뿐만 아니라 혐기성 조건에서도 상기 균주에 대한 우수한 억제 활성을 가지며, 인간 대식세포 및 인간 배아세포 유래 대식세포 내에서도 우수한 억제 활성을 가진다. 즉, 상기 조성물은 시험관 내(in vitro) 및 세포 내(intracellular) 모두에서 우수한 억제 활성을 가지는 바, 이를 활용하여 비결핵 항산균 감염 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING NONTUBERCULOUS MYCOBACTERIAL INFECTION DISEASES}
본 발명은 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)에 의해 유발되는 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria; NTM) 감염 질환을 예방하거나 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
비결핵 항산균(non-tuberculosis mycobacteria, NTM)은 토양 및 식수원과 같은 환경 도처에 존재하며 높은 비율로 인간-병원체 접촉을 유발한다. NTM 감염의 발생률은 급격히 증가하여 자원이 풍부한 선진국에서의 결핵 발생률을 능가한다. 질병 또는 면역 억제 치료로 인한 세포 면역 시스템에 결함이 있는 노인 및 개인과 같은 감수성 숙주 집단의 증가가 NTM 감염 증가에 기여한다. 폐 NTM 감염이 가장 빈번하고, 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus, M. abscessus)와 같은 일부 NTM은 겉보기에 건강한 대상에서도 폐 또는 다른 감염을 유발할 수 있으며, 폐 외의 신체 부위와 관련된 감염도 증가하고 있다.
M. abscessus는 Runyon group IV에 속하는 NTM으로, 급속 성장하는 마이코박테리아(rapid-growing mycobacteria, RGM)로 분류된다. 일본 및 미국에서는, 폐 감염의 약 5%가 RGM에 의해 발생되고 RGM 감염의 약 65-80%가 M. abscessus에 의해 기인된다. M. abscessus에 의한 폐 질환은 낭포성 섬유증(cystic fibrosis, CF) 환자 사이에서 흔한 반면, 파종성 감염(disseminated infection)은 면역 저하 환자에서 흔하다. CF로부터 고통 받는 환자는 M. abscessus로부터 콜로니화(colonization) 및 감염의 기회가 증가한다. 전향적 연구에 따르면, NTM 감염의 주요 위험 요소 중 하나가 CF이며 M. abscessus가 가장 만연했다. CF에서 M. abscessus는 염증성 폐 손상을 가속화하여 치료가 불가능한 경우가 빈번하며, 안전한 폐 이식을 방해하여 임상 결과가 좋지 않거나 증상 없이 평생 지속되는 감염을 초래한다.
M. abscessus는 가장 흔하게 고립된 폐 감염으로, 평균 치료 성공률이 단 45.6%에 불과하며, M. abscessus subsp. massiliense의 특정 치료 성공률은 56.7%이다. M. abscessus는 화학요법제에 대해 가장 내성이 강한 유기체 중 하나이며, 인간 병원체로써 주요 위협은 높은 다중 약물 내성 때문이다. M. abscessus는 또한, 생물막 형성, 소독제 내성, 고온 및 산성 환경과 관련이 있다. NTM으로 인한 만성 폐 질환 환자의 경우, 현재 이용 가능한 치료법 중 어느 것도 완치되거나 장기간의 담(sputum) 전환에 효과적이지 않다. M. abscessus의 높은 항생제 내성률은 항생제 병용 치료조차 효과가 없을 수 있다.
M. abscessus 폐 감염에 대한 현재 치료 권장사항은 클라리스로마이신(clarithromycin, CLR), 아미카신(amikacin, AMK), 아지트로마이신(azithromycin, AZR), 세팔로스포린(cephalosporin, β-락탐계), 세폭시틴( cefoxitin, FOX) 및 카바페넴 (β-락탐의 다른 타입) 이미페넴(carbapenem (another type of β-lactam) imipenem, IPM)을 포함할 수 있는 복합 약물 요법을 포함하고, 이는 미국흉부학회 및 미국감염병학회에서 권장하나, 이러한 치료법으로는 M. abscessus 감염 환자의 절반 미만만이 완치될 수 있다.
