KR20230078876A - 발효 흑삼의 추출 및 농축방법 - Google Patents

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농업회사법인 주식회사 함초록
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Abstract

본 발명은 원료 인삼에 증포 과정을 반복하여 얻어지는 흑삼에 관한 것으로 유효성분들의 체내 흡수율을 높이기 위하여, 본 발명은 세척 및 건조된 삼에 효소를 처리하고 복합균주를 사용하여 발효한 후 증포 과정을 거쳐 흑삼을 제조하며, 구체적으로 삼을 세척한 후 건조하는 세척 및 건조 단계; 건조된 삼을 제1 배양액에서 35-65 ℃ 에서 2.5-5.5 시간 동안 효소로 처리하는 효소처리 단계; 효소처리된 삼을 제2 배양액에 접종하여 발효 시키는 발효 단계; 발효된 삼을 85-90 ℃에서 7-9 시간 동안 증숙하여 삼을 제조하는 증숙 단계 및 상기 증숙된 삼을 50-60 ℃에서 7-9 시간 동안 건조 시키는 건조 단계를 포함한다.

Description

발효 흑삼의 추출 및 농축방법 {Extraction and concentration method of the black ginseng}
본 발명은 저분자 진세노사이드를 유효성분으로 함유하는 발효 흑삼의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 프로바이오틱스 활성을 나타내는 균주로 발효시켜 저분자 진세노사이드 함량이 증진된 흑삼을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인삼은 가공 방법에 따라 수삼, 백삼, 태극삼 및 홍삼 등으로 분류 된다. 일반적으로 훈증과 가공법에 따라 삼의 종류가 달라지고 그 기능성 성분 또한 증가되는 것으로 보고되고 있다. 2000년대 초부터 금산 지역을 중심으로 한약재의 수치법(修治法)의 일종인 아홉 번 찌고 아홉 번 말리는 이른바, 구증구포九蒸九曝)의 원리를 이용하여 인삼을 찌는 가공법이 개발되었고, 수삼을 찌고 말리는 과정을 반복하여 색깔이 흑색을 띠게 되어 해당 과정을 통해 얻어진 삼을 흑삼(black ginseng)이라고 부르게 되었다. 흑삼은 기존의 홍삼과는 외관 특성과 성분 면에서 차별화되고 Rg3를 비롯한 생리활성 성분들이 인삼보다 홍삼이 많고, 홍삼보다는 흑삼이 더 높은 것으로 알려져 있다. 이외에도 Ginsenoside Re, Rf, Rg1, Rg2 및 Rh1의 함량 또한 다른 삼 제품보다 흑삼에서 그 함량이 증가되는 것으로 알려져 있다. 그러나 흑삼은 유효성분이 수삼, 홍삼 등 다른 삼 등에 비해 많지만 대부분 고분자 화합물이기 때문에 체내흡수율이 떨어지는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 한국등록특허 제10-2209235호는 진세노사이드 Rk1 및 Rg5의 함량의 합계 대비 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rg3(s), Rk1, Rg5 및 Rh1(s)의 함량의 특정 합계를 가진 흑삼 추출물을 포함하는 식품 조성물을 개시하고 있다. 그러나 증숙 시간과 온도만을 조절한 것으로 증숙 과정이 늘어날수록 진세노사이드 Rb1은 감소하는 문제점을 나타내고 있다. 흑삼 내 진세노사이드 유효성분들이 균일하게 높은 함량으로 포함되어 있으면서도 체내흡수율을 높이기 위한 흑삼의 제조, 가공방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-2209235호
본 발명은 흑삼 내 고분자 진세노사이드를 저분자 진세노사이드로 변환하여 체내 흡수율이 높고, 진세노사이드를 포함한 다양한 유효성분이 높은 함량으로 함유된 흑삼을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 또한 연화된 조직을 갖고 용이하게 추출할 수 있는 흑삼의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세척 및 건조된 삼에 효소를 처리하고 복합균주를 사용하여 발효한 후 증포 과정을 거쳐 흑삼을 제조하는 것으로,
구체적으로 삼을 세척한 후 건조하는 세척 및 건조 단계; 건조된 삼을 제1 배양액에서 35-65 ℃ 에서 2.5-5.5 시간 동안 효소로 처리하는 효소처리 단계; 효소처리된 삼을 제2 배양액에 접종하여 발효 시키는 발효 단계; 발효된 삼을 85-90 ℃에서 7-9 시간 동안 증숙하여 삼을 제조하는 증숙 단계 및 상기 증숙된 삼을 50-60 ℃에서 7-9 시간 동안 건조 시키는 건조 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 삼의 조직을 연화시키고 효소의 침투를 용이하게 하기 위하여 상기 세척 및 건조된 삼을 효소로 처리하기 전에 75-85 ℃에서 증숙하는 저온 증숙 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면 흑삼을 제조하기 위해, 삼을 증포 시키는 과정 즉 증숙 및 건조 처리를 하기 전에 효소로 처리하고 복합균주를 접종하여 발효 시킴으로써 체내 흡수 및 이용성을 향상시킬수 있는 저분자 진세노사이드 성분들이 풍부하게 함유된 흑삼을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 따라 삼의 조직을 연화시키고 효소와 복합균주, 수분의 침투를 용이하게 함으로써 고분자 진세노사이드를 저분자 진세노사이드로의 변환율을 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시에 따른 흑삼의 제조 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 다른 일 실시에 따른 흑삼의 제조 방법을 나타낸 흐름도이다.
