KR20230082324A - 알루미늄 제거, 항염증, 항산화 효과를 가지는 신규한 락토바실러스 파라파라지니스 균주 및 이의 이용 - Google Patents

알루미늄 제거, 항염증, 항산화 효과를 가지는 신규한 락토바실러스 파라파라지니스 균주 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알루미늄 제거, 항염증, 항산화 효과를 가지는 L. parafarraginis A6-2 균주, 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물, 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 항산화 조성물, 또는 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 알루미늄 제거용 조성물에 관한 것이다.

Description

알루미늄 제거, 항염증, 항산화 효과를 가지는 신규한 락토바실러스 파라파라지니스 균주 및 이의 이용 {Novel Lactobacillus parafarraginis having aluminum removal effect, anti-inflammatory and anti-oxidant and use thereof}
본 발명은 알루미늄 제거, 항염증, 항산화 효과를 가지는 L. parafarraginis A6-2 균주, 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물, 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 항산화 조성물, 또는 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 알루미늄 제거용 조성물에 관한 것이다.
치매(dementia)는 라틴어에서 유래한 말로서 “정신이 없어진 것”이라는 의미를 지니고 있다. 태어날 때부터 지적 능력이 모자라는 경우를 정신 지체 라고 부르는 반면, 치매는 정상적인 생활을 해오던 사람이 점차 뇌기능이 손상되면서 이전에 비해 인지 기능이 지속적으로 저하되어 일상생활에 상당한 지장이 나타나고 있는 상태이다. 여기서 인지 기능이란 기억력, 언어능력, 시공간 파악 능력, 판단력 및 추상적 사고력 등 다양한 지적능력을 가리키는 것으로서 각 인지기능은 특정 뇌 부위와 밀접한 관련이 있다. 치매와 같은 임상 증후군을 유발하는 원인은 세분할 경우 약 70여 가지에 이른다. 다양한 치매 중에서 가장 많은 것은 알츠하이머병과 혈관성 치매이지만, 그 밖에도 루이체 치매, 파킨슨씨병 등의 퇴행성 뇌질환과 뇌수두증, 두부외상, 뇌종양, 마약 중독, 감염성 질환 등 다양한 원인에 의해 치매가 발생할 수 있다.
지금까지 치매 발병 원인은 베타아밀로이드와 타우 단백질(tau protein)의 인산화와 연관되며 이들을 제거 내지 줄이는데 역점을 두어왔다. 즉 단백질의 유전적 변이 등에 집중하였다고 볼 수 있다. 그러나 쌍둥이의 알츠하이머 발병을 추적함으로써, 유전적 요인 외에도 환경적 요인도 중요함을 확인하였다. 치매 발병 원인에 대해 유전적 요인이 어느 정도 그 원인일 수 있으나, 유전자 돌연변이에 의한 치매는 5% 정도이고 유전적 요인은 인류가 수백만 년 지구에서 생존하면서 유전적 열성은 적자생존의 원칙에 의해 자연 도태되고, 현재에 이르러서는 환경적 요인이 더 크게 작용하는 것으로 보인다. 치매 환자의 뇌를 해부하여 보면 구리, 철, 알루미늄 등이 많이 누적되어 있고 베타아밀로이드 및 타우 단백질이 일정 수준 이상으로 나타난다. 망간 및 알루미늄이 신경질환을 야기할 것이라는 많은 연구 결과가 있었으나 어떻게 해를 끼치는지에 대한 원인 규명은 부족하였다. 아밀로이드 단백질과 뇌 속에 있는 전이금속 물질과의 결합에 의하여 타우단백질의 인산화 촉진 정도를 실험한 결과 철(Fe) 또는 알루미늄과 결합 시에 급격한 아밀로이드의 인산화 및 섬유화가 진행되는 것으로 밝혀졌다. 특히 알루미늄과 결합한 아밀로이드 단백질에 현격한 인산화가 진행되는 것은 알츠하이머의 진행과 알루미늄 금속간의 밀접한 관련이 있음을 보여준다. (S. Bollognin, et al., 2011)
일본의 남쪽 키이반도에는 유난히 운동성신경장애질환(Amylotrophic lateral sclerosis; ALS 또는 motorneuron disease)이 많이 발생하는데, 이 지역은 비가 많이 와서 토양에 칼슘과 마그네슘이 낮고 망간과 알루미늄 성분이 높아서 아직도 이 지역에서 ALS 환자가 많은 것으로 알려져 있다. 이 같은 현상은 태평양의 미국령괌 남부 지역에서도 있었던 것으로 알려져 있다. 즉 알루미늄의 축적이 많다는 공통점이 있으며, 망간도 어떤 작용을 하는 것으로 유추된다. 또한 우리나라 제주도에서도 치매 환자 비율이 높은 것으로 알려져 있다.