이에, 새로운 치료 접근법을 확인하는 것이 필요하고, 다양한 기전에서 M. abscessus에 대한 잠재적 활성을 가진 실험적 항생제 및 새로운 치료법에 대한 연구가 급증하고 있으나, M. abscessus에 대한 효능에 대해서는 충분히 연구되지 않은 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-0817425호 (2008년03월27일 공고)
본 발명의 목적은 비결핵 항산균(non-tuberculosis mycobacteria, NTM)에 대한 억제 효과가 우수한 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)일 수 있다.
상기 조성물은 마이코박테리움 압세수스 야생형 균주, 이의 임상 분리주 또는 이의 클라리스로마이신(clarithromycin)-내성 균주의 성장을 억제할 수 있다.
상기 비결핵 항산균 감염 질환은 비결핵 항산균 감염에 의한 폐 질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환일 수 있다.
<화학식 1>
Figure pat00001
본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적/식품학적으로 허용가능한 염의 신규한 용도로, 상기 화합물 또는 이의 염은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus, M. abscessus) 야생형 균주, 이의 임상 분리주 또는 이의 클라리스로마이신(clarithromycin)-내성 균주에 대해 우수한 성장 억제능을 가지는 바, 이를 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 활용하여 비결핵 항산균 감염 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실험예에 따른 10-DEBC의 시험관 내(in vitro) 활성을 나타낸 것이다. (A)는 MH(Mueller-Hinton) 브로스 배지에서 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus, M. abscessus)에 대한 10-DEBC의 활성을 나타낸 것으로, REMA 방법으로 용량-반응 곡선을 플로팅하였다 (RFU; Relative Fluorescence Units 상대 형광 단위). (B)는 패널 B RLU (Relative Luciferase Units; 상대 루시페라제 단위)와 동일한 조건에서 배양된 M. abscessus-LUX에 대한 10-DEBC의 활성을 나타낸 것이다. 실험은 3개의 생물학적 복제로 수행되었고, 각 농도에 대한 평균 ± SEM으로 표시되었다.
도 2는 클라리스로마이신-내성 M. abscessus 돌연변이체(clarithromycin-resistant M. abscessus mutants; M. abscessus CLR-R)에 대한 10-DEBC의 활성을 나타낸 것으로, M. abscessus CLR-R을 100g/L에서 97μg/L의 클라리스로마이신(CLR) 및 10-DEBC로 처리했을 때 MH 배지에서 성장하는 능력을 테스트하였다. 왼쪽 도면은 M. abscessus CLR-R의 용량-반응 곡선을 나타내고, 오른쪽 도면은 레자주린(resazurin)의 색 변화를 통해 박테리아의 생존율을 나타낸 것이다. 레자주린의 파란색이 살아있는 M. abscessus에 의해 산화되면 분홍색으로 변하여 M. abscessus의 성장을 나타낸다. 이 결과는 대표적인 실험에서 만들어졌다. 실험은 3개의 생물학적 복제로 수행되었고, 각 농도에 대한 평균 ± SEM으로 표시되었다.
도 3은 REMA를 사용하여 호기성 및 혐기성 조건 하에서 M. abscessus에 대한 용량-반응 곡선을 나타낸 것으로, (A)는 클라리스로마이신(CLR), (B)는 10-DEBC 처리에 의한 활성을 나타낸다. 혐기성 생성 용기 시스템 (BD GasPak™EZ) 내에서 M. abscessus가 7일 동안 진행되었다. 실험은 3개의 생물학적 복제로 수행되었고, 각 농도에 대한 평균 ± SEM으로 표시되었다.
도 4는 10-DEBC의 MBEC 생물막 항균성 생존율을 분석한 것(왼쪽 도면)으로, MBEC 생물막 생존율 분석은 레자주린을 사용(오른쪽 도면)하여 생물막 내 살아있는 M. abscessus의 대사 활성 측정을 통해 생물막 내 M. abscessus에 대한 10-DEBC의 유도 박멸 효과를 확인할 수 있다. 실험은 3개의 생물학적 복제로 수행되었고, 각 농도에 대한 평균 ± SEM으로 표시되었다.
