KR20230078733A - 펩티드 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 C-말단 PEG화를 포함하는 극성 조합체 (PA) 펩티드의 합성 변형인 펩티드를 제공한다. 본 발명은 보체계를 조절하고 호중구와 상호작용하여 그들의 결합 및 활성을 변경시키기 위한 최소 1종의 합성 펩티드를 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 9월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 63/085,556, 및 2021년 5월 7일에 출원된 63/185,831에 대해 우선권을 주장하며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2021년 9월 16일에 생성된 상기 ASCII 사본은 251110_000139_SL.txt로 명명되고, 1,228 바이트의 크기이다.
1. 발명의 분야
본 발명의 실시양태는 일반적으로 합성 펩티드 및 요법 및 진단을 위한 그의 용도, 및 보다 구체적으로 합성 펩티드의 PEG화된 형태에 관한 것이다.
2. 배경
보체계
선천 면역계의 필수적인 성분인 보체계는 침입 병원체에 대한 방어 메커니즘으로서 중요한 역할을 하고, 적응 면역 반응을 프라이밍하며, 면역 복합체 및 아폽토시스 세포를 제거하는 것을 돕는다. 3가지 상이한 경로는 보체계를 포함한다: 고전적 경로, 렉틴 경로 및 대안적 경로. C1q 및 만노스-결합 렉틴 (MBL)은 각각 고전적 및 렉틴 경로의 구조적으로 관련된 인식 분자이다. IgM 또는 군집화된 IgG는 C1q에 대한 주요 리간드로서 역할을 하는 반면, MBL은 폴리사카라이드, 예컨대 만난을 인식한다. C1q 및 MBL에 의한 리간드 결합은 C4 및 C2의 순차적 활성화를 발생시켜 각각 고전적 및 렉틴 경로 C3-컨버타제를 형성한다. 대조적으로, 대안적 경로 활성화는 인식 분자를 요구하지 않지만, 고전적 또는 렉틴 경로에 의해 개시된 C3 활성화를 증폭시킬 수 있다. 임의의 이들 3가지 경로의 활성화는 염증성 매개자 (C3a 및 C5a) 및 막 공격 복합체 (MAC)의 형성을 발생시키며, 이는 세포 용해를 유발한다.
보체계는 많은 보호적 면역 기능에 있어서 중요한 역할을 하지만, 보체 활성화는 폭넓은 범위의 자가면역 및 염증성 질환 과정에서 조직 손상의 중요한 매개자이다. (Ricklin and Lambris, "Complement-targeted therapeutics." Nat Biotechnol 2007; 25(11):1265-75).
보체 조절제에 대한 필요가 존재한다. 한편으로, 보체계는 병원성 유기체에 대한 필수적인 숙주 방어이다. 다른 한편으로, 그의 비점검된 활성화는 파괴적인 숙주 세포 손상을 유발할 수 있다. 현재, 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반 루푸스, 중증 근무력증, 및 다발 경화증을 포함하는 많은 질환 과정에서의 보체 조절이상과 연관된 공지된 이환율 및 사망률에도 불구하고, 단지 2가지 항-보체 요법만이 최근 인간에서 사용하기 위해 승인되었다: 1) 발작성 야간 혈색뇨 (PNH) 및 비정형 용혈성 요독 증후군 (aHUS)의 치료에 사용되는 C5에 대한 2가지 인간화, 장기-작용 모노클로날 항체인 에쿨리주맙 (솔리리스(Soliris)™) 및 2) 울토미리스 (라불리주맙(Ravulizumab)™). PNH 및 aHUS는 매우 소수의 사람들이 걸리는 희귀 질환이다. 현재, 이상조절된 보체 활성화가 중심적 역할을 하는 보다 통상적인 질환 과정에 대해 승인된 보체 조절제는 없다. 이상조절된 보체 활성화는 만성 질환 적응증 및 급성 질환 적응증 둘 다에서 역할을 할 수 있다.
보체계의 고전적, 렉틴 및 대안적 경로를 억제하는 펩티드를 개발할 필요가 있는데, 이는 이들 3가지 경로의 각각이 다수의 자가면역 및 염증성 질환 과정에 기여하는 것으로 입증되었기 때문이다. 고전적 및 렉틴 경로의 특이적 차단이 특히 필요한데, 이는 이들 경로 둘 다가 많은 동물 모델에서 허혈 재관류-유도된 손상 및 다른 질환에 관련되었기 때문이다. 대안적 경로 결핍을 갖는 인간은 중증 박테리아 감염을 앓는다. 따라서, 침입 병원체에 대한 면역 감시를 위한 기능적인 대안적 경로가 필수적이다.
PIC1 패밀리의 분자는 보체의 고전적 경로의 억제, 미엘로퍼옥시다제 억제, 호중구 세포외 트랩 (NET) 억제 및 항산화 활성을 포함하는 몇몇 항-염증성 기능적 특성을 갖는 스크램블된 아스트로바이러스 외피 단백질에 기반한 합리적으로 디자인된 펩티드의 집합을 포함한다. 원래 화합물은 15개 아미노산 펩티드 서열, IALILEPICCQERAA (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)이며, 그의 수가용성을 증가시키는 C-말단 단분산 24-mer PEG화된 모이어티를 갖는다 (IALILEPICCQERAA-dPEG24; PA-dPEG24; 서열식별번호: 2). PA-dPEG24 분자의 추가의 특징은 본원에서 논의된다.
보체계 및 안구 질환
보체계는 면역 항상성을 유지하는 것 및 병원체로부터의 눈의 보호에 있어서 활성이며, 이는 잠재적 감염을 제어하는 보체 활성화 분자 및 보체 조절 분자 사이의 복잡한 상호작용을 수반한다. 보체계는 면역 감시를 위해 필요하지만, 과도하고 이상조절된 보체 활성화는 많은 안구내 염증성 및 각막 염증성 질환, 예컨대 자가면역 및 감염성 포도막염, 급성 황반 변성 (AMD), 건성안 질환 (DED), 감염성 및 비-감염성 각막염, 각막 손상 및 복구, 미숙아 망막병증 (ROP), 안구 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 당뇨병성 망막병증 (Jha et al., 2007), 망막 정맥 폐색 (RVO) 후 황반 부종, 및 당뇨병성 황반 부종 (DME)에 관련되었다.
호중구, 호중구 세포외 트랩, 및 안구 질환
최근, 마우스 모델 및 AMD 환자로부터의 사체 인간 눈에 대한 생체외 연구에서 보여진 바와 같이 호중구가 AMD의 발병기전에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었음이 보고되었다 (Ghosh et al., 2019). 이들 연구에서, 인간 및 마우스 눈 둘 다에서 상승된 인터페론 람다가 확인되었으며, 인터페론 람다의 이러한 높은 발현은 정맥 순환으로부터 망막으로의 호중구의 유출을 유도하여 결국 눈에 대한 병리학적 손상을 초래하였다.
눈 질환에서 호중구의 일반화된 역할 외에도, 호중구 세포외 트랩 (NET)은 다양한 눈 질환, 예컨대 각막의 만성 염증, DED, 감염성 각막염, 각막 손상, 안구 GvHD, 비-감염성 포도막염 (예를 들어, 베체트병) 뿐만 아니라 감염성 포도막염, 당뇨병성 망막병증, 및 마지막으로 AMD에 있어서 특이적으로 병원성 역할을 하는 것으로 입증되었다 (Estua-Acosta et al., 2019; Ghosh et al., 2019). 구체적으로, AMD의 경우에, 네토시스(NETosis) 바이오마커, 미엘로퍼옥시다제 (MPO), 호중구 엘라스타제 및 시트룰린화된 히스톤 H3이 AMD의 마우스 모델에서 발병기전에 기여하는 것으로 입증되었다 (Ghosh et al., 2019).
보체계 및 급성 폐 손상 (ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)
ALI는 종종 상당한 이환율 및 사망률을 발생시키는 ARDS로 진행할 수 있는 중증 외상의 합병증이다 [Maca J, Jor O, Holub M, Sklienka P, Bursa F, Burda M, et al. Past and Present ARDS Mortality Rates: A Systematic Review. Respir Care 2017;62(1):113-122]. 지금까지, 성질상 지원적인 현재의 치료의 표준으로 ALI를 예방하는 약리학적 개입은 없다. ALI는 환자의 기저의 임상적 병태 (예를 들어, 염증, 외상, 저혈압)와 2차 인설트, 예컨대 혈액 수혈 (수혈-관련 ALI (TRALI), 소생, 방사선) [Cho MS, Modi P, Sharma S. Transfusion-related Acute Lung Injury. 2020; In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan; Kumar AK, Anjum F. Ventilator-Induced Lung Injury (VILI). 2020 Dec 15. In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan; Arroyo-Hernandez M, Maldonado F, Lozano-Ruiz F, Munoz-Montano W, Nunez-Baez M, Arrieta O. Radiation-induced lung injury: current evidence. BMC Pulm Med 2021;21(1):9.] 또는 바이러스성 폐렴 (예를 들어, 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스 또는 코로나바이러스-관련 ALI) [Klomp M, Ghosh S, Mohammed S, Nadeem Khan M. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol 2020;Sep 8; Alvarez AE, Marson FA, Bertuzzo CS, Arns CW, Ribeiro JD. Epidemiological and genetic characteristics associated with the severity of acute viral bronchiolitis by respiratory syncytial virus. J Pediatr (Rio J)2013;89(6):531-43; Lee C, Choi WJ. Overview of COVID-19 inflammatory pathogenesis from the therapeutic perspective. Arch Pharm Res 2021;Jan 4:1-18]의 조합으로부터 초래될 수 있다. 2차 인설트는 상이할 수 있지만, 폐 부전을 초래하는 급속하게 진행성인 질환 과정은 전형적으로 과도한 보체 및 호중구-매개 염증성 반응에 의해 유도된 과장되고 압도적인 선천 면역학적 또는 염증성 반응에 의해 매개된다. ALI 외에도, 이상조절된 호중구 및 보체 활성화는 만성 폐 질환, 예컨대 COPD 및 스테로이드 저항성 호중구성 천식의 급성 악화의 핵심적 매개자이다 [Pandya PH, Wilkes DS. Complement system in lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol 2014; 51:467-473; Khan MA, Nicolls MR, Surguladze B, Saadoun I. Complement components as potential therapeutic targets for asthma treatment. Respir Med 2014;108:543-549].
수혈-관련 사망률의 선두적인 원인 중 하나를 나타내는 TRALI의 경우에, 이러한 질환 과정은 복잡하고, 충분히 이해되어 있지 않지만, '2-히트' 모델은 현재 환자의 기저의 임상적 병태에 의해 매개되는 제1 히트 및 수혈된 단위에서의 성분에 의해 촉발되는 제2 히트를 갖는 임상적 상황을 가장 정확하게 예시하는 것으로 믿어진다 [Silliman CC, Paterson AJ, Dickey WO, Stroneck DF, Popovsky MA, Caldwell SA, et al. The association of biologically active lipids with the development of transfusion-related acute lung injury: a retrospective study. Transfusion 1997;37(7):719-26; Silliman CC, McLaughlin NJ. Transfusion-related acute lung injury. Blood Rev 2006;20(3):139-59]. 다양한 시험관내, 생체내 및 생체외 연구는 급성 폐 손상 (ALI)을 발생시키는 직접적 활성화, 반응성 산소 종 (ROS)의 형성 및 호중구 세포외 트랩 (NET) 형성을 통해 TRALI의 발병기전에서 핵심적 역할을 하는 것으로서 호중구가 관련되었음을 보여주었다 [Rebetz J, Semple JW, Kapur R. The Pathogenic Involvement of Neutrophils in Acute Respiratory Distress Syndrome and Transfusion-Related Acute Lung Injury. Transfus Med Hemother 2018;45(5):290-298]. 추가로, 보체계는 호중구 활성화 뿐만 아니라 ROS 및 NET 형성을 발생시키는 호중구와의 C3a 및 C5a 상호작용을 통해 TRALI에 있어서 역할을 할 수 있음이 이전에 상정되었다 [Jongerius I, Porcelijn L, van Beek AE, Semple JW, van der Schoot CE, Vlaar APJ, et al. The Role of Complement in Transfusion-Related Acute Lung Injury. Transfus Med Rev 2019;33(4):236-242].
천식
기관지 천식은 호산구성, 호중구성, 혼합된 과립구성 및 소수과립구성 천식을 포함하는 독특한 면역병리학적 메커니즘에 의해 매개되는 만성, 불균질, 염증성 질환이다. 천식을 갖는 환자의 3.6-10%는 천식의 치료를 위해 사용되는 표준 약물을 대표하는 코르티코스테로이드 및 β2-효능제에 대해 불응성인 중증, 비제어된 질환을 갖는 것으로 추정된다 [Syabbalo N (2020) Clinical Features and Management of Neutrophilic Asthma. J Pulm Med Respir Res 6: 036]. 호중구성 천식은 성인에서 나타나는 급성 중증 천식의 가장 통상적인 형태이다. 호중구성 천식을 갖는 환자는 빈번한 응급실 방문, 입원, 및 삽관을 특징으로 하며, 환자의 대략 23%에서 돌발-발병 치명적 천식을 갖는다 [Fahy JV, Kim KW, Liu J, Boushey HA (1995) Prominent neutrophil inflammation in sputum from subjects with asthma exacerbations. J Allergy Clin Immunol 95: 843-852; Sur S, Crotty TB, Kephart GM, Hyama BA, Colby TV, et al. (1993) Sudden-onset fatal asthma: A distinct entity with few eosinophils and relatively more neutrophils in the airway mucosa? Am Rev Respir Dis 148:713-719]. 스테로이드-불응성, 호중구성 천식을 제어하지 못하는 것은 현재 충족되지 않은 임상적 필요를 나타낸다.
중증 천식에 있어서 호중구의 병리생리학적 역할은 인간 생체외 연구에서 입증되었다. 최근, NET, 세포외 DNA 및 다른 호중구-유래 생성물은 중증 천식에 대한 가능한 바이오마커 및 치료적 표적으로 간주되었다 [Lachowicz-Scroggins ME, Dunican EM, Charbit AR, Raymond W, Looney MR, Peters MC, et al. (2019) Extracellular DNA, Neutrophil Extracellular Traps, and Inflammasome Activation in Severe Asthma. Am J Respir Crit Care Med. 199(9):1076-1085; Varricchi G, Modestino L, Poto R, Cristinziano L, Gentile L, Postiglione L, et al. (2021) Neutrophil extracellular traps and neutrophil-derived mediators as possible biomarkers in bronchial asthma. Clin Exp Med. 2021 Aug 3. doi: 10.1007/s10238-021-00750-8].
본 발명자들은 PIC1 펩티드가 호중구 활성화를 조정할 수 있음을 발견하였으며, 따라서 오브알부민 (OVA) 및 리포폴리사카라이드 (LPS) 알레르겐을 사용하여 호중구성 천식의 래트 모델에서 RLS-0071의 효능을 평가하였다.
혈관신생
혈관신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정이며, 스프라우팅 및 스플리팅의 과정에 의해 혈관구조의 성장을 계속한다. 혈관신생은 성장 및 발달에 있어서 정상적인 생리학적 과정이며, 또한 상처 치유에 있어서 및 과립 조직의 형성에 있어서 중요한 역할을 한다. 그러나, 이는 또한 종양의 성장에 있어서 중요한 인자이며, 각각 암 및 안과 질환의 치료에서 혈관신생 억제제의 사용을 초래하는 많은 안구 병태, 예컨대 급성 황반 변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP) 및 당뇨병성 망막병증에 있어서 병원성 역할을 한다. VEGF는 혈관신생의 과정에서 주요한 역할을 하는 것이며, 많은 혈관신생 억제 약물은 VEGF를 표적화한다. 그러나, VEGF-독립적 혈관신생은 또한 다양한 염증성 질환 상태에서 발생한다. 따라서, 본 발명자들은 VEGF에 대한 PIC1 펩티드의 효과를 연구하기를 희망하였다.
보체계의 상이한 경로의 펩티드-기반 억제제에 대한 필요가 관련 기술분야에 있다. 또한, 안과 질환 및/또는 병태 뿐만 아니라 ALI 및/또는 ARDS, 천식을 치료하고, 혈관신생을 조정하는 치료적 펩티드에 대한 필요가 관련 기술분야에 있다.
배경기술 섹션에서 구체화된 바와 같이, 보체계의 상이한 경로의 펩티드-기반 억제제에 대한 기술을 확인하고, 이러한 이해를 사용하여 신규한 치료적 펩티드를 개발해야 할 큰 필요가 관련 기술분야에 있다. 본 발명은 상기 및 다른 필요를 충족시킨다. 본 발명의 실시양태는 일반적으로 합성 펩티드, 및 보다 구체적으로 PEG화된 합성 펩티드, 및 보체계를 조절하고 호중구와 상호작용하여 그들의 결합 및 다른 활성을 조절하는 방법에 있어서의 그들의 용도에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 보체계를 조절하는 합성 펩티드 및 이들 펩티드를 사용하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 일부 실시양태에서, 합성 펩티드는 C1 및 MBL에 결합하고, 이를 조절하고, 불활성화시킬 수 있으며, 따라서 대안적 경로를 무손상으로 남겨 두면서 보체 캐스케이드의 그의 가장 빠른 지점에서 고전적 및 렉틴 경로 활성화를 효율적으로 억제할 수 있다. 이들 펩티드는 대안적 경로에 영향을 미치지 않으면서 C1 및 MBL 활성화를 선택적으로 조절하고 억제하기 위한 치료적 가치가 있으며, 고전적 및 렉틴 경로의 이상조절된 활성화에 의해 매개되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 펩티드는 고전적 경로 활성화를 조절하지만, 렉틴 경로 활성화는 조절하지 않는다. 펩티드는 다양한 치료적 적응증에 유용하다.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 ALI 및/또는 ARDS의 모델에서의 시토카인 발현을 포함하나 이에 제한되지는 않는 시토카인 발현을 변경시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 호중구 결합 및/또는 부착을 억제하거나 변경시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 호중구 생존을 개선시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 세포 표면 수용체, 예컨대 예를 들어 인테그린 및 세포간 부착 분자 (ICAM) (그러나 이에 제한되지는 않음)에 생체내에서 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 극성 조합체 (PA: Polar Assortant) 펩티드 (서열식별번호: 1)로부터의 15개 아미노산의 펩티드의 확인 및 변형, 펩티드의 유도체, 및 그들의 사용 방법에 기반한다. PA 펩티드는 CP1로 지칭되는 인간 아스트로바이러스 단백질로부터 유래된 스크램블된 펩티드이다. PA 펩티드는 또한 PIC1 (보체 C1의 펩티드 억제제), 아스트로펜드(AstroFend), AF, 또는 서열식별번호: 1로 공지되어 있다. PIC1 펩티드는 원래 그것이 보체계에 의해 매개되는 질환과 연관된 것으로 밝혀졌기 때문에 그렇게 명명되었다. PA-dPEG24 (서열식별번호: 2; RLS-0071)로 지칭되는 PIC1 펩티드의 PEG화된 형태는 펩티드의 C 말단 상에 24개의 PEG 단위를 가지며, 수용액에서 개선된 가용성을 갖는 것으로 제시되었다. PA-I8Sar (서열식별번호: 3; RLS-0088)로 지칭되는 PIC1 펩티드의 사르코신 치환된 형태는 펩티드의 위치 8에 이소류신에 대해 치환된 사르코신을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 시토카인 발현의 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 시토카인 발현을 변경시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 결합 및/또는 부착의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 결합 및/또는 부착을 억제하거나 변경시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 생존의 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 생존을 개선시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 세포 표면 수용체에의 호중구 결합의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면 수용체에의 호중구 결합을 억제하거나 변경시키는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면 수용체의 변경된 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, ALI 및 ARDS를 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2를 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이상조절된 보체 활성화 및/또는 호중구 조정을 특징으로 하는 안구 질환 및/또는 병태를 치료하고/거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 보체 억제 및/또는 미엘로퍼옥시다제 활성 또는 네토시스의 억제를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 자가면역 및 감염성 포도막염, 급성 황반 변성 (AMD), 건성안 질환 (DED), 감염성 및 비-감염성 각막염, 각막 손상 및 복구, 미숙아 망막병증 (ROP), 안구 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 (RVO) 후 황반 부종, 및 당뇨병성 황반 부종 (DME)이다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2를 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 천식을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 천식은 중증 천식, 스테로이드-불응성 천식, 또는 호중구성 천식이다.
한 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 조정하는 방법을 제공한다.
임의의 상기 방법의 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 안정화제, 또는 부형제를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg이다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 약 20 mg/kg 내지 약 160 mg/kg이다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 약 40 mg/kg 내지 약 160 mg/kg이다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 적어도 1개의 용량으로 투여되며, 제1 용량은 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함한다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제2 용량이 투여되며, 제2 용량은 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함한다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 2개의 용량으로 투여되며, 제1 용량은 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하고, 제2 용량은 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 용량은 제1 용량이 투여된 후 30초 내지 3시간에 투여된다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 조성물은 안과 투여를 위해 제제화된다. 한 실시양태에서, 조성물은 안과용으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함한다. 임의의 상기 방법의 실시양태에서, 안과 투여는 국소 투여, 안구주위 주사, 결막하 주사, 방수내 주사, 안구내 주사, 유리체내 주사, 또는 각막내 또는 안구내 삽입물의 도입을 포함한다. 임의의 상기의 실시양태에서, 조성물은 비강 투여를 위해 제제화된다. 임의의 상기의 실시양태에서, 비강 투여는 흡입, 통기, 또는 분무화를 포함한다. 임의의 상기의 실시양태에서, 비강 조성물은 스프레이, 용액, 겔, 크림, 로션, 네뷸라이저를 위한 에어로졸 또는 용액의 형태로, 또는 통기를 위한 초미세 분말로서 존재한다.
임의의 상기의 실시양태에서, 세포 표면 수용체는 인테그린 또는 세포간 부착 분자 (ICAM)를 포함한다. 임의의 상기의 실시양태에서, ICAM은 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5를 포함한다. 임의의 상기의 실시양태에서, 질환 또는 병태는 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5 중 적어도 하나의 증가를 특징으로 한다.
본 발명의 이들 및 다른 목적, 특색 및 이점은 첨부된 설명, 청구범위 및 도면과 함께 하기 명세서를 읽을 때 보다 명백하게 될 것이다.
본 명세서에 포함되고 그의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 하기 기재된 몇몇 측면을 예시한다.
도 1은 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 PA-dPEG24 (또한 본원에서 RLS-0071로 지칭됨)의 정맥내 (IV) 투여가 IFN감마, IL-6, IL-2, IL-10, TNF알파, MCP-1, RANTES, MIP1알파, IL-1베타, MIP-2의 수준을 감소시킴을 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 수준을 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. LPS+30% 수혈에 비해 *는 P < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타낸다.
도 2는 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 RLS-0071의 정맥내 (IV) 투여가 IL-5, IL-18, IL-1알파, IL-13, IL-17, IL-12, 및 IP-10의 수준을 감소시킴을 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 수준을 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. LPS+30% 수혈에 비해 *는 P < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타낸다.
도 3은 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 RLS-0071의 정맥내 (IV) 투여가 항-염증성 시토카인 IL-4의 수준에 유의하게 영향을 미치지 않음을 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 IL-4를 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다.
도 4는 EGF, LIX, VEGF, 렙틴, GRO, 프랙탈카인, GM-CSF, 에오탁신 및 G-CSF의 수준에 대한 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 RLS-0071의 정맥내 (IV) 투여의 효과를 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 및 성장 인자 수준을 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. LPS+30% 수혈에 비해 *는 P < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타낸다.
도 5a-b는 비처리된 동물에 비해 400 mg/kg PA-dPEG24의 정맥내 (IV) 투여를 받은 래트로부터의 RLS-0071에 대한 간 (5a) 및 신장 (5b) 조직의 염색을 제시한다. 간 (5a) 및 신장 (5b) 조직 섹션을 RLS-0071에 대해 염색하고, 20X 및 40X 배율로 현미경검사에 의해 가시화하였다. 갈색 염색은 조직에서의 RLS-0071의 존재를 지시한다. 간 섹션에서 적색 화살표는 반점 RLS-0071 염색을 나타낸다.
도 6은 펩티드가 인간 호중구에 결합함을 입증하는 RLS-0071에 대한 면역형광 염색을 제시한다. 인간 호중구를 유리 슬라이드 상에 부착하고, 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 RLS-0071의 존재 또는 부재 하에서 인큐베이션하였다. 이어서 슬라이드를 RLS-0071에 대한 항체 (닭 항-PIC1), 이어서 표지된 2차 항체 (항-닭, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488)로 염색하고, DAPI로 대조염색하였다. 후속적으로 세포를 현미경검사에 의해 가시화하였다.
도 7은 RLS-0071이 유리 슬라이드에의 인간 호중구 부착을 억제함을 제시한다. 영상은 증가하는 농도의 RLS-0071의 존재 하에서 유리 슬라이드의 표면에 부착된 인간 호중구를 제시한다. 호중구를 DAPI로 염색하고, 형광 현미경검사로 영상화하였다. 대표적인 영상이 제시된다. 하부 우측 패널에서의 그래프는 증가하는 농도의 RLS-0071과의 인큐베이션, 이어서 PBS로의 세척, 그 후 유리 슬라이드 상에의 정치 및 2.5시간 동안의 인큐베이션 후에 유리 슬라이드에 부착된 호중구의 수를 제시한다. His는 히스티딘 완충제 단독 (pH 6.5)으로 처리된 세포를 나타낸다. 데이터는 n = 4의 평균 ± SEM이다.
도 8은 RLS-0071이 피브리노겐 처리와 함께 및 없이 유리 슬라이드에의 인간 호중구 부착을 억제함을 제시한다. 영상은 증가하는 농도의 PA-DPEG24의 존재 하에서 피브리노겐 코팅된 유리 슬라이드의 표면에 부착된 인간 호중구를 제시한다. 호중구를 DAPI로 염색하고, 형광 현미경검사로 영상화하였다. 대표적인 영상이 제시된다. 하부 우측 패널에서의 그래프는 증가하는 농도의 RLS-0071과의 인큐베이션, 이어서 PBS로의 세척, 그 후 피브리노겐-코팅된 유리 또는 비처리된 유리 슬라이드 상의 정치 및 2.5시간 동안의 인큐베이션 후의 호중구의 수를 제시한다.
도 9는 RLS-0071이 생존율 (살아있는 세포의 수)의 지시로서 세포 호흡을 측정하는 CCK8 검정에 의해 측정된 바와 같이 인간 호중구 생존율을 증가시킴을 제시한다. RLS-0071은 CCK8 검정에서 인간 호중구 생존율을 용량-의존적으로 증가시킨다. PBS 또는 RPMI 중의 세포를 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. "신선한"은 정제 과정이 완결된 직후 37℃에서 2시간 동안 CCK8로 플레이팅된 비조작된 세포를 나타낸다.
도 10은 RLS-0071이 호중구 수용체 LFA-1 및 상피 세포 수용체 ICAM-1 둘 다에 결합할 수 있음을 제시한다. RLS-0071은 정제된 내피 및 호중구 세포 수용체에 선택적으로 결합한다. 플레이트를 정제된 호중구 수용체 LFA-1 및 MAC-1 및 내피 세포 수용체 ICAM-1 및 ICAM-2로 코팅하고, 이어서 완충제 중 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 토끼 항-RLS0071 항혈청과 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 항-토끼 HRP와 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. PIC1 = RLS-0071. C1q를 RLS-0071 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 11은 RLS-0071이 상피 세포 수용체 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및 ICAM-5에 결합할 수 있음을 제시한다. 플레이트를 정제된 호중구 수용체 ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4, 및 ICAM-5로 코팅하고, 이어서 완충제 중 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 토끼 항-RLS0071 항혈청과 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 항-토끼 HRP와 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. C1q를 RLS-0071 결합에 대한 양성 대조군으로서 및 ICAM-2를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 12는 RLS-0071이 혈장에서 호중구 수용체 LFA-1 또는 내피 세포 ICAM-1에 결합할 수 있음을 제시한다. 플레이트를 정제된 수용체로 코팅하고, 이어서 인간 혈장 중 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 친화성 정제된 토끼 항-RLS0071 항혈청과 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 항-토끼 HRP와 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. PIC1 = RLS-0071. C1q 및 MPO (미엘로퍼옥시다제)를 RLS-0071 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 13은 20 mg/kg의 [14C]-PIC1- RLS-0071의 단일 IV 용량 후의 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트로부터의 시점 풀링된 혈장의 라디오크로마토그램을 제시한다.