생균제(probiotics)는 일반적으로 건강에 유익한 생균 식품 첨가제로 정의되었으나 (Lilly and Stillwell, Science 147:747-748, 1965), 최근 들어 Salminen 등 (Int. J. Food Microbiol. 44:93-106, 1998)에 의해 인체나 동물의 건강을 증진시키기 위하여 고안된 식품 및 사료 또는 식이 첨가제에 들어있는 살아있는 미생물 제제라고 정의되고 있다. 생균제로 가장 많이 이용되고 있는 미생물에는 유산균(Lactic acid bacteria)이 있으며, 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등이 대표적인 유산균에 해당된다. 유산균(lactic acid bacteria; LAB)은 전통적으로 인류가 오랫동안 안전하게 사용해온 미생물로서, 사람이나 동물의 장내뿐만이 아니라 다양한 식품, 환경에 정상적으로 서식하고 있는 대표적인 유용미생물이며, 장내 균총의 안정화, 유해세균의 정착 억제에 따른 부패산물 생성 감소 및 질병 예방, 면역 활성화 작용, 항암작용, 콜레스테롤 저하 등 숙주동물에 많은 도움을 준다. 유산균은 발효 유제품은 물론 각종 발효식품, 장류, 김치 등에 폭넓게 활용되고 있으며, 최근에는 사람의 의약품이나 가축의 사료 첨가제에 이르기까지 매우 다양하게 이용되고 있다.
본 발명자들은 치매 등의 신경계 질환을 야기할 수 있는 알루미늄을 효과적으로 흡착 및 제거하며, 알루미늄으로부터 유래되는 신경염증을 치료 또는 예방하는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명자들은 젓갈로부터 알루미늄 제거, 항염증 및 항산화 효과를 가지는 신균주를 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 젓갈로부터 알루미늄 제거, 항염증 및 항산화 효과를 가지는 신균주를 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다. 이에, 본 발명의 목적은 알루미늄 제거, 항염증 및 항산화 효과를 가지는 락토바실러스 파라파라지니스 Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주(KACC 81065BP) 및 이를 이용한 알루미늄 제거용 조성물, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 항산화 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 알루미늄 제거, 항염증 및 항산화 효과를 가지는 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP)를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 알루미늄 제거용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 항산화 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 판토에 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP)는 알루미늄 제거 활성을 가지고 있고, 신경대식세포의 염증개선 효과를 가지고 있으며, 항산화 효과를 가지고 있으므로, 신경염증 특히 치매의 예방 및 치료에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 젓갈에서 분리한 균주들의 알루미늄 제거활성을 비교, 분석한 결과이다.
도 2은 젓갈에서 분리한 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 유전학적 정보를 계통학적으로 분석한 결과이다.
도 3은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 알루미늄 제거 특성을 분석한 결과이다.
도 4는 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 담즙 및 산 내성 특성을 분석한 결과이다.
도 5는 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 생균(Live cell)과 사균(Dead cell)에 대한 알루미늄 제거 특성을 분석한 결과이다.
도 6은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 알루미늄 흡착에 따른 표면 작용기 변화를 분석한 결과이다.
도 7는 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 분해물의 신경아교세포의 신경 염증 개선 효과 확인한 결과이다.
도 8은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 분해물의 항산화 활성에 대하여 분석한 결과이다.
도 9는 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 분해물의 면역 대식세포에서의 항염증 효과에 대하여 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 치매 등의 신경계 질환을 야기할 수 있는 알루미늄을 효과적으로 흡착 및 제거하며, 알루미늄으로부터 유래되는 신경염증을 치료 또는 예방하는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명자들은 젓갈로부터 알루미늄 제거, 항염증 및 항산화 효과를 가지는 신균주를 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 알루미늄 제거, 항염증 및 항산화 효과를 가지는 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP)를 제공할 수 있다.