도 5는 10-DEBC의 세포 내 M. abscessus의 사멸 촉진 효과를 나타낸 것으로, (A)는 대식세포 내 10-DEBC의 이중 판독 분석 결과로, 대식세포의 감염은 3시간 동안 세포당 2개의 박테리아의 다중 감염(multiplicities of infection, MOI)으로 수행되었고, 세척하여 세포외 마이코박테리아를 제거한 후. THP-1 대식세포 내에서 루시페라제를 발현하는 M. abscessus 단독으로부터 발광이 검출되었다. SYTO 60으로 염색된 감염 THP-1 세포를 형광 검출하에서 계수하고, 멀티 리더기(Multi Reader)를 사용하여 총 세포를 계수하였다.
(B)는 THP-1 세포 내 10-DEBC의 M. abscessus에 대한 용량-반응 곡선으로, PMA로 활성화된 THP-1를 MOI 2에서 GFP-발현된 M. abscessus로 3시간 동안 감염시킨 다음, 신선한 배지에서 10-DEBC를 지시된 농도로 처리하였다. 비율 합계 강도 값은 모든 데이터 감소 단계에 사용된다.
(C)는 iMAC 세포 내 10-DEBC의 M. abscessus에 대한 용량-반응 곡선으로, iMAC은 MOI 2에서 GFP-발현된 M. abscessus로 3시간 동안 감염시킨 다음, 신선한 배지에서 10-DEBC를 지시된 농도로 처리하였다.
(D)는 표시된 농도의 10-DEBC로 처리한 후 3일째 GFP-발현된 M. abscessus 감염된 iMAC의 이미지로, LionheartTM 자동화된 살아있는 세포 이미저를 사용한 자동화 현미경 이미지이다. Gen5TM 3.05 소프트웨어 개체 기능으로 이미징 필드 내에서 세포 식별할 수 있다. 데이터는 각 농도의 3배에 대한 평균 ± SD로 표현되었다 (Scale bar = 100μm).
본 명세서에서 사용되는 용어에 대해 간략히 설명하고, 본 발명에 대해 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
명세서 전체에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
아래에서는 첨부한 도면을 참고하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에 대한 해결하고자 하는 과제, 과제의 해결 수단, 발명의 효과를 포함한 구체적인 사항들은 다음에 기재할 실시 예 및 도면들에 포함되어 있다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure pat00002
상기 화합물은 4-(2-클로로-10H-페녹사진-10-일)-N,N-디에틸부탄-1-아민[4-(2-chloro-10H-phenoxazin-10-yl)-N,N-diethylbutan-1-amine] 또는 10-[4′-(N,N-디에틸아미노)부틸]-2-클로로페녹사진 (10-[4′-(N,N-diethylamino)butyl]-2-chlorophenoxazine, 10-DEBC)으로 명명될 수 있고, 또는 10-DEBC로 명명될 수 있다.
상기 화합물은 Akt (또는 Protein kinase B, PKB)의 선택적 억제제이다. Akt는 일종의 세린(serine)/트레오닌(threonine) 키나아제로, Caspase 9 및 BAD를 포함한 세포 사멸 기계의 구성 요소를 인산화 및 비활성화하고, Forkhead 전사 인자를 인산화 및 억제하여 세포 생존을 촉진한다. 그러나, 비결핵 항산균에 대한 상기 화합물에 대한 기전은 아직 연구된 바 없다.
상기 화합물은 이와 동일한 효능을 갖는 범위 내에서 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, "약학적 또는 식품학적으로 허용가능한"이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 의미한다.
상기 염은 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염기성 염 또는 산성염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있다. 염기성염은 유기 염기염, 무기 염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
산성염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 이중 인산, 질산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 말산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산, 스테아르산 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 다양한 무기산 및 유기산을 이용하여 형성되는 염이 모두 포함될 수 있다.
또한, 상기 화합물은 약학적 또는 식품학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물, 유도체 등을 모두 포함할 수 있다. 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있고, 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹여 과량의 유기염기를 가하거나 무기염기의 염기 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 또는 이 혼합물에서 용매나 과량의 염기를 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
바람직하게는, 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 상기 화합물의 염산염(hydrochloride), 즉, 10-DEBC 염산염(10-DEBC hydrochloride)의 형태로 사용될 수 있다.