도 14는 200 mg/kg의 [14C]-PIC1- RLS-0071의 단일 IV 용량 후의 수컷 스프라그-돌리 래트로부터의 시점 풀링된 혈장의 라디오크로마토그램을 제시한다.
도 15는 RLS-0071이 인간 단핵구 상의 수용체에 결합하는 C1q-면역 복합체의 결합을 방해하지 않음을 제시한다. 인간 단핵구를 정제하고, 미세역가 플레이트에 부착하게 하였다. 열-응집된 인간 면역 복합체를 증가하는 양의 RLS-0071의 존재 하에서 C1q에 결합하게 하였다. 이어서 이들 복합체를 단핵구에 결합하게 하고, 이어서 세척하고, 결합된 C1q/면역 복합체를 1차 항체, 이어서 2차 항체-HRP에 의해 검출하고, TMB로 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. N=3. 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 지시한다.
도 16a-16c는 RLS-0071이 혈액에서 염증성 시토카인의 수준을 감소시킴을 제시한다. 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 수준 IL-1a, IFN-g, IL-1b, IL-6 (16a); IL-17, IL-18, TNFa 및 RANTES (16b); IL-4, IL-10, 및 VEGF (16c)를 하기 실험 그룹에 대해 xMAP 비드 기반 면역검정에 의해 결정하였다: 샴, 제1-히트 단독, 2-히트, 2-히트 + 10mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, 2-히트 + 160mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 뿐만 아니라 2-히트 + 40mg/kg 구제 용량 RLS-0071 및 2-히트 + 160mg/kg 구제 용량 RLS-0071. 명확성을 위해, 단지 구제 투여 데이터가 제시된다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 2-히트 인설트를 받은 동물에 비해 P <0.05를 나타낸다.
도 17a-17c는 RLS-0071이 혈액에서 염증성 케모카인의 수준을 감소시킴을 제시한다. 말단 혈액 채혈로부터의 케모카인 수준 (17a) MCP-1, (17b) MIP-1a 및 (17c) MIP-2를 하기 실험 그룹에 대해 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다: 샴, 제1-히트 단독, 2-히트, 2-히트 + 10mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, 2-히트 + 160mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 뿐만 아니라 2-히트 + 40mg/kg 구제 용량 RLS-0071 및 2-히트 + 160mg/kg 구제 용량 RLS-0071. 명확성을 위해, 단지 구제 투여 데이터가 제시된다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 2-히트 인설트를 받은 동물에 비해 P <0.05를 나타낸다.
도 18a-18k는 RLS-0071의 예방적 또는 구제 투여가 급성 폐 손상을 감소시킴을 제시한다. 래트 폐의 대표적인 조직학 (H&E 염색). (18a) 샴 대조군, (18b) 제1 히트 단독, (18c) 2-히트, (18d) 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, (18e) 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, (18f) 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, (18g) 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071, (18h) 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071, (18i) 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071, (18j) 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 및 (18k) 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071. 막대는 100 μm를 나타낸다. 조직을 실온에서 20X의 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스(Olympus))으로 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다.
도 19는 RLS-0071의 예방적 또는 구제 투여가 호중구-매개 폐 손상을 감소시킴을 제시한다. H&E-염색된 폐 조직 영상을 흑백으로 전환시키고, 이미지제이(ImageJ) 분석에 의해 정량화하였다. 흑색 대 백색 화소의 비를 계산하고, 폐 손상의 척도로서 사용하였다 (Y 축). 샴 대조군 동물 (n=3), 제1 히트 단독 (n=2), 2-히트 (n=3), 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=6), 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=9), 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3), 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3) 및 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3). 각각의 동물에 대해 슬라이드당 10개 이상의 영상을 정량화하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. 통계적 분석을 일반화된 선형 모델을 사용하여 수행하였다. 2-히트 동물에 비해 *는 p=0.002를 나타내고, **는 p<0.001을 나타낸다.
도 20은 RLS-0071이 보체 활성화를 억제함을 제시한다. 혈장을 제1-히트 전에 (0분) 및 5분 및 1시간에서 샴 동물 (n=3) 및 하기 그룹으로부터 단리하였다: 제1 히트 단독 (n=3), 2-히트 (n=3), 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=8), 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3), 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3) 및 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3). 이어서 C5a를 각각의 샘플에서 ELISA에 의해 측정하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 각각의 동물에 대해 2개의 반복시험물을 모든 시점에 대해 측정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. 통계적 분석을 부트스트랩 접근법 또는 웰치(Welch) ANOVA를 사용하여 수행하였다. 2-히트 동물에 비해 *는 p=0.010을 나타내고, **는 p=0.004를 나타내고, ***는 p=0.002를 나타내고, ****는 p≤0.001을 나타낸다.
도 21은 RLS-0071이 혈액에서 유리 DNA 수준을 감소시킴을 제시한다. 혈장을 실험의 시작 후 4시간에 샴 동물 (n=3) 및 하기 그룹으로부터 단리하였다: 제1 히트 단독 (n=3), 2-히트 (n=3), 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=9), 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3), 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3) 및 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3). 혈장 샘플을 피코그린(PicoGreen)과 인큐베이션하였다. 형광을 마이크로플레이트 판독기에서 485 nm의 여기 파장 및 520nm의 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 동물에 대해 모든 유리 DNA 측정을 삼중으로 수행하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. 통계적 분석을 부트스트랩 접근법 또는 웰치 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 2-히트 동물에 비해 *는 p=0.026을 나타내고, **는 p=0.039를 나타내고, ***는 p=0.005를 나타낸다.
도 22a-22d는 유리체내 (IVT) 주사를 통해 전달된 RLS-0071이 정맥내 (IV) 투여된 RLS-0071보다 더 긴 반감기를 가졌음을 제시한다. (22a) 및 (22b): 160 mg/ml RLS-0071로 IVT 투여된 래트를 지시된 시점에서 안락사시키고, 유리체액을 단리하였다. (22c) 및 (22d): 200 mg/ml RLS-0071로 IV 투여된 래트를 지시된 시점에서 채혈하고, 혈장을 단리하였다. 이어서 유리체 및 혈장 샘플을 샌드위치 ELISA에서 분석하여 RLS-0071의 수준을 검출하였다. 패널 22b 및 22d는 각각 나중의 시점에서의 펩티드 수준을 강조하기 위해 Y축이 규모확대된 패널 22a 및 22c와 동일하다.
도 23은 IVT를 통해 전달된 RLS-0071이 투여 후 1시간에 망막 조직을 염색하였음을 제시한다. 래트를 염수 또는 160 mg/kg RLS-0071로 IVT 주사하였다. 동물을 염수 주입 후 5분 또는 RLS-0071 주입 후 1시간에 안락사시키고, 눈을 조직학을 위해 프로세싱하고, RLS-0071에 대한 항체로 염색하고, 이어서 DAB 염색에 의해 검출하였다. 영상을 IVT 후 5분 (좌측 패널) 및 IVT 후 1시간 (우측 패널)에 4X (상부 패널) 및 20X (하부 패널)의 배율로 현미경검사에 의해 관찰하였다.
도 24는 급성 폐 손상의 2-히트 래트 모델의 혈장에서 측정된 C5a 생성을 제시한다.
도 25는 2-히트 ALI 모델에서 제2 히트로서 수혈된 비혼화성 적혈구가 혈장에서 측정된 혈액 내로 유리 헤모글로빈을 방출시키는 용혈을 유발하는 고전적 보체 경로를 활성화시켰음을 제시한다. 염수 처리된 동물은 중간 칼럼에 나타내어지고, RLS-0071 동물은 우측 칼럼에 나타내어진다. 좌측 칼럼에 있는 샴 동물은 수혈되지 않았다.
도 26은 2-히트 ALI 동물로부터 얻어진 혈장 상의 CH50 검정의 결과를 제시한다. 염수 처리된 동물은 우측 칼럼에 제시되고, RLS-0071 동물은 좌측 칼럼에 제시된다.
도 27은 중증 천식에 대한 RLS-0071의 효과를 시험하기 위한 실험 디자인을 제시한다.
도 28은 RLS-0071이 천식 래트의 기관지폐포 세척액 (BALF)에서 호중구 수준을 감소시킴을 제시한다. 상부 패널: 대표적인 BALF 영상이 각각의 실험 그룹에 대해 제시된다: 샴 대조군, 복강내 오브알부민 (OVA)/리포폴리사카라이드 (LPS) 프로토콜을 받은 동물 (천식, 제24일), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 모든 동물을 제24일에 희생시키고, BALF를 수집하였다. BALF를 실온에서 40X의 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스)에 의해 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다. 하부 패널: 2개의 독립적인 판독기에 의한 백혈구의 정량화. 세포 카운트는 전체의 퍼센트로서 표현된다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 천식 동물에 비해 P < 0.03을 나타낸다.
도 29는 RLS-0071이 천식 래트의 BALF에서 단백질 수준을 감소시킴을 제시한다. 하기 실험 그룹을 평가하였다: 샴 동물 (비자극됨), OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물 (천식), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 천식 래트의 그룹을 제20-24일에 희생시키고, RLS-0071을 받은 천식 래트를 제24일에 희생시키고, BALF 액을 수집하고, 총 단백질 수준을 BCA 단백질 검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다.
도 30은 RLS-0071이 천식 래트의 BALF에서 유리 MPO 수준을 감소시킴을 제시한다. 하기 실험 그룹을 평가하였다: 샴 동물 (비자극됨), OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물 (천식), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 천식 래트의 그룹을 제20-24일에 희생시키고, RLS-0071을 받은 천식 래트를 제24일에 희생시키고, BALF 액을 수집하고, MPO 수준을 비색 검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 천식 동물 (제24일)에 비해 P = 0.05를 나타낸다.
도 31은 RLS-0071이 천식 래트의 BALF에서 유리 DNA 수준을 감소시킴을 제시한다. 하기 실험 그룹을 평가하였다: 샴 동물 (비자극됨), OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물 (천식), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 천식 래트의 그룹을 제20-24일에 희생시키고, RLS-0071을 받은 천식 동물을 제24일에 희생시키고, BALF 액을 수집하고, 유리 DNA 수준을 피코그린 검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다.
도 32는 RLS-0071이 인간 VEGF에 용량-의존적 방식으로 결합함을 제시한다. VEGF를 미세역가 플레이트 상으로 코팅하고, 증가하는 농도에서 RLS-0071과 인큐베이션하고, 이를 후속적으로 펩티드에 대한 항체, 이어서 2차 항체-HRP 접합체로 검출하였다. 이어서 HRP 접합체로부터 생성된 신호를 플레이트 판독기에서 450nm의 OD에서 판독하였다. C1q를 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 33은 RLS-0088이 인간 VEGF에의 낮은 수준의 결합을 가짐을 제시한다. VEGF를 미세역가 플레이트 상으로 코팅하고, 1 mg/ml RLS-0071 (양성 대조군) 또는 RLS-0088과 인큐베이션하였다. 후속적으로 펩티드를 펩티드에 대한 항체, 이어서 2차 항체-HRP 접합체로 검출하였다. 이어서 HRP 접합체로부터 생성된 신호를 플레이트 판독기에서 450nm의 OD에서 판독하였다.
도 34는 RLS-0071 및 RLS-0088이 VEGFR-2에의 VEGF 결합 및 세포 신호전달을 억제함을 제시한다. VEGF 신호전달을 억제하는 RLS-0071 및 RLS-0088의 능력을 평가하기 위해, 프로메가(Promega)의 VEGF 생물검정을 이용하였다. 이러한 생물발광 세포-기반 검정은 판독물로서 루시페라제를 사용하여 리포터 세포 상의 VEGFR-2에의 VEGF 결합을 측정한다. 생물발광 신호를 바이오-글로(Bio-Glo)™ 루시페라제 검정 시스템 및 표준 광도계를 사용하여 검출하고 정량화하였다. 증가하는 농도의 VEGF는 발광의 용량-의존적 증가를 초래하였다 (양성 대조군, 마름모). 세포를 증가하는 농도의 펩티드와 인큐베이션하고, 이어서 인간 VEGF로 세포를 자극하였다 (흑색 선은 참조물로서 VEGF 자극 단독의 수준을 제시함). RLS-0071 및 RLS-0088 둘 다는 VEGF-매개 신호전달을 용량-의존적 방식으로 억제하였다 (각각 정사각형 및 삼각형).
도 35. RLS-0071 및 RLS-0088은 인간 제대 혈관 내피 세포 (HUVEC) 3-차원 배양 시스템에서 혈관신생을 억제한다. 정제된 HUVEC를 셀트레이스(CellTrace) 염료로 염색하고, RLS-0071 및 RLS-0088과 사전인큐베이션하고, 이어서 LPS를 함유하는 세포외 매트릭스에 첨가하여 혈관신생을 자극하였다. 이어서 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 혈관신생 (발생기 관 형성 및 스프라우팅)을 도립 현미경 상의 가시화에 의해 관찰하였다.
도 36. RLS-0071은 HUVEC 기저막-매개 배양 시스템에서 혈관신생을 억제한다. 정제된 HUVEC를 30분 동안 증가하는 농도로 RLS-0071과 사전인큐베이션하였다. 세포를 LPS를 함유하는 기저막 매트릭스의 층에 적용하여 혈관신생을 자극하고, 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 혈관신생 (발생기 관 형성 및 스프라우팅)을 광 현미경검사에 의해 관찰하였다.
도 1은 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 PA-dPEG24 (또한 본원에서 RLS-0071로 지칭됨)의 정맥내 (IV) 투여가 IFN감마, IL-6, IL-2, IL-10, TNF알파, MCP-1, RANTES, MIP1알파, IL-1베타, MIP-2의 수준을 감소시킴을 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 수준을 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. LPS+30% 수혈에 비해 *는 P < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타낸다.
도 2는 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 RLS-0071의 정맥내 (IV) 투여가 IL-5, IL-18, IL-1알파, IL-13, IL-17, IL-12, 및 IP-10의 수준을 감소시킴을 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 수준을 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. LPS+30% 수혈에 비해 *는 P < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타낸다.
도 3은 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 RLS-0071의 정맥내 (IV) 투여가 항-염증성 시토카인 IL-4의 수준에 유의하게 영향을 미치지 않음을 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 IL-4를 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다.
도 4는 EGF, LIX, VEGF, 렙틴, GRO, 프랙탈카인, GM-CSF, 에오탁신 및 G-CSF의 수준에 대한 비혼화성 적혈구 수혈 전 또는 후에 전달된 RLS-0071의 정맥내 (IV) 투여의 효과를 제시한다. 샴 동물 및 LPS 단독, LPS+30% 수혈 및 LPS+30% 수혈 및 수혈 전에 투여된 (예방적) 10 또는 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량 또는 수혈 후에 투여된 (구제) 40 및 160 mg/kg RLS-0071의 단일 용량을 받은 동물로부터 얻어진 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 및 성장 인자 수준을 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. LPS+30% 수혈에 비해 *는 P < 0.05를 나타내고, **는 P < 0.01을 나타낸다.
도 5a-b는 비처리된 동물에 비해 400 mg/kg PA-dPEG24의 정맥내 (IV) 투여를 받은 래트로부터의 RLS-0071에 대한 간 (5a) 및 신장 (5b) 조직의 염색을 제시한다. 간 (5a) 및 신장 (5b) 조직 섹션을 RLS-0071에 대해 염색하고, 20X 및 40X 배율로 현미경검사에 의해 가시화하였다. 갈색 염색은 조직에서의 RLS-0071의 존재를 지시한다. 간 섹션에서 적색 화살표는 반점 RLS-0071 염색을 나타낸다.
도 6은 펩티드가 인간 호중구에 결합함을 입증하는 RLS-0071에 대한 면역형광 염색을 제시한다. 인간 호중구를 유리 슬라이드 상에 부착하고, 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 RLS-0071의 존재 또는 부재 하에서 인큐베이션하였다. 이어서 슬라이드를 RLS-0071에 대한 항체 (닭 항-PIC1), 이어서 표지된 2차 항체 (항-닭, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488)로 염색하고, DAPI로 대조염색하였다. 후속적으로 세포를 현미경검사에 의해 가시화하였다.
도 7은 RLS-0071이 유리 슬라이드에의 인간 호중구 부착을 억제함을 제시한다. 영상은 증가하는 농도의 RLS-0071의 존재 하에서 유리 슬라이드의 표면에 부착된 인간 호중구를 제시한다. 호중구를 DAPI로 염색하고, 형광 현미경검사로 영상화하였다. 대표적인 영상이 제시된다. 하부 우측 패널에서의 그래프는 증가하는 농도의 RLS-0071과의 인큐베이션, 이어서 PBS로의 세척, 그 후 유리 슬라이드 상에의 정치 및 2.5시간 동안의 인큐베이션 후에 유리 슬라이드에 부착된 호중구의 수를 제시한다. His는 히스티딘 완충제 단독 (pH 6.5)으로 처리된 세포를 나타낸다. 데이터는 n = 4의 평균 ± SEM이다.
도 8은 RLS-0071이 피브리노겐 처리와 함께 및 없이 유리 슬라이드에의 인간 호중구 부착을 억제함을 제시한다. 영상은 증가하는 농도의 PA-DPEG24의 존재 하에서 피브리노겐 코팅된 유리 슬라이드의 표면에 부착된 인간 호중구를 제시한다. 호중구를 DAPI로 염색하고, 형광 현미경검사로 영상화하였다. 대표적인 영상이 제시된다. 하부 우측 패널에서의 그래프는 증가하는 농도의 RLS-0071과의 인큐베이션, 이어서 PBS로의 세척, 그 후 피브리노겐-코팅된 유리 또는 비처리된 유리 슬라이드 상의 정치 및 2.5시간 동안의 인큐베이션 후의 호중구의 수를 제시한다.
도 9는 RLS-0071이 생존율 (살아있는 세포의 수)의 지시로서 세포 호흡을 측정하는 CCK8 검정에 의해 측정된 바와 같이 인간 호중구 생존율을 증가시킴을 제시한다. RLS-0071은 CCK8 검정에서 인간 호중구 생존율을 용량-의존적으로 증가시킨다. PBS 또는 RPMI 중의 세포를 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. "신선한"은 정제 과정이 완결된 직후 37℃에서 2시간 동안 CCK8로 플레이팅된 비조작된 세포를 나타낸다.
도 10은 RLS-0071이 호중구 수용체 LFA-1 및 상피 세포 수용체 ICAM-1 둘 다에 결합할 수 있음을 제시한다. RLS-0071은 정제된 내피 및 호중구 세포 수용체에 선택적으로 결합한다. 플레이트를 정제된 호중구 수용체 LFA-1 및 MAC-1 및 내피 세포 수용체 ICAM-1 및 ICAM-2로 코팅하고, 이어서 완충제 중 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 토끼 항-RLS0071 항혈청과 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 항-토끼 HRP와 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. PIC1 = RLS-0071. C1q를 RLS-0071 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 11은 RLS-0071이 상피 세포 수용체 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및 ICAM-5에 결합할 수 있음을 제시한다. 플레이트를 정제된 호중구 수용체 ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4, 및 ICAM-5로 코팅하고, 이어서 완충제 중 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 토끼 항-RLS0071 항혈청과 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 항-토끼 HRP와 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. C1q를 RLS-0071 결합에 대한 양성 대조군으로서 및 ICAM-2를 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 12는 RLS-0071이 혈장에서 호중구 수용체 LFA-1 또는 내피 세포 ICAM-1에 결합할 수 있음을 제시한다. 플레이트를 정제된 수용체로 코팅하고, 이어서 인간 혈장 중 증가하는 양의 RLS-0071과 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 친화성 정제된 토끼 항-RLS0071 항혈청과 인큐베이션하고, 세척하고, 이어서 항-토끼 HRP와 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. PIC1 = RLS-0071. C1q 및 MPO (미엘로퍼옥시다제)를 RLS-0071 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 13은 20 mg/kg의 [14C]-PIC1- RLS-0071의 단일 IV 용량 후의 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트로부터의 시점 풀링된 혈장의 라디오크로마토그램을 제시한다.
도 14는 200 mg/kg의 [14C]-PIC1- RLS-0071의 단일 IV 용량 후의 수컷 스프라그-돌리 래트로부터의 시점 풀링된 혈장의 라디오크로마토그램을 제시한다.
도 15는 RLS-0071이 인간 단핵구 상의 수용체에 결합하는 C1q-면역 복합체의 결합을 방해하지 않음을 제시한다. 인간 단핵구를 정제하고, 미세역가 플레이트에 부착하게 하였다. 열-응집된 인간 면역 복합체를 증가하는 양의 RLS-0071의 존재 하에서 C1q에 결합하게 하였다. 이어서 이들 복합체를 단핵구에 결합하게 하고, 이어서 세척하고, 결합된 C1q/면역 복합체를 1차 항체, 이어서 2차 항체-HRP에 의해 검출하고, TMB로 현상하였다. 흡광도를 450nm에서 판독하였다. N=3. 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 지시한다.
도 16a-16c는 RLS-0071이 혈액에서 염증성 시토카인의 수준을 감소시킴을 제시한다. 말단 혈액 채혈로부터의 시토카인 수준 IL-1a, IFN-g, IL-1b, IL-6 (16a); IL-17, IL-18, TNFa 및 RANTES (16b); IL-4, IL-10, 및 VEGF (16c)를 하기 실험 그룹에 대해 xMAP 비드 기반 면역검정에 의해 결정하였다: 샴, 제1-히트 단독, 2-히트, 2-히트 + 10mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, 2-히트 + 160mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 뿐만 아니라 2-히트 + 40mg/kg 구제 용량 RLS-0071 및 2-히트 + 160mg/kg 구제 용량 RLS-0071. 명확성을 위해, 단지 구제 투여 데이터가 제시된다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 2-히트 인설트를 받은 동물에 비해 P <0.05를 나타낸다.
도 17a-17c는 RLS-0071이 혈액에서 염증성 케모카인의 수준을 감소시킴을 제시한다. 말단 혈액 채혈로부터의 케모카인 수준 (17a) MCP-1, (17b) MIP-1a 및 (17c) MIP-2를 하기 실험 그룹에 대해 xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 결정하였다: 샴, 제1-히트 단독, 2-히트, 2-히트 + 10mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, 2-히트 + 160mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 뿐만 아니라 2-히트 + 40mg/kg 구제 용량 RLS-0071 및 2-히트 + 160mg/kg 구제 용량 RLS-0071. 명확성을 위해, 단지 구제 투여 데이터가 제시된다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 2-히트 인설트를 받은 동물에 비해 P <0.05를 나타낸다.
도 18a-18k는 RLS-0071의 예방적 또는 구제 투여가 급성 폐 손상을 감소시킴을 제시한다. 래트 폐의 대표적인 조직학 (H&E 염색). (18a) 샴 대조군, (18b) 제1 히트 단독, (18c) 2-히트, (18d) 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, (18e) 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, (18f) 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, (18g) 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071, (18h) 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071, (18i) 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071, (18j) 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 및 (18k) 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071. 막대는 100 μm를 나타낸다. 조직을 실온에서 20X의 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스(Olympus))으로 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다.
도 19는 RLS-0071의 예방적 또는 구제 투여가 호중구-매개 폐 손상을 감소시킴을 제시한다. H&E-염색된 폐 조직 영상을 흑백으로 전환시키고, 이미지제이(ImageJ) 분석에 의해 정량화하였다. 흑색 대 백색 화소의 비를 계산하고, 폐 손상의 척도로서 사용하였다 (Y 축). 샴 대조군 동물 (n=3), 제1 히트 단독 (n=2), 2-히트 (n=3), 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=6), 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=9), 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3), 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3) 및 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3). 각각의 동물에 대해 슬라이드당 10개 이상의 영상을 정량화하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. 통계적 분석을 일반화된 선형 모델을 사용하여 수행하였다. 2-히트 동물에 비해 *는 p=0.002를 나타내고, **는 p<0.001을 나타낸다.
도 20은 RLS-0071이 보체 활성화를 억제함을 제시한다. 혈장을 제1-히트 전에 (0분) 및 5분 및 1시간에서 샴 동물 (n=3) 및 하기 그룹으로부터 단리하였다: 제1 히트 단독 (n=3), 2-히트 (n=3), 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=8), 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3), 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3) 및 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3). 이어서 C5a를 각각의 샘플에서 ELISA에 의해 측정하고, 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 각각의 동물에 대해 2개의 반복시험물을 모든 시점에 대해 측정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. 통계적 분석을 부트스트랩 접근법 또는 웰치(Welch) ANOVA를 사용하여 수행하였다. 2-히트 동물에 비해 *는 p=0.010을 나타내고, **는 p=0.004를 나타내고, ***는 p=0.002를 나타내고, ****는 p≤0.001을 나타낸다.
도 21은 RLS-0071이 혈액에서 유리 DNA 수준을 감소시킴을 제시한다. 혈장을 실험의 시작 후 4시간에 샴 동물 (n=3) 및 하기 그룹으로부터 단리하였다: 제1 히트 단독 (n=3), 2-히트 (n=3), 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=9), 2-히트 + 40 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 0.5분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=4), 2-히트 + 60분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3), 2-히트 + 90분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=5), 2-히트 + 120분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3) 및 2-히트 + 180분에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (n=3). 혈장 샘플을 피코그린(PicoGreen)과 인큐베이션하였다. 형광을 마이크로플레이트 판독기에서 485 nm의 여기 파장 및 520nm의 방출 파장에서 판독하였다. 각각의 동물에 대해 모든 유리 DNA 측정을 삼중으로 수행하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. 통계적 분석을 부트스트랩 접근법 또는 웰치 ANOVA를 사용하여 수행하였다. 2-히트 동물에 비해 *는 p=0.026을 나타내고, **는 p=0.039를 나타내고, ***는 p=0.005를 나타낸다.
도 22a-22d는 유리체내 (IVT) 주사를 통해 전달된 RLS-0071이 정맥내 (IV) 투여된 RLS-0071보다 더 긴 반감기를 가졌음을 제시한다. (22a) 및 (22b): 160 mg/ml RLS-0071로 IVT 투여된 래트를 지시된 시점에서 안락사시키고, 유리체액을 단리하였다. (22c) 및 (22d): 200 mg/ml RLS-0071로 IV 투여된 래트를 지시된 시점에서 채혈하고, 혈장을 단리하였다. 이어서 유리체 및 혈장 샘플을 샌드위치 ELISA에서 분석하여 RLS-0071의 수준을 검출하였다. 패널 22b 및 22d는 각각 나중의 시점에서의 펩티드 수준을 강조하기 위해 Y축이 규모확대된 패널 22a 및 22c와 동일하다.
도 23은 IVT를 통해 전달된 RLS-0071이 투여 후 1시간에 망막 조직을 염색하였음을 제시한다. 래트를 염수 또는 160 mg/kg RLS-0071로 IVT 주사하였다. 동물을 염수 주입 후 5분 또는 RLS-0071 주입 후 1시간에 안락사시키고, 눈을 조직학을 위해 프로세싱하고, RLS-0071에 대한 항체로 염색하고, 이어서 DAB 염색에 의해 검출하였다. 영상을 IVT 후 5분 (좌측 패널) 및 IVT 후 1시간 (우측 패널)에 4X (상부 패널) 및 20X (하부 패널)의 배율로 현미경검사에 의해 관찰하였다.
도 24는 급성 폐 손상의 2-히트 래트 모델의 혈장에서 측정된 C5a 생성을 제시한다.
도 25는 2-히트 ALI 모델에서 제2 히트로서 수혈된 비혼화성 적혈구가 혈장에서 측정된 혈액 내로 유리 헤모글로빈을 방출시키는 용혈을 유발하는 고전적 보체 경로를 활성화시켰음을 제시한다. 염수 처리된 동물은 중간 칼럼에 나타내어지고, RLS-0071 동물은 우측 칼럼에 나타내어진다. 좌측 칼럼에 있는 샴 동물은 수혈되지 않았다.
도 26은 2-히트 ALI 동물로부터 얻어진 혈장 상의 CH50 검정의 결과를 제시한다. 염수 처리된 동물은 우측 칼럼에 제시되고, RLS-0071 동물은 좌측 칼럼에 제시된다.
도 27은 중증 천식에 대한 RLS-0071의 효과를 시험하기 위한 실험 디자인을 제시한다.
