KR20230083267A - 다중특이적 항-tcr 델타 가변 1 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감마 델타 T 세포의 T 세포 수용체 및 또 다른 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적, 특히 이중특이적 항체 및 이의 단편 및 변이체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 적어도 2종의 새로운 부류의 이중특이적 항체: γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄 및 암 항원 또는 암-연관 항원에 결합하는 이중특이적 T-세포 관여자, 및 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄 및 면역조절 항원에 결합하는 이중특이적 이중 면역조절자(DI)를 제공한다.

Description

다중특이적 항-TCR 델타 가변 1 항체
본 발명은 감마 델타 T 세포의 T 세포 수용체 및 또 다른 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적, 특히 이중특이적 항체 및 이의 단편 및 변이체에 관한 것이다.
암에 대한 T 세포 면역요법에 대한 증가하는 관심은 특히 PD-1, CTLA-4 및 다른 수용체에 의해 발휘된 저해 경로의 임상적으로 매개된 길항작용에 의해 탈억제될 때, 암 세포를 인식하고 숙주-보호 기능적 잠재력을 매개하는 CD8+ 및 CD4+ 알파 베타(αβ) T 세포 하위세트의 명백한 능력에 초점을 맞추었다. 그러나, αβ T 세포는 MHC-제한되는데 이는 이식편대숙주병을 야기할 수 있다.
감마 델타 T 세포(γδ T 세포)는 γδ T-세포 수용체(TCR)를 정의하는 구별되는 표면 상에서 발현되는 T 세포의 하위세트를 나타낸다. 이러한 TCR은 1개의 감마(γ) 및 1개의 델타(δ) 쇄로 구성되며, 이들 각각은 쇄 재배열을 거치지만 αβ T 세포에 비해 제한된 수의 V 유전자를 갖는다. Vγ를 암호화하는 주요 TRGV 유전자 분절은 TRGV2, TRGV3, TRGV4, TRGV5, TRGV8, TRGV9 및 TRGV11 및 비기능성 유전자 TRGV10, TRGV11, TRGVA 및 TRGVB이다. 가장 빈번한 TRDV 유전자 분절은 Vδ1, Vδ2 및 Vδ3와, Vδ 및 Vα 명칭 둘 다를 갖는 여러 V 분절을 암호화한다(Adams et al., 296:30-40 (2015) Cell Immunol.). 특정 γ 및 δ 유형은 하나 이상의 조직 유형에서 배타적이지 않지만 더 널리 퍼져 세포 상에서 발견되므로, 인간 γδ T 세포는 TCR 쇄에 기반하여 광범위하게 분류될 수 있다. 예를 들어, 대부분의 혈액-상주 γδ T 세포는 Vδ2 TCR, 일반적으로 Vγ9Vδ2를 발현하지만, 이는 감마 쇄와 짝을 이룬, 예를 들어, 종종 장에서 Vγ4와 짝을 이룬 Vδ1 TCR을 더 빈번하게 사용하는 피부에서와 것과 같은 조직-상주 γδ T 세포 중에서 덜 일반적이다.
γδ T 세포는 스트레스 마커의 패턴을 통해 악성 또는 형질전환된 세포(예를 들어, 암 세포)를 인식한 다음 강력하고 선택적인 세포독성을 발휘하는 면역 감시에서 중요한 역할을 한다. 따라서 γδ T 세포는 면역 반응의 조정자 역할을 할 수 있다. 동일계에서 이러한 세포의 조절은 다른 면역요법으로 어려운 것으로 입증된 돌연변이 부하가 낮은 종양에서도 면역원성을 증가시킬 수 있는 가능성을 제공한다. γδ T 세포에 의한 종양의 인식은 임의의 단일 종양 항원에 좌우되지 않으며 γδ T 세포의 조절인자는 혈액학적 및 고형 악성종양 모두를 포함하는 다양한 질환 징후에서 잠재력을 갖는다. γδ T 세포의 인식 기전은 MHC 제한되지 않는다.
국제 공개 제WO2019147735호의 저자는 일부 γδ 세포가 전종양 활성을 갖거나 αß T 세포에 의해 매개되는 항암 면역 반응을 저해한다는 가설을 세웠다. 이 저자는 γδ T 세포가 면역억제제라고 가정하고 따라서 이들이 항체의 도움으로 암 환경에서 고갈, 저해 또는 차단되어야 한다고 제안한다.
그러나, 항-γδ 항체가 이러한 세포를 차단하거나 사멸시킴으로써 γδ 세포 기능을 부정적으로 조절할 것이라는 일반적인 견해에도 불구하고, γδ T 세포 침윤과 환자의 예후 및/또는 생존 사이에 양의 상관관계가 존재하는 것으로 밝혀졌다.
αβTCR 수용체/리간드 상호작용에 비해, vδ1 TCR 수용체/리간드 상호작용에 대한 이해는 제한적이다. 이러한 이해가 없는 경우, 현재까지 vδ1 TCR을 인식하는 항체는 주로 이러한 상호작용을 조사하기 위한 탐색 도구이다. 이러한 도구는 전형적으로 TCR 수용체/리간드 상호작용이 vδ1+ 세포의 차단, 억제 또는 제거를 초래한다는 것을 시사하는 미가공(crude) 차단 항체이다. 예를 들어, 도구 항체 TS8.2 및 TS-1은 상기 항체가 vδ1 세포의 세포독성을 감소시킨다고 제안하는 연구에서 항-γδ 차단 항체로 사용된다. 이들 연구는 다른 것들과 조합하여 동일계 질환 설정에서 vδ1 세포의 세포독성을 유리하게 조절하기 위한 이러한 항-vδ1 항체의 사용이 상상할 수 없으며 따라서 vδ1 세포독성을 감소시키는 것이 아니라 증가시키는 항체에 대한 필요성이 있음을 시사한다.
면역요법에 대해 γδ T 세포를 활용하기 위해 동일계에서 세포를 확장시키거나 또는 이를 수거하고, 재주입 전에 생체외에서 이들을 확장시키기 위한 수단이 필요하다. 후자의 접근법은 이전에 외인성 사이토카인의 첨가를 사용하여 기재되었으며, 이는, 예를 들어, 국제 공개 제WO2017/072367호 및 제WO2018/212808호을 참조한다. 환자 자신의 γδ T 세포를 확장시키는 방법은 하이드록시-메틸 부트-2-엔일 피로포스페이트(HMBPP) 또는 임상적으로 승인된 아미노비스포스포네이트의 약리학적으로 변형된 형태를 사용하여 기재되었다. 이러한 접근법에 의해서, 250명 초과의 암 환자가 치료되었고, 겉보기에는 안전하지만, 완전 관해 정도는 드물기 단지 드물다. 그러나, 다수의 γδ T 세포를 확장시키는 입증된 능력을 갖는 활성화제가 여전히 필요하다.
또한, 동일계에서 Vδ1+ 세포의 수를 우선적으로 표적화하거나 결합하거나 인식하거나 특이적으로 조절하거나 또는 증가시킬 수 있는 결합제 또는 활성화제가 의약으로서 매우 바람직할 수 있다.
그러나, Zometa®(졸레드론산)와 같은 아미노비스포스포네이트를 포함시켜 Vδ2+ 세포를 감재적으로 조절하는 의약이 존재하는 동안, 상기 의약은 주로 뼈 재흡수를 둔화시키도록 설계된다. 그리고 상기 Vδ2+ 조절과 무관하게, 다수의 Vδ1+ 세포에 결합하거나, 표적화하거나, 조절하거나, 활성화시키거나 또는 증가시키도록 특이적으로 설계된 의약품을 개발할 필요가 있다. 이는, 예를 들어, Vδ2+ 조절을 반복하면 오래 지속되고 점진적으로 소진되는 표현형이 될 수 있기 때문이다.
또한, 그리고 Vδ1+ 세포의 우세한 조직-상주 본질을 고려하면, Vδ1+를 조절할 수 있는 이상적인 의약은 또한 '표적외(off-target)'인 바람직하지 않은 효과 및 빠른 신장 제거를 더 적게 나타낼 것이다. 전형적으로, 상기 바람직하지 않은 효과는 소분자 화학물질을 이용할 때 나타날 수 있다. 예를 들어, Vδ2+ 세포의 별도의 부류를 조절할 수 있는 것으로 제시된 전술된 아미노비스포스포네이트는 (뼈에 대한 1차 조절 효과에 비해 2차 효과로서) 신장 기능 악화 및 잠재적인 신부전으로 나타나는 신장 독성과 연관되어 있다(예를 들어, Markowitz et al. (2003) Kidney Int. 64(1):281-289). Zometa에 대해 유럽의약품기구(European Medicine Agency)에 의해 열거된 추가적인 바람직하지 않은 효과는 빈혈증, 과민 반응, 고혈압, 동맥 세동, 근육통, 일반 통증, 권태감, 혈액 요소 증가, 구토, 관절 부종, 흉통 등을 포함한다.
vδ1+ 세포가 스스로를 찾는 동일계 환경에 대해서도 추가로 고려해야 한다.　예를 들어, 이전에 비-조혈, 조직-상주 γδ T 세포는 조직으로부터 처음 분리되었을 때 강력한 증식 반응을 나타내었지만 자가유래 섬유아세포와 직접 세포 접촉하지 않은 경우에만 나타내었다. 비-조혈 조직-상주 T 세포(γδ T 세포)는 기능하기 위해 비-조혈 세포(예를 들어, 간질 세포, 특히 섬유아세포)로부터 분리되어야 하는 것으로 밝혀졌다. 이는 기질 또는 상피 세포와 림프구의 직접적인 접촉이 조직-상주 γδ T 세포의 확장을 저해하는 것으로 보이기 때문이다. 사전-활성화된 세포가 추가로 억제된 상태로 존재한다는 관찰은 vδ1 세포가 현재까지 유망한 치료 표적으로 간주되지 않은 또 다른 이유이다. 사실, 본 명세서에 기재된 발견이 있기 전까지는 혈액 및 조직 vδ1+ 세포가 전형적으로 '휴지', '사전-활성화' 또는 '비-활성화'로 간주되는 동일계에서 이러한 세포를 유리하게 그리고 선택적으로 조절할 수 있는 방법을 인지하지 못했다.
다양한 치료 용도를 위해 다양한 형식의 이중특이적 및 다중특이적 항체가 개발되었다. 이중특이적 및 다중특이적 항체는 생물학적 표적의 유형 및 작용 모드에 기초하여 중첩되지만 별개의 부류로 나눌 수 있다. 예를 들어, 이러한 다중특이적 항체는 세포독성 효과기 세포 리디렉터(이중특이적 T-세포-동원 항체, 이중특이적 T-세포 관여자(engager), TCE 또는 BiTE라고도 알려짐) 및 이중 면역조절제(DI)와 같은 부류로 나눌 수 있다.
TCE는 T 세포를 종양 세포로 또는 그 반대로 표적화함으로써 종양에 대한 환자의 면역 반응을 향상시키고 T-세포(통상적으로 CD3)의 T-세포 수용체 복합체의 제1 에피토프 및 제2 에피토프(이는 암 항원 또는 종양 연관 항원(TAA)과 같은 암-연관 항원임)를 표적화함로써 작용한다. 이러한 항체는 종양 세포 및 T 세포를 공동 국재화하여 종양 세포 사멸을 촉진한다. BiTE의 예는 CD3 x CD19 이중특이적 항체 블리나투모맙, CD3 x EpCAM 이중특이적 항체 카투막소맙 및 CD3 x HER2 이중특이적 항체 에르투막소맙을 포함한다. BiTE와 같은 TCE는 일반적으로 scFv 형식으로 제공되지만 다른 형식도 제공된다. 예를 들어, BiKE는 BiTE와 유사하지만, 이것은 CD3가 아닌 NK 세포의 CD16을 표적으로 한다.
T 세포 수용체는 포유동물 면역계의 가장 복잡한 수용체 구조로 설명되었다. 이는 다수의 CD3 쇄에 매우 근접한 T-세포 수용체를 포함하는 막관통 다중-단백질 수용체 복합체를 포함한다. 예를 들어, 포유동물에서, 전형적인 이러한 복합체는 T-세포 수용체, CD3γ 쇄, 1개의 CD3δ 쇄 및 2개의 CD3ε 쇄를 포함한다. 이 쇄는 T 림프구에서 전형적인 활성화 신호를 생성하는 ζ-쇄(제타-쇄)와 함께 T-세포 수용체(TCR)와 회합한다. 그러나 대체 복합체가 또한 보고되어 있다. 예를 들어, T-세포 수용체 및 제타 쇄 동종이량체를 포함하는 T-세포 수용체 복합체가 기술되어 있다. 추가 보조 수용체, 예컨대, CD4 및 CD8이 또한 TCR 기능을 도울 수 있다.
수용체 복합체 조성에 관계없이, 상기 복합체가 세포 표면 결합 사건을 세포내 인산화 신호전달 캐스케이드로 변환한다는 것이 잘 확립되어 있다. 이러한 인산화 사건은 사이토카인 및 효과기 단백질, 예컨대, 그랜자임 및 퍼포린의 발현을 증가시키는 전사 인자, 예컨대, NFAT 및 NFkB의 활성화에서 절정에 이른다. 그러나, 암을 치료하기 위한 이러한 TCE의 사용은 매력적인 개념으로 남아 있지만, 초기 임상 개발에서 TCE를 발전시키기 위한 공동 노력의 30년 후에도 현재까지 많은 이러한 이중특이적 항체는 부족한 안전성, 효능 및 제조 가능성 프로파일을 나타내었다. 실제로, 2020년 1월 현재, 블리나투모맙은 당시 철회되지 않은 유일한 승인된 TCE로 남아있다. 이러한 TCE 다중특이적 항체 단편은 제1 결합 아암 상의 T-세포 수용체 복합체와 제2 결합 아암 상의 CD19 표적에 결합한다.
이중특이적 T-세포-동원 항체는 문헌[Lejeune et al., 2020, Front Immunol., 11:762]에서 논의된다. 그러나, 이러한 범주 내의 기존의 이중특이적 항체, 특히 CD3 결합을 통해 T 세포를 동원하는 항체는 환자의 T 세포 집단에서 신호 전달자로서의 CD3 항원의 효력 및 이의 편재성을 고려할 때 심각한 역 효과를 초래하는 상당한 표적외 효과를 갖는다. 따라서 카투막소맙(현재 철회됨)과 같은 CD3 표적화 이중특이적 예인 경우, 전신 전달(예를 들어, 정맥내)은 현실적인 가능성이 없다. 대신, 수술 중, 복강내, 복강내 등과 같은 보다 함유된 전달이 더 자주 고려된다. 이로써 상기 이중특이체의 의약으로서의 선택성 및 사용이 제한된다. 실제로, 효과기-약화된 항-CD3 항체(즉, CD3 표적화 T-세포 복합체 관여자이지만 이중특이적이 아님)의 경우에도, 연관된 독성이 I.V. 전달을 도전으로 만든다. 예를 들어, 노출을 제한하고 독성을 줄이기 위해, 항-CD3 항체 포랄루맙(Foralumab)은 현재 경구 전달(예를 들어, 장 질환 치료)을 위해 가장 자주 고려되고 있다.
초기 임상 시험에서 이러한 TCE로 관찰된 현재의 많은 좌절은 사용된 고-친화성 T-세포 복합체 결합 도메인으로 인한 것이라고 종종 언급된다. 또한, 이는 이러한 TCE를 설계하는 사람들이 자연 TCR-복합체 결합 사건의 낮은 친화성에 대해서 적절히 고려하지 않았기 때문에, 심각한 용량 제한 독성으로 인해 방해되어 치료 창이 상당히 좁아졌기 때문이라고 제안되었다. 이와 관련하여, 많은 초기 TCE 약물 개발자들이 OKT3, SP34 및 UCHT1로부터 유래된 3개의 항-CD3 T-세포 복합체 결합 도메인에 의존했다는 것이 강조되었다. 그리고 이러한 본래 결합 도메인은 모두 자연 결합 사건보다 대략 1,000배 더 높은 친화도에 해당하는 한 자릿수 내지 작은 두 자릿수nM 범위에서 상대적으로 높은 친화도로 결합한다. 결과적으로 이것은 T-세포 수용체 복합체의 자연 결합과 비교하여 T-세포의 활성화에 대해 근본적으로 상이한(그리고 종종 바람직하지 않은) 효과를 초래할 수 있다고 제안되었다. 예를 들어, 친화도가 더 높은 OKT3에 기반한 플랫폼을 사용하는 TCE 개발자는 OKT3가 IL-2의 존재 하에서 T-세포에 대해 아폽토시스를 일으킨다는 사실에 당황할 수 있다.
이러한 이유로, 더 낮은 친화도 T-세포 복합체 결합이 T-세포 관여 이중특이적 항체 치료제의 설계 매개변수를 결정하기 위한 중요한 고려사항이라는 것이 명백해졌다.
상기 TCE를 설계할 때의 또 다른 문제는 Fc 기능을 약화시켜야 한다는 것이다. 실제로, Fc가 Fc 감마 수용체(FcγR)에 결합하면 면역 효과기 세포가 활성화되기 때문에 전형적으로 TCE는 치료 효능을 최대화하고 표적외 독성을 최소화하기 위해 Fc-매개 효과기 기능을 완전히 억제해야 한다. 실제로, 현재 임상 실시에서의 대부분의 CD3-표적화 이중특이적 항체는 FcγR에 대한 결합 활성이 감소된 Fc 도메인을 갖거나 의도적으로 Fc 영역이 없는 이중특이적 단편이다. 일반적으로 Fc 기능이 약화되지 않은 TCE는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 효과를 유도하여 항체에 의해 인식되는 γδ T-세포 집단을 고갈시킬 것으로 예상될 것이다. 그러나 독성/안전성 복잡성을 피하기 위해 이러한 기능을 약화시킴으로써, 예를 들어, CD16+ 또는 CD32+ 또는 CD64+ 면역 세포를 관여시키거나 이중특이체의 반감기를 감소시킴으로써(예를 들어, BITE와 같은 더 작은 이중특이적 항체 단편을 사용하는 경우) 잠재적으로 중요한 효능 각도를 또한 약화시킬 수 있다. FcγR 및 TCE의 상호작용을 감소시키는 방법(예컨대, 상기 상호작용을 감소시키도록 설계된 IgG 형식 사용)은 TCE의 Fc-매개 고정화를 감소시키고 고정된 TCE와의 가교결합에 의해 TCR 클러스터링을 감소시킬 것으로 예상된다.
이러한 합병증의 전부는 아니지만 일부를 해결하기 위해서, Xencor(미국 캘리포니아주 패서디나 소재), Macrogenics(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재) 및 Genentech(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)와 같은 많은 회사는 최근에 각각의 TCE 플랫폼에서 T-세포 수용체 복합체 결합 아암의 결합 친화도를 감소시키는 것을 최근에 보고하였다. 그러나, 상기 결합의 친화도를 감소시키는 것은 TCE 설계 및 기능성 양상에서 덜 효과적인 효능 및 덜 선택적인 결과를 초래할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 이르러서 이러한 TCE에서 결합 도메인의 친화도가 생체내에서 분포 프로파일을 구동한다는 것이 입증되었다. 특히, 전형적으로 TCE 분포가 가장 높은 친화도 목표를 향해 편향되어 있음이 관찰된다. 따라서, T-세포 복합체에 대한 TCE 결합 도메인의 친화도를 감소시킴으로써, 그 다음 T-세포로부터 분포를 편향시키는 것이 전형적인데; 이것이 그러한 TCE의 효능을 발휘하는 데 필요한 바로 그 세포이다. 이것이 부분적으로는 TCE 치료 창이 상당히 좁다'고 불리는 이유이다.
따라서 더 많은 선택성을 제공하고 Fc-도메인 비활성화 또는 감쇠 또는 TCR 복합체에 대한 특정 친화도에 의존하지 않거나 부정적인 부작용이 감소된 보다 안전한 치료법을 제공하는 플랫폼을 포함하여, 기존 요법 및 후보 요법으로 이러한 문제를 해결하는 개선된 TCE-유형 의약이 필요하다.
이중 면역조절제 항체(DI)는 2개의 구별되는 면역조절성 표적에 결합하는 항체이다. 면역조절성 표적은, 예를 들어, 면역 관문 저해제 PD-L1, PD-1, OX40, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 및 VISTA를 포함한다(예를 들어, 문헌[Qin et al., 2019, Molecular cancer, 18:155]). 이 부류의 전형적인 예시적인 화합물은 2개의 면역조절성 신호전달 경로의 표적화를 조합한다. 이러한 DI의 예는 전형적으로 적어도 2개의 결합 도메인을 포함하며, 여기서 두 도메인은 각각 T-세포와 같은 면역 세포에 존재하는 2개의 개별 표적 단백질 또는 복합 단백질 상의 에피토프를 표적으로 한다. 지금까지 면역억제성 종양 미세환경을 극복하고, 그것을 "차가운" 상태에서 "뜨거운" 상태로 전환시켜, 전염증성 사이토카인의 축적 및 T 세포 침윤 및 종양 세포 사멸을 촉진하는 것을 돕기 위해서, 적어도 2개의 면역조절성 표적을 표적으로 하는 DI를 생성하는 것은 생각되지 않았거나 실제로 가능한 것으로 간주되지 않았고, 여기서 이러한 하나의 표적은 TCR δ1 쇄이다. 기존의 DI 접근법은 병용 요법과 연관된 높은 독성을 줄이거나 극복하기 위한 시도로 연구되고 있지만(또한 병용 요법에 비해 효능을 향상시키기 위해), 다수는 주의 깊은 모니터링이 필요하며 혼합된 성공률이 존재하였다. 암과 같은 병태의 치료를 위한 대안적인 면역조절성 접근법을 제공할 필요성이 남아 있으며, 본 발명은 이전에는 전혀 고려되지 않았던 DI 항체에 대한 완전히 새롭고 대안적인 접근법을 제공한다.
따라서 감염, 자가면역 병태 및 암의 치료를 위한 개선된 의약, 특히 다중- 및 이중-특이적 항체가 필요하다.
본 발명은 γδ T-세포 및 또 다른 항원을 표적으로 하는 다중특이적 항체에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 제1 양상에서, 제1 표적 에피토프(제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타(Vδ) 쇄의 에피토프임); 및 제2 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 다중특이적 항체는 제1 표적 에피토프(제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프임); 및 제2 표적 에피토프에 결합한다.
본 발명의 다중특이적 항체는 2개의 부류로 나눌 수 있다. 첫 번째 것은 T-세포 관여자인 다중특이적 항체이다. 두 번째 것은 이중 면역조절제인 다중특이적 항체이다.
따라서, 본 발명의 제2 양상에서 제1 표적 에피토프(제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프임); 및 제2 표적 에피토프(제2 표적 에피토프는 암 항원 또는 암-연관 항원의 에피토프임)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체가 제공된다.
본 발명의 제3 양상에서 제1 표적 에피토프(제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프임); 및 제2 표적 에피토프(제2 표적 에피토프는 면역조절 항원의 에피토프임)에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체가 제공된다.
본 발명의 제4 양상에서, 본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 제공된다.
본 발명의 제5 양상에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 세포 배양 배지에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 임의의 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 생산하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명의 다중특이적 항체 또는 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하고, 선택적으로 사용 설명서 및/또는 추가 치료 활성제를 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 대상체에게 본 발명의 다중특이적 항체 또는 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 대상체에게 본 발명의 다중특이적 항체 또는 단편 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명의 다중특이적 항체 또는 단편을 제조하는 방법에 따라 제조된 항체를 제공하는 단계 및 다중특이적 항체를 적어도 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 공동 제형화하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명의 다중특이적 항체의 생성 방법이 제공되며, 이 방법은 제1 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일특이적 항체를 선택하는 단계로서, 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프인, 선택하는 단계; 및 항체 또는 상기 제1 항체의 항원-결합 단편을 제2 에피토프를 표적으로 하는 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 재조합 다중특이적 항체를 생성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 더 추가의 양상에서, 의약품에서 사용하기 위한, 본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편, 또는 본 발명의 약제학적 조성물, 또는 본 발명의 키트가 제공된다. 또한 의약의 제조에서의 본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 용도가 제공된다.
도 1: 항-Vδ1Ab(REA173, 밀테니 바이오테크사(Miltenyi Biotec))로 직접 코팅된 항원의 ELISA 검출. Vδ1 도메인을 함유하는 항원을 사용한 것만 검출이 인지되었다. 류신 지퍼(LZ) 포맷은 세포-기반 유동 경쟁 검정(데이터 제시되지 않음)과 일치하는 Fc 포맷보다 더 강력한 것으로 보인다.
도 2: DV1 선택을 위한 다클론성 파지 DELFIA 데이터. (A) 이종이량체 선택: 라운드 1 및 2에서 이종이량체성 LZ TCR 포맷과, 두 라운드에서 이종이량체성 LZ TCR에 대한 선택해제. (B) 동종이량체 선택: 인간 IgG1 Fc에 대한 선택해제와 동종이량체성 Fc 융합 TCR을 사용하여 수행된 라운드 1, 이어서 이종이량체성 LZ TCR에 대한 선택해제와 이종이량체성 LZ TCR에 대한 라운드 2. 각각의 그래프는 상이한 라이브러리로부터의 선택을 나타내는 각각의 표적에 대한 2개의 막대를 함유한다.
도 3: IgG 포획: 좌측) 항-L1 IgG와 L1의 상호작용에 대한 센서그램, 우측) 이용 가능한 경우, 정상 상태 맞춤. 모든 실험은 MASS-2 기기에서 실온에서 수행되었다. 랭뮤어(Langmuir) 1:1 결합에 따른 정상 상태 맞춤.
도 4: 클론 1245_P01_E07, 1252_P01_C08, 1245_P02_G04, 1245_P01_B07 및 1251_P02_C05 (A) 또는 클론 1139_P01_E04, 1245_P02_F07, 1245_P01_G06 1245_P01_G09, 1138_P01_B09, 1251_P02_G10 및 1252_P01_C08 (B)에 대한 TCR 하향조절 검정의 결과.
도 5: 클론 1245_P01_E07, 1252_P01_C08, 1245_P02_G04, 1245_P01_B07 및 1251_P02_C05 (A) 또는 클론 1139_P01_E04, 1245_P02_F07, 1245_P01_G06, 1245_P01_G09, 1138_P01_B09 및 1251_P02_G10 (B)에 대한 T 세포 탈과립화(degranulation) 검정의 결과.
도 6: 클론 1245_P01_E07, 1252_P01_C08, 1245_P02_G04, 1245_P01_B07 및 1251_P02_C05 (A) 또는 클론 1139_P01_E04, 1245_P02_F07, 1245_P01_G06, 1245_P01_G09, 1138_P01_B09 및 1251_P02_G10 (B)에 대한 사멸 검정(THP-1 유동-기반 검정)의 결과.
도 7: 실시예 10의 실험 1 동안 총 세포 계수치. 샘플을 본 명세서에 기재된 다양한 농도의 항-Vδ1 항체와 함께 배양하고 비교 항체 또는 대조군과 함께 배양된 샘플과 비교하였다. 그래프는 (A) 제7일, (B) 제14일 및 (C) 제18일의 총 세포 계수치를 나타낸다.
도 8: 실시예 10의 실험 1 동안 Vδ1 T 세포의 분석. 그래프는 제18일에 샘플에서 (A) Vδ1 T 세포의 백분율, (B) Vδ1 T 세포 계수치 및 (C) Vδ1 배수 변화를 나타낸다.
도 9: 실시예 10의 실험 2 동안 총 세포 계수치. 샘플을 본 명세서에 기재된 다양한 농도의 항-Vδ1 항체와 함께 배양하고 비교 항체 또는 대조군과 함께 배양된 샘플과 비교하였다. 그래프는 (A) 제7일, (B) 제11일, (C) 제14일 및 (D) 제17일의 총 세포 계수치를 나타낸다.
도 10: 실시예 10의 실험 2 동안 Vδ1 T 세포의 분석. 그래프는 제17일에 샘플에서 (A) Vδ1 T 세포의 백분율, (B) Vδ1 T 세포 계수치 및 (C) Vδ1 배수 변화를 나타낸다.
도 11: 세포 조성물 분석. 샘플에 존재하는 세포 유형(비-Vδ1 세포 포함)을 실험 2의 제17일에 측정하였다. 세포를 수거하고 Vδ1, Vδ2 및 αβTCR의 표면 발현에 대해 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 백분율 값은 또한 표 7에 제공되어 있다.
도 12: SYTOX-유동 사멸 검정 결과. 세포 기능성을 SYTOX-유동 사멸 검정을 사용하여 시험하였고 결과는 (A) 세포를 10:1 효과기-대-표적(E:T) 비로 사용하여 제14일에 실험 1, 및 (B) 세포를 1:1 및 10:1 E:T 비로 사용하여 제17일(동결-해동 후)에 실험 2에 대해 제시된다.
도 13: 동결-해동 후 총 세포 계수치. 그래프는 동결 전에 B07, C08, E07, G04 또는 OKT-3 항체와 접촉된 배양물에 대해 동결-해동 후 세포 배양 7일 후에 총 세포 계수치를 나타낸다.
도 14: 세포 확장 모니터링. 총 세포 계수치를 동결-해동 후 배양된 세포에 대해 42일까지 모니터링하였다.
도 15: 변형된 항-Vδ1 항체에 대한 결합 동등성 연구.
도 16: 인간 생식계열 Vδ1 항원 및 이의 다형성 변이체에 대한 항-Vδ1 항체 결합 동등성 연구.
도 17: 항-Vδ1 항체는 Vδ1+ 세포 사이토카인 분비 수준의 증가를 부여하였다. 조직-유래 γδ T 세포를 제시된 바와 같은 항체와 함께 인큐베이션시켰다. (A) 관찰된 TNF-알파의 수준 (B) 관찰된 IFN-감마의 수준.
도 18: 항-Vδ1 항체는 Vδ1+ 세포 그랜자임 B 수준/활성의 증가를 부여하였다. 암 세포를 1:20 T:E 비 설정으로 조직-유래 γδ T 세포 및 제시된 바와 같은 항체와 함께 1시간 동안 공배양하였다. 결과는 공배양의 종료 시 암 세포에서 검출된 그랜자임 B의 양을 강조한다.
도 19: 항-Vδ1 항체는 인간 조직에서 면역 세포의 조절 및 증식을 부여하였다. 인간 피부 펀치-생검(5명의 상이한 공여자로부터 유래)을 제시된 바와 같은 항체와 함께 배양물에서 21일 동안 인큐베이션시켰다. (A) 생존 가능한 pan-γδ+ 세포의 수. (B) 생존 가능한 Vδ1+ 세포의 수. (C) 생존 가능한, 이중-양성 Vδ1+ CD25+ 세포의 백분율.
도 20: 항-Vδ1 항체는 인간 종양에서 종양-침윤-림프구(tumour-infiltrating-lymphocyte: TIL)의 조절 및 증식을 부여하였다. 신장 세포 암종(RCC) +/- 항체에 대한 연구. (A) TIL Vδ1+ 세포에서 배수 증가. (B) TIL Vδ1+ 세포의 총 수. (C) 예시적인 게이팅 전략. (D) TIL Vδ1+ 세포의 세포-표면 표현형 프로파일링 비교. (E) TIL Vδ1-음성 게이팅 분획의 분석.
도 21: 항-Vδ1 항체는 Vδ1+ 매개 세포독성 및 병든 세포-특이적 세포독성의 향상을 부여하였다. Vδ1+ 효과기 세포, THP-1 단핵구 암 세포 및 병들지 않은 건강한 1차 단핵구의 삼중배양물을 포함하는 모델 시스템에서 세포독성/효력-검정. (A) 항-Vδ1 mAb 또는 대조군의 존재 하에서 γδ T-세포를 포함하는 삼중 공배양물에서 THP-1 및 단핵구 세포 수의 정량화. (B) 병든 세포 특이적 사멸과 병들지 않은 건강한 세포 사이의 창을 강조하는 막대 차트 표현: 좌측 막대 차트; 병들지 않은 세포(1차 인간 단핵구)의 사멸 대비 병든 세포(THP-1)의 사멸에서의 배수 증가; 우측 막대 차트; 동일한 데이터지만 대조군 대비 향상된 사멸율로 표현됨 (C) THP-1 표적 세포 +/- mAb의 Vδ 1+ 효과기 세포 사멸의 효력에서 개선 백부율을 요약한 표로 작성된 결과. (D) 50% THP-1 세포 사멸을 부여하는 데 필요한 γδ T-세포 수로 표현된 도 (A)로부터 계산된 바와 같은 EC50 값의 표로 작성된 결과.
도 22: 다중특이적 항체는 Vδ1+ 효과기 세포 매개 세포독성의 향상을 부여하였다. 조직-중추적 질환 연관 항원의 표적화: (A 내지 D) Vδ1+ 효과기 세포와 A-431 암 세포 +/- 항-Vδ1 x 항-TAA(EGFr) 이중특이적 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 항체의 예시적인 공배양물, 여기서 (제1 표적에 대한) 항-Vδ1 VL+VH 결합 도메인은 (제2 표적에 대한) 항-EGFr 결합 모이어티의 CH1-CH2-CH3 도메인과 조합된다. (E 내지 H) Vδ1+ 효과기 세포와 A-431 암 세포 +/- 항-Vδ1 x 항-TAA(EGFr) 이중특이적 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 항체의 예시적인 공배양물, 여기서 (제1 표적에 대한) 항-Vδ1 결합 도메인은 그 다음 (제2 표적에 대한) 항-EGFr 세툭시맙(세툭시맙)-유래 scFv 결합 모이어티와 조합되는 전장 항체(VH-CH1-CH2-CH3/VL-CL)를 포함한다. (I 내지 J) 데이터를 표현하기 위한 대안적인 접근법: 성분 부분에 비해 EGFR+ 세포에 대한 Vδ1+ 효과기 세포 세포독성에 대한 다중특이적 항체에 의해 부여된 개선 백분율.
도 23: 다중-특이적 항체는 Vδ1+ 매개 세포독성 및 병든 세포-특이적 세포독성의 향상을 부여하였다. 조혈 질환 연관 항원의 표적화 (A) 50% Raji 세포 사멸을 유도하는 데 필요한 E:T 비 (B) Vδ1-CD19 다중-특이적 항체의 첨가로의 향상 백분율.
도 24: 항-Vδ1/CD19 이중특이적 항체는 모 단클론성 Vδ1 mAb와 대등한, 인간 Vδ1 및 cyno Vδ1에 대한 고 친화도 결합을 나타낸다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 Vδ1/CD19 이중특이체를 사용하여 수행하여 인간 Vδ1 및 CD19 항원에 대한 결합을 평가하였다. 이중특이적 항체는 두 항원에 대한 친화도에서 단지 약간의 감소로 인간 및 cyno Vδ1에 결합한다.
도 25: Vδ1-CD19 이중특이적 T 세포 관여자는 건강한 CD19+ B-세포를 보존하면서 CD19+ 표적 세포 세포독성 및 γδT-세포 활성화를 향상시킨다. (A) 유세포 분석법에 의해서 결정된 암성 NALM-6, Raji, B-세포 및 Vδ1 γδT-세포 상에서의 CD19의 발현. (B 내지 D) NALM-6 세포 (B), Raji 세포 (C) 및 B-세포 세포독성 (D)에 대한 항-Vδ1-CD19 BiTE의 효과. 항체를 12시간 동안 1:1 E:T 비의 존재 하에서 Vδ1 γδT-세포로 적정하였다. 살아있는 세포 백분율을 고함량 공초점 현미경으로 계산하고 Vδ1 γδT-세포의 부재 하에서의 살아있는 세포 계수치에 대해 정규화하였다. (E) (B), (C) 및 (D)에 제시된 바와 같이 Vδ1 BiTE 및 대조군의 존재 하에서 NALM-6, Raji 또는 B-세포 중 하나의 Vδ1 γδT-세포의 공배양 12시간 후 살아있는 세포의 백분율 수를 나타낸 막대 차트. (F 내지 G) 4시간 공배양 후 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같은 NALM-6 표적 세포 (F) 및 건강한 B-세포 (G)의 존재 하에서 Vδ1 TCR 표면 발현에 대한 Vδ1-CD19 BiTE의 효과. (H) 최고 농도(3㎍/㎖)에서 (F) 및 (G)에 제시된 바와 같은 최대 백분율 TCR 하향조절을 나타낸 막대 차트. (I 내지 J) 4시간 공배양 후 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같은 NALM-6 표적 세포 (I) 및 건강한 B-세포 (J)의 존재 하에서 Vδ1 세포 표면 상의 CD107a 상향조절에 대한 Vδ1-CD19 이중특이체의 효과. (K) B-세포 및 NALM-6 세포에서 CD107a 상향조절. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차를 나타내며 n=3을 나타낸다. 블리나투모맙(CD3-CD19 BiTE)을 모든 검정에서 대조군으로서 포함시켰다.
도 26: 이중특이적 포맷의 친화도 성숙된 Vδ1 클론은 Her2 + 표적 세포에 결합하고, Vδ1 γδT-세포에 대한 향상된 결합 및 Her2 + 표적 세포의 향상된 세포독성을 나타낸다. (A) 유방암 세포주 및 Vδ1 γδT 세포 (B) 상에서 Her2 및 Vδ1의 세포 표면 발현. (C 내지 E) Her2+(SK-BR-3 (C), BT-474 (D)), Her2-(MDA-MD-231 (E)) 및 Vδ1+ 세포 (F)에 대한 Vδ1-Her2 이중특이적 항체 및 Her2 mAb 대조군 (트라스투주맙)의 결합. (G 내지 I) Vδ1-Her2 이중특이적 항체의 존재 하에서 Vδ1 γδT-세포 및 SK-BR-3 세포 (G), BT-474 (H) 및 MDA-MB-231 세포 (I)와 1:1 E:T 비로 24시간 공배양한 후 남아 있는 살아있는 세포 백분율. (J) Vδ1 γδT-세포 Vδ1-Her2 이중특이적 항체의 24시간 후 세포독성 증가 백분율을 나타낸 막대 차트.
도 27: 항- Vδ1/EGFR 이중특이적 항체는 이들의 모 mAb와 대등한 인간 EGFR에 대한 높은 친화도 결합 및 인간 Vδ1-결합 친화도를 나타낸다. (A, B) Vδ1/EGFR 이중특이체를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석을 수행하여 인간 Vδ1 (A) 및 인간 EGFR 항원 (B)에 대한 결합을 평가하였다. 모 mAb, 세툭시맙 및 음성 대조군 mAb를 비교 목적으로 포함시켰다.
도 28: Vδ1/EGFR 이중특이적 항체는 EGFR+ A431 표적 세포 및 Vδ1 γδ T-세포에 결합한다. (A 내지 D) A431 세포주 및 1차 Vδ1 γδT-세포 상에서의 EGFR의 세포 표면 발현. (E,F) A431 세포주 또는 1차 Vδ1 γδ T-세포에 대한 항-Vδ1/EGFR 이중특이적 항체에 의한 결합 수준. 표적 세포를 다양한 농도의 항체로 염색한 후 형광 항-인간 IgG 검출 항체로 염색하였다. 모든 인큐베이션 단계를 4℃에서 수행하였고, 유세포 분석법을 사용하여 mAb 결합을 결정하여 형광의 중간 수준을 측정하였다. GraphPad Prism 9를 사용하여 대수 4개 매개변수 용량-반응 곡선을 피팅하였다.
도 29: Vδ1/EGFR 이중특이적 항체는 EGFR-특이적 T 세포 활성화 및 탈과립화를 유도하여 A431 표적 세포의 γδ T 세포 매개 세포독성을 증가시킨다.
(A) A431 세포의 존재 또는 부재 하에서 24시간 동안 이중특이적 항체와 함께 배양한 후 1차 Vδ1 γδ T-세포 상의 γδTCR의 세포 표면 발현. (B, C) 생존 가능한 A431 세포의 수 (B) 및 24시간 동안 다양한 농도의 항체와 함께 1:1 비로 공동 배양한 후 1차 Vδ1 γδ T-세포의 활성화 상태. CD25 항체를 사용하여 생존성 염료 및 활성화 상태에 의해 생존율을 측정하였다. (D) 4시간 동안 다양한 농도의 항체와 함께 1:1 비로 A431 세포와의 공배양 후 1차 Vδ1 γδ T-세포의 탈과립화. 공배양 시작 시 형광단-접합된 항-CD107α 항체를 세포-항체 혼합물에 직접 첨가하여 탈과립화를 결정하였다. (E) 10pM의 항체 및 다양한 양의 1차 Vδ1 γδ T-세포와 함께 24시간 공배양 후 살아있는 A431 세포의 수. (A 내지 E) 모든 경우에, 유세포 분석법을 사용하여 형광을 결정하여 형광의 중간 수준을 측정하였다. GraphPad Prism 9를 사용하여 대수 4개 매개변수 용량-반응 곡선을 피팅하였다. 데이터는 2개의 생물학적 반복물의 평균 ± SD로 표시된다.
도 30: CD3 하향조절. (A)는 mAb 표적 관여의 지표로서 항체 자극 시 vδ1 TCR MFI를 나타낸다. (B)는 양성으로 게이팅된 vδ1 세포에서 CD3 발현의 MFI를 도시한다. vδ1 항체로의 자극은 vδ1 세포와 맞물려 vδ1 세포에서 vδ1 및 CD3 둘 다의 하향 조절을 초래하였다.
도 31: Vδ1xFAPα 이중특이적 항체는 FAPα + 섬유아세포의 Vδ1 γδT-세포 활성화 및 용해를 향상시킨다. (A)는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정된 바와 같은 재조합 인간 Vδ1 및 FAPα에 대한 항-Vδ1, 항 FAPα 단클론성 및 항-Vδ1xFAPα 이중특이적 항체의 결합 동력학을 나타낸다. (B,C) FAPα+ 섬유아세포 (B) 및 Vδ1 γδT-세포 (C)에 대한 항-Vδ1 및 항 FAPα 항체의 결합.
(D,E) FAPα+ 섬유아세포의 부재 (D) 또는 존재 (E) 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1xFAPα 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. (F 내지 G) FAPα+ 섬유아세포의 부재 (F) 또는 존재 (G) 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 CD107a 상향조절에 대한 항-Vδ1xFAPα 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. (H) 24시간 공배양 후 Vδ1 γδT-세포에 의한 섬유아세포 용해에 대한 항-Vδ1xFAPα 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. 살아있는 세포 백분율을 고함량 공초점 현미경으로 계산하고 Vδ1 γδT-세포의 부재 하에서의 살아있는 세포 계수치에 대해 정규화하였다.
도 32: Vδ1xMSLN 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 활성화 및 MSLN + 표적 세포의 용해를 향상시킨다. (A) 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 결정된 바와 같은 재조합 인간 Vδ1 및 MSLN에 대한 항-Vδ1, 항-MSLN 단클론성 및 항-Vδ1xMSLN 이중특이적 항체의 결합 동력학. (B,C) MSLN+ HeLa 세포 (B) 및 Vδ1 γδT-세포 (C)에 대한 항-Vδ1 및 항-MSLN 항체의 결합. (D,E) MSLN+ OVCAR-3 세포의 부재 (D) 또는 존재 (E) 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1xMSLN 이중특이적 및 단클론성 항체의 효과. (F,G) MSLN+ OVCAR-3 세포의 부재 (F) 또는 존재 (G) 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 CD107a 상향조절에 대한 항-Vδ1xMSLN 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. (H) 24시간 공배양 후 Vδ1 γδT-세포에 의한 HeLa 세포 용해에 대한 항-Vδ1xMSLN 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. 살아있는 세포 백분율을 고함량 공초점 현미경으로 계산하고 Vδ1 γδT-세포의 부재 하에서의 살아있는 세포 계수치에 대해 정규화하였다.
도 33: Vδ1xPD-1 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포의 활성화를 향상시키고, PD-1 + T-세포의 관문 차단을 저해한다. A) 재조합 인간 Vδ1 및 PD-1에 결합하는 항-Vδ1, 항-PD-1, 항-RSVIgG 대조군x항-PD-1 및 항-Vδ1x항-PD-1 이중특이적 항체의 SPR 분석. B) SPR에 의해 결정된 바와 같은 재조합 인간 PD-1 및 Vδ1에 대한 항-Vδ1 및 항-PD-1 이중특이적 항체의 이중 결합. C) 항-CD3/항-CD28 dynabead로 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포 상의 PD-1의 발현. D) PD-1+ 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포 및 Vδ1 γδT-세포에 대한 항-Vδ1 및 항-PD-1 항체의 결합. E) PD-1+ CD4 T-세포의 부재 또는 존재 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. F) PD-1+ CD4 T-세포의 존재 또는 부재 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체의 EC50. G) PD-1+ T-세포 활성화에 대한 Vδ1 가교된 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체의 효과.
도 34: Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 및 4-1BB + T-세포의 활성화를 향상시킨다. A) 재조합 인간 Vδ1 및 4-1BB에 결합하는 항-Vδ1, 항-4-1BB, 항-RSVIgG 대조군x항-4-1BB 및 항-Vδ1x항-4-1BB 이중특이적 항체의 SPR 분석. B) SPR에 의해 결정된 바와 같은 재조합 인간 4-1BB 및 Vδ1에 대한 항-Vδ1 및 항-4-1BB 이중특이적 항체의 이중 결합. C) 항-CD3/항-CD28 dynabead로 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포 상의 4-1BB의 발현. D) 4-1BB+ 활성화된 CD8 T-세포 및 Vδ1 γδT-세포에 대한 항-Vδ1 및 항-4-1BB 항체의 결합. E 내지 F) 4-1BB+ CD8 T-세포의 부재(E) 또는 존재(F) 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. G) 4-1BB+ T-세포 활성화에 대한 Vδ1 가교된 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체의 효과.
도 35: Vδ1xOX40 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 및 OX40 + T-세포의 활성화를 향상시킨다. A) 재조합 인간 Vδ1 및 OX40에 결합하는 항-Vδ1, 항-OX40, 항-RSVIgG대조군x항-OX40 및 항-Vδ1x항-OX40 이중특이적 항체의 SPR 분석. B) SPR에 의해 결정된 바와 같은 재조합 인간 OX40 및 Vδ1에 대한 항-Vδ1 및 항-OX40 이중특이적 항체의 이중 결합. C) 항-CD3/항-CD28 dynabead로 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포 상의 OX40의 발현. D) OX40+ 활성화된 CD4 T-세포 및 Vδ1 γδT-세포에 대한 항-Vδ1 및 항-OX40 항체의 결합. E 내지 F) OX40+ CD4 T-세포의 부재(E) 또는 존재(F) 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. G) OX40+ T-세포 활성화에 대한 Vδ1 가교된 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체의 효과.
도 36: Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포의 활성화를 향상시키고, TIGIT + T-세포의 관문 차단을 저해한다. A) 재조합 인간 Vδ1 및 TIGIT에 결합하는 항-Vδ1, 항-TIGIT, 항-RSVIgG대조군x항-TIGIT 및 항-Vδ1x항-TIGIT 이중특이적 항체의 SPR 분석.　B) SPR에 의해 결정된 바와 같은 재조합 인간 TIGIT 및 Vδ1에 대한 항-Vδ1 및 항-TIGIT 이중특이적 항체의 이중 결합. C) 항-CD3/항-CD28 dynabead로 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포 상의 TIGIT의 발현. D) TIGIT+ 활성화된 CD4 및 CD8 T-세포 및 Vδ1 γδT-세포에 대한 항-Vδ1 및 항-TIGIT 항체의 결합. E) TIGIT+ CD8 T-세포의 부재 또는 존재 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체 및 단클론성 대조군의 효과. F) TIGIT+ CD8 T-세포의 존재 또는 부재 하에서 Vδ1 γδT-세포 상의 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체의 EC50. G) TIGIT+ T-세포 활성화에 대한 Vδ1 가교된 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체의 효과.
도 37: ADCC 리포터 생물검정은 항-vδ1 항체의 결과로 ADCC가 없음을 나타낸다. 표적 세포, 즉, γδ 세포를 항-vδ1 항체, 항-vδ1 LAGA 항체(Fc 손상) 및 RSV 아이소타입 대조군의 존재 하에서 ADCC 생물검정 효과기 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 발광 신호를 상대 광 단위(RLU)로 기록하였고, 배수 유도를 본 방법에 기재된 바와 같이 계산하였다. "항-vδ1 항체", "항-vδ1 LAGA 항체", "RSV", "OKT3"의 경우 N=2명의 γδ 공여자(기술적 반복물로 수행됨). "리툭시맙 + Raji" 조건의 경우 N=1개의 Raji 세포주(기술적 반복물) 및 "항-vδ1 항체 + 효과기" 및 "항-vδ1 LAGA 항체 + 효과기" 조건의 경우 n=1명의 γδ 공여자(각각 기술적 반복물 및 단일물에서 수행됨). 효과기:표적 비 3:1.
도 38: Vδ1-CD19 이중특이적 T 세포 관여자는 건강한 CD19+ B-세포를 보존하면서 CD19+ 표적 세포 세포독성 및 γδT-세포 활성화를 향상시킨다. A 내지 F) Raji 세포 또는 건강한 1차 B-세포의 γδ T-세포 또는 αβ T-세포 매개 용해에 대한 항-Vδ1xCD19 및 CD3xCD19 이중특이적 항체의 효과. 양성 Raji 또는 건강한 1차 B-세포 백분율을, Vδ1 γδT-세포와 Raji 세포 (A) 및 1차 건강한 B-세포 (B)의 삼중배양물; αβT-세포와 Raji 세포 (C) 및 1차 건강한 B-세포 (D)의 삼중배양물; 또는 Vδ1 γδT-세포 및 αβT-세포와, Raji 세포 (E) 및 1차 건강한 B-세포 (F)의 사중배양물에서 공초점 현미경에 의해 24시간에 결정하였다. G 내지 I) 항-Vδ1xCD19 및 CD3xCD19 이중특이적 항체에 의한 자극 24시간 후 γδT-세포 또는 αβ T-세포로부터의 IL-17A 분비의 정량화. Raji 세포, 1차 B-세포 및: γδT-세포 (G); 또는 αβ T-세포 (H); 또는 γδT-세포 및 αβ T-세포 (I)의 공배양물로부터 세포 배양 상청액을 수집하고, IL-17A 분비를 MSD에 의해 결정하였다. 점선은 가장 낮은 정량화 수준을 나타낸다.
본 발명은 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 쇄, 예를 들어, 가변 델타 1(Vδ1) 쇄 및 제2 항원을 표적으로 하는 다중특이적 항체의 새로운 부류를 제공한다. 제2 항원은, 예를 들어, 암 항원 또는 암-연관 항원(예컨대, TAA)일 수 있어서, 항체는 T-세포 관여자(TCE)라고 지칭될 수 있다. 대안적으로, 제2 항원은, 예를 들어, 면역조절 항원일 수 있어서, 항체는 이중 면역조절성 항체일 수 있다.
본 발명의 TCE는 선행 기술의 TCE에 비해서 몇몇 이점을 제공한다. 특히, TCE는 전체적으로 신규하고 구별되는 기전을 통해 T-세포 수용체 복합체를 표적화함으로써 선행 기술의 TCE와 연관된 도전 중 다수를 극복할 수 있다. 실제로, TRDV1 도메인의 에피토프에 대한 결합을 통해서만 T-세포 수용체 복합체를 특이적으로 표적화(활성화)함으로써 다음과 같은 많은 이점이 실현된다:
Figure pct00001
모든 T-세포가 아닌 T-세포의 하위세트만 관여함(예를 들어, 암 설정에서 T-reg의 관여는 바람직하지 않을 수 있음);
Figure pct00002
주로 '조직-상주'하고, 이의 존재가 암/종양 설정에서 양호한 예후와 종종 긍정적인 상관관계가 있는 T 세포의 하위세트(TRDV1+ T 세포)만 관여함;
Figure pct00003
TRDV1 맞물림을 통해 T-세포 수용체 복합체를 활성화하여 더 많은 선택성을 제공함(예를 들어, 이 결합 도메인의 친화도 증가). 예를 들어, CD3가 아닌 TRDV1 도메인을 통해서만 T-세포 수용체 복합체와 맞물리는 재조합 TCE를 개발함으로써, 증가된 친화도가 더 유리한 기능성을 유도할 수 있다. 예를 들어, 고-친화도 TRDV1-결합 TCE는 T 세포를 활성화할 수 있지만 소진하지는 않음; 및/또는
Figure pct00004
상기 신규한 수단 및 재조합 TRDV1 결합 도메인을 통해 TCE 복합체와 맞물리는 것은 덜 유해한 효과를 야기할 수 있고, 따라서 상기 TCE 모이어티에서 Fc 기능성을 약화시킬 필요성을 감소시킬 수 있다. 그 다음 이것은, 예를 들어, TRDV1 TCE가 하나의 결합 도메인을 통해 TRDV1+ 세포와 맞물리고, 제2 결합 아암에 의해 제2 세포 유형(예컨대, 암 세포)과 맞물리고, 기능하는 Fc 도메인을 통해서 다른 효과기 세포, 예컨대, CD16+ 또는 CD32+ 또는 CD64+ 면역 세포와 맞물리게 함으로써 추가적인 선택성을 제공할 수 있다.
따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 발견을 통해, 본 발명자들은 새로운 부류의 재조합 TCE를 생성시켰다. 구체적으로, 본 발명자들은 상기 T-세포 수용체 신호전달 복합체에서 다른 도메인보다는 TRDV1 도메인을 통해 T-세포 수용체와 맞물리는 새로운 부류의 TCE를 발견하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 TRDV1 상의 활성화 에피토프를 통해 이 복합체와 맞물리고, 고-친화도 T-세포 수용체 복합체 맞물림과 관련하여 이전에 보고된 유해한 효과 중 일부를 잠재적으로 부여하지 않으면서 더 높은 친화도로 결합될 수 있는 새로운 부류의 TCE를 발견하였다. 또한 이 새로운 부류의 TCE는 야생형 Fc 기능도 허용할 수 있는 이러한 방식에 관여할 수 있으므로 추가 효능 잠재력도 제공할 수 있다.
본 발명의 DI는 완전히 고유한 이중 면역조절 표적 맞물림의 완전히 신규한 방법을 제공하여, 암과 같이 면역조절을 필요로 하는 매우 다양한 신규 요법을 제공한다. 본 발명의 DI 플랫폼은 기존 DI 접근법에 대한 중요한 대안 또는 개선점을 제공할 수 있는 새로운 부류의 치료법을 제공한다. 이전에는 본 명세서에 기재된 바와 같은 TRDV1-특이적 결합 기능이 DI 포맷으로 통합될 수 있다는 것이 고려되지 않았다.
본 발명의 다중특이적 항체는 또한 동등한 단일특이적 항체와 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다중특이적 항체는 또한 다중특이적 항체의 성분 부분과 동일한 항원 결합 도메인을 갖는 단일특이적 항체와 비교하여 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 재조합 다중특이적 항체는 동등한 양의 상기 제1 단일특이적 항체에 의해 부여되는 세포독성과 비교하여 제2 에피토프를 발현하는 병든 세포에 대해 증가된 감마 델타 T-세포 매개 세포독성을 부여한다. 본 발명의 다중특이적 항체는 또한 건강한 세포는 여전히 보존하면서 병든 세포에 대해 개선된 세포독성을 나타낼 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 아래에 주어진 의미를 갖는다.
