JP2023548001A - ペプチドおよび使用方法 - Google Patents

ペプチドおよび使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023548001A
JP2023548001A JP2023520207A JP2023520207A JP2023548001A JP 2023548001 A JP2023548001 A JP 2023548001A JP 2023520207 A JP2023520207 A JP 2023520207A JP 2023520207 A JP2023520207 A JP 2023520207A JP 2023548001 A JP2023548001 A JP 2023548001A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rls
seq
dose
therapeutically effective
effective amount
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023520207A
Other languages
English (en)
Inventor
ニール ケイ． クリシュナ
ケンジ クニオン
ウルリヒ ティーネル
Original Assignee
レアルタ ライフ サイエンシズ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by レアルタ ライフ サイエンシズ インコーポレイテッド filed Critical レアルタ ライフ サイエンシズ インコーポレイテッド
Publication of JP2023548001A publication Critical patent/JP2023548001A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、C末端ペグ化を含む極性アソータント（PA）ペプチドの合成修飾体であるペプチドを提供する。本発明は、さらに、補体系を調節し、かつ好中球と相互作用してその結合および活性を変化させるための、少なくとも1つの合成ペプチドの使用方法を提供する。TIFF2023548001000017.tif71155

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年9月30日に出願された米国仮出願第63/085,556号および2021年5月7日に出願された第63/185,831号に対して優先権を主張し、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。該ASCIIコピーは2021年9月16日に作成され、251110_000139_SL.txtと名付けられ、1,228バイトのサイズである。
1. 発明の分野
本発明の態様は、一般に、療法および診断のための合成ペプチドおよびその使用に関し、より具体的には、ペグ化形態の合成ペプチドに関する。
2. 背景
補体系
自然免疫系の必須の成分である補体系は、侵入する病原体に対する防御機構として重要な役割を果たし、適応免疫応答を刺激し、免疫複合体およびアポトーシス細胞を除去するのを助ける。以下の3つの異なる経路が補体系を含む：古典的経路、レクチン経路、および代替経路。C1qおよびマンノース結合レクチン（MBL）は、それぞれ、古典的経路およびレクチン経路の構造的に関連した認識分子である。IgMまたはクラスター化IgGはC1qに対する主なリガンドとして働くが、MBLはマンナンなどの多糖を認識する。C1qおよびMBLによるリガンド結合はC4およびC2の連続的活性化をもたらして、それぞれ、古典的経路およびレクチン経路のC3コンバターゼを形成する。これに対して、代替経路の活性化は認識分子を必要としないが、古典的経路またはレクチン経路によって惹起されるC3活性化を増幅することができる。これらの3つの経路のいずれかの活性化は、炎症性メディエーター（C3aおよびC5a）ならびに細胞溶解を引き起こす膜攻撃複合体（MAC）の形成をもたらす。
補体系は多くの保護的免疫機能で重要な役割を果たす一方で、補体活性化は、幅広い自己免疫性疾患および炎症性疾患のプロセスにおいて、組織損傷の重要なメディエーターである（Ricklin and Lambris, 「Complement-targeted therapeutics.」 Nat Biotechnol 2007; 25(11):1265-75）。
補体調節因子が必要とされている。一方では、補体系は病原性生物に対するきわめて重要な宿主防御である。他方では、その抑制されていない活性化は壊滅的な宿主細胞損傷を引き起こし得る。現在、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、および多発性硬化症などの自己免疫疾患を含めた多くの疾患プロセスにおける補体調節不全と関連する公知の罹患率および死亡率にもかかわらず、ヒトにおける使用について以下の2つの抗補体療法しか最近承認されていない：発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）および非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）の処置で使用されているC5に対する2つのヒト化長時間作用型モノクローナル抗体である、（1）エクリズマブ（Soliris（商標））および（2）ユルトミリス（Ravulizumab（商標））。PNHおよびaHUSは、非常に少数の人だけが苦しんでいる奇病である。現在、調節不全になった補体活性化が中心的役割を果たすより一般的な疾患プロセスについて承認されている補体調節因子はない。調節不全になった補体活性化は、慢性疾患徴候と急性疾患徴候の両方で役割を果たし得る。
補体系の古典的経路、レクチン経路、および代替経路を阻害するためのペプチドの開発が必要とされ、なぜならば、これらの3つの経路のそれぞれが、多数の自己免疫性疾患および炎症性疾患のプロセスに寄与することが示されているからである。古典的経路およびレクチン経路の特異的な遮断が特に必要とされ、なぜならば、これらの経路の両方が多くの動物モデルにおいて虚血再灌流誘導性傷害および他の疾患に関与しているからである。代替経路欠損を有するヒトは、重症の細菌感染症を患う。したがって、機能的代替経路が、侵入する病原体に対する免疫監視に必須である。
PIC1分子ファミリーは、スクランブル化されたアストロウイルスコートタンパク質に基づいて合理的に設計されたペプチドのコレクションを含み、これは、補体の古典的経路の阻害、ミエロペルオキシダーゼ阻害、好中球細胞外トラップ（NET）阻害、および抗酸化活性を含めたいくつかの抗炎症性機能特性を有する。元の化合物は、15アミノ酸ペプチド配列、
Figure 2023548001000002
であり、その水溶解度を高める、C末端の単分散24merペグ化部分
Figure 2023548001000003
を有する。PA-dPEG24分子のさらなる特徴は本明細書に記載される。
補体系および眼疾患
補体系は、免疫恒常性の維持および病原体からの眼の保護において活性があり、これは、潜在的な感染を制御するために、補体活性化分子と補体調節分子の間の複雑な相互作用を含む。補体系は免疫監視に必要であるが、過剰かつ調節不全になった補体活性化は、多くの眼内炎症性疾患および角膜炎症性疾患、例えば、自己免疫性および感染性ブドウ膜炎、急性黄斑変性（AMD）、ドライアイ疾患（DED）、感染性および非感染性角膜炎、角膜の傷害および修復、未熟児網膜症（ROP）、眼移植片対宿主病（GvHD）、糖尿病性網膜症（Jha et al., 2007）、網膜静脈閉塞症（RVO）後の黄斑浮腫、ならびに糖尿病黄斑浮腫（DME）に関与している。
好中球、好中球細胞外トラップ、および眼疾患
最近、マウスモデルおよびAMD患者の死体のヒトの眼でのエクスビボ研究で見られたように、好中球がAMDの発病で重要な役割を果たすことが示されたことが報告された（Ghosh et al., 2019）。これらの研究では、ヒトの眼およびマウスの眼の両方におけるインターフェロンラムダの上昇が確認され、インターフェロンラムダのこの高発現により静脈循環から網膜への好中球の遊出が誘導され、最終的に、眼への病的損傷がもたらされた。
眼疾患における好中球の一般化された役割に加えて、好中球細胞外トラップ（NET）は、様々な他の眼疾患、例えば、角膜の慢性炎症、DED、感染性角膜炎、角膜傷害、眼のGvHD、非感染性ブドウ膜炎（例えば、ベーチェット病）、ならびに感染性ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、および最終的にはAMDにおいて病原性の役割を特に果たすことが示されている（Estua-Acosta et al., 2019; Ghosh et al., 2019）。特に、AMDの場合は、NETosisバイオマーカー、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）、好中球エラスターゼ、およびシトルリン化ヒストンH3は、AMDのマウスモデルにおける発病に寄与することが示されている（Ghosh et al., 2019）。
補体系ならびに急性肺傷害（ALI）および急性呼吸窮迫症候群（ARDS）
ALIは、しばしば、ARDSに進行し、著しい罹患率および死亡率をもたらす可能性がある、重症の外傷の合併症である［Maca J, Jor O, Holub M, Sklienka P, Bursa F, Burda M, et al. Past and Present ARDS Mortality Rates: A Systematic Review. Respir Care 2017;62(1):113-122］。現在までに、ALIを防止するための薬理学的介入はなく、現在の標準的なケアは事実上支持的である。ALIは、患者の根底にある臨床状態（例えば、炎症、外傷、低血圧）と輸血などの二次的侵襲（輸血関連ALI（TRALI）、蘇生、放射線照射）［Cho MS, Modi P, Sharma S. Transfusion-related Acute Lung Injury. 2020; In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan; Kumar AK, Anjum F. Ventilator-Induced Lung Injury (VILI). 2020 Dec 15. In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan; Arroyo-Hernandez M, Maldonado F, Lozano-Ruiz F, Munoz-Montano W, Nunez-Baez M, Arrieta O. Radiation-induced lung injury: current evidence. BMC Pulm Med 2021;21(1):9.］またはウイルス性肺炎（例えば、インフルエンザ、呼吸系発疹ウイルス、もしくはコロナウイルス関連ALI）［Klomp M, Ghosh S, Mohammed S, Nadeem Khan M. From virus to inflammation, how influenza promotes lung damage. J Leukoc Biol 2020;Sep 8; Alvarez AE, Marson FA, Bertuzzo CS, Arns CW, Ribeiro JD. Epidemiological and genetic characteristics associated with the severity of acute viral bronchiolitis by respiratory syncytial virus. J Pediatr (Rio J)2013;89(6):531-43; Lee C, Choi WJ. Overview of COVID-19 inflammatory pathogenesis from the therapeutic perspective. Arch Pharm Res 2021;Jan 4:1-18］との組み合わせから生じ得る。二次的侵襲は異なる可能性があるが、肺不全につながる急速に進行する疾患プロセスは、過剰な補体および好中球媒介性炎症反応によって引き起こされる、誇張されかつ圧倒的な自然免疫学的応答または炎症応答によって典型的には媒介される。ALIに加えて、調節不全になった好中球および補体活性化は、慢性肺疾患、例えば、COPDおよびステロイド抵抗性好中球性喘息の急性増悪の重要なメディエーターである［Pandya PH, Wilkes DS. Complement system in lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol 2014; 51:467-473; Khan MA, Nicolls MR, Surguladze B, Saadoun I. Complement components as potential therapeutic targets for asthma treatment. Respir Med 2014;108:543-549］。
輸血関連死亡の主因のうちの1つに相当するTRALIの場合は、この疾患プロセスは複雑であり、十分に理解されていないが、「2ヒット」モデルは、現在、臨床状況を最も正確に例証すると考えられており、第1のヒットは患者の根底にある臨床状態によって媒介され、第2のヒットは輸血ユニット中の成分によって誘発される［Silliman CC, Paterson AJ, Dickey WO, Stroneck DF, Popovsky MA, Caldwell SA, et al. The association of biologically active lipids with the development of transfusion-related acute lung injury: a retrospective study. Transfusion 1997;37(7):719-26; Silliman CC, McLaughlin NJ. Transfusion-related acute lung injury. Blood Rev 2006;20(3):139-59］。様々なインビトロ、インビボ、およびエクスビボ研究によって、直接的活性化、活性酸素種（ROS）の形成、および好中球細胞外トラップ（NET）の形成を介し、急性肺傷害（ALI）をもたらすTRALIの発病における中心的存在として、好中球を関係づけた［Rebetz J, Semple JW, Kapur R. The Pathogenic Involvement of Neutrophils in Acute Respiratory Distress Syndrome and Transfusion-Related Acute Lung Injury. Transfus Med Hemother 2018;45(5):290-298］。さらに、補体系が好中球とのC3aおよびC5aの相互作用を介してTRALIで役割を果たし、好中球活性化ならびにROSおよびNET形成をもたらす可能性があることが以前に仮定された［Jongerius I, Porcelijn L, van Beek AE, Semple JW, van der Schoot CE, Vlaar APJ, et al. The Role of Complement in Transfusion-Related Acute Lung Injury. Transfus Med Rev 2019;33(4):236-242］。
喘息
気管支喘息は、好酸球性喘息、好中球性喘息、混合顆粒球性喘息、および顆粒球寡少型喘息を含む、異なる免疫病理学的機構によって媒介される慢性の不均一な炎症性疾患である。喘息の患者の3.6～10％が、喘息の処置のために使用される標準的薬物に相当するコルチコステロイドおよびβ2-アゴニストに不応性である、重症の制御されていない疾患を有することが推定される［Syabbalo N (2020) Clinical Features and Management of Neutrophilic Asthma. J Pulm Med Respir Res 6: 036］。好中球性喘息は、成人に見られる急性の重症の喘息の最も一般的な形態である。好中球性喘息の患者は、頻繁な救急科来院、入院、および挿管を特徴とし、患者のおよそ23％で突発性の致死的喘息をともなう［Fahy JV, Kim KW, Liu J, Boushey HA (1995) Prominent neutrophil inflammation in sputum from subjects with asthma exacerbations. J Allergy Clin Immunol 95: 843-852; Sur S, Crotty TB, Kephart GM, Hyama BA, Colby TV, et al. (1993) Sudden-onset fatal asthma: A distinct entity with few eosinophils and relatively more neutrophils in the airway mucosa? Am Rev Respir Dis 148:713-719］。ステロイド不応性の好中球性喘息を制御することができないことは、現在、未だ対処されていない臨床的必要性に相当する。
重症の喘息における好中球の病態生理学的役割は、ヒトのエクスビボ研究で示されている。最近、NET、細胞外DNAおよび他の好中球由来産物は、重症の喘息に対する可能性のあるバイオマーカーおよび治療標的として考えられている［Lachowicz-Scroggins ME, Dunican EM, Charbit AR, Raymond W, Looney MR, Peters MC, et al. (2019) Extracellular DNA, Neutrophil Extracellular Traps, and Inflammasome Activation in Severe Asthma. Am J Respir Crit Care Med. 199(9):1076-1085; Varricchi G, Modestino L, Poto R, Cristinziano L, Gentile L, Postiglione L, et al. (2021) Neutrophil extracellular traps and neutrophil-derived mediators as possible biomarkers in bronchial asthma. Clin Exp Med. 2021 Aug 3. doi: 10.1007/s10238-021-00750-8］。
本発明者らは、PIC1ペプチドが好中球活性をモジュレートすることができることを発見し、そのため、オボアルブミン（OVA）およびリポ多糖（LPS）アレルゲンを使用して、好中球性喘息のラットモデルにおいてRLS-0071の有効性を評価した。
血管新生
血管新生は、新しい血管が既存の血管から生じ、出芽および分裂のプロセスによって血管構造の成長が続くプロセスである。血管新生は、成長および発達における正常な生理的プロセスであり、創傷治癒において、および肉芽組織の形成において重要な役割も果たす。しかし、これはまた、腫瘍の成長において重要な因子であり、かつ急性黄斑変性（AMD）、未熟児網膜症（ROP）、および糖尿病性網膜症などの多くの眼の状態において病原性の役割を果たし、これらは、それぞれ、癌および眼科的疾患の処置において血管新生阻害剤の使用につながる。VEGFは、血管新生のプロセスの主な存在であり、多くの血管新生阻害薬物はVEGFを標的にする。しかし、VEGF非依存的血管新生も、様々な炎症性疾患状況で起こる。したがって、本発明者らは、VEGFに対するPIC1ペプチドの効果を研究したいと考えた。
補体系の異なる経路のペプチドベースの阻害剤が当技術分野において必要である。眼部の疾患および／または状態ならびにALIおよび／またはARDS、喘息を処置するための、ならびに血管新生をモジュレートするための、治療用ペプチドも、当技術分野において必要である。
発明の簡単な概要
背景セクションで明記したように、補体系の異なる経路のペプチドベースの阻害剤のための技術を特定すること、および新規な治療用ペプチドを開発するためにこの知識を使用することが当技術分野において大いに必要である。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。本発明の態様は、一般に合成ペプチド、より具体的にはペグ化された合成ペプチド、ならびに補体系を調節し、かつ好中球と相互作用してその結合および他の活性を調節する方法におけるそれらの使用に関する。