상기 균주는 하기 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함할 수 있다.
gcactttccctgtatattatggttttgccatgggcagcaatacatgcaagtcgaacgcgtcttggttaatgatgttaggtgcttgcatttaactgatttaacattgagatgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggtaacctgccctgaagtgggggataacacttggaaacaggtgctaataccgcataacaacgaaaaccacatggttttcgtttgaaagatggcttcggctgtcacttttggatggacccgcggcgtattagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggccatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgatgaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttggagaagaacaggtgatagagtaactgttatcatcttgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaggtctgatgtgaaagccttcggcttaaccggagaagggcatcggaaaccgggagacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttctgctaacctaagagattaggcgttcccttcggggacggaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgtcagttgccagcatttagttgggcactctggccagactgccggtgacaaaccggaggaaaggtggggatgaagtcaaatcatcctggccccttatggaccggggctaacaacgtgctacaatg
본 발명자들은 상기 수득된 신균한 균주를 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2라 명명하고, 2017년 11월 10일자로 국립농업과학원 미생물은행에 기탁하여 기탁번호 KACC 81065BP를 부여 받았다.
본 발명자들은 젓갈로부터 유산균을 분리하기 위하여 단계희석법으로 젓갈을 희여 석하였고, 상기 희석된 젓갈액을 MRS 고체 배지에 도말한 후, 37℃에서 24시간동안 호기 배양하여 14개의 유산균을 분리하였다. MRS 액체 배지를 사용하여 14개의 유산균을 37℃, 120 rpm 조건하에서 전배양(pre-culture)하여, 알루미늄을 포함하는 증류수에 접종하여 배양한 뒤 상등액을 희석하여 유도결합 플라즈마 발광 광도법을 측정하였다. 그 결과, A6-2 균주가 다른 균주들과 비교하여 월등히 높은 알루미늄 제거 효율을 보이는 것으로 확인하였으며, 24시간 동안 32 mg Al/g의 알루미늄을 약 98% 이상 제거하는 것을 확인하였다 (도 1).
본 발명의 상기 균주는 젓갈의 시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 이에 상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 sequencing을 통한 계통수(phylogenetic tree)를 확인한 결과, 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis)인 것을 확인하였다 (도 2).
또한, 본 발명은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 알루미늄 제거용 조성물을 제공할 수 있다.
MRS 액체 배지에서 전배양된 상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP) 균주를 알루미늄 농도가 조절된 증류수에 접종하여 유도결합 플라즈마 발광 광도법을 이용하여 알루미늄 제거 효과를 확인한 결과, 32 mg Al/L 이하의 농도에서 24시간 이내에 약 35%의 제거율을 나타내었으며 10 mg Al/L 이상의 알루미늄을 제거할 수 있었다 (도 3).
상기 균주의 생균과 사균의 알루미늄 제거 활성을 조사한 결과 생균과 사균이 알루미늄 제거에 차이를 보이지 않았으며 이를 통해 A6-2 균주의 생균과 사균 프로바이오틱스와 포스트바이오틱스 소재로 활용할 수 있는 것으로 확인하였다(도 5). 알루미늄 생체 흡착 전, 후의 A6-2 균주의 표면 작용기의 변화를 확인하기 위해서 동결건조된 펠렛을 KBr과 혼합하고 슬라이스로 가압한 다음에 FTIR 적외선 분광계(Jabco 430, Japan)로 분석하였다. 그 결과 A6-2 균주의 표면에 존재하는 hydroxyl 작용기, 개방사슬 이미노(-C=N-) 작용기, 지방족 나이트로 작용기, 1차 아민 작용기, 유기 황산염 및 방향족 인산염이 크게 변화하는 것으로 확인되었으며, 이들을 통하여 A6-2 균주 표면에 알루미늄 흡착이 일어나는 것으로 확인되었다(도 6).
상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주의 내담 및 산 내성을 확인한 결과, 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주는 0.3%의 답즙 조건에서 생장이 우수하여 내담즙성을 가지고, pH 4 조건에서도 우수한 내산성이 특성을 나타내었다(도 4).
또한, 본 발명은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP)는 LPS로 유도된 면역 미세아교세포의 NO의 농도를 감소시키는 것을 확인되었으며, 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2의 생균제가 낮은 투여량에도 보다 효과적으로 신경 미세아교세포 내 염증 수치를 감소시킬 수 있는 것으로 확인되었다(도 7b). 또한 LPS로 유도된 대식세포에서의 NO의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다 (도 9).
본 명세서에서, “예방”이란, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 투여에 의해 신경염증질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상의 발생을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한 재발을 예방하거나 방지하기 위해 상기 질병에 차도가 있는 대상의 치료를 포함한다.
본 명세서에서, “치료”란, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 신경염증질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 변행위를 의미한다.
본 명세서에서, “개선”이란, 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 섭취에 의해 신경염증질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서, “약학 조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물로, 본 발명의 목적상 신경염증질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 예방하거나 또는 치료하기 위해 투여되는 것을 의미한다.