감마 델타(γδ) T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 정의하는 별개의 표면 상에서 발현하는 T 세포의 작은 하위세트를 나타낸다. 이 TCR은 1개의 감마(γ) 및 1개의 델타(δ) 쇄로 구성된다. 각각의 쇄는 가변(V) 영역, 불변(C) 영역, 막관통 영역 및 세포질 꼬리를 함유한다. V 영역은 항원 결합 부위를 함유한다. 인간 γδ T 세포의 2가지 주요 하위 유형이 존재한다: 하나는 말초 혈액에서 우세한 것이고 다른 하나는 비-조혈 조직에서 우세한 것이다. 2가지 하위 유형은 세포 상에 존재하는 δ 및/또는 γ 유형에 의해 정의될 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액에서 우세한 γδ T 세포는 주로 델타 가변 2 쇄(Vδ2)를 발현한다. 비-조혈 조직에서 우세한(즉, 조직-상주하는) γδ T 세포는 주로 델타 가변 1 쇄를 발현한다. "Vδ1 T 세포" 또는 "Vδ1+ T 세포"에 대한 언급은 Vδ1 쇄가 있는 γδ T 세포, 즉, Vδ1+ 세포를 지칭한다.
"델타 가변 1"에 대한 언급은 또한 Vδ1 또는 Vd1로도 지칭될 수 있는 반면, 이 영역을 함유하는 TCR 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 "TRDV1"로 지칭될 수 있다. γδ TCR의 Vδ1 쇄와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편은 Vδ1에 결합하는 모두 효과적인 항체 또는 이의 단편이며 "항-TCR 델타 가변 1 항체 또는 이의 단편" 또는 "항-Vδ1 항체 또는 이의 단편"또는 "항-TRDV1 항체 또는 이의 단편" 또는 "항-TRDV1 항체 또는 이의 단편"으로 지칭될 수 있다.
"델타 가변 2" 쇄와 같은 다른 쇄에 대한 추가의 참조가 본 명세서에서 이루어진다. 이들은 유사한 방식으로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 델타 가변 2 쇄는 Vδ2로 지칭될 수 있는 반면, 이 영역을 함유하는 TCR 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드는 "TRDV2"로 지칭될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 γδ TCR의 Vδ1 쇄와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편은 Vδ2와 같은 다른 델타 쇄와 상호작용하지 않는다. 본 발명에서, 항체는 TRDV1에 특이적이고, TRDV2(서열번호 174) 또는 다른 항원, 예컨대, TRDV3(서열번호 175)에 결합하지 않는다.
'감마 가변 쇄'에 대한 언급이 또한 본 명세서에서 이루어진다. 이들은 γ-쇄 또는 Vγ로 지칭될 수 있는 반면, 이 영역을 함유하는 TCR 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 이 영역을 포함하는 TCR 단백질 복합체는 TRGV로 지칭될 수 있다. 예를 들어, TRGV4는 Vγ4 쇄를 지칭한다. 바람직한 실시형태에서, γδ TCR의 Vδ1 쇄와 상호작용하는 항체 또는 이의 단편은 Vγ4(TRGV4, 서열번호 173)와 같은 감마 쇄와 상호작용하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 또한 γδ TCR, 예컨대, TRDJ, TRDC, TRGJ 또는 TRGC 내에서 발견되는 다른 도메인에 결합하지 않거나 상호작용하지 않는다.
용어 "T-세포 수용체 복합체"는 다양한 항원을 인식하는 책임이 있는 T-세포의 표면 상에서 발견되는 "T-세포 수용체"(또는 "TCR")를 포함하는 단백질의 복합체이다. 세포 수용체 복합체는 T-세포 수용체의 알파 쇄 및 베타 쇄를 포함하거나, 감마 델타 T 세포의 경우, T-세포 수용체의 감마 쇄 및 델타 쇄 및 최대 6개의 추가 쇄 또는 그 초과, 예컨대, CD3δ, CD3γ, CD3ε 및 CD3ζ를 포함하지만, T-세포 수용체 복합체의 정확한 구성은 달라질 수 있다. T-세포 수용체는 T-세포에서 세포내 신호전달을 매개하는데, 이것은 T-세포 활성화로 이어질 수 있다.
용어 "항체"는 적어도 하나의 항원 결합 부위(ABS)를 포함하는 적어도 하나의 항체 가변 도메인을 포함하는 임의의 항체 단백질 작제물을 포함한다. 항체는 유형 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM(뿐만 아니라 이의 하위유형)의 면역글로불린을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 2개의 동일한 중쇄(H) 및 2개의 동일한 경쇄(L) 폴리펩타이드로부터 조립된 면역글로불린 G(IgG) 항체의 전반적인 구조는 포유동물에서 잘 확립되고 고도로 보존된다(Padlan (1994) Mol. Immunol. 31:169-217).
통상적인 항체 또는 면역글로불린(Ig)은 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 단백질이다: 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L). 각각의 쇄는 불변 영역 및 가변 도메인으로 나뉜다. 중쇄(H) 가변 도메인은 본 명세서에서 VH로 약칭되고, 경쇄(L) 가변 도메인은 본 명세서에서 VL로 약칭된다. 이들 도메인, 이와 관련된 도메인 및 이들로부터 유래된 도메인은 본 명세서에서 면역글로불린 쇄 가변 도메인으로 지칭될 수 있다. VH 도메인 및 VL 도메인(또한 VH 및 VL 영역으로도 지칭됨)은 "프레임워크 영역"("FR")이라고 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 "상보성 결정 영역"("CDR")이라고 불리는 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 프레임워크 및 상보성 결정 영역은 정확하게 정의되어 있다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition U.S. Department of Health and Human Services, (1991) NIH Publication Number 91-3242). 또한 예를 들어, 문헌[Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883]에 제시된 것 또는 IMGT.org에 요약된 것과 같은 CDR 서열에 대한 대안적인 넘버링 규칙이 있다. 통상적인 항체에서, 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 2개의 면역글로불린 중쇄 및 2개의 면역글로불린 경쇄의 통상적인 항체 사량체는, 예를 들어, 이황화물 결합에 의해 상호연결된 중쇄 및 면역글로불린 경쇄, 및 유사하게 연결된 중쇄로 형성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인은 항원과 상호작용하는 결합 도메인이다. 항체의 불변 영역은 전형적으로 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 항체의 단편("항체 단편", "면역글로불린 단편", "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"로도 지칭될 수 있음)은 표적에 특이적으로 결합하는 항체의 부분(또는 상기 부분을 함유하는 작제물)인 γδ T 세포 수용체의 델타 가변 1(Vδ1) 쇄(예를 들어, 하나 이상의 면역글로불린 쇄가 전장은 아니지만, 표적에 특이적으로 결합하는 분자)를 지칭한다. 용어 항체 단편 내에 포함되는 결합 단편의 예는 다음을 포함한다:
(i) Fab 단편(VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편);
(ii) F(ab')2 단편(힌지 영역에서 이황화물 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편으로 이루어진 2가 단편);
(iii) Fd 단편(VH 및 CH1 도메인으로 이루어짐);
(iv) Fv 단편(항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어짐);
(v) 단일 쇄 가변 단편, scFv(재조합 방법을 사용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로 만들어질 수 있도록 하는 합성 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 도메인으로 이루어짐);
(vi) VH(VH 도메인으로 이루어진 면역글로불린 쇄 가변 도메인);
(vii) VL(VL 도메인으로 이루어진 면역글로불린 쇄 가변 도메인);
(viii) 도메인 항체(dAb, VH 또는 VL 도메인으로 이루어짐);
(ix) 미니바디(CH3 도메인을 통해 연결된 한 쌍의 scFv 단편으로 이루어짐); 및
(x) 다이아바디(작은 펩타이드 링커에 의해 연결된 하나의 항체로부터의 VH 도메인 또 다른 항체로부터의 VL 도메인으로 이루어진 scFv 단편의 비공유 이량체로 이루어짐).
본 명세서에서 지칭되는 다중특이적 항체의 단편은 항원-결합 단편이다. 보다 구체적으로, 다중특이적 항체의 항체 단편은 전체 다중특이적 항체에 의해서 결합된 바와 같은 동일한 항체에 결합한다. 예를 들어, TRDV1 및 제2 항원에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체의 단편은 또한 TRDV1 및 동일한 제2 항원에 특이적으로 결합한다.
"인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 상기 인간 항체가 투여된 인간 대상체는 상기 항체 내에 함유된 1차 아미노산에 대한 종간 항체 반응(예를 들어, HAMA 반응이라고 불림 - 인간-항-마우스 항체)을 생성하지 않는다. 상기 인간 항체는, 예를 들어, CDR 및 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 도입되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성 또는 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 이 용어는 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다. 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체와 같이, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 인간 항체는 또한 "재조합 인간 항체"로 지칭될 수 있다.
비-인간 면역글로불린 가변 도메인의 프레임워크 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 인간 가변 도메인의 상응하는 잔기로 치환하는 것은 "인간화"로 지칭된다. 가변 도메인의 인간화는 인간에서 면역원성을 감소시킬 수 있다.
"특이성"은 특정 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 다수의 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정기를 지칭한다. 항체의 특이성은 특정 항원을 고유한 분자 개체로 인식하고 또 다른 항원과 구별하는 항체의 능력이다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 당업계에서 널리 이해되는 용어이다. 분자는 대체 표적보다 특정 표적 항원 또는 에피토프와 더 큰 지속기간 및/또는 더 큰 친화도로 더 빈번하고 더 빠르게 반응하는 경우 "특이적 결합"을 나타낸다고 한다. 항체가 다른 물질과 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력, 더 빠르게 및/또는 더 큰 지속기간으로 결합하는 경우 항체는 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다".
본 발명의 항체는 다중특이적 항체이다. "다중특이적 항체"는 복수의 상이한 에피토프에 동시에 또는 순차적으로 결합할 수 있는 항체이다. 일반적으로, 에피토프는 동일한 항원 상에 존재하지 않을 것이다. 따라서 다중특이적 항체는 복수의 상이한 결합 도메인을 통해 상이한 항원 상에 존재하는 에피토프에 선택적으로 결합하는 능력을 갖는다. 이는 이 능력이 없는 기존의 단일-특이적 항체와 대조된다. 오히려 "단일특이적 항체"는 하나의 항원에 대해 다수의 결합 부위를 가질 수 있지만 이것은 하나의 항원에 대해 특이적인 결합만을 갖는다(예를 들어, 전체 인간 IgG 항체의 원자가는 2이고 다른 항체의 원자가는 더 높을 수 있지만, 항체가 하나의 항원만 인식하는 경우 여전히 단일특이적 항체로 분류된다). 따라서, 본 발명의 다중특이적 항체는 다수의 상이한 항원에 동시에 및/또는 순차적으로 결합한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. "이중특이적 항체"는 2개의 상이한 에피토프에 동시에 그리고/또는 순차적으로 결합할 수 있는 항체이다. 일반적으로, 에피토프는 동일한 항원 상에 존재하지 않을 것이다. 따라서 이중특이적 항체는 2개의 상이한 결합 도메인을 통해 2개의 상이한 항원 상에 존재하는 2개의 상이한 에피토프에 선택적으로 결합하는 능력을 갖는다. 이는 이 능력이 없는 기존의 단일-특이적 항체와 대조된다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원에 동시에 및/또는 순차적으로 결합한다.
항원과 항원-결합 폴리펩타이드의 해리에 대한 평형 상수로 나타내는 "친화도"(KD)는 항원 결정기와 항체(또는 이의 단편) 상의 항원-결합 부위 사이의 결합 강도의 척도이고: KD 값이 더 작을수록, 항원 결정기와 항원-결합 폴리펩타이드 사이의 결합 강도는 더 커진다. 대안적으로, 친화도는 또한 1/KD인 친화도 상수(KA)로 표현될 수 있다. 친화도는 특정 관심 항원에 따라 알려진 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, KD는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
10-6 미만의 임의의 KD 값은 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 항원 또는 항원 결정기에 대한 항체, 또는 이의 단편의 특이적 결합은, 예를 들어, 스캐차드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정, 예컨대, 방사선면역 검정(RIA), 효소 면역검정(EIA) 및 샌드위치 경쟁 검정, 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라스몬 공명, 또는 분광법(예를 들어, 형광 검정 사용) 및 당업계에 알려진 이의 상이한 변형을 포함하는 임의의 적합한 알려진 방식으로 결정될 수 있다.
"결합활성"은 항체, 또는 이의 단편, 및 관련 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합활성은 항원 결정기 및 항체 상의 항원 결합 부위 사이의 친화도 및 항체 상에 존재하는 관련 결합 부위의 수 모두와 관련이 있다.
"동일계"는 또 다른 위치로 이동하는 대신 자연 또는 본래 위치를 의미한다. 예를 들어, 환자에서 동일계 Vδ1+ 세포는 시험관내 또는 생체외 세포와 반대로 생체내 vδ1 세포를 지칭한다.
"인간 조직 Vδ1+ 세포," 및 "조혈 및 혈액 Vδ1+ 세포" 및 "종양 침윤 림프구(TIL) Vδ1+ 세포"는 각각 인간 조직 또는 조혈 혈액계 또는 인간 종양에 함유되거나 또는 이로부터 유래된 Vδ1+ 세포로 정의된다. 모든 상기 세포 유형은 이들의 (i) 위치 또는 유래된 곳 및 (ii) Vδ1+ TCR의 발현에 의해 식별될 수 있다.
"조절 항체"는 항체가 결합하는 표적을 발현하는 세포와 접촉 또는 결합 시, 세포 주기, 및/또는 세포 수 및/또는 세포 생존력 및/또는 하나 이상의 세포 표면 마커 및/또는 하나 이상의 분비 분자(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 류코트리엔 등)의 분비, 및/또는 기능(예컨대, 표적 세포 또는 병든 세포에 대한 세포 독성)에서 측정 가능한 변화를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 측정 가능한 변화를 부여하는 항체이다. 세포, 또는 이의 집단을 "조절하는" 방법은 적어도 하나의 측정 가능한 변화에서 상기 세포 또는 세포들에서 또는 이로부터의 분비를 촉발시켜 하나 이상의 "조절된 세포"를 생성하는 방법을 지칭한다.
"면역 반응"은 조절 항체의 첨가 시 면역계(세포-매개 반응, 호르몬 반응, 사이토카인 반응, 케모카인 반응을 포함하지만 이들로 제한되지 않음)의 적어도 하나 세포, 또는 하나의 세포-유형, 또는 하나의 내분비 경로, 또는 하나의 외분비 경로에서 측정 가능한 변화이다.
"면역 세포"는 CD34+ 세포, B-세포, CD45+(림프구 공통 항원) 세포, 알파-베타 T-세포, 세포독성 T-세포, 헬퍼 T-세포, 형질 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포, 적혈구, 혈소판, 수지상 세포, 식세포, 과립구, 선천성 림프구 세포, 천연 살해(NK) 세포 및 감마 델타 T-세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 면역계의 세포로 정의된다. 전형적으로, 면역 세포는 면역 세포를 하위 집단으로 구별하기 위해 식별하거나 또는 그룹화 또는 클러스터화하기 위해 조합 세포 표면 분자 분석의 도움으로(예를 들어, 유세포 분석법을 통해) 분류된다. 그런 다음 이들은 여전히 추가 분석에 따라 추가로 세분될 수 있다. 예를 들어, CD45+ 림프구는 vδ 양성 집단 및 vδ 음성 집단으로 추가로 세분될 수 있다.
"모델 시스템"은 항체 또는 이의 단편과 같은 의약품이 질환의 징후 또는 증상을 개선하는 데 의약으로서 기능할 수 있는 방법에 대한 이해를 돕기 위해 설계된 생물학적 모델 또는 생물학적 표현이다. 이러한 모델은 전형적으로 시험관내, 생체외, 및 생체내 병든 세포, 병들지 않은 세포, 건강한 세포, 효과기 세포, 조직 등의 사용을 포함하고, 여기서 상기 의약의 성능이 연구되고 비교된다.
"병든 세포"는 암과 같은 질환, 바이러스 감염과 같은 감염, 또는 염증성 병태 또는 염증성 질환의 진행과 연관된 표현형을 나타낸다. 예를 들어, 병든 세포는 종양 세포, 자가면역 조직 세포 또는 바이러스 감염된 세포일 수 있다. 따라서 상기 병든 세포는 종양성, 또는 바이러스 감염성, 또는 염증성으로 정의될 수 있다.
"건강한 세포"는 병들지 않은 정상 세포를 지칭한다. 이들은 또한 "정상" 또는 "병들지 않은" 세포로 지칭될 수 있다. 병들지 않은 세포는 비-암성, 또는 비-감염성, 또는 비-전염성 세포를 포함한다. 상기 세포는 종종 의약에 의해 부여된 병든 세포 특이성을 결정하고/하거나 약제의 치료 지수를 더 잘 이해하기 위해 관련 병든 세포와 함께 이용된다.
"병든 세포-특이성"은 효과기 세포 또는 이의 집단, (예컨대, 예를 들어, Vδ1+ 세포의 집단)이 병들지 않은 또는 건강한 세포를 보존하면서, 암 세포와 같은 병든 세포를 구별하고 사멸시키는 데 얼마나 효과적인지에 대한 척도이다. 이 잠재력은 모델 시스템에서 측정될 수 있고 병들지 않은 또는 건강한 세포를 사멸시키거나 또는 용해시키는 상기 효과기 세포/세포들의 잠재력에 비해 병든 세포를 선택적으로 사멸시키거나 또는 용해시키는 효과기 세포, 또는 효과기 세포 집단의 성향을 비교하는 것을 수반할 수 있다. 상기 병든 세포-특이성은 의약의 잠재적인 치료 지수를 알릴 수 있다.
"향상된 병든 세포 특이성"은 병든 세포를 특이적으로 사멸시키는 능력을 추가로 증가시키도록 조절된, 예를 들어, Vδ1+ 세포와 같은 효과기 세포, 또는 이의 집단의 표현형을 기재한다. 이 향상은 병든 세포 사멸 특이성 또는 선택성에서 배수 변화, 또는 백분율 증가를 포함하는 다양한 방식으로 측정될 수 있다.
"ADCC" 또는 "항체-의존성 세포-매개 세포독성"은 세포의 표면 항원에 결합된 항체로 코팅된 세포에 대한 면역 반응을 설명한다. 그것은 세포-매개 과정인데, 이에 의해서 면역 효과기 세포(예컨대, NK 세포)는 세포 결합된 항체를 인식하여, 표적 세포의 탈과립화 및 용해를 촉발한다. 전형적으로, 이것은 Fc-Fcγ 상호작용을 통해서 매개된다. 세포-결합된 항체의 Fc 영역은 Fcγ 수용체를 발현하는 효과기 세포(예를 들어, NK 세포)를 동원하여, 효과기 세포 탈과립화 및 표적 세포의 사멸을 유발한다.
"Fc 무손상(enabled)"은 돌연변이 또는 다른 것에 의해서 손상(disabled)되지 않은 기능성 Fc 영역(단편 결정화 가능한 영역), 즉, Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 무손상 항체는 약화되지 않은 Fc 기능을 나타낸다. Fc 무손상 항체는 하나 이상의 Fc 감마 수용체에 대한 결합을 감소시키도록 변형되거나 조작되거나 작제되지 않은 IMGT에 의해 열거된 인간 IGHC 중쇄 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, IGHC 힌지 돌연변이를 통해 또는 IgG1/IgG2A 또는 IgG1/IgG4 IGHC 서열에 대해 키메라 또는 혼성체인 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체의 작제를 통해. 적합하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 단편(즉, 폴리펩타이드)은 단리된다. "단리된" 폴리펩타이드는 원래 환경에서 제거된 것이다. 용어 "단리된"은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Vδ1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체, 또는 이의 단편은 Vδ1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 용어 "단리된"은 또한 단리된 항체가 약제학적 조성물의 활성 성분으로 제형화될 때 치료적으로 투여하기에 충분히 순수하거나, 또는 적어도 70 내지 80%(w/w) 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 80 내지 90%(w/w) 순수하고, 보다 바람직하게는, 90 내지 95% 순수하고; 가장 바람직하게는, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(w/w) 순수한 제제를 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오타이드는 단리된다. "단리된" 폴리뉴클레오타이드는 원래 환경에서 제거된 것이다. 예를 들어, 자연-발생 폴리뉴클레오타이드는 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리되는 경우 단리된다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 자연 환경의 일부가 아닌 벡터로 클로닝되거나 또는 cDNA 내에 포함되는 경우 단리되는 것으로 간주된다.
항체 또는 이의 단편은 자연 발생 대립유전자 변이체, 뿐만 아니라 돌연변이체 또는 임의의 다른 비자연 발생 변이체를 또한 포함하는 "기능적 활성 변이체"일 수 있다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 대립유전자 변이체는 본질적으로 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실, 또는 부가를 갖는 것을 특징으로 하는 (폴리)펩타이드의 대체 형태이다. 비제한적인 예로서, 상기 기능적으로 활성 변 이체는 CDR을 함유하는 프레임워크가 변형되거나, CDR 자체가 변형되거나, 상기 CDR이 대체 프레임워크에 이식되거나, 또는 N- 또는 C-말단 연장이 혼입될 때 여전히 기능할 수 있다. 또한, CDR 함유 결합 도메인은 또 다른 항체와 공유되는 것과 같은 상이한 파트너 쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 소위 '공통' 경쇄 또는 '공통' 중쇄와 공유할 때, 상기 결합 도메인은 여전히 기능할 수 있다. 또한, 상기 결합 도메인은 다량체화될 때 기능할 수 있다. 또한, '항체 또는 이의 단편'은 또한 VH 또는 VL 또는 불변 도메인이 상이한 표준 서열(예를 들어, IMGT.org에 열거됨)에서 떨어지거나 또는 향하여 변형되어 여전히 기능하는 기능적 변이체를 포함할 수 있다.
2개의 밀접하게 관련된 폴리펩타이드 서열을 비교하려는 목적으로, 제1 폴리펩타이드 서열 및 제2 폴리펩타이드 서열 사이의 "% 서열 동일성"은 폴리펩타이드 서열에 대한 표준 설정(BLASTP)을 사용한 NCBI BLAST v2.0을 사용하여 계산될 수 있다. 2개의 밀접하게 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 비교하려는 목적으로, 제1 뉴클레오타이드 서열 및 제2 뉴클레오타이드 서열 사이의 "% 서열 동일성"은 뉴클레오타이드 서열에 대한 표준 설정(BLASTN)을 사용한 NCBI BLAST v2.0을 사용하여 계산될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 이들이 전체 길이에 걸쳐 100% 서열 동일성을 공유하는 경우, 다른 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 같거나 또는 "동일한" 것이라고 한다. 서열에서 잔기는 좌측에서 우측으로, 즉, 폴리펩타이드의 경우 N-말단에서 C-말단으로; 폴리뉴클레오타이드의 경우 5' 말단에서 3' 말단으로 넘버링된다.
일부 실시형태에서, 서열의 임의의 명시된 % 서열 동일성은 항체의 6개 CDR 모두의 서열 없이 계산된다. 예를 들어, 항-Vδ1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 명시된 가변 중쇄 영역 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 갖는 가변 중쇄 영역 서열 및/또는 명시된 가변 경쇄 영역 서열에 대해 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 가변 경쇄 영역 서열을 포함할 수 있고, 임의의 아미노산 변경은 가변 중쇄 영역 서열 및 경쇄 영역 서열의 프레임워크 영역에서만 일어난다. 이러한 실시형태에서, 항-Vδ1 항체 또는 특정 서열 동일성을 갖는 이의 항원-결합 단편은 상응하는 항-Vδ1 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 완전한 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 보유한다.
서열 사이의 "차이"는 제1 서열에 비해, 제2 서열의 위치에서 단일 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 지칭한다. 2개의 폴리펩타이드 서열은 1, 2개 또는 그 이상의 이러한 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 달리 제1 서열과 동일한(100% 서열 동일성) 제2 서열에서 삽입, 결실 또는 치환은 감소된 % 서열 동일성을 초래한다. 예를 들어, 동일한 서열이 9개 아미노산 잔기 길이이면, 제2 서열에서 하나의 치환은 88.9%의 서열 동일성을 초래한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열이 9개 아미노산 잔기 길이이고 6개의 동일한 잔기를 공유하는 경우, 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 66% 초과의 동일성을 공유한다(제1 및 제2 폴리펩타이드 서열은 66.7% 동일성을 공유한다).
대안적으로, 제1 참조 폴리펩타이드 서열을 제2 비교 폴리펩타이드 서열과 비교하려는 목적으로, 제2 서열을 생성하기 위해 제1 서열에 이루어진 부가, 치환 및/또는 결실의 수가 확인될 수 있다. "부가"는 하나의 아미노산 잔 기가 제1 폴리펩타이드의 서열에 첨가된 것(제1 폴리펩타이드의 어느 한 쪽 말단에서 첨가 포함)이다. "치환"은 제1 폴리펩타이드의 서열에서 하나의 아미노산 잔기를 하나의 상이한 아미노산 잔기로 치환하는 것이다. 상기 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. "결실"은 제1 폴리펩타이드의 서열에서 하나의 아미노산 잔기의 결실(제1 폴리펩타이드의 어느 한 쪽 말단에서 결실 포함)이다.
3개의 문자 및 1개의 문자 코드를 사용하여 자연 발생 아미노산은 다음과 같이 언급될 수 있다: 글리신(G 또는 Gly), 알라닌(A 또는 Ala), 발린(V 또는 Val), 류신(L 또는 Leu), 아이소류신(I 또는 Ile), 프롤린(P 또는 Pro), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 티로신(Y 또는 Tyr), 트립토판(W 또는 Trp), 라이신(K 또는 Lys), 아르기닌(R 또는 Arg), 히스티딘(H 또는 His), 아스파트산(D 또는 Asp), 글루탐산(E 또는 Glu), 아스파라긴(N 또는 Asn), 글루타민(Q 또는 Gln), 시스테인(C 또는 Cys), 메티오닌(M 또는 Met), 세린(S 또는 Ser) 및 트레오닌(T 또는 Thr). 잔기가 아스파트산 또는 아스파라긴일 수 있는 경우, 기호 Asx 또는 B를 사용할 수 있다. 잔기가 글루탐산 또는 글루타민인 경우 기호 Glx 또는 Z를 사용할 수 있다. 잔기가 임의의 아미노산일 수 있는 경우 기호 Xaa 또는 X를 사용할 수 있다. 아스파트산에 대한 언급은 아스파르트산염을 포함하고, 글루탐산은 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 글루타메이트를 포함한다.
"보존적" 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되고 폴리펩타이드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 예상되는 아미노산 치환이다. 이러한 보존적 치환은 적합하게는 하기 그룹 내의 하나의 아미노산이 동일한 그룹 내의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다:
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적합하게는, 소수성 아미노산 잔기는 비극성 아미노산이다. 보다 적합하게는, 소수성 아미노산 잔기는 V, I, L, M, F, W 또는 C로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 소수성 아미노산 잔기는 글리신 알라닌, 발린, 메티오닌, 류신, 아이소류신, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드 서열의 넘버링 및 CDR 및 FR의 정의는 내용에 제시된 바와 같이 EU 및/또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된 바와 같다. 제1 폴리펩타이드 서열과 제2 폴리펩타이드 서열 사이의 "상응하는" 아미노산 잔기는 제2 서열의 아미노산 잔기와 내용에 제시된 바와 같은 EU 및/또는 IMGT 넘버링 시스템에 따라 동일한 위치를 공유하는 제1 서열 친화도의 아미노산 잔기이지만, 제2 서열의 아미노산 잔기는 제1 서열과 동일성이 상이할 수 있다. 적합하게는 상응하는 잔기는 프레임워크 및 CDR이 EU 및/또는 IMGT 정의에 따라 동일한 길이인 경우 동일한 숫자(및 문자)를 공유할 것이다. 정렬은 수동으로 또는, 예를 들어, 표준 설정을 사용한 NCBI BLAST v2.0(BLASTP 또는 BLASTN)과 같은 서열 정렬을 위한 알려진 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
본 명세서에서 "에피토프"에 대한 언급은 항체 또는 이의 단편에 의해 특이적으로 결합되는 표적의 부분을 지칭한다. 에피토프는 또한 "항원 결정기"로 지칭될 수 있다. 항체는 동일하거나 또는 입체적으로 중첩된 에피토프를 둘 다 인식하는 경우 또 다른 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 2개의 항체가 동일하거나 또는 중첩된 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 경쟁 검정이며, 이는 표지된 항원 또는 표지된 항체를 사용하여 다수의 상이한 포맷(예를 들어, 방사성 또는 효소 표지를 사용한 웰 플레이트 또는 항원-발현 세포에 대한 유세포 분석법)으로 구성될 수 있다. 항체는 이들 모두가 동일한 에피토프를 인식하는 경우 또 다른 항체와 "동일한 에피토프"에 결합한다(즉, 항원과 항체 사이의 모든 접촉점이 동일함). 예를 들어, 항체는 항원의 명시된 영역 전체의 모든 접촉점이 특징규명 방법, 예컨대, 항체/항원 가교 커플링 MS, HDX, X선 결정학, cryo-EM 또는 돌연변이생성의 도움으로 동일한 경우 또 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
추가로, 이러한 특징규명 방법의 도움으로, 동일한 접촉점 모두는 아니지만 일부를 인식함으로써 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 특징규명하는 것이 또한 가능하다. 특히, 이러한 항체는 광범위하게 동등한 기술적 효과 및/또는 동등한 항원 상호작용 선택성을 전달하기 위해 명시된 항원 영역에서 충분한 수의 동일한 접촉점을 공유할 수 있다. 추가로, 항체가 본질적으로 동일한 에피토프를 인식하고 광범위하게 동등한 기술적 효과 및/또는 상호작용 선택성을 부여하는 일부 경우에, 가장 N-말단 항원 접촉점 내지 가장 C-말단 항원 접촉점까지를 포함하는 항원 접촉의 전체성에 의해 에피토프 결합 풋프린트를 정의하는 것이 또한 유용할 수 있다.
단백질 표적 상에서 발견되는 에피토프는 "선형 에피토프" 또는 "입체배좌 에피토프"로 정의될 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 항원에서 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다. 입체배좌 에피토프는 단백질 서열에서 불연속적이지만, 단백질이 3차원 구조로 접힐 때 야기되는 아미노산으로 형성된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하도록 의도된다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 및 효모 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있으며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이므로 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 이러한 다른 형태의 발현 벡터 및 또한 박테리오파지 및 파지미드 시스템을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하도록 의도된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하도록 의도되며, 예를 들어, 상기 자손이 세포주 또는 세포 은행을 만드는 데 이용되면 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 제조하기 위해 선택적으로 저장되거나, 제공되거나, 판매되거나, 전달되거나 또는 이용된다.
"대상체", "환자" 또는 "개체"에 대한 언급은 치료될 대상체, 특히 포유동물 대상체를 지칭한다. 포유동물 대상체는 인간, 비인간 영장류, 농장 동물(예컨대, 소), 스포츠 동물, 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트 또는 마우스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 대안적인 실시형태에서, 대상체는 비인간 포유동물, 예컨대, 마우스이다.
용어 "충분한 양"은 원하는 효과를 생성하는 데 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료적 유효량"은 질환 또는 장애의 증상을 개선하는 데 효과적인 양이다. 치료적 유효량은 예방이 요법으로 간주될 수 있으므로 "예방적 유효량"일 수 있다.
질환 또는 장애는 질환 또는 장애의 징후 또는 증상의 중증도, 대상체가 이러한 징후 또는 증상을 경험하는 빈도, 또는 둘 다가 감소되는 경우 "개선된다".
본 명세서에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애를 치료하는 것"은 대상체가 경험하는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 및/또는 중증도가 감소하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "암"은 세포의 비정상적인 성장 또는 분열을 지칭한다. 일반적으로, 암 세포의 성장 및/또는 수명은 초과하고, 정상 세포 및 주위 조직의 성장 및/또는 수명과 일치하지 않다. 암은 양성, 전암성 또는 악성일 수 있다. 암은 구강(예를 들어, 입, 혀, 인두 등), 소화계(예를 들어, 식도, 위, 소장, 결장, 직 장, 간, 담관, 담낭, 췌장 등), 호흡계(예를 들어, 후두, 폐, 기관지 등), 뼈, 관절, 피부(예를 들어, 기저 세포, 편평 세포, 수막종 등), 유방, 생식계, (예를 들어, 자궁, 난소, 전립선, 고환 등), 비뇨계(예를 들어, 방광, 신장, 요관 등), 눈, 신경계(예를 들어, 뇌 등), 내분비계(예를 들어, 갑상선 등), 및 조혈계(예를 들어, 림프종, 골수종, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 등)를 포함한 다양한 세포 및 조직에서 발생한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 본 명세서에 사용될 때 명시된 값보다 최대 10% 및 10% 이상, 및 10% 이하, 적합하게는 명시된 값보다 최대 5% 및 5% 이상, 및 5% 이하, 특히 명시된 값을 포함한다. 용어 "사이"는 명시된 경계의 값을 포함한다.
다중특이적 항체 또는 이의 단편
본 명세서에는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 델타 가변 1 쇄(Vδ1) 및 또 다른 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적(적합하게는 이중특이적) 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명은 치료될 대상체에 투여하기 위한 의약으로서의 상기 다중특이적 항체의 용도에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 가변 도메인(예를 들어, VH 또는 VL), 다이아바디, 미니바디 또는 단클론성 항체이다. 추가 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 scFv이다.
본 발명의 다중특이적 항체는 임의의 부류, 예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD 또는 이들의 아이소타입일 수 있고, 카파 또는 람다 경쇄를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체는 IgG 항체, 예를 들어, 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 적어도 하나이다. 추가의 실시형태에서, 다중특이적 항체는 Fc가 효과기 기능을 감소시키거나, 반감기를 연장하거나, ADCC를 변경하거나, 또는 힌지 안정성을 개선하도록 돌연변이된 Fc를 갖는 것과 같이 원하는 특성을 부여하도록 변형된 포맷, 예컨대, IgG 포맷일 수 있다. 이러한 변형은 당업계에 널리 알려져 있다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 인간이다. 따라서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 인간 면역글로불린(Ig) 서열 로부터 유래될 수 있다. 항체(또는 이의 단편)의 CDR, 프레임워크 및/또는 불변 영역은 인간 Ig 서열, 특히 인간 IgG 서열로부터 유래될 수 있다. CDR, 프레임워크 및/또는 불변 영역은 인간 Ig 서열, 특히 인간 IgG 서열에 대해 실질적으로 동일할 수 있다. 인간 다중특이적 항체를 사용하는 것의 이점은 인간에서 면역원성이 낮거나 또는 없다는 것이다.
다중특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 키메라, 예를 들어, 마우스-인간 항체 키메라일 수 있다.
대안적으로, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 마우스와 같은 비-인간 종으로부터 유래된다. 이러한 비-인간 항체는 인간에서 자연적으로 생성된 항체 변이체에 대해 유사성을 증가시키도록 변형될 수 있어서, 항체 또는 이의 단편은 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 인간화된다.
다중특이적 항체 서열
본 발명의 단리된 항-Vδ1 항체 또는 이의 단편은 TRDV1 결합을 부여하는 이의 CDR 서열을 참조하여 기재될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 서열에 제한되지 않는데, 그 이유는 본 발명이 예를 들어, TCE 플랫폼 또는 DI 플랫폼에서 TRDV1에 결합하기 위해서, 다중특이적 항체를 사용하여 TRDV1을 표적화하는 완전히 새로운 원칙에 기초하기 때문이다. 유사하게, 본 발명은 제2 항원(예컨대, 암 또는 암-연관 항원 또는 면역조절 항원)에 대한 결합을 부여하는 도메인의 특정 서열에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 양상에 따르면, 하기 중 하나 이상을 포함하는 단리된 다중특이적 항-Vδ1 항체 또는 이의 단편이 제공된다:
서열번호 2 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3;
서열번호 26 내지 37 및 서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2; 및/또는
서열번호 38 내지 61 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1.
본 발명의 일 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 단리된 항-Vδ1 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 26 내지 37 및 서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 38 내지 61 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 2 내지 25 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 26 내지 37 및 서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 38 내지 61 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 2 내지 25 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 26 내지 37 및 서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 38 내지 61 중 어느 하나와 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR1을 포함한다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 특별한 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 7, 특히 2 내지 6, 예컨대, 2, 3 또는 4 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 19, 특히 14 내지 18, 예컨대, 14, 15 또는 16 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 7, 특히 2 내지 6, 예컨대, 2, 3 또는 4 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 19, 특히 14 내지 18, 예컨대, 14, 15 또는 16 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 특별한 양상에 따르면, 서열번호 8 내지 13, 특히 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 20 내지 25, 특히 20, 21, 22 또는 23 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 서열번호 8 내지 13, 특히 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 20 내지 25, 특히 20, 21, 22 또는 23 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 특별한 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 7, 특히 2 내지 6, 예컨대, 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 19, 특히 14 내지 18, 예컨대, 14, 15, 16 또는 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 7, 특히 2 내지 6, 예컨대, 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 19, 특히 14 내지 18, 예컨대, 14, 15, 16 또는 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 특별한 양상에 따르면, 서열번호 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 20, 21, 22 또는 23 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 서열번호 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 20, 21, 22 또는 23 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 특별한 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 7, 특히 2 내지 6, 예컨대, 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 19, 특히 14 내지 18, 예컨대, 14, 15, 16 또는 17 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 7, 특히 2 내지 6, 예컨대, 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 14 내지 19, 특히 14 내지 18, 예컨대, 14, 15, 16 또는 17 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 특별한 양상에 따르면, 서열번호 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 20, 21, 22 또는 23 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 서열번호 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및/또는 서열번호 20, 21, 22 또는 23 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 명세서에서 "적어도 80%" 또는 "80% 이상"을 지칭하는 실시형태는 80% 이상의 모든 값, 예컨대, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 명시된 서열에 대해 적어도 85%, 예컨대, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 포함한다.
백분율 서열 동일성 대신에, 실시형태는 또한 하나 이상의 아미노산 변화, 예를 들어, 하나 이상의 부가, 치환 및/또는 결실로 정의될 수 있다. 일 실시형태에서, 서열은 최대 5개의 아미노산 변화, 예컨대, 최대 3개의 아미노산 변화, 특히 최대 2개의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 서열은 최대 5개의 아미노산 치환, 예컨대, 최대 3개의 아미노산 치환, 특히 최대 1 또는 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 CDR3은 서열번호 2 내지 25 중 임의의 하나와 비교하여 2개 이하, 보다 적합하게는 1개 이하의 치환(들)을 갖는 서열을 포함하거나 또는 보다 적합하게는 이로 이루어진다.
적합하게는 서열번호 2 내지 61 및 서열번호 160 내지 171의 상응하는 잔기와 상이한 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 임의의 잔기는 상응하는 잔기에 대한 보존적 치환이다. 예를 들어, 서열번호 2 내지 25의 상응하는 잔기와 상이한 CDR3의 임의의 잔기는 상응하는 잔기에 대한 보존적 치환이다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역;
(ii) 서열번호 26 내지 37 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역;
(iii) 서열번호 38 내지 49 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역;
(iv) 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역;
(v) 서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역; 및/또는
(vi) 서열번호 50 내지 61 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 하기를 갖는 중쇄를 포함한다:
(i) 서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역;
(ii) 서열번호 26 내지 37 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역; 및
(iii) 서열번호 38 내지 49 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 하기를 갖는 경쇄를 포함한다:
(i) 서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역;
(ii) 서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역; 및
(iii) 서열번호 50 내지 61 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분(즉, 결합 도메인)은 하기로 이루어짐) 서열번호 2, 3, 4, 5 또는 6, 예컨대, 2, 3, 4 또는 5, 특히 2, 3 또는 4 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 26, 27, 28, 29 또는 30, 예컨대, 26, 27, 28 또는 29, 특히 26, 27 또는 28 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 38, 39, 40, 41 또는 42, 예컨대, 38, 39, 40 또는 41, 특히 38, 39 또는 40 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 8, 9, 10 또는 11 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 32, 33, 34 또는 35 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 44, 45, 46 또는 47 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 2의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 26의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 38의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 2의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 26의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 38의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 3의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 27의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 39의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 3의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 27의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 39의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 4의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 28의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 40의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 4의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 28의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 40의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 5의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 29의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 41의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 5의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 29의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 41의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 6의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 30의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 42의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 6의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 30의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 42의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 8의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 32의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 8의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 32의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 44의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 9의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 33의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 9의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 33의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 45의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 10의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 34의 CDR2 서열 및 서열번호 46의 CDR1 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 10의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 34의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 46의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 11의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 35의 CDR2 서열 및 서열번호 47의 CDR1 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 11의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 35의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 47의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 14 내지 25, 예컨대, 서열번호 14, 15, 16, 17 또는 18, 예컨대, 14, 15, 16 또는 17, 특히 14, 15 또는 16 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 160 내지 171, 예컨대, 서열번호 160, 161, 162, 163 또는 164, 예컨대, 160, 161, 162 또는 163, 특히 160, 161 또는 162 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 50 내지 61, 예컨대, 서열번호 50, 51, 52, 53 또는 54, 예컨대, 50, 51, 52 또는 53, 특히 50, 51 또는 52 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 14의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 160의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 50의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 14의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 160의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 50의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 15의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 161의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 51의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 15의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 161의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 51의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 16의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 162의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 52의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 16의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 162의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 52의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 17의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 163의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 53의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 17의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 163의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 53의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 18의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 164의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 54의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 18의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 164의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 54의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 20, 21, 22 또는 23 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 166, 167, 168 또는 169 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은(또는 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 하기로 이루어짐) 서열번호 56, 57, 58 또는 59 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 20의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 166의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 56의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 20의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 166의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 56의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 21의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 167의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 57의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 21의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 167의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 57의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 22의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 168의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 58의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 22의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 168의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 58의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VL 영역은 서열번호 23의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 169의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 59의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, CDR3은 서열번호 23의 서열로 이루어지고, CDR2는 서열번호 169의 서열로 이루어지고, CDR1은 서열번호 59의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 2의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 26의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 38의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 14의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 160의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 50의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 2의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 26의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 38의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 14의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 160의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 50의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 3의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 27의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 39의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 15의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 161의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 51의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 3의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 27의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 39의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 15의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 161의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 51의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 4의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 28의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 40의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 16의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 162의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 52의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 4의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 28의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 40의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 16의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 162의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 52의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 5의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 29의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 41의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 17의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 163의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 53의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 5의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 29의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 41의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 17의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 163의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 53의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 6의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 30의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 42의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 18의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 164의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 54의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 6의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 30의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 42의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 18의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 164의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 54의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 7의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 31의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 43의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 19의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 165의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 55의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 7의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 31의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 43의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 19의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 165의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 55의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 8의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 32의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 44의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 20의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 166의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 56의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 8의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 32의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 44의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 20의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 166의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 56의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 9의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 33의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 45의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 21의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 167의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 57의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 9의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 33의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 45의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 21의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 167의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 57의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 10의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 34의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 46의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 22의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 168의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 58의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 10의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 34의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 46의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 22의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 168의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 58의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 11의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 35의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 47의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 23의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 169의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 59의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 11의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 35의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 47의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 23의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 169의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 59의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 12의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 36의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 48의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 24의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 170의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 60의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 12의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 36의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 48의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 24의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 170의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 60의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, VH 영역은 서열번호 13의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 37의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 49의 서열을 포함하는 CDR1을 포함하고, VL 영역은 서열번호 25의 서열을 포함하는 CDR3, 서열번호 171의 서열을 포함하는 CDR2 및 서열번호 61의 서열을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일 실시형태에서, HCDR3은 서열번호 13의 서열로 이루어지고, HCDR2는 서열번호 37의 서열로 이루어지고, HCDR1은 서열번호 49의 서열로 이루어지고, LCDR3은 서열번호 25의 서열로 이루어지고, LCDR2는 서열번호 171의 서열로 이루어지고, LCDR1은 서열번호 61의 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 하나 이상의 CDR 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1252_P01_C08의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1245_P01_E07의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1245_P02_G04의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1245_P02_B07의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1251_P02_C05의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1139_P01_E04의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1245_P02_F07의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1245_P01_G06의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1245_P01_G09의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1138_P01_B09의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표 3에 기재된 바와 같은 클론 1251_P02_G10의 하나 이상의(예컨대, 모든) CDR 서열을 포함한다.
적합하게는 상기에 언급된 VH 및 VL 영역은 각각 4개의 프레임워크 영역(FR1 내지 FR4)을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나 내의 프레임워크 영역과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나 내의 프레임워크 영역과 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 97% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나 내의 서열을 포함하는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나 내의 서열로 이루어진 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 항체는 TRDV1 결합을 부여하는 완전 경쇄 및/또는 중쇄 가변 서열에 의해서 정의될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 양상에 따르면, 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 다중특이적 항-Vδ1 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 발명의 추가 양상에 따르면, 단리된 다중특이적 항-Vδ1 항체 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH 영역을 포함한다. 추가 실시형태에서, VH 영역은 적어도 서열번호 62, 63, 64, 65 또는 66, 예컨대, 62, 63, 64 또는 65, 특히 62, 63 또는 64 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, VH 영역은 적어도 서열번호 62, 63, 64, 65 또는 66, 예컨대, 62, 63, 64 또는 65, 특히 62, 63 또는 64 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 추가 실시형태에서, VH 영역은 적어도 서열번호 68, 69, 70, 71, 72 또는 73, 예컨대, 68, 69, 70 또는 71 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, VH 영역은 적어도 서열번호 68, 69, 70, 71, 72 또는 73, 예컨대, 68, 69, 70 또는 71 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 추가 실시형태에서, VL 영역은 적어도 서열번호 74, 75, 76, 77 또는 78, 예컨대, 74, 75, 76 또는 77, 특히 74, 75 또는 76 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, VL 영역은 적어도 서열번호 74, 75, 76, 77 또는 78, 예컨대, 74, 75, 76 또는 77, 특히 74, 75, 또는 76 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 추가 실시형태에서, VL 영역은 적어도 서열번호 80, 81, 82, 83, 84 또는 85, 예컨대, 80, 81, 82 또는 83 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, VL 영역은 적어도 서열번호 80, 81, 82, 83, 84 또는 85, 예컨대, 80, 81, 82 또는 83 중 어느 하나와 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VL 영역을 포함한다.
추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VL 영역을 포함한다.
추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VL 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 63의 아미노산 서열(1252_P01_C08)을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62의 아미노산 서열(1245_P01_E07)을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열(1245_P02_G04)을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 68의 아미노산 서열(1139_P01_E04)을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 69의 아미노산 서열(1245_P02_F07)을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 70의 아미노산 서열(1245_P01_G06)을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열(1245_P01_G09)을 포함하는 VH 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 63의 아미노산 서열(1252_P01_C08)로 이루어진 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62의 아미노산 서열(1245_P01_E07)로 이루어진 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열(1245_P02_G04)로 이루어진 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 68의 아미노산 서열(1139_P01_E04)로 이루어진 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 69의 아미노산 서열(1245_P02_F07)로 이루어진 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 70의 아미노산 서열(1245_P01_G06)로 이루어진 VH 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열(1245_P01_G09)로 이루어진 VH 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 75의 아미노산 서열(1252_P01_C08)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 74의 아미노산 서열(1245_P01_E07)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 76의 아미노산 서열(1245_P02_G04)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 80의 아미노산 서열(1139_P01_E04)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 81의 아미노산 서열(1245_P02_F07)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 82의 아미노산 서열(1245_P01_G06)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 83의 아미노산 서열(1245_P01_G09)을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 75의 아미노산 서열(1252_P01_C08)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 74의 아미노산 서열(1245_P01_E07)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 76의 아미노산 서열(1245_P02_G04)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 80의 아미노산 서열(1139_P01_E04)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 81의 아미노산 서열(1245_P02_F07)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 82의 아미노산 서열(1245_P01_G06)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 83의 아미노산 서열(1245_P01_G09)로 이루어진 VL 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 63의 아미노산 서열(1252_P01_C08)을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 75의 아미노산 서열(1252_P01_C08)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62의 아미노산 서열(1245_P01_E07)을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 74의 아미노산 서열(1245_P01_E07)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열(1245_P02_G04)을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 76의 아미노산 서열(1245_P02_G04)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 68의 아미노산 서열(1139_P01_E04)을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 80의 아미노산 서열(1139_P01_E04)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 69의 아미노산 서열(1245_P02_F07)을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 81의 아미노산 서열(1245_P02_F07)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 70의 아미노산 서열(1245_P01_G06)을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 82의 아미노산 서열(1245_P01_G06)을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열(1245_P01_G06)을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 83의 아미노산 서열(1245_P01_G09)을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 63의 아미노산 서열(1252_P01_C08)로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 75의 아미노산 서열(1252_P01_C08)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 62의 아미노산 서열(1245_P01_E07)로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 74의 아미노산 서열(1245_P01_E07)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 64의 아미노산 서열(1245_P02_G04)로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 76의 아미노산 서열(1245_P02_G04)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 68의 아미노산 서열(1139_P01_E04)로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 80의 아미노산 서열(1139_P01_E04)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 69의 아미노산 서열(1245_P02_F07)로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 81의 아미노산 서열(1245_P02_F07)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 70의 아미노산 서열(1245_P01_G06)로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 82의 아미노산 서열(1245_P01_G06)로 이루어진 VL 영역을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 71의 아미노산 서열(1245_P01_G06)로 이루어진 VH 영역 및 서열번호 83의 아미노산 서열(1245_P01_G09)로 이루어진 VL 영역을 포함한다.
VH 및 VL 영역 둘 다를 포함하는 단편의 경우, 이들은 공유적으로(예를 들어, 이황화물 결합 또는 링커를 통해) 또는 비-공유적으로 회합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다중특이적 항체 단편은 scFv, 즉, 링커에 의해 연결된 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, VH 영역 및 VL 영역은 (예를 들어, 합성) 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된다. 폴리펩타이드 링커는 (Gly4Ser)n 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 n = 1 내지 8, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 7이다. 폴리펩타이드 링커는 [(Gly4Ser)n(Gly3AlaSer)m]p 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 n = 1 내지 8, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 7이고, m = 1 내지 8, 예를 들어, 0, 1, 2 또는 3이고, p = 1 내지 8, 예를 들어, 1, 2 또는 3이다. 추가의 실시형태에서, 링커는 서열번호 98을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 링커는 서열번호 98로 이루어진다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 86 내지 97 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 86 내지 97 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 더 추가의 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 87의 아미노산 서열(1252_P01_C08)을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 86의 아미노산 서열(1245_P01_E07)을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 88의 아미노산 서열(1245_P02_G04)을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 92의 아미노산 서열(1139_P01_E04)을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 93의 아미노산 서열(1245_P02_F07)을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 94의 아미노산 서열(1245_P01_G06)을 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 95의 아미노산 서열(1245_P01_G09)을 포함한다.
일 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 86 내지 97 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 추가 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 86 내지 97 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다. 더 추가의 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 87의 아미노산 서열(1252_P01_C08)로 이루어진다. 대안적인 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 86의 아미노산 서열(1245_P01_E07)로 이루어진다. 대안적인 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 88의 아미노산 서열(1245_P02_G04)로 이루어진다. 대안적인 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 92의 아미노산 서열(1139_P01_E04)로 이루어진다. 대안적인 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 93의 아미노산 서열(1245_P02_F07)로 이루어진다. 대안적인 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 94의 아미노산 서열(1245_P01_G06)로 이루어진다. 대안적인 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 95의 아미노산 서열(1245_P01_G09)로 이루어진다.
scFv 작제물은 번역, 정제 및 검출을 돕기 위해 N-말단 및 C-말단 변형을 포함하도록 설계 및 제조될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, scFv 서열의 N-말단에서, 추가의 메티오닌 및/또는 알라닌 아미노산 잔기가 표준 VH 서열의 앞에 포함될 수 있다(예를 들어, QVQ 또는 EVQ로 시작). C-말단(즉, IMGT 정의에 따라 끝나는 표준 VL 도메인 서열의 C-말단)에서, (i) 불변 도메인의 부분 서열 및/또는 (ii) 정제 및 검출을 돕기 위해 His-태그 및 Flag-태그와 같은 태그를 포함하는 추가의 합성 서열과 같은 추가의 서열이 포함될 수 있다. 일 실시형태에서, 서열번호 124는 서열번호 86, 88 내지 90, 92-97 중 임의의 하나의 C-말단에 첨가된다. 일 실시형태에서, 서열번호 125는 서열번호 86, 88 내지 90, 92 내지 97 중 임의의 하나의 C-말단에 첨가된다. 일 실시형태에서, 서열번호 126은 서열번호 87 또는 91 중 임의의 하나의 C-말단에 첨가된다. 일 실시형태에서, 서열번호 127은 서열번호 87 또는 91 중 임의의 하나의 C-말단에 첨가된다. 상기 scFv N- 또는 C-말단 서열은 임의적이고 대안적인 scFv 설계, 번역, 정제 또는 검출 전략이 채택되는 경우 제거되거나, 변형되거나 또는 치환될 수 있음이 잘 이해된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체는 임의의 포맷일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 IgG1 포맷이다. 따라서, 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 111 내지 122 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 추가 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 111 내지 122 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 더 추가의 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 111 내지 116, 예컨대, 서열번호 111 내지 113 및 116의 아미노산 서열을 포함한다. 더 추가의 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 117 내지 122, 예컨대, 서열번호 117 내지 120의 아미노산 서열을 포함한다. 더 추가의 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 서열번호 111, 112, 116 내지 120, 예컨대, 서열번호 111, 112 또는 116, 또는 서열 117 내지 120의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 111 내지 122 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다. 추가 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 111 내지 122 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진다. 더 추가의 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 111 내지 116, 예컨대, 서열번호 111 내지 113 및 116의 아미노산 서열로 이루어진다. 더 추가의 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 117 내지 122, 예컨대, 서열번호 117 내지 120의 아미노산 서열로 이루어진다. 더 추가 실시형태에서, TRDV1-결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분은 서열번호 111, 112, 116 내지 120, 예컨대, 서열번호 111, 112 또는 116, 또는 서열 117 내지 120의 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편과 동일하거나, 또는 본질적으로 동일한 TRDV1 에피토프에 결합하거나, 또는 이와 경쟁한다. 다중특이적 항체가 당업계에 알려진 일상적인 방법을 사용함으로써 참조 항-Vδ1 항체와 동일한 TRDV1 에피토프에 결합하거나, 또는 이와의 결합에 대해 경쟁하는지를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-Vδ1 항체와 동일한 TRDV1 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건 하에 Vδ1 단백질 또는 펩타이드에 결합하도록 허용된다. 다음으로, Vδ1 쇄에 결합하는 시험 다중특이적 항체의 능력이 평가된다. 시험 다중특이적 항체가 참조 항-Vδ1 항체와의 포화 결합 후 Vδ1에 결합할 수 있는 경우, 시험 다중특이적 항체는 참조 항-Vδ1 항체와 상이한 TRDV1 에피토프에 결합한다고 결론내릴 수 있다. 반면에, 시험 다중특이적 항체가 참조 항-Vδ1 항체와의 포화 결합 후 Vδ1 쇄에 결합할 수 없는 경우, 시험 다중특이적 항체는 본 발명의 참조 항-Vδ1 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 TRDV1 에피토프에 결합할 수 있다. 물론, TRDV1 에피토프에 대한 결합은 TRDV1의 에피토프인 제1 표적 에피토프에 대한 결합을 부여하는 다중특이적 항체의 성분을 지칭한다. 동일하거나 상이한 에피토프에 대한 결합의 시험은 대안적으로 본 명세서에 제공된 다중특이적 항체의 서열을 사용하여 그러나 단일특이적 포맷에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 예시적인 항체의 CDR 서열을 갖는 항체와 Vδ1에 대한 결합에 대해 경쟁하는 다중특이적 항-Vδ1 항체를 포함한다. 예를 들어, 경쟁적 검정은 단백질, 항체 및 다른 길항제가 본 발명의 항체와 Vδ1 쇄에 대한 결합에 대해 경쟁하고/하거나 에피토프를 공유하는지를 결정하기 위해 본 발명의 항체로 수행될 수 있다. 이러한 검정은 당업자에게 용이하게 알려져 있으며; 이들은 단백질, 예를 들어, Vδ1 상의 제한된 수의 결합 부위에 대한 길항제 또는 리간드 사이의 경쟁을 평가한다. 항체(또는 이의 단편)은 경쟁 전 또는 후에 고정화 또는 불용해성이되고 Vδ1 쇄에 결합된 샘플은, 예를 들어, 디캔팅(항체가 사전 불용화된 경우) 또는 원심분리(항체가 경쟁적 반응 후 침전된 경우)에 의해 결합되지 않은 샘플로부터 분리된다. 또한, 경쟁적 결합은 기능이 단백질에 대한 항체의 결합 또는 결합의 결여에 의해 변경되는지, 예를 들어, 항체 분자가 예를 들어, 표지의 효소적 활성을 저해하거나 또는 강화하는지에 의해 결정될 수 있다. ELISA 및 다른 기능적 검정은 당업계에 알려지고 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
2개의 항체는 각각이 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 저해(차단)하는 경우 동일하거나 또는 중첩된 에피토프에 결합한다. 즉, 하나의 항체의 1 -, 5-, 10-, 20- 또는 100-배 초과량은 다른 항체의 결합을 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%까지 저해한다. 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 표적 항원에서 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다.