도 3은 발효 시간에 따른 복합균주 수를 나타낸 배지들의 사진이다.
본 발명에서 사용되는 인삼은 수삼, 흑삼 모두 포함하는 것으로서 수삼은 말리지 않은 인삼을, 흑삼은 증숙 및 건조를 통해 어두운 색을 띠는 인삼일 수 있다. 본 발명의 각 단계에 따른 인삼, 수삼, 흑삼을 모두 삼이라고 통칭한다. 이하에서는 도면 및 실시예와 함께 본 발명을 설명하도록 한다.
본 발명은 흑삼 내 저분자 진세노사이드 함량을 높이고 이에 따른 유효성분의 체내 성분 흡수율을 높이기 위하여 원료 인삼을 효소로 처리하고 발효 시키는 데에 특징이 있다. 상세하게 본 발명은 수삼을 세척한 후 건조하는 세척 및 건조 단계(S100); 건조된 삼을 제1 배양액에서 35-65 ℃ 에서 2.5-5.5 시간 동안 효소로 처리하는 효소처리 단계(S200); 효소처리 된 삼을 제2 배양액에 접종하여 발효 시키는 발효 단계(S300); 발효된 삼을 85-90 ℃에서 7-9 시간 동안 증숙하는 증숙 단계(S400) 및 증숙된 삼을 50-60 ℃에서 7-9 시간 동안 건조 시키는 건조 단계(S500);로 이루어진다.
또한 본 발명에서 세척 및 건조된 삼을 효소로 처리하기 전에 효소의 투입을 용이하게 하기 위하여 75-85 ℃에서 증숙하여 삼의 조직을 연화시키는 저온 증숙 단계(S600)를 더 추가할 수 있다.
세척 및 건조 단계(S100)는 수삼을 흐르는 물에 세척하고 50 ℃에서 24 시간 건조하여 외부 이물질 또는 흙을 제거하는 전처리 공정이다.
본 발명에서 효소처리 단계(S200)는 전처리된 수삼을 제1 배양액에 침지시키는데 제1 배양액은 효소가 포함된 배양액으로 효소로서 Cellulase, Hemicellulase, β-glucosidase을 포함하고, 100mL 당 NB배지 0.8g, 설탕 0.5g을 포함한다.
제1 배양액은 인삼 대비 10 중량%의 효소액과 인삼 대비 400 중량%의 물로 배합하여 얻어지며 건조된 삼을 제1 배양액에 35-65 ℃ 에서 2.5-5.5 시간 동안 침지시켜 효소 처리한다.
본 발명에서 발효 단계(S300)는 상기 효소처리된 삼을 제2 배양액에 침지시켜 발효시키는 과정으로, 제2 배양액은 복합균주가 포함된 배양액으로 복합균주로서 Lactobacillus plantarum(Lactobacillus plantarum Hamchorok01, KACC 81160BP, 국제특허기탁균주), Lactobacillus sakei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum 및 Streptococcus thermophilus 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다.
제2 배양액은 상기 복합균주를 30~38 ℃ 에서 18~24 시간 동안 배양하고, 30~38 ℃ 에서 18~24 시간 동안 발효시킨다.