<화학식 2>
Figure pat00003
상기 화합물 또는 이의 염은 비결핵 항산균의 성장을 억제할 수 있다.
바람직하게는, 상기 비결핵 항산균은 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 화합물 또는 이의 염은 마이코박테리움 압세수스 야생형 균주, 이의 임상 분리주 또는 이의 클라리스로마이신(clarithromycin)-내성 균주의 성장을 억제할 수 있다.
더불어, 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 화합물 또는 이의 염은 거친 형(rough type) 또는 매끄러운 형(smooth type)의 콜로니(colony)를 보이는 마이코박테리움 압세수스 모두에 대해 효과적으로 성장 억제 활성을 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 상기 화합물 또는 이의 염은 호기성뿐만 아니라 혐기성 조건에서도 상기 균주에 대한 우수한 억제 활성을 가지며, 인간 대식세포 및 인간 배아세포 유래 대식세포 내에서도 우수한 억제 활성을 가지는 바, 시험관 내(in vitro) 및 세포 내(intracellular) 모두에서 이러한 활성을 확인할 수 있었다.
이러한 활성을 가지는 상기 화합물 또는 이의 염은 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물로 활용할 수 있다.
상기 비결핵 항산균 감염 질환은 비결핵 항산균 감염에 의한 폐 질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
또한, 상기 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 등을 더 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 비결핵 항산균 감염 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure pat00004
바람직하게는, 상기 화합물 또는 이의 염은 하기 화학식 2로 표시되는 상기 화합물의 염산염(hydrochloride), 즉, 10-DEBC 염산염일 수 있다.
<화학식 2>
Figure pat00005
상기 화합물 또는 이의 염은 비결핵 항산균, 바람직하게는, 마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)의 성장을 억제할 수 있고, 보다 상세하게는, 상기 화합물 또는 이의 염은 마이코박테리움 압세수스 야생형 균주, 이의 임상 분리주 또는 이의 클라리스로마이신(clarithromycin)-내성 균주의 성장을 억제할 수 있다.
이에, 상기 화합물 또는 이의 염은 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물로 활용할 수 있다.
상기 비결핵 항산균 감염 질환은 비결핵 항산균 감염에 의한 폐 질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 화합물 또는 이의 염의 유효 용량은 비결핵 항산균 감염 질환 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 비결핵 항산균 감염 질환 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
아래의 실험예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험방법
1-1. 박테리아 균주 및 배양 조건
M. abscessus 균주 (DSMZ 44196)를 10% OADC (BD, 212240)가 보충된 Middlebrook 7H9 배지 (BD, 27130), 37℃에서 성장시켰다. 국가병원체 자원은행(National Culture collection for Pathogens, NCCP)으로부터 9개 임상 균주를 획득하였고 통상의 미생물 및 생화학적 테스트를 위해 서울 임상 실험실(seoul clinical laboratory, SCL)로 보내졌다. SCL은 마이코박테리아 식별 결과를 제공하였다. 10-DEBC를 제외한, 9개 약물에 대한 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 브로스 미량희석법(broth microdilution method, SCL의 가이드라인, Yongin-si, Gyeonggi-do, Korea)으로 형성되었다.
M. abscessus CLR 내성 돌연변이(M. abscessus CLR-R)와 녹색 형광 단백질 및 대식세포 감염에 대한 발광(luminoscence) 단백질을 발현하는 재조합 M. abscessus는 이전에 설명한대로 준비하였다 (International Journal of Molecular Sciences 2021, 22, (20), 11029., Lee, D.-G. et al.).
혐기성 조건에서 M. abscessus에 대한 항생제 능력을 평가하기 위하여, 10% OADC가 보충된 5mL의 7H9 액체 배지 (BD, 271310)에 5×106 박테리아/mL을 접종하였다. 박테리아 배양물을 혐기성 병 (BD BBLTM GasPakTM Jar; Franklin Lakes, NJ, USA)에 넣었다. 여기서 BD BBLTM GsaPakTM 혐기성 지시약 (산소 고갈을 모니터링하는데 사용되는 메틸렌 블루)을 사용하였다. 약물 감수성을 테스트하기 위해, 양이온으로 조정된 뮬러-힌트(Mueller-Hinton) 브로스 (MH; Sigma-Aldrich, 90922)에서 박테리아를 성장시켰다.