그런 다음 추가의 일상적인 실험(예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여 시험 항체의 관찰된 결합 결여가 실제로 참조 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합 때문인지 또는 입체 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 결여에 책임이 있는지를 확인할 수 있다. 이러한 종류의 실험은 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유세포 분석법 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 Asn 297에 연결된 당에 대한 변경을 통해 변형된 효과기 기능을 함유한다(EU 넘버링 기법). 추가의 상기 변형에서, Asn 297은 푸코실화되지 않거나 또는 감소된 푸코실화를 나타낸다(즉, 탈푸코실화된 항체 또는 비-푸코실화된 항체). 푸코실화는 분자에 당 푸코스의 첨가, 예를 들어, N-글리칸, O-글리칸 및 당지질에 푸코스의 부착을 포함한다. 따라서, 탈푸코실화된 항체에서, 푸코스는 불변 영역의 탄수화물 쇄에 부착되지 않는다. 항체는 항체의 푸코실화를 방지하거나 또는 저해하도록 변형될 수 있다. 전형적으로, 글리코실화 변형은 표적화 조작 또는 표적화 또는 뜻밖의 숙주 또는 클론 선택을 통해 대안적인 글리코실화 처리 능력을 함유하는 숙주 세포에서 상기 항체 또는 이의 단편을 발현하는 것을 수반한다(예를 들어, 실시예 13 참조). 이들 및 다른 효과기 변형은 문헌[Xinhua Wang et al. (2018) Protein & Cell 9: 63-73 및 Pereira et al. (2018) mAbs 10(5): 693-711]에 의한 것과 같은 최근 검토에서 추가로 논의되며 이는 본 명세서에 포함된다.
항체 서열 변형
다중특이적 항체 및 이의 단편은 알려진 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체 분자, 특히 Vδ1 결합을 부여하는 다중특이적 항체의 부분에 대한 서열 변형은 당업자에 의해 용이하게 포함될 수 있다. 하기 예는 비제한적이다.
파지 라이브러리로부터 항체 발견 및 서열 회수 동안, 원하는 항체 가변 도메인은 서브클로닝에 의해 전장 IgG로 재포맷될 수 있다. 이 과정을 가속화하기 위해, 가변 도메인은 종종 제한 효소를 사용하여 전달된다. 이들 고유한 제한 부위는 추가적/대안적 아미노산을 도입하여 표준 서열로부터 멀어질 수 있다(이러한 표준 서열은, 예를 들어, 국제 ImMunoGeneTics [IMGT] 정보 시스템에서 찾을 수 있으며, http://www.imgt.org 참조). 이들은 카파 또는 람다 경쇄 서열 변형으로 도입될 수 있다.
카파 경쇄 변형
가변 카파 경쇄 가변 서열은 전장 IgG로 재포맷하는 동안 제한 부위(예를 들어, Nhe1-Not1)를 사용하여 클로닝될 수 있다. 보다 구체적으로, 카파 경쇄 N-말단에서, 추가의 Ala-Ser 서열이 클로닝을 지원하기 위해 도입되었다. 바람직하게는, 이러한 추가의 AS 서열은 이어서 표준 N-말단 서열을 생성하도록 추가 개발 동안 제거된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 카파 경쇄 함유 항체는 N-말단에서 AS 서열을 함유하지 않으며, 즉, 서열번호 74, 76-78 및 80-85는 초기 AS 서열을 포함하지 않는다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 74 및 76-78은 초기 AS 서열을 포함하지 않는다. 이 실시형태는 또한 이 서열을 함유하는 본 명세서에 포함된 다른 서열(예를 들어, 서열번호 86, 88 내지 90 및 92 내지 97)에 적용되는 것으로 이해될 것이다.
추가의 아미노산 변화는 클로닝을 지원하기 위해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체의 경우, 카파 경쇄 가변-도메인/불변 도메인 경계에서 발린에서 알라닌으로의 변화가 클로닝을 지원하기 위해 도입되었다. 이는 카파 불변 도메인 변형을 초래하였다. 구체적으로, 이는 (NotI 제한 부위로부터) RTAAAPS로 시작하는 불변 도메인을 초래한다. 바람직하게는, 이 서열은 RTVAAPS로 시작하는 표준 카파 경쇄 불변 영역을 생성하기 위한 추가 개발 동안 변형될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서 본 명세서에 기재된 카파 경쇄 함유 항체는 서열 RTV로 시작하는 불변 도메인을 함유한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서열번호 111 내지 114 및 117 내지 122의 서열 RTAAAPS는 서열 RTVAAPS로 대체된다. 예를 들어, 실시예 13 및 서열번호 129, 130을 참조한다.
람다 경쇄 변형
상기 카파 예와 유사하게, 람다 경쇄 가변 도메인은 또한 전장 IgG로 재포맷하는 동안 제한 부위(예를 들어, Nhe1-Not1)를 도입함으로써 클로닝될 수 있다. 보다 구체적으로, 람다 경쇄 N-말단에서, 추가의 Ala-Ser 서열은 클로닝을 지원하기 위해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 추가의 AS 서열은 이어서 표준 N-말단 서열을 생성하도록 추가 개발 동안 제거된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 람다 경쇄 함유 항체는 이의 N-말단에서 AS 서열을 함유하지 않으며 즉, 서열번호 75 및 79는 초기 AS 서열을 포함하지 않는다. 이 실시형태는 또한 이 서열을 함유하는 본 명세서에 포함된 다른 서열(예를 들어, 서열번호 87, 91, 115 및 116)에 적용되는 것으로 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 서열번호 75는 초기 6개의 잔기를 함유하지 않으며, 즉, ASSYEL 서열은 제거된다.
또 다른 예로서, 본 명세서에 기재된 항체의 경우 람다 경쇄 가변-도메인/불변 도메인 경계에서 라이신에서 알라닌으로의 서열 변화는 클로닝을 지원하기 위해 도입되었다. 이는 람다 불변 도메인 변형을 초래하였다. 구체적으로, 이는 (NotI 제한 부위로부터) GQPAAAPS로 시작하는 불변 도메인을 초래한다. 바람직하게는, 이 서열은 GQPKAAPS로 시작하는 표준 람다 경쇄 불변 영역을 생성하도록 추가 개발 동안 변형될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 람다 경쇄 함유 항체는 서열 GQPK로 시작하는 불변 도메인을 함유한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서열번호 115 또는 116의 서열 GQPAAAPS는 서열 GQPKAAPS로 대체된다.
중쇄 변형
전형적으로, 인간 가변 중쇄 서열은 염기성 글루타민(Q) 또는 산성 글루타메이트(E)로 시작한다. 그러나, 이러한 서열은 모두 이어서 산성 아미노산 잔기인 피로-글루타메이트(pE)로 전환되는 것으로 알려져 있다. Q에서 pE로의 전환은 항체에 대한 전하 변화를 초래하는 반면, E에서 pE로의 전환은 항체의 전하를 변화시키지 않는다. 따라서 시간 경과에 따른 가변 전하-변화를 피하기 위한 한 가지 옵션은 우선 먼저 Q에서 E로 시작하는 중쇄 서열을 변형시키는 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄는 N-말단에서 Q에서 E로의 변형을 함유한다. 특히, 서열번호 62, 64 및/또는 67 내지 71의 초기 잔기는 Q에서 E로 변형될 수 있다. 이 실시형태는 또한 이 서열을 함유하는 본 명세서에 포함된 다른 서열(예를 들어, 서열번호 86, 88, 91 내지 97 및 111, 112, 115, 117 내지 120)에 적용되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 실시예 13 및 서열번호 129, 130을 참조한다.
또한, IgG1 불변 도메인의 C-말단은 PGK로 끝난다. 그러나, 말단 염기성 라이신(K)은 이어서 종종 발현 동안(예를 들어, CHO 세포에서) 절단된다. 이는 차례로 C-말단 라이신 잔기의 다양한 손실을 통해 항체에 대한 전하 변화를 초래한다. 따라서, 한 가지 옵션은 우선 먼저 라이신을 제거하여 PG에서 끝나는 균일하고 일관된 중쇄 C-말단을 초래하는 것이다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄는 C-말단으로부터 제거된 말단 K를 갖는다. 특히, 본 발명의 항체는 말단 라이신 잔기가 제거된 서열번호 111 내지 122 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 141을 참조한다.
선택적인 동종이형 변형
항체 발견 동안, 특이적 인간 동종이형이 이용될 수 있다. 선택적으로, 항체는 개발 동안 상이한 인간 동종이형으로 전환될 수 있다. 비제한적인 예로서, 카파 쇄의 경우 3개의 Km 대립유전자를 정의하는 Km1, Km1,2 및 Km3으로 지정된 3개의 인간 동종이형이 있다(동종이형 넘버링 사용): Km1은 발린 153(IMGT V45.1) 및 류신 191(IMGT L101)과 상관관계가 있고; Km1,2는 알라닌 153(IMGT A45.1) 및 류신 191(IMGT L101)과 상관관계가 있고; Km3은 알라닌 153(IMGT A45.1) 및 발린 191(IMGT V101)과 상관관계가 있다. 선택적으로, 따라서 표준 클로닝 접근법에 의해 하나의 동종이형을 또 다른 동종이형으로 서열을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, L191V(IMGT L101V) 변화는 Km1, 2 동종이형을 Km3 동종이형으로 전환시킬 것이다. 이러한 동종이형에 대한 추가 참조를 위해 문헌[Jefferis and Lefranc (2009) MAbs 1(4):332-8]을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
따라서 일 실시형태에서 본 명세서에 기재된 다중특이적 항체는 동일한 유전자의 또 다른 인간 동종이형으로부터 유래된 아미노산 치환을 함유한다. 추가 실시형태에서, 항체는 c-도메인을 km1,2로부터 km3 동종이형으로 전환시키기 위해서 카파 쇄에 대한 L191V(IMGT L101V) 치환을 함유한다. 예를 들어, 실시예 13 및 서열번호 129, 130을 참조한다.
TRDV1 에피토프에 표적화된 항체
본 명세서에는 (다른 곳에 논의된 제2 에피토프에 결합하는 것에 더하여) γδ TCR의 Vδ1 쇄의 에피토프에 결합하는 항체(또는 이의 단편)가 제공된다. 이러한 결합은 선택적으로 γδ TCR 활성에 대한 효과, 예컨대, 활성화를 가질 수 있다. 본 발명의 The 항체는 바람직하게는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 대해 특이적이고, 다른 항원의 에피토프, 예컨대, γδ TCR의 Vδ2 쇄 또는 γδ TCR의 Vδ3 쇄에 결합하지 않는다. 본 발명의 항체는 적어도 결합 시 Vδ1 세포에 부여된 효능작용적 효과와 관련하여, 효능작용 항체라고 간주될 수 있다.
일 실시형태에서, 에피토프는 γδ T 세포의 활성화 에피토프일 수 있다. "활성화" 에피토프는, 예를 들어, TCR 기능 자극, 예컨대, 세포 탈과립화, TCR 하향조절, 세포독성, 증식, 동원, 생존 또는 고갈에 대한 저항성 증가, 세포내 신호전달, 사이토카인 또는 성장 인자 분비, 표현형 변화, 또는 유전자 발현의 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성화 에피토프의 결합은 γδ T 세포 집단, 바람직하게는 Vδ1+ T 세포 집단의 확장(즉, 증식)을 자극할 수 있다. 따라서, 이들 다중특이적 항체를 사용하여 γδ T 세포 활성화를 조절하고, 이에 의해 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 활성화 에피토프의 결합은 γδ TCR을 하향조절한다. 추가적 또는 대안적인 실시형태에서, 활성화 에피토프의 결합은 γδ T 세포의 탈과립화를 활성화시킨다. 추가의 추가적 또는 대안적인 실시형태에서, 활성화 에피토프의 결합은 γδ T 세포 매개 사멸을 촉진한다.
일부 실시형태에서, TRDV1의 활성화 에피토프는, 항체에 의한 결합 시에, 수용체를 하향조절하고 선택적으로 Vδ1 세포를 활성화시키는 것이다. 일부 실시형태에서 상기 수용체의 하향조절은 또한 회합된 CD3 분자를 하향조절한다. 일부 실시형태에서, 활성화 에피토프는 Vδ1 세포의 활성 마커, 예를 들어, CD107a, CD25, CD69 및/또는 Ki67의 발현을 상향조절하는 것이다. 일부 실시형태에서, 활성화 에피토프는 Vδ1 세포의 활성 마커, 예를 들어, CD107, CD25 및 선택적으로 CD69 및/또는 Ki67의 발현을 상향조절하는 것이다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 활성 마커(예컨대, CD107a)의 상향조절은 암 세포의 존재 하에서의 상향조절일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 다중특이적 항체는 특히 TRDV1-결합 도메인을 통해 TRDV1의 활성화 에피토프에 결합한다.
T-세포 수용체는 종종 다른 단백질과 착물을 형성하기 때문에, Vδ1 항체 결합을 통한 T-세포 수용체의 하향조절은 T-세포 수용체와 회합된 다른 단백질의 하향조절을 초래할 수 있다(즉, Vδ1 항체의 결합은 T-세포 수용체 복합체의 하향조절을 초래한다). 예를 들어, 일부 실시형태에서, TRDV1의 활성화 에피토프는 결합 시에 TCR/CD3 수용체 복합체를 하향조절하는 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 항체는 항체에 의해서 결합되지 않지만, T-세포 수용체에 대해 복합체를 형성하는 세포 표면 단백질의 간접적인 하향조절을 초래할 수 있다. 감마 델타 1 쇄를 발현하는 T-세포 (즉, Vδ1 세포)가 적은 수의 총 T-세포 집단을 나타낸다는 것을 고려할 때, 본 발명의 항체는 Vδ1 세포에서 단백질만을 하향조절함으로써, TCR 복합체, 예컨대, CD3에서 단백질을 선택적으로(그리고 간접적으로) 햐향조절하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, T-세포 수용체 복합체 활성화 에피토프는 활성화 시, T-세포 수용체 복합체를 하향조절하지만, 상기 TRDV1 TCR 복합체와 회합되지 않은 CD3 분자를 햐항조절하지 않는 것이다.
에피토프는 바람직하게는 γδ TCR의 Vδ1 쇄의 적어도 하나 세포외, 가용성, 친수성, 외부 또는 세포질 부분으로 구성된다.
특히, 에피토프는 γδ TCR의 Vδ1 쇄의 초가변 영역, 특히 Vδ1 쇄의 CDR3에서 발견된 에피토프를 포함하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 에피토프는 γδ TCR의 Vδ1 쇄의 비가변 영역 내에 있다. 이러한 결합은 고도로 가변적인 TCR(특히 CDR3)의 서열에 대한 제한 없이 Vδ1 쇄의 고유한 인식을 허용하는 것으로 인식될 것이다. MHC-유사 펩타이드 또는 항원을 인식하는 다양한 γδ TCR 복합체는 Vδ1 쇄의 존재에 의해서만 이러한 방식으로 인식될 수 있다. 이와 같이, 임의의 Vδ1 쇄-포함 γδ TCR은 γδ TCR의 특이성과 무관하게 본 명세서에 정의된 바 와 같은 항체 또는 이의 단편을 사용하여 인식될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 1-24 및/또는 35-90, 예를 들어, CDR1 및/또는 CDR3 서열의 일부가 아닌 Vδ1 쇄의 부분 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 91-105(CDR3) 내에 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서 에피토프는 TRDV-1 CDR2 서열 내의 아미노산을 포함한다.
잘 특징규명된 αβ T 세포와 유사한 방식으로, γδ T 세포가 αβ T 세포보다 더 적은 수의 V, D, 및 J 분절을 함유하더라도, γδ T 세포는 체세포적으로 재배열된 가변(V), 다양성(D), 연결(J), 및 불변(C) 유전자의 별개의 세트를 활용한다. 일 실시형태에서, 항체(또는 이의 단편)에 의해 결합된 에피토프는 Vδ1 쇄의 J 영역(예를 들어, 인간 델타 하나의 쇄 생식계열에서 암호화된 4개의 J 영역 중 하나: 서열번호 152(J1*0) 또는 153(J2*0) 또는 154(J3*0) 또는 155(J4*0)) 또는 Vδ1 쇄의 C-영역(예를 들어, C-말단 막근접/막관통 영역을 함유하는 서열번호 156(C1*0))에서 발견된 에피토프를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 항체(또는 이의 단편)에 의해 결합된 에피토프는 Vδ1 쇄의 N-말단 리더 서열(예를 들어, 서열번호 150)에서 발견된 에피토프를 포함하지 않는다. 따라서 항체 또는 단편은 Vδ1 쇄의 V 영역(예를 들어, 서열번호 151)에서만 결합할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 에피토프는 γδ TCR의 V 영역(예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 잔기 1-90)의 에피토프로 이루어진다.
에피토프에 대한 언급은 문헌[Luoma et al. (2013) Immunity 39: 1032-1042, 및 서열번호 1로 제시된 RCSB 단백질 Data Bank 항목: 4MNH 및 3OMZ에 기재된 서열로부터 유래된 Vδ1 서열과 관련하여 이루어졌다:
AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGESLTRADKLIFGKGTRVTVEPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESS (서열번호 1)
서열번호 1은 V 영역(또한 가변 도메인으로도 지칭됨), D 영역, J 영역 및 TCR 불변 영역을 포함하는 가용성 TCR을 나타낸다. V 영역은 아미노산 잔기 1-90을 포함하고, D 영역은 아미노산 잔기 91-104를 포함하고, J 영역은 아미노산 잔기 105-115를 포함하고 불변 영역은 아미노산 잔기 116 내지 209를 포함한다. V 영역 내에서, CDR1은 서열번호 1의 아미노산 잔기 25-34로 정의되고, CDR2는 서열번호 1의 아미노산 잔기 50-54로 정의되고, CDR3은 서열번호 1의 아미노산 잔기 93-104로 정의된다(Xu et al., PNAS USA 108(6):2414-2419 (2011)).
따라서, 본 발명의 양상에 따르면, 하기 아미노산 영역 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 단편이 제공된다:
(i) 서열번호 1의 3 내지 20; 및/또는
(ii) 서열번호 1의 37 내지 77.
추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 추가로 서열번호 128의 아미노산 잔기 1-90 에피토프를 포함하는 다형성 V 영역을 인식한다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 1-90 및 다형성 생식계열 변이체 서열(아미노산 1-90 서열번호 128)은 본 명세서에 기재된 에피토프를 정의할 때 상호 교환 가능한 것으로 간주될 수 있다. 본 명세서에 제시된 연구는 본 발명의 항체가 이 생식계열 서열의 두 변이체를 인식할 수 있다는 것을 입증하였다. 예로서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이 서열번호 1의 아미노산 영역 1-24 및/또는 35-90 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프를 인식하는 것으로 언급되는 경우 이는 또한 서열번호 128의 동일한 영역; 구체적으로 서열번호 128의 아미노산 영역 1 내지 24 및/또는 35 내지 90을 지칭한다.
일 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 1의 아미노산 영역 1-90 내의 하나 이상의 아미노산 잔기 및 서열번호 128에서 영역 1-90의 동등하게 위치한 아미노산을 인식한다. 보다 구체적으로, 일 실시형태에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편은 인간 생식계열 에피토프를 인식하며 여기서 상기 생식계열은 서열번호 1의 위치 71에서 알라닌(A) 또는 발린(V)을 암호화한다.
일 실시형태에서, 에피토프는 기재된 영역 내에 하나 이상, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 포함한다.
추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 3 내지 20 내에 하나 이상(예컨대, 5개 이상, 예컨대, 10개 이상)의 아미노산 잔기를 포함한다. 대안적인 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 37- 77(예컨대, 아미노산 영역 50 내지 54) 내에 하나 이상(예컨대, 5개 이상, 예컨대, 10개 이상)의 아미노산 잔기를 포함한다. 또한 추가의 실시형태에서, 에피토프는 아미노산 영역 3 내지 20(예컨대, 5 내지 20 또는 3 내지 17) 내에 하나 이상(예컨대, 5개 이상, 예컨대, 10개 이상)의 아미노산 잔기 및 서열번호 1의 아미노산 영역 37 내지 77(예컨대, 62 내지 77 또는 62 내지 69) 내에 하나 이상(예컨대, 5개 이상, 예컨대, 10개 이상)의 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 항체(또는 이의 단편)는 정의된 범위 내의 모든 아미노산에 결합할 필요가 없다는 것이 추가로 이해될 것이다. 이러한 에피토프는 선형 에피토프로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 영역 5 내지 20 내에 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체는 상기 범위의 아미노산 잔기, 예를 들어, 선택적으로 범위 내의 아미노산(즉, 아미노산 5, 9, 16 및 20)을 포함하여 범위의 각 끝에 있는 아미노산 잔기(즉, 아미노산 5 및 20) 중 하나 이상에만 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기 3, 5, 9, 10, 12, 16, 17, 20, 37, 42, 50, 53, 59, 62, 64, 68, 69, 72 또는 77 중 적어도 하나를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미 노산 잔기 3, 5, 9, 10, 12, 16, 17, 20, 37, 42, 50, 53, 59, 62, 64, 68, 69, 72 또는 77로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1(또는 상기 기재된 바와 같이 서열번호 128)의 하기 아미노산 영역 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다:
(i) 3 내지 17;
(ii) 5 내지 20;
(iii) 37 내지 53;
(iv) 50 내지 64;
(v) 59 내지 72;
(vi) 59 내지 77;
(vii) 62 내지 69; 및/또는
(viii) 62 내지 77.
추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역: 5 내지 20 및 62 내지 77; 50 내지 64; 37 내지 53 및 59 내지 72; 59 내지 77; 또는 3 내지 17 및 62 내지 69 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역: 5 내지 20 및 62 내지 77; 50 내지 64; 37 내지 53 및 59 내지 72; 59 내지 77; 또는 3 내지 17 및 62 내지 69 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다.
추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 3, 5, 9, 10, 12, 16, 17, 62, 64, 68 및 69를 포함하거나, 또는 적합하게는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 3, 5, 9, 10, 12, 16, 17, 62, 64, 68 및 69로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 5, 9, 16, 20, 62, 64, 72 및 77을 포함하거나, 또는 적합하게는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 5, 9, 16, 20, 62, 64, 72 및 77로 이루어진다. 또한 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 37, 42, 50, 53, 59, 64, 68, 69, 72, 73 및 77을 포함하거나, 또는 적합하게는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 37, 42, 50, 53, 59, 64, 68, 69, 72, 73 및 77로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 50, 53, 59, 62 및 64를 포함하거나, 또는 적합하게는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 50, 53, 59, 62 및 64로 이루어진다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 59, 60, 68 및 72를 포함하거나, 또는 적합하게는 서열번호 1의 아미노산 잔기: 59, 60, 68 및 72로 이루어진다.
일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 5 내지 20 및/또는 62 내지 77 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 5 내지 20 및 62 내지 77 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다. 대안적인 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 5 내지 20 또는 62 내지 77 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 에피토프를 갖는 항체 또는 이의 단편은 1245_P01_E07의 서열의 일부 또는 전부를 가질 수 있거나, 또는 이러한 항체 또는 이의 단편은 1245_P01_E07로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 1245_P01_E07의 하나 이상의 CDR 서열 또는 1245_P01_E07의 VH 및 VL 서열 중 하나 또는 둘 다를 갖는 항체 또는 이의 단편은 이러한 에피토프에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 50 내지 64 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 50-64 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다. 이러한 에피토프를 갖는 항체 또는 이의 단편은 1252_P01_C08의 서열의 일부 또는 전부를 가질 수 있거나, 또는 이러한 항체 또는 이의 단편은 1252_P01_C08로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 1252_P01_C08의 하나 이상의 CDR 서열 또는 1252_P01_C08의 VH 및 VL 서열 중 하나 또는 둘 다를 갖는 항체 또는 이의 단편은 이러한 에피토프에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 37 내지 53 및/또는 59 내지 77 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 37 내지 53 및 59 내지 77 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다. 대안적인 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 37 내지 53 또는 59 내지 77 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 에피토프를 갖는 항체 또는 이의 단편은 1245_P02_G04의 서열의 일부 또는 전부를 가질 수 있거나, 또는 이러한 항체 또는 이의 단편은 1245_P02_G04로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 1245_P02_G04의 하나 이상의 CDR 서열 또는 1245_P02_G04의 VH 및 VL 서열 중 하나 또는 둘 다를 갖는 항체 또는 이의 단편은 이러한 에피토프에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 59 내지 72 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 59 내지 72 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진다. 이러한 에피토프를 갖는 항체 또는 이의 단편은 1251_P02_C05의 서열 중 일부 또는 전부를 가질 수 있거나, 또는 이러한 항체 또는 이의 단편은 1251_P02_C05로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 1251_P02_C05의 하나 이상의 CDR 서열 또는 1251_P02_C05의 VH 및 VL 서열 중 하나 또는 둘 다를 갖는 항체 또는 이의 단편은 이러한 에피토프에 결합할 수 있다.
일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 11 내지 21 내에 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 21 내지 28 내에 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 59 및 60 내에 아미노산 잔기를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 67 내지 82 내에 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
실시형태에서, 에피토프는 상업적으로 이용 가능한 항-Vδ1 항체, 예컨대, TS-1 또는 TS8.2에 의해 결합된 동일한 에피토프가 아니다. WO2017197347에 기재된 바와 같이, 가용성 TCR에 대한 TS-1 및 TS8.2의 결합은 δ1 쇄가 Vδ1 J1 및 Vδ1 J2 서열을 포함하지만 Vδ1 J3 쇄를 포함하지 않을 때 검출되었으며, 이는 TS-1 및 TS8.2의 결합이 델타 J1 및 델타 J2 영역에서 중요한 잔기를 수반함을 나타낸다.
본 명세서에서 "내"에 대한 언급은 정의된 범위의 맨 끝을 포함한다. 예를 들어, "아미노산 영역 5 내지 20 내"는 잔기 5부터 포함하여 잔기 20까지 포함하는 존재하는 모든 아미노산을 지칭한다.
에피토프가 항체에 의해 결합되는 것을 확립하기 위한 다양한 기술이 당업계에 알려져 있다. 예시적인 기술은, 예를 들어, 일상적인 교차-차단 검정, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석, 펩타이드 절단 분석 결정학 연구 및NMR 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 이용될 수 있다. 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내의 아미노산을 식별하는 데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분광법에 의해 검출된 수소/중수소 교환이다(실시예 9에 기재된 바와 같음). 일반적으로 말하면, 수소 /중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소로 표지한 후, 중수소-표지된 단백질에 항체를 결합시키는 것을 수반한다. 다음으로, 단백질/항체 복합체를 물로 옮기고 항체 복합체에 의해 보호된 아미노산 내의 교환가능한 양성자는 계면의 일부가 아닌 아미노산 내의 교환가능한 양성자보다 더 느린 속도로 중수소에서 수소로의 역교환을 거친다. 결과적으로, 단백질/항체 계면의 일부를 형성하는 아미노산은 중수소를 보유할 수 있으며 따라서 계면에 포함되지 않은 아미노산과 비교하여 상대적으로 더 높은 질량을 나타낸다. 항체의 해리 후, 표적 단백 질은 프로테아제 절단 및 질량 분광법 분석에 적용되어, 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 드러낸다.
다중특이적 항체 및 이의 단편은 TRDV1-결합 도메인을 통해 인간 TRDV1(서열번호 1 및 서열번호 128의 다형성 변이체)뿐만 아니라 cyno TRDV1(서열번호 172) 둘 다에 적합하게 특이적으로 결합한다.
제2 항원의 에피토프에 표적화된 항체
본 발명의 항체는 다중특이적 항체(바람직하게는 이중특이적 항체)이기 때문에, 이들은 TRDV1에 특이적으로 결합하면서 제2 항원에 특이적으로 결합한다. 제2 항원의 아이덴티티는 항체가 본 명세서에 논의된 바와 같은 2개의 범주 중 하나인지를 결정한다: T-세포 관여자(TCE) 항체 또는 이중 면역조절제(DI) 항체.
TCE에 관련된 실시형태에서, 제2 항원은 암 항원 또는 암-연관 항원이다. 이러한 실시형태에서, 항체는 제1 표적 에피토프(제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프임); 및 제2 표적 에피토프(제2 표적 에피토프는 암 항원 또는 암-연관 항원의 에피토프임)에 특이적으로 결합한다. 이러한 범주에서 특정 가능한 제2 항원의 아이덴티티는 다른 곳에 논의되어 있다. 그러나, 제2 항원은 상기 암 세포의 Vδ1-T 세포 매개 사멸(예를 들어, 직접 사멸 또는 종양 세포 결합 시 다른 면역 세포에 대한 신호전달의 면역 라이센싱 효과를 통해서)을 촉진하는 암 세포에 의해서 발현되는 임의의 항원일 수 있다. 이러한 Vδ1-세포 매개 암 세포 사멸은 Vδ1-T 세포 및 암 세포를 공동 국재화함으로써 그리고 Vδ1-T 세포의 활성화 에피토프에 대한 다중특이적 항체의 결합을 통한 Vδ1-T 세포의 활성화에 의해서 촉진된다. 본 발명은 TCE-유형 항체에 대해 완전히 신규한 플랫폼을 예시한다.
일부 실시형태에서, 제2 항원은 난소 암종의 항원이 아니다. 일부 실시형태에서, 제2 항원은 Mov19+ 난소 암종의 항원이 아니다. 일부 실시형태에서, 다중특이적(적합하게는 이중특이적) 항체는 Mov19+ 난소 암종 세포에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 다중특이적(적합하게는 이중특이적) 항체는 알파-폴레이트 수용체(알파-FR)에 특이적으로 결합하지 않는다. 알파-FR은 폴레이트 수용체 1, FOLR1, 폴레이트 수용체 알파 또는 FRα로서도 알려져 있다. 그것은 FOLR1 유전자(UniProt 수탁 번호 P15328)에 의해서 암호화되고, 서열번호 176의 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다중특이적(적합하게는 이중특이적) 항체는 scFv MOV19에 의해서 결합된 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 이중특이적 항체이고, 제2 항원은 알파-폴레이트 수용체가 아니다.
일부 실시형태에서 다중특이적 항체는 재조합 핵산 오픈 리딩 프레임 또는 재조합 숙주 세포로부터 발현된 프레임에 의해서 암호화된 인간 재조합 항체이다. 일부 실시형태에서 다중특이적 항체는 B-세포 융합 하이브리도마 기술로부터 유래된 설치류 또는 다른 비-인간 항체가 아니다. 일부 실시형태에서 다중특이적 항체는 비-인간 동물 종에서만 발견되는 비-인간 IgG 불변 도메인 서열, 예컨대, 설치류-유래 하이브리도마에서 발견되는 서열을 포함하지 않는다.
DI와 관련된 실시형태에서, 제2 항원은 면역조절 항원이다. 이러한 실시형태에서, 항체는 제1 표적 에피토프(제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프임); 및 제2 표적 에피토프(제2 표적 에피토프는 면역조절 항원임)에 특이적으로 결합한다. "면역조절" 항원은 항체 및/또는 세포 매개 면역을 조절(예를 들어, 촉진)하는 항원이다. 면역조절 항원은 T 세포의 세포 표면에 존재한다. 제2 항원이 면역조절 항원인 본 발명의 실시형태에서, 제2 항원은 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체 복합체의 성분이 아니다. 예를 들어, 제2 에피토프가 면역조절 항원의 에피토프인 본 발명의 실시형태에서, 제2 에피토프는 TRDV1의 에피토프가 아니다. 제2 에피토프가 면역조절 항원의 에피토프인 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 제2 에피토프는 T-세포 수용체 복합체의 에피토프가 아니다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 에피토프는 CD3의 에피토프가 아니다. 따라서 이들 실시형태의 항체는 TRDV1을 통해 T-세포에 특이적으로 결합하고 추가로 제2의 상이한 에피토프를 통해 T-세포에 결합할 수 있으므로 "이중 면역조절제"이며, 여기서 에피토프는 T-세포 수용체 복합체의 에피토프가 아니다. 예시적인 제2 항원은, 예를 들어, 면역 관문 저해제 PD-L1, PD-1, OX40, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, TIGIT 및 VISTA를 포함한다. 예를 들어, 고형 종양은 골수 유래 억제 세포(MDSC), 종양-연관 대식세포(TAM) 및 조절 T 세포(Treg)와 같은 면역억제 세포를 동원하며, 이들 모두는 세포독성 T 세포의 활동을 저해한다. 따라서, 고형 종양에서 DI를 가장 효과적으로 사용하려면 면역 억제성 TME를 극복하고 면역 배제 또는 면역 사막 "차가운" 종양을 염증이 있는 "뜨거운" 종양으로 만드는 데 도움이 되도록 하기 위해서 조합으로 T-세포 조절 경로를 표적으로 하는 다중특이적 모이어티를 사용할 필요가 있을 것이다. 그러나, 본 발명은 DI-유형 항체에 대한 완전히 신규한 플랫폼을 제공하기 때문에 특정 제2 면역조절 항원에 제한되지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 다중특이적 항체(적합하게는 이중특이적 항체)는 CD3에 특이적으로 결합(또는 직접 상호작용)하지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 제2 항원은 CD3이 아니다.
항체 결합
본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 1.5×10-7M(즉, 150nM) 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, KD는 1.5×10-7M(즉, 150nM) 미만이다. 추가 실시형태에서, KD는 1.3×10-7M(즉, 130nM) 이하, 예컨대, 1.0×10-7M(즉, 100nM) 이하이다. 더 추가의 실시형태에서, KD는 5.0×10-8M(즉, 50nM) 미만, 예컨대, 4.0×10-8M(즉, 40nM) 미만, 3.0×10-8M(즉, 30nM) 미만 또는 2.0×10-8M(즉, 20nM) 미만이다. 예를 들어, 일부 양상에 따르면, 1.5×10-7M(즉, 150nM) 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 인간 다중특이적 항체가 제공된다.
본 발명이 일 양상에서, 4.0×10-8M(즉, 40nM) 미만, 3.0×10-8M(즉, 30nM) 미만 또는 2.0×10-8M(즉, 20nM) 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 1.5×10-7M(즉, 150nM) 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 제2 항원(또는 제2 항원의 에피토프)에 결합할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, KD는 1.5×10-7M(즉, 150nM) 미만이다. 추가 실시형태에서, KD는 1.3×10-7M(즉, 130nM) 이하, 예컨대, 1.0×10-7M(즉, 100nM) 이하이다. 더 추가의 실시형태에서, KD는 5.0×10-8M(즉, 50nM) 미만, 예컨대, 4.0×10-8M(즉, 40nM) 미만, 3.0×10-8M(즉, 30nM) 미만 또는 2.0×10-8M(즉, 20nM) 미만이다. 예를 들어, 일부 양상에 따르면, 1.5×10-7M(즉, 150nM) 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 제2 항원(또는 제2 항원의 에피토프)에 결합하는 인간 다중특이적 항체가 제공된다.
본 발명이 일 양상에서, 4.0×10-8M(즉, 40nM) 미만, 3.0×10-8M(즉, 30nM) 미만 또는 2.0×10-8M(즉, 20nM) 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 제2 항원(또는 제2 항원의 에피토프)에 결합하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 결합 친화도는 항체 또는 이의 단편을 센서(예를 들어, 아민 고용량 칩 또는 등가물)의 표면 위에 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 항-인간 IgG Fc를 사용한 포획) 코팅함으로써 달성되며, 여기서 항체 또는 이의 단편에 의해 결합된 표적(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄)은 결합을 검출하기 위해 칩 위로 흐른다. 적합하게는, MASS-2 기기(또한 Sierra SPR-32로 지칭될 수 있음)가 30㎕/분으로 PBS + 0.02% Tween 20 실행 완충액에서 25℃에서 사용된다.
본 명세서에는 항체 기능을 정의하는 데 사용될 수 있는 다른 검정이 기재된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편은 γδ TCR 관여, 예를 들어, 항체 결합 시 γδ TCR의 하향조절 측정에 의해 평가될 수 있다. 항체 또는 이의 단편(선택적으로 세표의 표면 상에 제시됨)의 적용 후 γδ TCR의 표면 발현 은, 예를 들어, 유세포 분석법에 의해 측정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편은 또한 γδ T 세포 탈과립화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 세포 탈과립화에 대한 마커인 CD107a의 발현은 항체 또는 이의 단편(선택적으로 세포의 표면 상에 제시됨)을 예를 들어, 유세포 분석법에 의해 γδ T 세포에 적용한 후 측정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편은 γδ T 세포 사멸 활성을 측정함으로써(항체가 γδ T 세포의 사멸 활성에 영향을 미치는 지를 시험하기 위함) 평가될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 항체 또는 이의 단편(선택적으로 세포의 표면 상에 제시됨)의 존재 하에 γδ T 세포와 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 후, 배양물을 세포 생존성 염료로 염색하여 살아있는 표적 세포와 죽은 표적 세포 사이를 구별할 수 있다. 그런 다음 죽은 세포의 비율을 예를 들어, 유세포 분석법에 의해 측정될 수 있다.
다중특이적 항체
본 발명의 항체는 이중특이적 또는 다중특이적이다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나 또는 하나 초과의 표적 폴리펩타이드에 대해 특이적일 수 있다. 그러나, 본 발명에서, 항체는 일반적으로 2개(또는 그 초과)의 상이한 항원에 특이적으로 결합한다.
다양한 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 암 항원 또는 암-연관 항원(예를 들어, 종양-연관 항원)의 에피토프이다. 다양한 실시형태에서, 암 항원 또는 암-연관 항원은 다음으로부터 선택된 것이다: AFP, AKAP-4, ALK, 알파태아단백질, 안드로겐 수용체, B7H3, BAGE, BCA225, BCAA, Bcr-abl, 베타-카테닌, 베타-HCG, 베타-인간 융모성 성선자극호르몬, BORIS, BTAA, CA 125, CA 15-3, CA 195, CA 19-9, CA 242, CA 27.29, CA 72-4, CA-50, CAM 17.1, CAM43, 탄산 탈수효소 IX, 암배아 항원, CD22, CD33/IL3Ra, CD68＼P1, CDK4, CEA, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4) , c-Met, CO-029, CSPG4, 사이클린 B1, 사이클로필린 C-연관 단백질, CYP1B1, E2A-PRL, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, EphrinB2, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA, ERG(TMPRSS2ETS 융합 유전자), ETV6-AML, FAP, FGF-5, Fos-관련 항원 1, 푸코실 GM1, G250, Ga733＼EpCAM, GAGE-1, GAGE-2, GD2, GD3, 신경교종-연관 항원, GloboH, 당지질 F77, GM3, GP 100, GP 100(Pmel 17), H4-RET, HER-2/neu, HER-2/Neu/ErbB-2, 고분자량 흑색종-연관 항원(HMW-MAA), HPV E6, HPV E7, hTERT, HTgp-175, 인간 텔로머라제 역 전사효소, 이디오타입, IGF-I 수용체 , IGF-II, IGH-IGK, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, 장내 카복실 에스테라제, K-ras, LAGE-1a, LCK, 렉틴-반응성 AFP, 레구마인, LMP2, M344, MA-50, Mac-2 결합 단백질, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MART-1, MART-1/MelanA, M-CSF, 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 메소텔린, MG7-Ag, ML-IAP, MN-CA IX, MOV18, MUC1, Mum-1, hsp70-2, MYCN, MYL-RAR, NA17, NB/70K, 신경교세포 항원 2(NG2), 호중구 엘라스타제, nm-23H1, NuMa, NY-BR-1, NY-CO-1, NY-ESO, NY-ESO-1, NY-ESO-1, OY-TES1, p15, p16, p180erbB3, p185erbB2, p53, p53 돌연변이체, Page4, PAX3, PAX5, PDGFR-베타, PLAC1, 폴리시알산, 전립선-암종 종양 항원 항원-1(PCTA-1), 전립선-특이적항원, 전립선산 포스파타제(PAP), 프로테이나제 3(PR1), PSA, PSCA, PSMA, RAGE-1, Ras, Ras-돌연변이체, RCAS1, RGS5, RhoC, ROR1, RU1, RU2(AS), SART3, SDCCAG16, sLe(a), 정자 단백질 17, SSX2, STn, 서바이빈, TA-90, TAAL6, TAG-72, 텔로머라제, 티로글로불린, Tie 2, TIGIT, TLP, Tn, TPS, TRP-1, TRP-2, TRP-2, TSP-180, 티로시나제, VEGF, VEGFR2, VISTA, WT1, XAGE 1, 43-9F, 5T4 및 791Tgp72.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 ErbB 서브패밀리이다. Erb-B1(EGFR), Erb-B2(HER2)는 수용체 티로신 키나제(RTK)의 서브패밀리의 서브패밀리 I의 구성원이다. 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 RTK이다. RTK는 세포외 리간드 결합 도메인과 단일 막관통 나선으로 구성된 유사한 단백질 구조를 공유한다. 그런 다음 세포내 티로신 키나제 도메인(TKD)과 카복실(C-) 말단 꼬리의 특성을 통해 별도의 하위 부류로 주로 세분된다. RTK의 세포외 도메인 영역은 면역글로불린(Ig)-유사 또는 표피 성장 인자(EGF)-유사 도메인을 비롯한 다양한 보존 요소를 나타낸다. 일부 실시형태에서 제2 에피토프는 수용체 티로신 키나제의 에피토프이다. RTK 패밀리의 예는 VEGFR2, EGFR, c-MET, IGF-I 수용체, PDGFR-베타, CD115, CD117, CD140A, CD140B, CD167a, CD167b, CD172g, CD220, CD246, CD303 CD331, CD332, CD333 및 CD340을 포함한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 HER2(인간 표피 성장 인자 수용체 2)이다. HER2(ErbB-2 또는 CD340이라고도 함)는 암-연관 항원이며, ErbB 서브패밀리에서 수용체 티로신 키나제의 예이다. HER2 발현은 정상 조직에 비해 Her2+ 암에서 발현이 최대 40 내지 100배 증가하며 건강한 조직에서는 낮다. Her2 과발현은 많은 유방암, 위암, 식도암, 난소암, 자궁내막암, NSCLC 및 결장직장암과 연관된다. 많은 암에서, HER2는 다른 ErbB 수용체와 이량체를 형성하여 다양한 하류 신호전달 경로의 활성화를 초래하여 제어되지 않는 증식 및 아폽토시스 저항성을 유발한다. HER2의 과발현은 낮은 생존율과 상관관계가 있으므로, 그것은 예후를 개선하는 표적일 뿐만 아니라 종양 마커이다. HER2의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 트라스투주맙은 HER2의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 EGFR이다. EGFR(표피 성장 인자 수용체)은 암-연관 항원이며, ErbB 서브패밀리에서 수용체 티로신 키나제의 예이다. EGFR은 다수의 기관에서 발현되며 상피 세포 및 상피 기원 종양의 거동을 지시하는 신호전달을 개시하는 데 중요한 역할을 한다. EGFR-매개 신호는 다양한 세포 경로를 조절하여 세포 증식, 이동, 생존 및 전이를 조절하는 데에도 관여한다. 다른 수용체 티로신 키나제와 마찬가지로 EGFR 활성에 영향을 미치거나 EGFR 상향 조절을 유발하는 돌연변이는 많은 암과 연관된다. 사실, EGFR의 유전적 변경은 고형 종양의 최대 30%에서 관찰되며 전형적으로 불량한 예후와 연관된다. 세포외 도메인에 대한 EGF의 결합을 저해하거나 세포내 티로신 키나제 활성을 저해함으로써 EGFR 신호전달의 파괴는 EGFR-발현 종양 성장을 제한할 수 있다. 따라서 EGFR 저해제는 항암제가 될 수 있다. 실제로, 특정 종양 세포는 EGFR 신호에 의존하므로 "종양유전자 중독"을 가지고 있고, 이것이 이 수용체를 치료의 매력적인 표적으로 만든다. EGFR의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 세툭시맙은 EGFR의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 B-림프구 항원의 에피토프이다. B-세포 상에서 현저하게 발현되는 항원의 예는 CD1d, CD5, CD10, CD11b, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD32A, CD32B CD37, CD39, CD40, CD45, CD52, CD72, CD79a, CD79b, CD138, CD166, CD179A, CD179B, CD180, CD185, CD150, CD213a1, CD213a2, CD217, CD244, CD255, CD229, CD232, CD267, CD268, CD269, CD274, CD277, CD279, CD290, CD300A, CD300C, CD305, CD307a, CD307b, CD307c, CD307d, CD307e, CD316, CD319, CD327, CD352, 및 CD361을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 CD19이다. CD19(분화 클러스터 19)는 암-연관 항원이다. CD19는 또한 면역글로불린 슈퍼패밀리에서 타입 I 막관통 당단백질의 예이다. 일부 실시형태에서 제2 표적은 면역글로불린 슈퍼패밀리(IgSF)의 구성원 상에 존재하는 에피토프이다. 이러한 패밀리의 예는 CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD19, CD79A, CD79B, CD28, CD48, CD58, CD80, CD86, CD90, CD96, CD147, CD150, CD155, CD229, CD244, CD273, CD274, CD276을 포함한다. CD19는 발달 전반에 걸쳐 B 세포에서 광범위하게 발현되며 B 세포가 성숙함에 따라 CD19의 표면 밀도가 증가한다. CD19는 세포질로부터 신호전달 단백질을 동원하는 데 관여한다. CD19는 또한 B 세포 수용체 신호전달 경로에 관여하며 B 세포 수용체의 기능에 필수적이다. B 세포에서의 이의 발현은 이를 B 세포로부터 발생하는 암에 대한 진단 바이오마커뿐만 아니라 백혈병 및 종양 림프구에 대한 유용한 표적으로 만든다. CD19 돌연변이는 항체 생산 감소 및 면역결핍으로 이어질 수 있으므로 CD19는 자가면역 질환 치료의 표적이 될 수도 있다. CD19의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 블리나투모맙은 CD19의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 종양 간질 항원 상에 존재한다. 종양 간질 항원의 예는 FAP 알파, CD29, CD44, CD73, CD105 및 CD166을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 FAPα(섬유아세포 활성화 단백질 α)이다. FAPα는 세프라제(seprase) 또는 프롤릴 엔도펩티다제 FAP로도 알려진 암-연관 항원이다. 이는 다양한 상피 암종의 간질에서 선택적으로 발현된다. FAPα는 다이펩티딜 펩티다제 패밀리의 세포 표면 세린 프로테아제의 예이다. FAPα는 종양 미세 환경에서 중요한 역할을 하는 암 연관 섬유아세포(CAF)에 의해 발현된다. CAF에서 선택적으로 발현되는 다른 분자는 CD10, CD90, CD140A 및 CD140B를 포함한다. 일부 실시형태에서 제2 에피토프는 CAF에서 선택적으로 발현되는 분자에 존재하는 에피토프이다. 상피암(유방암, CRC 피부암 및 췌장암)의 90% 초과가 주변 기질의 CAF 표면에서 FAPα를 발현하는 것으로 밝혀져 있다. CAF는 T-세포 상의 CXCR4에 결합하고 면역억제성인 케모카인 CXCL12를 분비한다. FAPα는 공격적인 흑색종 세포주에서 발현되는 것으로 밝혀져 있고, 유방암에서 불량한 결과 및 생존율을 보이는 환자에서 상당히 증가한다. FAPα는 콜라게나제 및 다이펩티다제 활성을 모두 가지며 종양 성장, 이동, 침습, 전이 및 ECM 분해를 촉진한다. 정상적인 건강한 성인 조직은 조직 리모델링 또는 상처 치유 영역 밖에서는 검출 가능한 FAPα 발현을 가지지 않으므로, FAPα는 종양 간질에서 거의 독점적으로 발현되고 암 진행의 다양한 양상에서 FAPα의 직접적인 역할로 인해 유망한 항암 표적이다. FAPα의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 시브로투주맙은 FAPα의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 세포 표면 당단백질에 존재한다. 단백질 글리코실화는 중요하고 일반적인 번역 후 변형이다. 인간 단백질의 50% 초과가 글리코실화되어 단백질의 기능을 조절하는 것으로 여겨진다. 이상 글리코실화는 여러 질환, 예컨대, 염증성 피부 질환, 진성 당뇨병, 심혈관 질환, 류마티스 관절염, 알츠하이머 및 프리온 질환, 암과과 관련이 있다. 세포-표면 당단백질의 예는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD3d, CD3e, CD3g, CD8a, CD8b, CD11a, CD21, CD36, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD66a, CD66f, CD177, CD235a, CD235b, CD236, CD238, CD243, CD227 및 CD301을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 메소텔린(MSLN)이다. MSLN은 암-연관 항원이며 세포 표면 당단백질의 예이다. MSLN은 건강한 세포(흉막, 복막 및 심낭을 감싸는 중피 세포)에서 제한된 발현을 갖지만 또한 다수의 암(악성 중피종 및 췌장암, 담관암종, 난소 및 폐 선암종, 악성 중피종, 췌장암, 난소암, 자궁내막암, 담도암, 위암, 소아 급성 골수성 백혈병)에서 발현된다. MSLN은 종양-분화 항원의 예이다. MSLN의 생리학적 기능은 불명확하지만 MSLN은 MSLN+ 종양에 대한 치료법의 국재화에 유용한 표적이거나 종양 마커로 이용될 수 있다. MSLN의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 아네투맙은 MSLN의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
다양한 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 면역조절 항원의 에피토프이다. 면역조절 항원은 면역계를 조절(활성화 또는 억제)하는 항원이다. 일부 실시형태에서, 면역조절 항원은 세포 표면 단백질(즉, 세포 표면에서 발현되는 항원, 특히 림프구, 호중구, 단핵구 또는 대식세포와 같은 면역 세포의 표면에서 발현되는 항원)이다. 면역조절 항원은 Vδ1+ T-세포에서 발현될 수 있거나 다른 세포, 예를 들어, CD4+ 세포, CD8+ 세포 또는 다른 면역 세포에 의해 발현될 수 있다. 면역조절 항원은 B7-1(CD80), B7-2(CD86), B7-DC(CD273), B7-H1(CD274), B7-H2(CD275), B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), B7-H5(VISTA), BTLA(CD272), 4-1BB(CD137), CD137L, CD24, CD27, CD28, CD38, CD40, CD40L(CD154), CD54, CD59, CD70, CTLA4(CD152), CXCL9, GITR(CD357), HVEM(CD270), ICAM-1(CD54), ICOS(CD278), LAG-3(CD223), OX40(CD134), OX40L(CD252), PD-1(CD279), PD-L1(CD274), TIGIT, CD314, CD334, CD335, CD337, 및 TIM-3(CD366)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 자극성 면역 관문 분자의 에피토프이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 OX40(CD134)이다. OX40은 면역조절 항원이며 TNFR 슈퍼패밀리(TNFRSF) 구성원의 일례이다. 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 TNFRSF 분자 상에 존재하는 에피토프이다. 이 단백질은 세포외 시스테인이 풍부한 도메인을 통해 종양 괴사 인자(TNF)에 결합하는 능력을 특징으로 하는 사이토카인 수용체의 슈퍼패밀리이다. 예는 CD18, CD27, CD30, CD40, CD95, CD120a, CD120b, CD134, CD137, CD265, CD268, CD269, CD270, CD271, CD357 및 CD358을 포함한다. 이러한 예 중 하나인 OX40(CD134)은 CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 발현되는 후기 공자극성 면역 관문 수용체이다. OX40은 CD4+ T 세포에서 더 높게 발현되며, OX40의 발현이 T 세포의 완전한 활성화에 의존하기 때문에 미경험 T 세포에서는 구성적으로 발현되지 않는다. 활성화되면(예를 들어, OX40L에 의해), OX40은 CD4+/CD8+ T 세포 활성화, 효과기 및 기억 T-세포의 생존 및 확장을 촉진할 뿐만 아니라 Treg 활성을 억제한다. 이는 종양에 의한 면역 회피를 억제한다. OX40은 자극성 표적이기 때문에, OX40을 표적으로 하는 요법은 OX40 발현 면역 세포를 활성화하여 종양에 대한 면역 반응(예를 들어, CD48+ T 세포 반응)을 자극한다. OX40의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 포갈리주맙은 OX40의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 TNF 슈퍼패밀리 구성원에 존재하는 에피토프이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 4-1BB(CD137)의 에피토프이다. 4-1BB는 면역조절 항원이며 또한 TNF 슈퍼패밀리 구성원의 예이다. 이것은 CD70, CD137, CD153, CD154, CD252, CD253, CD254, CD256, CD257, 및 CD258을 포함하는 TNF 상동성 도메인을 함유하는 타입 II 막관통 단백질의 단백질 슈퍼패밀리이다. 4-1BB(CD137)는 T 세포뿐만 아니라 NK 세포, 수지상 세포(DC), 단핵구, 호중구 및 B 세포에서 발현되는 유도성 공자극성 면역 관문 수용체이다. 4-1BB는 자극성 항원이며 특히 활성화된 CD8+ T 세포에서 발현된다. 시험관내 4-1BB는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포 및 수지상 세포의 확장과 사이토카인 생산을 자극한다. 생체내 4-1BB는 CD8+ T 세포 활성화에 대해서 편향되어 있으며 4-1BB의 가교결합이 T-세포 증식, IL-2 분비, 생존 및 세포용해 활성을 향상시키는 것으로 나타났기 때문에 강력한 항종양 활성을 나타낸다. 4-1BB는 자극성 표적이기 때문에 4-1BB를 표적으로 하는 요법법은 4-1BB 발현 면역 세포를 활성화하여 종양에 대한 면역 반응(예를 들어, 세포용해 CD8+ T 세포 반응)을 자극한다. 4-1BB의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 우토밀루맙은 4-1BB의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 면역 관문 저해제 분자이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체)이다. TIGIT는 면역조절 항원이며 γδ T 세포 및 NK 세포를 포함한 T 세포에서 발현되는 면역 관문 저해제의 예이다. TIGIT는 이의 리간드(PVR/CD155)에 결합하여 T 세포를 억제함으로써 면역 항상성과 자가면역을 예방하는 역할을 한다. TIGIT는 종양 침윤 림프구에서 과발현된다. TIGIT의 치료적 차단은, 이것이 T-세포 증식, 사이토카인 생산 및 탈과립을 증가시키기 때문에 바람직하다. TIGIT의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 티라골루맙은 TIGIT의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 면역 관문 저해제 분자이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제2 표적 에피토프는 PD-1(세포 예정사 단백질 1)이다. PD-1은 면역조절 항원이며 면역글로불린 슈퍼패밀리의 세포 표면 수용체 구성원의 예이다. PD-1은 활성화된 CD4+/CD8+ T 세포뿐만 아니라 γδ T 세포, B 세포 및 대식세포와 같은 다른 유형의 면역 세포에서 발현되는 면역 관문 저해제의 예이다. PD-1이 이의 리간드에 결합하면 T 세포 활성화가 저해된다. 정상적인 상황에서, 이것은 Treg의 아폽토시스를 감소시키고 항원-특이적 T-세포의 아폽토시스를 증가시켜 자가면역에 대해서 보호하는 면역 항상성에서 역할을 한다. 암 설정에서 이것은 세포용해성 CD8+ T-세포를 불활성화함으로써 종양 세포에 대한 면역 탈출을 초래한다. 따라서 PD-1의 차단은 유망한 치료 표적이다. PD-1의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 펨브롤리주맙은 PD-1의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 자극성 면역 관문 분자이다. 자극성 면역 관문 분자는, 예를 들어, OX40, OX40L, 4-1BB(CD137), CD137L, CD27, CD70, CD28, GITR, ICOS, CD40 및 CD40L을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 OX40, OX40L, 4-1BB(CD137), CD137L, CD27, CD70, CD28, GITR, ICOS, CD40 및 CD40L로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 OX40 및 4-1BB로부터 선택된 하나 이상이다.