一局面では、本発明は、補体系を調節する合成ペプチドおよびこれらのペプチドの使用方法を提供する。特に、いくつかの態様では、合成ペプチドは、C1およびMBLに結合し、C1およびMBLを調節し、C1およびMBLを不活性化することができ、したがって、代替経路をインタクトなままにしながら、補体カスケードのその最も初期の時点で古典的経路およびレクチン経路の活性化を効率的に阻害することができる。これらのペプチドは、代替経路に影響を及ぼすことなくC1およびMBLの活性化を選択的に調節および阻害するために治療的価値があり、古典的経路およびレクチン経路の調節不全になった活性化によって媒介される疾患を処置するために使用することができる。他の態様では、本ペプチドは、古典的経路の活性化を調節するが、レクチン経路の活性化は調節しない。本ペプチドは、様々な治療的適応症に有用である。
他の態様では、合成ペプチドは、限定されないが、ALIおよび／またはARDSのモデルにおけるサイトカインの発現を含めて、サイトカインの発現を変化させることができる。
他の態様では、合成ペプチドは、好中球の結合および／または接着を阻害するかまたは変化させることができる。
他の態様では、合成ペプチドは、好中球の生存を向上させることができる。
他の態様では、合成ペプチドは、インビボで、例えば、限定されないが、インテグリンおよび細胞間接着分子（ICAM）などの細胞表面受容体に結合することができる。
いくつかの態様では、本発明は、極性アソータント（Assortant）（PA）ペプチド（SEQ ID NO:1）からの15アミノ酸のペプチドの特定および修飾、本ペプチドの誘導体、ならびにそれらの使用方法に基づく。PAペプチドは、CP1と呼ばれるヒトアストロウイルスタンパク質に由来するスクランブルペプチドである。PAペプチドは、PIC1（補体C1のペプチド阻害剤）、AstroFend、AF、またはSEQ ID NO:1としても公知である。PIC1ペプチドは、これが、補体系によって媒介される疾患と関連することが見出されたので、最初にそのように名付けられた。PA-dPEG24（SEQ ID NO:2；RLS-0071）と呼ばれる、ペグ化形態のPIC1ペプチドは、本ペプチドのC末端に24個のPEG単位を有し、水溶液中の溶解度が向上していることが示された。PA-I8Sar（SEQ ID NO:3；RLS-0088）と呼ばれるPIC1ペプチドのサルコシン置換形態は、本ペプチドの8位のイソロイシンと置換されたサルコシンを有する。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、サイトカインの発現を変化させる方法を提供する。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の結合および／または接着を阻害するかまたは変化させる方法を提供する。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の生存を向上させる方法を提供する。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、細胞表面受容体への好中球の結合を阻害するかまたは変化させる方法を提供する。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、細胞表面受容体の発現の変化を特徴とする疾患または状態を処置する方法を提供する。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、ALIおよびARDSを処置および／または防止する方法を提供する。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、調節不全になった補体活性化および／または好中球モジュレーションを特徴とする眼の疾患および／または状態を処置および／または防止する方法を提供する。いくつかの態様では、眼の疾患または状態は、補体阻害および／またはミエロペルオキシダーゼ活性もしくはNETosisの阻害を特徴とする。いくつかの態様では、眼の疾患または状態は、自己免疫性および感染性ブドウ膜炎、急性黄斑変性（AMD）、ドライアイ疾患（DED）、感染性および非感染性角膜炎、角膜の傷害および修復、未熟児網膜症（ROP）、眼移植片対宿主病（GvHD）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（RVO）後の黄斑浮腫、ならびに糖尿病黄斑浮腫（DME）である。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、喘息を処置する方法を提供する。いくつかの態様では、喘息は、重症の喘息、ステロイド不応性喘息、または好中球性喘息である。
一局面では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、血管新生をモジュレートする方法を提供する。
前述の方法のいずれかの一態様では、組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、安定化剤、または賦形剤をさらに含む。前述の方法のいずれかの一態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、約10mg/kg～約160mg/kgである。前述の方法のいずれかの一態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、約20mg/kg～約160mg/kgである。前述の方法のいずれかの一態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、約40mg/kg～約160mg/kgである。前述の方法のいずれかの一態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、少なくとも1つの用量で投与され、第1の用量は、約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む。前述の方法のいずれかの一態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量を含む第2の用量が投与され、第2の用量は、約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む。前述の方法のいずれかの一態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、2つの用量で投与され、第1の用量は、約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含み、第2の用量は、約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む。いくつかの態様では、第2の用量は、第1の用量が投与されてから30秒～3時間後に投与される。前述の方法のいずれかの一態様では、組成物は、眼部投与のために製剤化される。一態様では、組成物は、眼科的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。前述の方法のいずれかの一態様では、眼部投与は、局所投与、眼周囲注射、結膜下注射、房水内（intra-aqueous）注射、眼内注射、硝子体内注射、または角膜内もしくは眼内インプラントの導入を含む。前述のいずれかの一態様では、組成物は、経鼻投与のために製剤化される。前述のいずれかの一態様では、経鼻投与は、吸入、吹送、または噴霧を含む。前述のいずれかの一態様では、経鼻組成物は、スプレー、溶液、ゲル、クリーム、ローション、エアロゾル、もしくはネブライザー用の溶液の形態であるか、または吹送用の超微粒粉末としてである。
前述のいずれかの一態様では、細胞表面受容体は、インテグリンまたは細胞間接着分子（ICAM）を含む。前述のいずれかの一態様では、ICAMは、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／またはICAM-5を含む。前述のいずれかの一態様では、疾患または状態は、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／またはICAM-5の少なくとも1つの増加を特徴とする。
本発明のこれらのおよび他の目的、特徴および利点は、添付の説明、特許請求の範囲、および図面とともに以下の明細書を読めばより明らかになるであろう。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図は、以下に記載のいくつかの局面を図示する。
図1は、不適合赤血球輸血の前または後に送達されるPA-dPEG24（本明細書において、RLS-0071とも称される）の静脈内（IV）投与が、IFNガンマ、IL-6、IL-2、IL-10、TNFアルファ、MCP-1、RANTES、MIP1アルファ、IL-1ベータ、MIP-2のレベルを低減させることを示す。シャム動物、ならびにLPS単独、LPS＋30％輸血、ならびにLPS＋30％輸血と輸血の前に投与される単回用量の10もしくは160mg/kgのRLS-0071（予防）または輸血の後に投与される単回用量の40および160mg/kgのRLS-0071（レスキュー）を受けた動物から得た最終の採血からのサイトカインレベルを、xMAPビーズベースのイムノアッセイによって決定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。LPS＋30％輸血と比較して、*はP<0.05を表し、**はP<0.01を表す。 図2は、不適合赤血球輸血の前または後に送達されるRLS-0071の静脈内（IV）投与が、IL-5、IL-18、IL-1アルファ、IL-13、IL-17、IL-12、およびIP-10のレベルを低減させることを示す。シャム動物、ならびにLPS単独、LPS＋30％輸血、ならびにLPS＋30％輸血と輸血の前に投与される単回用量の10もしくは160mg/kgのRLS-0071（予防）または輸血の後に投与される単回用量の40および160mg/kgのRLS-0071（レスキュー）を受けた動物から得た最終の採血からのサイトカインレベルを、xMAPビーズベースのイムノアッセイによって決定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。LPS＋30％輸血と比較して、*はP<0.05を表し、**はP<0.01を表す。 図3は、不適合赤血球輸血の前または後に送達されるRLS-0071の静脈内（IV）投与が、抗炎症性サイトカインIL-4のレベルに有意に影響を及ぼさないことを示す。シャム動物、ならびにLPS単独、LPS＋30％輸血、ならびにLPS＋30％輸血と輸血の前に投与される単回用量の10もしくは160mg/kgのRLS-0071（予防）または輸血の後に投与される単回用量の40および160mg/kgのRLS-0071（レスキュー）を受けた動物から得た最終の採血からのIL-4を、xMAPビーズベースのイムノアッセイによって決定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。 図4は、EGF、LIX、VEGF、レプチン、GRO、フラクタルカイン、GM-CSF、エオタキシン、およびG-CSFのレベルに対する、不適合赤血球輸血の前または後に送達されるRLS-0071の静脈内（IV）投与の効果を示す。シャム動物、ならびにLPS単独、LPS＋30％輸血、ならびにLPS＋30％輸血と輸血の前に投与される単回用量の10もしくは160mg/kgのRLS-0071（予防）または輸血の後に投与される単回用量の40および160mg/kgのRLS-0071（レスキュー）を受けた動物から得た最終の採血からのサイトカインおよび増殖因子レベルを、xMAPビーズベースのイムノアッセイによって決定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。LPS＋30％輸血と比較して、*はP<0.05を表し、**はP<0.01を表す。 図5A～Bは、未処置の動物と比較して、400mg/kgのPA-dPEG24の静脈内（IV）投与を受けたラットからのRLS-0071についての肝臓（5A）および腎臓（5B）組織の染色を示す。肝臓（5A）および腎臓（5B）組織切片をRLS-0071について染色し、20倍および40倍の拡大率で顕微鏡によって可視化した。茶色の染色は、組織中のRLS-0071の存在を示す。肝臓切片中の赤色の矢印は、点状のRLS-0071の染色を表す。 図6は、RLS-0071についての免疫蛍光染色を示し、これは、本ペプチドがヒト好中球に結合することを示す。ヒト好中球をガラススライド上に接着させ、パラホルムアルデヒドで固定し、次いで、RLS-0071の存在または非存在下でインキュベートした。次いで、スライドをRLS-0071に対する抗体（ニワトリ抗PIC1）、その後の標識された二次抗体（抗ニワトリ、Alexa Fluor 488）で染色し、DAPIで対比染色した。続いて、顕微鏡によって細胞を可視化した。 図7は、RLS-0071がガラススライドへのヒト好中球の接着を阻害することを示す。画像は、漸増濃度のRLS-0071の存在下でガラススライドの表面に接着したヒト好中球を示す。好中球をDAPIで染色し、蛍光顕微鏡で画像化した。代表的な画像を示す。底部右パネルのグラフは、漸増濃度のRLS-0071とインキュベートし、その後に、PBSで洗浄してからガラススライド上に設置し、2.5時間インキュベートした後にガラススライドに接着している好中球の数を示す。Hisは、ヒスチジン緩衝液（pH6.5）のみで処理した細胞を表す。データはn=4±SEMの平均値である。 図8は、RLS-0071がフィブリノーゲン処理ありおよび処理なしの両方で、ガラススライドへのヒト好中球の接着を阻害することを示す。画像は、漸増濃度のPA-DPEG24の存在下で、フィブリノーゲンをコーティングしたガラススライドの表面に接着したヒト好中球を示す。好中球をDAPIで染色し、蛍光顕微鏡で画像化した。代表的な画像を示す。底部右パネルのグラフは、漸増濃度のRLS-0071とインキュベートし、その後に、PBSで洗浄してからフィブリノーゲンでコーティングしたガラスまたは未処理のガラススライド上に設置し、2.5時間インキュベートした後の好中球の数を示す。 図9は、生存率（生細胞の数）の指標として細胞呼吸を測定するCCK8アッセイによって測定した場合に、RLS-0071がヒト好中球の生存率を高めることを示す。RLS-0071は、CCK8アッセイにおいて、ヒト好中球の生存率を用量依存的に高める。PBSまたはRPMI中の細胞を漸増量のRLS-0071とともにインキュベートした。「新鮮」は、精製プロセスが完了した直後にCCK8とともに37℃で2時間プレーティングした、操作されていない細胞を表す。 図10は、RLS-0071が好中球受容体LFA-1と上皮細胞受容体ICAM-1の両方に結合することができることを示す。RLS-0071は、精製された内皮細胞受容体および好中球細胞受容体に選択的に結合する。プレートを精製された好中球受容体LFA-1およびMAC-1ならびに内皮細胞受容体ICAM-1およびICAM-2でコーティングし、次いで、緩衝液中で漸増量のRLS-0071とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、ウサギ抗RLS0071抗血清とともにインキュベートし、洗浄し、次いで、抗ウサギHRPとともにインキュベートした。プレートを再び洗浄し、発色させた。450nmで吸光度を読み取った。PIC1=RLS-0071。RLS-0071結合に対する陽性対照としてC1qを使用した。 図11は、RLS-0071が上皮細胞受容体ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、およびICAM-5に結合することができることを示す。プレートを、精製された好中球受容体ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4、およびICAM-5でコーティングし、次いで、緩衝液中で漸増量のRLS-0071とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、ウサギ抗RLS0071抗血清とともにインキュベートし、洗浄し、次いで、抗ウサギHRPとともにインキュベートした。プレートを再び洗浄し、発色させた。450nmで吸光度を読み取った。RLS-0071結合に対する陽性対照としてC1qを使用し、陰性対照としてICAM-2を使用した。 図12は、RLS-0071が血漿中の好中球受容体LFA-1または内皮細胞ICAM-1に結合することができることを示す。プレートを、精製された受容体でコーティングし、次いで、ヒト血漿中の漸増量のRLS-0071とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、アフィニティー精製されたウサギ抗RLS0071抗血清とともにインキュベートし、洗浄し、次いで、抗ウサギHRPとともにインキュベートした。プレートを再び洗浄し、発色させた。450nmで吸光度を読み取った。PIC1=RLS-0071。RLS-0071結合に対する陽性対照として、C1qおよびMPO（ミエロペルオキシダーゼ）を使用した。 図13は、20mg/kgの[14C]-PIC1-RLS-0071の単回IV投与後の雄のSprague-Dawley系ラットから血漿をプールした時点のラジオクロマトグラムを示す。 図14は、200mg/kgの[14C]-PIC1-RLS-0071の単回IV投与後の雄のSprague-Dawley系ラットから血漿をプールした時点のラジオクロマトグラムを示す。 図15は、RLS-0071がヒト単球上の受容体に結合するC1q免疫複合体の結合を妨げないことを示す。ヒト単球を精製し、マイクロタイタープレートに接着させた。漸増量のRLS-0071の存在下で、熱凝集ヒト免疫複合体をC1qに結合させた。次いで、これらの複合体を単球に結合させ、次いで、洗浄し、結合したC1q／免疫複合体を一次抗体、その後の二次抗体-HRPで検出し、TMBで発色させた。450nmで吸光度を読み取った。N=3。バーは平均値の標準誤差（SEM）を示す。 図16A～16Cは、RLS-0071が血液中の炎症性サイトカインのレベルを低減させることを示す。以下の実験群について、最終の採血からのIL-1a、IFN-g、IL-1b、IL-6（16A）；IL-17、IL-18、TNFa、およびRANTES（16B）；IL-4、IL-10、およびVEGF（16C）のサイトカインレベルを、xMAPビーズベースのイムノアッセイによって決定した：シャム、第1のヒットのみ、2ヒット、2ヒット＋10mg/kgの予防用量のRLS-0071、2ヒット＋160mg/kgの予防用量のRLS-0071、ならびに2ヒット＋40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071および2ヒット＋160mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071。明確にするために、レスキュー投与のデータのみを示す。データは平均値および平均値の標準誤差である。*は、2ヒットの侵襲を受けた動物と比較して、P<0.05を表す。 図17A～17Cは、RLS-0071が血液中の炎症性ケモカインのレベルを低減させることを示す。以下の実験群について、最終の採血からの（17A）MCP-1、(17B）MIP-1a、および（17C）MIP-2のケモカインレベルを、xMAPビーズベースのイムノアッセイによって決定した：シャム、第1のヒットのみ、2ヒット、2ヒット＋10mg/kgの予防用量のRLS-0071、2ヒット＋160mg/kgの予防用量のRLS-0071、ならびに2ヒット＋40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071および2ヒット＋160mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071。明確にするために、レスキュー投与のデータのみを示す。データは平均値および平均値の標準誤差である。*は、2ヒットの侵襲を受けた動物と比較して、P<0.05を表す。 図18A～18Kは、RLS-0071の予防投与またはレスキュー投与が急性肺傷害を低減させることを示す。ラットの肺の代表的な組織診断（H&E染色）。