구체적으로는, 제2 배양액은 복합균주를 NB 배지에 37℃, 24 시간 동안 배양(1 × 108 CFU/mL 이상)하여 준비하고, 전처리된 삼 대비 10 중량% 배양액(NB배지 8g/L, 설탕 5g/L)에 3.5% (3-5%) 접종하여 30-35℃, 24 시간 동안 발효시킨다.
인삼은 증포 과정, 즉 증숙 단계와 건조 단계를 수 회 반복할수록 색이 점점 진해지고 홍색, 갈색을 거쳐 검게 변하면서 흑삼으로 진행된다. 본 발명에서 효소처리 및 발효된 삼은 85-90 ℃에서 7-9 시간 동안 증숙한 후 50-60 ℃에서 7-9 시간 동안 건조 시킨다.
증숙 단계(S400)에서 시간과 온도는 진세노사이드 함량과 추출 수율에 중요한 역할을 하는데 90 ℃를 초과하면 시간과 관계없이 변환율 및 수율이 감소하게 되며, 7시간 미만으로 수행하면 고분자 진세노사이드에서 저분자 진세노사이드로의 변환이 충분히 일어나지 않게 된다.
더욱이 상기 증숙 온도가 90 ℃ 초과이면 효소와 복합균주들의 생존 온도를 넘게 되어 사멸할 수 있으며 85 ℃ 미만이면 수증기가 인삼 조직 안으로 침투하여 화학반응을 일으키는데 충분치 않을 수 있다. 더 바람직하게는 효소처리 및 발효된 인삼은 85-90 ℃에서 8 시간 동안 증숙한 후 50-60 ℃에서 8 시간 동안 건조 시킨다.
또한 건조 단계(S500)은 증숙 단계에서의 온도보다 약 30 ℃ 낮은 50-60 ℃에서 증숙 시간과 거의 동일한 시간인 7-9 시간 동안 수행한다. 건조 단계에서의 온도가 60 ℃ 초과인 경우 증숙된 삼 조직으로부터 수분이 충분히 증발하지 않고 남아있게 되고, 고분자 진세노사이드에서 저분자 진세노사이드로의 변환이 원활히 일어나지 않게 된다. 또한 건조 시간이 상기 범위 밖에서 수행되면 인삼 내 진세노사이드 화합물이 분해되어 유효함량이 감소할 수 있다. 상기 증숙 단계와 건조 단계는 7 내지 8회 반복하여 총 120-140 시간의 증포 과정을 거칠 수 있다.
실시예
원료 인삼을 세척한 후 50℃에서 24시간 건조하여 외부 이물질 혹은 흙을 제거하였다. 세척한 인삼을 85℃ 수준에서 저온 증숙하고 인삼과 인삼 대비 10% 중량의 효소액과 인삼대비 400% 중량의 물을 배합한 배양액을 준비하여 4 내지 8시간 동안 50℃의 온도로 효소처리 진행하였다. 인삼 무게 대비 약 10%중량으로 100ml 당 NB배지 0.8g, 설탕 0.5g을 포함하도록 배양액을 준비하고, 배양액 대비 5-10%로 복합 유산균주(Lactobacillus plantarum Hamchorok01 : Lactobacillus sakei(Hamchorok02) = 1:1 혼합)를 접종하며(S300), 37℃의 온도에서 24시간 동안 배양하였다. 증삼기에서 90℃의 온도에서 5시간씩 2번 연속적으로 증숙한 후 70℃의 온도에서 5시간 동안 건조하였다.
실험예 1 : 프로바이오틱스 활성 평가
프로바이오틱스 활성을 평가하기 위하여, 내산성(pH tolerance(pH 2.5)) 및 내담즙성(bile salt tolerance[oxgall 0.3%(w/v)])을 하기와 같은 방법을 통해 평가하였다. 먼저, 본 발명에 따른 균주를 MRS 배지에서 37℃, 24시간 배양하여 실험을 진행하였다.
내산성을 확인하기 위해, MRS 액체배지에 HCl와 NaOH를 이용하여 각각 pH 2.5와 7.0으로 조절한 후 37℃에서 3시간 진탕 배양한 후, 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 MRS 고체배지에 도말하고 37℃, 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다. pH 조절 전 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 내산성 정도를 확인하였다.