일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 면역 관문 저해제 분자이다. 면역 관문 저해제 분자는, 예를 들어, TIGIT, CD155, PD-1, PD-L1, CTLA-4, B7-H3, B7-H4, BTLA, LAG-3, VISTA 및 TIM-3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 TIGIT, CD155, PD-1, PD-L1, CTLA-4, B7-H3, B7-H4, BTLA, LAG-3, VISTA 및 TIM-3으로부터 선택된 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 TIGIT 및 PD-1로부터 선택된 하나 이상이다.
본 명세서에서 세포 "상"에 있는 항원에 대한 언급은 세포 표면 막에서 발현되거나 이러한 세포의 세포 표면 막(의 세포외 측면)과 연관된 항원을 지칭한다.
다양한 실시형태에서, 제2 표적 에피토프는 분화 클러스터 CD 항원의 에피토프이다. 분화 클러스터(CD) 명명법은 세포 표면 분자를 식별하고 명명하는 통합 시스템이다. 전형적으로, 세포 표면 단백질은 상기 세포 표면 단백질에 대해 적어도 2개의 단클론성 항체가 생성될 때까지 CD 번호가 부여되지 않는다. 이와 같이 이 시스템은 CD 번호가 할당된 모든 세포 표면 단백질이 특정 단클론성 항체 또는 이의 단편에 의해 인식되고 결합되기 쉽도록 한다. 다양한 실시형태에서, CD 항원은 하기로부터 선택된 것이다: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD13, CD14, CD15, CD16, CD16a, CD16b, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32A, CD32B, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD60b, CD60c, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64a, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75s, CD77, CD79A, CD79B, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85A, CD85B, CD85C, CD85D, CD85F, CD85G, CD85H, CD85I, CD85J, CD85K, CD85M, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CD129, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD139, CD140A, CD140B, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD156a, CD156b, CD156c, CD157, CD158, CD158A, CD158B1, CD158B2, CD158C, CD158D, CD158E1, CD158E2, CD158F1, CD158F2, CD158G, CD158H, CD158I, CD158J, CD158K, CD159a, CD159c, CD160, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167a, CD167b, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179a, CD179b, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD187, CD188, CD189, CD190, CD191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CDw198, CDw199, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210, CDw210a, CDw210b, CD211, CD212, CD213a1, CD213a2, CD214, CD215, CD216, CD217, CD218a, CD218b, CD219, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235b, CD236, CD237, CD238, CD239, CD240CE, CD240D, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245[17], CD246, CD247, CD248, CD249, CD250, CD251, CD252, CD253, CD254, CD255, CD256, CD257, CD258, CD259, CD260, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD285, CD286, CD287, CD288, CD289, CD290, CD291, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300A, CD300C, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD307, CD307a, CD307b, CD307c, CD307d, CD307e, CD308, CD309, CD310, CD311, CD312, CD313, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD323, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD330, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362, CD363, CD364, CD365, CD366, CD367, CD368, CD369, CD370, 및 CD371.
건강한 세포 보존
γδ T-세포가 항원을 인식하고 건강한 세포와 병든 세포를 구별하는 기전은 완전히 이해되지 않았지만(Ming Heng and Madalene Heng, Antigen Recognition by γδ T-Cells. Madame Curie Bioscience Database [Internet], Austin (TX): Landes Bioscience; 2000-2013), γδ T-세포가 건강한 세포와 병든 세포를 구별하고 주목할 만한 병든 세포 다세포독성을 나타낸다는 사실(표 1의 비제한적인 예 세포 유형 참조)은 이들이 개선된 치료 창을 갖는 개선된 의약을 제공하기 위해 활용될 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 이러한 γδ T-세포 능력을 활용함으로써, 특정 암 항원, 염증성 항원, 또는 병원성 항원이 알려지지 않았거나, 또는 또한 특정 환자에서 건강한 세포에 존재하는 경우에도 γδ T-세포를 병든 세포와 공동국재화함으로써, 건강한 세포를 보존하면서 질환을 치료할 기회가 제공된다.
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하나의 비제한적인 예로서, CD3xHER2 다중-특이성에 대한 최근 연구는 현재 또는 통상적인 접근법의 과제를 강조한다. 구체적으로, 이러한 통상적인 접근법의 사용은 덜 유리한 독성 프로파일을 초래할 수 있다. 이는 많은 다른 종양 연관 항원(TAA)과 마찬가지로, HER2 항원이 유방암과 같은 암에서 발현될 뿐만 아니라 심장 세포와 같은 건강한 조직에서도 발현되기 때문이다. 따라서 모든 T-세포와 HER2 양성 세포를 공동 국재화하고 관여하는 CD3xHER2 약제의 사용은 덜 유리한 요법 창 또는 치료 지수를 초래할 수 있다. 이러한 의약은 순환 시 대다수가 αβ T-세포(CD4+ 양성, CD8+ 양성 등)인 모든 T-세포에 관여할 것이기 때문이다. αβ T-세포가 HER2 양성 세포와 공동 국재화되면, 이러한 통상적인 αβ T-세포는 HER2+ 건강한 세포를 보존하는 제한된 능력 및 병든 HER2+ 병든 세포만을 사멸시키는 제한된 능력을 나타낸다. 결과적으로, 그리고 이 예로서, 이러한 CD3xHER2 이중특이체가 투여된 시노몰거스 연구에서, 일부 상황에서 조기 안락사(심지어 투여 당일)가 필요하였다. 또한, 이러한 예시적인 연구 동안(문헌[Staflin et al. (2020) JCI Insight 5(7): e133757] 참조) HER2-발현 세포를 사멸시키기 위해 T 세포를 재표적화하는 것은 HER2-발현 조직에 대한 부작용을 유도할 수 있는 것으로 결론내렸다. 간을 제외하고, 모든 영향을 받았거나 또는 손상된 조직은 HER2를 발현한다는 것에 주목하였다.
추가의 비제한적인 예에서, 제2 결합 특이성은 또한 면역 세포 기능을 제어하거나 또는 조절하는 데 수반되는 종양 연관 모이어티에 대한 것일 수 있다. 예를 들어, 제2 특이성은 PD-L1(CD274) 또는 CD155와 같은 소위 "관문 저해제"를 표적화하도록 설계될 수 있다. 다시 한번, PDL-1 및 CD155는 100% 질환 특이적이지 않다. 두 단백질은 또한 건강한 세포 상에서 발현될 수 있다. 그러나, Vδ1+ 세포를 PD-L1 양성 세포 또는 CD155 양 성 세포에 특이적으로 공동 국재화하도록 설계된 다중특이적 항체는 PD-L1 또는 CD155 양성의 병든 또는 암성 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있다. 암 세포와 같은 병든 세포에 존재하는 질환-연관 관문 저해제를 추가로 표적화하는 것은 Vδ1+ 세포를 이러한 종양에 공동 국재화할 뿐만 아니라, 예를 들어, 달리 질환에 대한 T 세포-매개 면역 반응을 부정적으로 조절할 수 있는 PD-1/PD-L1 또는 TIGIT/CD155 신호전달을 조절하거나 또는 약화시킴으로써 추가적인 유리한 효과를 부여할 수 있다.
따라서 이러한 통상적인 접근법을 이용하는 대신에, 본 명세서에는 적어도 하나의 제1 결합 특이성이 Vδ1+ 세포에 결합할 수 있고 적어도 하나의 제2 결합 특이성이 병든 조직 및 세포에 존재하는 표적에 결합할 수 있는 다중특이적 항체가 제공된다. 이러한 다중특이적 항체를 이러한 방식으로 사용하는 것은 Vδ1+ 세포를 제2 표적을 발현하는 병든 세포에 공동 국재화할 수 있다. 또한, 이러한 질환 연관 표적이 종종 100% 질환 특이적이지 않다는 것을 고려하면, Vδ1+ 효과기 세포를 특이적으로 표적화하고 공동 국재화하는 이 접근법은 통상적인 접근법보다 더 바람직할 수 있다. 이는 Vδ1+ 효과기 세포가 병든 또는 감염된 세포에서 스트레스 패턴을 인식할 수 있고 또한 동일한 표적을 발현하는 건강한 세포를 보존하면서 병든 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있기 때문이다.
따라서 본 명세서에 제시된 다중특이적 항체는 vδ1 세포의 TCR에 관여할 수 있지만 종양 세포가 또한 존재하지 않는 한 완전한 활성화는 발생하지 않는다. TCR에 대한 현재 제시된 항체의 완전한 맞물림은 부분적 하향조절을 초래하고, 현재 제시된 항체에 의해 결합된 vδ1 세포는 종양 세포와 같은 스트레스 세포의 존재 시에만 완전히 활성화되고 세포독성이 되는 것으로 여겨진다. 이것은, 예를 들어, 도 25, I, J, K 및 도 38 A 내지 F에 제시되어 있다. 이는 표적외 세포독성이 감소되고 vδ1 세포를 활성화하는 다중특이적 항체의 전체 효력이 종양 세포의 존재 하에서만 발휘되기 때문에 본 명세서에 제시된 접근법에 대한 또 다른 중요한 안전성 이점을 나타내는데, 이는 건강한 세포(심지어 다중특이적 항체의 제2 표적 항원을 발현하는 건강한 세포)가 보존된다는 것을 의미한다.
γδ T 세포가 종양 세포에서 스트레스 신호를 감지할 수 있는 이면의 한 기전은 이들이 발현하는 NCR(자연 세포독성 수용체) 때문인 것으로 여겨진다. NCR은 종양 세포에서 NCR 리간드와 맞물릴 수 있다. 따라서 활성화의 이중 기전이 사용될 수 있는데, 여기서 γδ T 세포는 완전한 활성화 및 세포독성을 가능하게 하기 위해 종양 세포를 감지할 수 있는 NCR을 통한 것을 포함하여 TCR 자극을 통해 활성화된다.
이것은, 예를 들어, 모든 자극이 TCR을 통해 이루어지는 CD3를 통한 αβ T 세포의 자극과 대조된다. 따라서 이러한 세포는, 예를 들어, NCR을 통한 종양 세포의 항원 제시 독립적 감지와 같은 기전이 없기 때문에 건강한 세포와 형질전환된 세포 간에 거의 무차별적이다. 따라서, CD3 항체가 Fc 무손상이면 이들은 사이토카인 폭풍, 탈진, 심지어 예를 들어, NK 세포가 T 세포를 사멸시키는 면역 세포의 과활성화와 같은 예측할 수 없고 바람직한 사건의 캐스케이드를 촉발할 수 있는 다른 면역 세포를 끌어들일 것이다. 본 접근법에서, 현재 제시된 다중특이적 항체로 γδ T 세포를 자극하는 것은 γδ T 세포가 NCR 감지 기전을 통해 건강한 세포와 종양 세포를 구별할 수 있고 따라서 이러한 병든 세포 특이성으로 인해서 스트레스 받은 세포, 예컨대, 암 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 사멸시킬 수 있기 때문에 이러한 문제로 이어지지 않는다.
추가의 비제한적인 예에서, 환자는 간암이 있을 수 있으며, 여기서 간암 특이적 항원은 환자에서 알려져 있지 않다. 이 경우, 다중특이적 항체의 제2 특이성은, 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체 1과 같은 많거나 또는 모든 간 세포 상에 존재하는 에피토프일 수 있다. 그런 다음 이것은 γδ T-세포를 간에 공동 국재화할 것이며, 여기서 γδ T-세포는 건강한 간 세포를 보존하면서 간암 세포를 사멸시킬 수 있다. 이것은, 예를 들어, 도 25, I, J, K 및 도 38 A 내지 도 38f에 도시되어 있다. 제3의 비제한적인 예로서, 폐암 항원이 환자에서 알려져 있지 않은 폐암 환자에서, 다중특이적 항체의 제2 특이성은, 예를 들어, SP-1과 같은 정상 폐 세포 상의 에피토프에 대한 것일 수 있다. 이것은 γδ T-세포를 폐에 공동 국재화할 것이며, 여기서 γδ T-세포는 건강한 폐 세포를 보존하면서 폐암 세포를 사멸시킬 수 있다. 제4의 비제한적인 예로서, B 세포 림프종 항원이 환자에서 알려져 있지 않은 B 세포 림프종 환자에서, 다중특이적 항체의 제2 특이성은, 예를 들어, CD19와 같은 정상 B 세포 상의 에피토프에 대한 것일 수 있다 이것은 γδ T-세포를 B 세포에 공동 국재화할 것이며, 여기서 γδ T-세포는 건강한 B 세포를 보존하면서 림프종 세포를 사멸시킬 수 있다. 세포-특이적 항원, 세포-연관 항원, 조직-특이적 항원 및 조직-연관 항원은 당업계에 잘 알려져 있고 임의의 이러한 항원은 본 발명의 다중특이적 항체의 제2 특이성에 의해 표적화될 수 있다.
제2 결합 특이성은 Vδ1과 동일한 세포 또는 동일한 조직 유형 또는 상이한 조직 유형의 상이한 세포 상의 항원을 표적화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적 에피토프는 상이한 T-세포, B-세포, 종양 세포, 자가면역 조직 세포 또는 바이러스 감염된 세포를 포함한 상이한 세포 상에 존재할 수 있다. 대안적으로, 표적 에피토프는 동일한 세포 상에 존재할 수 있다.
다중특이적 항체, 또는 이의 단편은 항체, 또는 이의 단편이 다중 특이성을 갖는 한 임의의 포맷으로 만들어질 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 다중특이적(적합하게는 이중특이적) 항체는 적어도 2개의 결합 도메인인 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인을 포함한다. 제1 결합 도메인은 제1 표적 항원(또는 제1 표적 항원의 에피토프)에 결합 특이성을 부여하고, 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1 또는 TRDV1) 쇄의 에피토프이다. 제2 결합 도메인은 제2 표적 항원(또는 제2 표적 항원의 에피토프)에 결합 특이성을 부여한다. 제2 표적 항원은 암 항원 또는 암-연관 항원일 수 있거나, 제2 항원은 면역조절 항원일 수 있다.
다중특이적 항체 포맷의 예는 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 크로스맙(CrossMab), DAF(투인원(two-in-one)), DAF(포인원(four-in-one)), 듀타맙(DutaMab), DT-IgG, 놉인홀(Knobs-in-holes)(KIH), 놉인홀(공통 경쇄), 전하 쌍, Fab-아암 교환, 시드바디(SEEDbody), 트리오맙(Triomab), LUZ-Y, Fcab, κλ바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, 자이바디(Zybody), DVI-IgG(포인원), 나노바디, 나노바이-HAS, BiTE, 다이아바디, DART, TandAb, sc다이아바디, sc다이아바디-CH3, 다이아바디-CH3, 트리플 바디, 모리슨(Morrison) 포맷, 미니항체, 미니바디, TriBi 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab)2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc다이아바디-Fc, 다이아바디-Fc, 탠덤 scFv-Fc, 인트라바디, Dock 및 Lock, ImmTAC, HSAbody, sc다이아바디-HAS, 탠덤 scFv-독소, IgG-IgG, ov-X-바디, 듀오바디, mab2 및 scFv1-PEG-scFv2(Spiess 등 (2015) Molecular Immunology 67:95-106 참조).
본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편은 또한 이중특이적 또는 삼중특이적 포맷과 같은 다중특이적 포맷에서 향상된 기능성에 대한 능력을 측정함으로써 평가될 수 있다. 놀랍게도 이러한 연구를 통해 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편의 성능에서 추가의 기능적 개선을 식별하는 것이 가능하다(실시예 20 및 21 참조).
다양한 항체-유래 다중특이적 포맷은 이전에 기재되었고 전형적으로 구성요소 결합 부분으로부터 경험적으로 구축된다. 전형적으로, 일단 작제되면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 이러한 다중특이적 또는 다중-표적 결합 포맷의 성능은 전술된 모델 시스템(세포 사멸, 세포 증식, 건강한 세포 보존/병든 세포 특이적 모델 등) 중 하나 이상에서 측정될 수 있다. 선택적으로 이들은 또한 상기 성분 부분 및 다른 비교 분자와 비교된다.
이러한 접근법에 의해 제한되지는 않지만, 일반적으로 항체를 다중특이적 항체로서 작제할 때, 각 표적에 대한 결합 도메인 모듈(제1, 제2, 제3 등)은 scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 가변 도메인(예를 들어, VH 또는 VL), 다이아바디, 미니바디 또는 전장 항체로부터 선택적으로 작제된다. 예를 들어, 각각의 상기 결합 도메인 또는 모 듈은 하기 비제한적인 포맷 중 하나 이상에서 생성되며, 여기서 가변 도메인 및/또는 전장 항체, 및/또는 항체 단편을 포함하는 결합 도메인은 연속적으로 작동 가능하게 연결되어 다중특이적 항체를 생성한다.
두드러지게, 본 명세서에 기재된 바와 같은 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 적어도 하나의 (제1) 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체는 상기 제1 결합 도메인이 조직("고체") 및 조혈("액체") 질환 또는 세포-유형 연관 표적에 대한 적어도 하나의 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체 포맷으로 포맷화될 때 추가로 향상된다.
다중특이적 항체 - 비제한적인 예:
접근법의 적용 가능성을 설명하기 위해, 비제한적인 다중특이적 항체 예의 시리즈를 작제하였다. 이들 다중특이적 항체는 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 적어도 하나의 (제1) 결합 도메인 및 질환 연관 표적을 표적화하는 적어도 하나의 (제2) 결합 도메인을 포함하였다:
제1 예; Vδ1-EGFR 다중특이적 항체:
이 예의 경우, (제1 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제2 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 생성된 이중특이적 포맷은 때때로 '모리슨 포맷'이라고 불린다. 이 경우에서 제1 결합 도메인은 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하고 제2 결합 도메인은 EGFr을 표적화한다(실시예 20 참조).
제2 예; Vδ1-EGFR 다중특이적 항체:
이 예의 경우, (제1 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 항체 가변 도메인(구체적으로 VH 및 동족 VL 도메인 포함)을 포함하는 반면 (제2 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 중쇄 불변 도메인(CH1-CH2-CH3) 내에 결합 도메인을 포함한다(또한 EP2546268 A1 표 1/EP3487885 A1 참조). 생성된 이중특이체는 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제1 결합 도메인 및 EGF 수용체를 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함한다(실시예 20 참조).
제3 예; Vδ1-CD19 다중특이적 항체:
이 예의 경우, (제1 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제2 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 이 예의 경우, 생성된 이중특이체는 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제1 결합 도메인 및 CD19를 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함하였다(실시예 21 참조).
제4 예; 추가 Vδ1-CD19 다중특이적 항체
이 예의 경우, TRDV1 및 CD19 둘 다에 특이적으로 결합하는 추가적인 다중특이적 항체를 제조하였고, 항원 결합(인간 및 cyno-TRDV1 둘 다 포함), Vδ1-세포 활성화 및 Vδ1-세포 세포독성에 대해서 시험하였다(실시예 22 및 실시예 23 참조).
제5 예; Vδ1-Her2 다중특이적 항체
이 예의 경우, TRDV1 및 Her2 둘 다에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체를 제조하였고, 항원 결합, Vδ1-세포 활성화 및 Vδ1-세포 세포독성에 대해서 시험하였다(실시예 24 참조).
제6 예; 추가적인 Vδ1-EGFR 다중특이적 항체
이 예의 경우, TRDV1 및 EGFR 둘 다에 특이적으로 결합하는 추가적인 다중특이적 항체를 제조하였고, 항원 결합, Vδ1-세포 활성화 및 Vδ1-세포 세포독성에 대해서 시험하였다(실시예 26 및 실시예 27 참조).
제7 예; Vδ1-FAPα 다중특이적 항체
이 예의 경우, (제1 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제2 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 이 예의 경우, 생성된 이중특이체는 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제1 결합 도메인 및 FAPα를 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함하였다(실시예 29 참조).
제8 예; Vδ1-메소텔린 다중특이적 항체
이 예의 경우, (제1 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제2 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 이 예의 경우, 생성된 이중특이체는 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제1 결합 도메인 및 메소텔린을 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함하였다(실시예 30 참조).
제9 예; Vδ1-PD-1 다중특이적 항체
이 예의 경우, (제2 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제1 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 이 예의 경우, 이중특이체는 PD-1을 표적화하는 제1 결합 도메인 및 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함하였다(실시예 32 참조).
제10 예; Vδ1-4-1BB 다중특이적 항체
이 예의 경우, (제1 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제2 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 이 예의 경우, 생성된 이중특이체는 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제1 결합 도메인 및 4-1BB를 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함하였다(실시예 33 참조).
제11 예; Vδ1-OX40 다중특이적 항체
이 예의 경우, (제1 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제2 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 이 예의 경우, 생성된 이중특이체는 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제1 결합 도메인 및 OX40을 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함하였다(실시예 34 참조).
제12 예; Vδ1-TIGIT 다중특이적 항체
이 예의 경우, (제2 표적에 대한) 하나의 결합 도메인은 온전한 항체 모이어티; 구체적으로, VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 파트너를 포함하는 반면, (제1 표적에 대한) 제2 결합 도메인은 항체 단편; 구체적으로, scFv 포맷을 포함하였다. 그런 다음 2개의 결합 모듈을 링커의 도움으로 융합하였다. 이 예의 경우, 이중특이체는 TIGIT을 표적화하는 제1 결합 도메인 및 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 제2 결합 도메인을 포함하였다(실시예 35 참조).
두드러지게 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 적어도 하나의 (제1) 결합 도메인 및 제2 에피토프를 표적화하는 적어도 하나의 제2 도메인을 포함하는 모든 상기 예에서 대조군 및 성분 부분에 비해 향상된 기능성이 관찰되었다(본 명세서의 실시예 20 및 35 참조).
종합하면, 이들 비제한적인 예는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 유연성을 강조한다. 이들 비제한적인 예는 생식계열 Vδ1 쇄(서열번호 1의 아미노산 1-90)를 표적화하는 이의 단편의 항체가 제2 결합 도메인과 조합하여 다중특이적 항체를 형성함으로써 추가로 향상될 수 있다는 다중특이적 항체 접근법을 설명한다. 비제한적인 예로서, 기능성이 향상되고 온전한 항체를 포함하는 결합 도메인(VH-CH1-CH2-CH3 및 VL-CL), 및/또는 가변 도메인(VH 및 동족 VL 또는 VH-CH1 및 동족 VL-CL), 및/또는 항체 단편(scFv)을 함유하는 다중특이적 항체가 본 명세서에 제공된다.
일 실시형태에서 γδ TCR의 Vδ1 쇄(제1 표적)를 표적화하는 다중특이적 항체 결합 도메인은 (i) 각각이 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3) 및 동족 경쇄 파트너(VL-CL)를 포함하는 1 또는 2개 또는 그 초과의 항체 결합 도메인 및/또는 (ii) 각각이 중쇄 가변 도메인(VH, 또는 VH-CH1) 및 동족 경쇄 가변 도메인 파트너(VL, 또는 VL-VC)를 포함하는 1 또는 2개 또는 그 초과의 항체 결합 도메인 및/또는 (iii) 각각이 CDR-함유 항체 단편을 포함하는 1 또는 2개 또는 그 초과의 항체 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서 γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 적어도 하나의 제1 항체-유래 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체가 제공되며 이는 제2 에피토프를 표적화하는 적어도 하나의 제2 항체 결합 도메인에 작동 가능하게 연결된다. 선택적으로, 상기 결합 도메인은 적어도 하나 이상의 VH 및 동족 VL 결합 도메인, 또는 하나 이상의 VH-CH1-CH2-CH3 및 동족 VL-CL 결합 도메인, 또는 하나 이상의 항체 단편 결합 도메인을 포함한다. 선택적으로, 상기 제2 결합 도메인은 세포의 세포 표면 상에서 발현되거나 또는 이와 회합된 제2 에피토프를 표적화한다. 선택적으로, 상기 제2 에피토프는 병든 세포 또는 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포 또는 자가면역 조직 세포와 회합된 세포 표면 폴리펩타이드 상에 위치한다. 선택적으로, 상기 제2 에피토프 또는 에피토프들은 병든 및 세포-유형 연관 CD19, EGFR, Her2, FAPα, 메소텔린, PD-1, 4-1BB, OX40 또는 TIGIT 항원에 위치한다. 선택적으로, γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 적어도 하나의 제1 항체-유래 결합 도메인을 포함하는 상기 다중특이적 항체는 EGF 수용체에 결합하고 EU 명명법에 따라 하기 중쇄 변형 중 하나 이상을 포함하는 제2 결합 도메인에 작동 가능하게 연결된다: L358T 및/또는 T359D 및/또는 K360D 및/또는 N361G 및/또는 Q362P 및/또는 N384T 및/또는 G385Y 및/또는 Q386G 및/또는 D413S 및/또는 K414Y 및/또는 S415W 및/또는 Q418Y 및 또는 Q419K.
선택적으로, γδ TCR의 Vδ1 쇄를 표적화하는 적어도 하나의 제1 항체-유래 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체는 서열번호 147 또는 서열번호 148 또는 서열번호 149 또는 서열번호 157 또는 이의 기능적으로 동등한 결합 변이체를 포함하는 제2 결합 도메인에 작동 가능하게 연결되고 EGFR, CD19, Her2, FAPα, 메소텔린, PD-1, 4-1BB, OX40 또는 TIGIT를 표적화한다. 선택적으로, 생성된 다중특이적 항체는 서열번호 140 또는 서열번호 141 또는 서열번호 142 또는 서열번호 144 또는 서열번호 145 또는 서열번호 146 또는 서열번호 158 또는 서열번호 159를 포함한다. 상기 엔티티는 이해를 돕기 위해 비제한적인 신규 조성물로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 일 양상에서 본 발명의 다중특이적 항체는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 개선하도록 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량으로 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, γδ TCR의 Vδ1 쇄에 다중특이적 항체 포맷으로 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공되며 여기서 상기 다중특이적 항체는 상 기 다중특이적 개체 Vδ1+ 세포에 의해 부여된 효과(예를 들어, 상기 Vδ1+ 표현형 및/또는 세포독성 및/또는 병든 세포 특이성 및/또는 이의 향상에 대해)를 측정하기 위해 Vδ1+ 세포에 적용된다.
면역접합체
본 발명의 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 치료 모이어티, 예컨대, 세포독소 또는 화학치료제에 접합될 수 있다. 이러한 접합체는 면역접합체로 지칭될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "면역접합체"는 또 다른 모이어티, 예컨대, 세포독소, 방사성제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 독소, 펩타이드 또는 단백질 또는 치료제에 화학적으로 또는 생물학적으로 연결된 항체를 지칭한다. 항체는 표적에 결합할 수 있는 한 분자를 따라 임의의 위치에서 세포독소, 방사성제, 사이토카인, 인터페론, 표적 또는 리포터 모이어티, 효소, 독소, 펩타이드 또는 치료제에 연결될 수 있다. 면역접합체의 예는 항체 약물 접합체 및 항체-독소 융합 단백질을 포함한다. 일 실시형태에서, 작용제는 Vδ1에 대한 제2의 상이한 항체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 종양 세포 또는 바이러스 감염된 세포에 특이적인 제제에 접합될 수 있다. 항-Vδ1 항체에 접합될 수 있는 치료 모이어티의 유형은 치료될 병태 및 달성될 원하는 치료 효과를 고려할 것이다. 일 실시형태에서, 작용제는 Vδ1 이외의 분자에 결합하는 제2 항체, 또는 이의 단편일 수 있다.
γδ T 세포를 조절하기 위한 의약
본 명세서에 기재된 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 TRDV1-결합 도메인을 통해, 동일계(즉, 생체내)에서 환자의 델타 가변 1 쇄(Vδ1) T 세포를 조절하는 데 사용되거나 조절하는 데 유용할 수 있다. 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 이러한 목적을 위한 의약에 포함될 수 있다.
Vδ1 T 세포의 조절은 다음을 포함할 수 있다:
- 예를 들어, Vδ1 T 세포의 수를 선택적으로 증가시키거나 또는 Vδ1 T 세포의 생존을 촉진함으로써 Vδ1 T 세포의 확장;
- 예를 들어, Vδ1 T 세포 효력 증가, 즉, 표적 세포 사멸을 증가시킴으로써 Vδ1 T 세포의 자극;
- 예를 들어, Vδ1 T 세포의 지속성을 증가시킴으로써 Vδ1 T 세포 고갈 방지;
- Vδ1 T 세포의 탈과립화;
- NCR 발현의 증가;
- 예를 들어, Vδ1 TCR 세포 표면 발현의 하향조절에 의해서, 즉, Vδ1 TCR 내재화 또는 Vδ1 TCR 단백질의 감소된 발현을 유발하거나, 또는 Vδ1 TCR의 결합을 차단함으로써 Vδ1 T 세포의 면역조절; 및/또는
- TCR/CD3 복합체의 하향조절
Vδ1 T-세포의 고갈에 초점을 맞춘 선행 기술의 항-Vδ1 항체와 달리, 본 발명의 다중특이적 항체는 TRDV1-결합 도메인을 통한 Vδ1 T-세포의 활성화에 유용하다. 이들은 그들이 결합하는 T-세포에서 TCR의 하향 조절을 유발할 수 있지만, 이들은 Vδ1 T-세포 고갈을 유발하지는 않고 오히려 이들은 T-세포를 자극하므로 T-세포의 이러한 구획의 활성화로이부터 이익이 될 치료 설정에 유용할 수 있다. Vδ1 T-세포의 활성화는 TCR 하향조절, CD3 하향조절, CD25 및 Ki67과 같은 활성화 마커의 변화 및 탈과립 마커 CD107a를 통해 명백하다. 그 다음 Vδ1 T-세포의 활성화는 INFγ 및 TNFα와 같은 염증성 사이토카인의 방출을 유발하여 면역 라이센스를 촉진한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 다음을 특징으로 하는 다중특이적 항-Vδ1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다:
a. Vδ1 T-세포에서 TCR의 하향조절을 유발함;
b. CDC 또는 ADCC를 나타내지 않음;
c. Vδ1 T 세포를 고갈시키지 않음.
일부 실시형태에서, 다중특이적 항-Vδ1 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 Vδ1 T-세포 증식을 자극한다.
T-세포 고갈은 T 세포 사멸 제거 또는 감소 과정이다. Vδ1 T 세포를 고갈시키지 않는 다중특이적 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 언급은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체 중 하나 이상에 의해서 인큐베이션되는 경우 그리고 제어된 연구에서 임의의 적합한 수단을 통해(예를 들어, 제어된 유세포 분석법 방법론을 통해 또는 다른 확립된 제어된 검정을 통해) 측정되는 경우 생존 가능한 Vδ1 T+ 세포 집단의 약 30% 미만 또는 약 20% 미만(바람직하게는 약 10% 미만)의 고갈을 지칭한다.
ADCC 및 CDC는 T-세포 고갈이 발생할 수 있는 기전이다. ADCC 또는 CDC를 유발하지 않는 본 명세서에서의 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 언급은 임의의 적합한 수단을 통해(예를 들어, 제어된 유세포 분석법 방법론을 통해 또는 다른 확립된 제어된 검정을 통해) 측정되는 경우 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체 중 하나 이상에 의해서 인큐베이션되는 경우 ADCC 및/또는 CDC를 통한 생존 가능한 Vδ1 T+ 세포 집단의 약 30% 미만 또는 약 20% 미만(바람직하게는 약 10% 미만)의 고갈을 지칭한다.
일 실시형태에서, IL-17A의 분비를 유도하지 않는 것을 특징으로 하는 다중특이적 항-Vδ1 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. IL-17A(인터류킨-17A)는 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 전종양형성(pro-tumorigenic) 사이토카인이다. IL-17A는 종양 성장을 향상시키고 항암 면역 반응을 약화시킬 수 있다. 도 38, G 내지 I에 나타낸 바와 같이, 항-vδ1 항체는 IL-17A의 분비를 유도하지 않는 반면, 항-CD3 항체는 유도한다. 본 명세서에서 IL-17A의 분비를 유도하지 않는 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 언급은 동등한 CD3 다중특이적 항체에 의해 유도된 IL-17A 분비의 약 30% 미만, 또는 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만을 유도하는 것을 지칭한다.
다음 섹션 중 일부는 단일특이적 포맷으로 제공되는 항-Vδ1 항체에 관한 것으로, 다중특이적(적절하게는 이중특이적) 형식에서의 사용이 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 적합하게는, 단일특이적 포맷으로 제공될 때 항체의 기능적 특성은 추가로 제2 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 다중특이적 항체에 의해 공유된다.
Vδ1+ 세포 상에서 면역 세포 마커를 조절하는 의약
다중특이적 항체 또는 이의 단편은 환자에게 투여 시 Vδ1+ 세포의 면역 세포 마커를 조절할 수 있다.
본 명세서에 기재된 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 γδ T 조절을 측정함으로써 치료 용도에 대한 적합성에 대해 평가될 수 있고, 이러한 측정은 항체가 단일특이적 포맷으로 제공되는 경우 수행될 수 있다. 예를 들어, 모델 시스템에서 Vδ1+ T-세포 또는 세포들에 존재하는 CD25 또는 CD69 또는 CD107a 수준의 변화를 측정함으로써. 이러한 마커는 종종 림프구 조절(예를 들어, 증식 또는 탈과립화)의 마커로 사용되고 예를 들어, 유세포 분석법에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편의 적용 후 측정될 수 있다. 놀랍게도, 이러한 평가 동안(예를 들어, 실시예 7, 17, 18 참조) 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체는 표적 δ1+ T-세포에 대한 측정 가능하게 더 높은 수준의 CD25 또는 CD69 또는 CD107a 수준을 부여하는 것으로 관찰되었다. 선택적으로, 모델 시스템에서 시험된 Vδ1+ 세포 또는 이의 집단의 표현형의 변화는 이어서 대체 비교 항체(예를 들어, OKT-3, TS8.2 등)가 상기 동등한 γδ T 세포에 적용될 때 표현형의 변화와 비교될 수 있다.
따라서 본 발명의 일 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 투여하는 단계 및 Vδ1+ 세포의 표면 상에서 CD25 및/또는 CD69 및/또는 CD107a의 수준에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함하는, 치료 용도를 위한 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. CD25, CD69 및/또는 CD107a의 수준에 대한 효과는 일정 기간 동안 결정/측정될 수 있다. 효과는 상기 항체가 동일한 일정 기간 동안 상기 세포에 적용되지 않을 때 Vδ1+ 세포의 표면 상의 CD25 및/또는 CD69 및/또는 CD107a 수준과 비교하여 측정될 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 첨가한 다음 상기 Vδ1+ 세포의 표면 상의 CD25 또는 CD69 또는 CD107a의 수준(또는 발현)을 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
Vδ1+ 세포의 성장 특성 또는 수를 조절하는 의약
다중특이적 항체 또는 이의 단편은 환자에게 투여 시 Vδ1+ 세포의 성장 특성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 Vδ1+ 세포를 확장시킬 수 있다.
γδ T 증식을 측정하기 위한 대안적인 접근법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이 상기 세포를 함유하는 모델 시스템에 적용될 때 시간 경과에 따라 Vδ1+ 세포의 상대적 수의 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 놀랍게도, 이러한 평가 동안 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 상기 Vδ1+ T-세포의 수를 측정 가능하게 증가시킬 수 있는 단일특이적 포맷으로 제공되는 경우가 관찰되었다(예를 들어, 실시예 10, 17 및 18 참조). 선택적으로 이러한 수의 변 화는 이어서 대체 비교 항체(예를 들어, 항-OKT3)가 상기 모델 시스템에 적용될 때 관찰된 수의 변화와 비교될 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 투여하는 단계 및 집단에서 Vδ1+ 세포의 수에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함하는, γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 세포 수에 대한 효과는 일정 기간 동안 결정/측정될 수 있다. 효과는 상기 항체가 동일한 일정 기간 동안 세포 집단에 적용되지 않을 때 관찰된 세포 수에 대한 효과와 비교하여 측정될 수 있음이 이해될 것이다. 본 발명의 추가의 양상에서, 상기 항체를 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 적용한 다음 시간경과에 따라 상기 세포의 수를 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
Vδ1+ 세포의 증식 능력 및 수를 조절하는 의약
γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 이상적인 치료용 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 생체내에서 V δ1+ 세포의 증식을 향상시킬 수 있는 것일 수 있다. 그런 다음 이러한 항체는 대상체 또는 환자에서 V δ1+ 세포 수를 특이적으로 증가시키도록 설계된 의약으로서 이용될 수 있다. 예를 들어:
암:
Vδ1+ 세포 수의 상대적 증가는 많은 암에 대한 개선된 결과와 연관된 긍정적인 예후 지표로서 보고되었다(예를 들어, 문헌[Gentles et al (2015) Nature Immunology 21: 938-945; Wu et al. (2019) Sci. Trans. Med. 11(513): eaax9364; Catellani et al. (2007) Blood 109(5): 2078-2085] 참조). 일 실시형태에서, 본 명세서에는 암 환자에서 동일계에서 Vδ1+ 세포의 상대 또는 절대 수치를 증가시킬 수 있는 의약이 제공된다.
병원체/기생충/바이러스 감염:
Vδ1+ 세포 풍부화는 수많은 후천적 병원체/기생충/바이러스 감염에 대한 숙주 방어 동안 관찰된다. 최근 일반적인 검토에 대해서는 문헌[Zhao et al. (2018) Immunol. Res. 2018:5081634]을 참조한다. 또한, 증가된 수의 Vδ1+는 또한 다양한 DNA 및 RNA 바이러스 감염에 대해 보호하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 증가된 수는 또한 동종이계 이식과 연관된 CMV 감염 동안 보호하는 것으로 간주된다(문헌[van Dorp et al. (2011) Biology of Blood and Marrow Transplantation 17(2): S217] 참조). 추가적으로, Vδ+ 세포 수는 코로나바이러스 감염 환자에서 증가한다(Poccia et al. (2006) J. Infect. Dis. 193(9): 1244-1249).
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 병원체 감염을 보유하는 대상체 또는 환자에서 Vδ1+ 세포의 상대 또는 절대 수를 증가시킬 수 있는 의약이 제시된다.
줄기 세포 이식:
증가된 수의 Vδ1+ 세포는 또한 일반적으로 조혈 줄기 세포 이식 동안 더 적은 질환 재발, 더 적은 바이러스 감염, 더 높은 전체 및 무질환 생존 및 선호하는 임상 결과와 연관되었다(예를 들어, 문헌[Aruda et al. (2019) Blood 3(21): 3436-3448 및 Godder et al. (2007) Bone Marrow Transplantation 39: 751-757] 참조). 따라서 또 다른 실시형태에는, 줄기 세포 이식을 지원하는 치료 요법의 일부로서 대상체에서 Vδ1+ 세포의 상대 또는 절대 수를 증가시킬 수 있는 의약이 본 명세서에 제시된다.
결과적으로, 동일계에서 Vδ1+ 세포의 수를 우선적으로 또는 특이적으로 증가시킬 수 있는 의약이 매우 바람직하다.
Vδ1+ 세포 사이토카인 분비를 유지하거나 또는 유도하거나 또는 증가시키는 의약
사이토카인은 면역계의 특이적 세포에 의해 분비되는 단백질, 펩타이드 또는 당단백질의 큰 그룹이다. 이들은 면역, 염증, 및 조혈을 매개하고 조절하는 신호전달 분자의 범주이다. 다수의 사이토카인은 종양 및 세포 미세환경, 자가면역 조직 및 연관된 미세환경, 또는 바이러스 감염된 조직 또는 세포 환경의 직접 또는 간접 조절을 통해 질환의 징후 및 증상을 개선하는 것과 관련되어 있다. 본보기 전염증성 사이토카인은 종양 괴사 인자-알파(TNFα) 및 인터페론-감마(IFNγ)를 포함한다.
그러나, 많은 이러한 사이토카인은 전신으로 투여될 때 바람직하지 않은 독성을 나타낸다. 예를 들어, TNFα는 이식된 종양의 출혈성 괴사를 유도할 수 있고, 다른 화학요법 약물과 조합될 때 상승적인 항-종양 효과를 발휘하는 것으로 보고된 반면, 전신 재조합 인간 TNFα(rhTNFα)를 사용한 다양한 임상 시험은 저혈압, 오한, 정맥염, 혈소판감소증, 백혈구감소증 및 간독성, 발열, 피로, 메스꺼움/구토, 권태감 및 허약, 두통, 흉부 압박, 요통증, 설사 및 숨가뿜을 포함한 상당한 용량 제한 부작용을 강조하였다.
재조합 IFNγ의 사용은 또한 유사한 전신 독성 과제에 직면한다. 예를 들어, 암 환경에서 IFNγ는 항-종양 면 역을 자극하고, T-세포 침윤을 증가시키고, 항-혈관형성 효과를 부여하고, 케모카인/사이토카인 분비를 유도하고, 직접 암 세포 항-증식 효과를 발휘하는 MHC 클래스 I 및 II 상향조절을 포함한 유리한 다면발현성 효과를 발휘할 수 있는 반면, 유해한 부작용이 또한 관찰된다. 이들은 열, 두통, 오한, 피로, 설사, 메스꺼움, 구토, 식욕부진, 간의 아미노기 전이효소의 일시적 증가, 및 과립구 및 백혈구 계수의 일시적 감소를 포함한다.
전신 재조합 TNFα 및 IFNγ의 잠재력 및 한계 모두에 대한 최근 검토를 위해서 문헌[Shen et al. (2018) 세포 Prolif. 51(4): e12441]을 참조한다.
따라서 이러한 사이토카인의 동일계에서 더 많이 제어되고 더 많이 국재화된 더 많은 조직 또는 세포 특이적 생산이 필요하다. 예를 들어, 전염증성 사이토카인의 더 많이 제어된 발현 또는 유도는 한 가지 접근법으로 제안되며 이에 의해 "차가운" 종양은 "뜨거운" 종양으로 전환될 수 있다. 뜨거운 종양은 또한 관찰된 CD45+ T- 세포의 수 또는 밀도의 증가로 인해 또한 때때로 "T-세포-염증성"이라고 불린다. 최근 검토를 위해 문헌[Bonaventura et al. (2019) Front. Immunol. 10: 168]을 참조한다.
이러한 이유로, γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 이상적인 치료용 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 생체내에서 Vδ1+ 세포의 사이토카인 분비를 유지하거나 또는 향상시키거나 또는 유도할 수 있는 것일 수 있다. 그런 다음 이러한 항체는 더 많이 국재화된 덜 전신적 방식으로 대상체 또는 환자에서 사이토카인을 특이적으로 증가시키거나 또는 유도하도록 설계된 약제 및 상기 대상체 또는 환자에서 Vδ1+세포의 분포와 더 나은 상관관계가 있는 의약으로서 이용될 수 있다.
두드러지게, γδ TCR의 Vδ1에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체의 단일특이적 버전이 Vδ1+ 세포에 적용될 때, 상당히 더 높은 수준의 분비된 사이토카인이 관찰된다. 보다 구체적으로, 그리고 비제한적인 예로서, 상당히 더 높은 수준의 TNFα 및 IFNγ가 관찰된다. 예를 들어, 실시예 15를 참조한다.
따라서 본 발명의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 투여하는 단계 및 세포 집단에 의해 생성된 적어도 하나의 사이토카인의 양을 결정하는 단계를 포함하는, γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 생성된 사이토카인의 양은 일정 기간 동안 결정/측정되고 선택적으로 상기 항체가 동일한 일정 기간 동안 세포 집단에 적용되지 않을 때 관찰된 양과 비교될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체가 세포 집단에 투여될 때 생성된 사이토카인의 관찰된 수준은 항체가 적용되지 않을 때 생성된 사이토카인의 수준에 비해, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 50% 초과, 약 100% 초과, 약 150% 초과, 약 200% 초과, 약 250% 초과, 약 300% 초과, 약 350% 초과, 약 400% 초과, 약 450% 초과, 약 500% 초과, 약 1000% 초과이다. 본 발명의 추가의 양상에서, 사이토카인은 전염증성 사이토카인이다 본 발명의 추가의 양상에서, 사이토카인은 TNF-α 사이토카인이다. 본 발명의 추가의 양상에서, IFN-γ 사이토카인이다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 항체를 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 적용한 다음 생성된 적어도 하나의 사이토카인의 수준을 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다. 본 발명의 추가의 양상에서 측정된 사이토카인은 TNF-α 사이토카인 및/또는 IFN-γ 사이토카인이다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 적용하고 생성된 전염증성 사이토카인의 양 및/또는 종양 또는 종양 미세환경에 존재하는 CD45+ T-세포의 수 또는 밀도를 결정함으로써 더 차갑거나 또는 차가운 종양이 더 뜨겁거나 또는 뜨거운 종양이 되도록 조절하는 것에 대한 항체의 효과를 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다.
Vδ1+ 세포 그랜자임 B 활성을 유지하거나 또는 유도하거나 또는 증가시키는 의약
그랜자임 B는 자연 살해 세포(NK 세포) 및 세포독성 T 세포의 과립에서 일반적으로 발견되는 세린 프로테아제이다. 이는 표적 세포, 예컨대, 병든 세포에서 아폽토시스를 매개하기 위해 기공 형성 단백질 퍼포린과 함께 이들 세포에 의해 분비된다.
Vδ1+ 세포가 모델 시스템에서 표적 병든 세포(예컨대, 암 세포)와 공배양물에서 인큐베이션될 때, 그랜자임 B 수준 및 활성의 수준은 용해에 앞서 표적 병든 세포에서 측정될 수 있다. 두드러지게 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이 이어서 이러한 모델 시스템에서 Vδ1+ 세포 및 암 세포의 이러한 공배양물에 적용될 때, 더 높은 그랜자임 B 수준 및 활성은 이어서 세포 사멸에 앞서 병든 암 세포에서 관찰된다(실시예 16 참조).
따라서 본 발명의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포 및 병든 세포(예컨대, 암 세포)를 포함하는 공배양물에 투여하는 단계 및 공배양물에서 병든 세포에 의해 생성된 그랜자임 B의 양에 대한 효과를 측정하는 단계를 포함하는, γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 생성된 사이토카인의 양은 일정 기간 동안 결정/측정되고 선택적으로 상기 항체가 동일한 일정 기간 동안 상기 공배양물에 적용되지 않을 때 관찰된 양과 비교될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 항체가 상기 공배양물에 적용될 때 측정된 그랜자임 B의 수준은 상기 항체가 적용되지 않았을 때 관찰된 그랜자임 B 수준에 비해, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 약 100% 초과, 약 200% 초과이다.
본 발명의 추가의 양상에서, 상기 항체를 Vδ1+ 세포 및 병든 세포를 포함하는 공배양물에 적용한 다음 병든 세포에서 그랜자임 B의 양 또는 활성을 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
다클론성 Vδ1+ 세포 집단을 확장시키는 의약
이상적인 다중특이적 항체 의약은 또한 확장 Vδ1+ 세포가 초가변 CDR3 서열 수준에서 너무 클론적으로 집중되지 않도록 설계된 것일 수 있다. 따라서 이상적인 항체 의약은 특이적 또는 '개별' δ1+ CDR3 서열 파라토프에 결합함으로써 Vδ1+ 세포 증식을 유도하는 것을 피하도록 설계될 수 있다. 오히려, 항체는 Vδ1+ 세포의 하위세트에만 제시된 서열에 결합하기 보다는, 모든 Vδ1+ T 세포 수용체 상에 존재하는 보존된 생식계열 서열을 통해 감마-쇄 독립적 방식으로 결합할 수 있다.
따라서 이상적인 항체 의약은 확장 Vδ1+ 세포를 자극하여 CDR3 서열의 혼합물을 함유하는 복수의 Vδ1+ 세포를 생성할 수 있다. 이는 차례로 델타 가변 1 쇄 상에서 상이한 CDR3 서열을 나타내는 Vδ1+ 세포의 생체내 확장된 이종 다클론성 집단을 초래할 것이다. 두드러지게, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포를 함유하는 면역 세포의 시작 집단에 첨가하는 방법에 의해 생성된 확장된 Vδ1+ 세포 집단의 분석 동안, 광범위한 다클론성은 추출된 RNA의 CDR3 초가변 영역을 통해 서열분석하도록 설계된 RNAseq 기반 방법론에 의해 관찰된다(실시예 10 참조).
일 양상에 따르면, 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포를 포함하는 세포 집단에 투여하고 확장된 Vδ1+ 세포의 다클론성을 결정하는 단계를 포함하는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 항체 의약이 복수의 Vδ1+ CDR3 서열을 함유하는 확장된 다클론성 집단을 생성하는 것이 바람직하다. 다클론성은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여, 예컨대, 상기 Vδ1+ 세포의 Vδ1 쇄 초가변 CDR3 함량을 분석할 수 있는 핵산 서열분석 접근법에 의해 결정될 수 있다.
연장된 기간 동안 다클론성 Vδ1+ 세포를 확장시키는 의약
이상적인 다중특이적 항체 의약은 생체내에서 이러한 세포를 고갈시키지 않고 1차 Vδ1+ 세포의 증식을 향상시키거나 또는 촉진하거나 또는 자극할 수 있다. 예를 들어, 비교를 위해, OKT3(예를 들어, 무로노맙)과 같은 항- CD3 의약은 CD3 양성 T-세포를 확장시킬 수 있지만 또한 무반응을 고갈시키거나 또는 유도할 수 있다. 생존 가능한 Vδ1+ 세포의 지속적인 세포 분열을 구동하기 위해 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하고 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체의 능력을 평가하기 위해, 단일특이적 항체를 사용하여 장기간 증식 연구가 수행되었다. 두드러지게 이러한 연구는 γδ TCR의 V δ1 쇄에 결합하고 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체가 40일 초과 동안 생존 가능하고 여전히 기능적으로 세포독성인 Vδ1+ 세포의 세포 분열/증식을 구동할 수 있다는 것을 드러내었다(실시예 10 참조).
일 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편을 세포 집단에 적용하고 Vδ1+ 세포 분열이 발생하는 시간 길이를 모니터링하는 단계를 포함하는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 이상적으로, 항체는 5 내지 60일, 예컨대, 적어도 7 내지 45일, 7 내지 21일, 또는 7 내지 18일의 기간 동안 V δ1+ 세포 분열을 자극할 수 있다.
추가의 실시형태에서, γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하고 환자에게 투여될 때 Vδ1+ 세포 분열을 자극하여 수를 적어도 2-배, 수를 적어도 5-배, 수를 적어도 10-배, 수를 적어도 25-배, 수를 적어도 50-배, 수를 적어도 60-배, 수를 적어도 70-배, 수를 적어도 80-배, 수를 적어도 90-배, 수를 적어도 100-배, 수를 적어도 200-배, 수를 적어도 300-배, 수를 적어도 400-배, 수를 적어도 500-배, 수를 600-배, 적어도 수를 1,000-배 증가시킬 수 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다.