(18A)シャム対照、(18B)第1のヒットのみ、(18C)2ヒット、(18D)2ヒット＋10mg/kgの予防用量のRLS-0071、(18E)2ヒット＋40mg/kgの予防用量のRLS-0071、(18F)2ヒット＋160mg/kgの予防用量のRLS-0071、(18G)2ヒット＋0.5分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071、(18H)2ヒット＋60分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071、(18I)2ヒット＋90分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071、(18J)2ヒット＋120分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071、および(18K)2ヒット＋180分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071。バーは100μmを表す。室温で20倍の拡大率で顕微鏡（BX50, Olympus）を用いて組織を観察した。デジタルカメラ（DP70, Olympus）で画像を取得した。 図19は、RLS-0071の予防投与またはレスキュー投与が好中球媒介性肺傷害を低減させることを示す。H&E染色した肺組織画像を白黒に変換し、ImageJ解析によって定量化した。黒対白のピクセルの比を計算し、肺傷害の尺度（Y軸）として使用した。シャム対照動物（n=3）、第1のヒットのみ（n=2）、2ヒット（n=3）、2ヒット＋10mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=4）、2ヒット＋40mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=6）、2ヒット＋160mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=9）、2ヒット＋0.5分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=4）、2ヒット＋60分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）、2ヒット＋90分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=5）、2ヒット＋120分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）、および2ヒット＋180分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）。各動物について、スライドあたり10枚以上の画像を定量化した。データは平均値および平均値の標準誤差である。統計解析は、一般化線形モデルを使用して行った。2ヒット動物と比較して、*はp=0.002表し、**はp<0.001を表す。 図20は、RLS-0071が補体活性化を阻害することを示す。第1のヒットより前（0分）ならびに5分および1時間で、シャム動物（n=3）および以下の群から血漿を単離した：第1のヒットのみ（n=3）、2ヒット（n=3）、2ヒット＋10mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=8）、2ヒット＋40mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=4）、2ヒット＋160mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=5）、2ヒット＋0.5分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=5）、2ヒット＋60分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）、2ヒット＋90分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=5）、2ヒット＋120分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）、および2ヒット＋180分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）。次いで、ELISAによって各試料でC5aを測定し、450nmで吸光度を読み取った。すべての時点について、各動物について2回の反復実験を測定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。統計解析は、ブートストラップアプローチまたはWelchのANOVAを使用して行った。2ヒット動物と比較して、*はp=0.010を表し、**はp=0.004を表し、***はp=0.002を表し、****はp≦0.001表す。 図21は、RLS-0071が血液中の遊離DNAレベルを低減させることを示す。実験開始から4時間後にシャム動物（n=3）および以下の群血漿を単離した：第1のヒットのみ（n=3）、2ヒット（n=3）、2ヒット＋10mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=9）、2ヒット＋40mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=4）、2ヒット＋160mg/kgの予防用量のRLS-0071（n=5）、2ヒット＋0.5分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=4）、2ヒット＋60分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）、2ヒット＋90分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=5）、2ヒット＋120分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）、および2ヒット＋180分での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（n=3）。血漿試料をPicoGreenとともにインキュベートした。マイクロプレートリーダー中で485nmの励起波長および520nmの発光波長で蛍光を読み取った。各動物についてのすべての遊離DNAの測定は3連で行った。データは平均値および平均値の標準誤差である。統計解析は、ブートストラップアプローチまたはWelchのANOVAを使用して行った。2ヒット動物と比較して、*はp=0.026を表し、**はp=0.039を表し、***はp=0.005を表す。 図22A～22Dは、硝子体内（IVT）注射を介して送達されたRLS-0071が静脈内（IV）投与されたRLS-0071よりも長い半減期を有していたことを示す。（22A）および（22B）：160mg/mlのRLS-0071でIVT投与されたラットを指定された時点で安楽死させ、硝子体液を単離した。(22C)および(22D)：200mg/mlのRLS-0071でIV投与されたラットから指定された時点で採血し、血漿を単離した。次いで、硝子体および血漿試料をサンドイッチELISA法で解析して、RLS-0071のレベルを検出した。パネル22Bと22Dはそれぞれパネル22Aと22Cと同一であり、後期の時点のペプチドレベルを強調するようにY軸をスケール変更した。 図23は、IVT介して送達されたRLS-0071が投与から1時間後に網膜組織を染色したことを示す。食塩水または160mg/kgのRLS-0071でラットにIVT注射した。食塩水の注入から5分後またはRLS-0071の注入から1時間後に動物を安楽死させ、眼を組織診断およびRLS-0071に対する抗体による染色、その後のDAB染色による検出のために処理した。IVTから5分後（左パネル）およびIVTから1時間後（右パネル）に、4倍（上部パネル）および20倍（底部パネル）の拡大率で顕微鏡によって画像を観察した。 図24は、急性肺傷害の2ヒットラットモデルの血漿で測定されたC5a産生を示す。 図25は、2ヒットALIモデルにおいて第2のヒットとして輸血された不適合赤血球が古典的補体経路を活性化し、血漿で測定される遊離ヘモグロビンを血液中に放出する溶血を引き起こすことを示す。食塩水処置した動物を中央のカラムに示し、RLS-0071動物を右側のカラムに示す。左側のカラムのシャム動物は輸血されなかった。 図26は、2ヒットALI動物から得られた血漿に対するCH50アッセイの結果を示す。食塩水処置した動物を右側のカラムに示し、RLS-0071動物を左側のカラムに示す。 図27は、重症の喘息に対するRLS-0071の効果を試験するための実験計画を示す。 図28は、RLS-0071が喘息ラットの気管支肺胞洗浄液（BALF）中の好中球レベルを低減させることを示す。上部パネル：以下の各実験群について代表的なBALF画像を示す：シャム対照、腹腔内オボアルブミン（OVA）／リポ多糖（LPS）プロトコールを受けた動物（喘息、24日目）、21、22、23日目に予防用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた喘息動物、ならびに22および23日目にレスキュー用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた動物。24日目にすべての動物を屠殺し、BALFを収集した。室温で40倍の拡大率で顕微鏡（BX50, Olympus）によってBALFを観察した。デジタルカメラ（DP70, Olympus）で画像を取得した。下部のパネル：二人の独立の読み取り者による白血球の定量化。細胞数を全体のパーセントとして表した。データは平均値および平均値の標準誤差である。*は、喘息動物と比較して、P<0.03を表す。 図29は、RLS-0071が喘息ラットのBALF中のタンパク質レベルを低減させることを示す。以下の実験群を評価した：シャム動物（非刺激）、OVA/LPSプロトコールを受けた動物（喘息）、21、22、23日目に予防用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた喘息動物、ならびに22および23日目にレスキュー用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた動物。喘息ラットの群を20～24日目に屠殺し、RLS-0071を受けた喘息ラットを24日目に屠殺し、BALF液を収集し、全タンパク質レベルをBCAプロテインアッセイによって決定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。 図30は、RLS-0071が喘息ラットのBALF中の遊離MPOレベルを低減させることを示す。以下の実験群を評価した：シャム動物（非刺激）、OVA/LPSプロトコールを受けた動物（喘息）、21、22、23日目に予防用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた喘息動物、ならびに22および23日目にレスキュー用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた動物。喘息ラットの群を20～24日目に屠殺し、RLS-0071を受けた喘息ラットを24日目に屠殺し、BALF液を収集し、MPOレベルを比色定量アッセイによって決定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。*は、喘息動物（24日目）と比較して、P=0.05を表す。 図31は、RLS-0071が喘息ラットのBALF中の遊離DNAレベルを低減させることを示す。以下の実験群を評価した：シャム動物（非刺激）、OVA/LPSプロトコールを受けた動物（喘息）、21、22、23日目に予防用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた喘息動物、ならびに22および23日目にレスキュー用量の160mg/kgのRLS-0071を受けた動物。喘息ラットの群を20～24日目に屠殺し、RLS-0071を受けた喘息ラットを24日目に屠殺し、BALF液を収集し、遊離DNAレベルをPicoGreenアッセイによって決定した。データは平均値および平均値の標準誤差である。 図32は、RLS-0071が用量依存的様式でヒトVEGFに結合することを示す。VEGFをマイクロタイタープレート上にプレーティングし、漸増濃度のRLS-0071とともにインキュベートし、続いて、これを、ペプチドに対する抗体、その後の二次抗体－HRPコンジュゲートで検出した。次いで、HRPコンジュゲートから生成されるシグナルを、450nmのODでプレートリーダー中で読み取った。C1qを結合の陽性対照として使用した。 図33は、RLS-0088がヒトVEGFへの低レベルの結合を有することを示す。VEGFをマイクロタイタープレート上にプレーティングし、1mg/ml RLS-0071（陽性対照）またはRLS-0088とともにインキュベートした。続いて、ペプチドを、ペプチドに対する抗体、その後の二次抗体－HRPコンジュゲートで検出した。次いで、HRPコンジュゲートから生成されるシグナルを、450nmのODでプレートリーダー中で読み取った。 図34は、RLS-0071およびRLS-0088がVEGFR-2へのVEGF結合および細胞シグナル伝達を阻害することを示す。RLS-0071およびRLS-0088がVEGFシグナル伝達を阻害する能力を評価するために、PromegaのVEGFバイオアッセイを利用した。この生物発光性の細胞ベースのアッセイは、読み出し情報としてルシフェラーゼを使用して、レポーター細胞上のVEGFR-2へのVEGF結合を測定する。生物発光シグナルは、Bio-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムおよび標準的なルミノメーターを使用して検出および定量化する。漸増濃度のVEGFは、発光の用量依存的増加をもたらした（陽性対照、ひし形）。細胞を漸増濃度のペプチドとともにインキュベートし、その後、ヒトVEGF（参照としてVEGF刺激単独のレベルを示す黒色の線）で細胞を刺激した。RLS-0071とRLS-0088の両方とも用量依存的方式でVEGF媒介性シグナル伝達を阻害した（それぞれ、正方形および三角形）。 RLS-0071およびRLS-0088はヒト臍血管内皮細胞（HUVEC）3次元培養システムにおいて血管新生を阻害する。精製されたHUVECをCellTrace色素で染色し、RLS-0071およびRLS-0088とともにプレインキュベートし、次いで、LPSを含む細胞外基質を添加して血管新生を刺激した。次いで、細胞を37℃で一晩インキュベートし、倒立顕微鏡で可視化することによって、血管新生（新生管形成および出芽）を観察した。 RLS-0071はHUVEC基底膜媒介性培養システムにおいて血管新生を阻害する。精製されたHUVECを漸増濃度のRLS-0071とともに30分間プレインキュベートした。LPSを含む基底膜マトリックスの層に細胞を加えて血管新生を刺激し、37℃で18時間培養した。光学顕微鏡によって、血管新生（新生管形成および出芽）を観察した。
発明の詳細な説明
背景セクションで明記したように、補体系の異なる経路のペプチドベースの阻害剤のための技術を特定すること、および新規な治療用ペプチドを開発するためにこの知識を使用することが、当技術分野において大いに必要である。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。本発明の態様は、一般に合成ペプチド、より具体的にはペグ化形態の合成ペプチドに関する。
本発明の様々な態様の原理および特色を理解しやすくするために、様々な例示となる態様を以下で説明する。本発明の例示的な態様を詳細に説明するが、他の態様が企図されることを理解されたい。したがって、本発明が以下の説明または例で記載される成分の構成および配置の詳細にその範囲が限定されることは意図されない。本発明は、他の態様が可能であり、様々な方法で実施または実行することができる。さらに、例示的な態様の説明において、明確さのために特定の術語を用いる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈において別段明記しない限り、複数形の言及を含むことにも留意しなければならない。例えば、1つの成分への言及は、複数の成分の組成物を含むことも意図される。「1つの（a）」構成成分を含む組成物への言及は、指定されたものに加えて、他の構成成分を含むことが意図される。換言すれば、用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、分量の限定を表すのではなく、言及された項目の「少なくとも1つ」の存在を表す。
本明細書において使用する場合、用語「および／または」は、「および」を意味することができ、「または」を意味することができ、「排他的なまたは」を意味することができ、「1つ」を意味することができ、「すべてではないがいくつか」を意味することができ、「どちらも～でない」意味することができ、かつ／またはこれは「両方」を意味することができる。用語「または」は、包括的「または」を意味することが意図される。
さらに、例示的な態様の説明において、明確さのために術語を用いる。各用語は、当業者によって理解されるその最も広い意味を企図し、同様の目的を達成するために同様な方法で作動するすべての技術的均等物を含むことが意図される。開示される技術の態様は、これらの具体的な詳細なしで実施することができることを理解されたい。他の場合では、この説明の理解を不明瞭にしないために、周知の方法、構造、および技法は詳細に示されていない。「一態様（one embodiment）」、「ある態様」、「実例態様」、「いくつかの態様」、「ある特定の態様」、「様々な態様」などへの言及は、そのように記載された開示される技術の態様が、特定の特色、構造、または特徴を含むことができるが、すべての態様が特定の特色、構造、または特徴を必ずしも含むとは限らないことを示す。さらに、フレーズ「一態様では」の反復使用は、必ずしも同じ態様を指すとは限らないが、その可能性もある。
本明細書において使用する場合、用語「約」は、任意の範囲の終点として指定された数の両方を指すと解釈されるべきである。範囲へのいかなる言及も範囲内の任意のサブセットを支持するとして考慮されるべきである。範囲は、本明細書において、「約」もしくは「およそ」もしくは「実質的に」ある特定の値から、および／または「約」もしくは「およそ」もしくは「実質的に」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表される場合、他の例示的な態様は、ある特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。さらに、用語「約」は、当業者によって決定された特定の値に対して許容誤差範囲内であることを意味し、これは、どのように値が測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に部分的に依存すると考えられる。例えば、「約」は、当技術分野における慣例に従って、許容される標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の±20％まで、好ましくは±10％まで、より好ましくは±5％まで、より好ましくはさらに±1％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物的システムまたはプロセスについて、本用語は、値の1桁以内、好ましくは2倍以内を意味し得る。本出願および特許請求の範囲で特定の値が記載されている場合、別段の記載がない限り、用語「約」は暗黙的であり、この文脈において、特定の値に対して許容誤差範囲内であることを意味する。
本開示の全体を通して、本発明の様々な局面が範囲型式で提示され得る。範囲型式での説明は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、範囲内のすべての可能性のある部分範囲および個々の数値を具体的に開示したと考慮されるべきである。例えば、1～6のような範囲の説明は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6などのような部分範囲、ならびに範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したと考慮されるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