도 28은 RLS-0071이 천식 래트의 기관지폐포 세척액 (BALF)에서 호중구 수준을 감소시킴을 제시한다. 상부 패널: 대표적인 BALF 영상이 각각의 실험 그룹에 대해 제시된다: 샴 대조군, 복강내 오브알부민 (OVA)/리포폴리사카라이드 (LPS) 프로토콜을 받은 동물 (천식, 제24일), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 모든 동물을 제24일에 희생시키고, BALF를 수집하였다. BALF를 실온에서 40X의 배율로 현미경 (BX50, 올림푸스)에 의해 관찰하였다. 영상을 디지털 카메라 (DP70, 올림푸스)로 획득하였다. 하부 패널: 2개의 독립적인 판독기에 의한 백혈구의 정량화. 세포 카운트는 전체의 퍼센트로서 표현된다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 천식 동물에 비해 P < 0.03을 나타낸다.
도 29는 RLS-0071이 천식 래트의 BALF에서 단백질 수준을 감소시킴을 제시한다. 하기 실험 그룹을 평가하였다: 샴 동물 (비자극됨), OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물 (천식), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 천식 래트의 그룹을 제20-24일에 희생시키고, RLS-0071을 받은 천식 래트를 제24일에 희생시키고, BALF 액을 수집하고, 총 단백질 수준을 BCA 단백질 검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다.
도 30은 RLS-0071이 천식 래트의 BALF에서 유리 MPO 수준을 감소시킴을 제시한다. 하기 실험 그룹을 평가하였다: 샴 동물 (비자극됨), OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물 (천식), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 천식 래트의 그룹을 제20-24일에 희생시키고, RLS-0071을 받은 천식 래트를 제24일에 희생시키고, BALF 액을 수집하고, MPO 수준을 비색 검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다. *는 천식 동물 (제24일)에 비해 P = 0.05를 나타낸다.
도 31은 RLS-0071이 천식 래트의 BALF에서 유리 DNA 수준을 감소시킴을 제시한다. 하기 실험 그룹을 평가하였다: 샴 동물 (비자극됨), OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물 (천식), 제21일, 제22일, 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 예방적 용량을 받은 천식 동물 및 제22일 및 제23일에 160 mg/kg RLS-0071의 구제 용량을 받은 동물. 천식 래트의 그룹을 제20-24일에 희생시키고, RLS-0071을 받은 천식 동물을 제24일에 희생시키고, BALF 액을 수집하고, 유리 DNA 수준을 피코그린 검정에 의해 결정하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다.
도 32는 RLS-0071이 인간 VEGF에 용량-의존적 방식으로 결합함을 제시한다. VEGF를 미세역가 플레이트 상으로 코팅하고, 증가하는 농도에서 RLS-0071과 인큐베이션하고, 이를 후속적으로 펩티드에 대한 항체, 이어서 2차 항체-HRP 접합체로 검출하였다. 이어서 HRP 접합체로부터 생성된 신호를 플레이트 판독기에서 450nm의 OD에서 판독하였다. C1q를 결합에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 33은 RLS-0088이 인간 VEGF에의 낮은 수준의 결합을 가짐을 제시한다. VEGF를 미세역가 플레이트 상으로 코팅하고, 1 mg/ml RLS-0071 (양성 대조군) 또는 RLS-0088과 인큐베이션하였다. 후속적으로 펩티드를 펩티드에 대한 항체, 이어서 2차 항체-HRP 접합체로 검출하였다. 이어서 HRP 접합체로부터 생성된 신호를 플레이트 판독기에서 450nm의 OD에서 판독하였다.
도 34는 RLS-0071 및 RLS-0088이 VEGFR-2에의 VEGF 결합 및 세포 신호전달을 억제함을 제시한다. VEGF 신호전달을 억제하는 RLS-0071 및 RLS-0088의 능력을 평가하기 위해, 프로메가(Promega)의 VEGF 생물검정을 이용하였다. 이러한 생물발광 세포-기반 검정은 판독물로서 루시페라제를 사용하여 리포터 세포 상의 VEGFR-2에의 VEGF 결합을 측정한다. 생물발광 신호를 바이오-글로(Bio-Glo)™ 루시페라제 검정 시스템 및 표준 광도계를 사용하여 검출하고 정량화하였다. 증가하는 농도의 VEGF는 발광의 용량-의존적 증가를 초래하였다 (양성 대조군, 마름모). 세포를 증가하는 농도의 펩티드와 인큐베이션하고, 이어서 인간 VEGF로 세포를 자극하였다 (흑색 선은 참조물로서 VEGF 자극 단독의 수준을 제시함). RLS-0071 및 RLS-0088 둘 다는 VEGF-매개 신호전달을 용량-의존적 방식으로 억제하였다 (각각 정사각형 및 삼각형).
도 35. RLS-0071 및 RLS-0088은 인간 제대 혈관 내피 세포 (HUVEC) 3-차원 배양 시스템에서 혈관신생을 억제한다. 정제된 HUVEC를 셀트레이스(CellTrace) 염료로 염색하고, RLS-0071 및 RLS-0088과 사전인큐베이션하고, 이어서 LPS를 함유하는 세포외 매트릭스에 첨가하여 혈관신생을 자극하였다. 이어서 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 혈관신생 (발생기 관 형성 및 스프라우팅)을 도립 현미경 상의 가시화에 의해 관찰하였다.
도 36. RLS-0071은 HUVEC 기저막-매개 배양 시스템에서 혈관신생을 억제한다. 정제된 HUVEC를 30분 동안 증가하는 농도로 RLS-0071과 사전인큐베이션하였다. 세포를 LPS를 함유하는 기저막 매트릭스의 층에 적용하여 혈관신생을 자극하고, 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 혈관신생 (발생기 관 형성 및 스프라우팅)을 광 현미경검사에 의해 관찰하였다.
배경기술 섹션에서 구체화된 바와 같이, 보체계의 상이한 경로의 펩티드-기반 억제제에 대한 기술을 확인하고, 이러한 이해를 사용하여 신규한 치료적 펩티드를 개발할 큰 필요가 관련 기술분야에 있다. 본 발명은 상기 및 다른 필요를 충족시킨다. 본 발명의 실시양태는 일반적으로 합성 펩티드 및 보다 구체적으로 합성 펩티드의 PEG화된 형태에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 실시양태의 원리 및 특색의 이해를 용이하게 하기 위해, 다양한 예시적인 실시양태가 하기에 설명된다. 본 발명의 예시적인 실시양태가 상세하게 설명되지만, 다른 실시양태가 고려됨이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 그의 범주에 있어서 하기 설명 또는 실시예에 제시된 성분의 구조 및 배열의 상세사항에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하며, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 예시적인 실시양태를 설명하는데 있어서, 구체적인 용어는 명확성을 위해 재분류될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 언급대상을 포함함이 또한 주목되어야 한다. 예를 들어, 성분에 대한 언급은 또한 복수의 성분의 조성물을 포함하는 것으로 의도된다. 구성요소를 함유하는 조성물에 대한 언급은 명명된 것 외에도 다른 구성요소를 포함하는 것으로 의도된다. 다시 말해서, 단수 형태는 양의 제한을 나타내지 않지만, 오히려 언급된 항목 중 "적어도 하나"의 존재를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "및/또는"은 "및"을 의미할 수 있고/거나, 이는 "또는"을 의미할 수 있고/거나, 이는 "배타적-또는"을 의미할 수 있고/거나, 이는 "하나"를 의미할 수 있고/거나, 이는 "일부, 그러나 전부는 아님"을 의미할 수 있고/거나, 이는 "둘 다 아님"을 의미할 수 있고/거나, 이는 "둘 다"를 의미할 수 있다. 용어 "또는"은 포함적 "또는"을 의미하는 것으로 의도된다.
또한, 예시적인 실시양태를 설명하는데 있어서, 용어는 명확성을 위해 재분류될 것이다. 각각의 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 것과 같은 그의 가장 넓은 의미를 고려하고, 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 작동하는 모든 기술적 등가물을 포함하는 것으로 의도된다. 개시된 기술의 실시양태는 이들 구체적인 상세사항 없이 실시될 수 있음이 이해되어야 한다. 다른 경우에, 널리 공지된 방법, 구조, 및 기술은 본 설명의 이해를 모호하게 하지 않기 위해 상세하게 제시되지 않았다. "한 실시양태", "실시양태", "예시 실시양태", "일부 실시양태", "특정 실시양태", "다양한 실시양태" 등에 대한 언급은 그렇게 기재된 개시된 기술의 실시양태(들)가 특정한 특색, 구조, 또는 특징을 포함할 수 있지만, 모든 실시양태가 반드시 특정한 특색, 구조, 또는 특징을 포함하지는 않음을 지시한다. 또한, 어구 "한 실시양태에서"의 반복된 사용은 그럴 수는 있지만, 반드시 동일한 실시양태를 지칭하지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "약"은 임의의 범위의 종점(들)으로서 명시된 수 둘 다를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 범위에 대한 임의의 언급은 그 범위 내의 임의의 하위세트에 대한 지지를 제공하는 것으로서 간주되어야 한다. 범위는 본원에서 "약" 또는 "대략" 또는 "실질적으로" 한 특정한 값에서 및/또는 "약" 또는 "대략" 또는 "실질적으로" 또 다른 특정한 값까지로서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 다른 예시적인 실시양태는 한 특정한 값에서 및/또는 다른 특정한 값까지를 포함한다. 또한, 용어 "약"은 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법에 의존할 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같은 특정한 값에 대한 허용되는 오차 범위, 즉, 측정 시스템의 한계 내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 관행에 따라, 허용되는 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 보다 바람직하게는 최대 ±5%, 및 보다 바람직하게는 또한 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 관하여, 상기 용어는 값의 한 자릿수 내, 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"이 내포되며, 이러한 맥락에서 특정한 값에 대한 허용되는 오차 범위 내를 의미한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 측면은 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의성 및 간결성을 위한 것임이 이해되어야 하며, 본 발명의 범주에 대한 비유연한 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기재는 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수치 값을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 구체적으로 개시된 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭과 무관하게 적용된다.
유사하게, 본원에 사용된 무엇이 "실질적으로 없는", 또는 "실질적으로 순수한" 등의 특징규명은 무엇이 "적어도 실질적으로 없는", 또는 "적어도 실질적으로 순수한", 및 무엇이 "완전히 없는", 또는 "완전히 순수한" 둘 다를 포함할 수 있다.
"포함하는" 또는 "함유하는" 또는 "포괄하는"이란 적어도 명명된 화합물, 요소, 입자, 또는 방법 단계가 조성물 또는 물품 또는 방법에 존재하지만, 다른 화합물, 물질, 입자, 방법 단계가 명명된 것과 동일한 기능을 갖는다고 하더라도, 다른 이러한 화합물, 물질, 입자, 방법 단계의 존재를 배제하지 않는 것을 의미한다.
본 설명 전반에 걸쳐, 구체적인 값 또는 파라미터를 갖는 다양한 성분이 확인될 수 있지만, 이들 항목은 예시적인 실시양태로서 제공된다. 사실, 예시적인 실시양태는 많은 필적하는 파라미터, 크기, 범위, 및/또는 값이 실행될 수 있기 때문에, 본 발명의 다양한 측면 및 개념을 제한하지 않는다. 용어 "제1", "제2" 등, "1차", "2차" 등은 임의의 순서, 양, 또는 중요성을 나타내지 않지만, 오히려 한 요소를 또 다른 것으로부터 구별하는데 사용된다.
"구체적으로", "바람직하게는", "전형적으로", "일반적으로", 및 "대개"와 같은 용어는 청구된 발명의 범주를 제한하기 위해 또는 특정 특색이 청구된 발명의 구조 또는 기능에 중요하거나, 본질적이거나, 심지어 중요함을 암시하기 위해 본원에서 이용되지 않음이 주목된다. 오히려, 이들 용어는 단지 본 발명의 특정한 실시양태에 이용될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 대안적인 또는 추가의 특색을 강조하는 것으로 의도된다. 또한, "실질적으로" 및 "약"과 같은 용어는 임의의 정량적인 비교, 값, 측정, 또는 다른 묘사에 기인할 수 있는 불확실성의 고유한 정도를 나타내기 위해 본원에서 이용됨이 주목된다.
본원에 개시된 치수 및 값은 나열된 정확한 수치 값에 엄격하게 제한되는 것으로 이해되지 않아야 한다. 대신, 달리 명시되지 않는 한, 각각의 이러한 치수는 나열된 값 및 그 값 주위의 기능적으로 등가의 범위 둘 다를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "50 mm"로서 개시된 치수는 "약 50 mm"를 의미하는 것으로 의도된다.
또한, 하나 이상의 방법 단계의 언급은 명확하게 확인된 추가의 방법 단계 또는 그들 단계 사이의 개재하는 방법 단계의 존재를 불가능하게 하지 않음이 이해되어야 한다. 유사하게, 또한, 조성물에서 하나 이상의 성분의 언급은 명확하게 확인된 것들보다 추가의 성분의 존재를 불가능하게 하지 않음이 이해되어야 한다.
본 발명의 다양한 요소를 구성하는 이하에 기재된 물질은 예시적이고 제한적이 아닌 것으로 의도된다. 본원에 기재된 물질과 동일하거나 유사한 기능을 수행할 많은 적합한 물질은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 기재되지 않은 이러한 다른 물질은 예를 들어 본 발명의 개발의 시간 후에 개발된 물질을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다양한 도면에 열거된 임의의 치수는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 다른 치수 및 비율이 고려되며, 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 포유동물을 지칭하며, 제한 없이, 인간 및 수의과 동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 청구된 발명에 따른 합성 펩티드 및 적어도 제2 제약 활성 성분의 "조합"이라는 용어는 화합물의 적어도 2종, 그러나 임의의 목적하는 조합이 동시에 또는 순차적으로 (예를 들어, 24-시간 기간 내에) 전달될 수 있음을 의미한다. 다양한 질환을 치료하는데 사용되는 경우, 본 발명의 조성물 및 방법은 동일하거나 유사한 질환에 적합한 다른 치료적 방법/작용제와 함께 이용될 수 있음이 고려된다. 이러한 다른 치료적 방법/작용제는 공동-투여되어 (동시에 또는 순차적으로) 상가적 또는 상승적 효과를 생성할 수 있다. 각각의 작용제에 대한 적합한 치료 유효 투여량은 상가 작용 또는 상승작용으로 인해 저하될 수 있다.
"질환"은 대상체가 항상성을 유지할 수 없고, 질환이 개선되지 않는 경우, 대상체의 건강이 계속 악화되는 대상체의 건강의 상태이다. 대조적으로, 대상체에서의 "장애"는 대상체가 항상성을 유지할 수 있지만, 대상체의 건강의 상태가 장애의 부재 하에서보다 덜 바람직한 건강의 상태이다. 비치료되어 방치되면, 장애는 반드시 대상체의 건강의 상태의 추가의 감소를 유발하지는 않는다.
용어 "치료하다" 또는 상태, 장애 또는 병태의 "치료"는 (1) 상태, 장애 또는 병태에 걸리거나 그에 대한 성향이 있을 수 있지만 아직 상태, 장애 또는 병태의 임상적 또는 준임상적 증상을 경험하거나 나타내지 않은 대상체에서 발달하는 상태, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상의 출현을 예방하거나 지연시키는 것; 또는 (2) 상태, 장애 또는 병태를 억제하는 것, 즉, 질환의 발달 또는 그의 재발 (유지 치료의 경우) 또는 그의 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상을 정지시키거나, 감소시키거나, 지연시키는 것; 또는 (3) 질환을 완화시키는 것, 즉, 상태, 장애 또는 병태 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 치료되는 대상체에 대한 이익은 통계적으로 유의하거나, 환자에게 또는 의사에게 적어도 인지가능하다.
본원에 사용된 용어 "치료적"은 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료적 효과는 질환 상태의 억제, 감소, 완화, 또는 근절에 의해 얻어진다.
용량 또는 양에 적용되는 본원에 사용된 용어 "치료 유효"는 상태, 장애 또는 병태를 치료하기 (예를 들어, 예방하거나 개선시키기) 위해 대상체에게 투여되는 경우, 이러한 치료를 실행하는데 충분한 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 투여되는 화합물 또는 박테리아 또는 유사체, 뿐만 아니라 질환 및 그의 중증도 및 치료되는 포유동물의 연령, 중량, 신체 상태, 및 반응성에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 조성물에 관하여 사용된 어구 "제약상 허용되는"은 생리학적으로 허용가능하며, 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여되는 경우 전형적으로 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 이러한 조성물의 다른 성분을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 포유동물에서, 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에 열거된을 의미한다.
용어 "제약 담체" 또는 "제약상 허용되는 담체"는 화합물이 투여되는 희석제, 아주반트, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 제약 담체는 멸균 액체, 예컨대 물, 및 석유, 동물, 식물성, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함하는 오일일 수 있다. 물 또는 수용액 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 특히 주사가능한 용액에 대한 담체로서 채용된다. 대안적으로, 제약 담체는 결합제 (압축 환제에 대해), 활주제, 캡슐화제, 향미제, 및 착색제 중 1종 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고체 투여 형태 담체일 수 있다. 적합한 제약 담체는 이.더블유. 마틴(E.W. Martin)에 의한 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 기재되어 있다.
용어 "유사체" 또는 "기능적 유사체"는 상기 유사체가 생체내에서 및/또는 시험관내에서 비변형된 형태와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 보유하도록 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실, 또는 부가가 이루어진 폴리펩티드의 관련된 변형된 형태를 지칭한다.
용어 "서열 동일성" 및 "퍼센트 동일성"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 발명의 목적상, 이는 여기에서 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적을 위해 정렬하는 것 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 갭이 제1 아미노산 또는 핵산의 서열에 도입될 수 있음)으로 정의된다. 이어서 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성=동일한 위치의 수/위치의 총 수 (즉, 중첩하는 위치) x100). 바람직하게는, 2개의 서열은 동일한 길이이다.
몇몇 상이한 컴퓨터 프로그램은 2개의 서열 사이의 동일성의 정도를 결정하는데 이용가능하다. 예를 들어, 2개의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로섬(Blosum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여, 악셀리스(Accelrys) GCG 소프트웨어 패키지 (www.accelrys.com/products/gcg에서 입수가능함)에서의 GAP 프로그램에 포함된 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch) (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이들 상이한 파라미터는 약간 상이한 결과를 생성할 것이지만, 2개의 서열의 전체 퍼센트 동일성은 상이한 알고리즘을 사용하는 경우 유의하게 변경되지 않는다.
서열 비교는 비교되는 2개의 서열의 전체 길이에 걸쳐 또는 2개의 서열의 단편에 걸쳐 수행될 수 있다. 전형적으로, 비교는 비교되는 2개의 서열의 전장에 걸쳐 수행될 것이다. 그러나, 서열 동일성은, 예를 들어, 20개, 50개, 100개 또는 그 초과의 인접한 아미노산 잔기의 영역에 걸쳐 수행될 수 있다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 즉, 참조 서열 및 참조 서열과 비교되는 주어진 서열 사이의 관계를 지칭한다. 서열 동일성은 서열을 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정된 바와 같이 최적으로 정렬하여 가장 높은 정도의 서열 유사성을 생성한 후, 주어진 서열을 참조 서열과 비교함으로써 결정된다. 이러한 정렬시, 서열 동일성은 위치별 기초로 확인되며, 예를 들어, 서열은 특정한 위치에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우, 그 위치에서 "동일하다". 이어서 이러한 위치 동일성의 총 수를 참조 서열에서의 뉴클레오티드 또는 잔기의 총 수로 나누어 % 서열 동일성을 얻는다. 서열 동일성은 그들의 교시내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)], [Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993)]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)]; [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)]; 및 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 서열 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이에 가장 큰 매치를 제공하도록 디자인된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 주어진 서열 사이의 서열 동일성을 결정하는 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램에서 성문화된다. 이러한 프로그램의 예는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원 (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), 이의 교시내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 공개적으로 입수가능하다. 이들 프로그램은 주어진 서열 및 참조 서열 사이의 가장 높은 수준의 서열 동일성을 생성하기 위해 디폴트 갭 가중치를 사용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 예시로서, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어, 95%, 예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% "서열 동일성"을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란, 주어진 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각의 100개의 뉴클레오티드당 최대 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 점 돌연변이를 포함할 수 있음을 제외하고는 주어진 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말해서, 참조 뉴클레오티드 서열에 비해 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에서, 참조 서열에서의 뉴클레오티드의 최대 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%는 결실되거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열에서의 총 뉴클레오티드의 최대 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%의 다수의 뉴클레오티드는 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 참조 서열에서의 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 기에서 산재된 그들 말단 위치 사이의 어디에서나 일어날 수 있다. 유사하게, 참조 아미노산 서열과 적어도, 예를 들어, 95%, 예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 주어진 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란, 주어진 폴리펩티드 서열이 참조 아미노산 서열의 각각의 100개의 아미노산당 최대 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 아미노산 변경을 포함할 수 있음을 제외하고는 폴리펩티드의 주어진 아미노산 서열이 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 다시 말해서, 참조 아미노산 서열과 적어도 95%, 예를 들어, 적어도 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 주어진 폴리펩티드 서열을 얻기 위해, 참조 서열에서의 아미노산 잔기의 최대 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%는 결실되거나 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열에서의 아미노산 잔기의 총 수의 최대 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%의 다수의 아미노산은 참조 서열 내로 삽입될 수 있다. 참조 서열의 이들 변경은 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서, 또는 참조 서열에서의 잔기 중에서 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 기에서 산재된 그들 말단 위치 사이의 어디에서나 일어날 수 있다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 그러나, 보존적 치환은 서열 동일성을 결정하는 경우 매치로서 포함되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "면역 반응"은 선천 면역 반응, T-세포 매개 면역 반응, 및/또는 B-세포 매개 면역 반응을 포함한다. 예시적인 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들어, 시토카인 생산 및 세포성 세포독성, 및 B 세포 반응, 예를 들어, 항체 생산을 포함한다. 또한, 용어 "면역 반응"은 T 세포 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응, 예를 들어, 항체 생산 (체액성 반응) 및 시토카인 반응성 세포, 예를 들어, 대식세포의 활성화를 포함한다. 면역 반응에 관여하는 면역 세포는 림프구, 예컨대 B 세포 및 T 세포 (CD4+, CD8+, Th1 및 Th2 세포); 항원 제시 세포 (예를 들어, 전문 항원 제시 세포, 예컨대 수지상 세포, 대식세포, B 림프구, 랑게르한스 세포, 및 비-전문 항원 제시 세포, 예컨대 각질세포, 내피 세포, 성상세포, 섬유모세포, 희소돌기아교세포); 자연 킬러 세포; 골수 세포, 예컨대 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구, 및 과립구 (예를 들어 호중구)를 포함한다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어, 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 피내 (i.d.) 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
의학 분야의 맥락에서, 용어 "예방하다"는 질환으로부터의 사망률 또는 이환율의 부담을 감소시키는 임의의 활동을 포괄한다. 예방은 1차, 2차 및 3차 예방 수준에서 일어날 수 있다. 1차 예방은 질환의 발달을 회피하는 반면, 예방의 2차 및 3차 수준은 질환의 진행 및 증상의 발생을 예방하는 것, 뿐만 아니라 기능을 복원시키고 질환-관련 합병증을 감소시킴으로써 이미 확립된 질환의 부정적 영향을 감소시키는 것을 목표로 하는 활동을 포괄한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 "변이체"는 (i) 아미노산 잔기 중 하나 이상이 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 코딩된 것일 수 있거나 그렇지 않은 것일 수 있는 것, (ii) 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기, 예를 들어, 치환기의 부착에 의해 변형된 잔기가 있는 것, (iii) 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 선택적 스플라이스 변이체인 것, (iv) 폴리펩티드의 단편 및/또는 (v) 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드, 예컨대 리더 또는 분비 서열 또는 정제를 위해 (예를 들어, His-태그) 또는 검출을 위해 (예를 들어, Sv5 에피토프 태그) 채용되는 서열과 융합된 것일 수 있다. 단편은 원래 서열의 단백질분해적 절단 (다중-부위 단백질분해를 포함함)을 통해 생성된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 번역후로, 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변이체는 본원의 교시내용으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범주 내인 것으로 간주된다.
본 발명의 의미 내에서, 용어 "공동 투여"는 본 발명에 따른 조성물 및 하나의 조성물에서 동시에, 또는 상이한 조성물에서 동시에, 또는 순차적으로 (바람직하게는, 24-시간 기간 내에) 또 다른 치료적 작용제의 투여를 지칭하기 위해 사용된다.
본 발명에 따르면, 관련 기술분야의 기술 내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술이 채용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 다른 것들 중에서도, 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] (본원에서 "Sambrook et al., 1989"); [DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; [Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)]; [Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)]; [Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; [Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)]; [Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)]; [B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; [F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)]을 참조한다.
본 발명의 펩티드 조성물
CP1의 아미노산 구조의 변형은 보체 활성화, 예컨대 C1q 활성을 조절할 수 있는 추가의 펩티드의 발견을 초래하였다. PEG화와 같은 변형은 고전적 보체 경로 활성화/억제, 미엘로퍼옥시다제 (MPO) 억제, 항산화 활성 및 NET 활성의 억제의 시험관내 검정에서 모 분자 (IALILEPICCQERAA; 서열식별번호: 1)에 비해 펩티드의 가용성 뿐만 아니라 생물학적 활성의 강력한 억제를 증진시켰음이 이전에 입증되었다. C-말단 단분산 24-mer PEG화된 모이어티를 갖는 펩티드는 매우 가용성인 것으로 밝혀졌으며, 보체계의 강한 억제를 가졌다 (IALILEPICCQERAA-dPEG24; 서열식별번호: 2; PA-DPEG24; PA-dPEG24). 또 다른 적합한 펩티드는 서열식별번호: 2의 위치 8에 사르코신 치환을 포함한다 (IALILEP(Sar)CCQERAA; 서열식별번호: 3; PA-I8Sar; RLS-0088).
본원에 사용된 용어 "펩티드(들)"는 서열식별번호: 2에 기반한 약 15개의 아미노산의 천연 발생, 또는 펩티드 모방체, 펩티드 유사체 및/또는 합성 유도체 (예를 들어 PEG화된 펩티드를 포함하나 이에 제한되지는 않음)일 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 또한, 펩티드는 약 15개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 약 10 내지 약 15개의 아미노산 잔기 및 예컨대 약 5 내지 약 10개의 아미노산 잔기의 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 및 15개의 아미노산의 펩티드 잔기는 본 발명의 맥락 내에서 동등하게 펩티드일 가능성이 있다. 펩티드는 또한 15개 초과의 아미노산, 예컨대, 예를 들어, 16, 17, 18, 19, 및 20개, 또는 그 초과의 아미노산일 수 있다.
개시된 펩티드는 일반적으로 약 15개 초과의 아미노산 잔기, 약 15개의 아미노산 잔기, 또는 약 15개 미만의 아미노산 잔기의 구속된 (즉, 예를 들어, β 턴 또는 β 플리티드 쉬트를 개시하는 아미노산의 존재로서 구조의 일부 요소를 갖거나, 또는, 예를 들어, 디술피드 결합된 Cys 잔기의 존재에 의해 환화됨) 또는 비구속된 (즉, 선형) 아미노산 서열이다.
펩티드 서열 내의 아미노산에 대한 치환기는 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함한다. 방향족 고리 구조를 함유하는 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌 및 리신을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 예를 들어, 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적 등가물로서 작용하여, 침묵 변경을 발생시키는 유사한 극성의 또 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
보존적 변화는 일반적으로 생성된 단백질의 구조 및 기능의 더 적은 변화를 초래한다. 비-보존적 변화는 생성된 단백질의 구조, 활성, 또는 기능을 변경시킬 가능성이 더 많다. 예를 들어, 본 개시내용의 펩티드는 하기 보존적 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다: 지방족 아미노산, 예컨대 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신의 또 다른 지방족 아미노산으로의 대체; 세린의 트레오닌으로의 대체; 트레오닌의 세린으로의 대체; 산성 잔기, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산의 또 다른 산성 잔기로의 대체; 아미드 기를 보유하는 잔기, 예컨대 아스파라긴 및 글루타민의 아미드 기를 보유하는 또 다른 잔기로의 대체; 염기성 잔기, 예컨대 리신 및 아르기닌의 또 다른 염기성 잔기로의 교환; 및 방향족 잔기, 예컨대 페닐알라닌 및 티로신의 또 다른 방향족 잔기로의 대체.