본 명세서에서, “건강기능식품”이란, 건강기능식품에 관한 법률 제 6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 포함하며, 영양 공급 외에도 본 발명의 목적상 신경염증질환의 예방, 생체 방어, 면역, 회복 등의 생체 조절 기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다.
본 발명은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 균주는 생균 뿐만 아니라 사균체의 형태로 포함될수 있다. 상기 "사균체"란 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균과 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록 한 형태를 의미한다. 사균체는 세포질(cytoplasm), 세포벽(cell wall), 박테리오신(bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류(polysaccharide), 및/또는 유기산 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 배양물은 균주를 배양한 보통 한천배지(또는 영양 한천배지: Nutrient agar)배지, TSA(Tryptic soy agar) 배지, 표준한천배지(Standard Methods Agar; Plate Count Agar), 유당배지, BGIB 배지, 2배 농도 BGIB 배지, Endo 한천 배지 (Endo Agar),MRS 배지, EMB 한천배지(Eosin methylene blue agar), 보통 배지(또는 영양 배지; Nutrient Broth), 데스옥시콜레이트 유당 한천배지(Desoxycholate lactose Agar) 또는 EC 배지(EC Broth)로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "배양물"은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하나, 균주 배양 후 균주를 제거한 상등액, 이들의 추출물 및 분획물을 모두 포함하는 개념이다. 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액" 또는 “무세포 상등액”이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 배양물은 액체 배지뿐만 아니라 이의 건조물의 형태일 수 있다.
본 명세서에서, "약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한"이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP) 균주는 소교세포(microglia)의 염증 반응을 억제할 수 있다.
본 명세서에서, "소교세포(microglia)"란, 중추신경계(CNS)의 대식세포의 일종으로, '미세 아교 세포'라고도 한다. 뇌의 10 내지 15% 정도를 차지하는 소교세포의 지속적이고 과도한 염증성 활성화는 염증성 매개 분자의 분비를 증가시키고, 뇌 신경세포의 독성, 손상 또는 사멸을 야기하여 뇌 염증을 수반하는 다양한 질환의 위험성 증가시킬 수 있다.
상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP) 균주는 이러한 소교세포의 염증성 활성화를 억제함으로써, 염증성 매개 분자의 분비를 감소시키고, 신경 손상 또는 퇴화를 감소시킴으로써 신경염증질환을 예방 또는 치료할 수 있다
상기 신경 염증성 질환은 알츠하이머, 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 알콜성 치매, 파킨슨 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 일 수 으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "신경염증질환"이란, 신경교세포에 의해 매개되는 중추신경계에서의 염증 질환들로, 바람직하게 는 '뇌신경염증질환'을 의미할 수 있고, 상기 신경염증의 영향으로 발생하는 신경 퇴행성 질환(퇴행성 뇌질환), 염증성 뇌질환, 대사 합병증 등을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP) 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다
본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 피하, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다
또한, 본 발명은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 신경염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다. 상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP) 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명에 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상은 소교세포(microglia)의 염증 반응을 억제할 수 있다.
상기 신경염증은 알츠하이머, 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 알콜성 치매, 파킨슨 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 신경염증질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 신경염증질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제 (식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 필버톤, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효 용량은 신경염증질환 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
또한 본 발명은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화 조성물을 제공할 수 있다. 상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP) 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP)의 DPPH 라디칼의 소거능, 환원력, 철 이온 킬레이트 효과를 확인하여, 상기 균주가 높은 항산화 능력을 가지는 것을 확인하였다 (도 8).
또한 본 발명은 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다. 기 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP) 균주 및 건강기능식품 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 분리 및 동정
상업용 시판 전통 젓갈로부터 유산균을 분리하기 위하여 단계희석법으로 젓갈을 희석하였다. 희석된 젓갈액을 MRS 고체 배지에 도말한 후, 37℃에서 24시간동안 호기 배양하여 14개의 유산균을 분리하였다. 분리된 유산균들의 알루미늄 제거 활성을 확인 및 비교하기 위해 제거 실험을 실시하였다. MRS 액체 배지를 사용하여 14개의 유산균을 37℃, 120 rpm 조건하에서 전배양(pre-culture)하였으며, 전배양된 유산균들의 탁도(optical density)를 1.0으로 조정하여 알루미늄의 농도가 32 mg Al/L로 조성된 증류수에 접종하였다. 24시간동안 배양한 후, 채취한 시료를 원심 분리하여 상등액을 회수하였다. 제거된 알루미늄의 농도를 측정하기 위해 회수된 상등액을 희석하여 유도결합 플라즈마 발광광도법(inductively coupled plasma-atomic emission spectrophotometry; ICP-AES, Leeman Labs, Inc., Hudson, NH, USA)을 사용하였다. 실험결과, A6-2 균주가 다른 균주들과 비교하여 월등히 높은 알루미늄 제거 효율을 보이는 것으로 확인하였으며, 24시간 동안 32 mg Al/g의 알루미늄을 약 98% 이상 제거하는 것을 확인하였다 (도 1).