同様に、本明細書において使用する場合、何かが「実質的にない」または「実質的に純粋である」などの特徴づけは、何かが「少なくとも実質的にない」または「少なくとも実質的に純粋である」ことと何かが「完全にない」または「完全に純粋である」ことの両方を含むことができる。
「含む（comprising）」または「含む（containing）」または「含む（including）」は、少なくとも指定された化合物、要素、粒子、または方法工程が組成物または物品または方法中に存在することを意味し、他の化合物、材料、粒子、方法工程の存在を除外せず、これは、他のそのような化合物、材料、粒子、方法工程が指定されたものと同じ機能を有する場合でさえもである。
本説明の全体を通して、特定の値またはパラメーターを有する様々な成分が特定され得るが、これらの項目は例示的な態様として提供される。実際に、例示的な態様は、多くの匹敵するパラメーター、サイズ、範囲、および／または値が実施され得るので、本発明の様々な局面および概念を限定しない。用語「第1の」、「第2の」など、「一次の」、「二次の」などは任意の順序、分量、または重要性を表すのではなく、むしろ、ある要素を別の要素と区別するために使用される。
「特に」、「好ましくは」、「典型的には」、「一般に」、および「しばしば」のような用語は、主張される発明の範囲を限定するためには、またはある特定の特色が、主張される発明の構造または機能にとって決定的である、必須である、またはさらに重要であることを暗示すためには、本明細書において利用されないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の態様で利用することができるかまたはできない代替のまたはさらなる特色を単に強調することが意図される。「実質的に」および「約」のような用語は、任意の定量的比較、値、測定、または他の表現に起因し得る不確実性の固有の程度を示すために本明細書において利用されることにも留意されたい。
本明細書において開示される寸法および値は、列挙される正確な数値に厳密に限定されると理解されるべきでない。代わりに、別段の指定がない限り、そのような各寸法は、列挙される値とその値の周囲の機能的に同等な範囲の両方を意味することが意図される。例えば、「50mm」と開示される寸法は、「約50mm」を意味することが意図される。
1つまたは複数の方法工程の言及は、明白に特定されるそれらの工程の間のさらなる方法工程または介在する方法工程の存在を妨げないことも理解されたい。同様に、組成物中の1つまたは複数の成分の言及は、明白に特定されるもの以外のさらなる成分の存在を妨げないことも理解されたい。
本発明の様々な要素を構成するものとして以下に記載される材料は、例示的であり、限定的でないことが意図される。本明細書に記載される材料と同じまたは同様の機能を果たすであろう多くの適切な材料は、本発明の範囲内に包含されることが意図される。本明細書に記載されていないそのような他の材料としては、限定されないが、例えば、本発明の開発時後に開発された材料を挙げることができる。様々な図面に列挙されるいかなる寸法も例示目的のためのみであり、限定を意図したものではない。他の寸法および比率が企図され、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書において使用する場合、用語「対象」または「患者」は、哺乳動物を指し、非限定的に、ヒトおよび家畜（veterinary）動物を含む。好ましい態様では、対象はヒトである。
本明細書において使用する場合、主張される発明による合成ペプチドと少なくとも1つの第2の薬学的活性成分の「組み合わせ」という用語は、化合物の少なくとも2つの、しかし任意の望ましい組み合わせが、同時にまたは連続して（例えば、24時間以内に）送達されることを意味する。様々な疾患を処置するために使用される場合に、本発明の組成物および方法は、同じまたは同様の疾患に適した他の治療的方法／剤とともに利用可能であることが企図される。そのような他の治療的方法／剤は、相加的または相乗的効果を引き起こすために、（同時にまたは連続して）共投与することができる。相加作用または相乗作用の理由から、各剤についての適切な治療的に有効な投薬量を下げることができる。
「疾患」は、対象が恒常性を維持することができず、疾患が改善しない場合、対象の健康が悪化し続ける、対象の健康状況である。これに対して、対象の「障害」は、対象が恒常性を維持することができるが、対象の健康状況が障害がない場合よりも好ましくない健康状況である。未処置のままでも、障害は、対象の健康状況のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
状況、障害、もしくは状態を「処置する」または状況、障害、もしくは状態の「処置」という用語は、以下を含む：(1)状況、障害、もしくは状態に罹患しているか、またはそれらに罹りやすい可能性があるが、状況、障害、または状態の臨床的または準臨床的症状をまだ経験しておらず、呈してもいない対象で発生している状況、障害、または状態の少なくとも1つの臨床的または準臨床的症状の出現を防止するかまたは遅延させること；あるいは(2)状況、障害、または状態を阻害すること、すなわち、疾患の発生もしくはその再発（維持処置の場合）またはその少なくとも1つの臨床的もしくは準臨床的症状を停止させる、低減させる、または遅延させること；あるいは(3)疾患を軽減すること、すなわち、状況、障害、もしくは状態、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の少なくとも1つの退行を引き起こすこと。処置される対象への恩恵は、統計学的に有意であるか、または患者もしくは医師に少なくとも認知されるかのいずれかである。
本明細書において使用する場合、用語「治療的」は、処置および／または予防を意味する。治療効果は、疾患状況の抑制、縮小、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書において使用する場合、用量または量に適用される用語「治療的に有効な」は、状況、障害、または状態を処置する（例えば、防止するまたは改善する）ために対象に投与される場合に、そのような処置をもたらすのに十分である、化合物または薬学的組成物の分量を指す。「治療的に有効な量」は、投与される化合物または細菌または類似体、ならびに疾患およびその重症度ならびに治療される哺乳動物の年齢、体重、体調、および応答性に応じて変動すると考えられる。
本発明の組成物に関連して使用する場合、フレーズ「薬学的に許容される」は、生理的に忍容可能であり、典型的には、哺乳動物（例えばヒト）に投与される場合に有害な反応をもたらさない、そのような組成物の分子実体および他の成分を指す。好ましくは、本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される」は、哺乳動物、より詳細にはヒトでの使用について、連邦もしくは州政府の規制当局に承認されていること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められる薬局方に収載されていることを意味する。
用語「薬学的担体」または「薬学的に許容される担体」は、化合物が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌の液体、例えば、水および油、例えば、石油、動物、野菜、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などであってもよい。水または水溶液食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、特に注射用溶液のために、担体として好ましくは用いられる。あるいは、薬学的担体は、限定されないが、結合剤（圧縮丸剤用）、流動促進剤、カプセル化剤、風味剤、および着色剤の1つまたは複数を含めた、固形剤形の担体であってもよい。適切な薬学的担体は、E.W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
用語「類似体」または「機能的類似体」は、該類似体がインビボおよび／またはインビトロで非修飾形態と実質的に同じ生物活性を保持するように少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、または付加が行われた、ポリペプチドの関連した修飾形態を指す。
用語「配列同一性」と「同一性パーセント」は、本明細書において互換的に使用される。本発明において、2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較目的のために配列を整列させる（例えば、第2のアミノ酸配列または核酸配列との最適な整列化のために、第1のアミノ酸または核酸の配列中にギャップを導入することができる）ことが本明細書において定義される。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基を次いで比較する。第1の配列中のある位置が、第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチド残基で占められる場合、分子はその位置で同一である。2つの配列の間の同一性パーセントは、これらの配列に共通である同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数（すなわち、重複する位置）×100）である。好ましくは、2つの配列は同じ長さである。
2つの配列の間の同一性度を決定するために、いくつかの異なるコンピュータープログラムが利用可能である。例えば、2つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい態様では、2つのアミノ酸配列または核酸配列の間の同一性パーセントは、Accelrys GCGソフトウェアパッケージ（www.accelrys.com/products/gcgで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）のアルゴリズムを使用して、Blosum 62行列またはPAM250行列のいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップの重み（gap weight）、および1、2、3、4、5、または6の長さの重み（length weight）を使用して、決定される。これらの異なるパラメーターは、わずかに異なる結果をもたらすと考えられるが、異なるアルゴリズムを使用した場合に2つの配列の全体の同一性パーセンテージが大きく変わるわけではない。
配列比較は、比較される2つの配列の全長にわたって、または2つの配列の断片にわたって行うことができる。典型的には、比較は、比較される2つの配列の完全長にわたって行われると考えられる。しかし、配列同一性は、例えば、20個、50個、100個、またはそれ以上の連続したアミノ酸残基の領域にわたって行うことができる。
当技術分野において公知である「配列同一性」は、2つ以上のポリペプチド配列または2つ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち、参照配列と、参照配列と比較される所与の配列との間の関係性を指す。配列同一性は、そのような配列のストリング間のマッチによって決定される場合に最高度の配列類似性をもたらすように配列を最適に整列させた後に、所与の配列を参照配列と比較することによって決定される。そのような整列化の際に、配列同一性は位置ごとに確認され、例えば、配列は、ある特定の位置でヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合、その位置で「同一」である。次いで、そのような位置が同一であるものの総数を参照配列中のヌクレオチドまたは残基の総数で割ることによって、配列同一性％が得られる。配列同一性は、限定されないが、その教示が参照により本明細書に組み入れられる、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991);およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されているものを含めて、公知の方法によって、容易に計算することができる。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大のマッチを得るように設計される。配列同一性を決定するための方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する公的に利用可能なコンピュータープログラム中に体系化されている。そのようなプログラムの例としては、限定されないが、GCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、BLASTP、BLASTN、およびFASTA（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990）が挙げられる。BLASTXプログラムは、NCBIおよび他の供給源から公的に利用可能である（その教示が参照により本明細書に組み入れられる、BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列との間で最高レベルの配列同一性をもたらすために、デフォルトのギャップの重みを使用して配列を最適に整列させる。1つの例示として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば95％、例えば、少なくとも96％、97％、98％、99％、または100％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5個まで、4個まで、3個まで、2個まで、1個まで、または0個までの点変異を含むことができることを除いて、参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95％、例えば、少なくとも96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列のヌクレオチドの5％まで、4％まで、3％まで、2％まで、1％まで、もしくは0％までを欠失させることができ、別のヌクレオチドで置換することができ、あるいは参照配列の全ヌクレオチドの5％まで、4％まで、3％まで、2％まで、1％まで、もしくは0％までの数のヌクレオチドを参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の5'または3’末端の位置で、あるいは参照配列中のヌクレオチドの間に個々にかまたは参照配列内の1つもしくは複数の連続した群でかのいずれかで分散して、これらの末端位置の間の任意の場所で生じ得る。類似して、参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、95％、例えば、少なくとも96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列は、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列の各100アミノ酸あたり5個まで、4個まで、3個まで、2個まで、1個まで、または0個までのアミノ酸の変化を含むことができることを除いて、参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも95％、例えば、少なくとも96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るために、参照配列のアミノ酸残基の5％まで、4％まで、3％まで、2％まで、1％まで、もしくは0％までを欠失させることができ、または別のアミノ酸で置換することができ、あるいは参照配列のアミノ酸残基の総数の5％まで、4％まで、3％まで、2％まで、1％まで、または0％までの数のアミノ酸を参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置で、あるいは参照配列中の残基の間に個々にかまたは参照配列内の1つもしくは複数の連続した群でかのいずれかで分散して、これらの末端位置の間の任意の場所で生じ得る。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかし、配列同一性を決定する場合、保存的置換はマッチとしては含まれない。
本明細書において使用する場合、用語「免疫応答」は、自然免疫応答、T細胞媒介性免疫応答、および／またはB細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、T細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞傷害性、ならびにB細胞応答、例えば、抗体産生が挙げられる。さらに、用語「免疫応答」は、T細胞活性化の影響を間接的に受ける免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。免疫応答に関与する免疫細胞としては、リンパ球、例えばB細胞およびT細胞（CD4+、CD8+、Th1およびTh2細胞）；抗原提示細胞（例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Bリンパ球、ランゲルハンス細胞、およびノンプロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄系細胞、例えば、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球（例えば、好中球）が挙げられる。
免疫原性組成物の「非経口」投与としては、例えば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋肉内（i.m.）、または皮内（i.d.）注射または注入技法が挙げられる。
医学の分野では、用語「防止する」は、疾患による死亡率または罹患率の負荷を低減させる任意の活性を包含する。防止は、一次、二次、および三次防止レベルで生じ得る。一次防止は疾患の発生を回避するが、二次および三次レベルの防止は、疾患の進行および症状の出現を防止すること、ならびに機能を取り戻すことおよび疾患関連合併症を低減させることによって、既に確立された疾患の負の影響を低減させることを目的とした活性を包含する。
本発明によるポリペプチドの「変異体」は、(i)アミノ酸残基の1つまたは複数が保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）で置換されており、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号にコードされているものでもよいし、またはコードされていないものでもよいもの、(ii)1つまたは複数の修飾アミノ酸残基、例えば、置換基の付着によって修飾されている残基が存在するもの、(iii)ポリペプチドが本発明のポリペプチドの選択的スプライシング変異体であるもの、(iv)ポリペプチドの断片、および／あるいは(v)ポリペプチドが別のポリペプチド、例えば、リーダー配列もしくは分泌配列、または精製のために用いられる配列（例えば、Hisタグ）もしくは検出のために用いられる配列（例えば、Sv5エピトープタグ）と融合しているものであってもよい。断片は、元の配列のタンパク質分解性切断（多部位タンパク質分解を含める）を介して生成されたポリペプチドを含む。変異体は、翻訳後または化学的に修飾されていてもよい。そのような変異体は、本明細書における教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。
本発明の意味の範囲内で、用語「共投与」は、本発明による組成物と別の治療剤を1つの組成物中で同時に、または異なる組成物中で同時に、または連続して（好ましくは、24時間以内に）投与することを指すために使用される。
本発明によれば、当技術分野の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技法を用いることができる。そのような技法は、文献で十分に説明されている。数ある中でも、例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York（本明細書では「Sambrook et al., 1989」）； DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)を参照されたい。
本発明のペプチド組成物
CP1のアミノ酸構造の修飾は、C1q活性などの補体活性化を調節することができるさらなるペプチドの発見につながった。古典的補体経路の活性化／阻害、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）阻害、抗酸化活性およびNET活性の阻害のインビトロアッセイにおいて、親分子