특히 바람직한 아미노산 치환은 하기를 포함한다:
a) Glu를 Ala로 또는 그 역도 마찬가지임, 그에 따라 음전하가 감소될 수 있음;
b) Arg를 Lys로 또는 그 역도 마찬가지임, 그에 따라 양전하가 유지될 수 있음;
c) Arg를 Ala로 또는 그 역도 마찬가지임, 그에 따라 양전하가 감소될 수 있음;
d) Asp를 Glu로 또는 그 역도 마찬가지임, 그에 따라 음전하가 유지될 수 있음;
e) Thr을 Ser로 또는 그 역도 마찬가지임, 그에 따라 유리 -OH가 유지될 수 있음;
f) Asn을 Gln로 또는 그 역도 마찬가지임, 그에 따라 유리 NH2가 유지될 수 있음;
g) Leu를 또는 Val을 Ile로 또는 그 역도 마찬가지임, 대략 등가의 소수성 아미노산으로서;
h) Tyr을 Phe로 또는 그 역도 마찬가지임, 대략 등가의 방향족 아미노산으로서; 및
i) Cys를 Ala로 또는 그 역도 마찬가지임, 그에 따라 디술피드 결합이 영향을 받음.
펩티드 서열 내의 아미노산에 대한 치환기는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 피로리신, 셀레노시스테인, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, N-포르밀-L-메티오닌, 사르코신, 또는 다른 N-메틸화된 아미노산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 사르코신은 펩티드 서열 내의 아미노산을 치환한다. 일부 실시양태에서, 사르코신 잔기는 서열식별번호: 2의 위치 8에서 이소류신 잔기를 대체한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3의 아미노산 서열 및 변형을 포함하는 인간 아스트로바이러스 외피 단백질로부터 유래된 합성 펩티드를 개시한다.
표 1. 본 발명의 펩티드의 목록.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 급성 폐 손상 (ALI)의 모델을 포함하나 이에 제한되지는 않는 시토카인 발현을 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 시토카인 발현의 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 시토카인 발현을 변경시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 합성 펩티드는 ALI 및/또는 ARDS를 치료하고/거나 예방할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 펩티드는 안구 질환 또는 병태, 뿐만 아니라 천식을 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 펩티드는 혈관신생을 조정할 수 있다.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 호중구 결합 및/또는 부착을 억제하거나 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 결합 및/또는 부착의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 결합 및/또는 부착을 억제하거나 변경시키는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 호중구 생존을 개선시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 생존의 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 생존을 개선시키는 방법을 제공한다.
다른 실시양태에서, 합성 펩티드는 세포 표면 수용체, 예컨대 예를 들어, 인테그린 및/또는 ICAM (그러나 이에 제한되지는 않음)에 생체내에서 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 세포 표면 수용체에의 호중구 결합의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면 수용체에의 호중구 결합을 억제하거나 변경시키는 방법을 제공한다.
개시된 펩티드는 대안적 경로 활성에 영향을 미치지 않으면서 C1q 및 MBL 활성화를 선택적으로 조절할 수 있으며, 따라서, 고전적 및 렉틴 경로의 이상조절된 활성화에 의해 매개되는 질환을 예방하고 치료하는데 이상적이다. 고전적 및 렉틴 경로의 특이적 차단은 특히 필요한데, 이는 이들 경로 둘 다가 많은 동물 모델에서 허혈-재관류 유도된 손상에 관련되었기 때문이다. [Castellano et al., "Therapeutic targeting of classical and lectin pathways of complement protects from ischemia-reperfusion-induced renal damage." Am J Pathol. 2010; 176(4):1648-59; Lee et al., "Early complement factors in the local tissue immunocomplex generated during intestinal ischemia/reperfusion injury." Mol. Immunol. 2010 February; 47(5):972-81; Tjernberg, et al., "Acute antibody-mediated complement activation mediates lysis of pancreatic islets cells and may cause tissue loss in clinical islet transplantation." Transplantation. 2008 Apr. 27; 85(8):1193-9; Zhang et al. "The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury." J Mol Cell Cardiol. 2006 July; 41(1):62-7). 대안적 경로는 침입 병원체에 대한 면역 감시에 필수적이며, 대안적 경로 결함을 갖는 인간은 중증 박테리아 감염을 앓는다. C1q 및 MBL에 결합하고 이를 불활성화시킴으로써, 펩티드는 대안적 경로를 무손상으로 남겨 두면서 고전적 및 렉틴 경로 활성화를 효율적으로 조절할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "조절하다"는 i) 개별적으로 또는 복합체로, 효소, 단백질, 펩티드, 인자, 부산물, 또는 그의 유도체의 생물학적 기능을 제어하거나, 감소시키거나, 억제하거나, 조절하는 것; ii) 생체내에서 또는 시험관내에서, 생물학적 단백질, 펩티드, 또는 그의 유도체의 양을 감소시키는 것; 또는 iii) 관련된 일련의 생물학적 또는 화학적 반응을 포함하는 것으로 공지된 사건, 캐스케이드, 또는 경로의 생물학적 연쇄를 중단시키는 것을 지칭한다. 따라서, 용어 "조절하다"는, 예를 들어, 대조군 샘플에 비해 보체 캐스케이드의 단일 성분의 양을 감소시키거나, 성분 또는 성분의 복합체의 형성의 속도 또는 총량을 감소시키거나, 복잡한 과정 또는 일련의 생물학적 반응의 전체 활성을 감소시켜, 세포 용해, 컨버타제 효소의 형성, 보체-유래 막 공격 복합체의 형성, 염증, 또는 염증성 질환과 같은 결과를 초래하는 것을 기재하기 위해 사용될 수 있다. 시험관내 검정에서, 용어 "조절하다"는 일부 생물학적 또는 화학적 사건의 측정가능한 변화 또는 감소를 지칭할 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 측정가능한 변화 또는 감소가 "조절성"이 되기 위해 전체적일 필요는 없음을 인식할 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 보체계를 조절하는 효과를 갖는 치료 활성 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 제약 조성물
본 개시내용은 상기 논의된 바와 같은 적어도 1종의 펩티드, 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 안정화제, 또는 부형제를 포함하는, 보체계를 조절할 수 있는 제약 조성물을 제공한다. 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 채용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 이들은 고체, 반-고체, 또는 액체일 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 정제, 환제, 분말, 로젠지, 사세, 카세, 엘릭시르, 현탁액, 에멀젼, 용액, 또는 시럽의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 적절한 정도의 순도를 갖는 펩티드를 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 혼합함으로써 제조된다. 제제 및 이러한 제제를 제조하는 방법의 예는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 제약 조성물은 상기 제시된 바와 같은 다양한 장애 및 질환에 대한 예방적 및 치료적 작용제로서 유용하다. 한 실시양태에서, 조성물은 치료 유효량의 펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 보체계를 조절하는데 유효한 적어도 1종의 다른 활성 성분을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 보체계와 연관된 적어도 1종의 질환을 치료하는데 유효한 적어도 1종의 다른 활성 성분을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 보체계와 연관되지 않는 적어도 1종의 질환을 치료하는데 유효한 적어도 1종의 다른 활성 성분을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치료 유효량"은 대상체에게 이익을 나타내는데 충분한 각각의 활성 성분의 총량을 지칭한다.
펩티드의 치료 유효량은 몇몇 인자, 예컨대 치료되는 병태, 병태의 중증도, 투여의 시간, 투여의 경로, 채용되는 펩티드의 배설의 속도, 치료의 지속기간, 수반되는 공동-요법, 및 대상체의 연령, 성별, 중량, 및 상태 등에 따라 달라진다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 치료 유효량을 결정할 수 있다. 따라서, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 최대 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여의 경로를 변형시킬 필요가 있을 수 있다.
유효 일일 용량은 일반적으로 약 5 내지 약 160 mg/kg, 약 10 내지 약 160 mg/kg, 약 40 mg/kg 내지 약 160 mg/kg, 및 약 40 mg/kg 내지 약 100 mg/kg을 포함하는, 체중의 킬로그램당 약 0.001 내지 약 200 밀리그램 (mg/kg)의 범위 내이다. 이러한 용량은 1-6회(들) 일일 투여 레지멘을 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, 최적 치료는 덜 빈번한 투여 레지멘을 갖는 서방형 제제를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 약 20 mg/kg 내지 약 160 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 약 40 mg/kg 내지 약 160 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 적어도 1개의 용량으로 투여되며, 제1 용량은 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제2 용량이 투여되며, 제2 용량은 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량은 2개의 용량으로 투여되며, 제1 용량은 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하고, 제2 용량은 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 용량은 제1 용량이 투여된 후 30초 내지 3시간에 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
본 발명의 조성물은 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 요법을 위해 본 발명의 펩티드를 그 자체로서 사용하는 것이 가능하지만, 이를 제약 제제로, 예를 들어, 의도되는 투여의 경로 및 표준 제약 관행에 관하여 선택되는 적합한 제약 부형제 및/또는 담체와 혼합하여 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 부형제 및/또는 담체는 제제의 다른 성분과 혼화성이고, 그의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용"되어야 한다. 치료 용도를 위한 허용되는 부형제 및 담체는 제약 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins (A.R. Gennaro edit. 2005)]에 기재되어 있다. 제약 부형제 및 담체의 선택은 의도되는 투여의 경로 및 표준 제약 관행에 관하여 선택될 수 있다. 경구 제제는 추가의 혼합물, 예컨대, 예를 들어, 우유, 요거트, 및 영아용 포뮬라를 용이하게 수용한다. 경구 투여를 위한 고체 투여 형태는 또한 사용될 수 있으며, 예를 들어, 캡슐, 정제, 당의정, 환제, 트로키, 로젠지, 분말, 및 과립을 포함할 수 있다. 적합한 부형제의 비-제한적 예는, 예를 들어, 희석제, 완충제 (예를 들어, 중탄산나트륨), 보존제, 안정화제, 결합제, 압축제, 윤활제, 분산 증진제, 붕해제, 항산화제, 향미제, 감미제, 및 착색제를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다.
본 발명의 임의의 조성물의 한 실시양태에서, 조성물은, 예를 들어, 경구, 국소, 직장, 점막, 설하, 비강, 코/입-위관 영양, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 경막내, 비강, 및 기관내 투여와 같은 경로에 의한 전달을 위해 제제화된다. 본 발명의 임의의 조성물의 한 실시양태에서, 조성물은 액체, 폼, 크림, 스프레이, 분말, 또는 겔의 형태이다. 본 발명의 임의의 조성물의 한 실시양태에서, 조성물은 완충제 (예를 들어, 중탄산나트륨)를 포함한다.
본 발명의 방법에서 펩티드 및 조성물의 투여는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 유용한 전달의 경로의 비-제한적 예는 경구, 직장, 대변 (관장제에 의해), 및 코/입-위관 영양을 통해, 뿐만 아니라 비경구, 복강내, 피내, 경피, 경막내, 비강, 및 기관내 투여를 포함한다. 활성제는 투여 후 전신적일 수 있거나, 국지적 투여, 원내 투여의 사용, 또는 삽입의 부위에서 활성 용량을 보유하도록 작용하는 삽입물의 사용에 의해 국재화될 수 있다.
본 발명의 화합물 및 제제의 유용한 투여량은 질환의 성질, 환자의 의학적 내력, 투여의 빈도, 투여의 방식, 숙주로부터의 작용제의 청소율 등에 따라 폭넓게 달라질 수 있다. 초기 용량은 보다 더 크고, 이어서 보다 작은 유지 용량이 이어질 수 있다. 용량은 매주 또는 격주만큼 드물게 투여되거나, 유효 투여량 수준을 유지하기 위해, 보다 작은 용량으로 분할되고, 매일, 주 2회 등으로 투여될 수 있다. 다양한 용량은 치료 효과를 달성하는데 유효할 수 있음이 고려된다. 요법을 위해 본 발명의 화합물을 그 자체로서 사용하는 것이 가능하지만, 이를 제약 제제로, 예를 들어, 의도되는 투여의 경로 및 표준 제약 관행에 관하여 선택되는 적합한 제약 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 부형제, 희석제 및/또는 담체는 제제의 다른 성분과 혼화성이고, 그의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용"되어야 한다. 치료 용도를 위한 허용되는 부형제, 희석제, 및 담체는 제약 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins (A.R. Gennaro edit. 2005)]에 기재되어 있다. 제약 부형제, 희석제 및 담체의 선택은 의도되는 투여의 경로 및 표준 제약 관행에 관하여 선택될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제를 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.
용액 또는 현탁액은 하기 성분 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다: 예로서 제한 없이, 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매를 포함하는 멸균 희석제; 항미생믈제, 예컨대 벤질 알콜 및 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 및 포스페이트; 및 긴장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스.
작용제가 불충분한 가용성을 나타내는 경우, 작용제를 가용화하는 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 공동-용매, 예컨대, 예를 들어, 디메틸술폭시드 (DMSO)를 사용하는 것, 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)®80을 사용하는 것, 또는 수성 중탄산나트륨 중의 용해를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 작용제의 제약상 허용되는 유도체는 또한 유효 제약 조성물을 제제화하는데 사용될 수 있다.
조성물은 활성제와 함께, 예를 들어 및 제한 없이 희석제, 예컨대 락토스, 수크로스, 인산이칼슘, 또는 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘 및 활석; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검, 예컨대 검 아카시아 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스 및 그의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 이러한 결합제를 함유할 수 있다. 액체 제약상 투여가능한 조성물은, 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 활성제 및 임의적 제약 아주반트를 담체, 예컨대, 예로서 및 제한 없이, 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등에 용해시키거나, 분산시키거나, 다르게는 혼합하여, 그에 의해 용액 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 목적하는 경우, 투여되는 제약 조성물은 또한 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤화제, 유화제, 또는 가용화제, pH 완충제 등, 예컨대, 예로서 및 제한 없이, 아세테이트, 시트르산나트륨, 시클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 나트륨 아세테이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 및 다른 이러한 작용제를 함유할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 공지되어 있거나, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975]). 투여되는 조성물 또는 제제는 임의의 경우 치료되는 대상체의 증상을 경감시키는데 충분한 양으로 활성제의 양을 함유할 것이다.
활성제 또는 제약상 허용되는 유도체는 작용제를 신체로부터의 급속한 제거에 대해 보호하는 담체, 예컨대 시간 방출 제제 또는 코팅으로 제조될 수 있다. 조성물은 목적하는 특성의 조합을 얻기 위해 다른 활성제를 포함할 수 있다.
일반적으로 피하로, 근육내로, 또는 정맥내로 주사를 특징으로 하는 비경구 투여는 또한 본원에서 고려된다. 주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서, 또는 에멀젼으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 예로서 및 제한 없이, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 또는 에탄올을 포함한다. 또한, 목적하는 경우, 투여되는 제약 조성물은 또한 소량의 비-독성 보조 물질, 예컨대 습윤화제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제, 가용성 증진제, 및 다른 이러한 작용제, 예컨대, 예를 들어, 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 시클로덱스트린을 함유할 수 있다.
동결건조된 분말은 용액, 에멀젼, 및 다른 혼합물로서 투여를 위해 재구성되거나, 고체 또는 겔로서 제제화될 수 있다. 멸균, 동결건조된 분말은 본원에서 제공된 작용제, 또는 그의 제약상 허용되는 유도체를 적합한 용매에 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 안정성을 개선시키는 부형제 또는 분말 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 다른 약리학적 성분을 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 덱스트로스, 소르비탈, 프룩토스, 옥수수 시럽, 크실리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 작용제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 용매는 또한 완충제, 예컨대 시트레이트, 인산나트륨 또는 칼륨 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 이러한 완충제를 전형적으로, 약 중성 pH에서 함유할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 조건 하에서의 용액의 후속 멸균 여과, 이어서 동결건조는 목적하는 제제를 제공한다. 일반적으로, 생성된 용액은 동결건조를 위해 바이알로 배분될 수 있다. 각각의 바이알은 예로서 및 제한 없이, 작용제의 단일 투여량 (10-1000 mg, 예컨대 100-500 mg) 또는 다중 투여량을 함유할 수 있다. 동결건조된 분말은 적절한 조건 하에서, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 저장될 수 있다. 주사용수로의 이러한 동결건조된 분말의 재구성은 비경구 투여에 사용하기 위한 제제를 제공한다.
본 발명 조성물 또는 그의 제약상 허용되는 유도체는, 예를 들어, 흡입에 의한 또는 비내로 적용을 위해 에어로졸로서 제제화될 수 있다 (예를 들어, US 4,044,126, 4,414,209, 및 4,364,923에 기재된 바와 같이). 이들 제제는 단독으로 또는 불활성 담체, 예컨대 락토스와 조합으로, 네뷸라이저를 위한 에어로졸 또는 용액의 형태로, 또는 통기를 위한 초미세 분말로서 존재할 수 있다. 이러한 경우에, 제제의 입자는 예로서 및 제한 없이, 약 50 마이크로미터 미만, 예컨대 약 10 마이크로미터 미만의 직경을 가질 수 있다.
작용제는 또한 국부 또는 국소 적용을 위해, 예컨대 피부 및 점막에의 적용 (예를 들어, 비내로)을 위해, 비강 용액, 겔, 크림, 및 로션의 형태로 제제화될 수 있다.
본 발명의 안과 조성물
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 국소, 유리체내, 및/또는 안구내 투여를 포함하는 안과 투여를 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안구 표면, 상호연결 신경분포, 결막, 눈물샘, 또는 눈꺼풀판샘에 전달된다. 조성물은 점안액, 연고, 겔, 폼, 용액, 현탁액, 및/또는 안구내 삽입물의 형태로 존재할 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 안과용으로 허용되는 담체 및/또는 부형제 중에 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 2의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 이러한 담체는, 예를 들어, 본원에 열거된 것들을 포함한다.
한 실시양태에 따르면 활성 화합물을 함유하는 국소 제제는 또한 안과 기술분야의 통상의 기술자가 통상적인 기준을 사용하여 선택할 수 있는 바와 같은 생리학상 혼화성 비히클을 함유할 수 있다. 비히클은 염수 용액, 물 폴리에테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐, 예컨대 폴리비닐 알콜 및 포비돈, 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 석유 유도체, 예컨대 미네랄 오일 및 백색 바셀린, 동물 지방, 예컨대 라놀린, 아크릴산의 중합체, 예컨대 카르복시폴리메틸렌겔, 식물성 지방, 예컨대 땅콩 오일 및 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란, 및 글리코스아미노글리칸, 예컨대 히알루론산나트륨 및 염, 예컨대 염화나트륨 및 염화칼륨을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지된 안과 비히클로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 안과 조성물은 유리하게는 특히 용액, 현탁액, 연고, 겔, 또는 폼의 형태로 눈에 국소로 적용된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 안과 조성물은 주사 또는 삽입물을 통해 안구내로, 유리체내로 또는 방수내로 투여된다.
본 발명의 방법에 사용되는 정확한 제약 제제 (예를 들어, 안과 조성물)는 폭넓은 범위의 상업적 및 과학적 기준에 따라 달라질 것이다. 즉, 숙련된 독자는 본원에 기재된 본 발명의 상기 제제가 다른 작용제를 함유할 수 있음을 인식할 것이다.
한 실시양태에 따르면 상응하는 안과 조성물에 대해 통상적인 제약상 허용되는 부형제 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 첨가제, 예를 들어 하기 언급된 유형의 것들, 특히 담체, 안정화제, 가용화제, 긴장성 증진제, 완충제 물질, 보존제, 증점제, 착화제, 및 다른 부형제가 사용된다. 이러한 첨가제 및 부형제의 예는 미국 특허 번호 5,134,124 및 4,906,613에서 발견될 수 있다. 이러한 조성물은 그 자체로 공지된 방식으로, 예를 들어 활성 성분을 상응하는 부형제 및/또는 첨가제와 혼합하여 상응하는 안과 조성물을 형성함으로써 제조된다. 활성 성분은 바람직하게는 점안액의 형태로 투여되며, 활성 성분은 통상적으로 예를 들어, 담체에 용해된다. 용액은 적절한 경우, 목적하는 pH로 조정되고/거나 완충되고, 적절한 경우, 안정화제, 가용화제 또는 긴장성 증진제가 첨가된다. 적절한 경우, 보존제 및/또는 다른 부형제가 안과 조성물에 첨가된다.
본 발명에 따라 사용되는 담체는 전형적으로 국소 또는 전신 투여에 적합하며, 예를 들어 0.5 내지 5 중량% 히드록시에틸셀룰로스, 에틸 올레에이트, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐-피롤리돈 및 안과 용도를 위한 다른 비-독성 수용성 중합체, 예컨대, 예를 들어, 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 메틸히드록시프로필셀룰로스 및 히드록시프로필셀룰로스의 알칼리 금속 염, 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트, 예컨대 폴리아크릴산 또는 에틸 아크릴레이트의 염, 폴리아크릴아미드, 천연 생성물, 예컨대 젤라틴, 알기네이트, 펙틴, 트라가칸트, 카라야 검, 크산탄 검, 카라기닌, 한천 및 아카시아, 전분 유도체, 예컨대 전분 아세테이트 및 히드록시프로필 전분, 및 또한 다른 합성 생성물, 예컨대 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 메틸 에테르, 폴리에틸렌 옥시드, 바람직하게는 가교된 폴리아크릴산, 예컨대 중성 카르보폴, 또는 그러한 중합체의 혼합물을 포함하는 물, 물 및 수혼화성 용매, 예컨대 C1-C7-알칸올, 식물성 오일 또는 미네랄 오일의 혼합물이다. 바람직한 담체는 물, 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 메틸히드록시프로필셀룰로스 및 히드록시프로필셀룰로스의 알칼리 금속 염, 중성 카르보폴, 또는 이들의 혼합물이다.
한 실시양태에 따르면 본 발명의 안과 조성물에 사용되는 가용화제는, 예를 들어, 틸록사폴, 지방산 글리세롤 폴리-저급 알킬렌 글리콜 에스테르, 지방산 폴리-저급 알킬렌 글리콜 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 에테르 또는 그러한 화합물의 혼합물이다. 첨가되는 양은 전형적으로 활성 성분을 가용화하는데 충분하다. 예를 들어, 가용화제의 농도는 활성 성분의 농도의 0.1 내지 5000배이다. 저급 알킬렌은 최대 7개의 C-원자 (및 이를 포함함)를 갖는 선형 또는 분지형 알킬렌을 의미한다. 예는 메틸렌, 에틸렌, 1,3-프로필렌, 1,2-프로필렌, 1,5-펜틸렌, 2,5-헥실렌 또는 1,7-헵틸렌이다. 저급 알킬렌은 바람직하게는 최대 4개의 C-원자 (및 이를 포함함)를 갖는 선형 또는 분지형 알킬렌이다.
완충제 물질의 예는 아세테이트, 아스코르베이트, 보레이트, 히드로겐 카르보네이트/카르보네이트, 시트레이트, 글루코네이트, 락테이트, 포스페이트, 프로피오네이트, 및 TRIS (트로메타민) 완충제이다. 트로메타민 및 보레이트 완충제는 바람직한 완충제이다. 첨가되는 완충제 물질의 양은, 예를 들어, 생리학상 허용되는 pH 범위를 보장하고 유지하는데 필요한 것이다. pH 범위는 전형적으로 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8.2 및 보다 바람직하게는 6.8 내지 8.1의 범위이다.
긴장성 증진제는, 예를 들어, 이온성 화합물, 예컨대 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 할라이드, 예컨대, 예를 들어, CaCl2, KBr, KCl, LiCl, NaBr, NaCl, 또는 붕산이다. 비-이온성 긴장성 증진제는, 예를 들어, 우레아, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨, 프로필렌 글리콜, 또는 덱스트로스이다. 예를 들어, 충분한 긴장성 증진제는 사용 준비된 안과 조성물에 대략 50 내지 1000 mOsmol, 바람직하게는 100 내지 400 mOsmol, 보다 바람직하게는 200 내지 400 mOsmol 및 보다 더 바람직하게는 280 내지 350 mOsmol의 삼투압을 부여하도록 첨가된다.
보존제의 예는 4급 암모늄 염, 예컨대 세트리미드, 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤즈옥소늄 클로라이드, 티오살리실산의 알킬-수은 염, 예컨대, 예를 들어, 티메로살, 페닐질산수은, 페닐아세트산수은 또는 페닐붕산수은, 파라벤, 예컨대, 예를 들어, 메틸파라벤 또는 프로필파라벤, 알콜, 예컨대, 예를 들어, 클로로부탄올, 벤질 알콜 또는 페닐 에탄올, 구아니딘 유도체, 예컨대, 예를 들어, 클로로헥시딘 또는 폴리헥사메틸렌 비구아니드, 또는 소르브산이다. 바람직한 보존제는 세트리미드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈옥소늄 클로라이드 및 파라벤이다. 적절한 경우, 충분한 양의 보존제는 박테리아 및 진균에 의해 유발되는 사용 동안의 2차 오염에 대한 보호를 보장하기 위해 안과 조성물에 첨가된다.
한 실시양태에 따르면 안과 조성물은 추가의 비-독성 부형제, 예컨대, 예를 들어, 유화제, 습윤화제, 또는 충전제, 예컨대, 예를 들어, 200, 300, 400 및 600으로 지정된 폴리에틸렌 글리콜, 또는 1000, 1500, 4000, 6000 및 10000으로 지정된 카르보왁스(Carbowax)를 포함할 수 있다. 목적하는 경우 사용될 수 있는 다른 부형제는 하기 열거되지만, 이들은 가능한 부형제의 범주를 어떠한 식으로도 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이들은 특히 착화제, 예컨대 디나트륨-EDTA 또는 EDTA, 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 아세틸시스테인, 시스테인, 아황산수소나트륨, 부틸-히드록시아니솔, 부틸-히드록시-톨루엔 또는 α-토코페롤 아세테이트; 안정화제, 예컨대 시클로덱스트린, 티오우레아, 티오소르비톨, 나트륨 디옥틸 술포숙시네이트 또는 모노티오글리세롤; 또는 다른 부형제, 예컨대, 예를 들어, 라우르산 소르비톨 에스테르, 트리에탄올 아민 올레에이트 또는 팔미트산 에스테르이다. 바람직한 부형제는 착화제, 예컨대 디나트륨-EDTA 및 안정화제, 예컨대 시클로덱스트린이다. 첨가되는 부형제의 양 및 유형은 특정한 요건에 따르며, 일반적으로 대략 0.0001 내지 대략 90 중량%의 범위이다. 시클로덱스트린은 글루코스당 3개의 유리 히드록시 기를 갖는 몇몇 글루코스 단위로 구성된다. 한 실시양태에 따라 사용되는 시클로덱스트린의 양은 바람직하게는 0.01-20 중량%, 보다 바람직하게는 0.1-15 중량% 및 보다 더 바람직하게는 1-10 중량%의 범위일 수 있다.
한 실시양태에 따르면 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 2의 치료 유효량 및 담체, 가용화제 및 예를 들어, 항생제, 항알레르기제, 마취제, 또 다른 항염증제, 코르티코스테로이드, 안구내 압력을 저하시키는데 적합한 작용제, 또는 또 다른 약물일 수 있는 또 다른 치료 유효 제약 작용제를 포함하는 안과 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 사용되는 안과 조성물은 바람직하게는 비히클로서 생리학적 염수 용액을 사용하여 제조된다. 안과 조성물의 pH는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 적절한 완충제 시스템 (예를 들어, 아세테이트 완충제, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 보레이트 완충제)으로 실질적으로 중성 pH (예를 들어, 약 7.4, 약 6.5 내지 약 7.4의 범위 등)에서 유지될 수 있다.
국소 제제
안과 연고는 현탁액 및 확실히 용액보다 더 길게 활성제를 눈과 접촉하여 유지하는 경향이 있다. 대부분의 연고는 시각을 흐려지게 하는 경향이 있는데, 이는 이들이 눈물에 의해 용이하게 제거되지 않기 때문이다. 따라서, 연고는 일반적으로 낮 동안 사용되는 점안액에 대한 보조 요법으로서 밤에 사용된다.
본 발명 조성물의 유지성 연고 베이스는 모두 체온과 가까운 융점을 갖는 미네랄 오일, 바셀린 및 라놀린의 혼합물이다. 본 발명 화합물의 경우에, 조성물은 미네랄 오일, 바셀린, 또는 라놀린을 포함할 수 있다. 한 실시양태에 따르면 바람직한 조성물은 바셀린, 미네랄 오일, 및 라놀린의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 바람직한 조성물은 백색 바셀린, 미네랄 오일, 및 라놀린 (무수)을 함유하는 연고 조합물이다.
다른 예시적인 국소 제제는 점안액, 삽입물, 아이 팩, 함침된 콘택트 렌즈, 펌프 전달 시스템, 디메틸술폭시드 (DMSO)-기반 용액 및/또는 현탁액, 및 리포솜을 포함한다.