10-[4′-(N,N-디에틸아미노)부틸]-2-클로로페녹사진 (10-[4′-(N,N-diethylamino)butyl]-2-chlorophenoxazine, 10-DEBC)은 Tocris Bioscience (Bristol, UK)에서 구입하였다.
1-2. 용량 반응 곡선(dose-response curves, DRC) 테스트
최소 억제 농도(MIC)는 미국임상검사표준연구원(Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI)의 지침에 따라 결정되었다. 활발히 성장하는 M. abscessus, M. abscessus-pLUX G13, CLR-R 돌연변이, 및 혐기성 배양된 M. abscessus에 10-DEBC를 처리하였다.
10-DEBC를 총 부피 100μL의 96-웰 플레이트에서 2배 연속 희석한 다음, 0.025% 레자주린(resazurin) 시약을 첨가하기 전에 37℃로 84시간 동안 배양하였다. 밤새 배양한 후, Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (Bio-Tek, VT, USA)를 사용하여 레소루핀(resorufin; 대사체 레자주린)의 형광을 측정하였다. IC50 (half maximal inhibitory concentration; 세포의 절반을 억제하는 데 필요한 농도) 값은 Prism 5.0 소프트웨어 (GraphPad Inc., La Jolla, CA, USA)를 사용하여 원(raw) 형광 데이터로부터 계산되었다. 실험은 삼중으로 수행되었다.
1-3. 생물막(biofilm) 분석
최소 생물막 박멸 농도(minimal biofilm eradication concentration, MBEC) 분석은 이전에 설명하였다 (International Journal of Molecular Sciences 2021, 22, (20), 11029., Lee, D.-G. et al.). 이전과 같이 MBEC 측정용 MBEC Assay®(Innovotech, Edmonton, Canada)를 사용하여 분석을 진행하였다.
먼저, 생물막 형성을 진행하고 96-peg 뚜껑을 96-웰에 위치시킨 후, 배지와 함께 200μL 10-DEBC 용액을 준비한 다음, 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 4일 동안 두었다. 배양 후, 최적화된 레자주린 시약으로 MBEC를 정량화하였다.
1-4. 세포 내(intracellular) 사멸 분석
THP-1 세포를 최종 농도 50nM의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate, PMA; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 이틀 동안 처리하였다. 녹색 형광성(pTEC15) 또는 루시페라제를 함유하는 M. abscessus로의 감염은 2:1의 MOI(multiplicity of resistance)에서 3시간 동안 37℃에서 수행되었다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 50μg/L 젠타마이신(gentamycin)을 포함하여 30분 동안 배양한 다음, 다시 PBS로 세척하였다. 그리고나서, 표시된 농도의 10-DEBC가 포함된 200μL RPMI 1640 배지를 4일 동안 사용하였다. 대식세포를 37℃에서 최종 농도 5μM로 SYTO 60 (Invitrogen, USA) 염료로 30분간 염색하였다. 발광(luminescence)은 Synergy H1 microplate reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 4일 째 측정하였다.
인간 배아세포 유래 대식세포(human embryonic cell-derived macrophages, iMACs)는 이전에 설명되었다 (Stem Cell Reports 2019, 13, (6), 980-991. Han, H. W. et al.). 녹색 형광을 가진 M. abscessus를 iMAC 세포 감염 방법은 분화된 THP-1 세포와 동일하였다. 살아있는 세포의 이미지는 Lionheart™ FX automated microscopy (Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 자동화된 현미경에 의해 캡쳐되었다. Agilent BioTeK Gen5TM 3.05 소프트웨어 개체 기능을 사용하면 이미징 필드 내 세포를 식별할 수 있다.
1-5. 데이터 분석
Prism version 7.0 (GraphPad) 및 Gen5TM 3.05 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 그래프를 구성하였다.