Figure 2023548001000004
と比較して、ペグ化などの修飾が、ペプチドの溶解度および生物活性の強力な阻害を増強することが以前に示された。C末端の単分散24merペグ化部分を有するペプチドは、非常に可溶性であり、かつ補体系の強い阻害を有することが見出された
Figure 2023548001000005
。別の適切なペプチドは、
Figure 2023548001000006
の8位にサルコシン置換を含む。
本明細書において使用する場合、用語「ペプチド」は、天然に存在し得るアミノ酸配列、またはペプチド模倣物、ペプチド類似体、および／もしくはSEQ ID NO:2に基づく約15アミノ酸の合成誘導体（例えば、限定されないが、ペグ化ペプチドが挙げられる）を指す。さらに、ペプチドは、約15アミノ酸残基未満、例えば、約10～約15アミノ酸残基であってもよく、例えば、約5～約10アミノ酸残基のペプチドであってもよい。例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、および15アミノ酸のペプチド残基は、同様に本発明の文脈内のペプチドである可能性がある。ペプチドはまた、15アミノ酸を超えてもよく、例えば、16、17、18、19、および20、またはそれ以上のアミノ酸などであってもよい。
開示されるペプチドは、概して、約15アミノ酸残基を越える、約15アミノ酸残基の、または約15アミノ酸残基未満の、拘束されている（すなわち、例えば、βターンもしくはβプリーツシートを開始するアミノ酸の存在のような構造のある種の要素を有する、または例えば、ジスルフィド結合したCys残基の存在によって環化されている）、あるいは拘束されていない（すなわち、直鎖状）のアミノ酸配列である。
ペプチド配列内のアミノ酸に対する置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーより選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。芳香環構造を含むアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニンおよびリジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。例えば、配列内の1つまたは複数のアミノ酸残基を機能的同等物として作用する同様の極性の別のアミノ酸で置換することができ、これにより、サイレントな変化がもたらされる。
保存的変化は、一般に、得られたタンパク質の構造および機能の変化にあまりつながらない。非保存的な変化は、得られたタンパク質の構造、活性、または機能を変化させる可能性が高い。例えば、本開示のペプチドは、以下の保存的アミノ酸置換の1つまたは複数を含む：脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの別の脂肪族アミノ酸との置き換え；セリンのスレオニンとの置き換え；スレオニンのセリンとの置き換え；酸性残基、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の別の酸性残基との置き換え；アミド基を有する残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンのアミド基を有する別の残基との置き換え；塩基性残基、例えば、リジンおよびアルギニンの別の塩基性残基との交換；ならびに芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンの別の芳香族残基との置き換え。
特に好ましいアミノ酸置換としては以下が挙げられる：
（a）負電荷が低減し得るような、Gluに対するAlaまたはその逆；
（b）正電荷が維持され得るような、Argに対するLysまたはその逆；
（c）正電荷が低減し得るような、Argに対するAlaまたはその逆；
（d）負電荷が維持され得るような、Aspに対するGluまたはその逆；
（e）遊離-OHが維持することができるような、Thrに対するSerまたはその逆；
（f）遊離NH2が維持することができるような、Asnに対するGlnまたはその逆；
（g）おおよそ同等の疎水性アミノ酸としての、LeuもしくはValに対するIleまたはその逆；
（h）おおよそ同等の芳香族アミノ酸としての、Tyrに対するPheまたはその逆；および
（i）ジスルフィド結合が影響を受けるような、Cysに対するAlaまたはその逆。
ペプチド配列内のアミノ酸に対する置換物は、限定されないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン（pyrolysine）、セレノシステイン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、N-ホルミル-L-メチオニン、サルコシン、または他のN‐メチル化アミノ酸を含めた任意のアミノ酸より選択することができる。いくつかの態様では、サルコシンがペプチド配列内のアミノ酸と置換される。いくつかの態様では、サルコシン残基がSEQ ID NO:2の8位のイソロイシン残基と置き換わる。
一態様では、本発明は、ヒトアストロウイルス（human astrovirus）コートタンパク質に由来する合成ペプチドを開示し、本ペプチドは、SEQ ID NO:2および／または3のアミノ酸配列および修飾を含む。
（表１）本発明のペプチドのリスト
Figure 2023548001000007
他の態様では、合成ペプチドは、限定されないが、急性肺傷害（ALI）のモデルを含めて、サイトカインの発現を変化させることができる。いくつかの態様では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、サイトカインの発現を変化させる方法を提供する。いくつかの態様では、合成ペプチドは、ALIおよび／またはARDSを処置および／または防止することができる。いくつかの態様では、合成ペプチドは、眼の疾患または状態および喘息を処置することができる。いくつかの態様では、合成ペプチドは、血管新生をモジュレートすることができる。
他の態様では、合成ペプチドは、好中球の結合および／または接着を阻害するかまたは変化させることができる。いくつかの態様では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の結合および／または接着を阻害するかまたは変化させる方法を提供する。
他の態様では、合成ペプチドは、好中球の生存を向上させることができる。いくつかの態様では、本発明は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の生存を向上させる方法を提供する。
他の態様では、合成ペプチドは、インビボで、例えば、限定されないが、インテグリンおよび／またはICAMなどの細胞表面受容体に結合することができる。いくつかの態様では、方法は、SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、細胞表面受容体への好中球の結合を阻害するかまたは変化させる方法を提供する。
開示されるペプチドは、代替経路活性に影響を及ぼすことなく、C1qおよびMBLの活性化を選択的に調節することができ、したがって、古典的経路およびレクチン経路の調節不全になった活性化によって媒介される疾患の防止および処置に理想的である。古典的経路およびレクチン経路の特異的な遮断は、多くの動物モデルにおいてこれらの経路の両方が虚血再灌流誘導性傷害に関与しているので、特に必要とされる［Castellano et al., “Therapeutic targeting of classical and lectin pathways of complement protects from ischemia-reperfusion-induced renal damage.” Am J Pathol. 2010; 176(4):1648-59; Lee et al., “Early complement factors in the local tissue immunocomplex generated during intestinal ischemia/reperfusion injury.” Mol. Immunol. 2010 February; 47(5):972-81; Tjernberg, et al., “Acute antibody-mediated complement activation mediates lysis of pancreatic islets cells and may cause tissue loss in clinical islet transplantation.” Transplantation. 2008 Apr. 27; 85(8):1193-9; Zhang et al. “The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.” J Mol Cell Cardiol. 2006 July; 41(1):62-7)。代替経路は侵入する病原体に対する免疫監視に必須であり、代替経路が欠損したヒトは重症の細菌感染症を患う。C1qおよびMBLに結合し、これらを不活性化することによって、本ペプチドは、代替経路をインタクトなままにしながら、古典的経路およびレクチン経路の活性化を効率的に調節することができる。
本明細書において使用する場合、用語「調節する」は、（i）酵素、タンパク質、ペプチド、因子、副生成物、もしくはそれらの誘導体の生物学的機能を個々にかもしくは複合体かのいずれかで、制御する、低減させる、阻害する、もしくは調節すること；（ii）インビボもしくはインビトロのいずれかで、生物学的タンパク質、ペプチド、もしくはそれらの誘導体の分量を低減させること；または（iii）関連した一連の生物学的反応もしくは化学反応を含むことが公知である事象、カスケード、もしくは経路の生物学的連鎖を遮ることを指す。したがって、用語「調節する」は、例えば、対照試料と比較して補体カスケードの単一成分の分量を低減させ、成分もしくは成分の複合体の形成の速度もしくは総量を低減させ、または複雑なプロセスもしくは一連の生物学的反応の全体的な活性を低減させ、細胞溶解、コンバターゼ酵素の形成、補体由来の膜攻撃複合体の形成、炎症、または炎症性疾患などの結果につながることを説明するために使用することができる。インビトロアッセイでは、用語「調節する」は、ある種の生物学的または化学的事象の測定可能な変化または低減を指すことができるが、当業者は、測定可能な変化または低減が、「調節性」であるために絶対的である必要はないことを認識するであろう。
いくつかの態様では、本発明は、補体系を調節する効果を有する治療的に活性なペプチドに関する。
本発明の薬学的組成物
本開示は、上述したような少なくとも1つのペプチド、および少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、安定化剤、または賦形剤を含む、補体系を調節することができる薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投薬量および濃度で受容者に対して毒性を持たないものである。これらは、固体、半固体、または液体であってもよい。本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、粉末剤、ロゼンジ剤、サッシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、乳剤、溶液、またはシロップの形態であってもよい。
本発明の薬学的組成物は、適切な純度を有する本ペプチドを薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することによって調製される。製剤およびそのような製剤を調製するための方法の例は、当技術分野において周知である。本発明の薬学的組成物は、上記のような様々な障害および疾患のための予防剤および治療剤として有用である。一態様では、組成物は、治療的に有効な量の本ペプチドを含む。別の態様では、組成物は、補体系を調節するのに有効な少なくとも1つの他の活性成分を含む。別の態様では、組成物は、補体系と関連する少なくとも1つの疾患を処置するのに有効な少なくとも1つの他の活性成分を含む。別の態様では、組成物は、補体系と関連しない少なくとも1つの疾患を処置するのに有効な少なくとも1つの他の活性成分を含む。本明細書において使用する場合、用語「治療的に有効な量」は、対象への利益を示すのに十分である、各活性成分の総量を指す。
ペプチドの治療的に有効な量は、いくつかの因子、例えば、処置される状態、状態の重症度、投与時間、投与経路、用いられるペプチドの排出速度、治療期間、関与する併用療法、ならびに対象の年齢、性別、体重および状態などに応じて変動する。当業者は、治療的に有効な量を決定することができる。したがって、当業者は、最大の治療効果を得るために、投薬量をタイトレーションし、投与経路を修正する必要がある可能性がある。
有効な1日量は、一般に、約5～約160mg/kg、約10～約160mg/kg、約40mg/kg～約160mg/kg、および約40mg/kg～約100mg/kgを含めて、体重キログラムあたり約0.001～約200ミリグラム（mg/kg）の範囲内である。この用量は、毎日1～6回の投与レジメンによって達成することができる。あるいは、最適な処置は、より低頻度の投与レジメンを用いた持続性放出製剤によって達成することができる。いくつかの態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、約10mg/kg～約160mg/kgである。いくつかの態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、約20mg/kg～約160mg/kgである。いくつかの態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、約40mg/kg～約160mg/kgである。いくつかの態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、少なくとも1つの用量で投与され、第1の用量は、約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む。いくつかの態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量を含む第2の用量が投与され、第2の用量は、約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む。いくつかの態様では、SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量は、2つの用量で投与され、第1の用量は、約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含み、第2の用量は、約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む。いくつかの態様では、第2の用量は、第1の用量が投与されてから30秒～3時間後に投与される。
別の局面では、本発明は、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3と、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む薬学的組成物である。
本発明の組成物は、担体および／または賦形剤を含むことができる。本発明のペプチドを療法のためにそのまま使用することは可能であるが、薬学的製剤中で、例えば、意図された投与経路および標準的な薬学的慣習に関して選択された適切な薬学的賦形剤および／または担体との混合物中でこれを投与することが好ましいこともあり得る。賦形剤および／または担体は、製剤の他の成分と適合性であり、それらの受容者に有害でないという意味で「許容され」なければならない。治療的使用のための許容される賦形剤および担体は薬学分野で周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins（A.R. Gennaro edit. 2005）に記載されている。薬学的賦形剤および担体の選択肢は、意図された投与経路および標準的な薬学的慣習に関して選択され得る。経口製剤は、例えば、牛乳、ヨーグルト、および乳児用調製粉乳などのさらなる混合物に容易に対応する。経口投与用の固形剤形を使用することもでき、経口投与用の固形剤形としては、例えば、カプセル剤、錠剤、カプレット、丸剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、粉末剤、および顆粒剤を挙げることができる。適切な賦形剤の非限定例としては、例えば、希釈剤、緩衝化剤（例えば、炭酸水素ナトリウム）、防腐剤、安定化剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、分散促進剤、崩壊剤、抗酸化剤、着香剤、甘味剤、および着色剤が挙げられる。当業者は、適切な溶液を十分に調製することができる。
本発明の組成物のいずれかの一態様では、組成物は、例えば、経口、局所、直腸、粘膜、舌下、経鼻、経鼻／経口（naso/oro）胃強制栄養、非経口、腹腔内、皮内、経皮、髄腔内、経鼻、および気管内投与などの経路による送達のために製剤化される。本発明の組成物のいずれかの一態様では、組成物は、液体、フォーム、クリーム、スプレー、粉末、またはゲルの形態である。本発明の組成物のいずれかの一態様では、組成物は、緩衝化剤（例えば、炭酸水素ナトリウム）を含む。
本発明の方法におけるペプチドおよび組成物の投与は、当技術分野において公知の任意の方法によって達成することができる。送達の有用な経路の非限定例としては、経口、直腸、糞便（浣腸による）、および経鼻／経口胃強制栄養、ならびに非経口、腹腔内、皮内、経皮、髄腔内、経鼻、および気管内投与が挙げられる。活性剤は投与後に全身性でもよく、または領域性投与、壁内投与の使用、もしくは埋め込みの部位で活性用量を保持するように作用するインプラントの使用によって局在化されてもよい。
本発明の化合物および製剤の有用な投薬量は、疾患の性質、患者の病歴、投薬頻度、投与様式、宿主からの作用物質の排除などに応じて広く変動し得る。初回用量を多くし、その後の維持量を少なくすることができる。用量は、有効投薬量レベルを維持するために、毎週または隔週のような低頻度で投与することができるか、またはより小さな用量に分割し、毎日、半週ごとなどに投与することができる。治療効果を達成するために様々な用量が有効であり得ることが考えられる。本発明の化合物を療法のためにそのまま使用することは可能であるが、薬学的製剤で、例えば、意図された投与経路および標準的な薬学的慣習に関して選択された適切な薬学的賦形剤、希釈剤、または担体との混合物中でこれを投与するが好ましいこともあり得る。賦形剤、希釈剤、および／または担体は、製剤の他の成分と適合性であり、それらの受容者に有害でないという意味で「許容され」なければならない。治療的使用のための許容される賦形剤、希釈剤、および担体は、薬学分野で周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins（A.R. Gennaro edit. 2005）に記載されている。薬学的賦形剤、希釈剤、および担体の選択肢は、意図された投与経路および標準的な薬学的慣習に関して選択され得る。
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を意図された受容者の血液と等張にする溶質を含むことができる水性および非水性の等張無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性の懸濁液が挙げられる。
溶液または懸濁液は、以下の成分のいずれかを任意の組み合わせで含むことができる：無菌の希釈剤、例えば、例として非限定的に、注射用水、食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）；緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、およびリン酸；ならびに張性の調整のための剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。