점안액은 활성 성분을 멸균 수용액, 예컨대 생리학적 염수, 완충 용액 등에 용해시킴으로써, 또는 사용 전에 용해되는 분말 조성물을 배합함으로써 제조될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 균형 염 용액, 염수 용액, 수용성 폴리에테르, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐, 예컨대 폴리비닐 알콜 및 포비돈, 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 석유 유도체, 예컨대 미네랄 오일 및 백색 바셀린, 동물 지방, 예컨대 라놀린, 아크릴산의 중합체, 예컨대 카르복시폴리메틸렌 겔, 식물성 지방, 예컨대 땅콩 오일 및 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란, 및 글리코스아미노글리칸, 예컨대 히알루론산나트륨을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 비히클이 선택될 수 있다. 목적하는 경우, 점안액에 통상적으로 사용되는 첨가제가 첨가될 수 있다. 이러한 첨가제는 등장화제 (예를 들어, 염화나트륨 등), 완충제 (예를 들어, 붕산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨 등), 보존제 (예를 들어, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 클로로부탄올 등), 증점제 (예를 들어, 사카라이드, 예컨대 락토스, 만니톨, 말토스 등; 예를 들어, 히알루론산 또는 그의 염, 예컨대 히알루론산나트륨, 히알루론산칼륨 등; 예를 들어, 뮤코폴리사카라이드, 예컨대 콘드로이틴 술페이트 등; 예를 들어, 나트륨 폴리아크릴레이트, 카르복시비닐 중합체, 가교된 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 히드록시 프로필 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시 프로필 셀룰로스 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 작용제)를 포함한다.
본 조성물의 성분의 가용성은 계면활성제 또는 조성물 중의 다른 적절한 공-용매에 의해 증진될 수 있다. 이러한 공용매는 폴리소르베이트 20, 60, 및 80, 플루로닉(Pluronic) F68, F-84 및 P-103, 시클로덱스트린, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 작용제를 포함한다. 이러한 공-용매는 약 0.01 중량% 내지 2 중량%의 수준에서 채용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 보존제를 함유하지 않는 멸균 단위 용량 유형으로서 제제화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 다중용량 형태로 패키징될 수 있다. 보존제는 사용 동안 미생물 오염을 방지하기 위해 바람직할 수 있다. 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드, 티메로살, 클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 페닐에틸 알콜, 에데테이트 디나트륨, 소르브산, 오나머(Onamer) M, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 작용제를 포함한다. 종래 기술 안과 제품에서, 이러한 보존제는 0.004% 내지 0.02%의 수준에서 채용될 수 있다. 본 출원의 조성물에서 보존제, 바람직하게는 벤즈알코늄 클로라이드는 0.001% 내지 0.01% 미만, 예를 들어, 0.001% 내지 0.008%, 바람직하게는 약 0.005 중량%의 수준에서 채용될 수 있다. 0.005%의 벤즈알코늄 클로라이드의 농도는 미생물 공격으로부터 본 발명의 조성물을 보존하는데 충분할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 제제는 시간당 수 방울, 1일당 1 내지 4방울, 바람직하게는 1 내지 3방울, 보다 바람직하게는 1 내지 2방울, 및 가장 바람직하게는 1방울로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제제는 1일에 수 회, 바람직하게는 1일에 1 내지 6회, 보다 바람직하게는 1 내지 4회, 및 가장 바람직하게는 1회 적용되거나 분무될 수 있다.
결막/공막 제제
국소 결막 진입의 경로는 전안부 내로의 약물의 침투를 가능하게 한다. 더욱이, 국소로 적용된 약물은 결막으로부터 공막에의 접근을 갖는 것으로 제시되었다. 공막은 심지어 큰 분자량 화합물 (~150 kD)에도 용이하게 침투가능한 것으로 제시되었다. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 국소 용액, 현탁액, 겔, 또는 연고는 국소 결막 및 공막 적용을 위한 적합한 제제이다. 또한, 제약 조성물을 결막하 주사를 통해 투여하는 것이 가능하다.
안구내/유리체내 제제
본 발명의 제약 조성물은 안구내로 또는 유리체내로, 주사 (예를 들어, 안구주위, 결막하, 방수내, 안구내, 또는 유리체내 주사) 또는 적합한 삽입물 (예를 들어, 각막내 또는 안구내 삽입물)의 도입에 의해 투여되도록 제제화될 수 있다.
삽입가능한 제제
한 실시양태에서, 본 발명의 안구 조성물을 포함하는 삽입물은 생체적합성, 생체분해성/생체-침식성 중합체 매트릭스 내에 트랩된 PIC1 펩티드로 제제화된다. 작용제의 방출은 중합체의 침식, 이어서 유리체에의 이전에 트랩된 작용제 입자의 노출, 및 작용제의 후속 용해 및 방출에 의해 달성된다. 이러한 약물 방출의 형태에 의해 달성된 방출 동역학은 중합체 팽윤을 통해, 예컨대 히드로겔, 예컨대 메틸셀룰로스로 약물을 방출하는 제제를 통해 달성된 것과는 상이하다. 그 경우에, 약물은 중합체 침식을 통해 방출되지 않고, 액체가 노출되는 경로를 통해 확산함에 따라 약물을 방출하는 중합체 팽윤을 통해 방출된다. 방출 동역학을 결정하는 파라미터는 약물 입자의 크기, 약물의 수가용성, 약물 대 중합체의 비, 제조 방법, 노출되는 표면적, 및 중합체의 침식 속도를 포함한다.
삽입물로부터의 PIC1 펩티드(들)의 확산은 또한 삽입물의 구조에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 삽입물로부터의 PIC1 펩티드(들)의 확산은 약물을 포함하는 중합체 층에 부착된 막에 의해 제어될 수 있다. 막 층은 펩티드(들)를 포함하는 중합체 층 및 목적하는 요법의 부위에 대해 중간에 위치할 것이다. 막은 상기 지시된 임의의 생체적합성 물질, 중합체에 존재하는 펩티드(들) 외에도 작용제의 존재, PIC1 펩티드(들)를 포함하는 중합체의 조성, 목적하는 확산의 속도 등으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 중합체 층은 통상적으로 매우 다량의 펩티드(들)를 포함할 것이며, 전형적으로 포화될 것이다. 이러한 PIC1 펩티드(들)-포화된 중합체는 일반적으로 펩티드(들)를 매우 높은 속도로 방출할 수 있다. 이러한 상황에서, 펩티드(들)의 방출은 중합체보다 더 낮은 펩티드(들) 침투성의 것인 막을 선택함으로써 감속될 수 있다. 막의 더 낮은 펩티드(들) 침투성으로 인해, 펩티드(들)는 중합체에서 농축되어 잔류할 것이고, 확산의 전체 속도는 막의 펩티드(들) 침투성에 의해 결정될 것이다. 따라서, 삽입물로부터의 펩티드(들)의 방출의 속도는 감소되어, 요법의 부위에의 펩티드(들)의 보다 제어되고 연장된 전달을 제공한다.
안구 투여
본 발명의 안과 조성물의 투여는 안구내 주사에 의할 수 있지만, 다른 투여의 방식이 유효할 수 있다. 전형적으로, 안과 조성물은 안구내로 (화학적 전달 시스템 또는 침습적 장치에 의해) 개체에게 전달될 것이다. 그러나, 본 발명은 눈에 위치한 또는 눈에 인접한 세포 또는 조직 내의 펩티드의 충분한 양이 안과 병태의 부위와의 접촉을 달성하는 한, 그것이 또한 국소로 (안구외 적용) 또는 전신적으로 (예를 들어, 경구, 또는 다른 비경구 경로, 예컨대 예를 들어 피하 투여)를 포함한다는 점에서 안구내 전달에 제한되지는 않는다. 비경구 투여는 실시자에게 명백한 적절한 상황에서 사용된다. 바람직하게는, 안과 조성물은 정확한 투여량 양의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태로 투여된다.
상기 언급된 바와 같이, 원위치에서의 눈 내의 영역에의 전달은 목적하는 안과 조성물의 정확하게 계량된 양을 눈 내의 특정한 구획 또는 조직 (예를 들어, 후안방 또는 망막)에 도입하도록 디자인된 주사, 카눌라 또는 다른 침습적 장치에 의해 달성될 수 있다. 안구내 주사는 유리체 내로 (유리체내), 또는 결막 밑으로 (결막하), 또는 눈 뒤로 (안구후), 공막 내로, 또는 테논 낭 밑으로 (테논하)일 수 있으며, 데포 형태일 수 있다. 다른 안구내 투여의 경로 및 주사 부위 및 형태는 또한 고려되며, 본 발명의 범주 내이다.
안과 장애의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 안과 조성물의 국소 적용은 연고, 겔, 폼, 또는 점안액으로서 적용될 수 있다. 바람직하게는 PIC1 펩티드(들)를 포함하는 침투 조성물이 사용된다. 국소 안과 조성물은 또한 원위치에서 겔화가능한 수성 제제일 수 있다. 이러한 제제는 눈과의 또는 눈의 외부 중의 누선액과의 접촉시 겔화를 촉진시키는데 유효한 농도로 겔화제를 포함한다. 적합한 겔화제는 열경화성 중합체, 예컨대 에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드의 테트라-치환된 에틸렌 디아민 블록 공중합체 (예를 들어, 폴록사민); 폴리카르보필; 및 폴리사카라이드, 예컨대 겔란, 카라기난 (예를 들어, 카파-카라기난 및 아이오타-카라기난), 키토산 및 알기네이트 검을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
투여되는 PIC1 펩티드(들)의 양 및 방법에 사용되는 국소 안과 조성물 중의 화합물의 농도는 희석제, 전달 시스템 또는 선택되는 장치, 환자의 임상적 상태, 부작용, 및 제제 중의 화합물의 안정성에 의존한다. 따라서, 의사는 해당 환자로의 또는 유사한 환자로의 임상적 경험에 따라, 적절한 농도의 펩티드(들)를 함유하는 적절한 제제를 채용하고, 투여되는 제제의 양을 선택한다.
저속 또는 연장된-방출 전달 시스템은 임의의 다수의 생체중합체 (생물학적-기반 시스템)를 포함하고, 리포솜, 콜로이드, 수지를 채용하는 시스템, 및 다른 중합체성 전달 시스템 또는 구획화된 저장소는 치료적 화합물의 연속적 또는 장기 공급원을 제공하기 위해 본원에 기재된 조성물과 함께 이용될 수 있다.
숙련된 독자는 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 안과 조성물이 안구 환경에 머무를 지속기간이 그 중에서도 제제에 채용되는 화합물의 생리화학적 및/또는 약리학적 특성, 채용되는 화합물의 농도, 화합물의 생체이용률, 치료되는 질환, 투여의 방식 및 치료의 바람직한 길이와 같은 인자에 의존할 것임을 인식할 것이다.
본 발명의 방법에 따른 치료의 빈도는 치료되는 질환, PIC1 펩티드(들)의 전달가능한 농도 및 전달의 방법에 따라 결정된다. 펩티드(들)를 유리체내 주사에 의해 전달하는 경우, 투여 빈도는 매월일 수 있다. 바람직하게는, 투여 빈도는 3개월마다이다. 투여의 빈도는 또한 이전에 전달된 펩티드(들)가 가시적으로 청소되는 경우 전달되는 투여량에 따라, 관찰에 의해 결정될 수 있다. 치료 결과가 달성되면, 펩티드(들)는 점감되거나 중단될 수 있다. 때때로, 부작용은 요법의 중단을 정당화한다. 일반적으로, 화합물의 유효량은 증상의 주관적 완화 또는 임상의 또는 다른 자격 있는 관찰자에 의해 주목된 바와 같은 객관적으로 확인가능한 개선을 제공하는 것이다.
본 발명의 비강 조성물
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 흡입, 통기, 또는 분무화를 포함하는 비강 투여를 위해 제제화된다. 조성물은, 예를 들어, 점비액, 비강 스프레이, 및 흡입, 통기, 및/또는 분무화에 적합한 제제의 형태일 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 본 발명은 또한 비강으로 허용되는 담체 및/또는 부형제 중에 본원에 기재된 바와 같은 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 이러한 담체는, 예를 들어, 본원에 열거된 것들을 포함한다.
비강 투여
본 발명의 비강 조성물의 투여는 점비액, 스프레이, 흡입가능한 제제, 및 분무화된 제제에 의할 수 있지만, 다른 투여의 방식은 유효할 수 있다. 그러나, 본 발명은 코에 위치한 세포 또는 조직 내의 펩티드의 충분한 양이 치료 효능을 달성하는 한, 그것이 또한 국소로 (비내 적용) 또는 전신적으로 (예를 들어, 경구, 또는 다른 비경구 경로, 예컨대 예를 들어 피하 투여)를 포함한다는 점에서 비강 전달에 제한되지는 않는다. 비경구 투여는 실시자에게 명백한 적절한 상황에서 사용된다. 바람직하게는, 비강 조성물은 정확한 투여량 양의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태로 투여된다.
상기 언급된 바와 같이, 원위치에서의 코 내의 영역에의 전달은 목적하는 비강 조성물의 정확하게 계량된 양을 콧구멍에 도입하도록 디자인된 스프레이, 점액, 또는 흡입기 또는 네뷸라이저 장치에 의해 달성될 수 있다. 다른 비내 투여의 경로 및 형태는 또한 고려되며, 본 발명의 범주 내이다.
투여되는 PIC1 펩티드(들)의 양 및 방법에 사용되는 비강 조성물 중의 화합물의 농도는 희석제, 전달 시스템 또는 선택되는 장치, 환자의 임상적 상태, 부작용, 및 제제 중의 화합물의 안정성에 의존한다. 따라서, 의사는 해당 환자로의 또는 유사한 환자로의 임상적 경험에 따라, 적절한 농도의 펩티드(들)를 함유하는 적절한 제제를 채용하고, 투여되는 제제의 양을 선택한다.
숙련된 독자는 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 비강 조성물이 비강 환경에 머무를 지속기간이 그 중에서도 제제에 채용되는 화합물의 생리화학적 및/또는 약리학적 특성, 채용되는 화합물의 농도, 화합물의 생체이용률, 치료되는 질환, 투여의 방식 및 치료의 바람직한 길이와 같은 인자에 의존할 것임을 인식할 것이다.
본 발명의 방법에 따른 치료의 빈도는 치료되는 질환, PIC1 펩티드(들)의 전달가능한 농도 및 전달의 방법에 따라 결정된다. 펩티드(들)를 비강 흡입 또는 통기에 의해 전달하는 경우, 투여 빈도는 매월일 수 있다. 바람직하게는, 투여 빈도는 3개월마다이다. 투여의 빈도는 또한 이전에 전달된 펩티드(들)가 가시적으로 청소되는 경우 전달되는 투여량에 따라, 관찰에 의해 결정될 수 있다. 치료 결과가 달성되면, 펩티드(들)는 점감되거나 중단될 수 있다. 때때로, 부작용은 요법의 중단을 정당화한다. 일반적으로, 화합물의 유효량은 증상의 주관적 완화 또는 임상의 또는 다른 자격 있는 관찰자에 의해 주목된 바와 같은 객관적으로 확인가능한 개선을 제공하는 것이다.
조합 요법
본 발명의 추가의 실시양태는 본 발명의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 보체계를 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은 단독 활성 제약 작용제로서 투여될 수 있지만, 이들은 또한 보체계를 조절하는데 유효한 1종 이상의 치료적 또는 예방적 작용제(들)와 조합으로 사용될 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 방법은 보체계를 조절하는데 유효한 1종 이상의 추가의 치료적 또는 예방적 작용제 전에, 공동으로, 및/또는 후에 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 함께 또는 별개로, 또는 제약 조성물 및 추가의 작용제(들)를 하나의 조성물 내로 배합함으로써 조합 요법에서 추가의 작용제(들)와 함께 투여될 수 있다. 투여량은 보체계의 최대 조절을 달성하도록 투여되고 조정된다. 예를 들어, 제약 조성물 및 추가의 작용제(들) 둘 다는 통상적으로, 단일-요법 레지멘에서 통상적으로 투여되는 투여량의 약 10% 내지 약 150%, 보다 바람직하게는, 약 10% 내지 약 80%의 투여량 수준으로 존재한다.
실시예
본 발명은 또한 하기 실시예에 의해 기재되고 입증된다. 그러나, 본 명세서에서의 어디에서나 이들 및 다른 실시예의 사용은 단지 예시적이며, 어떤 식으로도 본 발명의 또는 임의의 예시된 용어의 범주 및 의미를 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 여기에 기재된 임의의 특정한 바람직한 실시양태에 제한되지 않는다. 사실, 본 발명의 많은 변형 및 변동은 본 명세서를 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 수 있으며, 이러한 변동은 취지에 있어서 또는 범주에 있어서 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 청구범위가 권리가 있는 등가물의 전체 범주와 함께 단지 첨부된 청구범위의 관점에서 제한되어야 한다.
실시예 1: ALI에서 시토카인 발현 및 폐 손상에 대한 PA-dPEG24의 효과
COVID-19의 중증 사례에서 나타나는 급성 폐 손상은 시토카인 폭풍을 수반하는 숙주 면역 반응으로부터 초래되는 것으로 입증되었으며 (Mehta et al., 2020), 네토시스는 직접적 폐 손상 뿐만 아니라 시토카인 생산에 기여함을 통해 COVID-19 환자에서의 급성 폐 손상 (ALI)의 핵심적 유도자인 것으로 상정되었다 (Barnes et al., 2020). 시토카인 수준에 대한, 수혈 전에 투여된 서열식별번호: 2의 10 및 160 mg/kg의 단일 용량 또는 수혈 후 상이한 시간에 투여된 40 및 160 mg/kg의 단일 용량의 효과를 결정하기 위해, 말단 혈액 샘플을 취하였다. 혈장을 혈액 샘플로부터 단리하고, xMAP 비드-기반 면역검정에 의해 하기 염증성 시토카인에 대해 분석하였다: IFN감마, IL-6, IL-2, IL-10, TNF알파, MCP-1 (CCL-2), RANTES (CCL-5), MIP1알파 (CCL-3), IL-1베타, 및 MIP-2 (CXCL2). 서열식별번호: 2의 이러한 용량을 2 히트 ALI 래트 모델에서 시험하였다 (Rivera et al., 2020). 확립된 2-히트 ALI 모델 (Silliman et al., 1997; Silliman, 2006)의 개조인 이러한 모델에서, 청소년기 수컷 위스타(Wistar) 래트를 리포폴리사카라이드 (LPS) (제1 히트)로 주사하여 호중구를 프라이밍하고, 이어서 30분 후에 30% 비혼화성 적혈구의 수혈 (제2 히트)을 행하여 보체 활성화를 개시하였다. 가장 중요하게는, 이러한 2 히트 ALI 모델은 시토카인 폭풍을 모사하는 염증유발성 시토카인의 폭넓은 스펙트럼에 걸쳐 극도로 왕성한 반응을 생성한다. 수혈 전에 주어진 서열식별번호: 2의 10 또는 160 mg/kg의 용량 또는 수혈 후에 주어진 40 또는 160 mg/kg의 용량은 유의한 염증유발성 시토카인 감소 또는 감소된 수준을 향한 경향으로 시토카인 수준을 조정하였다 (도 1). xMAP 비드-기반 면역검정에 의한 다른 염증성 시토카인의 분석은 IL-5, IL-18, IL-1알파, IL-13, IL-17, IL-12, 및 IP-10을 포함하였다 (도 2). 수혈 전에 주어진 10 또는 160 mg/kg의 PA-dPEG24 용량 또는 수혈 후에 주어진 40 또는 160 mg/kg의 용량은 유의한 염증유발성 시토카인 감소 또는 감소된 수준을 향한 경향으로 시토카인 수준을 조정하였다. 실험의 제2 라운드에서, 혈장 샘플을 하기 실험 그룹에 대해 분석하였다: 샴, 1-히트, 2-히트, 2-히트 + 10 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, 2-히트 + 160 mg/kg 예방적 용량 RLS-0071, 2-히트 + 30초에서의 40 mg/kg 구제 용량 RLS-0071, 및 2-히트 + 30초에서의 160 mg/kg 구제 용량 RLS-0071 (도 16a-16c 및 도 17a-17c). 보고된 각각의 시토카인에 대해, 2회의 반복시험을 각각의 동물에 대해 실행하였다. 데이터는 평균 및 평균의 표준 오차이다.
중요하게는, 도 1 및 2에 제시된 염증성 Th1 및 Th17 시토카인의 감소와 대조적으로, PA-dPEG24는 항-염증성 Th2 시토카인 IL-4의 수준을 유의하게 감소시키지 않았다 (도 3). Th2 세포는 병리학적 염증의 감소에 관여하는 M2 대식세포의 대안적 활성화를 촉진시키고, Th1 반응을 반대작용한다.
이들 발견은 놀랍게도 PA-dPEG24가 ALI에서 염증유발성 반응을 조정할 수 있음을 제시하였다. PA-dPEG24가 이러한 ALI 동물 모델에서 염증성 시토카인 수준을 조정할 수 있음은 예상치 않은 것이었다. 조직학에 의해 평가된 바와 같은 폐 손상 및 염증성 시토카인 수준 둘 다가 PA-DPEG24의 예방적 및 구제 투여 둘 다에 의해 감소된다는 관찰은 이러한 분자가 ALI에 기여하는 다수의 염증성 경로를 감소시킬 수 있음을 시사한다.
상기 제시된 시토카인 외에도, 수혈 전에 주어진 10 또는 160 mg/kg으로의 PA-dPEG24의 용량 또는 수혈 후에 주어진 40 또는 160 mg/kg의 용량은 유의한 감소 또는 감소된 수준을 향한 경향으로 다른 시토카인 및 성장 인자 수준을 조정하였다 (도 4).
RLS-0071은 호중구-매개 ALI를 감소시킨다
본 발명자들의 이전에 개발된 2-히트 ALI 모델은 위스타 래트 내로의 LPS의 주입 (제1 히트)에 의해 개시되고, 이어서 30분 후에 30% 비혼화성 적혈구의 수혈 (제2 히트) 및 4시간 후에 동물의 희생이 이어진다. 동물의 폐는 각각 혈류에서의 C5a 수준 및 유리 DNA에 의해 측정된 바와 같이 극적인 호중구-매개 ALI 뿐만 아니라 왕성한 보체 활성화 및 네토시스를 나타내었다. 이러한 모델에서 폐 손상을 완화시키는 RLS-0071의 능력을 평가하기 위해, 동물을 제2 히트 전 2분에 투여된 RLS-0071의 단일 예방적 용량으로 또는 제2 히트 후 다양한 시간에 구제 용량으로서 처리하였다. 폐를 제2 히트 후 4시간에 동물로부터 단리하고, 조직을 H&E 염색에 의해 평가하였다. 샴 동물 (도 18a) 또는 LPS 단독의 제1 히트를 받은 동물 (도 18b)은 정상적인 폐 조직 아키텍쳐를 나타낸 반면, 2-히트 인설트를 받은 동물은 폐포 벽 내로의 실질적인 호중구 침윤에 의해 매개된 현저한 폐 손상을 나타내었다 (도 18c). 대조적으로, 비혼화성 적혈구 수혈 전 2분에 10, 40 또는 160 mg/kg으로의 RLS-0071의 예방적 용량을 받은 동물은 폐 손상의 현저한 감소를 나타내었으며, 폐 조직은 샴 동물의 그것과 유사한 폐 형태학을 나타내었다 (도 18d-18f). 제2 히트의 투여 후 0.5, 60, 90, 120 및 180분에 40 mg/kg RLS-0071의 구제 투여를 받은 동물은 또한 샴 동물의 그것을 닮은 폐 조직 아키텍쳐를 나타내었다 (도 18g-18k).
이 모델에서 RLS-0071에 의한 폐 조직 보호의 수준을 결정하기 위해, 상이한 처리 그룹에 대해 세포벽 비후화에 대한 H&E 섹션의 등급화를 수행하였다. 무작위 현미경검사 필드의 영상을 흑백으로 전환시키고, 이미지제이 (NIH) 분석에 의해 정량화하였다. 이어서 흑색 대 백색 화소의 비를 폐 손상의 척도로서 결정하였다: 폐 손상이 증가함에 따라, 폐포 벽은 비후되어, 폐포 공간을 수축시켜 (백색 공간), 백색 화소의 감소 및 흑색 화소의 증가를 발생시킨다. H&E 섹션의 현미경검사 관찰에 의해 직접적으로 가시화된 조직 손상의 결여와 일치하게, 샴 동물 및 LPS 제1-히트 단독을 받은 동물은 낮은 폐 손상 점수를 가진 반면, 2-히트 인설트를 받은 동물은 이전에 입증된 바와 같이 훨씬 더 높은 손상 점수를 입증하였다 (도 19). RLS-0071의 10mg/kg 예방적 용량을 받은 동물은 폐 손상의 유의한 감소를 나타내었으며 (p=0.002), 이러한 효과는 비처리된 2-히트 동물에 비해 40mg/kg 예방적 용량을 받은 동물에서 증진되었다 (p<0.001). 160 mg/kg의 RLS-0071로 예방적으로 투여된 래트는 40mg/kg 용량과 유가한 폐 점수를 가졌으며, 이는 40 mg/kg을 초과하는 투여가 폐 조직에 임의의 추가의 보호를 제공하지 않았음을 지시한다 (40mg/kg 및 160mg/kg 용량을 비교하여 p=0.33) (도 19). 제2 히트 후 다양한 시간에서 동물을 투여하는 것이 폐 손상을 완화시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 2-히트 인설트로 처리된 동물을 적혈구 수혈 후 0.5, 60, 90, 120 및 180분에 40 mg/kg RLS-0071로 처리하였다. 제2 히트 후 모든 시점에서 RLS-0071로의 처리는 폐 손상의 유의한 감소를 입증하였다 (모두 p<0.001) (도 19). 이들 결과는 RLS-0071의 단일 용량이 2-히트 인설트 후 3시간까지 이러한 실험 모델에서 급성 폐 손상을 유의하게 약화시킬 수 있음을 시사한다.
RLS-0071은 혈액에서 C5a 생산을 감소시킨다
LPS 단독의 제1-히트를 받은 동물은 LPS-매개 대안적 경로 활성화에 기인하는 증가된 수준의 C5a를 나타낸 반면, 2-히트 인설트를 받은 동물은 LPS를 통한 대안적 경로 활성화 및 비혼화성 적혈구 수혈을 통한 고전적 경로 매개 활성화의 조합으로 인해 훨씬 더 높은 수준의 C5a를 입증하였다. 이러한 모델에서 C5a 생산에 대한 RLS-0071의 효과를 평가하기 위해, 2-히트 인설트로 처리된 래트를 RLS-0071의 예방적 또는 구제 용량으로 처리하고, C5a 수준을 제2-히트 인설트 후 0, 5분 및 1시간에 취해진 혈액 샘플로부터 측정하였다. 샴 동물은 기준선 수준의 C5a 생산을 가진 반면, LPS 제1-히트를 받은 동물은 5분 및 1시간에서 증가하는 수준을 나타내었다 (도 20). 2-히트 인설트를 받은 동물은 예상된 바와 같이 1-시간 시점에서 실질적으로 더 많은 C5a 생산을 가졌다 (도 20). 10, 40 및 160 mg/kg의 예방적 용량으로서 RLS-0071을 받은 동물은 각각의 용량 그룹에 대해 5-분 시점에서 C5a의 유의한 감소를 나타내었고 (p<0.001), 180-분 구제 용량을 예외로 하여, 1-시간 시점에서 C5a의 감소를 나타내었으며, 10mg/kg 용량은 유의성에 도달하였다 (p=0.002) (도 20). 예방적 투여로 관찰된 바와 같이, 5-분 시점에서, 2-히트 인설트 후 0.5 (p=0.001), 60 (p<0.001), 90 (p<0.001) 및 120 (p=0.001)분에 투여된 RLS-0071의 40 mg/kg 구제 용량은 또한 180분에 구제 용량을 받은 동물을 예외로 하여 유의하게 감소된 수준의 C5a를 입증하였다 (도 20). 1-시간 시점에서, 모든 구제 용량은 2-히트 단독 동물에 비해 유의하게 감소된 수준의 C5a를 가졌다 (0.5분 (p=0.004), 60분 (p<0.001), 90분 (p<0.001), 120분 (p=0.010) 및 180분 (p<0.001)). 이들 발견은 RLS-0071이 이러한 모델에서 보체 활성화를 유의하게 억제할 수 있음을 입증한다.