1-6. 윤리성
모든 연구는 국립마산결핵병원 기관심사위원회 (IRB-398837-2018-E34, 2019.01.14 승인) 및 기관생물안전위원회 (MTHIBC-19-01 및 MTHIBC-21-11, 2019.02.26 및 2021.01.15 승인)의 승인을 받았다.
2. 실험결과
2-1. M. abscessus 에 대한 10-DEBC의 활성 확인
CLSI는 현재 RGM(rapid-growing mycobacteria)에 대한 항균제의 MIC를 결정하기 위해 뮬러-힌트(Mueller-Hinton, MH) 브로스와 같은 미량희석 브로스-기반 방법을 권장하는 바, 7H9 브로스-기반 방법 대신 레자주린을 사용한 MH 브로스에서 M. abscessus에 대한 10-DEBC의 MIC 값을 얻었다. M. abscessus에 대한 10-DEBC의 IC50 은 각각 MH 브로스에서 3.006μg/mL 및 7H9 브로스에서 5.81μg/mL 이었다. 10-DEBC는 MH 또는 Middlebrook 7H9 브로스 배지의 유형과 관계없이 M. abscessus의 참조 균주에 대하여 유사한 효능을 발휘하였다.
도 1(A)를 참조하면, 10-DEBC는 작용 기전이 다른 클라리스로마이신(clarithromycin, CLR), 아미카신(amikacin, AMK) 및 스트렙토마이신(streptomycin, STR)과 같은 다른 참조 화합물과 유사한 시험관 내(in vitro) 활성을 나타내었다. 본 실험예에서, M. abscessus에 대한 클라리스로마이신(CLR), 아지트로마이신(azithromycin, AZR), 아미카신(AMK) 및 스트렙토마이신(STR)의 in vitro IC50은 각각 0.613, 5.784, 1.34 및 18.52μg/mL이었다.
염료 기반 및 흡광도 기반 분석에 비해 단순하고 섬세하여 약물 발견 응용 프로그램에 적합한 리포터-기반 분석(reporter-based assay) 방법을 채택하였다. 발광 리포터 균주를 구성한 다음, CLR 및 10-DEBC의 MIC를 결정하는 데 사용하였다. 먼저, 10-DEBC 및 CLR의 in vitro 활성을 리포터 기반 생물발광법으로 측정한 후, REMA 방법을 사용하여 MIC 데이터를 얻었다. 약물 감수성을 확인하기 위해 M. abscessus의 생물 발광 균주를 사용하였다.
도 1(B)를 참조하면, M. abscessus-LuxG13에서 10-DEBC의 용량-반응 곡선(DRC)을 확인할 수 있고, IC50 값은 3.9μg/mL로 나타났다. 따라서, 10-DEBC는 M. abscessus에 대한 효과적인 약물 후보로 간주될 수 있다.
2-2. M. abscessus 및 클라리스로마이신(clarithromycin, CLR) 내성 돌연변이의 임상 분리주에 대한 10-DEBC의 활성 확인
클라리스로마이신(CLR)은 M. abscessus 감염 치료에 필수적인 항생제이지만, CLR에 대한 내인성 및 후천성 내성으로 인해 치료가 점점 까다롭고 불만족스러운 결과를 초래한다. 이는 M. abscessus의 임상 분리주, 특히 R(rough) 형 균주에서 일반적이다. 이에, 거친(rough, R)- 및 매끄러운(smooth, S)- 콜로니 형태형을 포함하는 임상 분리주 패널에 대해 10-DEBC가 상기의 강력한 활성을 유지하는지 여부를 확인하였다.
하기 표 1은 M. abscessus 임상 분리주에 대한 10-DEBC 및 다양한 항균제의 활성을 나타낸 것이다.
Figure pat00006
* 약어 : 감수성 (Susceptible, S), 중간 (Intermediate, I), 유도성 내성 (Inducible Resistant, IR), 내성 (Resistant, R); 미국임상검사표준연구원에서 제안한 비결핵성 항산균 (NTM)에 대한 항균제 및 감수성 중단점 (CLSI 2011)
상기 표 1을 참조하면, 10-DEBC는 아종 참조 균주에 대해 관찰된 MIC와 유사하게 IC50 값의 범위가 1.69에서 2.63μg/mL로, 임상 분리주 9개 균주를 억제하였다.