剤が不十分な溶解度を示す場合、剤を可溶化するための方法を使用することができる。そのような方法は当業者に公知であり、限定されないが、共溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）などの使用、界面活性剤、例えば、TWEEN（登録商標）80の使用、または炭酸水素ナトリウム水溶液中への溶解が挙げられる。有効な薬学的組成物の製剤化において、剤の薬学的に許容される誘導体を使用することもできる。
組成物は、活性剤とともに、例えば、非限定的に以下を含むことができる：希釈剤、例えば、ラクトース、ショ糖、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびタルク；ならびに結合剤、例えば、デンプン、天然ゴム、例えば、アカシアゴムゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリドン、セルロース、およびそれらの誘導体、ポビドン、クロスポビドン、ならびに当業者に公知の他のそのような結合剤。液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、担体、例えば、例として、非限定的に、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなどに上記で定義された活性剤と任意の薬学的補助剤を溶解する、分散させる、または混合して、それによって、溶液または懸濁液を形成することによって、調製することができる。所望ならば、投与される薬学的組成物は、少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、または可溶化剤、pH緩衝化剤など、例えば、例として、非限定的に、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような剤を含むこともできる。そのような剤形を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者に明らかであろう（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975）。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、処置される対象の症状を軽くするのに十分な量の活性剤の分量を含む。
活性剤または薬学的に許容される誘導体は、徐放製剤またはコーティング剤など、体からの急速な排出から剤を保護する担体を用いて調製することができる。組成物は、特性の望ましい組み合わせを得るために、他の活性剤を含むことができる。
非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内、または静脈内のいずれかの注射を特徴とし、本明細書においても企図される。注射液は、液体の溶液もしくは懸濁液、注射前の液状の溶液もしくは懸濁液に適した固体形態としてか、または乳剤としてかのいずれかで、従来の形態で調製することができる。適切な賦形剤としては、例として、非限定的に、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールが挙げられる。さらに、所望ならば、投与される薬学的組成物は、少量の無毒の補助物質、例えば、湿潤または乳化剤、pH緩衝化剤、安定化剤、溶解度促進剤、および他のそのような剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、およびシクロデキストリンなどを含むこともできる。
凍結乾燥粉末は、溶液、乳剤、および他の混合物の投与のために再構成することができるか、または固体またはゲルとして製剤化することができる。無菌の凍結乾燥粉末は、本明細書において提供される剤または薬学的に許容されるそれらの誘導体を適切な溶媒に溶解することによって調製される。溶媒は、安定性を向上させる賦形剤、または粉末もしくは粉末から調製される再構成溶液の他の薬理学的成分を含むことができる。使用することができる賦形剤としては、限定されないが、デキストロース、ソルビトール（sorbital）、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、ショ糖、または他の適切な剤が挙げられる。溶媒は、緩衝液、例えば、クエン酸、ナトリウム、もしくはリン酸カリウム、または当業者に公知の他のそのような緩衝液を典型的にはほぼ中性pHで含むこともできる。続いて溶液の無菌濾過、その後の当業者に公知の標準的な条件下での凍結乾燥によって、望ましい製剤が提供される。一般に、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアル中に配分することができる。各バイアルは、例として、非限定的に、単回投薬量（10～1000mg、例えば、100～500mg）または複数回投薬量の剤を含むことができる。凍結乾燥粉末は、適切な条件下で、例えば、約4℃～室温で保存することができる。注射用水を用いたこの凍結乾燥粉末の再構成によって、非経口投与で使用するための製剤が提供される。
本発明の組成物または薬学的に許容されるそれらの誘導体は、例えば、（例えば、US 4,044,126、4,414,209、および4,364,923に記載されているように）吸入または鼻腔内による適用のためのエアロゾルとして製剤化することができる。これらの製剤は、単独で、またはラクトースなどの不活性な担体と組み合わせて、ネブライザー用のエアロゾルもしくは溶液の形態であるか、または吹送用の超微粒粉末としてであってもよい。そのような場合、製剤の粒子は、例として、非限定的に、約50ミクロン未満、例えば、約10ミクロン未満の直径を有し得る。
剤は、局部または局所適用のために、例えば、皮膚および粘膜（例えば、鼻腔内）への適用のために、点鼻液、ゲル、クリーム、およびローションの形態で製剤化することもできる。
本発明の眼用組成物
いくつかの態様では、本発明の組成物は、例えば、局所、硝子体内、および／または眼内投与を含めて、眼部投与のために製剤化される。いくつかの態様では、組成物は、眼の表面、相互接続している神経支配、結膜、涙腺、またはマイボーム腺に送達される。組成物は、点眼剤、軟膏、ゲル、フォーム、溶液、懸濁液、および／または眼内インプラントの形態であってもよい。
一態様によれば、本発明は、眼科的に許容される担体および／または賦形剤中に本明細書に記載される治療的に有効な量のSEQ ID NO:2を含む薬学的組成物も含む。そのような担体としては、例えば、本明細書列挙されるものが挙げられる。
一態様によれば、活性化合物を含む局所製剤は、眼科分野の当業者が従来の判断基準を使用して選択することができるように、生理的適合性のビヒクルを含むこともできる。ビヒクルは、公知の眼用ビヒクルより選択することができ、該ビヒクルとしては、限定されないが、食塩溶液、水性ポリエーテル、例えばポリエチレングリコール、ポリビニル、例えばポリビニルアルコールおよびポビドン、セルロース誘導体、例えばメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、石油誘導体、例えば鉱物油および白色ワセリン、動物性脂肪、例えばラノリン、アクリル酸のポリマー、例えばカルボキシポリメチレンゲル、植物性脂肪、例えばピーナッツ油、ならびに多糖、例えばデキストラン、ならびにグリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ならびに塩、例えば塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが挙げられる。
一態様によれば、眼用組成物は、有利には、特に、溶液、懸濁液、軟膏、ゲル、またはフォームの形態で、眼に局所的に適用される。別の態様によれば、眼用組成物は、注射またはインプラントを介して、眼内、硝子体内、または房水内に投与される。
本発明の方法で使用される正確な薬学的製剤（例えば、眼用組成物）は、幅広い商業的および科学的判断基準に従って変動すると考えられる。すなわち、当業者は、本明細書に記載される本発明の上記の製剤が他の剤を含むことができることを認識するであろう。
一態様によれば、対応する眼用組成物のために、当業者に公知の慣例の薬学的に許容される賦形剤および添加剤、例えば、下記のタイプのもの、特に、担体、安定化剤、可溶化剤、張性増強剤、緩衝物質、錯化剤、および他の賦形剤が使用される。そのような添加剤および賦形剤の例は、米国特許第5,134,124号および第4,906,613号に見出すことができる。そのような組成物は、それ自体公知の方法で、例えば、活性成分を対応する賦形剤および／または添加剤と混合して、対応する眼用組成物を形成することによって調製される。活性成分は、好ましくは、点眼剤の形態で投与され、活性成分は、例えば担体中に慣習的に溶解される。溶液は、適切な場合は、望ましいpHに調整および／または緩衝され、適切な場合は、安定化剤、可溶化剤、または張性増強剤が添加される。適切な場合は、防腐剤および／または他の賦形剤が眼用組成物に添加される。
本発明に従って使用される担体は、典型的には、局所または全身投与に適しており、例えば、水、水と水混和性溶媒、例えばC1～C7-アルカノールの混合物、0.5～5重量％のヒドロキシエチルセルロースを含む植物油または鉱物油、オレイン酸エチル、カルボキシメチルセルロースのアルカリ金属塩、ポリビニル－ピロリドン、ならびに眼用使用のための他の無毒の水溶性のポリマー、例えば、セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースなど、アクリレートまたはメタクリレート、例えば、ポリアクリル酸の塩またはアクリル酸エチル、ポリアクリルアミド、天然物、例えば、ゼラチン、アルギネート、ペクチン、トラガント、カラヤガム、キサンタンガム、カラゲニン、寒天、およびアラビアゴム、デンプン誘導体、例えば、酢酸デンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン、ならびにさらに他の合成生成物、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキシド、好ましくは、架橋結合したポリアクリル酸、例えば、中性Carbopol、またはこれらのポリマーの混合物である。好ましい担体は、水、セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのアルカリ金属塩、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース、中性Carbopol、またはこれらの混合物である。
一態様によれば、本発明の眼用組成物のために使用される可溶化剤は、例えば、チロキサポール、脂肪酸グリセロールポリ低級アルキレングリコールエステル、脂肪酸ポリ低級アルキレングリコールエステル、ポリエチレングリコール、グリセロールエーテル、またはこれらの化合物の混合物である。添加される量は、典型的には、活性成分を可溶化するのに十分である。例えば、可溶化剤の濃度は、活性成分の0.1～5000倍の濃度である。低級アルキレンは、7個を含めて7個までのC原子を有する直鎖状または分枝状のアルキレンを意味する。例は、メチレン、エチレン、1,3-プロピレン、1,2-プロピレン、1,5-ペンチレン、2,5-ヘキシレン、または1,7-ヘプチレンである。低級アルキレンは、好ましくは、4個を含めて4個までのC原子を有する直鎖状または分枝状のアルキレンである。
緩衝物質の例は、酢酸、アスコルビン酸、ホウ酸、炭酸水素／炭酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、リン酸、プロピオン酸、およびTRIS（トロメタミン）緩衝液である。トロメタミンおよびホウ酸緩衝液が好ましい緩衝液である。添加される緩衝物質の量は、例えば、生理的に忍容可能であるpH範囲を確実にし、かつ維持するために必要な量である。pH範囲は、典型的には5～9、好ましくは6～8.2、より好ましくは6.8～8.1の範囲である。
張性増強剤は、例えば、イオン性化合物、例えば、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属ハロゲン化物、例えば、CaCl2、KBr、KCl、LiCl、NaBr、NaClなど、またはホウ酸である。非イオン性張性増強剤は、例えば、尿素、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、プロピレングリコール、またはデキストロースである。例えば、すぐに使用可能な眼用組成物におよそ50～1000mOsmol、好ましくは100～400mOsmol、より好ましくは200～400mOsmol、さらにより好ましくは280～350mOsmolの重量モル浸透圧濃度を与えるために、十分な張性増強剤が添加される。
防腐剤の例は、第四級アンモニウム塩、例えば、セトリミド、塩化ベンザルコニウム、もしくは塩化ベンゾキソニウム、チオサリチル酸のアルキル水銀塩、例えば、チメロサール、硝酸フェニル水銀、酢酸フェニル水銀、もしくはホウ酸フェニル水銀など、パラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなど、アルコール、例えば、クロロブタノール、ベンジルアルコール、もしくはフェニルエタノールなど、グアニジン誘導体、例えば、クロロヘキシジンもしくはポリヘキサメチレンビグアニドなど、またはソルビン酸である。好ましい防腐剤は、セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゾキソニウム、およびパラベンである。適切な場合は、細菌および真菌によって引き起こされる使用中の二次的汚染からの保護を確実にするために、十分な量の防腐剤が眼用組成物に添加される。
一態様によれば、眼用組成物は、さらなる無毒の賦形剤、例えば、乳化剤、湿潤剤、またはフィラーなど、例えば、200、300、400、および600と指定されたポリエチレングリコール、または1000、1500、4000、6000、および10000と指定されたCarbowaxなどを含むことができる。所望ならば使用することができる他の賦形剤は以下に列挙されるが、これらは、可能性のある賦形剤の範囲を限定することを決して意図するものではない。これらは、特に、錯化剤、例えば、EDTA二ナトリウムまたはEDTA、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、アセチルシステイン、システイン、亜硫酸水素ナトリウム、ブチル-ヒドロキシアニソール、ブチル-ヒドロキシ-トルエン、もしくはα-酢酸トコフェロール；安定化剤、例えば、シクロデキストリン、チオ尿素、チオソルビトール、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、もしくはモノチオグリセロール；または他の賦形剤、例えば、ラウリン酸ソルビトールエステル、オレイン酸トリエタノールアミン、もしくはパルミチン酸エステルなどである。好ましい賦形剤は、錯化剤、例えばEDTA二ナトリウム、および安定化剤、例えばシクロデキストリンである。添加される賦形剤の量およびタイプは、特定の要件に従い、一般に、およそ0.0001～およそ90重量％の範囲である。シクロデキストリンは、グルコースあたり3つの遊離ヒドロキシ基を有するいくつかのグルコース単位から構成される。一態様に従って使用されるシクロデキストリンの量は、好ましくは0.01～20重量％、より好ましくは0.1～15重量％、さらにより好ましくは1～10重量％の範囲にわたり得る。
一態様によれば、本発明は、本明細書に記載される治療的に有効な量のSEQ ID NO:2、担体、可溶化剤、および例えば、抗生物質、抗アレルギー剤、麻酔剤、別の消炎剤、コルチコステロイド、眼内圧を低下させるのに適した剤、または別の薬物であってもよい別の治療的に有効な薬学的剤を含む眼用組成物にも関する。
本発明の方法で使用される眼用組成物は、好ましくは、ビヒクルとして生理食塩溶液を使用して調製される。眼用組成物のpHは、当業者に公知の適切な緩衝系（例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液）を用いて、実質的に中性のpH（例えば、約7.4、約6.5～約7.4の範囲内など）に維持することができる。
局所製剤
眼用軟膏は、懸濁液および確実に溶液よりも長く活性剤と眼との接触を保つ傾向がある。大抵の軟膏は、涙液によって容易に除去されないので、視覚をぼやかさせる傾向がある。したがって、軟膏は、一般に、日中に使用される点眼剤の補助的療法として夜に使用される。
発明組成物の油性軟膏基剤は鉱物油とワセリンとラノリンの混合物であり、すべて、体温に近い融点を有する。本発明の化合物の場合は、組成物は鉱物油、ワセリン、またはラノリンを含むことができる。一態様によれば、好ましい組成物は、ワセリンと鉱物油とラノリンの組み合わせを含むことができる。別の好ましい組成物は、白色ワセリン、鉱物油、およびラノリン（無水）を含む、軟膏の組み合わせである。
他の例示的な局所製剤としては、点眼剤、インサート、アイパック、含浸（impregnated）コンタクトレンズ、ポンプ送達システム、ジメチルスルホキシド（DMSO）ベースの溶液および／または懸濁液、ならびにリポソームが挙げられる。
点眼剤は、無菌の水溶液、例えば、生理食塩水、緩衝溶液などに活性成分を溶解することによって、または粉末組成物を組み合わせて使用前に溶解することによって調製することができる。当技術分野において公知であるように、限定されないが、以下を含めて、他のビヒクルを選択することができる：平衡塩類溶液、食塩溶液、水溶性ポリエーテル、例えばポリエチレングリコール、ポリビニル、例えばポリビニルアルコールおよびポビドン、セルロース誘導体、例えばメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、石油誘導体、例えば鉱物油および白色ワセリン、動物性脂肪、例えばラノリン、アクリル酸のポリマー、例えばカルボキシポリメチレンゲル、植物性脂肪、例えばピーナッツ油、ならびに多糖、例えばデキストラン、ならびにグリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸ナトリウム。所望ならば、点眼剤で通常使用される添加剤を添加することができる。そのような添加剤としては、等張化剤（例えば、塩化ナトリウムなど）、緩衝剤（例えば、ホウ酸、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノールなど）、増粘剤（例えば、サッカリド、例えば、ラクトース、マンニトール、マルトースなど；例えば、ヒアルロン酸もしくはその塩、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウムなど；例えば、ムコ多糖、例えば、コンドロイチン硫酸など；例えば、ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、架橋ポリアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、または当業者に公知の他の剤）が挙げられる。
本組成物の成分の溶解度を、組成物中の界面活性剤または他の適切な共溶媒によって増強することができる。そのような共溶媒としては、ポリソルベート20、60、および80、Pluronic F68、F-84、およびP-103、シクロデキストリン、または当業者に公知の他の剤が挙げられる。そのような共溶媒は、約0.01重量％～2重量％のレベルで用いることができる。
本発明の組成物は、防腐剤を含まない無菌の単位用量タイプとして製剤化することができる。本発明の組成物は、多回用量形態中に包装することができる。使用中の微生物汚染を防止するために、防腐剤が好ましい場合がある。適切な防腐剤としては、以下が挙げられる：塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、Onamer M、または当業者に公知の他の剤。先行技術の眼用生成物では、そのような防腐剤は、0.004％～0.02％のレベルで用いることができる。本出願の組成物では、防腐剤、好ましくは、塩化ベンザルコニウムは、重量基準で、0.001％～0.01％未満、例えば0.001％～0.008％、好ましくは、約0.005％のレベルで用いることができる。0.005％の塩化ベンザルコニウムの濃度が微生物の攻撃から本発明の組成物を守るのに十分であり得ることが見出されている。
本発明の製剤は、1回あたり数滴、1日あたり1～4滴、好ましくは1～3滴、より好ましくは1～2滴、最も好ましくは１滴投与することができる。あるいは、本発明の製剤は、1日数回、好ましくは1～6回、より好ましくは1～4回、最も好ましくは1日1回、適用またはスプレーすることができる。
結膜／強膜製剤