본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 Vδ1+ 세포 또는 Vδ1+ 세포를 함유하는 혼합 세포 집단에 적용한 다음 시간 경과에 따라 Vδ1+ 세포 수를 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
Vδ1+ 면역 세포 표적화를 통해 비-Vδ1+ 면역 세포를 조절하는 의약
본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 다른 면역 세포의 Vδ1+ 세포 매개 조절을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 비-γδ T 세포 '분획'에서 관찰된 변화는 인간 조직 αβ 세포 및 γδ T 세포를 포함하는 것과 같은 면역 세포의 혼합 집단을 포함하는 모델 시스템에 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편의 적용 후 측정될 수 있다. 또한, 상기 모델에서 비-γδ 세포 유형에 대한 효과는 유세포 분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, γδ T 세포 및 비-γδ T 세포를 포함하는 혼합 배양물에 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편의 첨가 시 CD8+ αβ T 세포 수의 상대적 변화를 측정함으로써. 선택적으로, 비-γδ T-세포 CD8+ 림프구 집단의 수 또는 표현형에서 관찰된 변화는 이어서 대체 비교 항체(예를 들어, OKT-3)가 상기 혼합 집단에 적용될 때 수의 변화와 비교될 수 있다
따라서 본 발명의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포 및 Vδ1-음성 면역 세포를 포함하는 면역 세포 또는 조직의 혼합 집단에 투여하고 Vδ1-음성 면역 세포에 대한 효과를 측정하는 단계를 포함하는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 효과는 일정 기간 동안 결정/측정되고 선택적으로 상기 항체가 동일한 일정 기간 동안 적용되지 않을 때 Vδ1-음성 세포에서 관찰된 효과와 비교될 수 있다. 효과는 Vδ1-음성 면역 세포 수의 변화로서 측정될 수 있다. 예를 들어, 항체는 Vδ1-음성 면역 세포 수를 상기 항체가 적용되지 않았을 때 관찰된 수준에 비해, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 약 100% 초과, 약 500% 초과로 증가시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에서 조절된 Vδ1-음성 세포는 CD45+ 세포이다. 본 발명의 추가의 양상에서 조절된 세포는 αβ T-세포이다. 본 발명의 추가의 양상에서 조절된 αβ+ 세포는 CD8+ 림프구이다. 본 발명의 추가의 양상에서 조절된 αβ T-세포, 또는 이의 집단은 향상된 세포 분열의 증거를 나타낸다. 본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 Vδ1+ 세포 및 Vδ1-음성 면역 세포를 포함하는 혼합 면역 세포의 집단에 투여한 다음 상기 항체 또는 이의 단편에 의해 조절된 Vδ1+ 세포에 의해 Vδ1-음성 세포 집단에 부여된 효과를 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
선택적으로, 그리고 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편에 의해 부여된 바와 같은 "Vδ1+ 세포 매개 면역계 조절" 동안, Vδ1+ 세포 수의 동반 증가가 또한 관찰된다. 이 이론에 얽매이지 않지만, Vδ1+ 세포 수의 상기 증가는 동시 존재 Vδ1-음성 면역 세포, 예컨대, αβ T-세포의 동반 확장을 구동하는 데 있어서 원인일 수 있다는 것이 가능성이 있다. 대안적인 가설은 Vδ1+ T 세포로부터의 항체-유도된 사이토카인 분비가 Vδ1-음성 면역 세포의 확장을 자극한다는 것일 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에서 αβ+ CD8+ 림프구 집단에서 관찰된 증가는 비교 항체 예컨대, OKT3 항체 또는 대안적인 항-Vδ1 항체와 비교된다. 본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 Vδ1+ T-세포 및 αβ T-세포를 포함하는 혼합 면역 세포의 집단에 적용한 다음 시간 경과에 따라 CD8+ αβ+ T-세포 림프구의 수를 측정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
종양 침윤 림프구(TIL)를 조절하는 의약
본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 모델 시스템에서 종양-침윤 집단(TIL)에 대해 부여된 효과를 측정함으로써 평가될 수 있다. 놀랍게도(실시예 18 참조) 이러한 평가 동안 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체는 인간 종양에서 TIL 집단을 측정 가능하게 조절하였다. 예를 들어, γδ+ 림프구 TIL 집단 또는 비-γδ 림프구 TIL 집단의 수 또는 표현형의 변화는 인간 종양, 예컨대, 인간 신세포 암종에 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편의 적용 후 측정된다. 선택적으로, γδ+ 림프구 TIL 집단 또는 비-γδ 림프구 TIL 집단의 수 또는 표현형에서 관찰된 변화는 이어서 대체 비교 항체(예를 들어, OKT-3)가 상기 모델 시스템에 적용될 때 관찰된 변화와 비교될 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 인간 종양에 위치하거나, 또는 이로부터 유래되는 TIL에 투여하고 TIL의 수에 대한 효과를 결정하는 단계를 포함하는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 효과는 일정 기간 동안 결정/측정되고 선택적으로 상기 항체가 동일한 일정 기간 동안 적용되지 않았을 때 관찰된 TIL 수와 비교될 수 있다. 효과는 TIL 수의 증가일 수 있다. 예를 들어, 항체는 TIL 수를 상기 항체가 적용되지 않았을 때 관찰된 TIL 수에 비해 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 약 100% 초과로 증가시킬 수 있다. 추가의 양상에서, 수가 관찰된 TIL은 γδ+ 림프구 TIL 세포 및/또는 비-γδ 림프구 TIL 세포이다.
본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 인간 종양에 위치하거나 또는 이로부터 유래된 TIL 또는 TIL들에 적용한 다음 일정 기간 동안 TIL 또는 TIL들의 세포 수 변화를 측정함으로써 γδ TCR 세포 항체의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
인간 Vδ1+ 세포독성을 조절하는 의약
본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 Vδ1+ 매개 세포 세포독성에 대해 부여된 효과를 측정함으로써 평가될 수 있다. 놀랍게도, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 및 다중특이적 항체 자체 중 일부의 이러한 평가 동안(예를 들어, 실시예 19, 23, 24 및 27 참조) 측정 가능하게 향상된 Vδ1+ 매개 세포 세포독성이 관찰되었다. 예를 들어, 암 세포 수의 감소 또는 사멸된 암 세포 수의 증가는 Vδ1+ 세포 및 상기 암 세포를 포함하는 혼합 배양물을 포함하는 모델 시스템에 항체 또는 이의 단편의 적용 후에 관찰된다. 선택적으로, 암 세포 수의 감소 또는 사멸된 암 세포 수의 증가는 이어서 대 체 비교 항체(예를 들어, OKT-3)가 상기 모델 시스템에 적용되었을 때의 결과와 비교될 수 있다.
따라서 본 발명의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포 및 암 세포를 포함하는 세포의 혼합 집단에 적용하고 암 세포에 대한 Vδ1+ 세포의 세포독성을 측정하는 단계를 포함하는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 세포독성은 일정 기간 동안 죽은 암 세포 수의 증가를, 선택적으로 상기 항체가 동일한 일정 기간 동안 세포의 혼합 집단에 적용되지 않았을 때 관찰된 죽은 암 세포의 수와 비교함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체가 적용될 때 죽은 세포에서 관찰된 증가는 상기 항체가 적용되지 않았을 때 관찰된 죽은 세포의 수에 비해, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 약 100% 초과, 약 200% 초과, 약 500% 초과일 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 인간 Vδ1+ 세포 및 암 세포를 포함하는 혼합 면역 세포의 상기 집단에 첨가한 다음 시간 경과에 따라 죽은 암 세포에서의 증가를 측정함으로써 γδ TCR 세포의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
Vδ1+ 세포 표적 대 효과기 세포 비(T:E 비)를 조절하는 의약
본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 또한 표적 세포 대 효과기 세포 비를 결정함으로써 상기 항체 가 Vδ1+ 매개 암 세포 세포독성을 향상시키는 방법을 측정함으로써 평가될 수 있으며 여기서 표적 세포의 50%(EC50)는 상기 항체를 잠재적인 의약으로서 평가하는 모델 시스템에서 사멸된다. 예를 들어, 표적 암 세포와 인간 Vδ1+ 효과기 세포를 포함하는 혼합 배양물. 놀랍게도, 이러한 평가 동안(예를 들어, 실시예 19 및 23 참조) 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체(뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 다중특이적 항체의 단일특이적 버전)는 모델 시스템에서 EC50 T:E 비를 유리하게 변형시킨다. 이러한 변형은 설정된 시간 동안 암 세포의 50% 사멸을 관찰하는 데 필요한 Vδ1+ 세포의 수로 측정될 수 있다. 이는 또한 상기 암 세포에 대한 세포독성의 변화 또는 배수-개선 또는 개선율로 보고될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 항체에 의해 부여된 T:E 비는 이어서 대체 비교 항체(예를 들어, OKT-3)가 상기 모델 시스템에 적용될 때 T:E 비와 비교될 수 있다. 일부 시나리오에서, 본 발명의 다중특이적 항체는 단일특이적 항체와 비교할 때 더 낮은 E:T 비에서도 개선된 암 세포 세포독성에 대한 기회를 제시한다.
따라서 본 발명의 또 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편을 인간 Vδ1+ 세포 및 암 세포를 포함하는 세포의 혼합 집단에 적용하고 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 Vδ1+ 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 이는 선택적으로 동일한 일정 기간 동안 상기 항체의 적용 없이 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 Vδ1+ 세포 수와 관련하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체가 적용될 때 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 Vδ1+ 세포 수의 감소는 상기 항체가 적용되지 않을 때 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 Vδ1+ 세포 수에 비해, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 약 100%, 약 200% 초 과, 약 500% 초과일 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 Vδ1+ 세포 및 암 세포를 포함하는 세포의 상기 집단에 첨가한 다음 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 Vδ1+ 세포 수를 측정함으로써 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
Vδ1+ 세포 EC50 세포독성을 향상시키는 의약
인간 Vδ1+ 세포 또는 이의 집단의 관찰된 향상된 세포독성을 측정하는 대안적인 방식은 조건 A(예컨대, 대조군으로 시작)에서 설정된 기간 동안 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 세포의 수를 측정하고 이를 조건 B(예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체의 적용 시)에서 설정된 기간 동안 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요한 세포의 수와 비교하는 것이다.
이해를 돕기 위해, 이러한 매개변수를 측정하는 다양한 방식이 있다는 것을 인식하고 있지만, 하기 비제한적인 가설적 예가 기술될 것이다:
가설적으로, 효과기 세포 세포독성 향상은 다음과 같이 측정될 수 있다:- 조건 A(대조군 처리)에서 1000개의 V δ1+ 세포가 설정된 기간(예를 들어, 5시간) 동안 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요함이 관찰된다. 조건 B(예를 들어, 본 명세서에 기재된 본 발명의 다중특이적 항체 적용)에서 500개의 Vδ1+ 세포가 동일한 일정 기간 동안 암 세포의 50%를 사멸시키는 데 필요하였음이 관찰된다. 따라서 이 예에서, 항체의 적용은 Vδ1+ 세포 집단의 세포독성을 200%까지 향상시켰다:
(1000/500)×100=200%
예를 들어(실시예 19 참조), 놀랍게도 이러한 향상율은 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체에 대해 관찰되었다.
본 발명의 추가의 양상에서 상기 항체를 Vδ1+ 세포 및 암 세포를 포함하는 혼합 면역 세포의 상기 집단에 첨가하고 상기 항체가 상기 세포의 혼합물에 적용되지 않는 동등한 또는 대조군 실험 대비 세포독성의 상대적 또는 퍼센트 변화를 결정함으로써 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공된다.
건강한 세포를 보존하면서 Vδ1+ 세포 병든 세포 특이성을 향상시키는 의약
본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 평가하기 위한 또 다른 접근법은 상기 항체가 병든 세포 특이적 세포독성을 조절하는 방법을 측정하는 것이다. 놀랍게도 이러한 연구 동안, 단일특이적 항체 및 다중특이적 항체는 건강한 또는 병들지 않은 세포를 보존하면서 암 세포와 같은 병든 세포의 Vδ1+ 세포 특이적 사멸을 특이적으로 향상시킬 수 있음을 발견하였다(예를 들어, 실시예 19 및 23 참조). 암의 증상을 개선하기 위해 환자에게 투여된 이상적인 항체 약제는 건 강한 세포를 보존하면서 병든 세포에 대해 특이적으로 향상된 세포독성을 부여할 것이다. 그리고 암 세포와 같은 병든 세포에 대해 특이적으로 효과기 세포 세포독성을 향상시키는 약제는 상기 병든 세포에 대해 특이적으로 효과기 세포 세포독성을 선택적으로 향상시키지 않는 의약에 비해 향상된 치료 지수(TI)를 나타낸다고 할 수 있다. 치료 지수는 또한 치료 비라고 지칭되며 약물의 상대적 안전성을 정량적으로 측정한 것이다. 이는, 예를 들어, 관련되거나 또는 관련한 건강한 세포 집단에서 바람직하지 않은 사멸을 부여함으로써 치료 효과를 야기하는 치료제의 양과 독성을 야기하는 양을 비교한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 모델 시스템에서 건강한 세포에 비해 병든 세포를 선택적으로 사멸시키는 Vδ1+ 세포 능력을 변화시키거나 또는 향상시키거나 또는 배수-개선하는 능력을 측정함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 상기 모델 시스템은 Vδ1+ 효과기 세포, 암 세포, 및 대조군 세포(예컨대, 건강한 세포)를 포함할 수 있다. 선택적으로 본 발명의 다중특이적 항체에 의해 부여된 선택적 병든 세포 사멸의 배수-개선은 이어서 대체 비교 항체(예를 들어, OKT-3)가 상기 모델 시스템에 적용될 때 관찰된 배수-개선과 비교될 수 있다.
Vδ1+ 세포의 병든 세포 특이성 및 병든 세포 특이성-향상은 Vδ1+ 세포, 병든 세포, 및 건강한 세포를 포함하는 배양물에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 병든 세포에 대한 Vδ1+ 특이성은 Vδ1+ 세포에 의해 사멸된 암 세포의 수를 관찰한 다음 Vδ1+ 세포에 의해 사멸된 건강한 세포의 수를 비교함으로써 측정될 수 있다. 이러한 비교는 또한 Vδ1+ 세포를 함유하는 모델 시스템 예를 들어, "삼중배양물"에서 동일한 수의 병든 세포 및 건강한 세포를 포함함으로써 제어될 수 있다. 예를 들어, 분석 또는 장비 제한이 단일 검정에서 3가지 세포 유형(Vδ 1+ 세포, 병든 세포, 및 병들지 않은 세포 포함) 또는 그 이상을 모두 동시에 구별하고 추적하는 능력을 감소시킬 때 대안적인 비교 방법론이 또한 간주될 수 있다. 상기 예에서, 하나의 실험에서 병든 세포에 대한 Vδ1+ 세포 세포독성을 비교한 다음 별도의 동등한 실험에서 건강한 세포에 대한 Vδ1+ 세포 세포독성을 비교하는 것은 이러한 연구에 대한 대안적인 접근법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 Vδ1+ 세포 및 표적 세포를 포함하는 세포 집단에 투여하고 표적 세포에 대한 세포 세포독성 특이성을 측정하는 단계를 포함하는 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 평가하는 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 제1 표적 세포 유형에 대한 세포 세포독성 특이성은 제2 표적 세포 유형에 대해 관찰된 세포독성과 비교될 수 있으며, 따라서 방법은 상이한 표적 세포 유형을 사용하여 반복될 수 있다. 본 발명의 추가의 양상에서, 제1 표적 세포 유형은 병든 세포이고 제2 표적 세포 유형은 건강한 세포와 같은 대조군 세포 또는 제1 표적 세포 유형과 상이한 질환을 갖는 세포이다.
본 발명의 추가의 양상에서 γδ TCR의 Vδ1 쇄에 결합하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 선택하거나 또는 특징규명하거나 또는 비교하는 방법이 제공되며, 여기서 (i) 제1 세포 유형 및 (ii) 제2 세포 유형에 대하여 Vδ1+ 세포 세포독성에 대해 상기 항체에 의해 부여된 효과가 측정되고 비교된다. 본 발명의 추가의 양상에서 제2 세포 유형에 대한 것보다 제1 세포 유형에 대한 특이적 세포독성을 더 향상시키는 항체가 이에 의해 선택된다. 본 발명의 추가의 양상에서 제1 세포 유형은 병든 세포이고 제2 세포 유형은 건강한 세포이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 검정에 사용되는 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 표면, 예를 들어, Fc 수용체를 포함하는 세포와 같은 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 THP-1 세포, 예컨대, TIB-202™ 세포(어메리칸 타입 걸쳐 콜렉션(ATCC)에서 이용가능)의 표면 상에 제시될 수 있다. 대안적으로, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 검정에서 직접적으로 사용될 수 있다.
이러한 기능적 검정에서, 출력은 "EC50" 또는 "50 퍼센트의 유효 농도"로도 지칭되는 절반 최대 농도를 계산함으로써 측정될 수 있다. 용어 "IC50"은 저해 농도를 지칭한다. EC50 및 IC50은 둘 다 유세포 분석 방법과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, EC50 및 IC50은 동일한 값이거나 또는 동등한 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 특정 세포 유형의 50%를 저해(예를 들어, 사멸)하는 데 필요한 효과기 세포의 유효 농도(EC)는 또한 50% 저해 농도(IC)로 간주될 수 있다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 출원에서 EC50의 값은 항체를 지칭할 때 IgG1 포맷된 항체를 사용하여 제공된다. 이러한 값은 다음과 같이 등가 값에 대한 항체 포맷의 분자량에 기반하여 용이하게 전환될 수 있다:
(㎍/㎖)/(MW(kDa 단위)) = ㎛
항체(또는 단편) 결합 시 γδ TCR의 하향조절에 대한 EC50은 0.50㎍/㎖ 미만, 예컨대, 0.40㎍/㎖, 0.30 ㎍/㎖, 0.20㎍/㎖, 0.15㎍/㎖, 0.10㎍/㎖, 0.06㎍/㎖ 또는 0.05㎍/㎖ 미만일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체(또는 단편) 결합 시 γδ TCR의 하향조절에 대한 EC50은 0.10㎍/㎖ 미만이다. 특히, 항체(또는 단편) 결합 시 γδ TCR의 하향조절에 대한 EC50은 0.06㎍/㎖ 미만, 예컨대, 0.05㎍/㎖, 0.04㎍/㎖ 또는 0.03㎍/㎖ 미만일 수 있다. 특히, 상기 EC50 값은 항체가 IgG1 포맷으로 측정될 때의 값이다. 예를 들어, EC50 γδ TCR 하향조절 값은 유세포 분석법(예를 들어 실시예 6 및 실시예 23의 검정에 기재된 바와 같음)을 사용하여 측정될 수 있다.
항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포 탈과립화에 대한 EC50은 0.050㎍/㎖ 미만, 예컨대 0.040㎍/㎖, 0.030㎍/㎖, 0.020㎍/㎖, 0.015㎍/㎖, 0.010㎍/㎖ 또는 0.008㎍/㎖ 미만일 수 있다. 특히, 항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포 탈과립화에 대한 EC50은 0.005㎍/㎖ 미만, 예컨대 0.002㎍/㎖ 미만일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포 탈과립화에 대한 EC50은 0.007㎍/㎖ 미만이다. 특히, 상기 EC50 값은 항체가 IgG1 포맷으로 측정될 때의 값이다. 예를 들어, γδ T 세포 탈과립화 EC50 값은 유세포 분석법(예를 들어 실시예 7의 검정에 기재된 바와 같음)을 사용하여 CD107a 발현(즉, 세포 탈과립화의 마커)을 검출함으로써 측정될 수 있다. 일 실시형태에서, CD107a 발현은 항-CD107a 항체, 예컨대, 항-인간 CD107a BV421(클론 H4A3)(비디 바이오사이언시스사(비디 바이오사이언시스사))을 사용하여 측정된다.
항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포 사멸에 대한 EC50은 0.50㎍/㎖ 미만, 예컨대 0.40㎍/㎖, 0.30㎍/㎖, 0.20㎍/㎖, 0.15㎍/㎖, 0.10㎍/㎖ 또는 0.07㎍/㎖ 미만일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포 사멸에 대한 EC50은 0.10㎍/㎖ 미만이다. 특히, 항체(또는 단편) 결합 시 γδ T 세포 사멸에 대한 EC50은 0.060㎍/㎖ 미만, 예컨대 0.055㎍/㎖ 미만, 특히 0.020㎍/㎖ 미만일 수 있다. 특히, 상기 EC50 값은 항체가 IgG1 포맷으로 측정될 때의 값이다. 예를 들어, EC50 γδ T 세포 사멸 값은 항체, γδ T 세포 및 표적 세포의 인큐베이션 후 유세포 분석법(예를 들어 실시예 8의 검정에 기재된 바와 같음)을 사용하여 죽은 세포의 비율을 검출함으로써(즉, 세포 생존성 염료 사용) 측정될 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 세포의 사멸은 세포 생존성 염료인 생존성 염료 eFluor™ 520(써모피셔사(ThermoFisher))을 사용하여 측정된다.
이들 양상에 기재된 검정에서, 항체 또는 이의 단편은 세포, 예컨대, THP-1 세포, 예를 들어 TIB-202™(ATCC)의 표면 상에 제시될 수 있다. THP-1 세포는 선택적으로 염료, 예컨대, CellTracker™ Orange CMTMR(써모피셔사)로 표지된다.
Vδ1 TCR과 연관된 CD3 분자를 하향조절하는 의약.
현재의 다중특이적 TCE-포맷 의약은 전형적으로 CD3 결합 이벤트를 통해 T-세포와 결합하고 활성화한다. 이것은 T-세포의 표면으로부터 CD3 분자 복합체의 하향조절을 초래할 수 있다. 그러나, TCE가 이러한 관여 및 하향조절을 통해 T 세포를 과도하게 자극할 수도 있다는 것이 또한 잘 이해된다. CD3 분자 복합체는 한 부류의 T-세포에 특이적이지 않으므로 목표로 삼을 정확한 표적이 아니다. CD3를 통해 모든 T 세포(주로 αß 하위유형)를 자극하면 사이토카인이 과잉 생산되어 급성 사이토카인 발적(소위 사이토카인 폭풍)이 발생할 수 있다. 또한, CD3를 통해 모든 T-세포를 관여시키고 활성화시키는 비-표적 접근법에서, 역설적으로 T-세포는 과도하게 활성화되어 만성 T-세포 고갈 및/또는 T-세포 사멸을 초래할 수 있다. 실제로, 이러한 비특이적 pan 활성화는 효과기 T 세포 둘 다의 활성화로 이어지는 반면, 현재 제시된 접근법은 효과기 집단과 특이적으로 상호 작용한다. 따라서 이러한 '큰 망치(sledge-hammer)' 접근법은 선택적인 T 세포만 상향조절하려는 경우 이상적이지 않다.
대조적으로, 본 명세서에서는 T-세포/CD3 복합체와 상이하게 관여하는 다중특이적 항체, 특히 T-세포 관여자를 제시한다. 특히, 이러한 TCE는 Vδ1+ 세포에서만 발현되는 Vδ1 TCR의 TRDV1 도메인을 통해 관여할 수 있다. 그렇게 함으로써 그러한 TCE 기반 의약은 상이하게 기능한다. 첫째, 이러한 TCE는 TRDV-1 에피토프를 결합하여 TCR을 하향조절할 수 있다. 차례로 이 결합 이벤트는 TCR 관련 CD3 분자 복합체를 하향조절할 수 있다. 이러한 CD3 하향조절은 T 세포 활성화와 동의어일 수 있다. 그러나 이러한 방식으로 TRDV1 도메인을 통해 T 세포/CD3 복합체와 관여함으로써, Vδ1 TCR과 관련된 CDR3 분자만 하향조절된다. Vδ1 세포를 특이적으로 표적화하고 활성화하는 이 접근법은 상기 많은 문제(예를 들어, 사이토카인 폭풍, T 세포 고갈/고갈 및 ADCC)를 피할 수 있다. 이 기전은 도 30에 명확하게 도시되어 있다.
CD3 '큰망치' 접근법을 통한 T 세포 자극은 또한 ADCC와 같은 Fc 감마 수용체 구동 기전을 통한 T 세포 고갈에 기여할 수 있다. 따라서, 현재 임상 실시에서의 대부분의 CD3-표적화 이중특이적 항체는 FcγR에 대한 결합 활성이 감소된 Fc 도메인을 갖거나 의도적으로 Fc 영역이 없는 이중특이적 단편이다. CD3-표적 요법은 또한 T-세포 수용체 복합체 결합 아암의 결합 친화도를 감소시킬 수 있다.
이러한 친화도 감소는 TCE 설계 및 기능 측면에서 효능 감소 및 선택 가능성 감소를 초래할 수 있다. 예를 들어, 이러한 TCE에서 결합 도메인의 친화도는 생체내에서 분포 프로파일을 구동하는 것으로 알려져 있다. 특히, 전형적으로 TCE 분포가 가장 높은 친화도 목표를 향해 편향되어 있음이 관찰된다. 따라서, T-세포 복합체에 대한 TCE 결합 도메인의 친화도를 감소시킴으로써, 그 다음 T-세포로부터 분포를 편향시키는 것이 전형적인데; 이것이 그러한 TCE의 효능을 발휘하는 데 필요한 바로 그 세포이다. 이것이 부분적으로는 TCE 치료 창이 상당히 좁다'고 불리는 이유이다.
본 명세서에 제시된 접근법은 vδ1 세포를 특이적으로 표적화하고 활성화하며, 선택적으로 Fc 기능을 제거하거나 친화도를 감소시킬 필요성을 회피한다.
또한, 본 명세서에 제시된 접근법에서 항체는 vδ1 세포의 TCR에 관여하지만 종양 세포가 또한 존재하지 않는 한 완전한 활성화는 발생하지 않는다. TCR에 대한 현재 제시된 항체의 완전한 맞물림은 부분적 하향조절을 초래하고, 현재 제시된 항체에 의해 결합된 vδ1 세포는 종양 미세환경에서 완전히 활성화되고 세포독성이 된다. 이는 표적외 세포독성이 감소되고 vδ1 세포를 활성화시키는 본 항체의 완전한 효력이 종양 세포의 존재 하에서만 발휘되기 때문에 본 접근법에 대한 또 다른 중요한 안전성의 이점을 나타낸다.
γδ T 세포가 종양 세포에서 스트레스 신호를 감지할 수 있는 이면의 한 기전은 이들이 발현하는 NCR(자연 세포독성 수용체) 때문인 것으로 여겨진다. NCR은 종양 세포에서 NCR 리간드와 맞물릴 수 있다. 따라서 활성화의 이중 기전이 사용되는데, 여기서 γδ T 세포는 TCR 자극을 통해 활성화되고 NCR은 종양 세포를 감지하여 완전한 활성화 및 세포 독성을 가능하게 한다.
이것은 모든 자극이 TCR을 통해 이루어지는 CD3를 통한 αβ T 세포의 자극과 대조된다. 따라서 이러한 세포는 이들이 NCR을 통해 종양 세포를 독립적으로 감지하는 이러한 항원 제시가 없기 때문에 건강한 세포와 형질전환된 세포 간에 거의 무차별적이다. 따라서, CD3 항체가 Fc이면 이들은 사이토카인 폭풍, 탈진, 심지어 예를 들어, NK 세포가 T 세포를 사멸시키는 면역 세포의 과활성화와 같은 예측할 수 없고 바람직한 사건의 캐스케이드를 촉발할 수 있는 다른 면역 세포를 끌어들일 것이다. 본 접근법에서, 현재 제시된 항체로 γδ T 세포를 자극하는 것은 γδ T 세포(및 NK 세포와 같은 다른 면역 세포) 모두 건강한 세포와 종양 세포를 구별할 수 있기 때문에 그러한 문제를 일으키지 않는다. 예를 들어, NCR 감지 기전을 통해 따라서 서로 사멸시키지 않는다.
예를 들어, 인간 및 cyno vδ1 항원(서열번호 1 및 서열번호 172) 모두에 대한 특이성을 갖는 본 명세서에 제시된 항-vδ1 Fc-무손상 다중특이적 항체를 사용한 초기 시노몰거스 연구에서 용량 증량, 반복 용량 생체내 연구에서 측정된 모든 매개변수에 의해 안전하고 양호하게 용인되는 것으로 밝혀져 있다. 사이토카인 방출 또는 체중 감소와 같은 T 세포 활성화와 관련된 일반적 부작용은 관찰되지 않았다.
이러한 발견은 또한 본 명세서에 설명된 접근법의 또 다른 이점을 강조한다. 구체적으로, 그리고 CD3 관여자 등으로 대표되는 TCE와 달리, 본 발명의 TCE 이중특이체는, 예를 들어, VL-CL 포맷을 갖는 동족 경쇄와 함께 VH-CH1-CH2-CH3 포맷을 갖는 중쇄를 포함하는 전장 항체로서 선택적으로 설계될 수 있다. 더 작은 이중특이적 포맷(예를 들어, 70KDa 미만)과 달리, 이러한 전장 이중특이적 포맷은 생체내에서 더 긴 반감기를 나타낼 수 있으므로 덜 빈번한 투여 요법이 필요하다. 이러한 포맷에 의해 관찰되는 더 긴 반감기는 크기 증가(70KDa 초과)를 포함하는 다양한 이유에 대한 것이며, 이는 이러한 포맷이 신장에 의해 필터링되지 않음을 의미한다(사구체 공극 크기 컷오프 60 내지 70KDa). 일 실시형태에서, 다중특이적 항체는 약 70KDa보다 클 수 있고, IMGT에 의해 열거된 바와 같은 인간 IGHC 서열(예를 들어, IGHA, IGHD, IGHD, IGHM, IGHG 서열)을 포함할 수 있다. 이러한 IgG1 포맷은 FcRn 기전에 의해 재순환될 수도 있다. 특히 TCE 이중특이체에 대한 이러한 전장 항체 포맷의 분명한 단점은 제거율 감소, 증가 및 더 많은 만성 노출로 인해 이러한 포맷이 바람직하지 않은 안전성 프로파일을 나타낸다는 것이다.
따라서, 본 접근법은 NK 세포가 γδ T 세포를 사멸시키거나 그 반대의 경우와 같은 표적외 효과의 어떠한 문제도 없이 Fc 기능성의 가능성을 허용한다. 따라서 본 접근법은 종양 환경 외부의 부수적 손상을 제한하기 위해 CD3 친화도 감소, Fc 기능 제거 등과 같은 해결 방법의 필요성에 의해 방해받는 CD3 지시 접근법보다 우수하다. 본 명세서에 제시된 다중특이적 항체, 특히 T-세포 관여자는 어떠한 손상 가능도 없이 vδ1 세포에 결합할 수 있으며 완전한 활성화 및 세포독성 향상은 vδ1 세포가 종양 세포와 밀접하게 접촉할 때만 관여한다.
따라서 일 실시형태에서 세포의 표면 상의 TRDV1-함유 Vδ1 TCR 및 연관된 CD3 분자 복합체를 TCE 다중특이적 항체로 하향조절하는 방법 및 이러한 목적을 위한 이러한 다중특이적 항체의 용도가 제공된다.
폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터
본 발명의 일 양상에서 본 발명의 다중특이적 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 99 내지 110과 적어도 70%, 예컨대, 적어도 80%, 예컨대, 적어도 90%, 예컨대, 적어도 95%, 예컨대, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 발현 벡터는 서열번호 99 내지 110의 VH 영역을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 서열번호 99 내지 110의 VL 영역을 포함한다. 추가의 실시형태에서 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 99 내지 110을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 추가의 양상에서 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 cDNA가 제공된다. 폴리뉴클레오타이드는 제2 결합 도메인을 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있고, 제2 결합 도메인은 제2 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터는 암호화된 아미노산 서열과 관련하여 또한 기재될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 발현 벡터는 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터는 추가의 도메인을 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있고, 추가의 도메인은 제2 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있다.
항체, 또는 이의 단편을 암호화하기 위해서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 발현 벡터에 삽입되어 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 따라서 본 발명의 일 양상에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
본 명세서에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 번역, 정제 및 검출을 돕기 위해 아미노산 잔기를 암호화하는 추가적인 서 열을 포함하지만, 사용되는 발현 시스템에 따라 대안적인 서열이 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 서열번호 99 내지 110의 초기(5'-단부) 9개의 뉴클레오타이드 및 서열번호 99 내지 100, 102 내지 103, 105 내지 110의 마지막(3'-단부) 36개의 뉴클레오타이드, 또는 서열번호 101 및 104의 마지막(3'-단부) 39개의 뉴클레오타이드는 임의적 서열이다. 이러한 임의적 서열은 대안적인 설계, 번역, 정제 또는 검출 전략이 채택된 경우 제거되거나, 변형되거나 또는 대체될 수 있다.
돌연변이는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 대해서는 침묵하지만, 특정 숙주에서 번역을 위한 바람직한 코돈을 제공하는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 또는 cDNA로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 뿐만 아니라 포유동물, 구체적으로 인간에서 핵산의 번역을 위한 바람직한 코돈이 알려져 있다.
폴리펩타이드의 돌연변이는, 예를 들어, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대한 치환, 부가 또는 결실에 의해 달성될 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 대한 치환, 부가 또는 결실은, 예를 들어, 오류 유발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오타이드-지시 돌연변이생성, 어셈블리 PCR, PCR 돌연변이생성, 생체내 돌연변이생성, 카세트 돌연변이생성, 반복 앙상블 돌연변이생성, 지수 앙상블 돌연변이생성, 부위-특이적 돌연변이생성, 유전자 재조립, 인공 유전자 합성, 유전자 부위 포화 돌연변이생성(GSSM), 합성 결찰 재조립(SLR) 또는 이러한 방법의 조합을 포함한 많은 방법에 의해 도입될 수 있다. 핵산에 대한 변형, 부가 또는 결실은 또한 재조합, 반복 서열 재조합, 포스포티오에이트-변형된 DNA 돌연변이생성, 우라실-함유 주형 돌연변이생성, 간극 이중체 돌연변이생성, 점 불일치 복구 돌연변이생성, 복구-결핍 숙주 균주 돌연변이생성, 화학적 돌연변이생성, 방사성 돌연변이생성, 결실 돌연 변이생성, 제한-선택 돌연변이생성, 제한-정제 돌연변이생성, 앙상블 돌연변이생성, 키메라 핵산 다량체 생성 또는 이들의 조합을 포함한 방법에 의해 도입될 수 있다.
특히, 인공 유전자 합성이 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자는, 예를 들어, 고체상 DNA 합성에 의해 합성적으로 생성될 수 있다. 전체 유전자는 전구체 주형 DNA를 필요로 하지 않고 새로 합성될 수 있다. 원하는 올리고뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 빌딩 블록을 생성물의 서열에 의해 요구되는 순서로 성장하는 올리고뉴클레오타이드 쇄에 순차적으로 커플링시킨다. 쇄 어셈블리가 완료되면, 생성물을 고체 상에서 용액을 방출하고, 탈보호하고, 수집한다. 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 단리시켜 고순도의 원하는 올리고뉴클레오타이드를 수득할 수 있다.
발현 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 레트로바이러스, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC) 및 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유래 에피솜을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 제공하도록 벡터에 결찰된다. 발현 및/또는 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 전사 종결인자, 코딩 서열에 대한 시작 코돈(즉, ATG) 5', 인트론에 대한 스플라이싱 신호 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 호환가능한 것으로 선택된다. 서열번호 99 내지 110은 합성 링커(서열번호 98을 암호화)에 의해 연결된 VH 영역 및 VL 영역을 포함하는, 본 발명의 다중특이적 항체에 포함될 수 있는 단일 쇄 가변 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터는 VH 영역, VL 영역 또는 둘 다(선택적으로 링커 포함)를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, VH 영역 및 VL 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 별개의 벡터에 삽입될 수 있으며, 대안적으로 두 영역을 암호화하는 서열은 동일한 발현 벡터에 삽입된다. 폴리뉴클레오타이드(들)는 표준 방법(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단 결찰)에 의해 발현 벡터에 삽입된다.
편리한 벡터는 임의의 VH 또는 VL 서열이 용이하게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위가 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 암호화하는 것이다. 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체(또는 이의 단편)의 분비를 용이하게 하는 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 신호 펩타이드가 항체의 아미노 말단에 프레임내 연결되도록 벡터로 클로닝될 수 있다. 신호 펩타이드는 면역글로불린 신호 펩타이드 또는 이종 신호 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩타이드)일 수 있다.
본 발명의 일 양상에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, 숙주 세포, 예컨대, 재조합 숙주 세포)가 제공된다. 세포는 항체 또는 이의 단편의 경쇄를 암호화하는 제1 벡터, 및 항체 또는 이의 단편의 중쇄를 암호화하는 제2 벡터를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 대안적으로, 동일한 발현 벡터 상에 암호화된 중쇄 및 경쇄는 둘 다 세포에 도입된다.
일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터는 항체 또는 이의 단편에 융합된 막 앵커 또는 막관통 도메인을 암호화하며, 여기서 항체 또는 이의 단편은 세포의 세포외 표면 상에 제시된다.
형질전환은 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위해 임의의 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포로 도입하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공법, 리포솜 내 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 유전자총 주입 및 DNA의 핵 내의 직접 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포에 도입될 수 있다.
발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 포유동물 세포주는 당업계에 잘 알려져 있고 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에서 이용가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은 특히, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특정 선호도의 세포주는 높은 발현 수준을 갖는 세포주를 결정하는 것을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대, Sf9 세포, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. scFv 및 Fv 단편과 같은 항체의 항원-결합 단편은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 이. 콜라이에서 단리되고 발현될 수 있다.
항체는 숙주 세포에서 항체의 발현 또는, 보다 바람직하게는, 숙주 세포가 성장하는 배양 배지에 항체의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 항체(또는 단편)는, 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2012) 4th Edition Cold Spring Harbour Laboratory Press]에 개시된 기술을 사용하여 수득되고 조작될 수 있다.
단클론성 항체는 특이적 항체-생산 B 세포를 조직 배양물에서 성장하는 능력 및 항체 쇄 합성의 부재에 대해 선택된 골수종(B 세포 암) 세포와 융합함으로써, 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
결정된 항원에 대해 지향되는 단클론성 항체는, 예를 들어, 다음에 의해 수득될 수 있다:
a) 하이브리도마를 형성하기 위해, 결정된 항원, 불멸 세포 및 바람직하게는 골수종 세포로 이전에 면역화된 동물의 말초 혈액으로부터 수득된 림프구의 불멸화,
b) 형성된 불멸화된 세포(하이브리도마)의 배양 및 원하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 세포의 회수.
대안적으로, 하이브리도마 세포의 사용은 필요하지 않다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 항원에 결합할 수 있는 항체는 일상적인 관행을 통해, 예를 들어, 당업계에 알려진 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스 플레이, 또는 포유동물 디스플레이 기술을 사용하여 적합한 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 따라서, 단클론성 항체는, 예를 들어, 다음 단계를 포함하는 과정에 의해 수득될 수 있다:
a) 벡터, 특히 파지 및 보다 특히 사상 박테리오파지에, 림프구, 특히 동물(적합하게는 결정된 항원으로 이전에 면역화됨)의 말초 혈액 림프구로부터 수득된 DNA 또는 cDNA 서열을 클로닝하는 단계,
b) 항체 생산을 허용하는 조건 하에서 원핵생물 세포를 상기 벡터로 형질전환시키는 단계,
c) 항체를 항원-친화도 선택에 적용하여 선택하는 단계,
d) 원하는 특이성을 갖는 항체를 회수하는 단계.
선택적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 또한 질환의 징후 또는 증상을 개선하기 위한 약제로서 이용되기에 충분한 양을 만들도록 용이하게 제조될 수 있다. 의약으로서 이 방식으로 이용될 때, 전형적으로 관심 폴리뉴클레오타이드는 먼저 대상체 또는 환자에서 상기 항체 또는 이의 단편을 발현하도록 설계된 발현 벡터 또는 발현 카세트에 작동 가능하게 연결된다 이러한 발현 카세트 및 폴리뉴클레오타이드 또는 때때로 '핵-기반' 의약이라고 불리는 것의 전달 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 최근 검토를 위해 문헌[Hollevoet and Declerck (2017) J. Transl. Med. 15(1): 131]을 참조한다.
또한 본 발명의 재조합 숙주 세포를 세포 내부에서 플라스미드 또는 벡터의 암호화 핵산 서열을 발현시키는 조건 하에서 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 변이체의 생산 방법이 제공된다. 두 결합 도메인이 동일한 재조합 세포에서 생산되는 경우, 방법은 세포 배양 상청액으로부터 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 변이체를 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그 다음 얻어진 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 약제학적 조성물로 추가로 가공 및/또는 제형화할 수 있다. 대안적으로 다중특이적 항체의 결합 도메인이 개별 재조합 숙주 세포에서 생성되는 경우, 다중특이적 항체는 먼저 각각의 재조합 숙주 세포로부터 개별 세포 상청액을 수집하고, 그 후 상기 결합 도메인을 다중특이적 항체에 배합하고, 이것을 약제학적 조성물로 추가로 가공 및/또는 제형화함으로써 얻어질 수 있다. 추가로, 상기 세포에 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 형질주입시키는 단계를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편 또는 변이체를 발현하는 재조합 숙주 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 그 다음 상기 세포는 다중특이적 항체 또는 이의 단편 또는 변이체의 생산을 위해서 배양될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 제공된다. 이러한 실시형태에서, 조성물은 다중특이적 항체를 선택적으로 다른 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 또한 1종 이상의 추가 활성제(예를 들어, 본 명세서에 언급된 질환을 치료하기에 적합한 활성제)를 포함하는 조성물이 포함된다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체와 함께 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본 발명의 다중특이적 항체는 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 상용 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예는 물, 염수, 염, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 이의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 많은 경우에, 조성물에 등장화제, 예를 들어, 당, 다가알코올 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 습윤제와 같은 약제학적으로 허용 가능한 물질 또는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 또는 소량의 보조 물질은 항체 또는 이의 단편의 수명 또는 유효성을 향상시킨다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이들은, 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대, 액체 용액(예를 들어, 주사용 및 주입용 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포솜 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 모드 및 치료적 적용에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사용 또는 주입용 용액 형태이다.
바람직한 투여 모드는 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 척추강내)이다. 바람직한 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
치료용 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 분산액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 질환의 치료를 위한 치료 방법에서 본 발명의 약제학적 조성물을 이러한 질환의 치료에 정상적으로 사용되는 다른 확립된 요법에 대한 보조물로서, 또는 이와 함께 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 추가의 양상에서, 항체, 조성물 또는 약제학적 조성물은 적어도 하나의 활성제와 순차적으로, 동시에 또는 별도로 투여된다.
치료 방법
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 의약으로서 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 단편이 제공된다. 본 명세서에서 의약으로서 또는 요법에서 "사용하기 위한" 다중특이적 항체 또는 이의 단편에 대한 언급은 대상체에게 항체 또는 이의 단편의 투여로 제한된다. 이러한 사용은 세포 배양물(즉, 시험관내 또는 생체외)에 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 투여를 포함하지 않으며 여기서 상기 세포 배양물 또는 유래된 세포 요법 생성물은 치료제로서 사용된다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이다. 다양한 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환이다. 일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이며, 건강한 세포를 보존하면서 병든 세포의 사멸을 야기한다. 추가의 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 의약으로서 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 암의 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 치료적 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응의 조절을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 것은 γδ T 세포의 결합 또는 표적화, γδ T 세포의 활성화, γδ T 세포 증식의 유발 또는 증가, γδ T 세포 확장의 유발 또는 증가, γδ T 세포 탈과립화의 유발 또는 증가, γδ T 세포 사멸 활성의 유발 또는 증가, 건강한 세포를 보존하면서 γδ T 세포 사멸 활성의 유발 또는 증가, γδ T 세포독성 유발 또는 증가, 건강한 세포를 보존하면서 γδ T 세포독성 유발 또는 증가, γδ T 세포 동원 유발 또는 증가, γδ T 세포 생존의 증가 또는 γδ T 세포 고갈에 대한 저항성의 증가를 포함한다. 대상체에서 면역 반응을 조절하는 것은 또한 제2 항원에 대한 결합 또는 표적화를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 특히 제2 항원이 면역조절 항원인 경우 제2 항원의 결합은 TRDV1에 대한 다중특이적 항체의 결합을 통한 면역조절에 더하여, 제2 항원을 통해서 면역조절을 자극할 수 있다. 따라서, 면역 반응의 조절은 2개의 상이한 신호전달 경로, 즉, TRDV1 항원 관여를 통해 조절되는 제1 신호전달 경로 및 제2 면역조절 항원의 관여를 통해 조절되는 제2 신호전달 경로를 통한 조절을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 치료적 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 감염성 질환 또는 염증성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 대안적으로, 치료적 유효량의 약제학적 조성물이 투여된다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 예를 들어, 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에서 약제의 제조를 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 용도가 제공된다.
일 실시형태에서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 대상체에게 투여되며, 여기서 대상체는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환이 있다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 의약으로서 사용하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 약제학적 조성물이 제공된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 투여되며, 여기서 대상체는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환이 있다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 치료적 유효량의 본 명세서에 정의된 바와 같은 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 방법이 제공되며, 여기서 대상체는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환이 있다. 대안적으로, 치료적 유효량의 약제학적 조성물이 투여된다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 예를 들어, 대상체에게 투여하기 위한 의약의 제조를 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 용도가 제공되며, 여기서 대상체는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환이 있다.
다양한 실시형태에서, 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 급성 림프모구성, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 충수암, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 골육종 및 악성 섬유성 조직구종, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 뇌 종양, 뇌간 신경교종, 중추 신경계 비정형 기형/횡문형 종양, 중추 신경계 배아성 종양, 소뇌 성상세포종, 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 두개인두종, 뇌실막모세포종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 수질상피종, 중간 분화의 송과 실질 종양, 천막상 원시 신경외배엽 종양 및 송과체모세포종, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 뇌 및 척수 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 유암종, 위장관 유암종, 중추 신경계 비정형 기형/횡문형 종양, 중추 신경계 배아성 종양, 중추 신경계 림프종, 소뇌 성상세포종 뇌 성상세포종/악성 신경교종, 자궁경부암, 척색종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 식도암, 유잉 계열 종양, 생식선외 생식세포 종양, 간외 담관암, 안내 흑색종, 망막모세포종, 담낭암, 위(위장)암, 위장관 유암종, 위장관 간질 종양(gastrointestinal stromal tumor: gist), 생식세포 종양, 임신 융모 종양, 신경교종, 신경교종 뇌간, 신경교종 뇌 성상세포종, 신경교종 시각 경로 및 시상하부, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간)암, 랑게르한스 세포 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 안내 흑색종, 섬세포 종양, 신장(신 세포)암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발 세포 백혈병, 구순암 및 구강암, 간암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 에이즈-관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 골 및 골육종의 악성 섬유 조직구종, 수모세포종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발성 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발성 내분비 종양형성 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 진균증, 식육종, 골수이형 성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수구성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수성 백혈병 급성, 다발성 골수종, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 비소세포 폐암, 경구암, 구강암, 구인두 암, 골육종 및 골의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피성 암, 난소 생식세포 종양, 난소 저악성 잠재 종 양, 췌장암, 췌장암, 유두종증, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화성세포종, 중간 분화의 송과 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐모세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포(신장)암, 신우 및 요관, 염색체 15에 너트 유전자를 수반하는 호흡기 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 유잉 계열 종양, 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁 육종, 세자리 증후군, 피부암(비흑색종), 피부암(흑색종), 메르켈 세포 피부 암종, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평경부암, 위장(위)암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, T-세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선암, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 임신 융모 종양, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 매크로글로불린혈증, 및 빌름스 종양. 다양한 실시형태에서, 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 건강한 세포를 보존하면서 치료된다,
다양한 구현예에서, 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 염증성 질환은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 이완불능증, 급성 파종 뇌척수염(Acute disseminated encephalomyelitis: ADEM), 급성 운동 축삭 신경병증, 급성 호흡 장애 증후군(Acute respiratory distress syndrome: ARDS), 애디슨병, 동통성 지방, 성인형 스틸병, 성인발병형 스틸병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 근위축성 측색 경화증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항-N-메틸-D-아스파르테이트(항-NMDA) 수용체 뇌염, 항인지질 증후군(Antiphospholipid syndrome), 항인지질 증후군(APS, APLS), 항합성효소 증후군, 항-관형 기저 막 신염, 재생불량성 빈혈, 아토피성 알레르기, 아토피성 피부염, 자가면역 혈관부종, 자가면역 동반이환, 자가면역 자율신경이상증, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 장질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(Autoimmune inner ear disease: AIED), 자가면역 림프구증식성 증후군, 자가면역 심근염, 자가면역 호중구감소증, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 췌장염(Autoimmune pancreatitis: AIP), 자가면역 말초 신경병증, 1형 자가면역 다내분비 증후군(Autoimmune polyendocrine syndrome: APS), 2형 자가면역 다내분비 증후군(APS), 3형 자가면역 다내분비 증후군(APS), 자가면역 망막증, 자가면역 혈소판감소성자반, 자가면역 갑상선염, 자가면역 두드러기, 자가면역 포도막염, 자가면역 혈관염, 축삭 및 신경 신경병증(Axonal & neuronal neuropathy: AMAN), 발로씨 동심성 경화증(Balo concentric sclerosis), 발로병, 베체트병, 양성 점막성 유천포창, 비커스태프 뇌염(Bickerstaff's encephalitis), 블라우 증후군(Blau syndrome), 수포성 유천포창, 캐슬맨병(Castleman disease: CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 피로 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy: CIDP), 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 재발성 다초점 골수염(Chronic recurrent multifocal osteomyelitis: CRMO), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss Syndrome: CSS) 또는 호산성 육아육종(Eosinophilic Granulomatosis: EGPA), 흉터유사천포창, 코간 증후군, 저온 응집병, 보체 성분 2 결핍증, 복합 부위 통증 증후군, 선천성 심장 차단, 결합 조직, 전신, 및 다중-기관, 접촉 피부염, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론병, 쿠싱 증후군, 피부 백혈구 파괴성 혈관염, 데고스병, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경 척수염), 1형 진성 당뇨병, 소화계, 원판성 루푸스, 드레슬러 증후군, 약물 유발성 루푸스, 습진, 자궁내막증, 착부염-관련 관절염, 호산구 식도염(Eosinophilic esophagitis: EoE), 호산구 근막염, 호산구 위장염, 호산성 육아육종 다발혈관염(Eosinophilic granulomatosis with polyangiitis: EGPA), 호산구성 폐렴, 수포성 표피 박리, 결절 홍반, 태아 적혈구증, 식도 이완불능증, 혼합 한랭 글로불린혈증, 애번스 증후군, 외분비, 펠티 증후군, 진행성 골화성 섬유이형성증, 섬유근육통, 섬유성 폐렴, 위염, 위장관 유사천포창, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿패스처 증후군, 다발성 맥관염 동반 육아종, 그레이브스 눈병증, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 하시모토 뇌병증, 용혈성 빈혈, 쇤-라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura: HSP), 임신 헤르페스 또는 유사천포창 임신(pemphigoid gestationis: PG), 화농성 한선염(Hidradenitis Suppurativa: HS)(Acne Inversa), 저감마글로불린혈증, 특발성 거대-세포 심근염, 특발성 염증성 탈수초 질환, 특발성 폐섬유증, IgA 신장병, IgA 혈관염(IgAV), IgG4-관련 질환, IgG4-관련 경화성 질환, 면역 혈소판감소성자반(Immune thrombocytopenic purpura: ITP), 봉입체 근염(IBM), 염증성 장 질환, 중간 포도막염, 간질성 방광염(IC), 간질성 폐질환, IPEX 증후군, 소아 관절염, 소아 당뇨병(1형 당뇨병), 소아 근염(JM), 가와사키병, 람베르트-이튼 증후군, 백혈구 파괴성 혈관염, 편평태선, 경화태선, 목질 결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스, 루푸스 신염, 루푸스 혈관염, 만성 라임병, 마지드 증후군, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(Microscopic polyangiitis: MPA), 혼합 결합 조직 질환(Mixed connective tissue disease: MCTD), 잠식성 각막 궤양, 국소피부경화증, 무카-하베르만병(Mucha-Habermann disease), 다초점성 운동 신경병증(MMN) 또는 MMNCB, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근염, 근염, 기면증, 신생아 루푸스, 신경계, 시신경 척수염, 신경근긴장증, 호중구감소증, 안구 흉터 유사천포창, 안구간대경련 근간대경련 증후군, 시신경염, 오드 갑상선염, 오스토란 증후군, 재발성 류머티즘(Palindromic rheumatism: PR), 방종양성 소뇌 변성(Paraneoplastic cerebellar degeneration: PCD), 발작성 야간 혈색뇨(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: PNH), 페리-롬버그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 평면 부염(말초 포도막염), 연쇄상구균과 연관된 소아과 자가면역 신경정신학적 장애(Autoimmune Neuropsychiatric Disorder Associated with Streptococcus: PANDAS), 골반 염증성 질환(Pelvic Inflammatory Disease: PID), 수포창, 심상성천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈(Pernicious anemia: PA), 급성 두창양 태선양 비강진, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, I, II, III형 다선 증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발성근염, 심근경색 후 증후군, 심낭절제술 증후군, 원발성 담즙성 담관염(Primary biliary cholangitis: PBC), 원발성 담즙성 간경병증, 원발성 면역결핍증, 원발성 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 진행성 염증성 신경병증, 건선, 건선성 관절염, 순적혈구 무형성증(Pure red cell aplasia: PRCA), 괴저성 농피증, 라스무센 뇌염, 레이노 현상, 반응성 관절염, 반사 교감신경 이영양증, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군(Restless legs syndrome: RLS), 복막후 섬유증, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 류머티스 혈관염, 사르코이드증, 조현병, 슈미트 증후군, 슈니츨러 증후군, 공막염, 경피증, 혈청병, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고 환 자가면역, 척추관절병증, 강직 인간 증후군(Stiff person syndrome: SPS), 아급성 세균성 심내막염(Subacute bacterial endocarditis: SBE), 수삭 증후군, 스위트 증후군, 시드넘 무도병, 교감성 안염(Sympathetic ophthalmia: SO), 전신 홍반성 루푸스(Systemic lupus erythematosus: SLE), 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소, 혈소판감소성자반(Thrombocytopenic purpura: TTP), 갑상선, 톨로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt syndrome: THS), 횡단 척수염, 1형 당뇨병, 궤양성 대장염(Ulcerativecolitis: UC), 미분화 결합 조직 질환(Undifferentiated connective tissue disease: UCTD), 미분화 척추관절병증, 두드러기 혈관염, 두드러기, 포도막염, 혈관 염, 백반증, 및 보그트-코야나기-하라다병. 다양한 실시형태에서, 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 염증성 질환은 건강한 세포를 보존하면서 치료된다.