R-표현형은 숙주 방어 전략에 저항할 수 있는 방식으로, S-표현형 보다 훨씬 더 강한 경향이 있다. 이러한 결과는 10-DEBC가 참조 균주 M. abscessus (DSMZ 44196) 및 임상 R- 및 S- 콜로니 형태 균주 모두에 대해 in vitro 에서 효과적임을 입증한다.
더불어, 10-DEBC가 고농도 (100μg/mL의 CLR, 프로토콜에서 사용됨)에서 실험실에서 생성된 약물 내성 균주의 성장을 효과적으로 억제하는지 여부를 테스트하였다.
도 2를 참조하면, 실험실-생성 내성 돌연변이는 CLR에 대해 높은 약물 내성을 보였다. 항 CLR-변이체는 IC50 밴드가 4.662 ~ 5.535μg/mL로 10-DEBC에 대해서는 감수성을 보였고, 이는 CLR-내성 또는 감수성 균주와 관계없이 동일하게 나타났다. 즉, 10-DEBC는 CLR 감수성 및 내성 균주에 대해 모두 활성인 바, 10-DEBC는 CLR-내성 M. abscessus의 치료를 위한 활성 약물로 간주될 수 있다.
2-3. M. abscessus 를 성장시키는 비복제 및 생물막에 대한 10-DEBC 민감성 확인
산소 기아에 의해 유도된 비복제 단계 배양에 대한 10-DEBC의 활성을 확인하였다. 약물에 대한 영향을 평가하기 전에, 호기성(aerobic) 및 혐기성(anaerobic) 조건 하에서 M. abscessus의 성장 곡선을 측정하여 비복제 조건을 확인하였다.
도 3(A)를 참조하면, CLR은 호기성 조건 (IC50 0.034μg/mL) 보다 혐기성 조건에서 배양된 M. abscessus (IC50 1.309μg/mL)에 대하여 증가된 활성을 보였고, 더 높은 IC50 값으로 유의미한 37.52배 이동을 보여주었다.
흥미롭게도, 혐기성 조건에서 10-DEBC의 IC50 값은 호기성 배양과 비교하여 1.18배 증가하여 호기성 배양과 유사한 결과를 나타내었다. 즉, 10-DEBC는 비복제 환경과 밀접한 관련이 있는 혐기성 M. abscessus에 대한 활성을 가짐을 확인할 수 있다.
생물막 성장은 항균제 내성의 필수 요소이다. 생물막을 형성하는 미생물에 의한 항생제, 소독제 및 살균제에 대한 내성은 치료 실패로 이어질 수 있다. 임상 경험에 따르면, 생물막은 감염을 해결하기 위해 물리적으로 박멸해야 한다. M. abscessus에서 MIC 및 MBEC 사이 차이점, 특히 CLR의 MBEC가 MIC와 비교하여 100,000배 증가됨이 발견되었으나, M. abscessus가 CLR에 노출되었을 때, CLR의 일반적인 MIC 보다 MBEC가 0.034μg 내지 200μg 미만으로 6,000배 더 높음을 확인하였다.
도 4를 참조하면, CLR은 성장 배지에서 우수한 살균 활성 (IC50 = 0.034μg/mL)을 가지나, 궁극적으로 생물막-성장 M. abscessus에 대한 활성 (IC50 > 200μg/mL)은 상실되었다. 반면에, 10-DEBC는 생물막-성장 박테리아에 대해 여전히 38.72μg/mL의 IC50 값을 나타냈다. 이는 생물막-성장 M. abscessus에 대한 활성이 있음을 의미한다. 이러한 결과는 10-DEBC가 모든 종류의 항 M. abscessus 치료에 중요한 물질임을 보여준다.
2.4. 10-DEBC의 세포 내 M. abscessus 에 대한 효과 확인
10-DEBC가 세포 독성에 영향을 미치지 여부를 결정하기 위하여 다양한 농도에 대한 세포 생존율을 평가하였다. 10-DEBC는 세포 내 M. abscessus를 억제하는 특정 농도에서 세포 독성이 관찰되지 않았으며, 1차 줄기세포에서 분화된 대식세포에 대해 상당한 독성을 보이지 않았다. 또한, LDH 및 MTT 테스트에서 입증된 바와 같이, 10μM에서 10-DEBC 이염산염(dihydrochloride) 단독으로 적용했을 때 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다.