A6-2 균주의 동정을 위하여, 해당 균주의 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 분석한 유전자 염기서열을 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 기존에 알려진 미생물과의 상동성을 분석하였으며, MEGA7 프로그램을 이용하여 계통수를 작성하였다. 분석결과, A6-2 균주는 Lactobacillus parafarraginis와 99%의 상동성을 나타내었으며 기존에 존재하지 않은 신규한 균주임을 확인하였다. 따라서 알루미늄 제거활성이 우수한 A6-2 균주를 최종적으로 Lactobacillus parafarraginis A6-2로 명명하여 2017년 11월 10일 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 기탁하였다 (기탁번호 KACC 81065BP) (도 2)
실시예 2. 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 알루미늄 제거 효과의 확인
시간에 따른 A6-2 균주의 제거 특성을 확인하기 위하여, MRS 액체 배지에서 전배양된 A6-2 균주를 알루미늄 농도가 조절된 증류수에 접종하였다. 배양을 시작한 이후 시간별(0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24)로 시료를 채취하였다. 채취한 시료를 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 각 시료의 알루미늄 농도를 측정하기 위해 회수된 상등액을 희석하여 실시예 1과 같이 유도결합 플라즈마 발광광도법을 사용하였다. 그 결과, 32 mg Al/L 이하의 농도에서 24시간 이내에 약 35%의 제거율을 나타내었으며 10 mg Al/L 이상의 알루미늄을 제거할 수 있음이 확인되었다. 또한 MRS 액체배지 조성 보다 증류수 조건 내에서 더 높은 제거효율을 보이는 것이 확인되었다(도 3).
실시예 3. 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 담즙 및 산 내성 특성의 확인
3.1 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 담즙 내성의 확인
A6-2 균주의 담즙산(bile acid) 내성 여부를 확인하기 위하여, 전배양된 A6-2 균주를 oxgall이 0, 0.3%씩 첨가된 MRS 액체배지에 107 CFU/mL 정도로 접종하였다. 균주가 접종된 배지를 3시간 동안 37℃에서 배양하였으며, 배양 이후 MRS 고체배지에 도말하여 생존한 집락을 계수하였다. 그 결과, A6-2 균주는 0.3%의 답즙 조건에서 생장이 우수한 것으로 확인되어 생균제를 위한 내담즙성 특성을 지니는 것으로 나타났다(도 4A).
3.2 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 산 내성의 확인
산성 환경 내 A6-2 균주의 생존 여부를 확인하기 위하여, 전배양된 A6-2 균주를 pH가 조정된 MRS 액체배지(pH 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.0, 2.0)에 107 CFU/mL 정도로 접종하였다. 균주가 접종된 배지를 24시간 동안 37℃에서 배양하였으며, 배양 이후 MRS 고체배지에 도말하여 생존한 집락을 계수하였다. 그 결과, A6-2 균주는 pH 4 조건에서도 우수한 내산성이 특성을 나타내었다(도 4B).
실시예 4. 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 생균과 사균이 지니는 알루미늄 제거 활성의 확인
A6-2 균주의 생균 및 사균일 경우 나타나는 알루미늄의 제거 특성을 평가하기 위하여 시간에 따른 제거 활성을 평가하였다. 유산균은 알루미늄을 흡착함으로써 제거하게 되는데, 생물체량(biomass)을 이용하여 A6-2 균주의 단위 그램당 납 흡착량을 분석하였다. 1 L의 MRS 액체 배지에서 A6-2 균주를 배양하였다. 배양된 배지를 원심 분리하여 상등액을 제거하고 균주의 펠렛을 회수하였다. 회수된 펠렛을 생리식염수를 사용하여 3회 세척 후 다시 생리식염수에 재부유(re-suspending)하였다. 재부유된 현탁엑을 열 건조기(70℃)에서 완전건조 시킨 후 건조된 펠렛의 무게를 측정하여 현탁액 mL 당 g량을 확인하였다. 알루미늄의 농도가 조절된 증류수에 생균 및 사균을 각각 첨가하였다. 생균을 처리한 실험군은 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48시간별로 시료를 채취하였으며, 사균을 처리한 실험군은 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24시간별로 시료를 채취하였다. 채취한 시료를 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 각 시료의 알루미늄 농도를 측정하기 위해 회수된 상등액을 희석하여 유도결합 플라즈마 발광광도법을 사용하였다. 유산균의 그램(gram)당 알루미늄 흡착량은 다음과 같은 생물체량(biomass) 공식을 이용하여 계산하였다.