局所的な結膜侵入経路によって、前眼部内への薬物の浸透が可能になる。さらに、局所適用された薬物は、結膜から強膜にアクセスできることが示されている。強膜は、大きな分子量の化合物（約150kD）でさえも容易に透過させることが示されている。SEQ ID NO:2および／または3を含む局所用の溶液、懸濁液、ゲル、または軟膏は、局所的な結膜および強膜適用に適した製剤である。結膜下注射を介して薬学的組成物を投与することも可能である。
眼内／硝子体内製剤
本発明の薬学的組成物は、注射（例えば、眼周囲、結膜下、房水内、眼内、もしくは硝子体内注射）または適切なインプラント（例えば、角膜内もしくは眼内インプラント）の導入によって、眼内または硝子体内に投与されるように、製剤化することができる。
埋め込み式製剤
一態様では、本発明の眼組成物を含むインプラントは、生体適合性の生分解性／生体浸食性（bio-erodible）ポリマーマトリックス内に封入されたPIC1ペプチドを用いて製剤化される。剤の放出は、ポリマーの浸食、その後の、以前に封入された剤粒子の硝子体への曝露、および引き続く剤の溶解および放出によって達成される。この形態の薬物放出によって達成される放出動態は、メチルセルロースなどのハイドロゲルなどを用いたポリマー膨潤を通して薬物を放出する製剤によって達成されるものと異なる。その場合、薬物は、ポリマー浸食を通してではなく、ポリマー膨潤を通して放出され、これは曝露された経路を通って液体が拡散するにしたがって薬物を放出する。放出動態を決定するパラメーターとしては、薬物粒子のサイズ、薬物の水溶性、薬物対ポリマーの比、製造方法、曝露される表面積、およびポリマーの浸食速度が挙げられる。
インプラントからのPIC1ペプチドの拡散は、インプラントの構造によって制御することもできる。例えば、インプラントからのPIC1ペプチドの拡散は、薬物を含むポリマー層に付けられた膜によって制御することができる。膜層は、本ペプチドを含むポリマー層と、療法の望ましい部位との中間に位置すると考えられる。膜は、上記で示される生体適合性材料のいずれか、ポリマー中に存在するペプチド以外の剤の存在、PIC1ペプチドを含むポリマーの組成物、望ましい拡散速度などから構成されてもよい。例えば、ポリマー層は、通常、非常に大量のペプチドを含むと考えられ、かつ典型的には飽和していると考えられる。そのようなPIC1ペプチドが飽和したポリマーは、一般に、非常に速い速度でペプチドを放出することができる。この状況では、ポリマーよりもペプチド透過性が低い膜を選択することによって、ペプチドの放出を遅くすることができる。膜のペプチド透過性が低いことが理由で、ペプチドはポリマー中に濃縮されたままであると考えられ、全体的な拡散速度は、膜のペプチド透過性によって決定されると考えられる。したがって、インプラントからのペプチドの放出速度が低減され、これにより、療法の部位へのペプチドのより制御されかつ長期にわたる送達が提供される。
眼投与
本発明の眼用組成物の投与は眼内注射であってもよいが、他の投与様式が有効である可能性がある。典型的には、眼用組成物は、（化学的送達システムまたは侵襲的装置によって）個体に眼内送達されると考えられる。しかし、本発明は、眼に位置するかまた眼に隣接する細胞または組織内の十分な量のペプチドが、眼部の状態の部位との接触を達成するという条件で、局所的（外眼適用）または全身的（例えば、経口、もしくは他の非経口経路、例えば皮下投与など）も含むという点において、眼内送達に限定されない。非経口投与は、専門家に明らかな適切な環境で使用される。好ましくは、眼用組成物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形で投与される。
前述のように、インサイチューでの眼内領域への送達は、注射、カニューレ、または正確に計量された量の望ましい眼用組成物を眼内の特定のコンパートメントまたは組織（例えば、後眼房または網膜）に導入するように設計された他の侵襲的装置によって達成することができる。眼内注射は、硝子体中（硝子体内）、または結膜の下（結膜下）、または眼の後ろ（眼球後）、強膜中、またはテノン嚢の下（テノン下）であってもよく、デポー形態であってもよい。他の眼内投与経路ならびに注射の部位および形態も企図され、本発明の範囲内である。
眼部障害の処置または防止のための本発明の眼用組成物の局所適用は、軟膏、ゲル、フォーム、または点眼剤であってもよい。好ましくは、PIC1ペプチドを含む浸透組成物が使用される。局所眼用組成物は、さらに、インサイチューでゲル化可能な水性製剤であってもよい。そのような製剤は、眼または眼の外側の涙液に接触した際にゲル化を促進するのに有効な濃度で、ゲル化剤を含む。適切なゲル化剤としては、限定されないが、熱硬化性ポリマー、例えば、エチレンオキシドとプロピレンオキシドの4置換エチレンジアミンブロックコポリマー（例えば、ポロキサミン）；ポリカルボフィル；および多糖、例えば、ジェラン、カラゲナン（例えば、カッパ-カラゲナンおよびイオタ-カラゲナン）、キトサン、ならびにアルギネートガムが挙げられる。
この方法で使用される、投与されるPIC1ペプチドの量および局所眼用組成物中の化合物の濃度は、希釈剤、送達システム、または選択される装置、患者の臨床状態、副作用、および製剤中の化合物の安定性に依存する。したがって、医師は、適切な濃度のペプチドを含む適切な調製物を用い、問題になっている患者または同様の患者での臨床経験に応じて、投与される製剤の量を選択する。
緩効性または持続放出送達システムは、いくつかのバイオポリマーのいずれか（生物ベースのシステム）、リポソーム、コロイド、樹脂、および他のポリマー送達システムを用いるシステム、または区画化されたリザーバーを含み、治療用化合物の連続的または長期的供給源を提供するために、本明細書に記載される組成物とともに利用することができる。
当業者は、本発明の方法で使用される眼用組成物のいずれかが眼の環境に留まると考えられる持続期間は、特に、製剤中に用いられる化合物の物理化学的および／または薬理学的特性、用いられる化合物の濃度、化合物のバイオアベイラビリティ、処置される疾患、投与様式、ならびに処置の好ましい寿命のような因子に依存することを認識するであろう。
本発明の方法による処置の頻度は、処置される疾患、PIC1ペプチドの送達可能濃度、および送達方法に従って決定される。硝子体内注射によってペプチドを送達する場合、投薬頻度は月1回であってもよい。好ましくは、投薬頻度は3か月ごとである。投薬頻度は、観察によって決定することもでき、投薬量は、以前に送達されたペプチドが目に見えて排除される場合に送達される。一旦治療結果が達成されれば、ペプチドを漸減または中止することができる。場合によっては、副作用が、療法の中止の十分な根拠となる。一般に、有効量の化合物は、症状の主観的軽減かまたは臨床医もしくは他の資格のある観察者によって認められるような客観的に確認可能な好転のいずれかを提供するものである。
本発明の経鼻組成物
いくつかの態様では、本発明の組成物は、例えば、吸入、吹送、または噴霧を含めた経鼻投与のために製剤化される。組成物は、例えば、点鼻剤、鼻スプレー、およびに吸入、吹送、および／または噴霧に適した製剤の形態であってもよい。
一態様によれば、本発明は、経鼻的に許容される担体および／または賦形剤中に本明細書に記載される治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3を含む薬学的組成物も含む。そのような担体としては、例えば、本明細書列挙されるものが挙げられる。
経鼻投与
本発明の経鼻組成物の投与は、点鼻剤、スプレー、吸入可能な製剤、および噴霧製剤であってもよいが、他の投与様式が有効である場合もある。しかし、本発明は、鼻に位置する細胞または組織内の十分な量のペプチドが、治療的有効性を達成するという条件で、局所的（鼻腔内適用）または全身的（例えば、経口、もしくは他の非経口経路、例えば皮下投与など）も含むという点において、経鼻送達に限定されない。非経口投与は、専門家に明らかな適切な環境で使用される。好ましくは、経鼻組成物は、正確な投薬量の単回投与に適した単位剤形で投与される。
前述のように、インサイチューでの鼻内領域への送達は、スプレー、滴剤、または正確に計量された量の望ましい経鼻組成物を鼻孔に導入するように設計された吸入器もしくはネブライザー装置によって達成することができる。他の鼻腔内投与経路および形態も企図され、本発明の範囲内である。
この方法で使用される、投与されるPIC1ペプチドの量および経鼻組成物中の化合物の濃度は、希釈剤、送達システムまたは選択される装置、患者の臨床状態、副作用、および製剤中の化合物の安定性に依存する。したがって、医師は、適切な濃度のペプチドを含む適切な調製物を用い、問題になっている患者または同様の患者での臨床経験に応じて、投与される製剤の量を選択する。
当業者は、本発明の方法で使用される経鼻組成物のいずれかが鼻の環境に留まると考えられる持続期間は、特に、製剤中に用いられる化合物の物理化学的および／または薬理学的特性、用いられる化合物の濃度、化合物のバイオアベイラビリティ、処置される疾患、投与様式、ならびに処置の好ましい寿命のような因子に依存するであろうことを認識するであろう。
本発明の方法による処置の頻度は、処置される疾患、PIC1ペプチドの送達可能濃度、および送達方法に従って決定される。経鼻吸入または吹送によってペプチドを送達する場合、投薬頻度は月1回であってもよい。好ましくは、投薬頻度は3か月ごとである。投薬頻度は、観察によって決定することもでき、投薬量は、以前に送達されたペプチドが目に見えて排除される場合に送達される。一旦治療結果が達成されれば、ペプチドを漸減または中止することができる。場合によっては、副作用が、療法の中止の十分な根拠となる。一般に、化合物の有効量は、症状の主観的軽減かまたは臨床医もしくは他の資格のある観察者によって認められるような客観的に確認可能な好転のいずれかを提供するものである。
併用療法
本発明のさらなる態様は、本発明の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、補体系を調節する方法を提供する。本発明の薬学的組成物は、唯一の活性な薬学的剤として投与することができるが、これらは、補体系の調節に有効な1種または複数種の治療剤または予防剤と組み合わせて使用することもできる。この局面では、本発明の方法は、補体系の調節で有効な1種もしくは複数種のさらなる治療剤もしくは予防剤の前に、該剤と同時に、および／または該剤の後に、本発明の薬学的組成物を投与する段階を含む。
本発明の薬学的組成物は、併用療法でさらなる剤とともに、一緒にかもしくは別々かのいずれかで、または薬学的組成物とさらなる剤を1つの組成物中で組み合わせることによって、投与することができる。投薬量は、補体系の最大の調節を達成するように、投与および調整される。例えば、薬学的組成物とさらなる剤の両方は、通常、単独療法レジメンで通常投与される投薬量の約10％～約150％の間、より好ましくは約10％から約80％の間の投薬量レベルで存在する。
本発明はまた、以下の実施例を通して説明され、示される。しかし、本明細書の任意の場所でのこれらおよび他の実施例の使用は例示に過ぎず、本発明または任意の例示された用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書で説明されるいかなる特定の好ましい態様にも限定されない。実際に、本明細書を読めば、本発明の多くの修正および変形が当業者に明らかになる可能性があり、そのような変形は、趣旨または範囲において本発明を逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
実施例1：ALIにおけるサイトカインの発現および肺傷害に対するPA-dPEG24の効果
COVID-19の重症例で顕在化する急性肺傷害は、サイトカインストームをともなう宿主免疫応答から生じることが示されており（Mehta et al., 2020）、NETosisが、サイトカイン産生への寄与だけでなく、直接的な肺傷害を介した、COVID-19患者における急性肺傷害（ALI）の重要な駆動体であることが仮定された（Barnes et al., 2020）。輸血前に投与されたSEQ ID NO:2の10および160mg/kgの単回用量、または輸血後に異なる時間に投与された40および160mg/kgの単回用量のいずれかのサイトカインレベルに対する効果を決定するために、最終の血液試料を得た。血液試料から血漿を単離し、これを、xMAPビーズベースのイムノアッセイによって以下の炎症性サイトカインについて解析した：IFNガンマ、IL-6、IL-2、IL-10、TNFアルファ、MCP-1（CCL-2）、RANTES（CCL-5）、MIP1アルファ（CCL-3）、IL-1ベータ、およびMIP-2（CXCL2）。SEQ ID NO:2のこの用量を2ヒットALIラットモデル（Rivera et al., 2020）で試験した。確立された2ヒットALIモデル（Silliman et al., 1997; Silliman, 2006）を作り替えたこのモデルでは、青年期の雄のウィスターラットにリポ多糖（LPS）（第1のヒット）を注射して、好中球を刺激し、続いて30分後に30％の不適合赤血球（第2のヒット）の輸血を行い、補体活性化を惹起する。最も重要なことは、この2ヒットALIモデルは、幅広い炎症促進性サイトカイン全体にわたってきわめて強い応答を生じさせ、サイトカインストームを再現する。輸血前に与えたSEQ ID NO:2の10もしくは160mg/kgの用量、または輸血後に与えた40もしくは160mg/kgの用量は、炎症促進性サイトカインの有意な低減またはレベルの低減傾向のいずれかをともなって、サイトカインレベルをモジュレートした（図1）。xMAPビーズベースのイムノアッセイによる他の炎症性サイトカインの解析は、以下を含んでいた：IL-5、IL-18、IL-1アルファ、IL-13、IL-17、IL-12、およびIP-10（図2）。輸血前に与えた10または160mg/kgの用量または輸血後に与えた40または160mg/kgの用量のPA-dPEG24は、炎症促進性サイトカインの有意な低減またはレベルの低減傾向のいずれかをともなって、サイトカインレベルをモジュレートした。実験の第2ラウンドでは、以下の実験群について血漿試料を解析した：シャム、1ヒット、2ヒット、2ヒット＋10mg/kgの予防用量のRLS-0071、2ヒット＋160mg/kgの予防用量のRLS-0071、2ヒット＋30秒での40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071、および2ヒット＋30秒での160mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071（図16A～16Cおよび図17A～17C）。報告される各サイトカインについて、各動物について2回の反復実験を行った。データは平均値および平均値の標準誤差である。
重要なことに、図1および2に示す炎症性Th1およびTh17サイトカインの低減と対照的に、PA-dPEG24は抗炎症性Th2サイトカインIL-4のレベルを有意に低下させなかった（図3）。Th2細胞は、病的炎症の低減に関与するM2マクロファージの代替活性化を促進し、Th1応答を中和する。
これらの発見は、驚いたことに、PA-dPEG24がALIにおいて炎症促進応答をモジュレートすることができることを示した。PA-dPEG24がALI動物モデルにおいて炎症性サイトカインレベルをモジュレートすることができることは予想外であった。組織診断によって評価した場合の肺損傷と炎症性サイトカインレベルの両方が、PA-DPEG24の予防投与とレスキュー投与の両方によって低減するという観察によって、この分子が、ALIに寄与する複数の炎症経路を低減させることができることが示唆される。
上に示されるサイトカインに加えて、輸血前に与えた10もしくは160mg/kgのPA-dPEG24の用量または輸血後に与えた40もしくは160mg/kgの用量は、有意な低減またはレベルの低減傾向のいずれかをともなって、他のサイトカインおよび増殖因子のレベルをモジュレートした（図4）。
RLS-0071は好中球媒介性ALIを低減させる
本発明者らの以前に開発した2ヒットALIモデルは、ウィスターラットへのLPS（第1のヒット）の注入によって開始し、続いて30分後に、30％の不適合赤血球（第2のヒット）の輸血を行い、4時間後に本動物を屠殺する。本動物の肺は、劇的な好中球媒介性ALIを示し、さらには、それぞれ血流中のC5aレベルおよび遊離DNAによって測定した場合に強い補体活性化およびNETosisも示した。このモデルにおいて、RLS-0071が肺損傷を緩和する能力を評価するために、第2のヒットの2分前に投与される単回予防用量のRLS-0071で、または第2のヒット後の様々な時点でのレスキュー用量として動物を処置した。第2のヒットから4時間後に動物から肺を単離し、H&E染色によって組織を評価した。シャム動物（図18A）またはLPS単独の第1のヒットを受けた動物（図18B）は正常な肺組織構造を呈したが、2ヒットの侵襲を受けた動物は、肺胞壁中への実質的な好中球浸潤によって媒介される際立った肺損傷を示した（図18C）。これに対して、不適合赤血球輸血の2分前に10、40、または160mg/kgで予防用量のRLS-0071を受けた動物は、肺損傷の顕著な低減を示し、肺組織はシャム動物のものと同様の肺形態を示した（図18D～18F）。第2のヒットの投与から0.5、60、90、120、および180後に40mg/kgのRLS-0071のレスキュー投与を受けた動物もシャム動物のものと似た肺組織構造を呈した（図18G～18K）。
このモデルにおいて、RLS-0071による肺組織保護のレベルを決定するために、異なる処置群についての細胞壁肥厚に関してH&E切片の段階分けを行った。ImageJ（NIH）解析によって、無作為化された顕微鏡視野の画像を白黒に変換し、定量化した。次いで、肺損傷の尺度として、黒対白のピクセルの比を決定した：肺損傷が増大するにしたがって、肺胞壁が肥厚し、肺胞腔（白色の腔）が縮み、これにより、白色のピクセルが減少し、黒色のピクセルが増加した。H&E切片の顕微鏡観察によって直接可視化された、組織損傷がないことと一致して、シャム動物およびLPSの第1のヒットのみを受けた動物は肺傷害スコアが低かったが、2ヒットの侵襲を受けた動物は、以前に示されたように、はるかに高い傷害スコアを示した（図19）。10mg/kgの予防用量のRLS-0071を受けた動物は肺損傷の有意な低減（p=0.002）を示し、この効果は、未処置の2ヒット動物と比較して、40mg/kgの予防用量を受けた動物で増強された（p<0.001）。160mg/kgのRLS-0071で予防的に投与されたラットは40mg/kg用量と同様の肺スコアを有しており、これは、40mg/kgを超える投与は、肺組織に対していかなる追加的な保護も与えなかったことを示す（40mg/kg用量と160mg/kg用量を比較して、p=0.33）（図19）。第2のヒット後の様々な時点で動物に投与することが肺損傷を緩和することができるかどうかを評価するために、2ヒットの侵襲に供した動物を赤血球輸血から0.5、60、90、120、および180分後に40mg/kgのRLS-0071で処置した。第2のヒット後のすべての時点におけるRLS-0071での処置によって、肺損傷の有意な低減（すべてp<0.001）が示された（図19）。これらの結果によって、単回用量のRLS-0071が、この実験モデルにおいて2ヒットの侵襲から最大3時間後まで急性肺傷害を有意に減弱することができることが示唆される。
RLS-0071は血液中のC5a産生を低減させる
LPSのみの第1のヒットを受けた動物は、LPS媒介性代替経路の活性化に起因するC5aのレベルの増加を呈したが、2ヒットの侵襲を受けた動物は、LPSを介した代替経路の活性化と不適合赤血球輸血を介した古典的経路媒介性活性化の組み合わせにより、はるかに高いレベルのC5aを示した。このモデルにおいて、C5a産生に対するRLS-0071の効果を評価するために、2ヒットの侵襲に供したラットを予防用量またはレスキュー用量のRLS-0071で処置し、第2のヒットの侵襲から0分、5分、および1時間後に得た血液試料からC5aレベルを測定した。シャム動物はベースラインレベルのC5a産生を有していたが、LPSの第1のヒットを受けた動物は、5分および1時間でレベルの増加を示した（図20）。2ヒットの侵襲を受けた動物は、予想通り、1時間の時点で実質的により多くのC5a産生があった（図20）。10、40、および160mg/kgの予防用量としてRLS-0071を受けた動物は、各用量群について、5分の時点でC5aの有意な低減を示し（p<0.001）、180分のレスキュー用量を除いて、10mg/kg用量での1時間の時点のC5a低減は有意性に達した（p=0.002）（図20）。5分の時点の予防投与で観察されたように、2ヒットの侵襲から0.5（p=0.001）、60（p<0.001）、90（p<0.001）、および120（p=0.001）分後に投与された40mg/kgのレスキュー用量のRLS-0071も、180分でレスキュー用量を受けた動物を除いて、C5aのレベルの有意な低下を示した（図20）。1時間の時点で、すべてのレスキュー用量は、2ヒットのみの動物と比較して、C5aのレベルが有意に低減した（0.5（p=0.004）、60（p<0.001）、90（p<0.001）、120（p=0.010）、および180（p<0.001）分。これらの発見により、このモデルにおいて、RLS-0071が補体活性化を有意に阻害することができることが示される。