다양한 구현예에서, 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 감염성 질환은 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 아시네토박터 감염, 악티노마이시즈증, 급성 이완성 척수염(Acute Flaccid Myelitis: AFM), 아프리카 수면병(아프리카 트리파노소마증), AIDS(후천성 면역결핍 증후군), 아메바 감염, 아메바증, 아나플라즈마 파고사이토필 감염, 아나플라즈마증, 안지오스트롱질루스증, 아니사키스병, 탄저병, 아르보바이러스병, 신경침습성 및 비-신경침습성, 용혈성 아카노박테리아균 감염, 아르헨티나 출혈열, 회충증, 아스페르길루스증, 아스트로바이러스 감염, 조류 독감, 바베시아증, 바실러스 세레우스 감염, 세균성 감염, 세균성 수막염, 세균성 폐렴, 세균성 질염, 박테로이드 감염, 대장섬모충증, 바르토넬라증, 베이리사카리스 감염, BK 바이러스 감염, 흑색털결절진균증, 블라스토시스토시스증, 볼리비아 출혈열, 보툴리즘, 보툴리즘(식품매개), 보툴리즘(유아), 보툴리즘(기타), 보툴리즘(상처), 브라질 출혈열, 브루셀라병, 림프절 페스트, 부르크홀데리아 감염, 부룰리 궤양, 칼리시바이러스 감염(노로바이러스 및 사포바이러스), 캘리포니아 혈청군 바이러스 질환, 캄필로박터, 캄필로박터증, 칸디다속 진균, 임상, 칸디다증(모닐리아증; 구강 칸디다증), 모세선충증, 카르바페네마제 생성 카르바페넴-내성 장내세균(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae: CP-CRE), 카르바페넴-내성 감염(Carbapenem-resistant Infection: CRE/CRPA), 카리온병, 고양이 발톱병, 봉와직염, 샤가스병(트리파노소마증), 연성하감, 수두, 치쿤군야 바이러스 감염(치쿤군야), 클라미다이아, 클라미다이아 트라코마티스, 클라미도필라 폐렴 감염, 콜레라, 색소모세포진균증, 키트리디오진균증, 시구아테라, 간디스토마증, 클로스트리듐 부르크홀데리아 디피실 장염, 클로스트리듐 디피실 감염, 클로스트리듐 퍼프린겐, 콕시디오이데스진균증 진균 감염(발리 열), 콜로라도 진드기열(Colorado tick fever: CTF), 감기(급성 바이러스 비인두염; 급성 코감기), 선천성 매독, 결막염, COVID-19(코로나 바이러스병 2019), 엔테로박터 종(Enterobacter spp.) CP-CRE, 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이) CP-CRE, 클레시엘라 종(Klebsiella spp.) CP-CRE, 크레이츠펠트-야콥병, 전염성 해면상 뇌병증(Creutzfeldt-Jacob Disease, transmissible spongiform encephalopathy: CJD), 크레이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease: CJD), 크리민-콩고 출혈열(Crimean-Congo hemorrhagic fever: CCHF), 딱지옴, 크립토콕쿠스증, 크립토스포리듐증(Crypto), 피부 유충이행증(Cutaneous larva migrans: CLM), 원포자충 속, 원포자충증, 낭충증, 사이토메갈로바이러스 감염, 뎅기 바이러스 감염, 뎅기, 1,2,3,4(뎅기 열), 뎅기-유사 병, 데스모데스무스 감염, 설사병, 디엔타모베이사시스(Dientamoebiasis), 디프테리아, 열두조충증, 용선충증, 이. 콜라이, 이. 콜라이 감염, 쉬가 독소-생성(Shiga toxin-producing: STEC), 동부 말 뇌염 바이러스병, 에볼라 출혈열(Ebola), 포충증, 에를리키아 샤펜시스 감염, 에를리키아 에인지감염, 엘리히증, 아나플라즈마증, 뇌염, 아르보바이러스 또는 부염증성, 요충증(요충 감염), 장구균 감염, 장내바이러스 감염, D68(EV-D68), 장내바이러스 감염, 비폴 리오(비폴리오 장내바이러스), 유행성발진 티푸스, 엡스타인-바 바이러스 감염성 단핵증(Mono), 전염성 홍반(제5병), 돌발 발진(제6병), 간질증, 비대흡충증, 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia: FFI), 제5병, 필라리아증, 독감(계절성), 식중독, 클로스트리듐 퍼프린겐에 의한 식중독, 자유생활 아메바증 감염, 진균 감염, 푸소박테륨 감염, 가스 괴저(클로스트리듐성 근괴사), 음부 헤르페스, 생식기혹, 지오트리쿰진균증, 풍진, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커 증후군(Gerstmann-Str
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ussler-Scheinker syndrome: GSS), 편모충증, 마비저, 유극악구충증, 임질, 서혜부육아종, 서혜부육아종(도너반증), A군 연쇄상구균 감염, A군 연쇄상구균, B군 연쇄상구균 감염, 구아나리토 바이러스, 헤모필루스 인플루엔자병, B형(Hib 또는 H-flu), 헤모필루스 인플루엔자 감염, 수족구병(foot and mouth disease: HFMD), 한센병, 한타 바이러스 감염, 한타바이러스 폐 증후군(Hantavirus Pulmonary Syndrome: HPS), 하트랜드 바이러스병, 헬리코박터 파일로리 감염, 용혈성 요독 증후군(Hemolytic Uremic Syndrome: HUS), 신증후군을 동반한 출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome: HFRS), 헨드라 바이러스 감염, A형 간염(Hep A), B형 간염(Hep B), C형 간염(Hep C), D형 간염(Hep D), E형 간염(Hep E), 헤르페스, 헤르페스 B 바이러스, 단순 포진, 대상 포진, 대상 포진 VZV(대상포진), Hib병, 히스토플라스마증 감염(히스토플라스마증), 구충 감염, HPV(인간 유두종바이러스), 인간 보카바이러스 감염, 인간 에인지 엘리히증(Human ewingii ehrlichiosis), 인간 과립구 아나플라즈마증(Human granulocytic anaplasmosis: HGA), 인간 면역결핍 바이러스/AIDS(HIV/AIDS), 인간 메타뉴모바이러스 감염, 인간 단핵구 엘리히증, 인간 유두종바이러스(HPV) 감염, 인간 파라인플루엔자 바이러스 감염, 왜소조충증, 농가진, 인플루엔자(독감), 인플루엔자(계절성), 침습성 폐렴구균 질환, 이소스포라증, 후닌 바이러스(Junin virus), 가와사키 증후군, 각막염, 킨겔라 킨개감염(Kingella kingae infection), 쿠루병, 라사열, 라사 바이러스, 레지오넬라증(재향군인병), 레슈마이어증, 나병(한센병), 렙토스피라병, 리스테리아증(리스테리아), 루요 바이러스, 라임병, 림프사상충증(상피병), 림프구성 맥락수막염(Lymphocytic Choriomeningitis: LCMV), 성병성 림프육아종감염(Lymphogranuloma venereum infection: LGV), 마추포 바이러스, 말라리아, 마르부르크 바이러스 감염, 홍역, 유비저(위트모어병), 뇌수막염, 뇌수막염 - 세균성, 뇌수막염-바이러스성, 수막구균성 질환, 요코가와흡충증, 미포자충증, 중동 호흡기 증후군(Middle East respiratory syndrome: MERS), 전염성 연속증(Molluscum contagiosum: MC), 원숭이두창, 단핵증, 모기-매개 질병, MRSA, 볼거리, 발진열(풍토성 티푸스), 균종, 마이코플라즈마 제니탈리움 감염, 마이코플라즈마 폐렴, 구데기증, 수막염균, 신생아 결막염(신생아 안염), 니파 바이러스 감염, 노카르다이아증, 노로바이러스, 사상충증(강변실명증), 간흡충증, 오르프 바이러스(구내염), 파라콕시디오이데스 진균증(남미 블라스토미세스진균증), 폐흡충증, 마비성 패독(마비성 패독, 시구아테라), 파스퇴렐라증, PEP, 기생충 감염, 백일해(백일 기침), 홍안병, 폐렴쌍구균 질환, 페렴구균 감염, 뉴모시스티스 폐렴(Pneumocystis pneumonia: PCP), 폐렴, 폐페스트, 회색질척수염(소아마비), 회색질척수염, 마비, 폴리오바이러스 감염, 폰티악열, 포와센 바이러스병, 프레보텔라 감염, 원발성 아메바성 뇌수막염(Primary amoebic meningoencephalitis: PAM), 진행성 다초점 백질뇌병증, 원생동물 감염, 앵무새병(앵무새열), 농포성 발진 질환(천연두, 원숭이두창, 우두), 광견병, 너구리 회충, 서교열, 물놀이 질병, 재귀열, 호흡기 세포융합 바이러스 감염, 라이 증후군, 리노스포리듐증, 리노바이러스 감염, 리케치아 감염, 구루병증(로키산 홍반열), 리프트 계곡열(Rift Valley fever: RVF), 백선, 로타바이러스 감염, 풍진, 사비아 바이러스, 살모넬라, 살모넬라 파라티피 감염, 살모넬라 티피 감염, 살모넬라증, SARS(중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome)), 옴, 성홍열, 주혈흡충증, 스콤브로이드, 패혈증, 패혈 쇼크, 패혈성 페스트, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 쉬가 독소-생산 에스케리키아 콜라이, 시겔라, 시겔라증, 대상포진, 대상포진(대상 포진), 천연두, 구내염(오르프 바이러스), 스포로트리쿰증, 반점열 구루병증, 세인트 루이스 뇌염 바이러스병, 포도상구균 감염, 포도상구균 감염(메티실린-내성(MRSA)), 포도상구균 식중독, 포도상구균 감염(반코마이신 중등도(VISA)), 패혈성 인두염, A군(침습성) 연쇄상구균 감염증(Strep A(침습성)), B군 연쇄상구균 감염증(Strep-B), 연쇄상구균 독성 쇼크 증후군, 분선충증, 아급성 경화성 지방층 염, 매독, 조충증, 파상풍 감염, 진드기 매개 질환, 백선성모창, 두부백선, 구간백선, 고부백선, 손백선, 흑색선, 족부백선, 손톱백선, 어루러기, 독성 쇼크 증후군, 톡소카라증(안구 유충이행증(ocular larva migrans: OLM)), 톡소카라증(내장 유충이행증(visceral larva migran: VLM)), 톡소플라즈마증, 트라코마, 섬모충증, 트리코모나스증, 선모충증 감염(선모충증), 편충증(편충 감염), 결핵(TB), 야토병(야생토끼열), 장티푸스, D군 장티푸스, 티푸스, 발진티푸스, 우레아플라즈마 우레알리티쿰 감염, 질증, 발리 열, 변이체 크레이츠펠트-야콥병(vCJD, nvCJD), 물마마(수두), 베네수엘라 말 뇌염, 베네수엘라 출혈열, 비브리오 콜레라(콜레라), 장염 비브리오균 감염증, 비브리오 패혈증균 감염, 비브리오병, 바이러스 감염, 바이러스 출혈열, 바이러스 출혈열(에볼라, 라사, 마르부르크), 바이러스 출혈열(Viral Hemorrhagic Fever: VHF), 바이러스 폐렴, 웨스트 나일 바이러스병, 서부 말 뇌염 바이러스병, 백색 사모(백색 윤선), 백일 기침, 황열, 예르시니아증(예르시나균), 예르시니아 가결핵성 감염, 예르시니아증, 제아스포라, 지카 열, 지카 바이러스, 선천적 지카 바이러스병, 비-선천적 지카 바이러스병, 지카 바이러스 감염(지카), 선천적 지카 바이러스 감염, 비-선천적 지카 바이러스 감염, 및 접합진균증. 다양한 실시형태에서, 개시된 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 감염성 질환은 건강한 세포를 보존하면서 치료된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 적어도 하나의 γδ T 세포를 활성화시키는 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 γδ T 세포 증식을 유발하거나 또는 증가시키는 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 γδ T 세포 탈과립화를 유발하거나 또는 증가시키는 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 γδ T 세포 사멸 활성을 유발하거나 또는 증가시키는 방법이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 건강한 세포를 보존하면서 대상체에서 γδ T 세포 사멸 활성을 유발하거나 또는 증가시키는 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 γδ T 세포독성을 유발하거나 또는 증가시키는 방법이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 건강한 세포를 보존하면서 대상체에서 γδ T 세포독성을 유발하거나 또는 증가시키는 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 γδ T 세포 동원을 유발하거나 또는 증가시키는 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 γδ T 세포 생존을 증가시키는 방법이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 γδ T 세포의 고갈에 대한 저항성을 증가시키는 방법이다.
본 발명의 추가 양상에 따르면, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양의 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함한다.
항체 또는 이의 단편의 용도
본 발명의 추가의 양상에 따르면, γδ T 세포(특히 Vδ1 T 세포)의 항원 인식, 활성화, 신호 전달 또는 기능을 연구하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 용도가 제공된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 항체는 γδ T 세포 기능을 조사하는 데 사용될 수 있는 검정에서 활성인 것으로 나타났다. 이러한 다중특이적 항체는 또한 γδ T 세포의 증식을 유도하는 데 유용할 수 있으며, 따라서 γδ T 세포(예컨대, Vδ1 T 세포)를 확장시키는 방법에 사용될 수 있다.
Vδ1 쇄에 결합하는 다중특이적 항체는 γδ T 세포를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지되거나 또는 샘플에서 Vδ1 T 세포를 선택적으로 검출 및/또는 단리시키기 위한 포획 리간드로서 사용될 수 있다. 표지된 항체는 당업계에 알려진 많은 방법, 예를 들어, 면역조직화학 및 ELISA에서 사용이 발견된다.
검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대, 3H, 14C, 32P, 35S, 또는 125I; 형광 또는 화학 발광 모이어티, 예컨대, 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트, 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 또는 루시퍼라제일 수 있다. 그런 다음 본 발명의 항체에 적용된 형광 표지는 형광-활성화 세포 분류(FACS) 방법에 사용될 수 있다.
따라서 다양한 실시형태에서, 본 발명은 생체내 γδ T 세포 조절 방법, γδ T 세포 결합 방법, γδ T 세포 표적화 방법, γδ T 세포 활성화 방법, γδ T 세포 증식 방법, γδ T 세포 확장 방법, γδ T 세포 검출 방법, γδ T 세포 탈과립화 유발 방법, γδ T 세포 사멸 활성 유발 방법, 항체 또는 이의 단편의 선택 방법을 포함하며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 본 명세서에 제공된 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 설명 및 구체적인 예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서, 다양한 변화 및 변형이 당업자에게 자명하게 될 것이므로 예시로만 제공됨이 이해되어야 한다. 본 발명은 이제 하기 비제한적인 실시예를 사용하여 기재될 것이다:
실시예
실시예 1. 물질 및 방법
인간 항체 발견
인간 파지 디스플레이를 이용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 항-인간 가변 Vδ1+ 도메인 항체를 생성하였다. 라이브러리를 Schofield 등(Genome biology 2007, 8(11): R254)에 기재된 바와 같이 작제하였고, 이것은 약 400억 개 인간 클론의 라이브러리를 나타내는 단일 쇄 단편 가변(scFv)을 포함하였다. 이 라이브러리를 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원, 방법, 선택, 선택해제, 스크리닝, 및 특징규명 전략을 사용하여 스크리닝하였다.
항원 제조
하기 실시예에 사용되는 TCRα 및 TCR β 불변 영역을 포함하는 가용성 yδ TCR 이종이량체의 설계는 문헌[Xu et al. (2011) PNAS 108: 2414-2419]에 따라 생성하였다. Vγ 또는 Vδ 도메인을 막관통 도메인이 결여된 TCRα 또는 TCRβ 불변 영역, 이어서 류신 지퍼 서열 또는 Fc 서열, 및 히스티딘 태그/링커로 프레임내 융합시켰다.
발현 작제물을 포유동물 EXPI HEK293 현탁 세포에서 일시적으로 형질감염시켰다(이종이량체에 대한 단일 또는 공동 형질감염으로). 분비된 재조합 단백질을 회수하고, 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 상청액으로부터 정제시켰다. 단량체 항원의 우수한 회수를 보장하기 위해, 샘플을 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 추가로 정제시켰다. 정제된 항원을 SDS-PAGE에 의해 순도에 대해 분석하고 분석 SEC에 의해 응집 상태에 대해 분석하였다.
항원 기능성 검증
델타 가변 1(Vδ1) 쇄를 함유하는 항원의 특이성을 REA173-밀테니사 Biotec 항-Vδ1 항체를 사용하여 γδ T 세포와의 경쟁으로 DELFIA 면역검정(퍼킨 엘머사(퍼킨 엘머사)) 및 유동-기반 검정에서 확인하였다.
해리 향상된 란탄족 형광 면역검정(DELFIA)
항원의 특이성을 확인하기 위해, DELFIA 면역검정을 플레이트에 직접 코팅된 항원(밤새 4℃에서 50㎕ PBS 중의 3㎍/㎖의 항원(Nunc #437111) 및 300nM에서 시작하는 1차 항체의 연속 희석으로 수행하였다. 검출을 위해 DELFIA Eu-N1 항-인간 IgG(퍼킨 엘머사 # 1244-330)를 50㎕의 3% MPBS(PBS + 3%(w/V) 탈지 분유)에 1/500 희석시켜 2차 항체로 사용하였다. 50㎕의 DELFIA 향상 용액(퍼킨 엘머사 #4001-0010)을 사용하여 현상하였다.
관심 항체의 친화도 순위를 항체가 플레이트에 코팅된 단백질 G를 통해 포획되고 가용성 바이오티닐화 L1(DV1-GV4) 항원이 50㎕(3M PBS) 중 5nM에 첨가된 DELFIA 면역검정을 사용하여 수행하였다. 검출을 위해 50㎕의 스트렙타비딘-Eu(검정 완충액 중 1:500, 퍼킨 엘머사)을 사용하고 신호를 DELFIA 향상 용액으로 현상시켰다. D1.3 hIgG1(문헌[England et al. (1999) J. Immunol. 162: 2129-2136]에 기재됨)을 음성 대조군으로 사용하였다.
파지 디스플레이 선택 출력을 scFv 발현 벡터 pSANG10으로 서브클로닝하였다(Martin et al. (2006) BMC Biotechnol. 6: 46). 가용성 scFv를 발현시키고, 직접 고정화된 표적에 대한 DELFIA에서의 결합에 대해 스크리닝하였다. 히트(Hit)를 3000 형광 단위 초과의 DELFIA 신호로 정의하였다.
항체 제조
선택된 scFv를 상업적으로 이용 가능한 플라스미드를 사용하여 IgG1 프레임워크로 서브클로닝하였다. expi293F 현탁 세포를 항체 발현을 위해 상기 플라스미드로 형질감염시켰다. 편의성을 위해, 달리 언급되지 않는 한, 이들 실시예에서 특징규명된 항체는 scFv로서 파지 디스플레이로부터 선택된 IgG1 포맷화 항체를 지칭한다. 그러나, 본 발명의 항체는 이전에 논의된 바와 같은 임의의 항체 포맷일 수 있다.
항체 정제
IgG 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 상청액으로부터 배취 정제시켰다. 그런 다음 농축된 단백질 A 용출물을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제시켰다. 정제된 IgG의 품질을 ELISA, SDS-PAGE 및 SEC-HPLC를 사용하여 분석하였다.
γδ T 세포 제조
풍부화된 γδ T 세포의 집단을 WO2016/198480(즉, 혈액-유래 γδ T 세포) 또는 WO2020/095059(즉, 피부-유래 γδ T 세포)에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 간략하면, 혈액-유래 γδ T 세포의 경우 PBMC를 혈액으로부터 수득하고 αβ T 세포의 자기 고갈에 적용하였다. 그런 다음 αβ-고갈된 PBMC를 7일 동안 OKT-3(또는 각각의 항-Vδ1 항체), IL-4, IFN-γ, IL-21 및 IL-1β의 존재 하에 CTS OpTmiser 배지(써모피셔사(ThermoFisher))에서 배양하였다. 배양 제7일에, 배지에 OKT-3(또는 각각의 항-Vδ1 항체), IL-21 및 IL-15를 추가 4일 동안 보충하였다. 배양 제11일에, 배지에 OKT-3(또는 각각의 항-Vδ1 항체) 및 IL-15를 추가 3일 동안 보충하였다. 배양 제14일에, 배지 절반을 새로운 완전한 OpTmiser로 교체하고 OKT-3(또는 각각의 항-Vδ1 항체), IL-15 및 IFN-γ를 보충하였다. 배양 제17일부터 계속, 배양물에 OKT-3(또는 각각의 항-Vδ1 항체) 및 IL-15를 3 내지 4일마다 보충하고; 배지 절반을 7일마다 새로운 배지로 교체하였다.
피부-유래 γδ T 세포의 경우, 피하 지방을 제거하여 피부 샘플을 준비하고 3mm 생검 펀치를 사용하여 다중 펀치를 만든다. 펀치를 탄소 매트릭스 그리드 상에 배치하고 G-REX6(윌슨 울프사(Wilson Wolf))의 웰에 배치한다. 각각의 웰을 AIM-V 배지(킵코사(Gibco), 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)), CTS 면역 혈청 대체물(라이프 테크놀로지즈사), IL-2 및 IL-15를 함유하는 완전 단리 배지로 채운다. 배양의 처음 7일 동안, 암포테리신 B(라이프 테크놀로지즈사)를 함유하는 완전 단리 배지를 사용하였다("+AMP"). 상부 배지를 부드럽게 흡인하고 플레이트 또는 생물반응기의 바닥에 있는 세포를 건드리지 않도록 노력하면서 2X 완전 단리 배지(AMP 없음)로 교체함으로써 배지를 7일마다 교환하였다. 그런 다음 배양 3주가 지나면, 생성된 유출 세포를 수거 전에 새로운 조직 배양 용기 및 새로운 배지(예를 들어, AIM-V 배지 또는 TexMAX 배지(밀테니사)) 및 재조합 IL-2, IL-4, IL-15 및 IL-21로 계대하였다. 선택적으로, 이어서 배양물 내에 또한 존재하는 αβ T 세포를 밀테니사에 의해 제공된 것과 같은 αβ T 세포 고갈 키트 및 연관 프로토콜의 도움으로 제거한다. 추가 참조를 위해 WO2020/095059를 참조한다.
γδ T 세포 결합 검정
고정된 농도의 정제된 항체를 250000개의 γδ T 세포와 인큐베이션시킴으로써 γδ T 세포에 대한 항체의 결합을 시험하였다. 이 인큐베이션을 Fc 수용체를 통한 항체의 비특이적 결합을 방지하는 차단 조건 하에 수행하였다. 인간 IgG1에 대한 2차 형광 염료-접합 항체를 첨가하여 검출을 수행하였다. 음성 대조군의 경우, 세포를 a) 아이소타입 항체 단독(재조합 인간 IgG), b) 형광 염료-접합 항-인간 IgG 항체 단독 및 c) a) 및 b)의 조합으로 준비하였다. 완전히 염색되지 않은 세포의 대조군 웰을 또한 준비하고 분석하였다. 양성 대조군으로서, 정제된 뮤린 단클론성 IgG2 항-인간 CD3 항체 및 정제된 뮤린 단클론성 IgG1 항-인간 TCR Vδ1 항체를 2 가지 상이한 농도로 사용하고 형광 염료-접합 염소 항-마우스 2차 항체로 염색하였다. FITC 채널에서 더 낮은 농도의 양성 대조군의 평균 형광 강도가 가장 높은 음성 대조군보다 적어도 10배 높았던 경우 검정이 허용되었다.
SPR 분석
아민 고용량 칩이 있는 MASS-2 기기(모두 독일 소재의 시에라 센서즈사(Sierra Sensors)로부터 구입)를 사용하여 SPR 분석을 수행하였다. 15nM의 IgG를 단백질 G를 통해 아민 고용량 칩(TS8.2의 경우 100nM)으로 포획하였다. L1(DV1-GV4) 항원을 다음 매개변수에 따라 2000nM에서 15.625nM까지의 1:2 희석 시리즈로 세포 위에 유동시켰다: 180초 회합, 600초 해리, 유량 30㎕/분, 전개 완충액 PBS + 0.02% Tween 20. 모든 실험은 MASS-2 기기에서 실온에서 수행되었다. 정상 상태 맞춤을 소프트웨어 Sierra Analyzer 3.2를 사용하여 랭뮤어 1:1 결합에 따라 결정하였다.
비교 항체
본 발명의 항체를 기재된 바와 같은 시험 검정에서 상업적으로 이용 가능한 항체와 비교하였다.
Figure pct00008
γδ TCR 하향조절 및 탈과립화 검정
시험 항체가 로딩되거나 또는 로딩되지 않은 THP-1(TIB-202™, ATCC) 표적 세포를 CellTracker™ Orange CMTMR(써모피셔사, C2927)로 표지하고 CD107a 항체(항-인간 CD107a BV421(클론 H4A3) 비디 바이오사이언시스사 562623)의 존재 하에 2:1 비로 γδ T 세포와 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 2시간 후, 유세포 분석법을 사용하여 γδ T 세포 상에서 γδ TCR의 표면 발현(TCR 하향조절 측정) 및 CD107a의 발현(탈과립화 측정)을 평가하였다.
사멸 검정(예를 들어, 도 6의 경우)
γδ T 세포의 사멸 활성에 대한 시험 항체의 감마 델타 T 세포 사멸 활성 및 효과를 유세포 분석법에 의해 평가하였다. γδ T 세포 및 CellTracker™ Orange CMTMR(써모피셔사, C2927) 표지된 THP-1 세포(항체가 로딩되거나 로딩되지 않음)의 20:1의 비로 시험관내 공배양 4시간 후 생존성 염료 eFluor™ 520(써모피셔사, 520 65-0867-14)으로 염색하여 살아있는 표적 THP-1 세포와 죽은 표적 THP-1 세포를 구별하였다. 샘플 획득 동안, 표적 세포를 CellTracker™ Orange CMTMR 양성에 대해 게이팅하고 생존성 염료의 흡수에 기반하여 세포 사멸에 대해 조사하였다. CMTMR 및 eFluor™ 520 이중 양성 세포를 사멸된 표적 세포로 인식하였다. γδ T 세포의 사멸 활성을 사멸된 표적 세포의 %로 표시하였다.
에피토프 매핑
에피토프 매핑에 사용된 모든 단백질 샘플(항원 L1(DV1-GV4) 및 항체 1245_P01_E07, 1245_P02_G04, 1252_P01_C08, 1251_P02_C05 및 1141_P01_E01)을 고질량 MALDI를 사용하여 단백질 완전성 및 응집 수준에 대해 분석하였다.
L1(DV1-GV4)/1245_P01_E07, L1(DV1-GV4)/1245_P02_G04, L1(DV1-GV4)/1252_P01_C08, L1(DV1-GV4)/1251_P02_C05, 및 L1(DV1-GV4)/1141_P01_E01 복합체의 에피토프를 고해상도로 결정하기 위해, 단백질 복합체를 중수소화 교차-링커와 인큐베이션시키고, 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신을 사용하여 다중 효소적 단백질분해에 적용하였다. 가교된 펩타이드의 풍부화 후, 샘플을 고해상도 질량 분광법(nLC-LTQOrbitrap MS)으로 분석하고 생성된 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
SYTOX-유동 사멸 검정
SYTOX 검정은 유세포 분석법을 사용하여 표적 세포의 T 세포 매개 세포용해의 정량화를 허용한다. 사멸된/사멸 중인 세포는 손상된 형질막이 있는 세포에만 침투하지만 건강한 세포의 온전한 세포막은 교차할 수 없는 사멸 세포 염색(SYTOX® AADvanced™, 라이프 테크놀로지즈사, S10274)에 의해 검출된다. NALM-6 표적 세포를 CTV 염료(Cell Trace Violet™, 라이프 테크놀로지즈사, C34557)로 표지하고 따라서 비표지된 효과기 T 세포와 구별하였다. 사멸/사멸되는 표적 세포는 사멸 세포 염료 및 세포 추적 염료의 이중 염색을 통해 식별된다.
표시된 효과기-대-표적 비(E:T, 1:1 또는 10:1)에서 효과기 및 CTV 표지된 표적 세포의 시험관내 공배양 16시간 후 세포를 SYTOX® AADvanced™으로 염색하고 FACSLyric™(BD)에서 획득하였다. 사멸 결과는 효과기 세포가 첨가되지 않은 대조군 웰에서 살아있는 표적 세포(최대 계수)에 비해 시험 샘플에서 살아있는 표적 세포의 수(샘플 계수)를 고려하여 계산된 표적 세포 감소율(%)로 제시된다:
표적 감소율(%) = 100-((샘플 계수/최대 계수)×100)
실시예 2. 항원 설계
감마 델타(γδ) T 세포는 CDR3 다클론성을 갖는 다클론성이다. 생성된 항체가 CDR3 서열에 대해 선택되는 상황을 피하기 위해(CDR3 서열은 TCR 클론에서 TCR 클론까지 상이할 것이기 때문), 항원 설계는 일관된 CDR3을 상이한 포맷으로 유지하는 것을 수반하였다. 이 설계는 생식계열이 암호화되어 모든 클론에서 동일한 가변 도메인 내의 서열을 인식하여, γδ T 세포의 더 넓은 하위세트를 인식하는 항체를 제공하는 항체를 생성하는 것을 목표로 한다.
항원 제조 과정의 또 다른 중요한 양상은 단백질로서 발현에 적합한 항원을 설계하는 것이었다. γδ TCR은 쇄간 및 쇄내 이황화 결합이 있는 이종이량체를 수반하는 복합 단백질이다. 류신 지퍼(LZ) 포맷 및 Fc 포맷을 사용하여 파지 디스플레이 선택에 사용될 가용성 TCR 항원을 생성하였다. LZ 및 Fc 포맷은 둘 다 잘 발현되었고 TCR(특히 이종이량체성 TCR, 예를 들어, Vδ1Vγ4)을 성공적으로 나타내었다.
γδ TCR에 대한 공개 데이터베이스 항목의 CDR3 서열은 단백질로서 잘 발현되는 것으로 밝혀졌다(RCSB Protein Data Bank entries: 3OMZ). 따라서 이는 항원 제조를 위해 선택되었다.
델타 가변 1 쇄를 함유하는 항원은 LZ 포맷에서 이종이량체(즉, 상이한 감마 가변 쇄와의 조합 - "L1", "L2", "L3") 및 Fc 포맷에서 이종이량체("F1", "F2", "F3") 또는 동종이량체(즉, 또 다른 델타 가변 1 쇄와의 조합 - "Fc1/1")로 발현되었다. 항원의 모든 델타 가변 1 쇄는 3OMZ CDR3을 함유하였다. 유사한 포맷을 사용하여 상이한 델타 가변 쇄(예컨대, 델타 가변 2 및 델타 가변 3)를 함유하는 γδ TCR 항원의 또 다른 시리즈를 설계하고 사용하여 비-특이적 또는 표적외 결합이 있는 항체("L4", "F9", "Fc4/4", "Fc8/8")를 선택해제하였다. 이들 항원을 또한 3OMZ CDR3을 포함하도록 설계하여 CDR3 영역에서 항체 결합이 또한 선택해제되도록 보장하였다.
항원 기능성 검증을 수행하여 설계된 항원이 항-TRDV1(TCR 델타 가변 1) 항체 및 다중특이적 항체를 생성하는 데 적합하다는 것을 확인하였다. δ1 도메인을 함유하는 항원에서만 검출이 보였다(도 1).
실시예 3. 파지 디스플레이
라운드 1 및 2에서 이종이량체성 LZ TCR 포맷을 사용하여 인간 scFv의 라이브러리에 대한 파지 디스플레이 선택을 수행하고, 두 라운드에서 이종이량체성 LZ TCR에 대한 선택해제를 수행하였다. 또는 동종이량체성 Fc 융합 TCR을 사용하여 라운드 1 및 인간 IgG1 Fc에 대한 선택해제 이어서 이종이량체성 LZ TCR에 대한 라운드 2 및 이종이량체성 LZ TCR에 대한 선택해제를 수행하였다(표 2 참조).
Figure pct00009
선택을 100nM 바이오티닐화된 단백질을 사용하여 용액상에서 수행하였다. 선택해제를 1㎛ 비-바이오티닐화된 단백질을 사용하여 수행하였다.
파지 디스플레이 선택의 성공은 다클론성 파지 ELISA(DELFIA)로 분석하였다. 모든 DV1 선택 출력은 표적 Fc 1/1, L1, L2, L3, F1 및 F3에 대한 원하는 결합을 나타내었다 비-표적 L4, F9, Fc 4/4, Fc 8/8 및 Fc에 대한 다양 한 결합 정도가 검출되었다(도 2A 및 도 2B 참조).
실시예 4. 항체 및 다중특이적 항체 선택
실시예 3에서 수득된 히트를 서열분석하였다(당업계에 알려진 표준 방법 사용). 130개의 고유한 클론을 식별하였으며, 이는 VH 및 VL CDR3의 고유한 조합을 나타내었다. 이러한 130개의 고유한 클론 중, 125개는 고유한 VH CDR3을 나타내었고 109개는 고유한 VL CDR3을 나타내었다.
고유한 클론을 재배열하고 특이성을 ELISA(DELFIA)로 분석하였다. TRDV1(L1, L2, L3, F1, F2, F3)에 결합하지만 TRDV2(L4)에는 결합하지 않는 94개의 고유한 인간 scFv 결합제의 패널이 선택에서 식별되었다.
앞으로 클론의 선택에 도움이 되도록 선택된 결합제의 친화도 순위가 포함되었다. 다수의 결합제는 25 내지 100nM 바이오티닐화된 항원과 반응하여 나노몰 범위에서 친화도를 나타내었다. 한 줌의 결합제는 5nM 항원과 강한 반응을 나타내었으며, 이는 가능한 한 자리 나노몰 친화도를 나타낸다. 일부 결합제는 100nM 항원과 반응을 나타내지 않았으며, 이는 마이크로몰 범위의 친화도를 나타낸다.
IgG 전환을 진행할 클론의 선택을 위해, 목표는 가능한 많은 생식계열 계통 및 많은 상이한 CDR3을 포함하는 것이었다. 또한, 글리코실화, 인테그린 결합 부위, CD11c/CD18 결합 부위, 짝지워지지 않은 시스테인과 같은 서열 경향은 피하였다. 또한, 다양한 친화도가 포함되었다.
선택된 클론을 상이한 공여자로부터 수득된 피부 유래 γδ T 세포를 사용하여 자연적 세포-표면 발현된 γδ TCR에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. IgG로 전환되도록 선택된 클론은 표 3에 제시되어 있다. 추가로, 그 다음 상기 항-TRDV1 결합제를 또한 표준 재조합, 발현, 가공 및 단리 방법에 의해서 다중특이적 항체로 포맷화하였다. 그 후, 두 제1 표적 항원(TRDV1) 및 제2 항원에 대한 결합을 상기 다중특이적 포맷에서 확인하였다.
Figure pct00010
실시예 5: 항체 SPR 분석
γδ 세포 결합 검정을 통해 통과된 경우 제조된 IgG 항체, 및 5개를 추가의 기능적 및 생물물리학적 특징규명을 위해 선택하였다. SPR 분석을 수행하여 평형 해리 상수(KD)를 결정하였다. 정상 상태 맞춤(이용 가능한 경우)과 함께 시험된 항체와 분석물의 상포작용에 대한 센서그램이 도 3에 제시되어 있다. 칩 상에 포획된 80RU의 IgG가 있는 TS8.2에 대한 결합은 검출되지 않았다. 결과는 표 4에 요약되어 있다.
Figure pct00011
실시예 6: TCR 관여 검정
본 발명자들은 선택된 항체의 기능적 특징규명에 사용될 여러 검정을 설계하였다. 첫 번째 검정은 항체 결합 시 γδ TCR의 하향조절을 측정함으로써 γδ TCR 관여를 평가하였다. 선택된 항체를 양성 대조군으로 사용되는 상업적인 항-CD3 및 항-Vδ1 항체 또는 양성 대조군으로서 1252_P01_C08(1139_P01_E04, 1245_P02_F07, 1245_P01_G06 및 1245_P01_G09의 경우)에 대해 시험하였다. 상업적 항-panγδ는 가변 쇄와 무관하게 모든 γδ T 세포를 인식하는 panγδ 항체이기 때문에 음성 대조군으로 사용되었고, 따라서 상이한 작용 모드를 가질 가능성이 있다.
검정을 3개의 상이한 공여자 샘플(94%, 80% 및 57% 순도를 갖는 샘플)에서 수득된 피부-유래 γδ T 세포를 사용하여 수행하였다. 결과는 도 4에 제시되어 있다. EC50 값은 하기 표 4에 요약되어 있다.
실시예 7: T 세포 탈과립화 검정
두 번째 검정은 γδ T 세포의 탈과립화를 평가하였다. γδ T 세포는 세포자멸사의 퍼포린-그랜자임-매개 활성화에 의해 표적 세포 사멸을 매개할 수 있는 것으로 생각된다. γδ T 세포의 세포질 내의 용해 과립은 T 세포 활성화 시 표적 세포를 향해 방출될 수 있다. 따라서, 표적 세포를 CD107a에 대한 항체로 표지화하고 유세포 분석법에 의해 발현을 측정하는 것을 사용하여 γδ T 세포의 탈과립화를 식별할 수 있다.
실시예 6에 대한 것과 같이, 선택된 항체를 양성 대조군으로서 상업적인 항-CD3 및 항-Vδ1 항체 또는 양성 대조군으로서 1252_P01_C08(1139_P01_E04, 1245_P02_F07, 1245_P01_G06 및 1245_P01_G09의 경우)에 대해 시험하였다. IgG2a, IgG1 및 D1.3 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 검정을 3개의 상이한 공여자 샘플(94%, 80% 및 57% 순도를 갖는 샘플)에서 수득된 피부-유래 γδ T 세포를 사용하여 수행하였다. 결과는 도 5에 제시되어 있다. EC50 값은 하기 표 5에 요약되어 있다.
실시예 8: 사멸 검정
세 번째 검정은 표적 세포를 사멸하기 위해 선택된 항체로 활성화된 γδ T 세포의 능력을 평가하였다.
실시예 6에 대한 것과 같이, 선택된 항체를 양성 대조군으로서 상업적인 항-CD3 및 항-Vδ1 항체 또는 양성 대조군으로서 1252_P01_C08(1139_P01_E04, 1245_P02_F07, 1245_P01_G06 및 1245_P01_G09의 경우) 및 음성 대조군으로서 항-panγδ에 대해 시험하였다. IgG2a, IgG1 및 D1.3 항체를 또한 아이소타입 대조군으로 사용하였다. 검정은 2명의 공여자(94% 및 80% 순도)에서 수득된 피부- 유래 γδ T 세포를 사용하여 수행하였고 결과는 도 6에 제시되어 있다.
실시예 6 내지 실시예 8에서 시험된 3가지 기능적 검정의 결과는 표 5에 요약되어 있다.
Figure pct00012
실시예 9: 에피토프 매핑
항원/항체 복합체의 에피토프를 고해상도로 결정하기 위해, 단백질 복합체를 중수소화 교차-링커와 인큐베이션시키고 다중-효소적 절단에 적용하였다. 가교된 펩타이드의 풍부화 후, 샘플을 고해상도 질량 분광법(nLC-LTQOrbitrap MS)으로 분석하고, 생성된 데이터를 XQuest(버전 2.0) 및 Stavrox 소프트웨어(버전 3.6)를 사용하여 분석하였다.
중수소화 d0d12가 있는 단백질 복합체 L1(DV1-GV4)/1245_P01_E07의 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 L1(DV1-GV4) 및 항체 1245_P01_E07 사이에 13개의 가교된 펩타이드를 검출하였다. 결과는 도 7에 제시되어 있다.
중수소화 d0d12가 있는 단백질 복합체 L1(DV1-GV4)/1252_P01_C08의 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 L1(DV1-GV4) 및 항체 1252_P01_C08 사이에 5개의 가교된 펩타이드를 검출하였다. 결과는 도 8에 제시되어 있다.
중수소화 d0d12가 있는 단백질 복합체 L1(DV1-GV4)/1245_P02_G04의 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 L1(DV1-GV4) 및 항체 1245_P02_G04 사이에 20개의 가교된 펩타이드를 검출하였다. 결과는 도 9에 제시되어 있다.
중수소화 d0d12가 있는 단백질 복합체 L1(DV1-GV4)/1251_P02_C05의 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 L1(DV1-GV4) 및 항체 1251_P02_C05 사이에 5개의 가교된 펩타이드를 검출하였다. 결과는 도 10에 제시되어 있다.
또 다른 항체, 클론 ID 1141_P01_E01과의 에피토프 결합을 또한 시험하였다. 중수소화 d0d12가 있는 단백질 복합체 L1(DV1-GV4)/1141_P01_E01의 트립신, 키모트립신, Asp-N, 엘라스타제 및 써모라이신 단백질분해 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석은 L1(DV1-GV4) 및 항체 1141_P01_E01 사이에 20개의 가교된 펩타이드를 검출하였다. 결과는 도 11에 제시되어 있다.
에피토프 매핑 결과의 요약은 표 6에 제시되어 있다.
Figure pct00013
실시예 10: Vδ1 T 세포의 확장
단리된 γδ T 세포의 확장을 선택된 항체 및 비교 항체의 존재 하에 조사하였다. 비교 항체는 양성 대조군으로서 OKT3 항-CD3 항체, 음성 대조군으로서 항체 없음 또는 아이소타입 대조군으로서 IgG1 항체로부터 선택되었다. 상업적으로 이용 가능한 항-Vδ1 항체, TS-1 및 TS8.2를 또한 비교를 위해 시험하였다.
실험 1:
초기 조사는 실시예 1의 혈액-유래 γδ T 세포에 대한 "γδ T 세포 제조"에 기재된 바와 같이 Complete Optimizer 및 사이토카인으로 웰당 70,000 개 세포를 시딩함으로써 수행하였다. 선택된 및 비교 항체를 4.2ng/㎖에서 420 ng/㎖까지의 다양한 농도 범위에서 시험하였다. 이 실험을 플라스틱에 대한 항체의 결합/고정화를 허용하는 조직 배양 플레이트를 사용하여 수행하였다.
세포를 제7일, 제14일 및 제18일에 수거하고 총 세포 계수치를 세포 계수기(NC250, 케모모테크사(ChemoMetec))를 사용하여 결정하였다. 결과는 도 7에 제시되어 있다. Vδ1 T 세포의 세포 생존력을 또한 각각의 수거물에서 측정하였고 모든 항체는 실험 내내 세포 생존력을 유지하는 것으로 나타났다(데이터는 제시되지 않음). 제18일에, Vδ1 T 세포의 백분율, 세포 계수 및 배수 변화를 또한 분석하였다. 결과는 도 8에 제시되어 있다.
도 7에서 인지할 수 있는 바와 같이, 항체를 갖는 배양물에서 생산된 세포의 총 수는 배양 전체에서 꾸준히 증가하였고, 상업적인 항-Vδ1 항체와 대등하거나 더 양호하였다. 제18일에, 가장 높은 시험된 농도에서 1245_P02_G04("G04"), 1245_P01_E07("E07"), 1245_P01_B07("B07") 및 1252_P01_C08("C08") 항체의 존재 하에서 Vδ1 양성 세포의 비율은 OKT3, TS-1 또는 TS8.2 대조군 항체가 존재한 배양물에서보다 더 높았다(도 8A 참조).
실험 2:
후속 실험을 실시예 1의 "γδ T 세포 제조"에 기재된 바와 같이 사이토카인과 함께 배양 용기 내의 단리된 세포에서 수행하였다. 실험 1과 비교하여, 표면이 항체 결합/고정화를 용이하게 하지 않는 상이한 배양 용기를 사용하였다. 선택된 항체 및 비교 항체를 42pg/㎖ 내지 42ng/㎖ 범위의 다양한 농도에서 시험하였다. 실험 2 동안, 결과는 삼중으로 실행한 실험으로부터 수득하였다.
세포를 제7일, 제11일, 제14일 및 제17일에 수거하고, 총 세포 계수치를 이전과 같이 세포 계수기를 사용하여 결정하였다. 결과는 도 9에 제시되어 있다. 제17일에, Vδ1 T 세포의 백분율, 세포 계수 및 배수 변화를 또한 분석하였다. 결과는 도 10에 제시되어 있다.
비-Vδ1 세포를 포함한 세포 조성물을 또한 실험 2 동안 측정하였다. 제17일에 세포를 수거하고 Vδ1, Vδ2 및 αβTCR의 표면 발현에 대해 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 각각의 배양물에서 각각의 세포 유형의 비율은 도 11에 그래프로 제시되어 있고 백분율 값은 표 6에 제공되어 있다.
Figure pct00014
이들 결과로부터 인지할 수 있는 바와 같이, Vδ1 양성 세포의 비율은 OKT3, TS-1 또는 TS8.2 대조군과 비교하여 B07, C08, E07 및 G04가 존재하는 배양물에서 더 크다. 따라서, 시험된 항체는, 배양물에 낮은 농도로 존재하는 경우에도, 상업적으로 이용 가능한 항체보다 더 효율적으로 Vδ1 양성 세포를 생산하고 확장시킨다.
실험 2의 제17일의 세포를 또한 CD3-CD56+를 포함한 추가적인 세포 마커에 대해 분석하여 CD27을 발현하는(즉, CD27+) 자연 살해(NK) 세포 및 Vδ1 T 세포의 존재를 식별하였다. 결과는 표 7에 요약되어 있다.
Figure pct00015
실시예 11: Vδ1 T 세포의 기능성
선택된 항체의 존재 하에 확장된 Vδ1 T 세포는 CDR3 영역의 다클론성 레퍼토리를 보유하였고 또한 SYTOX-유동 사멸 검정을 사용하여 기능성에 대해 시험하였다. 결과는 세포를 10:1 효과기-대-표적(E:T) 비로 사용하여 제14일에 실험 1 동안 수득된 세포(도 12A) 및 세포를 1:1 및 10:1 E:T 비로 사용하여 제17일(동결-해동 후)에 실험 2 동안 수득된 세포(도 12B)에 대해 제시된다.
도 12에서 인지될 수 있는 바와 같이, 모든 항체의 존재 하에 확장된 Vδ1 양성 세포는 표적 세포를 효과적으로 용해시켰으며, 이는 세포의 동결 및 해동 후에도 기능적임을 나타낸다.
실시예 12: 저장 후 세포의 기능성
동결 및 이어서 해동의 저장 단계 후 세포의 기능성을 또한 조사하였다. 세포의 일부를 실험 2의 제17일에 배양물에서 제거하고 동결시켰다. 그런 다음 세포를 해동시키고 IL-15와 함께 배양물에서 추가로 확장시켰다. 도 13은 동결 전에 B07, C08, E07, G04 또는 OKT-3 항체와 접촉된 배양물에 대해 동결-해동 후 세포 배양 7일 후에 총 세포 계수치를 나타낸다. 모든 배양물은 저장 후 증식 능력을 나타내었다. 배양을 제42일까지 계속하였고 총 세포 계수치를 이 기간 동안 모니터링하였다(결과는 도 14에 제시됨). 총 세포 수는 선택된 항체에 이전에 노출된 배양물에서 유지되거나 또는 증가하였다.
실시예 13: 변형된 항-Vδ1 항체에 대한 결합 동등성 연구.
ELISA-기반 항원 적정 결합 연구를 수행하여 HEK에서 제조된 1245_P02_G04 항체와 CHO에서 제조된 서열 및 이의 글리코실화 변이체를 비교하였다. 구체적으로, 프레임워크, 동종이형, 힌지-매개 효과기 기능성, Asn 297 글리코실화, 및/또는 제조 방법에 대한 변형을 수행한 다음 본 연구에 포함시켰다. 검정 ELISA 설정은 다음과 같았다: 항원은 항원 L1(TRDV1/TRGV4); 차단 완충액 - 2% Marvel/PBS; 5㎍/㎖에서 시작하는 1/2 희석 시리즈에 희석된 mAb를 포함하였고; ELISA 플레이트에서 항원-항체를 1시간 인큐베이션시키고; 비-특이적 결합을 제거하기 위해 3 x PBS-Tween, 이어서 3 x PBS로 세척하고; 1/500 희석에서 DELFIA Eu 표지된 항-인간 IgG(PerkinElmer; Cat #: 1244-330; 50㎍/㎖)를 2차 항체로 이용한 후; DELFIA 향상 용액(PerkinElmer, 지침에 따라 사용)을 첨가하기 전에 1시간 인큐베이션시키고; 시간-분해 형광분광법(TRF)으로 측정하였다. CHO에서 제조된 항체의 경우, 중쇄 및 경쇄 카세트를 함유하는 표준 발현 벡터를 음이온 교환 크로마토그래피에 기반한 낮은 내독소 조건 하에 제조하였다. DNA 농도는 260nm의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 서열은 Sanger 서열분석으로 확인하였다(cDNA의 크기에 따라 플라스미드당 최대 2개의 서열분석 반응 포함). 현탁-적응된 CHO K1 세포(원래 ATCC에서 유래 및 현탁 배양물에서 무혈청 성장에 적응)를 제조에 이용하였다. 시드 세포를 화학적으로 정의된 동물-성분 무함유, 무혈청 배지에서 성장시켰다. 그런 다음 세포를 벡터 및 형질감염 시약으로 형질감염시키고, 세포를 추가로 성장시켰다. 상청액을 원심분리 및 후속 여과(0.2㎛ 필터)로 수거하고 항체를 제형화 전에 MabSelect™ SuRe™을 사용하여 정제시켰다. 예시적인 탈푸코실화 항체를 생성하기 위해, 문헌[von Horsten HH et al. (2010) Glycobiology 20(12):1607-18]에 의해 처음으로 기재된 프로토콜을 상기 기재된 CHO 발현 플랫폼에 발현 및 정제에 앞서 도입하였다. 일단 제조 및 정제되면, mAb 탈푸코실화를 MS-기반 분석에 의해 확인하였다.
본 연구의 결과는 도 15에 요약되어 있다. 여기서 y-축은 ELISA 신호를 나타내고 x-축은 이용된 Vδ1 항원 농도(ug/㎖)를 나타낸다. 이 적정 연구에 포함된 항체는 요약되어 있고 추가의 세부내용을 위해, RSV = 항-RSV 제어 mAb 대조군(CHO에서 제조). G04 = 1245_P02_G04(HEK에서 제조, 서열번호 112). AD3 = 변이체 G04(CHO에서 제조; 서열번호 129 및 가변 도메인 서열 서열번호 131 및 서열번호 132 포함 및 불변 도메인 서열번호 133 및 서열번호 134 포함). AD4 = 힌지 변형된 AD3(CHO에서 제조; 서열번호 130 및 불변 도메인 서열번호 133 및 서열번호 135 포함). AD3gly = 조작된 CHO에서 제조된 탈푸코실화된 AD3. 모든 적정 하에, 동등한 항원 결합이 모든 변이체에 대해 관찰되었다.
실시예 14: 인간 생식계열 Vδ1 항원 및 이의 다형성 변이체에 대한 항-Vδ1 항체 결합 동등성 연구.
ELISA-기반 결합 연구 비교를 수행하여 다형성 인간 생식계열 Vδ1 항원(서열번호 128)에 대한 결합 대비 IMGT 데이터베이스당 인간 생식계열 Vδ1 항원(서열번호 1 참조)에 대한 항-Vδ1 항체를 연구하였다. 구체적으로, 항원 L1(표준 TRDV1/TRGV4 생식계열 서열 함유) 및 L1AV(상기 TRDV1 생식계열 다형성을 포함하는 변이체 TRDV1/TRGV4)와의 항체 결합 및 교차-반응성의 비교를 수행하였다. 결과는 도 16에 제시되어 있다. 항체는 다음과 같이 표시된다: G04 = 1245_P02_G04(서열번호 112); G04 LAGA = 힌지 Fc 변형이 있는 G04(L235A, G237A EU 넘버링; 서열번호 136). E07 LAGA =L235A, G237A, 서열번호 137이 있는 1245_P01_E07. C08 LAGA =L235A, G237A, 서열번호 138이 있는 1252_P01_C08, D1.3 = 대조군. 상기 항원에 대한 각 항체의 연속 희석을 수행하고 모든 희석에서, 각 항체 변이체에 대해, 두 항원에 대한 동등한 결합을 관찰하였다. 상기 시리즈에서 하나의 예시적인 희석(1nM 항체)에 대해 관찰된 동등한 결합이 제시된다.
실시예 15: 항-Vδ1 항체 결합은 Vδ1+ 세포 사이토카인 분비의 증가를 부여하였다
간략하면, 모든 항체를 10㎍/㎖로 희석시키고, 밤새 배양하여 항체를 플레이트에 결합시킨 후 세척하였다. 2개의 상이한 피부 공여로부터 피부-유래 γδ T 세포를 본 명세서의 다른 곳에 요약한 바와 같이 제조하였다(실시예 1; 구체적으로, 피부-유래 γδ T 세포 제조에 대한 섹션 참조). 그런 다음 이들 피부 세포를 표시된 바와 같이 결합된 항체를 함유하는 조직 배양 플레이트에 첨가하였다(웰당 100,000개 세포). 그런 다음 세포를 상청액의 수거 전에 1일 동안 방치하고 -80℃에서 저장하였다. 상청액의 사이토카인 분석을 위해서, MSD U-PLEX 인간 검정: K151TTK-1, K151UCK-1을 사용하였다(메조스케일 디아그노스틱스사(Mesoscale Diagnostics), 미국 매릴랜드 소재). 보 연구에 사용된 항체는 IgG1(비-Vδ1-결합 대조군), B07(1245_P01_B07), E07(1245_P01_E07), G04(1245_P02_G04; 1245) 및 C08(1252_P01_C08)을 포함하였다. 본 연구의 결과는 도 17에 제시되어 있다. 구체적으로, 도 17 (A) 및 도 17 (B)는 각각 피부-유래 γδ T 세포일 때 상청액에서 검출된 TNF-알파 및 IFN-감마의 양을 요약하고, 제시된 바와 같은 항-Vδ1 항체가 적용될 때 더 높은 수준이 관찰되었다.
실시예 16: 항-Vδ1 항체는 Vδ1+ 세포 그랜자임 B 수준/활성 증가를 부여하였다.
피부-유래 γδ T 세포를 본 명세서의 다른 곳에 요약된 바와 같이 제조하였다(실시예 1; 피부-유래 γδ T 세포 제조에 대한 섹션 참조). THP-1 세포를 먼저 GranToxiLux 프로브(세포 투과성 화학발색소 기질은 표적 세포에서 그랜자임 B 활성을 검출하도록 설계됨)와 제조업체의 지침에 따라 함께 로딩하였다(온코임닌사(OncoImmunin, Inc.), 미국 게이더스버그 소재). 그런 다음 THP-1 세포를 10㎍/㎖에서 도 18에 표시된 바와 같은 항체로 펄스화한 후 1: 20의 표적/효과기 비에서 피부-유래 γδ T와 혼합하였다. 그런 다음 공배양물을 간단히 원심분리시켜 신속한 접합체 형성을 보장한 후 1시간 동안 공배양하고 GranToxiLux 프로토콜에 따라 후속 유동 분석하였다. 보 연구에 사용된 항체는 IgG1(비-Vδ1-결합 대조군), B07(1245_P01_B07), E07(1245_P01_E07), G04(1245_P02_G04; 1245) 및 C08(1252_P01_C08)을 포함하였다. 결과는 도 18에 제시되어 있고 표시된 바와 같은 항-Vδ1 항체가 이러한 Vδ1+/THP-1 공배양 모델 시스템에 적용될 때 관찰된 표적 암세포에서 더 높은 그랜자임 B 수준을 강조한다.
실시예 17: 항-Vδ1 항체는 인간 조직에서 면역 세포의 조절 및 증식을 부여하였다.
인간 피부 펀치-생검(5 명의 상이한 공여자로부터 유래)을 제시된 바와 같은 항체와 함께 배양물에서 21일 동안 인큐베이션시켰다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 피하 지방 등을 제거함으로써 피부 샘플을 제조하였다(실시예 1; 피부-유래 γδ T 세포 제조에 대한 섹션 참조). 그런 다음 각 공여의 복제 펀치를 탄소 매트릭스 그리드 상에 배치한 다음 G-REX6(윌슨 울프사)의 웰에 배치하였다. 각각의 웰을 또한 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 완전 배지로 채웠다. 상이한 항체의 효과를 조사하고 비교하기 위해, 이들을 제0일, 제7일, 제14일에 100ng/㎖의 작동 농도로 첨가하였다. 배양물에서 21일 후 세포를 수거하고 유세포 분석법으로 분석하였다. 상기 연구의 결과는 도 19에 제시되어 있고 구체적으로 상이한 항체의 조절 효과에서 현저한 차이를 강조한다: 좌측에서 우측 순서로: Vd1 TS8.2 = TS8.2(써모 피셔사); OKT-3 (바이오레전드사); C08 IgG1 =1252_P01_C08; E07 =1245_P01_E07; G04 = 1245_P02_G04. 도 19 (A)는 배양 종료 시 관찰된 생존 가능한 pan-γδ TCR 양성 세포의 평균 양을 강조하며; 결과는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 총 살아있는 세포 집단의 게이팅된 분율 (퍼센트 평균 + Std Dev)로 제시된다. pan-γδ 함량 분석의 경우 유동 게이팅 전략은 다음과 같다: 단일항 > 살아있는 세포> Pan-γδ 항체(밀테니사, 130-113-508). 도 19 (B)는 배양 종료 시 관찰된 생존 가능한 Vδ1+ TCR 양성 세포의 평균 양을 강조하며; 결과는 유세포 분석법에 의해 분석된 바와 같이 총 살아있는 세포 집단의 게이팅된 퍼센트 분율 (퍼센트 평균 + Std Dev)로 제시된다. Vδ1+ 세포 함량 분석의 경우, 유동 게이팅 전략은 다음과 같다: 단일항 > 살아있는 세포> Panγδ(밀테니사, 130-113-508) > Vδ1(밀테니사, 130-100-553). 도 19 (C)는 배양 종료 시 관찰된 생존 가능한 이중 양성 Vδ1+ CD25+ 세포의 수를 강조하며; 결과는 총 살아있는 세포 집단의 게이팅 분율(퍼센트 평균 +Std Dev)로 제시된다. CD25+ Vδ1+ 세포 함량 분석을 위해, 유동 게이팅 전략은 다음과 같다: 단일항 > 살아있는 세포 > Panγδ(밀테니사, 130-113-508) > Vδ1(밀테니사, 130-100-553) > CD25(밀테니사, 130-113-286). 본 연구의 조합된 결과는 비교 항체 TS8.2 및 OKT3에 대한 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체의 차등 효과를 요약한다. 그리고 이 이론에 얽매이지 않으면서, TS8.2 또는 OKT3에 의해 Vδ1+ 세포에 대해 부여된 덜 유리한 효과에 대한 한 가지 가능성은 이 모델 시스템에서 시간 경과에 따라 면역 세포 기능에 대한 이들 비교 분자에 의해 부여된 유해한 효과 때문일 수 있다.