qe = (Ci - Ce)V / M
qe : 생물체량 당 흡착된 알루미늄의 양 (mg/g)
Ci : solution 내에 초기 알루미늄의 농도
Ce : solution 내에 최종 알루미늄의 농도
V : solution의 부피
M : 생물체량(biomass)
그 결과, 알루미늄은 A6-2 균주의 균체에 의하여 3시간 이내에 제거되는 것을 확인하였으며, A6-2 균주는 그람당 3.6 mg 이상의 알루미늄을 제거할 수 있는 것으로 나타났다. 특히 A6-2 균주의 생균과 사균이 알루미늄 제거에 차이를 보이지 않았으며 이를 통해 A6-2 균주의 생균과 사균 프로바이오틱스와 포스트바이오틱스 소재로 활용할 수 있는 것으로 확인하였다(도 5). 또한, 알루미늄 생체 흡착 전, 후의 A6-2 균주의 표면 작용기의 변화를 확인하기 위해서 동결건조된 펠렛을 KBr과 혼합하고 슬라이스로 가압한 다음에 FTIR 적외선 분광계(Jabco 430, Japan)로 분석하였다. 그 결과, 알루미늄 제거 전, 후 A6-2 균주의 표면에 존재하는 hydroxyl 작용기, 개방사슬 이미노(-C=N-) 작용기, 지방족 나이트로 작용기, 1차 아민 작용기, 유기 황산염 및 방향족 인산염이 크게 변화하는 것으로 확인되었으며, 이들을 통하여 A6-2 균주 표면에 알루미늄 흡착이 일어나는 것으로 확인되었다(도 6).
실시예 5. 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주 생균제와 분해물의 신경아교세포의 염증 개선 효과의 확인
실시예 5.1 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주를 처리한 신경아교세포의 세포 생존율의 확인
지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)로 유도된 신경염증에 대한 A6-2 균주와 이의 분해물이 나타내는 항염증 활성을 조사하기 위해서 우선적으로 미세아교세포(BV-2 cell)를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. 면역 미세아교세포를 1% penicillin/streptomycin과 10% fetal bovine serum이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지의 조건에서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 상기 계대배양한 면역 대식세포를 24-well plate에 분주하여 약 1일간 배양하고, 세포가 약 80% 생장된 시점에서 희석농도별(1/8, 1/4, 1/2, 1) A6-2 생균제와 분해물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 0.5 mL의 MTT 용액을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양한 다음에 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Mnnedrf, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 대조군의 흡광도를 기반으로 %로 환산하였다. 그 결과, A6-2 균주의 생균제와 균주 분해물 모두에서 신경 미세아교세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인되어 A6-2 균주가 프로바이오틱스 혹은 포스트바이오틱스 소재로 생체 내 안정성이 높은 것으로 확인되었다(도 7a).
실시예 5.2 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주를 처리한 신경아교세포의 Nitric oxide (NO) 농도 측정
LPS의 처리로 활성화된 면역 미세아교세포에서 A6-2 균주 분해물의 전처리가 NO 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해서 세포독성이 나타나지 않는 희석농도(1/8, 1/4, 1/2, 1)의 A6-2 생균제와 분해물을 처리하고 0.1 mg/L의 LPS를 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 세포 배양 상등액과 griess reagent를 1 : 1로 혼합하고 30분간 반응시켜 ELISA microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, A6-2 균주의 생균제와 균주 분해물이 모두 유의적으로 신경 미세아교세포에서 발생된 염증을 유의적으로 감소시킬 수 있는 것으로 확인되었으며, A6-2의 생균제가 낮은 투여량에도 보다 효과적으로 신경 미세아교세포 내 염증 수치를 감소시킬 수 있는 것으로 확인되었다(도 7b).