RLS-0071은 혈액에서 유리 DNA 축적을 억제한다
활성화된 호중구로부터 방출된 호중구 세포외 트랩 (NET)은 다양한 자가면역, 대사성, 및 염증성 질환에서 병원성 역할을 하는 것으로 이전에 제시되었다. NET는 바이러스 유도된 ALI 뿐만 아니라 TRALI의 뮤린 모델에서 관찰되었으며, 혈류에서의 유리 DNA는 TRALI를 갖는 인간 환자 뿐만 아니라 COVID-19 환자의 혈액에서 NET에 대한 바이오마커이다. 혈액에서의 유리 DNA 수준에 대한 RLS-0071의 효과를 확인하기 위해, 상이한 처리 그룹으로부터의 혈장을 수혈 후 4시간에 피코그린 검정에서 정량화하였다. 예상된 바와 같이, 2-히트 인설트를 받은 동물은 샴 동물 및 LPS 단독의 제1 히트를 받은 동물에 비해 유리 DNA의 높은 혈장 수준을 나타내었다 (도 21). RLS-0071의 예방적 용량을 받은 동물은 10 mg/kg, 40 mg/kg 및 160 mg/kg 용량에서 감소된 수준의 유리 DNA를 나타내었으며, 160 mg/kg 용량은 2-히트 단독 동물에 비해 유리 DNA의 유의한 감소를 입증하였다 (p=0.026). 제2 히트 인설트 후 40 mg/kg RLS-0071의 구제 용량으로 처리된 동물은 2-히트 손상 후 3시간까지 투여된 경우 감소된 수준의 유리 DNA를 나타내었으며, 120 및 180분에서의 구제 투여는 통계적 유의성에 도달하였다 (각각 p=0.039 및 p=0.005). 이들 결과는 RLS-0071이 이러한 질환 모델 및 이러한 활성에서 NET 형성을 조정할 수 있음을 입증한다.
RLS-0071은 혈액에서 염증성 시토카인 및 케모카인 수준을 감소시킨다
ALI의 중증 사례에서, 폐포 대식세포 및 상피 세포는 질환 과정을 악화시키는 유의한 양의 염증유발성 시토카인을 방출하여 급성 호흡기 질환 증후군 (ARDS)을 초래할 수 있다. 이러한 소위 '시토카인 폭풍'은 바이러스-유도된 ALI, 특히 COVID-19에서의 중증 결과와 연관된 공격적인 염증 반응에 대해 널리 문서화되었다 [Polidoro RB, Hagan RS, de Santis Santiago R, Schmidt NW. Overview: Systemic Inflammatory Response Derived From Lung Injury Caused by SARS-CoV-2 Infection Explains Severe Outcomes in COVID-19. Front Immunol 2020;11:1626]. 본 발명자들의 래트 2-히트 모델에서 폐 조직학에 의해 보여진 유의한 ALI를 고려하여, 래트의 혈액으로부터의 시토카인 (도 16a-16c) 및 케모카인 (도 17a-17c)의 수준을 종결 4-시간 시점에서 RLS-0071의 부재 또는 존재 하에서 측정하였다. 예상된 바와 같이, 샴 동물로부터의 혈장은 시험된 모든 시토카인에 대해 낮은 수준의 신호를 가졌다. LPS 단독의 1-히트를 받은 동물은 증가된 수준의 시토카인을 가진 반면, 2-히트 인설트를 받은 동물은 조직학에 의해 관찰된 바와 같이 2-히트 동물에서의 폐 손상의 증가와 상관되는 보다 큰 수준의 시토카인을 가졌다 (도 18a-18k). 평가된 염증유발성 시토카인 (IL-1a, IL-1b, IL-6, IFN-g, IL-17, IL-18, TNFa, 및 RANTES) 및 케모카인 (MCP-1, MIP-1a 및 MIP-2)의 각각에 대해, 10 또는 160 mg/kg으로의 RLS-0071의 예방적 투여 및 40 또는 160 mg/kg으로의 RLS-0071의 구제 투여를 받은 동물은 비처리된 2-히트 동물에 비해 감소된 수준의 시토카인 및 케모카인을 가졌으며, 일부는 유의하게 감소된 수준을 가졌다 (도 16a-16c 및 17a-17c). 함께 취해져, 이들 결과는 RLS-0071의 단일 예방적 또는 구제 용량이 보체 억제 및 호중구-매개 NET 형성의 직접적 조정의 그의 이중 억제 활성을 통해 이러한 2-히트 모델에서 중증 ALI를 완화시킬 수 있음을 입증한다.
논의
이 연구의 목적은 항-염증성 분자 RLS-0071이 이전에 기재된 신규한 2-히트 래트 모델에서 ALI를 완화시킬 수 있는지를 결정하는 것이었다 [Gregory Rivera M, Hair PS, Cunnion KM, Krishna NK. Peptide Inhibitor of Complement C1 (PIC1) demonstrates antioxidant activity via single electron transport (SET) and hydrogen atom transfer (HAT). PLoS One 2018;13(3):e0193931]. LPS 제1 히트, 이어서 30분 후에 비혼화성 적혈구 제2 히트는 적혈구 수혈 후 4시간 내에 중증 ALI를 발생시킨다. 조직학에 의해 관찰된 ALI는 왕성한 호중구 활성화 및 폐 조직 내로의 격리, 고전적 및 대안적 보체 경로 활성화 및 여기에 보고된 바와 같이, 염증성 시토카인의 유의한 생산에 의해 매개될 수 있다. RLS-0071은 PIC1 패밀리의 화합물의 선두적 유도체이며, 시험관내, 생체내 및 생체외 연구에서 고전적 보체 활성화를 억제하고, 시험관내 및 생체외 연구에서 미엘로퍼옥시다제의 억제를 통해 NET 형성을 억제하는 것으로 입증되었다. 보체 억제 및 호중구 조정의 이중 항-염증 활성을 고려하여, RLS-0071은 이러한 동물 모델에서 ALI를 억제할 수 있다고 가설화되었다. 본원의 결과는 예방적으로 또는 구제 용량으로서 단일 용량으로서 전달된 RLS-0071이, 심지어 비혼화성 적혈구 수혈의 제2-히트 후 3시간까지 전달된 경우에도, ALI를 억제할 수 있었음을 입증한다. 이는 조직학에 의해 평가된 바와 같은 감소된 폐 손상 점수, C5a의 척도로서 보체 활성화의 감소, 네토시스에 대한 바이오마커로서 역할을 하는 유리 DNA의 감소된 수준 및 염증성 시토카인 및 케모카인의 감소에 의해 입증되었다.
ALI는 보체 캐스케이드의 활성화 및 외부 촉발제, 예컨대 바이러스 감염 (예를 들어, COVID-19, RSV, 또는 인플루엔자) 또는 수혈에 의한 선천 면역 반응 후 뒤따르며, 환자의 기저의 건강 상태에 의해 영향을 받는다. 보체 활성화가 수 초 내에 일어나 폐 조직에의 호중구 동원 및 이들 세포의 활성화를 초래하여 NET를 생성할 뿐만 아니라 대식세포를 동원하고 활성화시키며, 이는 다시 염증성 시토카인을 생산한다. 면역 반응의 이러한 시간적 증폭은 ALI/ARDS 및 사망으로 진행할 수 있는 과다염증 상태를 초래한다. RLS-0071에 의해 이러한 2-히트 모델에서 관찰된 ALI의 강력한 억제는 분자의 이중 항-염증 활성, 즉, 면역 조절이상의 가장 초기 단계에서의 보체 억제 및 호중구 조정에 기인할 수 있다. RLS-0071은 래트에서 IV 투여의 30초 내에 고전적 보체 활성을 억제할 수 있으며, 호중구 활성화 (네토시스 및 미엘로퍼옥시다제 활성)를 직접적으로 조정할 수 있다. 수 초 내에 작용함으로써, RLS-0071은 염증성 캐스케이드의 가장 초기 단계에서 선천 면역 반응의 체액성 및 세포성 측면 둘 다를 하향조절하여 시토카인 폭풍 및 뒤따르는 조직 손상을 예방할 수 있다. 이러한 2-히트 모델에서 ALI를 완화시키는 RLS-0071의 능력은 바이러스 유도된 ALI 또는 TRALI에 대한 임상적 치료제로서의 유용성에 대한 잠재성을 갖는다.
실시예 2: PA-dPEG24 생체내 조직 결합
PA-dPEG24가 래트의 조직에서 검출될 수 있는지를 결정하기 위해, 수컷 위스타 래트에게 내재 경정맥 카테터를 통해 400 mg/kg PA-dPEG24의 볼루스 IV 용량을 제공하였다. 주입 후 4시간에, 래트를 희생시키고, 간 및 신장을 수거하고, 포르말린에서 고정시켰다. 후속적으로 이들 기관으로부터의 조직을 섹션화하고, 유리 슬라이드에 고정시켰다. PA-dPEG24가 조직에 결합되었는지를 결정하기 위해, 조직 섹션을 탈파라핀화하고, 1:1,000 희석으로의 친화성 정제된 토끼 항-PA-dPEG24 항체로 탐색하였다. 이어서 항체 신호를 비오틴 및 스트렙타비딘 퍼옥시다제의 조합, 이어서 퍼옥시다제의 존재 하에서 갈색 침전물을 형성하는 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB)에 의해 부스팅하였다. 도 5에서 입증된 바와 같이, PA-dPEG24를 받지 않은 래트로부터 수거된 간 조직의 현미경 영상은 염색을 나타내지 않은 반면 (좌측 패널), 별개의 염색은 PA-dPEG24로 처리된 래트로부터의 조직 상에 가시화되었다 (우측 패널). 동일한 발견은 PA-dPEG24를 받지 않은 동물이 염색을 입증하지 않은 신장 조직에 대해 관찰된 반면 (좌측 패널), PA-dPEG24-처리된 동물은 사구체 및 세관 상의 어두운 염색을 입증하였다 (우측 패널). 이들 결과는 PA-dPEG24가 유의하고 예상치 않은 조직 침투를 나타냄을 입증하였다.
실시예 3: PA-dPEG24는 호중구 결합 및 부착에 영향을 미친다
PA-dPEG24는 시험관내에서 호중구에 직접적으로 결합한다
본 발명자들은 PA-dPEG24가 시험관내에서 네토시스를 겪은 호중구를 조정할 수 있음을 이전에 보고하였다 [Hair et al., 2018]. 호중구와 인큐베이션된 PA-dPEG24를 시험하는 후속 실험을 수행하는 동안, 본 발명자들은 PA-dPEG24에 노출된 호중구가 유리 슬라이드의 표면에 부착된 감소된 수를 입증하였음을 주목하였다. 이어서 본 발명자들은 PA-dPEG24가 호중구에 영향을 미치고 있었거나 슬라이드의 표면이 감소된 부착의 원인이 되었는지 여부를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 호중구는 PA-dPEG24로 코팅되고, 반복된 세척 단계 후에 코팅되어 잔류할 수 있음이 결정되었으며, 이는 PA-dPEG24가 호중구 표면에 긴밀하게 부착되었음을 입증한다. 따라서, 슬라이드의 표면은 호중구 결합에 영향을 미치지 않았다.
생체내 ALI 모델에서 보여지는 NET 형성의 억제는 PA-dPEG24가 호중구와 직접적으로 상호작용함을 시사한다. 호중구에의 PA-dPEG24의 결합을 평가하기 위해, 정제된 인간 호중구를 유리 슬라이드 상으로 세포원심분리하였다. 이어서 PA-dPEG24 (1 mM)를 슬라이드의 한 세트에 30분 동안 첨가하고, 후속적으로 슬라이드를 PBS로 세척하였다. 이어서 세포를 PA-dPEG24에 대한 항체 (닭 항-PIC1의 1:1,000 희석), 이어서 표지된 2차 항체 (항-닭의 1:2,000 희석, 알렉사 플루오르 488)와 인큐베이션하고, DAPI로 대조염색하였다. 이어서 세포를 현미경검사에 의해 가시화하였다. 각각의 경우에, DAPI 염색은 세포가 슬라이드 상에 존재하고 무손상이었음을 확인시켜 주었다. 신호를 나타내지 않은 PA-dPEG24를 받지 않은 세포에 비해, PA-dPEG24로 처리된 호중구는 형광 신호를 나타내었으며, 이는 세포 표면에의 펩티드의 직접적 결합을 입증한다 (도 6).
PA-dPEG24는 시험관내에서 호중구의 부착을 감소시킨다
PA-dPEG24의 결합이 시험관내에서 표면에 부착하는 호중구의 능력에 대한 효과를 갖는지 여부를 확인하기 위해, 정제된 인간 호중구를 증가하는 농도의 PA-dPEG24와 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척하고, 유리 슬라이드 상에 정치하고, 이어서 습화된 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2의 존재 하에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로 슬라이드를 DAPI (2% BSA 중 1:1000)로 염색하고, 이어서 20x에서 형광 현미경검사에 의해 영상화하였다. 세포 염색의 양의 정량화를 이미지제이 분석 (NIH)을 사용하여 수행하였다. 증가하는 양의 PA-dPEG24는 슬라이드에 부착된 세포의 수를 용량-의존적으로 감소시켰다 (도 7). 호중구의 부착이 피브리노겐으로 사전-코팅된 유리 슬라이드 상에서 변경되었는지를 확인하기 위해, 정제된 인간 호중구를 증가하는 농도의 PA-dPEG24와 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척하고, 피브리노겐-코팅된 유리 슬라이드 상에 정치하고, 이어서 습화된 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2의 존재 하에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로 슬라이드를 DAPI (2% BSA 중 1:1000)로 염색하고, 이어서 20x에서 형광 현미경검사에 의해 영상화하였다. 세포 염색의 양의 정량화를 이미지제이 분석 (NIH)을 사용하여 수행하였다. 피브리노겐 처리 없이 유리 슬라이드 상에 코팅된 샘플에 비해, PA-dPEG24는 호중구 부착을 예기치 않게 및 용량-의존적으로 감소시켰다 (도 8).
PA-dPEG24는 시험관내에서 인간 호중구 생존율을 증가시킨다
인간 호중구에 직접적으로 결합하고, 시험관내에서 표면에의 그들의 부착을 조정하는 PA-dPEG24의 능력을 고려하여, 본 발명자들은 다음으로 이러한 펩티드가 세포 생존율에 직접적 영향을 갖는지 여부를 결정하였다. 증가하는 양의 PA-dPEG24의 존재 하에서의 세포 생존율을 세포 카운팅 키트-8 (도진도(Dojindo))을 사용하여 결정하였다. 세포 카운팅 키트-8 (CCK-8)은 세포 증식 및 세포독성 검정에서 세포 생존율의 결정을 위한 민감성 비색 검정이다. 고도로 수용성 테트라졸륨 염인 WST-8은 세포에서 데히드로게나제 활성에 의해 감소되어 조직 배양 배지에서 가용성인 황색 포르마잔 염료를 제공한다. 세포에서 데히드로게나제의 활성에 의해 생성된 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 수에 정비례한다. 호중구를 전혈로부터 단리하였다. 간략하게, 헤파린화된 전혈을 4개의 상이한 개체로부터 수집하였다 (n=4). 혈액을 하이파크/피콜(Hypaque/Ficoll) 구배 상에서 회전시켰다. 펠릿을 수집하고, 3% 덱스트란을 20분 동안 첨가하였다. 상청액을 수집하고, 수 회 세척하였다. 적혈구 용해 후, 호중구를 1.0x10^6개 세포/mL의 농도로 PBS 또는 RPMI 중 어느 하나에 재현탁시켰다. '신선한' 호중구를 이 지점에서 취하고, 100 uL (100,000개 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 10 uL의 CCK-8 (도진도 몰리큘라 테크놀로지스(Dojindo Molecular Technologies))을 각각의 웰에 37C에서 2시간 동안 첨가하였다. 450nm에서의 흡광도를 판독하여 생존율을 결정하였다. 상기 인큐베이션 동안, 나머지 세포를 실온에서 30분 동안 다양한 용량으로의 PA-dPEG24와 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 2 mL의 PBS/RPMI로 세척하고, 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 추가의 30분 인큐베이션하고, 이어서 100uL를 플레이트에 첨가하였다. 10uL의 CCK-8을 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 37C에서 2시간 동안 시약과 인큐베이션하였다. 450nm에서의 흡광도를 판독하여 생존율을 결정하였다. 완충제 단독에 비해, PBS 또는 RPMI 중 PA-dPEG24로 처리된 세포는 생존율의 용량-의존적 증가를 나타내었으며 (도 9), 이는 PA-dPEG24 투여가 세포 생존율의 증가를 발생시킴을 의미한다.
호중구 및 상피 세포 수용체에의 PA-dPEG24 결합
호중구에 결합하고 세포 생존율 및 부착에 영향을 미치는 PA-dPEG24의 능력은 펩티드가 호중구 표면 수용체, 및 잠재적으로 호중구와의 상호작용 및 부착에 요구되는 내피 세포의 수용체에 특이적으로 결합함을 시사한다. 이러한 가설을 다루기 위해, 호중구 리간드 (LFA-1 및 MAC-1/CR3) 및 상피 세포 리간드 (ICAM-1/CD54 및 ICAM-2/CD102)가 미세역가 플레이트에 결합된 ELISA-유형 결합 검정을 개발하였다. 이어서 플레이트를 1% 젤라틴/PBS 완충제 중의 증가하는 양의 PA-dPEG24와 인큐베이션하고, 펩티드에 대한 항체로 탐색하고, 현상하였다. PA-dPEG24는 호중구 수용체 LFA-1에 용량-의존적으로 결합하였지만, MAC-1에는 그렇지 않았다. 또한, PA-dPEG24는 내피 수용체 ICAM-1에 결합하였지만, ICAM-2에는 그렇지 않았다. 양성 대조군으로서, C1q를 리간드로서 사용하였으며, 예상된 바와 같이 PA-dPEG24에 용량-의존적 방식으로 결합하였다 (도 10). 추가로, PA-dPEG24는 ICAM-1와 유사한 친화성으로 ICAM-3 및 ICAM-4에 결합하였지만, 또한 ICAM-5에의 우수한 결합을 입증하였다 (도 11).
PA-dPEG24가 혈장에서 ICAM-1 및 LFA-1에 결합할 수 있는지를 확인하기 위해, 이들 수용체를 미세역가 플레이트 상으로 코팅하고, 이어서 증가하는 양의 PA-dPEG24를 함유하는 인간 혈장과 인큐베이션하고, 펩티드에 대한 항체로 탐색하고, 이어서 현상하였다. PA-dPEG24는 호중구 수용체 LFA-1 및 내피 수용체 ICAM-1에 용량-의존적으로 결합하였다. 양성 대조군으로서, C1q 및 MPO를 리간드로서 사용하였으며, 예상된 바와 같이 PA-dPEG24에 용량-의존적 방식으로 결합하였다 (도 12). 이들 결과는 PA-dPEG24가 세포 표면 수용체와의 특이적 상호작용을 통해 호중구 부착 및 생존율을 조정할 수 있음을 시사한다.
여기에 제시된 결과는 PA-dPEG24가 특이적 세포 표면 수용체를 통해 인간 호중구에 직접적으로 결합하고 호중구 생존율 및 부착을 조정할 수 있음을 입증한다. PA-dPEG24가 조직 (간 및 신장)에 결합하고 ALI로 처리된 대상체에서의 시토카인 수준을 조정하는 것을 입증하는 생체내 데이터와 함께, 이들 결과는 PA-dPEG24가 호중구를 직접적으로 표적화함으로써 강력한 항-염증성 분자로서 작용할 수 있음을 시사한다. 추가로, 이들 특성은 RLS-0071이 다수의 안구내 염증성 및 각막 염증성 질환 (예를 들어, 포도막염, ROP, 및/또는 망막염)에서 보체 매개 염증 및 호중구 활성을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 4: 방사성표지된 PA-dPEG24의 동역학 검정
풀링된 전혈 및 혈장에서 [14C]-PIC1-dPEG24 (방사성표지된 PA-dPEG24) 관련 총 방사능의 동역학, 및 풀링된 혈장 샘플에서 대사물 프로파일을 20 또는 200 mg/kg PA-dPEG24 (200 μCi/kg, 각각 그룹 3 및 그룹 4)로의 단일 IV 용량 후 수컷 무손상 스프라그-돌리 래트 (N=6)에서 수행하였다. 그룹 3 및 그룹 4에서의 6마리의 래트를 10, 30분 및 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24, 및 48시간에서의 일련의 혈액 수집을 위해 2개의 하위그룹으로 추가로 나누었다. 혈액을 각각의 시점에서 동물에 걸쳐 동등한 부피에 의해 풀링하고, 풀링된 혈액의 분취물 (~ 200 μL)을 총 방사능을 위해 각각의 시점에서 제거하고, 혈액 샘플의 나머지를 원심분리하여 혈장을 얻었다. 담즙, 소변, 대변, 및 케이지 세척 샘플을 담관 캐뉼러삽입된 (BDC) 래트에서 72시간까지, 및 무손상 래트에서 168시간까지 수집하고, 말단 혈액 샘플을 연구의 종료 (투여 후 72시간 또는 168시간)에서 수집하였다. 배설물, 혈액 및 혈장에서의 총 방사능 농도를 균질화, 연소 및/또는 액체 섬광 카운팅 (LSC)에 의해 결정하였다. 대사물 프로파일 및 구조 특징규명을 풀링된 혈장, 소변, 및 담즙 샘플에서 LC-UV/MS 뿐만 아니라 방사능 검출을 사용하여 수행하였다. 혈액 및 혈장에서 [14C]-PIC1-dPEG24 관련 성분의 총 방사능의 PK 파라미터를 윈논린(WinNonlin) 소프트웨어에 의해 얻었다.
[14C]-PIC1-dPEG24는 래트에서 광범위하게 대사되었으며, 적어도 15종의 대사물이 가수분해된 및/또는 탈수소화된 화합물로서 검출되었다. PIC1-dPEG24는 용액, 래트 소변, 및/또는 래트 혈장에서 안정하지 않았으며, 탈수소화에 의해 M2768로 분해될 수 있다. 탈수소화 위치는 내부 디술피드를 형성하는 2개의 Cys 잔기 상에 있는 것으로 제안되었다. 제안된 대사 경로는 N-말단으로부터의 펩티드의 순차적 가수분해를 나타내었다. M2768로부터의 Ile, Ala, Leu, Ile, Leu, Glu-Pro, Ile, 탈수소화된 Cys-Cys, Gln, Glu, Arg, Ala의 순차적 소실 후, 대사물 M2654, M2583, M2470, M2357, M2244, M2018, M1905, M1701, M1573, M1444, M1288, 및 M1217이 형성되었다. M160 및 M89는 아미노산 및 dPEG24 사이의 아미드 결합의 가수분해 후의 M1444 및 M1288로부터의 대사물이었다. 대사 프로파일을 래트 혈장, 소변, 및 담즙에 대해 얻었지만, 대변으로부터는 낮은 방사능으로 인해 얻지 못했다. 저 및 고용량 그룹 사이에 PIC1-dPEG24의 대사에 대해 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
저용량 그룹 (그룹 3) 및 고용량 그룹 (그룹 4)에 대한 래트 혈장의 방사능 프로파일은 정성적으로 유사하였다. 0-24시간 AUC 풀링된 샘플에서, 모 PIC1-dPEG24 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768은 함께 저용량 및 고용량 그룹에서 각각 약 12% 및 16%의 혈장 방사능을 나타내었다. 대사물 M89/M160, M2018, M2244/M2357/M2470, M2583, 및 M2654는 상대적으로 더 높은 양으로 검출되었고, 저용량 그룹에서 각각 약 7%, 12%, 52%, 4%, 및 10%의 혈장 방사능, 및 고용량 그룹에서 각각 9%, 7%, 44%, 7%, 및 12%의 혈장 방사능을 나타내었다. 다른 대사물은 소량이었고, 각각 3% 미만의 혈장 방사능을 나타내었다. AUC0-24시간 풀링된 혈장에서 각각의 방사능 피크의 추정된 농도는 0-24시간 내에 평균 농도를 나타내었다. 저용량 그룹에서, 모 PIC1-dPEG24 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768은 함께 187 ng Eq/g으로서 계산되었다. 대사물 M89/M160, M2018, M2244/M2357/M2470, M2583, 및 M2654는 각각 114, 183, 252, 65, 및 161 ng Eq/g의 추정된 농도를 가졌다. 고용량 그룹에서, 모 PIC1-dPEG24 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768은 함께 2225 ng Eq/g으로서 계산되었다. 대사물 M89/M160, M2018, M2244/M2357/M2470, M2583, 및 M2654의 계산된 농도는 각각 1237, 981, 3024, 953, 및 1678 ng Eq/g이었다. 8시간까지 시점 풀링된 샘플에서, 모체, PIC1-dPEG24, 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768의 퍼센트는 함께 시간 경과에 따라 저용량 그룹에서 약 5%에서 40%로, 및 고용량 그룹에서 7%에서 60%로 증가하였으며, 이는 저 및 고용량에서 PIC1-dPEG24보다 PIC1-dPEG24의 대사물이 더 빨리 제거되었음을 지시할 수 있다 (표 1 및 도 13 및 14 참조). 주요 대사물 (>10%의 혈장 방사능)은 M89/M160, M2357, M2470, 및 M2018로서 관찰되었으며, 그들의 계산된 농도는 0.5시간에서 8시간까지 시간 경과에 따라 감소하였다.
결론적으로, [14C]-PIC1-dPEG24의 대사, 동역학, 및 배설 질량 균형을 [14C]-PIC1-dPEG24의 20 또는 200 mg/kg으로의 단일 IV 용량 후 수컷 무손상 또는 BDC 래트에서 연구하였다. 투여된 방사능은 급속하게 배설되었고, 대다수의 용량 (>70%의 용량)은 투여 후 24시간 내에 및 주로 소변을 통해 회수되었고, 단지 작은 내지 흔적량의 용량은 대변 및/또는 담즙에서 발견된 반면, 약 82% 내지 91%의 용량은 168시간까지 배설물에서 발견되었다. 이러한 연구의 결과는 20 및 200 mg/kg으로의 단일 IV 용량 후 수컷 BDC 및 무손상 래트에서 소변 배설이 [14C]-PIC1-dPEG24-관련 방사능의 제거의 주요 경로였음을 지시하였다. 무손상 래트에서 동일한 IV 용량 하에서, 혈장 PK 파라미터를 총 방사능에 대한 긴 제거 반감기 (≥ 40시간)로서 특징규명하였다. [14C]-PIC1-dPEG24는 수컷 BDC 래트에서 다수의 가수분해된/ 탈수소화된 대사물로 신속하게 가수분해되었다. M89/M160, M2018, M2244/M2357/M2470은 혈장에서 관찰된 주요 대사물이었던 반면, 비변화된 모 화합물 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768은 함께 풀링된 혈장에서 IV-주사 후 30분에 작은 방사능 피크로서 관찰되었지만, 이는 8시간 시점에서 여전히 검출가능하였다. 소변에서 검출된 주요 대사물은 M1444/M1701/M1573, M2018, M1288, M1217, M2244/M2357, 및 M2470이었으며, 비변화된 모 화합물은 20 및 200 mg/kg 용량에서 검출가능하지 않았다. 가수분해 및 탈수소화는 단일 IV 용량 후 래트에서 [14C]-PIC1-dPEG24의 주요 대사 경로였다. 수컷 래트에서 20 또는 200 mg/kg의 IV 용량 사이에 [14C]-PIC1-dPEG24의 대사, 동역학, 및 배설에 대해 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
용액, 래트 혈장 및 래트 소변에서의 PIC1-dPEG24의 안정성
탈수소화된 생성물 M2768은 -20℃ 냉동고에서 6-일 저장 후 물 중 희석된 용량 용액에서 검출되었다. 데이터는 PIC1-dPEG24가 안정하지 않았음을 지시하였다. 래트 혈장 및 소변에서 PIC1-dPEG24의 안정성을 탐구하기 위해, [14C]-PIC1-dPEG24를 대조군 블랭크 래트 혈장 및 투여 전 소변 샘플 내로 첨가하였다. 탈수소화된 생성물 M2768의 양은 래트 혈장 및 소변 첨가된 샘플 둘 다에서 유의하게 증가하였다. 이들 데이터는 PIC1-dPEG24가 래트 혈장/소변에서 안정하지 않았거나, 샘플 프로세싱 동안 탈수소화된 생성물로 분해될 수 있었음을 지시하였다. 따라서, 이들 데이터에 기반하여, M2768 및 PIC1-dPEG24의 통합은 래트 혈장 프로파일에 대해 조합되었는데, 이는 M2768이 효소적 관여 없이 형성될 수 있었기 때문이다. 또한, M1905, M2018, M2244, M2357, M2470, M2583, 및 M2654를 포함하는 다른 탈수소화된 대사물은 가수분해 후에 M2768로부터 형성되거나 먼저 가수분해에 의해 형성되고, 이어서 상응하는 탈수소화된 대사물로 분해될 수 있었다. 탈수소화는 Cys-Cys 디펩티드 잔기에서 디술피드 형성인 것으로 제안되었다.