실시예 18: 항-Vδ1 항체는 TIL에서 면역 세포의 조절 및 증식을 부여하였다.
연구를 수행하여 인간 종양 침윤 림프구(TIL)의 조절 및 증식이 부여된 항-Vδ1 항체를 탐색하였다. 이들 연구를 위해, 인간 신세포 암종(RCC) 종양 생검을 신선하게 수송하고 수령 시 처리하였다. 구체적으로, 조직을 약 2mm2로 잘게 잘랐다. 최대 1g의 조직을 적절한 세포 표면 분자의 절단을 방지하기 위해 0.2× 농도에서 사용된 효소 R을 제외하고 제조업체에 의해 권고된 농도에서 밀테니사의 종양 해리 키트로부터의 효소 및 4.7㎖ RPMI와 함께 각각의 밀테니사 C 튜브에 배치하였다. C-튜브를 가열기가 장착된 gentleMACS™ Octo 해리기에 배치하였다. 연부 종양의 해리를 위해 프로그램 37C_h_TDK_1을 선택하였다. 그런 다음 소화물을 70mM 필터를 통해 여과하여 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 10% FBS를 함유하는 RPMI를 소화물에 첨가하여 효소적 활성을 급랭시켰다. 세포를 RPMI/10%FBS로 2회 세척하고 계수를 위해 재현탁하였다. 그런 다음 유래된 세포를 TC 웰(24-웰 G-REX, 윌슨 울프사)에 웰당 2.5×10e6개로 시딩하였다. 그런 다음 세포를 사이토카인이 있거나 없이 그리고 항체가 있거나 없이 18일 동안 인큐베이션시켰다. 본 연구에 포함된 항체는 도 20에 요약되어 있다. 이들은 OKT3(최대 50ng/㎖) 및 본 명세서에서 "C08"이라고 하는 1252_P01_C08(최대 500ng/㎖)을 포함한다. 포함되는 경우, 이들 항체의 볼러스 첨가물을 제0일, 제7일, 제11일 및 제14일에 첨가하였다. 상기 인큐베이션 동안, 배지를 제11일 및 제14일에 새로운 배지로 교체하였다. 유세포 분석법 분석을 제0일 및 제18일에 수행하여 림프구 표현형뿐만 아니라 세포 수의 배수 변화를 결정하였다. 세포를 먼저 살아있는 CD45+ 세포에서 이어서 표시된 바와 같이 게이팅하였다. 재조합 사이토카인이 포함된 아암에서 이들을 다음과 같이 첨가하였다. 제0일: IL-4, IFN-γ, IL-21, IL-1β. 추가적인 IL-15를 제7일, 제11일, 제14일에 포함시켰다. 추가적인 IL-21 및 IFN-γ를 제7일 및 제14일에 각각 포함시켰다. 도 20 (A)는 표시된 경우 사이토카인 지지체(CK)가 있거나 없이 C08 또는 OKT3의 존재 하에 18일 배양 후 TIL Vδ1+ 세포에서 배수 증가를 나타낸다. 이러한 결과는 항체 또는 사이토카인 단독과 비교하여, 사이토카인의 존재 하에 C08 또는 비교 OKT3 항체의 적용에 따른 TIL Vδ1+ 세포의 실질적인 배수 증가를 나타낸다. 도 20 (B)는 수거 후 총 Vδ1 세포 수의 증가를 나타낸다. 이러한 결과는 항체 또는 사이토카인 단독과 비교하여, 사이토카인의 존재 하에 C08 또는 비교 OKT3 항체와 배양 후 TIL Vδ1+ 세포 수의 실질적인 증가를 나타낸다. 도 20 (C)는 세포의 유세포 분석법 분석에서 사용되는 예시적인 게이팅 전략을 제시한다. 살아있는 CD45+ 세포 집단으로부터 세포를 정방향 및 측면 산란 특성에 기반하여 림프구 상에서 게이팅한 다음(제시되지 않음), γδ T 세포를 T 세포 수용체에 대한 염색에 의해 αβ T 세포로부터 분리시켰다. 마지막으로, 총 γδ T 세포 집단 내의 Vδ1 세포의 비율을 결정하였다. 제18일에 대한 예시적인 데이터는 표시된 바와 같이 2가지 조건에 대해 제시된다(+/-1252_P01_C08): 64.3% 세포는 CD45+였고, 이러한 CD45% 세포 중, 53.1%는 γδ+였고, γδ 세포 중, 89.7%는 Vδ1+였다. 도 20 (D)는 수거 시 TIL Vδ1+ 세포의 세포-표면 표현형 프로파일을 제시한다. C08 항체와 배양 후 더 높은 수준의 CD69가 관찰되었다. 도 20 (E)는 수거 시 살아있는 CD45-양성 게이트 내의 TIL γδ-음성, CD8-양성 림프구 분획의 분석을 제시한다. 요약하면, 조합된 결과는 TIL 집단에 대해 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-Vδ1 항체에 의해 부여된 조절 효과를 강조한다.
실시예 19: 항-Vδ1 항체는 Vδ1+ 세포 매개 세포독성 및 병든 세포-특이적 세포독성의 향상을 부여하였다.
세포독성/효력-검정 및 연구를 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-Vδ1 항체(1245_P02_G04; 1245_P01_E07; 1252_P01_C08) 및 도 21에 표시된 바와 같은 대조군(mAb 없음 또는 D1.3)을 포함하거나 하지 않는 Vδ1+ 효과기 세포, THP-1 단핵구 암 세포, 및 건강한 1차 단핵구의 삼중배양물을 포함하는 모델 시스템에서 수행하였다. 간략하면, 모든 항체를 PBS에서 10㎍/㎖으로 희석시키고 항체를 플레이트에 결합시키기 위해 384-웰 울트라 이미징 검정 플레이트(퍼킨 엘머사)에서 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, PBS로 세척하였다. 건강한 대조군 단핵구를 자기 활성화 세포 분류(MACS; 바이오테크사)를 사용하여 음성 선택에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC; 론자사)로부터 단리시켰다. 단핵구 및 배양된 THP-1 세포(ATCC)를 각각 [0.5㎛] CellTrace Violet 및 CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 20 분 동안 염색한 후 1:1 비로 혼합하였다. 확장된 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 조직 배양 플라스크로부터 떼어내고 연속 희석시켜 효과기 대 표적 비(E:T)의 범위를 생성한 후 THP1:단핵구 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포 현탁액을 384-웰 검정 플레이트에 시딩하여 웰당 1,000개의 THP-1 세포의 최종 세포 시딩 밀도, 웰당 1,000개의 단핵구, 및 γδ T-세포의 범위(60:1의 상위 E:T 비)를 제공하였다. 24시간 후 살아있는 THP-1 및 건강한 대조군 단핵구의 수를 결정하기 위해, 10x 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 살아있는 세포 균주의 크기, 형태, 질감 및 강도에 기초하여 정량화하였다. 결과는 도 21에 제시되어 있다. 도 21(A)는 표시된 바와 같이 플레이트-결합된 mAb 또는 대조군의 존재 하에 γδ T-세포와의 삼중 공배양 24 시간 후 THP-1 및 단핵구 세포 수를 제시한다. 세포 수는 살아있는 세포 이미징을 사용하여 고함량 공초점 현미경을 사용하여 계산하였다. 도 21(B)는 24시간 공배양 후 상위 E:T 비(60:1)를 보존하면서 병든 세포 특이적 사멸과 병들지 않은 건강한 세포 사이의 창을 강조하도록 설계된 막대 차트 표현을 제시한다: 좌측 막대 차트; 병들지 않은 세포(1차 인간 단핵구)의 사멸에 비해 병든 세포(THP-1)의 사멸에서 배수 증가. 우측 막대 차트; 동일한 데이터이지만 대조군에 비해 향상된 사멸율로 표현된다. 도 21(C)는 도 (A)에서 계산된 바와 같이 mAb 없음 대조군과 비교하여 Vδ1 mAb의 존재 하에 THP-1 표적 세포를 사멸시키는 Vδ1 γδ T-세포 효력의 개선율을 요약하는 표로 작성된 결과를 제시한다. 도 21(D)는 50% THP-1 세포 사멸을 부여하는 데 필요한 γδ T-세포 수로 표현된 도 (A)에서 계산된 바와 같은 EC50 값의 표로 작성된 결과를 제시한다. 도 21에 요약된 바와 같은 조합된 결과 및 발견은 Vδ1+ 세포의 세포독성 및 병든 세포 특이성을 향상시키는 본 명세서에 기재된 항체의 능력을 강조한다.
실시예 20: 다중특이적 항체는 Vδ1+ 효과기 세포 매개 세포독성의 향상을 부여하였으며; 조직-중심 질환 연관 항원을 표적화한다.
세포독성/효력-검정 연구를 수행하여 Vδ1+ 효과기 세포 및 A-431 암 세포의 공배양물에 대한 다중특이적 항체의 효과를 탐구하였다. A-431(EGFR++; ATCC) 표적 세포를 384-웰 이미징 플레이트(퍼킨 엘머사)에 웰당 1,000개의 세포로 시딩하고 DMEM(10% FCS)에서 밤새 37℃에서 인큐베이션시켰다. 표시된 바와 같은 항체 및 다중특이적 항체를 10㎍/㎖로 희석시키고 검정 플레이트(2㎍/㎖ 최종 검정 농도)에 첨가하였다. 확장된 피부- 유래 Vδ1 γδ T-세포를 조직 배양 플라스크로부터 떼어내고 연속 희석시켜 E:T 비의 범위(60:1의 상위 E:T 비)를 제공한 후 검정 플레이트에 첨가하였다. A-431 세포를 항체 또는 대조군의 존재 하에 Vδ1 γδ T-세포와 30℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 24시간 인큐베이션 후, Hoechst 33342(써모피셔사)를 균주 세포 (2㎛ 최종)에 첨가하였다. 살아있는 A-431 세포의 수를 결정하기 위해, 10x 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 살아있는 세포 균주의 크기, 형태, 질감 및 강도에 기초하여 정량화하였다. 표시된 바와 같은 대조군, 비교, 항체 및 다중특이적 항체가 있거나 없는 모델 시스템에서 표적 세포의 50%가 사멸되는 E:T 비를 결정하기 위한 효과기/표적(E:T) 시간 경과 연구. 결과는 도 22에 제시되어 있다.
먼저, 도 22(A 내지 D)는 Vδ1+/A-431 공배양물이 항-Vδ1 x 항-TAA(EGFr) 이중특이적 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 항체가 있거나 없는 연구인 예시적인 공배양 결과를 제시하며 여기서 (제1 표적에 대한) 항-Vδ1 VL+VH 결합 도메인은 (제2 표적에 대한) 항-EGFr 결합 모이어티의 CH1-CH2-CH3 도메인과 조합된다. 대조군 및 비교는 표시된 바와 같이 이용된다; 좌측에서 우측으로: mAb 없음 = 첨가된 항체 없음; D1.3 = D1.3 대조군; D1.3 IgG LAGA = D1.3 + L235A,G237A; D1.3 FS1-67 = EGFr 결합 불변 도메인 + L235A, G237A(서열번호 139)가 있는 D1.3 가변 도메인; 세툭시맙(자체 제조). 보다 구체적으로, 도 22(A)는 전술된 대조군, 비교, 및 하기 시험 물품과의 5시간 공배양물에 대한 결과를 제시한다: C08-LAGA = L235A, G237A(서열번호 138)가 있는 1252_P01_C08; C08 FS1-67 = L235A, G237A(서열번호 140)를 함유하는 EGFr 결합 도메인과 조합된 1252_P01_C08. 도 22(B)는 전술된 대조군, 비교, 및 하기 시험 물품과의 5시간 공배양물에 대한 동등한 데이터를 제시한다: G04-LAGA = L235A,G237A가 있는 1245_P02_G04; G04 FS1-67 = L235A, G237A(서열번호 141)를 함유하는 EGFr 결합 도메인과 조합된 1245_P02_G04. 도 22(C)는 대조군, 비교, 및 하기 시험 물품과의 5시간 공배양물의 동등한 데이터를 제시한다: E07-LAGA = L235A,G237A가 있는 1245_P01_E07; E07 FS1-67 = L235A, G237A(서열번호 142)를 함유하는 EGFr 결합 도메인과 조합된 1245_P01_E07. 도 22(D)는 5, 12 및 24시간에 걸쳐 대조군, 비교, 및 시험 물품의 존재 하에 Vδ1 γδ T-세포의 세포독성의 개선율을 요약하는 표를 제시한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이 다중특이적 포맷으로 제시될 때 450% 초과 향상이 관찰될 수 있다.
두 번째로, 도 22(E 내지 H)는 Vδ1+/A-431 공배양이 항-Vδ1 x 항-TAA(EGFr) 이중특이적 결합 모이어티를 포함하는 다중특이적 항체가 있거나 없이 연구된 예시적인 결과를 제시하며 여기서 (제1 표적에 대한) 항-Vδ1 결합 도메인은 전장 항체(VH-CH1-CH2-CH3/VL-CL)를 포함하며 이어서 (제2 표적에 대한) 항-EGFr scFv 결합 모이어티와 조합된다. 대조군 및 비교는 표시된 바와 같이 이용된다; 좌측에서 우측으로: 좌측에서 우측으로: mAb 없음 = 첨가된 항체 없음; D1.3 = 대조군; D1.3 IgG LAGA = D1.3 + L235A, G237A; D1.3 LAGA 세툭시맙 = L235A, G237A 및 C-말단 세툭시맙-유래 scFv(서열번호 143)가 있는 D1.3; 세툭시맙(자체 제조). 보다 구체적으로, 도 22(E)는 전술된 대 조군, 비교, 및 하기 시험 물품과의 5시간 공배양물을 제시한다: C08-LAGA = L235A, G237A가 있는 1252_P01_C08; C08 LAGA 세툭시맙 = L235A, G237A 및 C-말단 세툭시맙-유래 scFv(서열번호 144)가 있는 1252_P01_C08. 도 22(F)는 전술된 대조군, 비교, 및 하기 시험 물품과의 5시간 배양물을 제시한다: G04-LAGA = L235A, G237A가 있는 1245_P02_G04; G04 LAGA 세툭시맙 = L235A, G237A 및 C-말단 세툭시맙-유래 scFv(서열번호 145)가 있는 1245_P02_G04. 도 22(G)는 대조군, 비교, 및 하기 시험 물품과의 5시간 배양물을 제시한다: E07-LAGA = L235A, G237A가 있는 1245_P01_E07; E07 LAGA 세툭시맙 = L235A, G237A 및 C-말단 세툭시맙-유래 scFv(서열번호 146)가 있는 1245_P01_E07. 도 22(H)는 5, 12 및 24시간에 걸쳐 대조군, 비교 및 시험 물품의 존재 하에 Vδ1 γδ T-세포의 효력 개선율을 요약하는 표를 제시한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 단편이 다중특이적 포맷으로 제시될 때 300% 초과 향상이 관찰될 수 있다.
세 번째로, 도 22(I 및 J)는 데이터를 나타내는 예시적인 대안적 접근법을 요약한다. 구체적으로 표시된 바와 같은 모든 성분 부분 및 비교에 대해 24시간 시점에서 상대적인 EGFR+ 세포에 대한 Vδ1+ 효과기 세포 세포독성에 대해 다중특이적 항체 E07 FS1-67 (I) 또는 C08 FS1-67 (J)에 의해 부여된 개선율이 제시된다.
실시예 21: 다중특이적 항체는 Vδ1+ 매개 세포독성 및 병든 세포-특이적 세포독성의 향상을 부여하였으며; 조혈-중심 질환 연관 항원을 표적화한다.
Vδ1 단클론성 항체에 연결된 종양 연관 항원(TAA)이 이중특이적 포맷으로 특이적 표적 세포의 Vδ1 γδ T-세포 사멸을 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 세포독성/효력-검정 및 연구를 항-Vδ1 x 항-TAA(CD19) 다중특이적 항체를 포함하는 다중특이적 항체가 있거나 없이 삼중배양물 Vδ1+ 효과기 세포, 및 Raji 암 세포, 및 건강한 1차 단핵구를 포함하는 모델 시스템에서 수행하였다. 구체적으로, Raji 세포(CD19++; ATCC)를 Vδ1 x CD19 다중특이적 항체의 존재 하에 Vδ1 γδ T-세포와 인큐베이션시켰다. 모든 항체를 4㎍/㎖(최종 검정 농도 1μ g/㎖)로 희석시키고 384-웰 이미징 플레이트(퍼킨 엘머사)에 첨가하였다. 확장된 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 조직 배양 플라스크에서 떼어내고 연속 희석시켜 효과기 대 표적 비의 범위(E:T)를 제공하였다. Raji 세포를 [0.5㎛] CellTrace Far Red로 염색한 후 적정된 Vδ1 γδ T-세포와 1:1로 혼합하였다. 세포 현탁액을 384- 웰 검정 플레이트에 시딩하여 웰당 1,000 개 Raji 세포의 최종 세포 시딩 밀도, 및 γδ T-세포의 범위(30:1의 상위 E:T 비)를 제공하였다. 24시간 후 살아있는 Raji의 수를 결정하기 위해, 10x 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초첨 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 살아있는 세포 균주의 크기, 형태, 질감 및 강도에 기초하여 정량화하였다. 결과는 도 23에 캡쳐되어 있다. 여기에 이용된 항체 및 비교는 표시된 바와 같다. 구체적으로, RSV IgG = 모타비주맙 비-결합 대조군, G04 = 1245_P02_G04; E07= 1245_P01_E07; D1.3 VHVL = 중쇄 C-말단 항-CD19 scFv가 있는 D1.3 HEL(이용된 scFv 결합 모듈의 경우 서열번호 157 참조); G04 VHVL = 중쇄 C-말단 항-CD19 scFv(서열번호 158)가 있는 1245_P02_G04 LAGA; E07 VHVL = 중쇄 C-말단 항-CD19 scFv(서열번호 159)가 있는 1245_P01_E07. 도 23(A) (i) 50% Raji 세포 사멸을 유도하는 데 필요한 γδ T-세포 수 또는 E:T 비로 표현된 계산된 EC50, 및 (ii) mAb 없음 대조군 과 비교하여 EC50의 개선율을 요약하는 표. 도 23(B) Vδ1-CD19 다중특이적 항체의 존재 하에 Raji 표적 세포의 50%를 용해시키는 γδ T-세포의 능력의 개선율을 나타내는 막대 차트.
실시예 24: 인간 및 cyno Vδ1에 대한 Vδ1-CD19 이중특이적 항체 결합 친화도
표적에 대한 항체의 결합 친화도(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄, 인간 및 cyno 항원 모두)를 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사(Reichert Technologies))를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이랑체 또는 cyno Vδ1 이종이랑체를 세포 위로 유동시켰다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 이들 데이터는 이중특이적 항체가 인간 및 cyno Vδ1 모두에 결합함을 입증한다.
실시예 25A: Vδ1 γδT-세포 활성화 및 세포독성 검정에서 Vδ1-CD19 이중특이적 항체.
음성 자기 활성화 세포 분류(MACS; 밀테니바이오테크사)를 사용하여 PBMC(론자사)로부터 건강한 B-세포를 분리시켰다. 암성 NALM-6 세포(ATCC), Raji 세포(ATCC) 및 건강한 단리된 B-세포에서 CD19의 발현을 결정하였다. 간략하면, 5×10^4개의 세포를 CD19 항체(바이오레전드사)와 함께 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후 세척 및 고정시켰다. CD19의 발현을 유세포 분석법(MACSQuant10, 밀테니바이오테크사)에 의해 결정하였다. 결과는 도 25A에 제시되어 있다.
CD19+ 표적 세포 세포독성 및 CD19+ 건강한 세포 보존에 대한 CD19-Vδ1 이중특이적 항체의 효과를 Opera Phenix(퍼킨 엘머사)에서 고함량 공초점 이미징을 사용하여 결정하였다. NALM-6, Raji 및 B 세포를 [0.5㎛] CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 20분 동안 염색하였다. 이중특이적 항체 및 대조군을 PBS에서 연속 희석시킨 후 384-웰 이미징 검정 플레이트(퍼킨 엘머사)에 첨가하였다. 확장된 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 조직 배양 플라스크로부터 떼어내고, 현탁액 중의 NALM-6, Raji 또는 B-세포와 1:1로 혼합하기 전에 기본 성장 배지에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 384-웰 분석 플레이트에 시딩하여 웰당 2,000개의 NALM-6, Raji 또는 B-세포 및 웰당 2,000개의 Vδ1 γδ T-세포의 최종 세포 시딩 밀도를 제공하였다. 최종 검정 항체 농도는 6.6nM 내지 66pM 범위였다. 세포를 24시간 동안 공배양한 후 DRAQ7(최종 1:300, 압캠사(Abcam))으로 염색하였다. 살아있는 표적 세포의 수를 결정하기 위해, 10x 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 CFSE 염색의 크기, 형태, 질감 및 강도 및 DRAQ7 염색의 부재에 기초하여 정량화하였다. 결과는 도 25 B 내지 E에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 활성화 및 탈과립화에 대한 CD19-Vδ1 이중특이적 항체의 효과를 결정하기 위해, Vδ1 TCR 하향조절 및 CD107a 상향조절을 CD19+ 표적 세포 및 CD19+ 건강한 세포의 존재 하에 정량화하였다. 간략하면, 항체를 PBS에서 연속적으로 희석시킨 후에 U-바닥 96-웰 플레이트에 첨가하였다. NALM-6 및 단리된 B-세포를 [0.5㎛] CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 20분 동안 염색하였다. 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 배양 플라스크에서 떼어내고 세포 현탁액을 NALM-6 또는 B-세포와 0.5:1로 혼합하였다. 세포 현탁액을 웰당 2.5×10^4개의 Vδ1 γδ T-세포 내지 웰당 5×10^4개의 NALM-6 또는 B-세포로 분석 플레이트에 시딩하였다. 최종 검정 항체 농도 범위는 60nM 내지 3pM 범위이다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고 4℃에서 30분 동안 죽은 세포(eFlour 520, 인비트로젠사(Invitrogen)), Vδ1 TCR(밀테니바이오테크사) 및 aCD107a(Miltenyi) 표면 발현에 대해 염색하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 Cell Fix(비디 사이언시스사)에 재현탁시킨 후, 암실에서 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. VD1 TCR 발현 수준을 다음날 MACS Quant Analyzer 16을 사용하여 유세포 분석기로 측정하였다. 결과는 도 25 F 내지 K에 제시되어 있다.
결론: Vδ1-CD19 이중특이적 항체는 건강한 CD19+ 세포를 보존하면서 CD19+ 표적 세포의 γδT-세포 매개 세포독성을 향상시킨다.
실시예 38: Vδ1-CD19 이중특이적 항체는 건강한 세포를 보존하면서 암 세포에 대한 Vδ1 γδT-세포의 세포독성 효과를 선택적으로 향상시킨다.
CD19+ 표적 세포 세포독성 및 CD19+ 건강한 세포 보존에 대한 CD19-Vδ1 이중특이적 항체의 효과를 Opera Phenix(퍼킨 엘머사)에서 고함량 공초점 이미징을 사용하여 결정하였다. 음성 자기 활성화 세포 분류(MACS; 멜티니바이오테크사)를 사용하여 PBMC(론자사)로부터 건강한 B-세포를 분리시켰다. Raji 세포와 건강한 1차 B 세포를 CellTrace 염료로 염색하였다. 확장된 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포 및 공여자 매칭 αβT-세포를 배양물로부터 제거하고, 세척하고, 배양 배지에 재현탁시킨 후 Raji 세포 및 B-세포와 1:1로 혼합하였다. 이중특이적 항체 및 대조군을 PBS에서 연속 희석시킨 후 384-웰 이미징 검정 플레이트(퍼킨 엘머사)에 첨가하였다. γδ T-세포, Raji 세포 및 B-세포, 또는 αβT-세포, Raji 세포 및 B-세포, 또는 Vδ1 γδ T-세포, αβT-세포 Raji 세포 및 B-세포의 세포 현탁액을 384웰 이미징 검정 플레이트에 첨가하여 웰당 각각의 세포 유형 2,000개 및 6.6nM 내지 66pM 범위의 최종 항체 검정 농도를 달성하였다. 살아있는 표적 세포의 수를 결정하기 위해, 10× 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 24시간에 CFSE 염색의 크기, 형태, 질감 및 강도에 기초하여 정량화하였다. 결과는 도 38 A 내지 F에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 또는 αβT-세포의 활성화가 전종양형성 사이토카인 IL-17의 생성을 증가시켰는지 여부를 결정하기 위해, 24시간에 이미지를 획득한 후 이미징 플레이트로부터 상청액을 수집하였다. 상청액을 U-Plex 10-plex Meso Scale Discovery(MSD)에서 실행하여 IL-17A 수준을 정량화하였다. 결과는 도 38 G 내지 I에 제시되어 있다.
IL-17A(인터류킨-17A)는 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 전종양형성 사이토카인이다. IL-17A는 종양 성장을 향상시키고 항암 면역 반응을 약화시킬 수 있다. 도 38, G 내지 I에 제시된 바와 같이, 항-vδ1 항체는 IL-17A의 분비를 유도하지 않지만, 항-CD3 항체는 유도한다.
결론: Vδ1-CD19 이중특이적 항체는 건강한 CD19+ 세포를 보존하면서 CD19+ 표적 세포의 γδT-세포 매개 세포독성을 향상시킨다. 대조적으로, 항-CD3xCD19 이중특이체는 CD19+ 표적 세포의 γδT-세포 및 αβT-세포 매개 용해 모두를 향상시켰지만, αβT-세포의 활성화는 또한 건강한 1차 CD19+ B-세포의 용해뿐만 아니라 전종양형성 사이토카인 IL-17A의 분비를 향상시켰다.
실시예 26: 결합 및 고함량 세포독성 검정에서 Vδ1-Her2 이중특이적 항체.
Her2 및 Vδ1 발현을 SK-BR-3 세포(칼태그-메드시스템즈사(Caltag-Medsystems Ltd)), BT-474 세포(ATCC), MDA-MB-231-Luc 세포(Creative Biogene Biotechnology) 및 Vδ1 γδT-세포에서 결정하였다. 간략하면, 5×10^4개의 세포를 Her2 및 Vδ1 항체(밀테니바이오테크사)와 함께 4℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후 세척 및 고정시켰다. Her2 및 Vδ1의 발현을 유세포 분석법(MACSQuant10, 멜티니바이오테크사)에 의해 결정하였다. 결과는 도 26A 및 도 26B에 제시되어 있다. 표적 세포를 다양한 농도의 항-Vδ1 항체 또는 Vδ1 이중특이적 항체, 또는 대조군(IgG 대조군 또는 트라스투주맙)과 함께 15분 동안 인큐베이션시킴으로써 Her2-Vδ1 이중특이적 항체의 결합을 결정하였다. 세척 후, 세포를 세척 및 고정하기 전에 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 추가로 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 세포 유형에 결합된 항체의 양을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 결과는 도 26 C 내지 F에 제시되어 있다.
Her2+/Her2- 표적 세포 세포독성에 대한 Her2-Vδ1 이중특이적 항체의 효과를 Opera Phenix(퍼킨 엘머사)에서 고함량 공초점 이미징을 사용하여 결정하였다. 간략하면, SK-BR-3, BT-474 및 MDA-MB-231 세포를 384-웰 이미징 플레이트(퍼킨 엘머사)에 시딩하여 웰당 2,000개 표적 세포의 최종 시딩 밀도를 제공한 후 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션시켰다. 항체를 PBS로 희석시키고, 1:10으로 연속 희석시킨 후 검정 플레이트에 첨가하여 333nM 내지 0.33pM의 최종 검정 농도를 제공하였다. 확장된 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 조직 배양 플라스크에서 떼어내고, 기본 성장 배지에 재현탁시킨 후 검정 플레이트에 웰당 2,000개 세포로 1:1 효과기:표적 비율로 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 공배양한 후 Hoechst(최종 1:1000, 인비트로젠사) 및 DRAQ7(최종 1:300, 압캠사)으로 염색하였다. 살아있는 표적 세포의 수를 결정하기 위해, 10x 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 살아있는 세포 균주의 크기, 형태, 질감 및 강도 및 DRAQ7 염색의 부재에 기초하여 정량화하였다. 결과는 도 26 G 내지 J에 제시되어 있다.
결론: Vδ1-Her2 이중특이적 항체는 Her2- 세포를 보존하면서 Her2+ 표적 세포의 γδT-세포 매개 세포독성을 향상시킨다.
실시예 27: 인간 Vδ1 및 인간 EGFR 항원에 대한 Vδ1-EGFR 이중특이적 항체 결합 친화도
표적에 대한 항체의 결합 친화도(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄 및 EGFR)를 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사)를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체(1.5ug/㎖)를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 또는 인간 EGFR을 다음 매개변수로 100nM의 농도로 세포 위로 유동시켰다: 180초 회합, 480초 해리, 유량 25ℓ/분, 전개 완충액 PBS + 0.05% Tween 20. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 결과는 도 27A 및 도 27B에 제시되어 있다.
결론: 본 데이터는 Vδ1/EGFR 이중특이적 항체가 인간 EGFR 결합 능력의 도입에 더하여 그들의 모 단일특이적 항체와 대등한 인간 Vδ1에 대한 결합을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 28: Vδ1-EGFR 이중특이적 항체의 표적 세포 결합
EGFR-양성 A431 및 Vδ1-양성 1차 γδT-세포를 검정하여 EGFR/Vδ1 이중특이적 항체 결합의 특이성 및 친화성을 결정하였다. 표적 세포를 조직 배양 플라스크로부터 떼어내고, PBS에 재현탁시키고, v-바닥 96-웰 플레이트에 웰당 100,000개 세포의 최종 밀도로 시딩하였다. 세포를 원심분리시키고, 세포 펠릿을 제조사의 지침에 따라 FcR 차단 시약에 재현탁시키고, 추가 세척 전에 4C에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 항체를 PBS에서 500nM로 희석시키고, 연속적으로 PBS에서 1:10으로 50pM로 희석시키고, 세포에 첨가한 후 4℃에서 20분간 인큐베이션시켰다. 세포 표면에 결합된 mAb의 양을 결정하기 위해, 그 다음 세포를 APC(제품 코드.., 희석: 1:100)에 접합된 뮤린 항-인간 IgG 2차 항체 및 생존성 염료로 염색하였다. 4C에서 20분간 인큐베이션시킨 후, 세포를 2회 세척하고, MACSQuant를 사용하여 형광을 측정하였다. 결과는 도 28 A 내지 F에 제시되어 있다.
결론: 본 데이터는 Vδ1/EGFR 이중특이적 항체가 EGFR-양성 A431 세포주에 대한 결합의 도입에 더하여 이들의 모 단일특이적 mAb와 대등한 Vδ1 γδT-세포에 대한 결합을 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 29: 생체내에서 γδ T 세포 활성화 및 표적 세포 세포독성의 평가
확장된 피부-유래 Vδ1 γδ T-세포 및 A431 세포를 조직 배양 플라스크에서 떼어내고, 기본 성장 배지에 재현탁시키고, 목적하는 효과기:표적 비에 따러 관련 세포 희석액으로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. mAb를 희석시키고, 명시된 농도로 각각의 웰에 첨가하였다. 그런 다음 배양물을 37℃, 5% CO2에서 4(D) 또는 24시간(A 내지 C, E) 동안 인큐베이션시켰다. 살아있는 세포의 수를 결정하기 위해, 세포를 수거하고 생존성 염료로 1:1000 희석으로 20분 동안 염색하였다. CD25 상태를 결정하기 위해, 세포 수거 후 항-CD25 항체로 세포 표면을 염색하였다. 탈과립화를 측정하기 위해, 공배양 시작 시 형광단-접합된 항-CD107α 항체를 세포-항체 혼합물에 직접 첨가하였다. 2회 세척 및 세포 고정 후에 MACSQuant를 사용하여 형광을 측정하고 살아있는 세포 계수치 및 중간 형광 강도를 결정하였다. 결과는 도 29 A 내지 E에 제시되어 있다.
결론: 본 데이터는 Vδ1/EGFR 이중특이적 항체가 1차 Vδ1-양성 γδ T-세포의 활성화 및 탈과립화를 유도하여 EGFR-양성 A431 세포주의 증가된 세포-매개 용해를 야기함을 입증한다.
실시예 30: 항-vδ1 항체는 vδ1 세포에서 CD3 하향조절을 초래한다.
vδ1 세포에 대한 CD3의 하향조절과 관련하여 항-vδ1 항체로 vδ1 세포를 자극/활성화하는 효과를 조사하기 위한 연구를 수행하였다. 이것은 항-vδ1 클론 ADT1-4-2를 PBMC와 함께 인큐베이션시킨 다음 표현형분석에 의해 TCR을 분석함으로써 시험되었다.
냉동보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 상업적으로 얻고, 10ng/㎖의 IL15를 함유하는 250ul의 완전 배지(10% FCS, pen/strep, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨 및 HEPES)에서 250,000개 세포/웰로 둥근 바닥 96-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 적정 vδ1 항체 ADT1-4-2를 1ug/㎖(6.67nM), 0.01ug/㎖(0.067nM) 또는 0.0001ug/㎖(0.00067nM)의 최종 농도로 첨가하였다. RSV IgG 항체를 매칭된 농도로 대조군으로 포함시켰다.　배지 및 항체를 3일마다 보충하면서 배양액을 14일 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 조건에서 vδ1 세포 및 TCR 발현을 표현형분석하기 위해 종점에서 유세포 분석을 수행하였다.　세포를 먼저 살아있는 단일항 상에서, 그 다음 vδ1(밀테니사 REA173; 130-100-553)에 대한 모 케이트인 panγδ(밀테니사 REA592; 130-113-508) 상에서 게이팅하였는데, 이것은 자체는 CD3에 대한 모 게이트였다(밀테니사　REA613;　130-113-142). 양성 염색을 통해 세포 집단을 확인한 다음, MFI를 통해 샘플 사이의 각각의 마커의 상대적인 발현 수준을 확인하였다.
도 30A는는 mAb 표적 관여의 지표로서 항체 자극 시 vδ1 TCR MFI를 나타낸다. 도 30B는 양성으로 게이팅된 vδ1 세포에서 CD3 발현의 MFI를 도시한다. vδ1 항체 ADT1-4-2로의 자극은 vδ1 세포와 맞물려 vδ1 세포에서 vδ1 및 CD3 둘 다의 하향 조절을 초래하였다.
실시예 31: Vδ1-FAPα 이중특이적 항체는 FAPα + 섬유아세포의 Vδ1 γδT-세포 활성화 및 용해를 향상시킨다.
표적(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄 및 FAPα)에 대한 항-Vδ1, 항-FAPα 및 항-Vδ1xFAPα 항체의 결합의 결합 동력학을 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사)를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체(1.5ug/㎖)를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 또는 인간 FAPα를 다음 매개변수로 100nM의 농도로 세포 위로 유동시켰다: 180초 회합, 480초 해리, 유량 25 L/분, 전개 완충액 PBS + 0.05% Tween 20. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 결과는 도 31 A에 제시되어 있다.
FAPα+ 표적 세포 또는 Vδ1+ 효과기 세포를 다양한 농도의 항-Vδ1 항체 또는 Vδ1 이중특이적 항체, 또는 대조군(IgG 대조군 또는 항-FAPα)과 15분 동안 인큐베이션시킴으로써 Vδ1-FAPα 이중특이적 항체의 결합을 결정하였다. 세척 후, 세포를 세척 및 고정하기 전에 항-인간 Fc 2차 항체와 함께 추가로 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 세포 유형에 결합된 항체의 양을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 결과는 도 31 B 내지 C에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 활성화 및 탈과립화에 대한 Vδ1-FAPα 이중특이적 항체의 효과를 결정하기 위해, Vδ1 TCR 하향조절 및 CD107a 상향조절을 FAPα+ 표적 세포의 존재 하에 정량화하였다. 간략하면, 항-Vδ1, 항-FAPα 및 항-Vδ1xFAPα 이중특이적 항체를 PBS에서 연속 희석시킨 후 U-바닥 96-웰 플레이트에 첨가하였다. FAPα+ 표적 세포(BJ 섬유아세포 또는 인간 진피 섬유아세포)를 [0.5㎛] CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 20분 동안 염색하였다. 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 배양 플라스크에서 떼어내고, 세포 현탁액을 FAPα+ 표적 세포와 1:1로 혼합하거나 배지와 1:1로 희석시켰다. 세포 현탁액을 웰당 2.5×10^4개의 FAPα+ 표적 세포의 존재 또는 부재 하에 웰당 2.5×10^4개의 Vδ1 γδ T-세포로 분석 플레이트에 시딩하였다. 최종 검정 항체 농도 범위는 200nM 내지 2pM 범위이다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 4℃에서 30분 동안 죽은 세포(eFlour 520, 인비트로젠사), Vδ1 TCR(밀테니바이오테크사) 및 aCD107a(밀테니사) 표면 발현에 대해 염색하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 Cell Fix(비디 사이언시스사)에 재현탁시킨 후, 암실에서 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 중간 형광 강도(MFI)로 결정된 VD1 TCR 및 CD107a 발현 수준을 다음날 MACS Quant Analyzer 16을 사용하여 유세포 분석기로 측정하였다. 결과는 도 31 D 내지 G에 제시되어 있다.
중간 정도의 Vδ1 TCR 하향조절이 FAPα+ 섬유아세포의 부재 하에서 관찰된다(도 31, D). 그러나, FAPα+ 섬유아세포의 존재 하에서, 항-FAPα-Vδ1 이중특이적 항체는 TCR 하향조절을 크게 향상시킨다(도 31, E). 이는 Vδ1 γδT-세포 상에서 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-FAPα-Vδ1 이중특이적 항체의 효과가 인접 세포 상의 FAPα와 같은 종양 특이적 항원에 대한 결합을 통해 향상된다는 것을 나타낸다.
항-Vδ1xFAPα 이중특이적 항체 및 FAPα+ 섬유아세포의 존재 하에서, CD107a(탈과립화의 마커)는 단클론성 대조군과 비교하여 Vδ1 γδT-세포에서 상향조절된다(도 31, G). FAPα+ 섬유아세포가 존재하지 않는 경우, CD107a는 단클론성 대조군과 비교하여 Vδ1 γδT-세포 상에서 상향조절되지 않는다(도 31, F). 이것은 Vδ1 γδ T-세포 상에서 CD107a 상향조절에 대한 항-FAPα-Vδ1 이중특이적 항체의 효과가 특이적이며, 항-FAPα-Vδ1 이중특이적 항체가 FAPα+ 세포의 존재 하에서 Vδ1 γδT-세포의 탈과립화 및 활성화를 향상시킨다는 것을 나타낸다.
FAPα+ 표적 세포 세포독성에 대한 FAPα-Vδ1 이중특이적 항체의 효과를 Opera Phenix(퍼킨 엘머사)에서 고함량 공초점 이미징을 사용하여 결정하였다. FAPα+ 표적 세포(BJ 섬유아세포, 인간 진피 섬유아세포)를 384-웰 이미징 플레이트(퍼킨 엘머사)에 시딩하고 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이중특이적 항체 및 대조군을 PBS에서 연속 희석시킨 후 검정 플레이트(퍼킨 엘머사)에 첨가하였다. 확장된 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 조직 배양 플라스크에서 떼어내고, 기본 성장 배지에 재현탁시킨 후 효과기:표적 비율이 1:1이 되도록 검정 플레이트에 첨가하였다. 최종 검정 항체 농도는 6.6nM 내지 66fM 범위였다. 세포를 24시간 동안 공배양한 후 DRAQ7(최종 1:300, 압캠사) 및 Hoechst(1:1,000, 인비트로젠사)로 염색하였다. 살아있는 표적 세포의 수를 결정하기 위해, 10x 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 Hoechst 염색의 크기, 형태, 질감 및 강도 및 DRAQ7 염색의 부재에 기초하여 정량화하였다. 결과는 도 31H에 제시되어 있다. 항-FAPα-Vδ1 이중특이적 항체의 존재 하에서, 항-Vδ1 및 항-FAPα 대조군과 비교하여 섬유아세포 세포독성의 현저한 증가가 관찰되었다(도 31H). 이는 Vδ1 γδ T-세포를 표적 세포와 직접 가교시키는 것이 Vδ1 γδ T-세포의 활성화 및 세포독성 효과를 구체적으로 향상시킬 수 있음을 입증한다.
결론: 항-Vδ1-FAPα 이중특이적 항체는 Vδ1+ γδ T-세포 및 FAPα+ 표적 세포에 특이적으로 결합하여 FAPα+ 세포의 존재 하에서 Vδ1 γδ T-세포의 향상된 활성화를 초래하는데, 이는 상승된 Vδ1 TCR 하향조절, CD107a 상향조절, 및 FAPα+ 섬유아세포의 용해를 나타낸다.
실시예 32: Vδ1-MSLN 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 활성화 및 MSLN + 표적 세포의 용해를 향상시킨다.
표적(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄 및 MSLN)에 대한 항-Vδ1, 항-MSLN (메소텔린) 및 항-Vδ1xMSLN 항체의 결합의 결합 동력학을 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사)를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체(1.5ug/㎖)를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 또는 인간 MSLN을 다음 매개변수로 100nM의 상위 농도로 세포 위로 유동시켰다: 180초 회합, 480초 해리, 유량 25ℓ/분, 전개 완충액 PBS + 0.05% Tween 20. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 결과는 도 32A에 제시되어 있다.
MSLN+ 표적 세포 또는 Vδ1+ 효과기 세포를 다양한 농도의 항-Vδ1 항체 또는 Vδ1 이중특이적 항체, 또는 대조군(IgG 대조군 또는 항-MSLN)과 15분 동안 인큐베이션시킴으로써 MSLN-Vδ1 이중특이적 항체의 결합을 결정하였다. 세척 후, 세포를 세척 및 고정하기 전에 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 추가로 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 세포 유형에 결합된 항체의 양을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 결과는 도 32B 내지 C에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 활성화 및 탈과립화에 대한 MSLN-Vδ1 이중특이적 항체의 효과를 결정하기 위해, Vδ1 TCR 하향조절 및 CD107a 상향조절을 MSLN+ 표적 세포의 존재 하에 정량화하였다. 간략하면, 항-Vδ1, 항-MSLN 및 항-Vδ1xMSLN 이중특이적 항체를 PBS에서 연속 희석시킨 후 U-바닥 96-웰 플레이트에 첨가하였다. MSLN+ 표적 세포(OVCAR-3 또는 HeLa)를 [0.5㎛] CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 20분 동안 염색하였다. 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 배양 플라스크에서 떼어내고, 세포 현탁액을 MSLN+ 표적 세포와 1:1로 혼합하거나 배지와 1:1로 희석시켰다. 세포 현탁액을 웰당 2.5×10^4개의 MSLN+ 표적 세포의 존재 또는 부재 하에 웰당 2.5×10^4개의 Vδ1 γδ T-세포로 분석 플레이트에 시딩하였다. 최종 검정 항체 농도 범위는 200nM 내지 2pM 범위이다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 4℃에서 30분 동안 죽은 세포(eFlour 520, 인비트로젠사), Vδ1 TCR(밀테니바이오테크사) 및 aCD107a(밀테니사) 표면 발현에 대해 염색하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척하고 Cell Fix(비디 사이언시스사)에 재현탁시킨 후, 암실에서 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 중간 형광 강도(MFI)로 결정된 VD1 TCR 및 CD107a 발현 수준을 다음날 MACS Quant Analyzer 16을 사용하여 유세포 분석기로 측정하였다. 결과는 도 32 D 내지 G에 제시되어 있다.
중간 정도의 Vδ1 TCR 하향조절이 MSLN+ 표적 세포의 부재 하에서 관찰된다(도 32, D). 그러나, MSLN+ OVCAR-3 세포의 존재 하에서, 항-MSLN-Vδ1 이중특이적 항체는 TCR 하향조절을 크게 향상시킨다(도 32, E). 이는 Vδ1 γδ T-세포 상에서 Vδ1 TCR 하향조절에 대한 항-MSLN-Vδ1 이중특이적 항체의 효과가 인접 세포 상의 MSLN와 같은 종양 특이적 항원에 대한 결합을 통해 향상된다는 것을 나타낸다.
항-Vδ1xMSLN 이중특이적 항체 및 MSLN+ OVCAR-3 세포의 존재 하에서, CD107a(탈과립화의 마커)는 단클론성 대조군과 비교하여 Vδ1 γδT-세포에서 상향조절된다(도 32, G). MSLN+ OVCAR-3 세포가 존재하지 않는 경우, CD107a는 단클론성 대조군과 비교하여 Vδ1 γδT-세포 상에서 상향조절되지 않는다(도 32, F). 이것은 Vδ1 γδ T-세포 상에서 CD107a 상향조절에 대한 항-MSLN-Vδ1 이중특이적 항체의 효과가 특이적이며, 항-MSLN-Vδ1 이중특이적 항체가 MSLN+ 세포의 존재 하에서 Vδ1 γδT-세포의 탈과립화 및 활성화를 향상시킨다는 것을 나타낸다.
MSLN+ 표적 세포 세포독성에 대한 MSLN-Vδ1 이중특이적 항체의 효과를 Opera Phenix(퍼킨 엘머사)에서 고함량 공초점 이미징을 사용하여 결정하였다. MSLN+ 표적 세포(HeLa 또는 OVCAR-2)를 384-웰 이미징 플레이트(퍼킨 엘머사)에 시딩하고 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 이중특이적 항체 및 대조군을 PBS에서 연속 희석시킨 후 검정 플레이트(퍼킨 엘머사)에 첨가하였다. 확장된 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포를 조직 배양 플라스크에서 떼어내고, 기본 성장 배지에 재현탁시킨 후 효과기:표적 비율이 1:1이 되도록 검정 플레이트에 첨가하였다. 최종 검정 항체 농도는 6.6nM 내지 66fM 범위였다. 세포를 24시간 동안 공배양한 후 DRAQ7(최종 1:300, 압캠사) 및 Hoechst(1:1,000, 인비트로젠사)로 염색하였다. 살아있는 표적 세포의 수를 결정하기 위해, 10x 배율에서 9개의 시야를 포획하는 Opera Phenix 고함량 플랫폼을 사용하여 공초점 이미지를 획득하였다. 살아있는 세포 계수치를 Hoechst 염색의 크기, 형태, 질감 및 강도 및 DRAQ7 염색의 부재에 기초하여 정량화하였다. 결과는 도 32H에 제시되어 있다. 항-MSLN-Vδ1 이중특이적 항체의 존재 하에서, 항-Vδ1 및 항-MSLN 대조군과 비교하여 표적 세포 세포독성의 현저한 증가가 관찰되었다(도 32H). 이는 Vδ1 γδ T-세포를 표적 세포와 직접 가교시키는 것이 Vδ1 γδ T-세포의 활성화 및 세포독성 효과를 구체적으로 향상시킬 수 있음을 입증한다.
결론: 항-Vδ1xMSLN 이중특이적 항체는 Vδ1+ γδ T-세포 및 MSLN+ 표적 세포에 특이적으로 결합하여 MSLN+ 세포의 존재 하에서 Vδ1 γδT-세포의 향상된 활성화를 초래하는데, 이는 상승된 Vδ1 TCR 하향조절, CD107a 상향조절, 및 MSLN+ 표적 세포의 용해를 나타낸다.
실시예 33: Vδ1-PD-1 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 활성화를 향상시키고, PD-1/PD-L1 관문 저해를 차단한다.
표적(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄 및 PD-1)에 대한 항-Vδ1, 항-PD-1 및 항-Vδ1xPD-1 항체의 결합의 결합 동력학을 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사)를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체(1.5ug/㎖)를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 또는 인간 PD-1을 100nM의 상위 농도로 세포 위로 유동시켰다: 결과는 도 33A에 제시되어 있다.
두 표적 리간드에 대한 이중특이적 항체의 이중 결합을 평가하기 위해, 재조합 PD-1을 먼저 10ug/㎖에서 카복시메틸 덱스트란 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사) 상에 고정시킨 후 100nM에서 이중특이적 항체 위로 유동시켰다. 그 다음 100nM에서 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 위로 유동시킴으로써 Vδ1 γδ TCR에 결합하는 능력을 평가하였다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 결과는 도 33B에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 및 PD-1+ 면역 세포에 대한 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체의 결합을 유세포 분석법으로 평가하였다. 먼저 전혈로부터 추출된 PBMC 버피 코트에서 자기 분류에 의해 CD4 및 CD8 T-세포를 음성으로 선택하였다. Dynabeads(인비트로젠사)에 접합된 항-CD3/항-CD28 항체에 의한 활성화 후, PD-1의 세포 표면 발현을 CD4 및 CD8 T-세포에서 검출하였다. 활성화된 T-세포 및 Vδ1 γδ T-세포를 다양한 농도의 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체 또는 대조군(IgG 대조군 또는 항-PD-1)과 함께 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 세포를 세척 및 고정하기 전에 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 추가로 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 세포 유형에 결합된 항체의 양을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 결과는 도 33C, D에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 활성화에 대한 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체의 효과를 결정하기 위해, PD-1+ T-세포의 존재 하에 Vδ1 TCR 하향조절을 정량화하였다. 간략하면, 항-Vδ1, 항-PD-1 및 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체를 PBS에서 연속 희석시킨 후 검정 플레이트에 첨가하였다. PD-1+ T-세포를 CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 염색하고 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포와 1:1로 혼합하거나 배지로 1:1로 희석시켰다. 세포 현탁액을 웰당 2.5×10^4개의 PD-1+ T-세포의 존재 또는 부재 하에 웰당 2.5×10^4개의 Vδ1 γδ T-세포로 분석 플레이트에 시딩하였다. 최종 검정 항체 농도 범위는 200nM 내지 2pM 범위이다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 죽은 세포(eFlour 520, 인비트로젠사) 및 Vδ1 TCR(밀테니바이오테크사에 대해 염색하였다. 세포를 세척하고 Cell Fix(비디 사이언시스사)에 재현탁시켰다. MACS Quant Analyzer 16을 사용하여 유세포 분석기로 측정된 중간 형광 강도(MFI)에 의해 VD1 TCR 발현 수준을 결정하였다. 결과는 도 33E, F에 제시되어 있다.
PD-1+ T-세포의 활성화에 대한 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위해, PD-1+ NFAT Jurkat 세포(프로메가사, JA2191)를 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체 또는 대조군(PD -1 단클론성 항체 또는 항-RSVIgGxanti-PD-1)와 함께 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 불투명한 백색 96-웰 플레이트에서 1㎍/웰로 미리 코팅된 재조합 Vδ1 단백질의 존재 또는 부재 하에서 검정을 수행하였다. 5시간 후, Bio-Glo Luciferase 시약(프로메가사)을 1:1 비율로 세포에 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 발광 신호를 BioTek Synergy 플레이트 판독기에서 검출하였다. 원시 발광 신호를 배수 상대 발광 단위(RLU)로 변환하였다. 결과는 도 33 G에 제시되어 있다.
결론: 항-Vδ1xPD-1 이중특이적 항체는, 예를 들어, PD-1+ CD4 또는 CD8 T-세포를 통한 가교에 의해 Vδ1 γδ T-세포의 활성화를 향상시킬 뿐만 아니라 CD4 또는 CD8 T 세포에서 PD-1/PD-L1 면역 관문 저해를 차단한다.
실시예 34: Vδ1-4-1BB 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 및 CD8 T-세포 활성화를 향상시킨다.
표적(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄 및 4-1BB)에 대한 항-Vδ1, 항-4-1BB 및 항-Vδ1x4-1BB 항체의 결합의 결합 동력학을 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사)를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체(1.5ug/㎖)를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 또는 인간 4-1BB를 100nM의 상위 농도로 세포 위로 유동시켰다: 결과는 도 34A에 제시되어 있다.
두 표적 리간드에 대한 이중특이적 항체의 이중 결합을 평가하기 위해, 재조합 4-1BB를 먼저 10ug/㎖에서 카복시메틸 덱스트란 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사) 상에 고정시킨 후 100nM에서 이중특이적 항체 위로 유동시켰다. 그 다음 100nM에서 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 위로 유동시킴으로써 Vδ1 γδ TCR에 결합하는 능력을 평가하였다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 결과는 도 34B에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 및 4-1BB+ 면역 세포에 대한 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체의 결합을 유세포 분석법으로 평가하였다. 먼저 전혈로부터 추출된 PBMC 버피 코트에서 자기 분류에 의해 CD8+ T-세포를 음성으로 선택하였다. Dynabeads(인비트로젠사)에 접합된 항-CD3/항-CD28 항체에 의한 활성화 후, 4-1BB의 세포 표면 발현이CD8 T-세포에서 상승하였다. 활성화된 4-1BB+ CD8 T-세포 및 Vδ1 γδ T-세포를 다양한 농도의 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체 또는 대조군(IgG 대조군 또는 항-4-1BB)과 함께 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 세포를 세척 및 고정하기 전에 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 추가로 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 세포 유형에 결합된 항체의 양을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 결과는 도 34C, D에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 활성화에 대한 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체의 효과를 결정하기 위해, 4-1BB+ T-세포의 존재 하에 Vδ1 TCR 하향조절을 정량화하였다. 간략하면, 항-Vδ1, 항-4-1BB 및 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체를 PBS에서 연속 희석시킨 후 검정 플레이트에 첨가하였다. 4-1BB+ CD8 T-세포를 CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 염색하고 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포와 1:1로 혼합하거나 배지로 1:1로 희석시켰다. 세포 현탁액을 웰당 2.5×10^4개의 4-1BB+ CD8 T-세포의 존재 또는 부재 하에 웰당 2.5×10^4개의 Vδ1 γδ T-세포로 분석 플레이트에 시딩하였다. 최종 검정 항체 농도 범위는 200nM 내지 2pM 범위이다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 죽은 세포(eFlour 520, 인비트로젠사) 및 Vδ1 TCR(밀테니바이오테크사에 대해 염색하였다. 세포를 세척하고 Cell Fix(비디 사이언시스사)에 재현탁시켰다. MACS Quant Analyzer 16을 사용하여 유세포 분석기로 측정된 중간 형광 강도(MFI)에 의해 VD1 TCR 발현 수준을 결정하였다. 결과는 도 34E, F에 제시되어 있다.