실시예 6. 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주 분해물의 항산화 효과의 확인 실시예
6.1 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 DPPH 라디칼 소거능의 확인
A6-2 균주의 생균제과 분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가 및 비교하기 위하여, 전배양된 균주의 펠렛을 인산완충생리식염수를 이용하여 3회 세척 및 재부유하였다. 재부유된 펠렛의 일부는 초음파 파쇄기를 사용하여 균주 분해물을 제조하였다. 5 mL의 제조된 펠렛 및 분해물 현탁액과 5 mL의 DPPH 용액을 30분간 반응한 후, 자외선-가시광 분광광도법(UV-Vis spectrophotometry, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 517 nm에서 흡광도를 분석하였다. DPPH 라디칼 소거 활성은 다음과 같은 공식을 이용하여 계산하였다.
(Ab-As) / Ab x 100 (%)
Ab : 시료 무첨가군의 흡광도
As : 시료 첨가군의 흡광도
그 결과, 생균제에서 최대 약 40% 이상, 분해물에서 최대 약 36% 이상의 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내어 우수한 항산화 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, A6-2 균주가 체내 발생하는 라디칼을 유의적으로 소거할 수 있을 것으로 확인되었다(도 8A).
6.2 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 환원력 활성의 확인
환원력을 평가 및 비교하기 위하여, 2 mL의 A6-2 균주 생균제 및 분해물 현탁액에 2 mL의 1% 페리시안화 칼륨 용액과 2mL의 sodium phosphate buffer (0.2 M, pH 7.0)을 혼합하고 50℃에서 20분간 반응시킨다. 반응 이후, 2 mL의 1% 트라이클로로아세트산을 첨가하고 3000 xg에서 5분간 원심 분리하여 상등액을 회수한다. 회수된 상등액과 4 mL의 0.1% 염화철 용액을 혼합하고 자외선-가시광 분광광도법을 사용하여 700 nm에서 흡광도를 분석하였다.환원력은 다음과 같은 공식을 이용하여 계산하였다.
(As-0.0161)/0.0064 (mg L-ascorbic acid/g)
As: 시료 첨가군의 흡광도
그 결과, 환원력 활성은 항산화 작용의 여러 기전 중에서 수소 원자를 제공하는 free radical의 연쇄 반응으로 금속 이온(Fe3+, Cu2+)을 환원시켜 Fe2+, Cu+로 전환하는 환원력을 나타낸 것으로 환원력이 높을수록 항산화 활성이 높다는 것을 나타낸다. A6-2 균주의 생균제 및 분해물에서 환원력을 지니는 것으로 확인되었으며, 특히 A6-2 균주 분해물에서 우수한 환원력을 나타내어 높은 항산화 활성을 지니는 것으로 나타났다(도 8B).
6.3 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주의 철 이온(Fe 2+ ) 킬레이트 효과의 확인
1 mL의 A6-2 균주 생균제 및 분해물 현탁액에 4 mL의 Tris-HCl buffer (pH 7.4), 0.5 mL의 1.8 mM 황산철 용액 그리고 1.6 mL의 10% hydroxylamine-HCi 용액을 혼합한다. 이후, 4 mL의 0.1% 2,2‘-bipyridyl 용액을 혼합하고 자외선-가시광 분광광도법을 사용하여 522 nm에서 흡광도를 분석하였다. 철 이온 킬레이트 효과는 다음과 같은 공식을 이용하여 계산하였다.
(Ab-As) / Ab x 100 (%)
Ab : 시료 무첨가군의 흡광도
As : 시료 첨가군의 흡광도
그 결과, 철은 세포 내 산화물 형성에 관여하는 물질로써 지질의 산화를 촉진시키는 인자로 철의 킬레이트 효과가 높을수록 지질의 산화를 방지할 수 있다. 특히 금속이온으로 인한 저밀도 지질단백(low density lipoprotein, LDL)의 산화가 신경퇴행성 질환을 일으킨다고 보고되었으며, 이는 LDL의 산화로 인해 생성된 지질 친화성 물질이 신경세포의 세포막을 쉽게 통과하여 사립체 기능 이상 및 칼슘 항상성의 붕괴를 통해 신경세포의 사멸을 유도한다고 알려져 있다. A6-2 균주 분해물이 높은 철이온 킬레이트 효과를 보이며 지질의 산화를 유의적으로 예방할 수 있는 것으로 확인되었다(도 8C).