이중-판독 테스트를 통해 M. abscessus 억제 및 THP-1 세포의 세포 독성에 대한 용량-반응 곡선을 얻을 수 있었다. 구체적으로, IC50 및 CC50 (cell toxicity concentration that induces 50% cell death; 50%의 세포 사멸을 유도하는 세포독성 농도)를 결정할 수 있다.
도 5는 10-DEBC에 대한 이중 DRC 및 시간에 따른 동일 스크리닝 웰에서 획득한 데이터를 보여준다. 세포 독성은 SYTO 60 프로브를 사용하여 결정되었다. CLR를 사용한 치료는 감염 공격으로부터 성공적으로 세포를 구출하고 박테리아 복제를 방지하였다. 기존 연구에 따르면, CLR은 0.1μg/mL 농도에서 감염 2일 후 존재하는 세포 내 M. abscessus를 유의하게 감소시켰다.
도 5(A)를 참조하면, 10-DEBC는 이중-판독 분석에서 최고 농도에서도 THP-1 세포 독성없이 3.48μg/mL의 IC50으로 M. abscessus (lux) 성장을 억제하였다.
도 5(B) 내지 도 (D)를 참조하면, THP-1 감염 모델과 일관되게, 10-DEBC의 세포 내 억제 활성이 나타났다. 10-DEBC는 13.18μg/mL의 IC50으로 THP-1 세포에서 M. abscessus의 세포 내 성장을 억제하는 동시에, 50μg/mL의 가장 높은 농도에서 숙주 세포 독성 없이도 5.8μg/mL의 IC50으로 iMAC 내부 M. abscessus의 복제를 억제하는 것으로 나타났다.
현재, 대식세포와 M. abscessus 상호작용을 밝히는 것을 목표로 하는 연구 및 실험은 1차 단핵구 유래 대식세포(primary monocyte-derived macrophages) 또는 THP-1, RAW264.7, J774A와 같은 대식세포 유사 세포주의 사용에 의존하고 있다. 1차 단핵구 유래 대식세포는 인간 혈액 조직 샘플에서 분리할 수 있지만, 비용 집약적인 분리/생성, 기증자간 가변성 및 확장에 대한 제한의 한계가 있다. 인간 대식세포 유사 세포주는 지속적인 재배에 대한 제한과 각각의 유전적 배경이 신뢰성을 저해하는 문제가 있다.
이러한 문제를 피하기 위해 iPSC-유래 원시 대식세포(iPSC-derived primitive macrophages, iMACs)를 사용하여 실험을 진행하였다. iMAC를 사용하여 GFP-형광 Mab 균주에 감염된 세포의 현미경적 스코어링을 설정하였다.
10-DEBC의 작용 방식은 Mab의 성장 조절에 관여하는 경로인 AKT1 신호 전달의 억제를 통한 것으로 보여지며, 이는 THP-1 세포 실험에서도 유사한 결과를 보이는 바, iMAC를 약물 발견에 사용함이 적합함을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며,이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    <화학식 1>
    Figure pat00007

  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 비결핵 항산균은,
    마이코박테리움 압세수스(Mycobacterium abscessus)인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은,
    마이코박테리움 압세수스 야생형 균주, 이의 임상 분리주 또는 이의 클라리스로마이신(clarithromycin)-내성 균주의 성장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 비결핵 항산균 감염 질환은,
    비결핵 항산균 감염에 의한 폐 질환, 림프절염, 피부·연조직·골감염증 또는 파종성 질환인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물:
    <화학식 1>
    Figure pat00008
KR1020210173613A 2021-12-07 2021-12-07 비결핵 항산균 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물 KR20230085439A (ko)

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KR100817425B1 (ko) 2000-02-09 2008-03-27 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤 피리돈카복실산류를 유효성분으로 하는 항항산균제

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KR100817425B1 (ko) 2000-02-09 2008-03-27 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤 피리돈카복실산류를 유효성분으로 하는 항항산균제

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