풀링된 혈장의 대사물 프로파일
저 및 고용량 그룹으로부터의 풀링된 혈장 샘플 (0-24시간 AUC 풀) 및 0.5, 1, 2, 및 8시간에서의 시점 풀의 라디오크로마토그램은 도 13 및 14에 제시된다. 방사능 피크의 퍼센트로서 표현된 퍼센트 분포는 표 1에 제시된다. 총 15종의 대사물이 래트 혈장에서 관찰되었다. 저용량 그룹 및 고용량 그룹에 대한 래트 혈장 샘플의 방사능 프로파일은 정성적으로 유사하였다.
표 1. [14C]-PIC1-dPEG24의 단일 20 또는 200 mg/kg IV 용량 후 수컷 래트의 풀링된 혈장 샘플에서의 PIC1-dPEG24 & 대사물의 피크 분포
저용량 그룹 (그룹 3) 및 고용량 그룹 (그룹 4)에 대한 래트 혈장의 방사능 프로파일은 정성적으로 유사하였다. 0-24시간 AUC 풀링된 샘플에서, 모 PIC1-dPEG24 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768은 함께 저용량 및 고용량 그룹에서 각각 약 12% 및 16%의 혈장 방사능을 나타내었다. 대사물 M89/M160, M2018, M2244/M2357/M2470, M2583, 및 M2654는 상대적으로 더 높은 양으로 검출되었고, 저용량 그룹에서 각각 약 7%, 12%, 52%, 4%, 및 10%의 혈장 방사능, 및 고용량 그룹에서 각각 9%, 7%, 44%, 7%, 및 12%의 혈장 방사능을 나타내었다. 다른 대사물은 소량이었고, 각각 3% 미만의 혈장 방사능을 나타내었다. AUC0-24시간 풀링된 혈장에서 각각의 방사능 피크의 추정된 농도는 0-24시간 내에 평균 농도를 나타내었다. 저용량 그룹에서, 모 PIC1-dPEG24 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768은 함께 187 ng Eq/g으로서 계산되었다. 대사물 M89/M160, M2018, M2244/M2357/M2470, M2583, 및 M2654는 각각 114, 183, 252, 65, 및 161 ng Eq/g의 추정된 농도를 가졌다. 고용량 그룹에서, 모 PIC1-dPEG24 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768은 함께 2225 ng Eq/g으로서 계산되었다. 대사물 M89/M160, M2018, M2244/M2357/M2470, M2583, 및 M2654의 계산된 농도는 각각 1237, 981, 3024, 953, 및 1678 ng Eq/g이었다. 8시간까지 시점 풀링된 샘플에서, 모 PIC1-dPEG24 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768의 퍼센트는 함께 시간 경과에 따라 저용량 그룹에서 약 5%에서 40%까지, 및 고용량 그룹에서 7%에서 60%까지 증가하였으며, 이는 PIC1-dPEG24의 대사물이 저 및 고용량에서 PIC1-dPEG24보다 더 빨리 제거되었음을 지시하였다. 주요 대사물 (>10%의 혈장 방사능)은 M89/M160, M2357, M2470, 및 M2018로서 관찰되었으며, 그들의 계산된 농도는 0.5시간에서 8시간까지 시간 경과에 따라 감소하였다.
논의
래트, 개, 및 원숭이에서의 PK 모델링 연구 (별개의 연구)는 PA-DPEG24가 혈류로부터 급속하게 청소되고, 배설되지 않은 물질은 또 다른 구획 (조직 층)에서 격리됨을 입증한다. 시간 경과에 따라 펩티드는 순환 내로 서서히 다시 방출된다. 이는 순환에서 저-수준 펩티드의 매우 긴 꼬리를 나타내는 PK 프로파일에서 반영된다.
8시간까지 시점 풀링된 샘플에서, 모체, PIC1-dPEG24, 및 그의 탈수소화된 생성물 M2768의 퍼센트는 함께 시간 경과에 따라 저용량 그룹에서 약 5%에서 40%까지, 및 고용량 그룹에서 7%에서 60%까지 증가하였다. 다시 말해서, PIC-dPEG24 무손상 분자는 처음에 풀링된 혈장에서 IV-주사 후 30분에 작은 방사능 피크로서 검철되었고, 8시간 시점에서 여전히 검출가능하였다. 이러한 놀라운 결과는 투여된 분자의 부분이 그것이 분해로부터 보호되고 이어서 무손상으로 혈류 내로 다시 방출되는 조직 층에서 중심 혈관구조로부터 격리됨을 제시한다. 이는 펩티드가 혈류에서 악명 높게 불안정하다는 점을 고려하면 신규하고 완전히 예상치 않은 발견이다.
실시예 5: PA-dPEG24는 단핵구 세포 상의 C1q-수용체에의 C1q-항체 복합체 결합을 방해하지 않는다
C1q는 보체의 고전적 경로의 제1 보체 성분이다. 세린 단백질 사량체 C1s-C1r-C1r-C1s와 함께 C1q는 C1 복합체로서 공지되어 있다. 항체-코팅된 병원체에 의한 C1q의 구형 헤드의 결합시, C1q는 C1q 콜라겐-유사 도메인의 소수성 포켓에 위치한 C1s-C1r-C1r-C1s 사량체의 활성화를 허용하는 형태적 변화를 겪는다. 이어서 활성화된 C1s-C1r-C1r-C1s는 C4를, 이어서 C2를 절단하여 고전적 보체 경로의 증폭을 유발하여 이펙터 기능, 예컨대 C3a 및 C5a 생성, C3b 옵소닌화 및 막 공격 복합체 형성을 발생시킨다 (Cooper, 1985).
혈류에서, 순환 C1 복합체 및 유리 C1q는 둘 다 존재한다. 고전적 경로의 활성화와 함께, C1q는 또한 세포 데브리스, 예컨대 아폽토시스 바디 및 면역 복합체의 청소에 있어서 중요한 항상성 역할을 한다. 이러한 청소는 아폽토시스 또는 면역 복합체 화물에 결합하고, 이어서 C1q의 콜라겐-유사 영역을 인식하는 포식세포 (즉, 호중구 및 단핵구/대식세포) 상의 C1q 수용체에 결속하는 C1q의 구형 헤드를 통해 일어난다. 이들 복합체는 궁극적으로 포식작용된다. 이러한 과정은 아폽토시스 데브리스/면역 복합체의 축적 및 자가면역의 발달 (예를 들어, 전신 홍반 루푸스)을 방지한다.
PA-dPEG24는 콜라겐-유사 영역의 소수성 포켓에 결합하고, C1q 분자의 구형 헤드에는 결합하지 않는 것으로 입증되었다 (Sharp et al., 2015). PA-dPEG24가 포식세포 상의 C1q 수용체와의 C1q의 상호작용을 방해하지 않음을 입증하기 위해, 하기 실험을 수행하였다. 신선하게 정제된 인간 단핵구를 96 웰 조직 배양 플레이트에 부착하게 하고, 비부착성 림프구를 제거하였다. 이어서 단독으로 또는 증가하는 농도의 PA-dPEG24의 존재 하에서의 C1q를 웰에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 비결합된 C1q를 세척 제거하고, 오브알부민 토끼 면역 복합체를 첨가하고, 인큐베이션하였다. 비결합된 면역 복합체를 세척 제거하고, 항-토끼 HRP 항체를 사용하여 결합된 면역 복합체를 검출하고, 이어서 TMB로 현상하고, 1N H2SO4로 반응을 켄칭하고, 450 nm에서 플레이트 판독기에서 검출하였다. 별개로, 항-C1q 항체를 C1q 인큐베이션 후에 사용하여 단핵구에의 C1q의 결합을 확인하였다. 증가하는 양의 PA-dPEG24의 존재는 C1q-면역 복합체의 수준을 감소시키지 않았다. 놀랍게도, 검출된 C1q의 양은 증가하는 양의 PA-dPEG24와 함께 증가하였다 (도 15). 이들 결과는 PA-dPEG24가 단핵구 상의 그의 동종체 수용체에의 C1q-면역 복합체의 결합을 방해하지 않으며, 따라서 C1q의 항상성 기능 (즉, 면역 복합체/아폽토시스 데브리스의 청소)을 방해할 것으로 예측되지 않을 것임을 시사하였다. 사실, PA-dPEG24는 놀랍게도 단핵구에의 C1q 결합을 증가시키는 것으로 제시되었다. 이러한 발견은 PA-dPEG24가 생체내에서 면역 복합체의 C1q-매개 청소를 증가시킬 수 있음을 시사한다. 따라서, 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 이러한 증가는 면역 복합체의 증가된 급속함이 질환 중증도를 잠재적으로 감소시킬 수 있는 상황인 다수의 염증성 안과 질환 (예를 들어, 포도막염 또는 망막염)을 포함하는, 면역 복합체가 발병기전에 기여하는 질환에 대한 관련을 갖는다.
실시예 5: 유리체내 (IVT) 주사를 통해 전달된 PA-dPEG24의 안전성 및 동역학 프로파일
방법
안전성 연구 . RLS-0071의 최대 전달가능한 용량 (5 마이크로리터 총 부피 중 160 mg/ml)을 4마리의 수컷 위스타 래트의 우측 눈에 유리체내로 전달하였다. 염수 대조군을 좌측 눈에 투여하였다. 이러한 절차를 위해, 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 또한 국소 마취제 프로파라카인을 받게 하였다. 추가로, 동물은 주사 후에 국소 항생제 토브라마이신을 받았다. 슬릿 램프 조사를 주사 후 72시간까지 지시된 시점에서 수행하고, 병리증상을 하기 점수화 스케일을 갖는 변형된 맥도날드-샤덕(MacDonald-Shadduck) 안구 등급화 시스템을 사용하여 등급화하였다: 0, 병리증상 없음; 1, 약간의 병리증상; 2, 중등도 병리증상; 3/4, 중증 병리증상.
동역학 연구 . RLS-0071의 최대 전달가능한 용량 (160 mg/ml, 5 μl 총 부피)을 수컷 위스타 래트의 우측 및 좌측 눈에 유리체내로 투여하였다. 동물을 5분 (n=4마리의 래트), 1시간 (n=3마리의 래트), 4시간 (n=2마리의 래트), 24시간 (n=2마리의 래트), 4일 (n=4마리의 래트) 및 10일 (n=3마리의 래트)에 CO2 질식에 의해 안락사시켰다. 눈을 안락사의 시간에 적출하고, 즉시 -80℃ 조건에서 저장하였다. 24시간 후, 동결된 눈을 해부학적 구획으로 섹션화하고, 추가의 프로세싱을 위해 -80℃ 조건에서 다시 저장하였다.
RLS-0071 샌드위치 ELISA . RLS-0071 반감기의 결정을 위해, 각각의 샘플에 대한 유리체액의 부피를 추정하고, 마이크로퓨즈 튜브에서의 샘플의 메니스커스에 기반하여 기록하였는데 (표준 공지된 양에 비해), 이는 샘플이 점성이고, 피펫 내로 용이하게 채취될 수 없었기 때문이다. 다음으로, 100 ul의 1% BSA / PBS를 각각의 샘플에 첨가하고, 이들을 4℃에서 밤새 진탕기에 정치하였다. 다음 날, 샘플을 5,000 rpm에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 수집하고, RLS-0071에 대한 결합된 1차 닭 폴리클로날 항체를 이용하여 펩티드를 포획하고, RLS-0071에 대한 1차 토끼 폴리클로날 항체를 이용하여 플레이트에 결합된 임의의 펩티드를 검출하는 RLS-0071 샌드위치 ELISA에 적용하였다. 이어서 토끼 항체를 HRP에 접합된 염소 항-토끼 2차 항체로 탐색하고, TMB로 현상하고, 플레이트를 450nm에서 분광광도법에 의해 판독하였다. 도 22a-22d에 제시된 데이터는 4회의 독립적인 실험으로부터의 평균이다. 오차 막대는 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다.
안구 조직에서의 RLS-0071에 대한 DAB 염색 . 망막에서의 RLS-0071의 조직 분포를 결정하기 위해, 유리체내로 투여된 염수 (대조군) 또는 상기 기재된 바와 같은 RLS-0071을 받은 동물을 염수 동물에 대해 IVT 후 5분 및 RLS-0071을 받은 동물에 대해 IVT 후 1-시간에 안락사시켰다. 이어서 눈을 수거하고, 안구 조직을 단리하고, RLS-0071에 대한 1차 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 조직학 및 DAB로의 염색을 위해 프로세싱하였다.
결과
RLS-0071의 유리체내 주사는 안전하다 . 래트를 160 mg/kg (최대 전달가능한 용량)의 RLS-0071로 유리체내로 주사하고, 눈을 하기 시점에서 슬릿 램프에 의해 병리증상에 대해 조사하였다: IVT 전, 0.5, 2, 24, 48 및 72시간. 0이 병리증상 없음을 지시하고, 3/4가 중증 병리증상을 지시하는 점수를 갖는 변형된 맥도날드-샤덕 안구 등급화 시스템을 사용하여 병리증상을 결정하였다. 염수 대조군과 유사하게 모든 4마리의 동물에 대해 RLS-0071 관련 독성은 관찰되지 않았다 (표 2). 이들 결과는 RLS-0071이 3일까지 유해 효과 없이 래트 눈의 유리체에 안전하게 전달될 수 있음을 입증한다.
표 2. 래트에서의 RLS-0071의 IVT 투여의 안전성 평가.
유리체내로 전달된 RLS-0071은 연장된 반감기를 갖는다 . IVT 전달된 RLS-0071의 동역학을 평가하기 위해, 래트 눈을 5 마이크로리터의 총 부피 중 160 mg/ml의 RLS-0071로 IVT 주사하였다. 주사 후 5분, 1시간, 4시간, 1일, 4일 및 10일에, 동물로부터의 눈을 안락사에서 제거하고, 유리체액을 분석을 위해 프로세싱하여 샌드위치 ELISA에서 RLS-0071을 검출하였다. 놀랍게도, RLS-0071은 IVT 주사 후 10일까지 검출될 수 있었으며, 24시간에서 0.12 mg/ml으로 검출되었다 (도 22a-22b). 그에 비해, 200 mg/ml (800 mg/kg) RLS-0071로 IV 주입된 래트는 24시간에서 0.07 mg/ml의 수준을 나타내었으며, 그 후 비검출가능하였다 (도 22c-22d). 이들 데이터는 IVT 전달된 RLS-0071이 정맥내로 전달된 펩티드보다 예상치 않게 눈에서 훨씬 더 긴 반감기를 가짐을 입증하였다.
유리체내로 전달된 RLS-0071은 망막 조직을 왕성하게 염색한다 . 래트 흡수, 분포, 대사, 및 배설 (ADME) 연구는 방사성표지된 RLS-0071이 IV 전달되는 경우 다양한 조직 층에서 유의한 조직 분포를 가짐을 이전에 입증하였다. 추가로, RLS-0071은 플레이트 결합 검정에서 ICAM1, 3, 4 및 5에 결합하는 것으로 제시되었고; 이들 부착 분자는 내피 및 상피 세포 상에 다양한 정도로 존재하며, 이는 RLS-0071이 망막 조직에 결합할 수 있음을 시사한다. RLS-0071이 펩티드의 IVT 주사를 받은 래트에서의 망막 조직에 결합하였는지를 평가하기 위해, 망막 조직을 조직학을 위해 프로세싱하고, 폴리클로날 토끼 항-RLS-0071 항체와 인큐베이션하고, 이어서 DAB 염색하였다. 염수로 IVT 주사된 래트 눈에 비해, RLS-0071의 IVT 주사를 받은 눈은 주사 후 1시간에 유의한 DAB 신호를 나타내었다 (도 23). 눈의 모든 조직 수준의 왕성한 염색은 예상치 않은 것이었는데, 이는 눈의 층이 구획화되는 장벽을 갖고, 감염성 입자 및 다른 비-영양 분자가 한 층에서 다음 층으로 횡단하는 것을 차단하기 때문이다. 집합적으로, 이들 발견은 IVT 투여된 RLS-0071이 래트의 눈에 대한 유해 효과를 갖지 않으며, 연장된 반감기 및 망막의 조직 침투를 나타냄을 입증한다. 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, RLS-0071은 보체 및 호중구-매개 염증이 병원성 역할을 하는 눈의 급성 질환의 억제에 있어서 치료 이익을 가질 수 있음이 제안된다.
실시예 7: 2-히트 래트 급성 폐 손상 (ALI) 모델에서의 저용량에서의 혈액 대 조직에서의 보체 활성화의 RLS-0071 억제.
배경 및 결과
RLS-0071을 ALI의 2-히트 래트 모델에서 시험하였다. 제1 인설트는 리포폴리사카라이드 (LPS)로의 호중구 자극이고, 이어서 30분 후에 비혼화성 적혈구로의 고전적 보체 활성화의 제2 인설트가 이어진다. 이러한 모델은 폐포 벽 내로의 극적인 호중구 침윤을 생성하여, 벽을 비후시키고, 폐포 공간을 85% 감소시킬 수 있다. 여기에 제시된 바와 같이, 10 mg/kg 내지 160 mg/kg으로 단일 용량 IV로서 주어진 RLS-0071은 유사한 폐 손상으로부터의 보호를 생성하였다. NET 생성을 혈장에서의 유리 DNA 정량에 의해 측정하였으며, 10 mg/kg은 160 mg/kg에 비해 유사한 감소를 생성하였음을 제시하였다. 감소된 염증유발성 시토카인 생산 (IL-1, IL-6, IL-17 및 TNFα)은 RLS-0071로 처리된 동물에서 입증되었다. 보체 억제는 제2 히트 후 5 및 60분에 10 mg/kg RLS-0071에 대한 래트 혈장에서의 C5a의 측정에 의해 입증가능하였다 (도 24). C5a의 짧은 5-분 반감기를 고려하여, 60분에서 상승된 C5a의 측정은 조직 생성된 C5a와 일치한다. 이들 데이터는 RLS-0071이 저용량, 예를 들어, 10 mg/kg IV에서 말초 조직에서 보체의 활성화를 억제할 수 있음을 입증하였다.
2-히트 ALI 모델에서 래트의 혈류에서의 보체 억제를 2가지 상이한 방법에 의해 측정하였다. 제1 방법은 수혈된 비혼화성 적혈구의 혈관내 용혈을 측정함으로써, 래트의 혈장에서 유리 헤모글로빈을 시간 경과에 따라 측정하였다. 도 25에서 보여지는 바와 같이, 비혼화성 수혈을 받은 래트는 1시간까지 거의 최대 수준에 도달하는 시간 경과에 따라 증가된 혈관내 용혈을 나타내었다. 10 mg/kg IV로 주어진 RLS-0071은 염수 처리에 비해 고전적 보체 경로 매개 용혈의 억제를 입증하지 않았다 (도 25). 혈장 샘플을 또한 생체외에서 mCH50에 의해 분석하였으며, 비혼화성 수혈에 의한 고전적 경로 활성화로부터 초래되는 보체 성분 소비로 인해 5분에 mCH50의 일시적 감소를 나타내었으며, 1시간에 거의 정상 mCH50 값으로 반등되었다 (도 26). 10 mg/kg IV로의 RLS-0071은 염수 처리된 대조군에 비해 mCH50을 억제하지 않았다 (도 26). 이들 2가지 검정은 10 mg/kg IV로의 RLS-0071이 염수 대조군에 비해 혈류에서 측정가능한 고전적 보체 억제를 생성하지 않았음을 입증한다. 이러한 결과는 조직에서 C5a 생성의 50% 감소를 생성한 10 mg/kg IV로의 RLS-0071과 대조적이다.
이들 동물 데이터는 RLS-0071이 혈류에서 보체 활성화를 억제하지 않는 저용량 (예를 들어, 10 mg/kg IV)에서의 다수의 동물 모델에서, 조직에서의 보체 활성화, 뿐만 아니라 염증성 조직 손상을 억제할 수 있다는 놀라운 발견을 입증한다.
실시예 8: RLS-0071 및 중증 천식의 치료
호중구성 천식은 빈번한 악화 및 입원을 초래하는, 고용량의 흡입된 코르티코스테로이드 및 β2-효능제에 불응성일 수 있는 천식의 중증 형태이다. 현재 스테로이드-저항성 천식에 대한 FDA-승인된 요법은 없다. 본 발명자들은 최근 제0일 및 제7일에 복강내 오브알부민 (OVA) 감작화, 이어서 제14일 및 제15일에 비내 OVA 챌린지 및 제21일 내지 제23일에 비내 OVA/LPS (리포폴리사카라이드) 챌랜지, 및 제24일에 동물의 안락사에 의해 매개된 호중구성 천식 위스타 래트 모델을 개조하였다. 이러한 레지멘은 폐 내로의 호중구 침윤, 폐 혈관 침투성을 암시하는 단백질 축적 및 기관지폐포 세척액 (BALF)에서의 호중구 활성화 및 호중구 세포외 트랩 형성 (네토시스)을 지시하는 MPO 뿐만 아니라 유리 DNA의 증가된 수준을 갖는 호중구성 천식 환자에서 관찰된 질환 과정을 모방한다. 이러한 연구의 목적은 이러한 동물 모델에서 RLS-0071의 역할을 평가하는 것이었다. 이러한 프로토콜로 처리된 청소년기 수컷 위스타 래트를 제21이 내지 제23일 (예방적 투여) 또는 제22일 및 제23일 (구제 투여)에 160 mg/kg RLS-0071로 정맥내로 투여하였다. RLS-0071을 받지 않은 동물에 비해, RLS-0071로 처리된 동물의 BALF는 BALF에서의 호중구 카운트 및 단백질 수준 뿐만 아니라 MPO 및 유리 DNA의 감소를 나타내었다. 이들 결과는 RLS-0071이 이러한 래트 모델에서 호중구-매개 천식을 조정할 수 있음을 입증한다.
물질 및 방법
동물 실험
호중구성 천식의 OVA/LPS 래트 모델을 이전에 공개된 설치류 모델로부터 개조하였다 [An TJ, Rhee CK, Kim JH, Lee YR, Chon JY, Park CK, et al (2018) Effects of Macrolide and Corticosteroid in Neutrophilic Asthma Mouse Model. Tuberc Respir Dis (Seoul). Jan;81(1):80-87. doi: 10.4046/trd.2017.0108; Thakur VR, Khuman V, Beladiya JV, Chaudagar KK, Mehta AA (2019) An experimental model of asthma in rats using ovalbumin and lipopolysaccharide allergens. Heliyon. Nov 19;5(11):e02864. doi: 10.1016/j.heliyon.2019.e02864]. 실험 디자인은 도 27에 제시된다.
제0일 및 제7일에 OVA (밀리포어시그마(MilliporeSigma), 미국 매사추세츠주 벌링톤) 투여를 위해, 래트를 5% 이소플루란 (엠더블유아이 애니멀 헬스(MWI Animal Health), 미국 아이다호주 보이스)으로 진정시키고, 2 mg Al(OH)3 용액 중 1.83 mg/kg의 OVA를 복강내 (IP) 투여하였다. 제14일 및 제15일에 OVA (0.92 mg/kg)의 비내 (IN) 투여를 위해, 래트를 5% 이소플루란으로 진정시키고, 이어서 75 mg/kg으로 케타민 (맥케슨(McKesson), 미국 텍사스주 라스 콜리나스) 및 7 mg/kg으로 크실라진 (로이드 래버러토리스(Lloyd Laboratories), 미국 아이오와주 셰난도아)의 IP 투여를 행하였다. 제21일, 제22일 및 제23일에, 래트를 이소플루란 및 케타민/크실라진으로 진정시키고, 0.92 mg/kg OVA 및 0.18 mg/kg 리포폴리사카라이드 (LPS, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) O111:B4로부터 [밀리포어시그마, 미국 매사추세츠주 벌링톤], 염수에 재구성되고 OVA Al(OH)3 용액 내로 희석됨)를 IN 투여하였다. 동물을 제24일에 상기 기재된 바와 같이 안락사시켰다. RLS-0071 처리를 받은 실험 그룹에 대해, 펩티드를 폴리펩티드 그룹(PolyPeptide Group) (미국 캘리포니아주 샌 디에고)에 의해 HPLC 및 질량 분광법 분석에 의해 입증된 바와 같이 ≥ 95% 순도로 제조하였다. 동결건조된 RLS-0071을 0.05 M 히스티딘 완충제에 가용화하고, pH를 6.5로 조정하였다. RLS-0071을 OVA/LPS 챌린지 후 4시간에 제21일, 제22일 및 제23일 (예방적 투여) 또는 제22일 및 제23일 (구제 투여)에 160 mg/kg으로의 내재 경정맥 카테터를 통해 이소플루란 진정된 동물에게 IV 투여하였다 (도 1). 비히클 대조군 동물은 펩티드 없는 염수를 IV로 받았다. RLS-0071 및 비히클 대조군을 받은 동물을 제24일에 희생시켰다.
기관지폐포 세척액 (BALF)을 안락사 후에 수집하였다. 기관을 중간선 절개를 통해 노출시키고, 이어서 기관 고리를 통해 22-게이지 0.5-인치 루어(Luer) 스터브 (인스테크 래버러토리스(Instech Laboratories), 미국 펜실베니아주 필마우스 미팅)의 삽입을 행하였다. 1 mL의 멸균 염수를 1 mL 시린지를 사용하여 폐 내로 도입하고, 래트의 흉부를 부드럽게 마사지한 후에 회수하였다. 이를 5 mL 멸균 염수의 총 부피에 대해 5회 반복하였다. 회수된 세척액 (대략 4 mL)을 1,500 rpm에서 5분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. BALF 상청액을 수집하고, 분취하고, 추가로 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 세포를 2 mL의 RPMI 1640 배지 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 매사추세츠주 월썸)에 재현탁시키고, 이어서 세포 농도를 트리판 블루(Trypan Blue) 염료 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월썸)로 세포를 염색한 후 자동화 세포 카운터 (카운테스 자동화 세포 카운터, 써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월썸)로 결정하였다. 세포를 추가의 분석을 위해 100,000개 세포/슬라이드의 최종 농도로 슬라이드 상으로 세포원심분리하였다.
BALF에서의 백혈구 정량화
BALF에 존재하는 백혈구의 수를 로마노프스키-가이스마(Romanowsky-Geisma) 염색 (데이드 베링(Dade Behring), 미국 일리노이주 디어필드)으로 세포원심분리된 슬라이드 상에서 세포를 염색함으로써 결정하고, 이어서 슬라이드를 수돗물로 철저하게 세정하였다. 세포를 현미경 (BX50, 올림푸스)으로 40x 배율로 가시화하고, 상이한 유형의 백혈구 (즉, 호중구, 호산구, 림프구, 및 대식세포)를 총 600개 세포가 도달될 때까지 슬라이드 전반에 걸쳐 무작위 시야에서 카운팅하였다. 이어서 각각의 백혈구 유형의 상대 백분율을 결정하였다. 카운팅 동안 임의의 편향을 감소시키기 위해, 조사자는 맹검이었고, 실험 그룹은 무작위화되었다.
BALF에서의 단백질 측정
BALF 상청액에서의 총 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월썸)을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 25 μL의 희석된 샘플을 96-웰 플레이트에서 200 μL의 작업 시약 용액과 혼합하였다. 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 8분 동안 냉각시키고, 이어서 흡광도를 562nm에서 바이오텍(BioTek) 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 모든 샘플을 중복으로 검정하고, 각각의 샘플의 단백질 농도를 공지된 농도의 소 혈청 알부민 (BSA)의 표준 곡선으로부터 결정하였다.
BALF에서의 MPO 측정
MPO 수준을 BALF 상청액에서 비색 검정으로 측정하였다. 간략하게, 100μL의 샘플을 다중-웰 플레이트에 중복으로 첨가하고, 이어서 50 μL의 TMB (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월썸)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, 이어서 50 μL의 2N 황산으로 정지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 바이오텍 마이크로플레이트 판독기로 판독하였다. 공지된 농도의 MPO를 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 이를 사용하여 샘플에서의 MPO 수준을 계산하였다.
BALF에서의 DNA 측정
BALF 상청액 중의 유리 DNA를 피코그린에 의해 측정하였다. 간략하게, BALF 샘플을 10 mM 트리스(Tris)-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE) 완충제에 희석하고, 50uL의 각각의 샘플을 피코그린 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드)의 50uL의 1:200 희석물과 함께 웰에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 광으로부터 보호하였다. DNA 표준 곡선을 TE 완충제에서 작성하였다. 이어서 형광을 485nm의 여기 파장 및 520nm의 방출 파장에서 바이오텍 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다. 모든 유리 DNA 측정을 중복으로 수행하였다.