내담즙성 분석은 상기 내산성 평가에서 사용된 MRS액체 배지에 담즙을 0.3% 첨가하여 37℃에서 3시간 진탕 배양한 후, 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 MRS 고체배지에 도말하고 37℃, 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다. 내담즙성은 담즙 첨가 전의 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 담즙성 정도를 확인하였다.
Initial count log (CFU/mL) Survival after 6h log (CFU/mL) Survival rate
(%)
pH tolerance
(pH 2.5)		 9.18±0.14 8.70±0.10 94.1
pepsin tolerance
(pH 2.5)		 9.15±0.12 8.80±0.07 96.2%
bile salt tolerance
[oxgall 0.3%(w/v)] 		9.15±0.12 9.05±0.02 98.9%
상기 표 1에 따르면, 본 발명에 따른 균주는 높은 생존률을 나타내어 내산성 및 내담즙산성을 갖는 것을 확인했으며, 이는 본 발명에 따른 신규 균주가 체내에서 위액의 영향을 받지 않고 장까지 도달할 수 있으며 장내에서는 담즙의 영향을 받지 않고 생존할 수 있음을 나타낸다.
비교예 1 내지 3
원료 인삼을 세척한 수삼을 비교예 1, 비교예 1의 수삼을 증숙 및 건조시킨 홍삼을 비교예 2, 비교예 2의 홍삼을 효소 처리한 것을 비교예 3이라고 한다.
실험예 2 : 진세노사이드 Rg1, Rb1, Rg3, Rg5 및 Rk1의 함량 측정
상기 실시예 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 각 인삼들에 대해 진세노사이드의 함량을 측정하여 아래 표 2에 나타내었다.
측정 방법은 상기 실시예 및 비교예 1 내지 3로 제조된 각 인삼들을 분쇄기를 이용하여 분말로 만들고 각 인삼 분말 5g을 에탄올 용매 50 ml에 투입한 시료를 고압 멸균기에서 80℃, 60 min 동안 추출한 후 conical tube에 상등액 회수 및 냉장 보관하였다.
추출물 0.25 ㎖과 증류수 0.75 ㎖와 Folin & Ciocalteu’s 페놀 용액 0.25 ㎖ 혼합하고 5분 동안 방치 후에 10% NaCO3 용액 025 ㎖ 첨가 후 실온에서 1시간 반응시켜 시료액을 준비하였다. Standard curve는 Gallic acid를 농도별로 희석하여 시료액 대신 사용하여 작성하였다. 경상대학교 공동실험실습관에 있는 분광광도계를 이용하였으며 640 nm 흡광도에서 측정하여 흡광도 값을 확인하였다. 이후 표준곡선을 작성하여 값을 구하였다.
고분자 진세노사이드 Rb1의 측정은 인삼 또는 흑삼 1g을 메탄올 50ml에 용해한 후 필터하여 시험용 샘플을 제조하고, 이를 고성능 액체크로마토 그래피(HPLC) 방법을 이용하여 진세노사이드 Rg1, Rg3, Rg5 및 Rk1의 함량을 측정하였다. 진세노사이드 Rg1, Rg3, Rg5 및 Rk1의 표준액을 이용하여 표준 검량 곡선을 작성한 후 시험용 샘플의 진세노사이드 함량을 측정하였다.
측정은 Agilent 1200 series(Agilent Technologies, 미국)를 이용하였으며, 컬럼은 Capcell Pak RP18(250mm * 4.6mm, 5um, ShiseidoCo, 일본)을 이용하였다. 검출 파장은 203nm이며, 시료는 20uL을 주입하였다.
성분 (g/mol) 함량 (mg/g)
비교예 1
(수삼)		 비교예 2
(홍삼)		 비교예 3
(구증구포)		 실시예
(발효흑삼)
Rb1 (고분자, 1,109.29) 0.33 mg/g 3.63 mg/g 9.06mg/g 0.31mg/g
Rg1 (고분자, 801.01) 0.15mg/g 1.73mg/g 1.47mg/g N.D.
Rg3 (저분자, 785.02) 0.04mg/g 0.05mg/g 4.02mg/g 13.23mg/g
Rg5 (저분자, 767.03) - - 2.42mg/g 7.66mg/g
Rk1(저분자, 767.02) - - 1.78mg/g 4.86mg/g
합 계 0.52mg/g 5.41mg/g 18.75 mg/g 26.06mg/g
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 진세노사이드의 총 함량은 본 발명에 따른 실시예에 의해 제조된 흑삼에서 가장 높은 것을 확인할 수 있으며, 특히 저분자 진세노사이드 Rg3, Rg5 및 Rk1의 함량이 비교예 대비 모두 현저히 높은 것으로 나타났다.