4-1BB+ T-세포의 활성화에 대한 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위해, 4-1BB+ NFAT Jurkat 세포(프로메가사, JA2191)를 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체 또는 대조군(항-4 -1BB 단클론성 항체 또는 항-RSVIgGxanti-4-1BB)와 함께 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 불투명한 백색 96-웰 플레이트에서 1㎍/웰로 미리 코팅된 재조합 Vδ1 단백질의 존재 또는 부재 하에서 검정을 수행하였다. 5시간 후, Bio-Glo Luciferase 시약(프로메가사)을 1:1 비율로 세포에 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 발광 신호를 BioTek Synergy 플레이트 판독기에서 검출하였다. 원시 발광 신호를 배수 상대 발광 단위(RLU)로 변환하였다. 결과는 도 34G에 제시되어 있다.
결론: 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체는, 예를 들어, 4-1BB+ CD8 T-세포에 대한 가교에 의해서 Vδ1 γδ T-세포의 활성화를 향상시킬 뿐만 아니라 4-1BB+ T-세포를 활성화시킨다.
실시예 35: Vδ1-OX40 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 및 CD4 T-세포 활성화를 향상시킨다.
표적(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄 및 OX40)에 대한 항-Vδ1, 항-OX40 및 항-Vδ1xOX40 항체의 결합의 결합 동력학을 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사)를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체(1.5ug/㎖)를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 또는 인간 OX40를 100nM의 상위 농도로 세포 위로 유동시켰다: 결과는 도 35A에 제시되어 있다.
두 표적 리간드에 대한 이중특이적 항체의 이중 결합을 평가하기 위해, 재조합 OX40를 먼저 10ug/㎖에서 카복시메틸 덱스트란 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사) 상에 고정시킨 후 100nM에서 이중특이적 항체 위로 유동시켰다. 그 다음 100nM에서 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 위로 유동시킴으로써 Vδ1 γδ TCR에 결합하는 능력을 평가하였다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 결과는 도 35B에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 및 OX40+ 면역 세포에 대한 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체의 결합을 유세포 분석법으로 평가하였다. 먼저 전혈로부터 추출된 PBMC 버피 코트에서 자기 분류에 의해 CD4+ T-세포를 음성으로 선택하였다. Dynabeads(인비트로젠사)에 접합된 항-CD3/항-CD28 항체에 의한 활성화 후, OX40의 세포 표면 발현이CD4 T-세포에서 상승하였다. 활성화된 OX40+ CD4 T-세포 및 Vδ1 γδ T-세포를 다양한 농도의 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체 또는 대조군(IgG 대조군 또는 항-OX40)과 함께 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 세포를 세척 및 고정하기 전에 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 추가로 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 세포 유형에 결합된 항체의 양을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 결과는 도 35C, D에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 활성화에 대한 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체의 효과를 결정하기 위해, OX40+ T-세포의 존재 하에 Vδ1 TCR 하향조절을 정량화하였다. 간략하면, 항-Vδ1, 항-OX40 및 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체를 PBS에서 연속 희석시킨 후 검정 플레이트에 첨가하였다. OX40+ CD4 T-세포를 CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 염색하고 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포와 1:1로 혼합하거나 배지로 1:1로 희석시켰다. 세포 현탁액을 웰당 2.5×10^4개의 OX40+ CD4 T-세포의 존재 또는 부재 하에 웰당 2.5×10^4개의 Vδ1 γδ T-세포로 분석 플레이트에 시딩하였다. 최종 검정 항체 농도 범위는 200nM 내지 2pM 범위이다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 죽은 세포(eFlour 520, 인비트로젠사) 및 Vδ1 TCR(밀테니바이오테크사에 대해 염색하였다. 세포를 세척하고 Cell Fix(비디 사이언시스사)에 재현탁시켰다. MACS Quant Analyzer 16을 사용하여 유세포 분석기로 측정된 중간 형광 강도(MFI)에 의해 VD1 TCR 발현 수준을 결정하였다. 결과는 도 35E, F에 제시되어 있다.
OX40+ T-세포의 활성화에 대한 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위해, OX40+ NFAT Jurkat 세포(프로메가사, JA2191)를 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체 또는 대조군(OX40L(OX40 리간드), 항-OX40 또는 항-RSVIgGxanti-OX40)와 함께 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 불투명한 백색 96-웰 플레이트에서 1㎍/웰로 미리 코팅된 재조합 Vδ1 단백질의 존재 또는 부재 하에서 검정을 수행하였다. 5시간 후, Bio-Glo Luciferase 시약(프로메가사)을 1:1 비율로 세포에 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 발광 신호를 BioTek Synergy 플레이트 판독기에서 검출하였다. 원시 발광 신호를 배수 상대 발광 단위(RLU)로 변환하였다. 결과는 도 35G에 제시되어 있다.
결론: 항-Vδ1xOX40 이중특이적 항체는, 예를 들어, OX40+ CD4 T-세포에 대한 가교에 의해 Vδ1 γδ T-세포의 활성화를 향상시킬 뿐만 아니라 OX40+ T-세포를 활성화시킨다.
실시예 36: Vδ1-TIGIT 이중특이적 항체는 Vδ1 γδT-세포 활성화를 향상시키고, TIGIT/PVR(CD155) 관문 저해를 차단한다.
표적(즉, γδ TCR의 Vδ1 쇄 및 TIGIT)에 대한 항-Vδ1, 항-TIGIT 및 항-Vδ1xTIGIT 항체의 결합의 결합 동력학을 Reichert 4SPR 기기(라이처트 테크놀로지즈사)를 사용하는 SPR 분석에 의해 확립한다. 항체(1.5ug/㎖)를 평면 단백질 A 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사)에 코팅하여 기준선에서 대략 500uRIU의 증가를 제공한다. 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 또는 인간 TIGIT를 100nM의 상위 농도로 세포 위로 유동시켰다: 결과는 도 36A에 제시되어 있다.
두 표적 리간드에 대한 이중특이적 항체의 이중 결합을 평가하기 위해, 재조합 TIGIT를 먼저 10ug/㎖에서 카복시메틸 덱스트란 센서 칩(라이처트 테크놀로지즈사) 상에 고정시킨 후 100nM에서 이중특이적 항체 위로 유동시켰다. 그 다음 100nM에서 재조합 인간 Vδ1 이종이량체 위로 유동시킴으로써 Vδ1 γδ TCR에 결합하는 능력을 평가하였다. 모든 실험은 실온에서 수행되었다. 결과는 도 36 B에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 및 TIGIT+ 면역 세포에 대한 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체의 결합을 유세포 분석법으로 평가하였다. 먼저 전혈로부터 추출된 PBMC 버피 코트에서 자기 분류에 의해 CD4 및 CD8 T-세포를 음성으로 선택하였다. Dynabeads(인비트로젠사)에 접합된 항-CD3/항-CD28 항체에 의한 활성화 후, 4-1BB의 세포 표면 발현을 CD4 및 CD8 T-세포에서 검출하였다. 활성화된 T-세포 및 Vδ1 γδ T-세포를 다양한 농도의 항-Vδ1x4-1BB 이중특이적 항체 또는 대조군(IgG 대조군 또는 항-4-1BB)과 함께 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 세포를 세척 및 고정하기 전에 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 추가로 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각각의 세포 유형에 결합된 항체의 양을 유세포 분석법에 의해 결정하였다. 결과는 도 36C, D에 제시되어 있다.
Vδ1 γδ T-세포 활성화에 대한 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체의 효과를 결정하기 위해, TIGIT+ T-세포의 존재 하에 Vδ1 TCR 하향조절을 정량화하였다. 간략하면, 항-Vδ1, 항-TIGIT 및 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체를 PBS에서 연속 희석시킨 후 검정 플레이트에 첨가하였다. TIGIT+ CD8 T-세포를 CellTrace CFSE 라이브 셀 염료로 염색하고 피부 유래 Vδ1 γδ T-세포와 1:1로 혼합하거나 배지로 1:1로 희석시켰다. 세포 현탁액을 웰당 2.5×10^4개의 TIGIT+ CD8 T-세포의 존재 또는 부재 하에 웰당 2.5×10^4개의 Vδ1 γδ T-세포로 분석 플레이트에 시딩하였다. 최종 검정 항체 농도 범위는 200nM 내지 2pM 범위이다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하고, 죽은 세포(eFlour 520, 인비트로젠사) 및 Vδ1 TCR(밀테니바이오테크사에 대해 염색하였다. 세포를 세척하고 Cell Fix(비디 사이언시스사)에 재현탁시켰다. MACS Quant Analyzer 16을 사용하여 유세포 분석기로 측정된 중간 형광 강도(MFI)에 의해 VD1 TCR 발현 수준을 결정하였다. 결과는 도 36E, F에 제시되어 있다.
TIGIT+ T-세포의 활성화에 대한 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위해, TIGIT+ NFAT Jurkat 세포(프로메가사, JA2191)를 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체 또는 대조군(항-TIGIT 단클론성 항체 또는 항-RSVIgGxanti-TIGIT)와 함께 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 불투명한 백색 96-웰 플레이트에서 1㎍/웰로 미리 코팅된 재조합 Vδ1 단백질의 존재 또는 부재 하에서 검정을 수행하였다. 5시간 후, Bio-Glo Luciferase 시약(프로메가사)을 1:1 비율로 세포에 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 발광 신호를 BioTek Synergy 플레이트 판독기에서 검출하였다. 원시 발광 신호를 배수 상대 발광 단위(RLU)로 변환하였다. 결과는 도 36G에 제시되어 있다.
결론: 항-Vδ1xTIGIT 이중특이적 항체는 TIGIT+ CD8 T-세포를 통한 가교에 의해 Vδ1 γδ T-세포의 활성화를 향상시킬 뿐만 아니라 CD8 T-세포에서 TIGIT/CD155 면역 관문 저해를 차단한다.
실시예 37: 항-vδ1 항체는 ADCC를 유도하지 않는다.
ADCC Reporter Bioassay(프로메가사)를 사용하여 대조군 항체와 비교하여 항-vδ1 항체에 의해 유도된 ADCC(항체 의존성 세포 매개 세포독성)의 수준을 평가하였다.
ADCC는 효과기 세포가 항체에 의해 태그가 지정된 표적 세포를 사멸시키는 생물학적 현상을 지칭한다. 효과기 세포는 Fcγ 수용체를 통해 항체에 결합하고 이어서 표적 세포를 사멸시킨다. 본 명세서에 제시된 ADCC 리포터 생물검정은 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자) 경로를 통한 유전자 전사의 활성화를 통해 ADCC의 초기 개시를 검출함으로써 검정 내에서 시험되는 항체의 잠재적인 ADCC 작용 기전을 밝힌다. 리포터 검정은 NFAT 경로에 연결된 고친화성 FcγRIIIa 수용체를 발현하는 효과기 세포(Jurkat)를 활용하는 조작된 시스템이며, 이것은 활성화 시 파이어플라이 루시퍼라제 효소의 추가 활성화를 유도하기 위해서 추가로 조작된다. 루시퍼라제 활성은 발생하는 ADCC 수준과 상관관계가 있을 수 있는 발광 판독값으로 정량화된다.
이 검정은 항-vδ1 항체, 또는 적절하게는 다중특이적 항체의 항-vδ1 아암이 ADCC 반응을 유도하는지 여부를 이해하기 위해 활용되었다. 이용된 표적 세포는 vδ1 γδ TCR을 통해 항-vδ1 항체에 결합하는 γδ 세포였다. ADCC 작용 기전이 존재한다면, 항-vδ1 항체는 검정 효과기 세포 상의 Fcγ 수용체에 결합하여 발광 신호를 생성할 것이고; 신호가 생성되지 않으면 ADCC가 발생하지 않는다는 것을 시사할 것이다.
이 검정의 경우 ADCC Reporter Bioassay Kit(프로메가사)를 사용하였다. Bio-Glo Luciferase Assay Buffer 한 병을 해동시키고, 기질 병으로 옮겼다. 혼합물을 실온에서 4 내지 6시간 동안 유지시켰다. 하기 항체에 대해 10nM 내지 0.01nM(최종 농도) 범위의 항체 농도(3X 농도)로 희석 플레이트를 제조하였다: 본 발명의 항-vδ1 항체, 동일한 항-vδ1 항체이지만 Fc 손상된 것(L235A, G237A), 리툭시맙, RSV 및 OKT3. 표적 세포(γδ 세포)를 웰당 25㎕로 2개의 검정 플레이트에 시딩하였다. 그 다음 항체 희석 플레이트에서 적절한 항체 용액 25㎕를 적절한 웰로 옮겼다. 효과기 세포(조작된 Jurkat 세포)를 따뜻한 검정 완충액에서 해동시키고, 검정 완충액 4ml에 재현탁시키고, 효과기 세포 용액 25㎕를 각각의 웰에 피펫팅하였다. 그 다음 플레이트를 37°C에서 4.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 후, 플레이트를 실온으로 평형화시킨 후, 75㎕의 Bio-Glo 루시퍼라제 검정 시약을 각각으 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음 플레이트에서 발광 신호(상대 광 단위 RLU)를 수집하는 Biotek H4 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 배수 유도를 다음 방정식을 사용하여 계산하였다: 유도 배수 = RLU(유도-배경) /RLU(항체 대조군 없음-배경).
양성 대조군으로서, OKT3(항-CD3 항체)를 사용하였다. 추가적인 양성 대조군으로서, 대조군 웰에 γδ 세포 대신 Raji 세포를 시딩하였다. Raji 세포는 항-CD20 항체인 리툭시맙과 함께 사용할 때 강력한 ADCC 반응을 입증하는 데 사용되는 일반적으로 허용되는 세포주이다. 내부 대조군으로서 그리고 항-vδ1 항체가 γδ 세포에 대한 vδ1 결합의 부재 하에서 ADCC를 유도하는지를 이해하기 위해, 본 발명의 항-vδ1 항체 및 동일한 항-vδ1 항체이지만 Fc-손상된 것인 L235A, G237A를 효과기 세포 단독과 함께 첨가하였다.
결과는 도 37에 제시되어 있다.
결론: Raji 세포와 함께 리툭시맙을 사용한 양성 대조군에서 강한 ADCC 반응이 나타났고, γδ 세포에 대한 OKT3에서는 훨씬 더 강한 ADCC 반응이 입증되었다. 대조적으로, ADCC 반응은 본 발명의 항-vδ1 항체, 동일한 항-vδ1 항체뿐만 아니라 Fc 손상된 것인 L235A, G237A 또는 RSV 음성 대조군을 사용하는 조건에서도 검출되지 않았다. 이는 이 시스템에서 vδ1에 결합하는 본 발명의 항체(예를 들어 항-vδ1 mAb 또는 항-vδ1 다중특이적 항체)가 ADCC 작용 기전의 증거를 나타내지 않는다는 것을 입증한다. 놀랍게도, Fc-무손상 항-Vδ1 항체조차도 γδ T 세포를 고갈시키지 않으며, 이는 본 명세서에 제시된 항-Vδ1 항체에서 Fc 기능을 유지하는 옵션을 제공하고, 예를 들어, 높은 Fcγ 종양 환경에서 기능성을 추가한다. 이는 본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체 포맷에 포함시키기 위한 이러한 항-Vδ1 항체의 적합성을 추가로 강조한다.
적합하게는, 단일특이적 포맷으로 제공될 때 항체의 기능적 특성은 추가로 제2 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 다중특이적 항체에 의해 공유된다.
실시형태
본 발명은 적어도 하기 넘버링된 실시형태를 포함한다:
1. 다중특이적 항체 또는 이의 단편으로서,
a. 제1 표적 에피토프이되, 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프인, 제1 표적 에피토프; 및
b. 제2 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
2. 실시형태 1에 있어서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
3. 임의의 상기 실시형태에 있어서, 제2 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프가 아닌, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
4. 임의의 상기 실시형태에 있어서, 제2 표적 에피토프는 T 세포 수용체(TCR)의 에피토프가 아닌, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
5. 임의의 상기 실시형태에 있어서, 제1 표적 에피토프는 γδ TCR의 Vδ1 쇄의 V 영역 내의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
6. 임의의 상기 실시형태에 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 1 및/또는 서열번호 128의 아미노산 잔기 1 내지 90 내의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
7. 임의의 상기 실시형태에 있어서, 제1 표적 에피토프는
(i) 서열번호 1의 3 내지 20; 및/또는
(ii) 서열번호 1의 37 내지 77의 아미노산 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
8. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 잔기 3, 5, 9, 10, 12, 16, 17, 20, 37, 42, 50, 53, 59, 62, 64, 68, 69, 72 또는 77 중 적어도 하나를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
9. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역: 5 내지 20 및 62 내지 77; 50 내지 64; 37 내지 53 및 59 내지 72; 59 내지 77; 또는 3 내지 17 및 62 내지 69 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
10. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역: 5 내지 20 및 62 내지 77; 50 내지 64; 37 내지 53 및 59 내지 72; 59 내지 77; 또는 3 내지 17 및 62 내지 69 내의 하나 이상의 아미노산 잔기로 이루어진, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
11. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 5 내지 20 및 62 내지 77 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
12. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 50 내지 64 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
13. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 영역 37 내지 53 및 59 내지 77 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
14. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 γδ TCR의 Vδ1 쇄의 CDR3에서 발견되는 에피토프가 아닌, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
15. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 서열번호 272의 아미노산 영역 91 내지 105(CDR3) 내의 에피토프가 아닌, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
16. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포의 활성화 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
17. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 활성화 에피토프의 결합은 (i) γδ TCR을 하향조절하고/하거나; (ii) γδ T 세포의 탈과립화를 활성화시키고/시키거나; (iii) γδ T 세포 매개 사멸을 촉진하는, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
18. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제1 표적 에피토프는 CD107a, CD25, CD69 및/또는 Ki67의 발현을 상향조절하는 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
19. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 1.5×10-7M 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 제1 에피토프에 결합하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
20. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 1.3×10-7M 이하, 예컨대, 1.0×10-7M 미만, 특히 5.0×10-8M 미만의 KD로 제1 에피토프에 결합하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
21. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 0.5㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ TCR의 하향조절에 대한 EC50 값을 갖는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
22. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 0.06㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ TCR의 하향조절에 대한 EC50 값을 갖는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
23. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 0.05㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ T 세포 탈과립화에 대한 EC50 값을 갖는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
24. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 0.005㎍/㎖ 미만, 예컨대, 0.002㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ T 세포 탈과립화에 대한 EC50 값을 갖는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
25. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, γδ T 세포 탈과립화 EC50 값은 CD107a 발현을 검출함으로써 측정되는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
26. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 0.5㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ T 세포 매개 사멸에 대한 EC50 값을 갖는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
27. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 0.055㎍/㎖ 미만, 예컨대, 0.020㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ T 세포 매개 사멸에 대한 EC50 값을 갖는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
28. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 0.5㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ TCR의 하향조절에 대한 EC50 값; 0.05㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ T 세포 탈과립화에 대한 EC50 값; 및/또는 0.5㎍/㎖ 미만인 결합 시 γδ T 세포 매개 사멸에 대한 EC50 값을 갖는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편
29. 실시형태 21 내지 28 중 어느 하나에 있어서, EC50 값은 유세포 분석법을 사용하여 측정되는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
30. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제2 에피토프는 세포 표면 단백질인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
31. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제2 에피토프는 Vδ1+ T 세포 상에 존재하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
32. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에서 있어서, 제2 에피토프는 Vδ1+ T 세포 상에 존재하지 않는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
33. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제2 에피토프는 면역 세포 상에 존재하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
34. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 제2 에피토프는 암 항원 또는 암-연관 항원의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
35. 실시형태 34에 있어서, 암 항원 또는 암-연관 항원은 종양 연관-항원(TAA)인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
36. 실시형태 35에 있어서, 암 항원 또는 암-연관 항원은 AFP, AKAP-4, ALK, 알파-태아단백질, 안드로겐 수용체, B7H3, BAGE, BCA225, BCAA, Bcr-abl, 베타-카테닌, 베타-HCG, 베타-인간 융모성 성선자극호르몬, BORIS, BTAA, CA 125, CA 15-3, CA 195, CA 19-9, CA 242, CA 27.29, CA 72-4, CA-50, CAM 17.1, CAM43, 탄산 탈수효소 IX, 암배아 항원, CD22, CD33/IL3Ra, CD68＼P1, CDK4, CEA, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4: CSPG4), c-Met, CO-029, CSPG4, 사이클린 B1, 사이클로필린 C-연관 단백질, CYP1B1, E2A-PRL, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, EphrinB2, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA , ERG(TMPRSS2ETS 융합 유전자), ETV6-AML, FAP, FGF-5, Fos-관련 항원 1, 푸코실 GM1, G250, Ga733＼EpCAM, GAGE-1, GAGE-2, GD2, GD3, 신경교종-연관 항원, GloboH, 당지질 F77, GM3, GP 100, GP 100(Pmel 17), H4-RET, HER-2/neu, HER-2/Neu/ErbB-2, 고분자량 흑색종-연관 항원(HMW-MAA), HPV E6, HPV E7, hTERT, HTgp-175, 인간 텔로머라제 역 전사효소, 이디오타입, IGF-I 수용체 , IGF-II, IGH-IGK, 인슐린 성장 인자 (IGF)-I, 장내 카복실 에스테라제, K-ras, LAGE-1a, LCK, 렉틴-반응성 AFP, 레구마인, LMP2, M344, MA-50, Mac-2 결합 단백질, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MART-1, MART-1/MelanA, M-CSF, 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 메소텔린, MG7-Ag, ML-IAP, MN-CA IX, MOV18, MUC1, Mum-1, hsp70-2, MYCN, MYL-RAR, NA17, NB/70K, 신경교세포 항원 2(NG2), 호중구 엘라스타제,nm-23H1, NuMa, NY-BR-1, NY-CO-1, NY-ESO, NY-ESO-1, NY-ESO-1, OY-TES1, p15, p16, p180erbB3, p185erbB2, p53, p53 돌연변이체, Page4, PAX3, PAX5, PDGFR-베타, PLAC1, 폴리시알산, 전립선-암종 종양 항원 항원-1(prostate-carcinoma tumor antigen-1: PCTA-1), 전립선-특이적항원, 전립선산 포스파타제(PAP), 프로테이나제3(PR1), PSA, PSCA, PSMA, RAGE-1, Ras, Ras-돌연변이체, RCAS1, RGS5, RhoC, ROR1, RU1, RU2(AS), SART3, SDCCAG16, sLe(a), 정자 단백질 17, SSX2, STn, 서바이빈, TA-90, TAAL6, TAG-72, 텔로머라제, 티로글로불린, Tie 2, TLP, Tn, TPS, TRP-1, TRP-2, TRP-2, TSP-180, 티로시나제, VEGF, VEGFR2, VISTA, WT1, XAGE 1, 43-9F, 5T4 및 791Tgp72로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
37. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 T-세포 관여자 이중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
38. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 CD19, Her2(CD340), EGFR, FAPα 또는 메소텔린(MSLN)의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
39. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 CD19의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
40. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에서 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 Her2(CD340)의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
41. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에서 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 EGFR의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
42. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에서 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 FAPα의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
43. 실시형태 1 내지 37 중 어느 하나에서 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 메소텔린 (MSLN)의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
44. 실시형태 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 제2 에피토프는 면역조절 항원의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
45. 실시형태 44에 있어서, 면역조절 항원은 B7-1(CD80), B7-2(CD86), B7-DC(CD273), B7-H1(CD274), B7-H2(CD275), B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), B7-H5(VISTA), BTLA(CD272), 4-1BB(CD137), CD137L, CD24, CD27, CD28, CD38, CD40, CD40L(CD154), CD54, CD59, CD70, CTLA4(CD152), CXCL9, GITR(CD357), HVEM(CD270), ICAM-1(CD54), ICOS(CD278), LAG-3(CD223), OX40(CD134), OX40L(CD252), PD-1(CD279), PD-L1(CD274), TIGIT, CD314, CD334, CD335, CD337 및 TIM-3(CD366)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
46. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 자극성 면역 관문 분자인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
47. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 저해성 면역 관문 분자인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
48. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 PD-1, 4-1BB(CD137), OX40 또는 TIGIT의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
49. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 PD-1의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
50. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 4-1BB(CD137)의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
51. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 OX40의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
52. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 항체는 이중특이적 항체이고, 제2 에피토프는 TIGIT의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
53. 임의의 상기 실시형태에 있어서, 제2 표적 에피토프는 분화 클러스터 CD 항원의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
54. 실시형태 53에 있어서, CD 항원은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD13, CD14, CD15, CD16, CD16a, CD16b, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32A, CD32B, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD60b, CD60c, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64a, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75s, CD77, CD79A, CD79B, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85A, CD85B, CD85C, CD85D, CD85F, CD85G, CD85H, CD85I, CD85J, CD85K, CD85M, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CD129, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD139, CD140A, CD140B, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD156a, CD156b, CD156c, CD157, CD158, CD158A, CD158B1, CD158B2, CD158C, CD158D, CD158E1, CD158E2, CD158F1, CD158F2, CD158G, CD158H, CD158I, CD158J, CD158K, CD159a, CD159c, CD160, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167a, CD167b, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179a, CD179b, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD187, CD188, CD189, CD190, CD191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CDw198, CDw199, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210, CDw210a, CDw210b, CD211, CD212, CD213a1, CD213a2, CD214, CD215, CD216, CD217, CD218a, CD218b, CD219, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235b, CD236, CD237, CD238, CD239, CD240CE, CD240D, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD250, CD251, CD252, CD253, CD254, CD255, CD256, CD257, CD258, CD259, CD260, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD285, CD286, CD287, CD288, CD289, CD290, CD291, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300A, CD300C, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD307, CD307a, CD307b, CD307c, CD307d, CD307e, CD308, CD309, CD310, CD311, CD312, CD313, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD323, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD330, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362, CD363, CD364, CD365, CD366, CD367, CD368, CD369, CD370 및 CD371로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
55. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 크로스맙(CrossMab), DAF(투인원), DAF(포인원), 듀타맙(DutaMab), DT-IgG, 놉인홀(KIH), 놉인홀(공통 경쇄), 전하 쌍, Fab-아암 교환, 시드바디(SEEDbody), 트리오맙(Triomab), LUZ-Y, Fcab, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, 자이바디(Zybody), DVI-IgG(포인원), 나노바디, 나노바이-HAS, BiTE, 다이아바디, DART, TandAb, sc다이아바디, sc다이아바디-CH3, 다이아바디-CH3, 트리플 바디, 모리슨(Morrison) 포맷, 미니항체, 미니바디, TriBi 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab)2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc다이아바디-Fc, 다이아바디-Fc, 탠덤 scFv-Fc, 인트라바디, Dock 및 Lock, ImmTAC, HSAbody, sc다이아바디-HAS, 탠덤 scFv-독소, IgG-IgG, ov-X-바디, 듀오바디, mab2 및 scFv1-PEG-scFv2로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
56. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
57. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 단편 항체은 이중특이적 항체 접합체(예컨대, IgG2, scFv, 탠덤 scFv, F(ab')2, KiH 이중특이적 항체, 모리슨 포맷(Morrison format) 이중특이적 항체(IgG-HC-scFv), 다이아바디, 트라이아바디, 미니바디 또는 전장 이중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
58. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 약 70KDa보다 큰, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
59. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 또는 IgY 다중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
60. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG 다중특이적 항체이고, 예를 들어, 상기 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 다중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
61. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단클론성 다중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
62. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 Fc-무손상인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
63. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 하기를 특징으로 하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편:
a. Vδ1 T-세포에서 TCR의 하향조절을 유발함;
b. CDC 또는 ADCC를 나타내지 않음;
c. Vδ1 T 세포를 고갈시키지 않음.
64. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 ADCC 및/또는 CDC를 통해 생존 가능한 Vδ1 T+ 세포 집단의 약 30% 미만 또는 약 20% 미만 또는 약 10% 미만의 고갈을 초래하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
65. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 IL-17A의 분비를 유도하지 않는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
66. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 동등한 CD3 다중특이적 항체에 의해서 유도되는 IL-17A 분비의 약 30% 미만, 또는 약 20% 미만, 또는 약 10% 미만을 유도하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
67. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 하기 중 하나 이상을 포함하는 다중특이적 항체 또는 이의 단편:
서열번호 2 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR3;
서열번호 26 내지 37 및 서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR2; 및/또는
서열번호 38 내지 61 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CDR1.
68. 실시형태 67에 있어서, 하기를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편:
서열번호 2 내지 13 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 HCDR3;
서열번호 26 내지 37 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 HCDR2;
서열번호 38 내지 49 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 HCDR1;
서열번호 14 내지 25 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 LCDR3;
서열번호 160 내지 171 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 LCDR2; 및/또는
서열번호 50 내지 61 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 LCDR1.
69. 실시형태 67에 있어서, 하기를 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편:
서열번호 2 내지 13 중 어느 하나의 서열을 포함하는 HCDR3;
서열번호 26 내지 37 중 어느 하나의 서열을 포함하는 HCDR2;
서열번호 38 내지 49 중 어느 하나의 서열을 포함하는 HCDR1;
서열번호 14 내지 25 중 어느 하나의 서열을 포함하는 LCDR3;
서열번호 160 내지 171 중 어느 하나의 서열을 포함하는 LCDR2; 및/또는
서열번호 50 내지 61 중 어느 하나의 서열을 포함하는 LCDR1.
70. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 서열번호 62 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
71. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
72. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
73. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
74. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
75. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
76. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
77. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
78. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나와 적어도 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나와 적어도 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
79. 임의의 상기 실시형태에서 있어서, 다중특이적 항체는 서열번호 62 내지 73 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 서열번호 74 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
80. 임의의 상기 실시형태에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
81. 실시형태 80에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터.
82. 실시형태 80에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 실시형태 81에 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
83. 실시형태 82에 있어서, 숙주 세포는 재조합 숙주 세포인, 숙주 세포.
84. 실시형태 82 또는 실시형태 83에 있어서, 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 서열을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 서열을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 숙주 세포.
85. 실시형태 82 또는 실시형태 83에 있어서, 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 서열을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 서열을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
86. 실시형태 82 또는 실시형태 83에 있어서, 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 서열을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 서열을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
87. 실시형태 82 내지 86 중 어느 하나의 숙주 세포를 세포 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 79 중 어느 하나의 임의의 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 생산 방법.
88. 실시형태 87에 있어서, 배양 배지로부터 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 단리시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
89. 임의의 상기 실시형태의 재조합 다중특이적 항체의 생성 방법으로서,
a. 제1 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일특이적 항체를 선택하는 단계로서, 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프인, 선택하는 단계;
b. 항체 또는 상기 제1 항체의 항원-결합 단편을 제2 에피토프를 표적으로 하는 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 재조합 다중특이적 항체를 생성시키는 단계를 포함하는, 방법.
90. 실시형태 89에 있어서, 제1 단일특이적 항체는 실시형태 5 내지 18 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 에피토프에 결합하는, 방법.
91. 실시형태 89 또는 실시형태 90에 있어서, 제1 단일특이적 항체는 실시형태 19 내지 20 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 KD로 TRDV1에 결합하고/하거나 제1 단일특이적 항체는 실시형태 21 내지 29 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 EC50을 갖는, 방법.
92. 실시형태 89 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 제1 단일특이적 항체는 제67항 내지 제79항 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는, 방법.
93. 실시형태 89 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 제2 에피토프를 표적으로 하는 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편은 실시형태 34 내지 55 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 에피토프를 표적으로 하는, 방법.
94. 실시형태 89에 있어서, 재조합 다중특이적 항체는 제1항 내지 제79항 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체인, 방법.
95. 실시형태 89 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 재조합 다중특이적 항체는 동등한 양의 상기 제1 단일특이적 항체에 의해 부여되는 세포독성과 비교하여 제2 에피토프를 발현하는 병든 세포에 대해 증가된 감마 델타 T-세포 매개 세포독성을 부여하는, 방법.
96. 실시형태 89 내지 95 중 어느 하나의 방법에 따라서 제조되거나 제조될 수 있는 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
97. 실시형태 1 내지 79 및 96 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물.
98. 실시형태 1 내지 79 및 96 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
99. 실시형태 1 내지 79 및 96 중 어느 하나의 다중특이적 항체 또는 이의 단편 또는 실시형태 98의 약제학적 조성물을 포함하는, 키트.
100. 실시형태 99에 있어서, 추가적인 치료 활성제를 더 포함하는, 키트.
101. 실시형태 99 또는 실시형태 100에 있어서, 사용 설명서를 더 포함하는, 키트.
102. 대상체의 질환 또는 장애의 치료 방법으로서, 대상체에게 실시형태 1 내지 79 및 961 중 어느 하나의 다중특이적 항체 또는 이의 단편, 또는 실시형태 98의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
103. 실시형태 102에 있어서, 질환 또는 장애는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환인, 방법.
104. 실시형태 102 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체에게 제2 작용제를 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
105. 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 대상체에게 실시형태 1 내지 79 및 96 중 어느 하나의 다중특이적 항체 또는 이의 단편, 또는 실시형태 98의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
106. 실시형태 105에 있어서, 대상체는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환을 갖는, 방법.
107. 실시형태 105 또는 실시형태 106에 있어서, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법은 γδ T 세포의 활성화, γδ T 세포 증식의 유발 또는 증가, γδ T 세포 확장의 유발 또는 증가, γδ T 세포 탈과립화의 유발 또는 증가, γδ T 세포 사멸 활성의 유발 또는 증가, γδ T 세포독성의 유발 또는 증가, γδ T 세포 동원의 유발 또는 증가, γδ T 세포 생존의 증가 및 γδ T 세포의 고갈에 대한 저항성의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 방법.
108. 실시형태 102 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 건강한 세포가 보존되면서 병든 세포가 사멸되는, 방법.
109. 의약품의 제조에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 79 및 96 중 어느 하나의 다중특이적 항체 또는 이의 단편 또는 실시형태 98의 약제학적 조성물 또는 실시형태 99 내지 101 중 어느 하나의 키트.
110. 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 실시형태 1 내지 79 내지 96 중 어느 하나의 다중특이적 항체 또는 이의 단편 또는 실시형태 98의 약제학적 조성물 또는 실시형태 99 내지 101 중 어느 하나의 키트.
111. 의약의 제조에서의 실시형태 1 내지 79 및 96 중 어느 하나의 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 용도.
112. 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 실시형태 1 내지 79 및 96 중 어느 하나의 다중특이적 항체 또는 이의 단편의 용도.
SEQUENCE LISTING <110> GammaDelta Therapeutics Limited <120> MULTISPECIFIC ANTI-TCR DELTA VARIABLE 1 ANTIBODIES <130> WO/2022/034562 <150> PCT/GB2020/051959 <151> 2020-08-14 <150> GB2102222.3 <151> 2021-02-17 <150> GB2102224.9 <151> 2021-02-17 <160> 176 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variable delta 1 (V delta 1) chain of a gamma delta T cell receptor (TCR) (human) <400> 1 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ser 85 90 95 Leu Thr Arg Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr 100 105 110 Val Glu Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr 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PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G09 Light CDR3 <400> 23 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Val Thr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> B09 Light CDR3 <400> 24 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G10 Light CDR3 <400> 25 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> E07 Heavy CDR2 <400> 26 Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C08 Heavy CDR2 <400> 27 Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G04 Heavy CDR2 <400> 28 Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Ser Thr 1 5 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G04 Heavy CDR2 <400> 29 Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C05 Heavy CDR2 <400> 30 Ile Ser Gly Gly Gly Gly Thr Thr 1 5 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> E01 Heavy CDR2 <400> 31 Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> E04 Heavy CDR2 <400> 32 Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> F07 Heavy CDR2 <400> 33 Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn 1 5 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G06 Heavy CDR2 <400> 34 Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G09 Heavy CDR2 <400> 35 Thr Tyr Tyr Gly Ser Lys Trp Tyr Asn 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> B09 Heavy CDR2 <400> 36 Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G10 Heavy CDR2 <400> 37 Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> E07 Heavy CDR1 <400> 38 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> C08 Heavy CDR1 <400> 39 Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 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sapiens <220> <223> C08 nucleotide <400> 100 gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggcaggtcc 60 ctgagactct cctgtgcagc ctctgggttc accgtcagta gcaactacat gagctgggtc 120 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagtta tttatagcgg tggtagcaca 180 tactacgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240 ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgagc 300 cccatagagc tgggtgcttt tgatatctgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg ctagctccta tgagctgact 420 cagccaccct cagtgtcagt ggccccagga aagacggcca ggattacctg tgggggaaac 480 aacattggaa gtcaaagtgt gcactggtac cagcagaagc caggccaggc ccctatgctg 540 gtcatctatt atgatagcga ccggccctca gggatccctg agcgattctc tggctccaac 600 tctgggaaca cggccaccct gaccatcagc agggtcgaag ccggggatga ggccgactat 660 tactgtcagg tgtgggatag tagtagtgat catgtggtat tcggcggcgg gaccaagctg 720 accgtcctag gtcagcccgc ggccgcatcc gcacatcatc atcaccat 768 <210> 101 <211> 774 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> 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gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 60 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc 120 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtgg tggtggtacc 180 acatactcct cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 240 acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg 300 agagattcag gggttgcttt tgatatctgg ggccaaggaa ccctggtcac cgtctcgagt 360 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg ctagcgacat ccagatgacc 420 cagtctccat ccttcctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggcc 480 agtcagaata tacgtacctg gttggcctgg tatcagcaga aaccagggag agcccctaag 540 ctcctgatct atgatgcctc cagtttggaa agtggggtcc catcaaggtt cagcggcagt 600 ggatctggga ctgatttcac tctcaccatc agcagcctgc agcctgaaga ttttgcaact 660 tattactgtc aacagtttaa acgttaccct ccgacgtttg gcctggggac caaggtggag 720 atcaaacgta ccgcggccgc atccgcacat catcatcacc at 762 <210> 104 <211> 780 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> E01 nucleotide <400> 104 gccatggccc aggtccagct ggtacagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 60 ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttacca gctactggat cggctgggtg 120 cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctgg tgactctgat 180 accagataca gcccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagc 240 accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttattgtgcg 300 agacatcagg ttgatacacg gacggctgat tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcgctag ccagtctgcg 420 ctgactcagc ctgcctccgt gtctgggtct cctggacagt cggtcaccat ctcctgcact 480 ggaaccagga gtgacgttgg tggttataac tatgtctcct ggtaccaaca ccacccaggc 540 aaagccccca aactcatgat ttatgaggtc agtaatcggc cctcaggggt ttctaatcgc 600 ttctctggct ccaagtctgg caacacggcc tccctgacca tctctgggct ccaggctgag 660 gacgaggctg attattactg cagctcatat acaagcacca gcactctggt attcggcgga 720 gggaccaagc tgaccgtcct aggtcagccc gcggccgcat ccgcacatca tcatcaccat 780 <210> 105 <211> 771 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> E04 nucleotide <400> 105 gccatggccc aggtacagct gcagcagtca ggtccaggac tggtgaagcc ctcgcagacc 60 ctctcactca cctgtgccat ctccggggac agtgtctcta gcaacagtgc tgcttggaac 120 tggatcaggc agtccccatc gagaggcctt gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc 180 aagtggtata atgattatgc agtatctgtg agaagtcgaa taaccatcaa cccagacaca 240 tccaagaacc agttctccct gcagctgaac tctgtgactc ccgaggacac ggctgtgtat 300 tactgtgcaa gaagctggaa tgatgctttt gatatctggg ggcaagggac cacggtcacc 360 gtctcgagtg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgc tagcgatatt 420 gtgatgacac agtctccttc caccctgtct gcatctatag gagacagagt caccatcact 480 tgccgggccg gtcagagtat tagtacctgg ttggcctggt atcagcagaa accagggaaa 540 gcccctaagc tcctgatcta tgatgcctcc agtttggaaa gtggggtccc attaaggttc 600 agcggcagtg gatctgggac agatttcact ctcaccatca gcagtctgca acctgaagat 660 tttgcaactt actactgtca acagagttac agtaccccgc tcactttcgg cggagggacc 720 aaggtggaga tcaaacgtac cgcggccgca tccgcacatc atcatcacca t 771 <210> 106 <211> 771 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> F07 nucleotide <400> 106 gccatggccc aggtacagct gcagcagtca 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<213> Homo sapiens <220> <223> 1245_P01_E07 with L235A, G237A (aka E07 LAGA) <400> 137 Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Gly 20 25 30 Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr 85 90 95 Leu Leu Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Leu Tyr Ala 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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 785 790 795 800 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 805 810 815 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 820 825 830 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser 835 840 845 Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro 850 855 860 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser 865 870 875 880 Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 885 890 895 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys 900 905 910 Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 915 920 925 Glu Ile Lys 930 <210> 159 <211> 928 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> E07 x Anti-CD19 multispecific (full length) <400> 159 Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Gly Gln Ser Ile Gly 20 25 30 Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Val Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr 85 90 95 Leu Leu Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ala 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 225 230 235 240 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala 245 250 255 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser 260 265 270 Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 275 280 285 Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala 290 295 300 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asp Tyr Ala Asp Ala 305 310 315 320 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 325 330 335 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 340 345 350 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 355 360 365 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 370 375 380 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 385 390 395 400 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 405 410 415 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 420 425 430 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 435 440 445 Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 450 455 460 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 465 470 475 480 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 485 490 495 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 500 505 510 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 515 520 525 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 530 535 540 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 545 550 555 560 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 565 570 575 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 580 585 590 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 595 600 605 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 610 615 620 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 625 630 635 640 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 645 650 655 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 660 665 670 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu 675 680 685 Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly 690 695 700 Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly 705 710 715 720 Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr 725 730 735 Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu 740 745 750 Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp 755 760 765 Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg 770 775 780 Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 785 790 795 800 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 805 810 815 Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu 820 825 830 Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr 835 840 845 Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro 850 855 860 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro 865 870 875 880 Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile 885 890 895 His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser 900 905 910 Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 915 920 925 <210> 160 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> E07 Light CDR2 <400> 160 Val Ala Ser 1 <210> 161 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> C08 Light CDR2 <400> 161 Tyr Asp Ser 1 <210> 162 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> G04 Light CDR2 <400> 162 Asp Ala Ser 1 <210> 163 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> B07 Light CDR2 <400> 163 Ala Ala Ser 1 <210> 164 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> C05 Light CDR2 <400> 164 Asp Ala Ser 1 <210> 165 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> E01 Light CDR2 <400> 165 Glu Val Ser 1 <210> 166 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> E04 Light CDR2 <400> 166 Asp Ala Ser 1 <210> 167 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> F07 Light CDR2 <400> 167 Asp Ala Ser 1 <210> 168 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> G06 Light CDR2 <400> 168 Ala Ala Ser 1 <210> 169 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> G09 Light CDR2 <400> 169 Asp Ala Ser 1 <210> 170 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> B09 Light CDR2 <400> 170 Asp Ala Ser 1 <210> 171 <211> 3 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> G10 Light CDR2 <400> 171 Ala Ala Ser 1 <210> 172 <211> 92 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Cyno variable delta 1 (V delta 1) chain of a gamma delta T cell receptor (TCR) - aka cyno TRDV1 <400> 172 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Glu 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Ser Trp Ser Tyr 20 25 30 Asp Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Gly Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile His Gln Gly Ser Ser Gln Gln Asn Ala Arg Asn Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Gln Lys Ala Ala Ser Ser Ile Thr Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 <210> 173 <211> 101 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Human variable delta 4 chain of a gamma delta T cell receptor (TCR) - aka human TRGV4 <400> 173 Lys Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr 1 5 10 15 Gly Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Thr Gly 20 25 30 Tyr Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu 35 40 45 Leu Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Ser Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg 65 70 75 80 Met Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Trp Asp Gly 100 <210> 174 <211> 96 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Human variable delta 2 (V delta 2) chain of a gamma delta T cell receptor (TCR) - aka TRDV2 <400> 174 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 <210> 175 <211> 95 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Human variable delta 3 (V delta 3) chain of a gamma delta T cell receptor (TCR) - aka TRDV3 <400> 175 Asp Lys Val Thr Gln Ser Ser Pro Asp Gln Thr Val Ala Ser Gly Ser 1 5 10 15 Glu Val Val Leu Leu Cys Thr Tyr Asp Thr Val Tyr Ser Asn Pro Asp 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Arg Ile Arg Pro Asp Tyr Ser Phe Gln Phe Val Phe 35 40 45 Tyr Gly Asp Asn Ser Arg Ser Glu Gly Ala Asp Phe Thr Gln Gly Arg 50 55 60 Phe Ser Val Lys His Ile Leu Thr Gln Lys Ala Phe His Leu Val Ile 65 70 75 80 Ser Pro Val Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Phe 85 90 95 <210> 176 <211> 257 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Folate receptor alpha <400> 176 Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val 1 5 10 15 Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu 20 25 30 Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly 35 40 45 Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala 50 55 60 Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys 85 90 95 Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn 100 105 110 Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg 115 120 125 Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu 130 135 140 Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp 145 150 155 160 Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln 165 170 175 Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile 180 185 190 Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu 210 215 220 Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala 225 230 235 240 Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu 245 250 255 Ser

Claims (31)

  1. 다중특이적 항체 또는 이의 단편으로서,
    a. 제1 표적 에피토프이되, 상기 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프인, 제1 표적 에피토프; 및
    b. 제2 표적 에피토프
    에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 표적 에피토프는 서열번호 1 및/또는 서열번호 128의 아미노산 잔기 1 내지 90 내의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 표적 에피토프는,
    (i) 서열번호 1의 3 내지 20; 및/또는
    (ii) 서열번호 1의 37 내지 77
    의 아미노산 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포의 활성화 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화 에피토프의 결합은 (i) 상기 γδ TCR을 하향조절하고/하거나; (ii) 상기 γδ T 세포의 탈과립화(degranulation)를 활성화시키고/시키거나; (iii) γδ T 세포 매개 사멸을 촉진하는, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 에피토프는 CD107a, CD25, CD69 및/또는 Ki67의 발현을 상향조절하는 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 1.5×10-7M 미만, 1.3×10-7M 미만, 1.0×10-7M 미만 또는 5.0×10-8M 미만의 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은 결합 친화도(KD)로 제1 에피토프에 결합하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 에피토프는 Vδ1+ T 세포 상에 존재하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 에피토프는 암 항원 또는 암-연관 항원의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암 항원 또는 암-연관 항원은 AFP, AKAP-4, ALK, 알파-태아단백질, 안드로겐 수용체, B7H3, BAGE, BCA225, BCAA, Bcr-abl, 베타-카테닌, 베타-HCG, 베타-인간 융모성 성선자극호르몬, BORIS, BTAA, CA 125, CA 15-3, CA 195, CA 19-9, CA 242, CA 27.29, CA 72-4, CA-50, CAM 17.1, CAM43, 탄산 탈수효소 IX, 암배아 항원, CD22, CD33/IL3Ra, CD68＼P1, CDK4, CEA, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4: CSPG4) , c-Met, CO-029, CSPG4, 사이클린 B1, 사이클로필린 C-연관 단백질, CYP1B1, E2A-PRL, EGFR, EGFRvIII, ELF2M, EpCAM, EphA2, EphrinB2, 엡스타인 바 바이러스 항원 EBVA , ERG(TMPRSS2ETS 융합 유전자), ETV6-AML, FAP, FGF-5, Fos-관련 항원 1, 푸코실 GM1, G250, Ga733＼EpCAM, GAGE-1, GAGE-2, GD2, GD3, 신경교종-연관 항원, GloboH, 당지질 F77, GM3, GP 100, GP 100(Pmel 17), H4-RET, HER-2/neu, HER-2/Neu/ErbB-2, 고분자량 흑색종-연관 항원(HMW-MAA), HPV E6, HPV E7, hTERT, HTgp-175, 인간 텔로머라제 역 전사효소, 이디오타입, IGF-I 수용체, IGF-II, IGH-IGK, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, 장내 카복실 에스테라제, K-ras, LAGE-1a, LCK, 렉틴-반응성 AFP, 레구마인, LMP2, M344, MA-50, Mac-2 결합 단백질, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MAGE, MAGE A1, MAGE A3, MAGE-1, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MART-1, MART-1/MelanA, M-CSF, 흑색종-연관 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), 메소텔린, MG7-Ag, ML-IAP, MN-CA IX, MOV18, MUC1, Mum-1, hsp70-2, MYCN, MYL-RAR, NA17, NB/70K, 신경교세포 항원 2(NG2), 호중구 엘라스타제, nm-23H1, NuMa, NY-BR-1, NY-CO-1, NY-ESO, NY-ESO-1, NY-ESO-1, OY-TES1, p15, p16, p180erbB3, p185erbB2, p53, p53 돌연변이체, Page4, PAX3, PAX5, PDGFR-베타, PLAC1, 폴리시알산, 전립선-암종 종양 항원 항원-1(prostate-carcinoma tumor antigen-1: PCTA-1), 전립선-특이적항원, 전립선산 포스파타제(PAP), 프로테이나제3(PR1), PSA, PSCA, PSMA, RAGE-1, Ras, Ras-돌연변이체, RCAS1, RGS5, RhoC, ROR1, RU1, RU2(AS), SART3, SDCCAG16, sLe(a), 정자 단백질 17, SSX2, STn, 서바이빈, TA-90, TAAL6, TAG-72, 텔로머라제, 티로글로불린, Tie 2, TLP, Tn, TPS, TRP-1, TRP-2, TRP-2, TSP-180, 티로시나제, VEGF, VEGFR2, VISTA, WT1, XAGE 1, 43-9F, 5T4 및 791Tgp72로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 T-세포 관여자(engager) 이중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체이고, 상기 제2 에피토프는 CD19, Her2(CD340), EGFR, FAPα 또는 메소텔린의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 에피토프는 면역 세포 상에 존재하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  14. 제1항 내지 제8항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 에피토프는 면역조절 항원의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 면역조절 항원은 B7-1(CD80), B7-2(CD86), B7-DC(CD273), B7-H1(CD274), B7-H2(CD275), B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), B7-H5(VISTA), BTLA(CD272), 4-1BB(CD137), CD137L, CD24, CD27, CD28, CD38, CD40, CD40L(CD154), CD54, CD59, CD70, CTLA4(CD152), CXCL9, GITR(CD357), HVEM(CD270), ICAM-1(CD54), ICOS(CD278), LAG-3(CD223), OX40(CD134), OX40L(CD252), PD-1(CD279), PD-L1(CD274), TIGIT, CD314, CD334, CD335, CD337 및 TIM-3(CD366)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  16. 제1항 내지 제8항 및 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이중특이적 항체이고, 상기 제2 에피토프는 PD-1, 4-1BB, OX40 또는 TIGIT의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적 에피토프는 분화 클러스터 CD 항원의 에피토프인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  18. 제17항에 있어서, 상기 CD 항원은 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD13, CD14, CD15, CD16, CD16a, CD16b, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32A, CD32B, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD60b, CD60c, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64a, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75s, CD77, CD79A, CD79B, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85A, CD85B, CD85C, CD85D, CD85F, CD85G, CD85H, CD85I, CD85J, CD85K, CD85M, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CD129, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD139, CD140A, CD140B, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD156a, CD156b, CD156c, CD157, CD158, CD158A, CD158B1, CD158B2, CD158C, CD158D, CD158E1, CD158E2, CD158F1, CD158F2, CD158G, CD158H, CD158I, CD158J, CD158K, CD159a, CD159c, CD160, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167a, CD167b, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179a, CD179b, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD187, CD188, CD189, CD190, CD191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CDw198, CDw199, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210, CDw210a, CDw210b, CD211, CD212, CD213a1, CD213a2, CD214, CD215, CD216, CD217, CD218a, CD218b, CD219, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235b, CD236, CD237, CD238, CD239, CD240CE, CD240D, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD250, CD251, CD252, CD253, CD254, CD255, CD256, CD257, CD258, CD259, CD260, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD285, CD286, CD287, CD288, CD289, CD290, CD291, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300A, CD300C, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, CD306, CD307, CD307a, CD307b, CD307c, CD307d, CD307e, CD308, CD309, CD310, CD311, CD312, CD313, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD323, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD330, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD360, CD361, CD362, CD363, CD364, CD365, CD366, CD367, CD368, CD369, CD370 및 CD371로 이루어진 군으로부터 선택되는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 크로스맙(CrossMab), DAF(투인원(two-in-one)), DAF(포인원(four-in-one)), 듀타맙(DutaMab), DT-IgG, 놉인홀(Knobs-in-holes)(KIH), 놉인홀(공통 경쇄), 전하 쌍, Fab-아암 교환, 시드바디(SEEDbody), 트리오맙(Triomab), LUZ-Y, Fcab, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, 자이바디(Zybody), DVI-IgG(포인원), 나노바디, 나노바이-HAS, BiTE, 다이아바디, DART, TandAb, sc다이아바디, sc다이아바디-CH3, 다이아바디-CH3, 트리플 바디, 모리슨(Morrison) 포맷, 미니항체, 미니바디, TriBi 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab)2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCAb, sc다이아바디-Fc, 다이아바디-Fc, 탠덤 scFv-Fc, 인트라바디, Dock 및 Lock, ImmTAC, HSAbody, sc다이아바디-HAS, 탠덤 scFv-독소, IgG-IgG, ov-X-바디, 듀오바디, mab2 및 scFv1-PEG-scFv2로 이루어진 군으로부터 선택되는 다중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체 또는 이의 단편은 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG 다중특이적 항체이고, 선택적으로 상기 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG1 다중특이적 항체인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 Fc-무손상(enabled)인, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 하기를 특징으로 하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편:
    a. Vδ1 T-세포에서 TCR의 하향조절을 유발함;
    b. CDC 또는 ADCC를 나타내지 않음; 및
    c. Vδ1 T 세포를 고갈시키지 않음.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 ADCC 및/또는 CDC를 통해 생존 가능한 Vδ1 T+ 세포 집단의 약 30% 미만 또는 약 20% 미만 또는 약 10% 미만의 고갈을 초래하는, 다중특이적 항체 또는 이의 단편.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 재조합 다중특이적 항체의 생성 방법으로서,
    a. 제1 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 단일특이적 항체를 선택하는 단계로서, 상기 제1 표적 에피토프는 γδ T 세포 수용체(TCR)의 가변 델타 1(Vδ1) 쇄의 에피토프인, 상기 선택하는 단계;
    b. 항체 또는 상기 제1 항체의 항원-결합 단편을 제2 에피토프를 표적으로 하는 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 단편과 조합하여 재조합 다중특이적 항체를 생성시키는 단계로서, 선택적으로 상기 재조합 다중특이적 항체는 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체인, 상기 생성시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 다중특이적 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제 또는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  27. 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법 또는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 다중특이적 항체 또는 이의 단편 또는 제26항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환이거나, 면역 반응이 조절되는 대상체는 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환을 갖는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법은 γδ T 세포의 활성화, γδ T 세포 증식의 유발 또는 증가, γδ T 세포 확장의 유발 또는 증가, γδ T 세포 탈과립화의 유발 또는 증가, γδ T 세포 사멸 활성의 유발 또는 증가, γδ T 세포독성의 유발 또는 증가, γδ T 세포 동원의 유발 또는 증가, γδ T 세포 생존의 증가 및 γδ T 세포의 고갈에 대한 저항성의 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 건강한 세포가 보존되면서 병든 세포가 사멸되는, 방법.
  31. 암, 감염성 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 다중특이적 항체 또는 이의 단편 또는 제26항의 약제학적 조성물.
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