통계적 분석
데이터는 평균 및 평균의 표준 오차로서 나타내어진다. 통계적 분석을 스튜던트(Student) t-검정을 사용하여 데이터에 대해 수행하여 실험 그룹 사이의 유의성을 비교하였다. 모든 통계적 검정을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) (미국 캘리포니아주 샌 디에고)을 사용하여 수행하였다. 모든 검정은 0.05에서 설정된 유의성 수준을 갖는 양측이었다.
결과
RLS-0071은 BALF에서 호중구 수준을 감소시킨다
RLS-0071은 고전적 보체 경로 활성화 및 호중구 이펙터 기능 (MPO 활성 및 네토시스) 둘 다를 억제할 수 있는 이중 표적화 항-염증성 분자이다. 호중구성 천식을 완화시키는 RLS-0071의 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 OVA/LPS의 복강내 (IP) 및 비내 (IN) 주입을 이용하는 호중구 천식의 기존의 뮤린 모델을 개조하였다 (도 27). OVA/LPS를 받은 동물에서 호중구의 수준을 결정하기 위해, 래트를 제24일에 희생시키고, BALF를 수집하고, 백혈구를 현미경검사에 의해 정량화하였다. 샴 동물은 예상된 바와 같이 BALF에서 >95% 폐포 대식세포를 나타내었다 (도 28). 대조적으로, OVA/LPS 레지멘을 받은 동물은 BALF에서 >40% 호중구 및 림프구의 >5% 증가를 가졌다. RLS-0071이 이러한 모델에서 폐에 대한 호중구 격리를 조정하는지를 결정하기 위해, RLS-0071 펩티드를 예방적 투여 레지멘을 모방하기 위해 제21일, 제22일 및 제23일에 또는 구제 투여 시나리오를 시뮬레이션하기 위해 제22일 및 제23일에 160 mg/kg IV의 볼루스 용량으로서 투여하였다. 둘 다의 투여 레지멘은 파일럿 실험에서 결정된 바와 같은 제22일에서의 피크 호중구 축적에 기반하였다. RLS-0071의 예방적 투여는 펩티드를 받지 않은 동물에 비해 BALF에서의 호중구 축적의 유의한 감소를 입증하였다 (P < 0.03). 구제 투여는 또한 호중구의 감소를 나타내었지만, 통계적 유의성에 도달하지는 않았다 (P < 0.1844). 이들 결과는 RLS-0071의 IV 투여가 예방적 또는 구제 투여 시나리오에서 호중구성 천식으로 처리된 래트의 폐에서 호중구 축적을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
RLS-0071은 BALF에서 단백질 수준을 감소시킨다
OVA/LPS 레지멘을 받은 동물에서 폐 혈관 누출의 수준을 확인하기 위해, 동물을 제20일 내지 제24일에 희생시키고, BALF를 수집하고, 총 단백질 농도를 결정하였다. 샴 래트에 비해, OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물은 제20일 내지 제23일에 BALF에서 증가하는 수준의 단백질을 나타내었고, 제24일에 강하하였으며, 이는 혈관 조직 내로의 단백질 재흡수를 지시할 가능성이 크다 (도 29). 이들 발견과 일치하게, RLS-0071의 예방적 또는 구제 투여를 받은 동물은 제24일에 천식 래트와 유사한 수준의 단백질을 가졌다.
RLS-0071은 BALF에서 MPO 수준 및 유리 DNA를 감소시킨다
OVA/LPS 프로토콜을 받은 동물의 BALF에서 MPO 수준에 대한 RLS-0071의 효과를 확인하기 위해, 동물을 제20일 내지 제24일에 희생시키고, BALF를 수집하고, 총 MPO 농도를 결정하였다. 샴 래트 및 OVA/LPS 레지멘을 받은 동물은 제20일 내지 제22일에 BALF를 수집한 경우 유리 MPO의 배경 수준을 나타내었다 (도 30). MPO 수준은 제23일에 극적으로 증가하였고, 천식 래트에서 제24일까지 점감되었다. 예방적 레지멘으로서 RLS-0071을 받은 동물은 펩티드를 받지 않은 제24일 동물에 비해 통계적 유의성에 도달하지 않은 MPO 수준의 감소를 나타낸 반면 (p = 0.12), 구제 투여는 MPO 수준의 유의한 감소를 나타내었다 (P = 0.05).
MPO는 호중구 세포외 트랩 (NET)의 생산에 있어서 핵심적 역할을 하는 것이다. 이는 호중구 과립에서 과산화수소와 조합되어 네토시스를 매개하며, RLS-0071은 시험관내에서 NET의 형성을 억제하는 것으로 제시되었다. NET는 호중구성 천식을 포함하는 다양한 자가면역, 대사성, 및 염증성 질환에서 병원성 역할을 하는 것으로 이전에 제시되었다 [Lachowicz-Scroggins ME, Dunican EM, Charbit AR, Raymond W, Looney MR, Peters MC, et al. (2019) Extracellular DNA, Neutrophil Extracellular Traps, and Inflammasome Activation in Severe Asthma. Am J Respir Crit Care Med. 199(9):1076-1085; Varricchi G, Modestino L, Poto R, Cristinziano L, Gentile L, Postiglione L, et al. (2021) Neutrophil extracellular traps and neutrophil-derived mediators as possible biomarkers in bronchial asthma. Clin Exp Med. 2021 Aug 3. doi: 10.1007/s10238-021-00750-8]. OVA/LPS 처리된 동물에서 NET 형성에 대한 효과를 확인하기 위해, BALF로부터의 유리 DNA를 결정하였다. 유리 또는 세포외 DNA는 자가면역 및 염증성 질환에서 NET 형성에 대한 바이오마커로서 빈번히 사용된다. 제20일 및 제21일에 단리된 샴 동물 및 천식 동물로부터의 BALF에서 낮은 수준의 유리 DNA가 관찰되었으며, 제22일, 제23일, 및 제24일에 천식 동물로부터 수거된 BALF에서 유리 DNA의 증가를 가졌다 (도 31). 예방적으로 또는 구제 투여 레지멘에서 RLS-0071로 투여된 동물에서, 제22일 내지 제24일에 천식 래트로부터의 유리 DNA 수준에 비해 유리 DNA의 감소가 관찰되었지만, 유리 DNA의 수준은 샴 동물에서 보여지는 바와 같이 기준선 수준으로 복귀하지 않았다. 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, MPO 및 유리 DNA 수준의 감소는 RLS-0071이 호중구성 천식으로 처리된 동물의 BALF에서 호중구 매개 이펙터 기능을 감소시킬 수 있음을 입증하는 것이 가능하다.
논의
이 실시예의 목적은 항-염증성 분자 RLS-0071이 문헌 [An TJ, Rhee CK, Kim JH, Lee YR, Chon JY, Park CK, et al (2018) Effects of Macrolide and Corticosteroid in Neutrophilic Asthma Mouse Model. Tuberc Respir Dis (Seoul). Jan;81(1):80-87. doi: 10.4046/trd.2017.0108; Thakur VR, Khuman V, Beladiya JV, Chaudagar KK, Mehta AA (2019) An experimental model of asthma in rats using ovalbumin and lipopolysaccharide allergens. Heliyon. Nov 19;5(11):e02864. doi: 10.1016/j.heliyon.2019.e02864]으로부터 개조된 OVA/LPS 뮤린 모델에서 중증 또는 호중구성 천식을 완화시킬 수 있는지를 결정하는 것이었다. 다른 이들에 의해 주목된 바와 같이, OVA/LPS 레지멘은 NET 형성을 지시하는 방출된 MPO 및 유리 DNA에 의해 입증된 바와 같이 폐 내로의 호중구 유입, 혈관 염증, 및 호중구 활성화를 발생시켰다. RLS-0071은 시험관내, 생체내 및 생체외 연구에서 고전적 보체 활성화를 억제하고, 시험관내 및 생체외 연구에서 MPO의 억제를 통해 NET 형성을 억제하는 것으로 입증되었다. 보체 억제 및 호중구 조정의 이중 항-염증 활성을 고려하여, 본 발명자들은 RLS-0071이 이러한 동물 모델에서 호중구성 천식을 억제할 것으로 가설화하였다. 여기에 제시된 결과는 예방적으로 또는 구제 용량으로서 전달된 RLS-0071이 폐에서 호중구 격리 및 활성화를 감소시킬 수 있었음을 입증한다. 이는 폐에서의 감소된 호중구 카운트, 단백질의 감소된 수준, BALF에서의 네토시스에 대한 바이오마커로서 역할을 하는 MPO 및 유리 DNA에 의해 입증되었다.
천식은 병리학적 역할을 하는 다양한 염증성 세포 (호산구, 호염기구, 호중구, 단핵구, 대식세포 및 활성화된 비만 세포)를 갖는 만성 복잡한 염증성 질환이다. 염증성 세포로부터 방출된 다수의 염증성 매개자, 예컨대 인터류킨, 시토카인 및 류코트리엔은 천식의 염증 특징에 기여하며, 알레르겐에 의한 유형 1 헬퍼 T 세포 (Th1) 및 유형 2 헬퍼 T 세포 (Th2)의 활성화는 중요한 역할을 하는 것으로 믿어진다 [P.J. Barnes (1996) Pathophysiology of asthma, Br. J. Clin. Pharmacol. 42 (1) 3-10]. OVA 및 LPS의 이중 알레르겐 챌린지를 사용한 동물 모델은 짐작건대 TLR-4의 LPS 활성화에 의해 매개된 Th1 헬퍼 T 세포 반응이 호중구 활성화에 의해 유도된 천식의 중증 형태를 초래함을 입증하였다. 이러한 호중구-유도된 질환 과정은 스테로이드 또는 b2-효능제에 대해 불응성인 인간에서 보여지는 중증 천식을 모방한다. 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 이러한 설치류 모델에서 호중구성 천식을 완화시키는 RLS-0071의 능력은 RLS-0071이 스테로이드 불응성, 호중구성 천식에 대한 임상적 치료제로서의 유용성에 대한 잠재성을 가짐을 지시하는 것으로 제안된다. 추가로, 이는 이상조절된 면역 반응을 특징으로 하는 다른 급성 호중구-매개 폐 악화, 예컨대 COPD에서 효능을 가질 수 있다.
실시예 9: 혈관신생 및 VEGF에의 결합의 RLS-0071 및 RLS-0088-매개 조정
세포-기반 생물검정에서의 VEGF에의 RLS-펩티드 결합 및 VEGF 신호전달의 억제
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 상피 세포, 종양 세포 및 대식세포로부터 분비되는 중요한 신호전달 단백질이다. 이는 혈관신생의 자극, 혈관 침투성의 증가, 종양 침습 및 생존의 증진, 및 Treg 세포에서의 항종양 반응의 억제를 포함하는 많은 기능을 갖는다. 몇몇 VEGF 수용체 하위유형-VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3이 있다. VEGFR2 (일명 KDR)는 VEGF에 대한 거의 모든 공지된 수용체 세포 반응을 매개한다. VEGF 패밀리의 모든 구성원은 수용체 티로신 키나제의 수용체, 즉, VEGFR-1 (Flt-1) 및 VEGFR-2 (Flk-1/KDR)에 결합함으로써 세포 반응을 자극한다. VEGF가 KDR에 결합하는 경우, 수용체는 이량체화하고, 인산전이반응을 통해 활성화된다.
RLS-0071은 여기에서 본 발명자들의 2-히트 래트 급성 폐 손상 모델에서 VEGF를 하향조절하는 것으로 제시된다 (도 4). 본 발명자들은 RLS-0071 및 RLS-0088이 ELISA 기반 검정에서 인간 VEGF와 직접적으로 상호작용할 수 있는지를 결정하기를 희망하였다. VEGF를 미세역가 플레이트 상으로 코팅하고, 증가하는 농도의 RLS-0071와 인큐베이션하고, 이를 후속적으로 펩티드에 대한 항체, 이어서 2차 항체-HRP 접합체로 검출하였다. 이어서 HRP 접합체로부터 생성된 신호를 플레이트 판독기에서 450nm의 OD에서 판독하였다. 도 32에 제시된 바와 같이, RLS-0071은 C1q (양성 대조군)보다 더 큰 정도로 인간 VEGF에 용량-의존적으로 결합한다. VEGF에의 RLS-0071의 유의한 결합이 있지만, RLS-0088의 결합은 훨씬 덜 현저하였다 (도 33). VEGF의 결합이 기능적 활성과 상관되었는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 판독물로서 루시페라제를 사용하여 VEGF 자극 및 KDR (VEGFR-2)의 억제를 측정하는 생물발광 세포-기반 검정인 VEGF 생물검정 (프로메가)을 이용하였다. 이러한 검정은 VEGF 반응을 유도하거나 억제하는 것을 목표로 하는 신규한 생물제제 요법의 발견 및 개발을 위해 사용된다. VEGF 반응성 세포는 luc2P의 상류의 반응 요소 (RE), 뿐만 아니라 외인성 VEGF 수용체를 발현하도록 조작되었다. VEGF가 VEGF 반응성 세포에 결합하는 경우, 수용체는 세포내 신호를 전달하여 발광을 발생시킨다. 생물발광 신호는 바이오-글로™ 루시페라제 검정 시스템 및 표준 광도계를 사용하여 검출되고 정량화된다. 이러한 검정에서, VEGF는 양성 대조군이었으며, 증가하는 농도의 VEGF는 VEGFR-2에의 VEGF 결합을 지시하고 세포내 신호전달에 영향을 미치는 발광의 용량-의존적 증가를 발생시킨다 (도 34, 마름모로 표시된 선). RLS-0071 및 RLS-0088은 둘 다 VEGFR-2에의 VEGF 결합을 억제하여 세포내 신호전달의 용량-의존적 억제를 발생시킬 수 있었다 (도 34, 각각 정사각형 및 삼각형으로 표시된 선). 이들 결과는 RLS-0071 및 RLS-0088이 VEGF-매개 신호전달을 억제할 수 있다는 놀라운 발견을 입증한다. 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, RLS-0071 및 RLS-0088은 다양한 VEGF-매개 질환 과정을 억제하는 치료적 분자로서 유용성을 가질 수 있음이 제안된다.
세포-기반 검정에서의 비-VEGF 매개 혈관신생의 RLS-펩티드 억제
RLS-0071 및 RLS-0088이 VEGF-독립적 방식으로 혈관신생을 억제할 수 있는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 인간 제대 혈관 내피 세포 (HUVEC) 3-차원 배양 시스템을 이용하였다. 이러한 시스템에서, HUVEC 세포를 셀트레이스 염료로 염색하고, 37℃에서 1시간 동안 펩티드로 사전-처리하고, 10 ug/ml의 리포폴리사카라이드 (LPS)를 함유하는 세포외 매트릭스 (시그마(Sigma))와 혼합하고, 플레이팅하고, 이어서 습화된 인큐베이터에서 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. LPS는 세포가 비-VEGF 매개 혈관신생을 겪는 것을 유발할 수 있으며, 이는 현미경검사에 의해 관찰될 수 있는 내피 스프라우팅의 형성 및 관 형성을 발생시킨다. 도 35 및 36에 제시된 바와 같이, LPS를 받지 않은 세포 (비자극됨 (LPS 없음))는 혈관신생의 관찰가능한 징후를 갖지 않은 반면, LPS로 처리되고 펩티드로 처리되지 않은 세포 (0 mg/ml RLS-0071 패널)는 혈관신생을 지시하는 스프라우팅 및 발생기 관 형성을 나타낸다. 증가하는 양의 RLS-0071의 존재 하에서, 혈관신생의 용량-의존적 감소가 관찰되었다. RLS-0088은 또한 10mg/ml의 펩티드의 농도에서 혈관신생의 감소를 입증하였다. 상이한 세포외 매트릭스 (겔트렉스(Geltrex), 시그마)를 사용하고 셀트레이스 염료를 사용하지 않은 상이한 HUVEC 세포 시스템에서 RLS-0071로 동일한 결과가 얻어졌다. 또한 이들 검정의 각각에서 RLS-0071 및 RLS-0088의 상대 활성을 제시하는 표 3을 참조한다. 이들 결과는 RLS-0071 및 RLS-0088이 비-VEGF 매개 혈관신생을 억제할 수 있다는 놀라운 발견을 입증한다. 이론에 구애되기를 원하지는 않지만, RLS-0071 및 RLS-0088은 항-혈관신생 치료적 분자로서의 잠재성을 가질 수 있음이 가능하다.
표 3. RLS-0071 및 RLS-0088의 상대 활성
실시예 10: 안과 제제의 투여
서열식별번호: 2의 치료 유효량을 포함하는 안과 조성물은 안과 질환 또는 병태를 치료하기 위해 대상체의 눈에 투여된다. 투여는 국소 (예를 들어, 연고, 점안액, 폼, 아이 팩), 주사 (예를 들어, 유리체내 주사, 방수내 주사, 결막하 주사)를 통해, 또는 안구내 또는 유리체내 삽입물의 삽입을 통해서일 수 있다. 안과 질환 또는 병태는 세포 표면 수용체, 예컨대 인테그린 또는 ICAM, 예를 들어, ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5의 변경된 발현을 특징으로 할 수 있다. 비-제한적인 예시적인 안과 질환 또는 병태는 자가면역 및 감염성 포도막염, 망막염, AMD, DED, 감염성 및 비-감염성 각막염, 각막 손상 및 복구, 미숙아 망막병증 (ROP), 안구 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 (RVO) 후 황반 부종, 및 당뇨병성 황반 부종 (DME)을 포함한다.
실시예 11: 비강 제제의 투여
서열식별번호: 2의 치료 유효량을 포함하는 비강 조성물은 천식을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 투여는 흡입, 통기, 또는 분무화를 통해서일 수 있다. 조성물은 스프레이, 용액, 겔, 크림, 로션, 네뷸라이저를 위한 에어로졸 또는 용액의 형태로, 또는 통기를 위한 초미세 분말로서 존재할 수 있다. 천식은 세포 표면 수용체, 예컨대 인테그린 또는 ICAM, 예를 들어, ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5의 변경된 발현을 특징으로 할 수 있다. 천식의 비-제한적인 예시적인 유형은 중증 천식, 스테로이드-불응성 천식, 및 호중구성 천식을 포함한다.
실시예 11: 제약 제제의 투여
서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물은 질환 또는 병태를 치료하기 위해 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 투여는 임의의 적절한 경로 (예를 들어, 주사, 주입, 삽입, 국소 투여, 비강 투여)에 의한 것일 수 있다. 질환 또는 병태는 세포 표면 수용체, 예컨대 인테그린 또는 ICAM, 예를 들어, ICAM1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5의 변경된 발현을 특징으로 할 수 있다.
서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 보체계를 조절하기 위해 보체계의 조절을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 투여는 임의의 적절한 경로 (예를 들어, 주사, 주입, 삽입, 국소 투여, 비강 투여)에 의한 것일 수 있다.
서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 시토카인 발현을 변경시키기 위해 시토카인 발현의 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 투여는 임의의 적절한 경로 (예를 들어, 주사, 주입, 삽입, 국소 투여, 비강 투여)에 의한 것일 수 있다.
서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 호중구 결합 및/또는 부착을 억제하거나 변경시키기 위해 호중구 결합 및/또는 부착의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 투여는 임의의 적절한 경로 (예를 들어, 주사, 주입, 삽입, 국소 투여, 비강 투여)에 의한 것일 수 있다.
서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 호중구 생존을 개선시키기 위해 호중구 생존의 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 투여는 임의의 적절한 경로 (예를 들어, 주사, 주입, 삽입, 국소 투여, 비강 투여)에 의한 것일 수 있다.
서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제약 조성물은 대상체에서 세포 표면 수용체에의 호중구 결합을 억제하거나 변경시키기 위해 세포 표면 수용체에의 호중구 결합의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 투여는 임의의 적절한 경로 (예를 들어, 주사, 주입, 삽입, 국소 투여, 비강 투여)에 의한 것일 수 있다. 세포 표면 수용체의 비-제한적 예는 인테그린 및 ICAM, 예를 들어, ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및 ICAM-5를 포함한다.
하기는 본 발명에 포함되는 항목의 비-완전한 목록이다.
1. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 시토카인 발현의 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 시토카인 발현을 변경시키는 방법.
2. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 결합 및/또는 부착의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 결합 및/또는 부착을 억제하거나 변경시키는 방법.
3. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 생존의 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 생존을 개선시키는 방법.
4. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 세포 표면 수용체에의 호중구 결합의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면 수용체에의 호중구 결합을 억제하거나 변경시키는 방법.
5. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면 수용체의 변경된 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
6. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 급성 폐 손상 및/또는 급성 호흡 곤란 증후군을 치료하고/거나 예방하는 방법.
7. 서열식별번호: 2를 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이상조절된 보체 활성화 및/또는 호중구 조정을 특징으로 하는 안구 질환 및/또는 병태를 치료하고/거나 예방하는 방법.
8. 서열식별번호: 2를 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 천식을 치료하는 방법.
9. 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 조정하는 방법.
10. 조성물이 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 안정화제, 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 항목 1 내지 9 중 어느 하나의 방법.
11. 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg인 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.
12. 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 약 20 mg/kg 내지 약 160 mg/kg인 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.
13. 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 약 40 mg/kg 내지 약 160 mg/kg인 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.
14. 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 적어도 1개의 용량으로 투여되며, 제1 용량이 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 것인 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.
15. 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제2 용량이 투여되며, 제2 용량이 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 것인 항목 14의 방법.
16. 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 2개의 용량으로 투여되며, 제1 용량이 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하고, 제2 용량이 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 것인 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.
17. 조성물이 안과 투여를 위해 제제화되는 것인 항목 1 내지 16 중 어느 하나의 방법.
18. 조성물이 안과용으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 항목 17의 방법.
19. 안과 투여가 국소 투여, 안구주위 주사, 결막하 주사, 방수내 주사, 안구내 주사, 유리체내 주사, 또는 각막내 또는 안구내 삽입물의 도입을 포함하는 것인 항목 17 또는 18의 방법.
19. 세포 표면 수용체가 인테그린 또는 세포간 부착 분자 (ICAM)를 포함하는 것인 항목 4의 방법.
20. ICAM이 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5를 포함하는 것인 항목 19의 방법.
21. 질환 또는 병태가 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5 중 적어도 하나의 증가를 특징으로 하는 것인 항목 5의 방법.
22. 안구 질환 또는 병태가 보체 억제 및/또는 미엘로퍼옥시다제 활성 또는 네토시스의 억제를 특징으로 하는 것인 항목 7의 방법.
23. 안구 질환 또는 병태가 자가면역 및 감염성 포도막염, 급성 황반 변성 (AMD), 건성안 질환 (DED), 감염성 및 비-감염성 각막염, 각막 손상 및 복구, 미숙아 망막병증 (ROP), 안구 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 (RVO) 후 황반 부종, 및 당뇨병성 황반 부종 (DME)인 항목 7의 방법.
24. 천식이 중증 천식, 스테로이드-불응성 천식, 또는 호중구성 천식인 항목 8의 방법.
25. 조성물이 비강 투여를 위해 제제화되는 것인 항목 1 내지 16 중 어느 하나의 방법.
26. 비강 투여가 흡입, 통기, 또는 분무화를 포함하는 것인 항목 25의 방법.
27. 조성물이 스프레이, 용액, 겔, 크림, 로션, 네뷸라이저를 위한 에어로졸 또는 용액의 형태로, 또는 통기를 위한 초미세 분말로서 존재하는 것인 항목 25의 방법.
서열 목록
서열식별번호: 1: IALILEPICCQERAA
서열식별번호: 2: C-말단 단분산 24-mer PEG화된 모이어티를 함유하는 IALILEPICCQERAA-dPEG24 (RLS-0071; PA-dPEG24; 서열식별번호: 2)
서열식별번호: 3: 위치 8에 사르코신 잔기를 함유하는 IALILEP(Sar)CCQERAA (RLS-0088; PA-I8Sar; 서열식별번호: 3)
몇몇 가능한 실시양태가 상기 개시되어 있지만, 본 발명의 실시양태는 그렇게 제한되지 않는다. 이들 예시적인 실시양태는 완전한 것이거나 본 발명의 범주를 불필요하게 제한하는 것으로 의도되지 않지만, 대신 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있도록 본 발명의 원리를 설명하기 위해 선택되고 기재되었다. 사실, 본원에 기재된 것들 외에도 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 해당하는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허, 출원, 공보, 시험 방법, 문헌, 및 다른 물질은 본 명세서에 물리적으로 존재하는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> REALTA LIFE SCIENCES, INC.
<120> PEPTIDES AND METHODS OF USE
<130> 251110.000139
<140> PCT/US2021/052174
<141> 2021-09-27
<150> 63/185,831
<151> 2021-05-07
<150> 63/085,556
<151> 2020-09-30
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 1
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<223> C-terminal monodisperse 24-mer PEGylated moiety
<400> 2
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ile Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Sarcosine
<400> 3
Ile Ala Leu Ile Leu Glu Pro Xaa Cys Cys Gln Glu Arg Ala Ala
1 5 10 15
Claims (27)
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 시토카인 발현의 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 시토카인 발현을 변경시키는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 결합 및/또는 부착의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 결합 및/또는 부착을 억제하거나 변경시키는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 호중구 생존의 개선을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 호중구 생존을 개선시키는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 세포 표면 수용체에의 호중구 결합의 억제 또는 변경을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면 수용체에의 호중구 결합을 억제하거나 변경시키는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 표면 수용체의 변경된 발현을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 급성 폐 손상 및/또는 급성 호흡 곤란 증후군을 치료하고/거나 예방하는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이상조절된 보체 활성화 및/또는 호중구 조정을 특징으로 하는 안구 질환 및/또는 병태를 치료하고/거나 예방하는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 천식을 치료하는 방법.
- 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 합성 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 조정하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 안정화제, 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 약 20 mg/kg 내지 약 160 mg/kg인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 약 40 mg/kg 내지 약 160 mg/kg인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 적어도 1개의 용량으로 투여되며, 제1 용량이 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량을 포함하는 제2 용량이 투여되며, 제2 용량이 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 2 및/또는 3의 치료 유효량이 2개의 용량으로 투여되며, 제1 용량이 약 10 mg/kg 내지 약 160 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하고, 제2 용량이 약 40 mg/kg 내지 약 60 mg/kg 서열식별번호: 2 및/또는 3을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 안과 투여를 위해 제제화되는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 조성물이 안과용으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 안과 투여가 국소 투여, 안구주위 주사, 결막하 주사, 방수내 주사, 안구내 주사, 유리체내 주사, 또는 각막내 또는 안구내 삽입물의 도입을 포함하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 세포 표면 수용체가 인테그린 또는 세포간 부착 분자 (ICAM)를 포함하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, ICAM이 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5를 포함하는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 질환 또는 병태가 ICAM-1, ICAM-3, ICAM-4, 및/또는 ICAM-5 중 적어도 하나의 증가를 특징으로 하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 안구 질환 또는 병태가 보체 억제 및/또는 미엘로퍼옥시다제 활성 또는 네토시스(NETosis)의 억제를 특징으로 하는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 안구 질환 또는 병태가 자가면역 및 감염성 포도막염, 급성 황반 변성 (AMD), 건성안 질환 (DED), 감염성 및 비-감염성 각막염, 각막 손상 및 복구, 미숙아 망막병증 (ROP), 안구 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 (RVO) 후 황반 부종, 및 당뇨병성 황반 부종 (DME)인 방법.
[청구항 24]
제8항에 있어서, 천식이 중증 천식, 스테로이드-불응성 천식, 또는 호중구성 천식인 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 비강 투여를 위해 제제화되는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 비강 투여가 흡입, 통기, 또는 분무화를 포함하는 것인 방법.
- 제25항에 있어서, 조성물이 스프레이, 용액, 겔, 크림, 로션, 네뷸라이저를 위한 에어로졸 또는 용액의 형태로, 또는 통기를 위한 초미세 분말로서 존재하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (5)
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|---|---|---|---|
| US202063085556P | 2020-09-30 | 2020-09-30 | |
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| US202163185831P | 2021-05-07 | 2021-05-07 | |
| US63/185,831 | 2021-05-07 | ||
| PCT/US2021/052174 WO2022072272A2 (en) | 2020-09-30 | 2021-09-27 | Peptides and methods of use |
Publications (1)
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ID=80951791
Family Applications (1)
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