특히, Rb1은 비교예 3의 흑삼에서 가장 높은 함량을 나타내고, Rg1은 비교예 2의 홍삼에서 가장 높은 함량을 나타내는 반면, 본 발명에 따른 실시예에 의해 제조된 발효흑삼에서 Rb1 및 Rg1이 가장 낮은 함량을 나타내고 있는 것을 확인하였다.
또한, 비교예 1의 수삼 및 비교예 2의 홍삼에서는 Rg5 및 Rk1이 전혀 함유되어 있지 않았으나 본 발명에 따른 실시예에 의해 제조된 발효흑삼에는 높은 함량으로 포함되어 있는 것으로 보아, 본 발명의 제조 방법에 의해 고분자 진세노사이드 Rg1 및 Rb1이 Rg3, Rg5 및 Rk1과 같이 저분자 진세노사이드로 변환하였다는 것을 알 수 있다.
또한, 상기 표 2에서와 같이 Rb1, Rg1, Rg3, Rg5 및 Rk1의 함량 측정 외에 진세노사이드 Rg1, Re, Rc, Rb2, Rd 등의 함량을 측정하였다(표 3 참조).
진세노사이드 함량 (mg/g)
비교예 1
(수삼)		 비교예 2
(흑삼)		 비교예 3
(효소처리 흑삼)		 실시예
(효소 및 발효 흑삼)
Re N.D N.D 0.42 0.13
Rf N.D 0.24 0.49 0.66
Rh1 (S) N.D 0.33 0.33 0.69
Rg2 (S) N.D 0.31 0.24 0.60
Rg2 (R) N.D 0.25 0.22 0.38
Rh1 (R) N.D 0.30 0.39 0.46
Rh4 N.D N.D N.D N.D
Rc N.D 0.20 1.01 0.68
F1 N.D N.D N.D N.D
Rb2 N.D 0.29 0.76 0.62
Rb3 N.D 0.05 0.19 0.20
Rd N.D 0.41 0.36 0.94
F2 N.D N.D 2.23 4.11
PPT (S) N.D N.D 0.17 0.17
PPT (R) N.D N.D 0.01 0.11
Compound-K N.D N.D 0.04 0.12
RH2 (S) N.D N.D N.D 0.24
RH2 (R) N.D N.D 0.02 0.12
Total 2.01 5.08 9.96 19.81
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였으나, 본 발명은 다양한 변화와 변경 및 균등물을 사용할 수 있다. 본 발명은 상기 실시예를 적절히 변형하여 동일하게 응용할 수 있음이 명확하다. 따라서 상기 기재 내용은 하기 특허청구범위의 한계에 의해 정해지는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

Claims (3)

  1. 진세노사이드로부터 Rg3, Rk1 및 Rg5의 생물전환 활성, 내산성 및 내담즙성을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) Hamchorok01 균주(기탁번호: KACC81160BP).
  2. (i) 수삼을 세척한 후 건조하는 세척 및 건조 단계(S100);
    (ii) 건조된 삼을 제1 배양액에서 35-65 ℃ 에서 2.5-5.5 시간 동안 효소로 처리하는 효소처리 단계(S200);
    (iii) 효소처리된 삼을 제 1 항에 따른 락토바실러스 플란타럼(lactobacillus plantarum) Hamchorok01 균주(기탁번호 : KACC 81160BP)를 포함하는 복합균주로 구성된 제2 배양액에 접종하여 발효시키는 발효 단계(S300);
    (iv) 발효된 삼을 85-90 ℃에서 7-9 시간 동안 증숙하는 증숙 단계(S400) 및
    (v) 상기 증숙된 삼을 50-60 ℃에서 7-9 시간 동안 건조 시키는 건조 단계(S500);를 포함하는 저분자 진세노사이드를 유효성분으로 함유하는 발효 흑삼의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 제1 배양액은 효소로서 Cellulase, Hemicellulase, β-glucosidase을 포함하는 것을 특징으로 하는 저분자 진세노사이드를 유효성분으로 함유하는 발효 흑삼의 제조방법.
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