실시예 7. 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주 분해물의 면역 대식세포 내 항염증 효과의 확인
실시예 7.1 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주를 처리한 면역 대식세포의 세포의 생존률의 확인
지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)로 유도된 염증에 대한 A6-2 균주 분해물이 나타내는 항염증 활성을 조사하기 위해서 우선적으로 쥐 면역 대식세포(RAW 264.7 cell)를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다. 면역 대식세포를 1% penicillin/streptomycin과 10% fetal bovine serum이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지의 조건에서 계대배양하여 실험에 사용하였다. 상기 계대배양한 면역 대식세포를 24-well plate에 분주하여 약 1일간 배양하고, 세포가 약 80% 생장된 시점에서 희석농도별(1/10, 1/8, 1/6, 1/4, 1/2) A6-2 분해물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 0.5 mL의 MTT 용액을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양한 다음에 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Mnnedrf, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 대조군의 흡광도를 기반으로 %로 환산하였다. 분석결과, A6-2 균주의 균주 분해물이 면역 대식세포에 대하여 세포독성을 나타내지 않는 것으로 확인되어 A6-2 균주가 프로바이오틱스 혹은 포스트바이오틱스 소재로 생체 내 안정성이 높은 것으로 확인되었다(도 9A).
실시예 7.2 락토바실러스 파라파라지니스 A6-2(Lactobacillus parafarraginis A6-2)균주를 처리한 면역 대식세포의 세포의 Nitric oxide (NO) 농도의 측정
LPS의 처리로 활성화된 면역 대식세포에서 A6-2 균주 분해물의 전처리가 NO 생성에 미치는 영향을 평가하기 위해서 세포독성이 나타나지 않는 희석농도(1/10, 1/8, 1/6, 1/4, 1/2)의 균주 분해물을 처리하고 1 mg/L의 LPS를 24시간 동안 배양하였다. 배양한 후 세포 배양 상등액과 griess reagent를 1 : 1로 혼합하고 30분간 반응시켜 ELISA microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, A6-2 균주의 분해물이 유의적으로 면역 대식세포에서 발생된 염증을 유의적으로 감소시킬 수 있는 것으로 확인되었으며, A6-2의 분해물이 낮은 투여량에도 매우 효과적으로 면역 대식세포 내 염증 수치를 감소시킬 수 있는 것으로 확인되었다(도 9B).
[기탁번호]
기탁기관명 : 국립농업과학원 미생물은행(KACC)
수탁번호 : KACC 81065BP
수탁일자 : 2017. 11. 10.
<110> InoB Science Inc. <120> Novel Lactobacillus parafarraginis having aluminum removal effect, anti-inflammatory and anti-oxidant and use thereof <130> 2021112301 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1265 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus parafarraginis strain A6-2 (27F) 16S ribosomal RNA gene <400> 1 gcactttccc tgtatattat ggttttgcca tgggcagcaa tacatgcaag tcgaacgcgt 60 cttggttaat gatgttaggt gcttgcattt aactgattta acattgagat gagtggcgaa 120 ctggtgagta acacgtgggt aacctgccct gaagtggggg ataacacttg gaaacaggtg 180 ctaataccgc ataacaacga aaaccacatg gttttcgttt gaaagatggc ttcggctgtc 240 acttttggat ggacccgcgg cgtattagct tgttggtgag gtaacggctc accaaggcca 300 tgatacgtag ccgacctgag agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac 360 tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg 420 ccgcgtgagt gatgaagggt ttcggctcgt aaaactctgt tgttggagaa gaacaggtga 480 tagagtaact gttatcatct tgacggtatc caaccagaaa gccacggcta actacgtgcc 540 agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag 600 cgcaggcggt tttttaggtc tgatgtgaaa gccttcggct taaccggaga agggcatcgg 660 aaaccgggag acttgagtgc agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc 720 gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga 780 ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga 840 tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact 900 ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 960 gcggtggagc atgtggttta attcgatgct acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc 1020 ttctgctaac ctaagagatt aggcgttccc ttcggggacg gaatgacagg tggtgcatgg 1080 ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1140 tgtcagttgc cagcatttag ttgggcactc tggccagact gccggtgaca aaccggagga 1200 aaggtgggga tgaagtcaaa tcatcctggc cccttatgga ccggggctaa caacgtgcta 1260 caatg 1265

Claims (8)

  1. 알루미늄 제거, 항염증 및 항산화 효과를 가지는 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 포함하는, 균주.
  3. 제 1항의 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 알루미늄 제거용 조성물.
  4. 제 1항의 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 신경 염증성 질환은 알츠하이머, 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 알콜성 치매, 파킨슨 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항의 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 신경 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제 1항의 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화 조성물.
  8. 제 1항의 락토바실러스 파라파라지니스 (Lactobacillus parafarraginis) A6-2 균주 (KACC 81065BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 항산화용 건강기능식품 조성물.
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