RLS-0071は血液中の遊離DNAの蓄積を阻害する
活性化された好中球から放出される好中球細胞外トラップ（NET）は、様々な自己免疫性、代謝性、および炎症性疾患において病原性の役割を果たすことが以前に示されている。NETは、ウイルス誘導性ALIおよびTRALIのマウスモデルで観察されており、さらには、血流中の遊離DNAは、TRALIを有するヒト患者およびCOVID-19患者の血液中のNETに対するバイオマーカーでもある。血液中の遊離DNAレベルに対するRLS-0071の効果を確認するために、輸血から4時間後に、異なる処置群からの血漿をPicoGreenアッセイで定量化した。予想通り、2ヒットの侵襲を受けた動物は、シャム動物およびLPSのみの第1のヒットを受けた動物と比較して、遊離DNAの高い血漿レベルを示した（図21）。予防用量のRLS-0071を受けた動物は、10mg/kg、40mg/kg、および160mg/kgの用量で遊離DNAのレベルの低減を示し、160mg/kg用量は、2ヒットのみの動物と比較して、遊離DNAの有意な低減を示した（p=0.026）。第2のヒットの侵襲後にレスキュー用量の40mg/kgのRLS-0071に供した動物も、2ヒットの傷害から最大3時間後までに投与した場合に遊離DNAのレベルの低減を示し、120および180分でのレスキュー投与は統計的有意性（それぞれ、p=0.039およびp=0.005）に達した。これらの結果によって、RLS-0071が、この疾患モデルおよびこの活性においてNET形成をモジュレートすることができることが示される。
RLS-0071は血液中の炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルを低減させる
ALIの重症例では、肺胞マクロファージおよび上皮細胞は、疾患プロセスを悪化させ、急性呼吸器疾患症候群（ARDS）につながる、かなりの量の炎症促進性サイトカインを放出する可能性がある。このいわゆる「サイトカインストーム」はウイルス誘導性ALI、特に、COVID-19における重症の転帰と関連する侵攻性の炎症応答について十分に実証されている［Polidoro RB, Hagan RS, de Santis Santiago R, Schmidt NW. Overview: Systemic Inflammatory Response Derived From Lung Injury Caused by SARS-CoV-2 Infection Explains Severe Outcomes in COVID-19. Front Immunol 2020;11:1626］。本発明者らのラット2ヒットモデルにおける、肺組織診断によって見られた著しいALIを考慮して、ラットの血液からのサイトカイン（図16A～16C）およびケモカイン（図17A～17C）のレベルをRLS-0071の非存在または存在下で最終の4時間の時点で測定した。予想通り、シャム動物からの血漿は、試験したすべてのサイトカインについてシグナルのレベルが低かった。LPSのみの1ヒットを受けた動物はサイトカインのレベルが増加していたが、2ヒットの侵襲を受けた動物はサイトカインのレベルがより大きく、これは、組織診断によって観察された2ヒット動物における肺損傷の増大と相関する（図18A～18K）。評価した炎症促進性サイトカイン（IL-1a、IL-1b、IL-6、IFN-g、IL-17、IL-18、TNFa、およびRANTES）ならびにケモカイン（MCP-1、MIP-1a、およびMIP-2）のそれぞれについて、10または160mg/kgのRLS-0071の予防投与および40または160mg/kgのRLS-0071のレスキュー投与を受けた動物は、未処置の2ヒット動物と比較して、サイトカインおよびケモカインのレベルが低減し、レベルが著しく低減したものもある（図16A～16Cおよび17A～17C）。まとめると、これらの結果によって、単回の予防用量またはレスキュー用量のRLS-0071は、補体阻害のその二重阻害活性および好中球媒介性NET形成の直接的モジュレーションを通して、この2ヒットモデルにおいて重症のALIを緩和することができることが示される。
考察
本研究の目的は、以前に記載された新規な2ヒットラットモデル［Gregory Rivera M, Hair PS, Cunnion KM, Krishna NK. Peptide Inhibitor of Complement C1 (PIC1) demonstrates antioxidant activity via single electron transport (SET) and hydrogen atom transfer (HAT). PLoS One 2018;13(3):e0193931］において、抗炎症性分子RLS-0071がALIを緩和することができるかどうかを決定することであった。LPSの第1のヒット、その後の、30分後の不適合赤血球の第2のヒットは、赤血球輸血後4時間以内に重症のALIをもたらす。組織診断によって観察されるALIは、強い好中球活性化および肺組織中への滞留、古典的および代替補体経路の活性化、ならびに本明細書で報告するように、炎症性サイトカインの著しい産生によって媒介され得る。RLS-0071はPIC1ファミリーの化合物のリード誘導体であり、インビトロ、インビボ、およびエクスビボ研究において古典的補体活性化を阻害し、インビトロおよびエクスビボ研究においてミエロペルオキシダーゼの阻害を介してNET形成を阻害することが示されている。補体阻害および好中球モジュレーションの二重抗炎症活性を考慮して、RLS-0071が、この動物モデルにおいてALIを阻害することができるという仮説が立てられた。本明細書の結果は、予防的にかまたはレスキュー用量としてかのいずれかで単回用量として送達されるRLS-0071は、不適合赤血球輸血の第2のヒットから最大3時間後までに送達された場合でさえ、ALIを阻害することができたことを示す。これは、組織診断によって評価した場合の肺損傷スコアの低減、尺度C5aとしての補体活性化の低減、NETosisのバイオマーカーとして働く遊離DNAのレベルの低下、ならびに炎症性サイトカインおよびケモカインの低減によって示された。
ALIは、ウイルス感染（例えば、COVID-19、RSV、もしくはインフルエンザ）または輸血などの外部の誘発因子による補体カスケードの活性化および自然免疫応答の後に続いて起こり、患者の根底にある健康状態の影響を受ける。補体活性化は数秒内に起こり、肺組織への好中球の動員およびこれらの細胞の活性化につながって、NETを生成し、さらにはマクロファージを動員および活性化し、次にこれが、炎症性サイトカインを産生する。免疫応答のこの経時的な増幅は、ALI/ARDSおよび死亡に進行する可能性がある過剰炎症の状況につながる。この2ヒットモデルで観察されたRLS-0071によるALIの強力な阻害は、免疫調節不全の最も初期の段階における該分子の二重抗炎症活性、すなわち、補体阻害および好中球モジュレーションに起因し得る。RLS-0071は、ラットにおいて、IV投与の30秒以内に古典的補体活性を阻害することができ、好中球活性化を直接モジュレートすることができる（NETosisおよびミエロペルオキシダーゼ活性）。数秒以内に作用することによって、RLS-0071は、炎症カスケードの最も初期の段階で自然免疫応答の体液性と細胞性の両方の局面をダウンレギュレートし、サイトカインストーム、および続いて起こる組織損傷を防止することができる。この2ヒットモデルにおいてRLS-0071がALIを緩和する能力は、ウイルス誘導性ALIまたはTRALIのための臨床的治療剤としての有用性について潜在性を有する。
実施例2：PA-dPEG24のインビボでの組織結合
PA-dPEG24をラットの組織で検出することができるかどうかを決定するために、留置頚静脈カテーテルを通して400mg/kgのPA-dPEG24のボーラスIV投与を雄のウィスターラットに行った。注入から4時間後、ラットを屠殺し、肝臓および腎臓を採取し、ホルマリン中で固定した。これらの器官からの組織を続いて切片化し、ガラススライドに固定した。PA-dPEG24が組織に結合しているかどうかを決定するために、組織切片を脱パラフィンし、アフィニティー精製した1:1,000希釈のウサギ抗PA-dPEG24抗体でプローブした。次いで、ビオチンとストレプトアビジンペルオキシダーゼの組み合わせ、その後ペルオキシダーゼの存在下で茶色の沈殿物を形成する3,3’-ジアミノベンジジン（DAB）によって抗体シグナルを強めた。図5に示すように、PA-dPEG24を受けていないラットから採取した肝臓組織の顕微鏡画像は染色を示さなかったが（左パネル）、PA-dPEG24で処置したラット由来の組織で分離した染色が可視化された（右パネル）。腎臓組織についても同じ発見が観察され、PA-dPEG24を受けていない動物は染色を示さなかったが（左パネル）、PA-dPEG24で処置した動物は、糸球体および尿細管で濃い染色を示した（右パネル）。これらの結果によって、PA-dPEG24が有意かつ予想外の組織浸透を呈することが示された。
実施例3：PA-dPEG24は好中球の結合および接着に影響を及ぼす
PA-dPEG24はインビトロで好中球に直接結合する
本発明者らは、PA-dPEG24が、インビトロでNETosisを受けている好中球をモジュレートすることができることを以前に報告した［Hair et al., 2018］。好中球とともにインキュベートされるPA-dPEG24を試験する継続実験を行っている間に、本発明者らは、PA-dPEG24に曝露された好中球が、ガラススライドの表面に接着した数の減少を示すことを認めた。次いで、本発明者らは、PA-dPEG24が好中球に影響を及ぼしていたのか、またはスライドの表面が接着性の低減の原因となったのかを決定するために実験を行った。好中球はPA-dPEG24でコーティングされている可能性があり、洗浄工程を繰り返した後でもコーティングされたままであると決定され、これにより、PA-dPEG24が好中球表面に密接に接着していることが示された。したがって、スライドの表面は好中球の結合に影響を及ぼさなかった。
インビボALIモデルで見られたNET形成の阻害によって、PA-dPEG24が好中球と直接相互作用することが示唆される。好中球へのPA-dPEG24の結合を評価するために、精製されたヒト好中球をガラススライド上にサイトスピンした。次いで、1セットのスライドにPA-dPEG24（1mM）を30分間添加し、続いて、スライドをPBSで洗浄した。次いで、細胞をPA-dPEG24に対する抗体（1:1,000希釈のニワトリ抗PIC1）とともにインキュベートし、その後に、標識された二次抗体（1:2,000希釈の抗ニワトリ、Alexa Fluor 488）とともにインキュベートし、DAPIで対比染色した。次いで、顕微鏡によって細胞を可視化した。それぞれの場合で、DAPI染色によって、細胞がスライド上に存在し、インタクトであることが確認された。シグナルを示さなかった、PA-dPEG24を受けていない細胞と比較して、PA-dPEG24で処理した好中球は蛍光シグナルを示し、これにより、細胞表面へのペプチドの直接結合が示される（図6）。
PA-dPEG24はインビトロで好中球の接着を低減させる
PA-dPEG24の結合が、インビトロで好中球が表面に接着する能力に影響があるかどうかを確認するために、精製されたヒト好中球を漸増濃度のPA-dPEG24とともにインキュベートし、PBSで2回洗浄し、ガラススライド上に設置し、次いで、加湿された37℃のインキュベーター中で5％CO2の存在下で2.5時間インキュベートした。続いて、スライドをDAPI（2％BSA中に1:1000）で染色し、その後、蛍光顕微鏡によって20倍で画像化した。ImageJ解析（NIH）を使用して細胞染色の量の定量化を行った。漸増量のPA-dPEG24は、スライドに接着した細胞の数を用量依存的に減少させた（図7）。フィブリノーゲンで予めコーティングしたガラススライド上で好中球の接着性が変わるかどうかを確認するために、精製されたヒト好中球を漸増濃度のPA-dPEG24とともにインキュベートし、PBSで2回洗浄し、フィブリノーゲンでコーティングしたガラススライド上に設置し、次いで、加湿された37℃のインキュベーター中で5％CO2の存在下で2.5時間インキュベートした。続いて、スライドをDAPI（2％BSA中に1:1000）で染色し、その後、蛍光顕微鏡によって20倍で画像化した。ImageJ解析（NIH）を使用して細胞染色の量の定量化を行った。フィブリノーゲン処理なしのガラススライド上にコーティングされた試料と比較して、PA-dPEG24は、予想外に、用量依存的に好中球の接着性を低下させた（図8）。
PA-dPEG24はインビトロでヒト好中球の生存率を高める
PA-dPEG24がインビトロでヒト好中球に直接結合し、表面へのその接着をモジュレートする能力を考慮して、本発明者らは、次に、このペプチドが細胞生存率に直接影響があるかどうかを決定した。Cell Counting Kit-8（Dojindo）を使用して、漸増量のPA-dPEG24の存在下での細胞生存率を決定した。Cell Counting Kit-8（CCK-8）は、細胞増殖アッセイおよび細胞傷害性アッセイにおける細胞生存率の決定のための感度のよい比色定量アッセイである。非常に水溶性のテトラゾリウム塩、WST-8は、細胞中の脱水素酵素活性によって還元されて、組織培養培地に可溶性である黄色のホルマザン色素を生じる。細胞中の脱水素酵素の活性によって生成されるホルマザン色素の量は、生細胞の数に正比例する。全血から好中球を単離した。手短に言えば、ヘパリン処理した全血を異なる4個体（n=4）から収集した。Hypaque／フィコールグラジエント上で血液をスピンさせた。ペレットを収集し、3％デキストランを20分間添加した。上清を収集し、数回洗浄した。赤血球を溶解した後、PBSまたはRPMIのいずれかに1.0×10^6細胞/mLの濃度で好中球を再懸濁した。この時点で「新鮮な」好中球が得られ、100μL（100,000細胞／ウェル）を96ウェルプレートに添加した。10μLのCCK-8（Dojindo Molecular Technologies）を37Cで2時間各ウェルに添加した。450nmの吸光度を読み取って、生存率を決定した。このインキュベーションの間、残りの細胞を様々な用量のPA-dPEG24とともに室温で30分間インキュベートした。次いで、細胞を2mLのPBS/RPMIで洗浄し、再懸濁した。細胞を室温でさらに30分間インキュベートし、次いで、100μLをプレートに添加した。10μLのCCK-8を各ウェルに添加した。細胞を試薬とともに37Cで2時間インキュベートした。450nmの吸光度を読み取って、生存率を決定した。緩衝液単独と比較して、PBSまたはRPMI中でPA-dPEG24で処理した細胞は、生存率の用量依存的増加を示し（図9）、これは、PA-dPEG24の投与が細胞生存率の増加をもたらすことを意味する。
好中球および上皮細胞受容体へのPA-dPEG2の結合
PA-dPEG24が好中球に結合し、細胞生存率および接着に影響を与える能力によって、ペプチドが好中球表面受容体と、潜在的に好中球との相互作用および接着に必要とされる内皮細胞の受容体とに特異的に結合することが示唆される。この仮説に対処するために、好中球リガンド（LFA-1およびMAC-1/CR3）ならびに上皮細胞リガンド（ICAM-1/CD54およびICAM-2/CD102）がマイクロタイタープレートに結合したELISA型結合アッセイを開発した。次いで、プレートを1％ゼラチン／PBS緩衝液中で漸増量のPA-dPEG24とともにインキュベートし、ペプチドに対する抗体でプローブし、発色させた。PA-dPEG24は、MAC-1ではなく、好中球受容体LFA-1に用量依存的に結合した。さらに、PA-dPEG24は、ICAM-2ではなく、内皮受容体ICAM-1に結合した。陽性対照として、C1qをリガンドとして使用し、これは、予想通り、PA-dPEG24に用量依存的様式で結合した（図10）。さらに、PA-dPEG24は、ICAM-1と同様の親和性でICAM-3およびICAM-4に結合したが、ICAM-5への優れた結合も示した（図11）。
PA-dPEG24が血漿中のICAM-1およびLFA-1に結合することができるかどうかを確認するために、これらの受容体をマイクロタイタープレート上にコーティングし、次いで、漸増量のPA-dPEG24を含むヒト血漿とともにインキュベートし、ペプチドに対する抗体でプローブし、次いで、発色させた。PA-dPEG24は、好中球受容体LFA-1および内皮受容体ICAM-1に用量依存的に結合した。陽性対照として、C1qおよびMPOをリガンドとして使用し、これらは、予想通り、PA-dPEG24に用量依存的様式で結合した（図12）。これらの結果によって、PA-dPEG24が、細胞表面受容体との特異的な相互作用を通して好中球の接着性および生存率をモジュレートすることができることが示唆される。
ここに示される結果によって、PA-dPEG24が、特異的な細胞表面受容体を介してヒト好中球に直接結合することができ、好中球の生存率および接着性をモジュレートすることができることが示される。PA-dPEG24が組織（肝臓および腎臓）に結合し、ALIに供したラットのサイトカインレベルをモジュレートすることを示すインビボデータとあわせて、これらの結果によって、PA-dPEG24が、好中球を直接標的化することによって強力な抗炎症性分子として作用することができることが示唆される。さらに、これらの特性によって、RLS-0071が、多数の眼内炎症性疾患ならびに角膜炎症性疾患（例えば、ブドウ膜炎、ROP、および／または網膜炎）において、補体媒介性炎症および好中球活性を低下させることができる可能性があることが示唆される。
実施例4：放射標識されたPA-dPEG24の薬物動態アッセイ
[14C]-PIC1-dPEG24（放射標識されたPA-dPEG24）に関連したプールされた全血および血漿中の全放射能の薬物動態、ならびにプールされた血漿試料中の代謝物プロファイルは、20または200mg/kgのPA-dPEG24（200μCi/kg、それぞれ、群3および群4）の単回IV投与後に無処置の雄のSprague-Dawley系ラット（N=6）で行った。10分、30分、および1時間、2時間、3時間、4時間、6時間、8時間、24時間、および48時間での連続的な採血のために、群3および群4の6匹のラットを2つの亜群にさらに分けた。各時点で、動物全体にわたって、等しい容量で血液をプールし、プールされた血液の一定分量（約200μL）を全放射能用に各時点で取り出し、残りの血液試料を遠心分離して、血漿を得た。胆管カニューレ処置（BDC）ラットで最大72時間まで、無処置のラットで最大168時間まで、胆汁、尿、糞便、およびケージ洗浄試料を収集し、研究の終わり（投与から72時間後または168時間後）に最終の血液試料を収集した。排泄物、血液、および血漿中の全放射能濃度を均質化、燃焼および／または液体シンチレーション計数（LSC）によって決定した。LC-UV/MSおよび放射性検出を使用して、プールされた血漿、尿、および胆汁試料において代謝物プロファイルおよび構造の特徴づけを行った。WinNonlinソフトウェアによって、血液および血漿中の[14C]-PIC1-dPEG24関連成分の全放射能のPKパラメーターを得た。
ラットにおいて[14C]-PIC1-dPEG24は広く代謝され、加水分解および／または脱水素化合物として少なくとも15種の代謝物が検出された。PIC1-dPEG24は溶液、ラットの尿、および／またはラットの血漿中で安定でなく、脱水素によってM2768に分解する可能性がある。脱水素の位置は、内部ジスルフィドを形成するための2つのCys残基上にあると提案された。提案された代謝経路は、N末端からのペプチドの連続的加水分解を示した。M2768からのIle、Ala、Leu、Ile、Leu、Glu-Pro、Ile、脱水素Cys-Cys、Gln、Glu、Arg、Alaの連続的な消失の後、代謝物M2654、M2583、M2470、M2357、M2244、M2018、M1905、M1701、M1573、M1444、M1288、およびM1217が形成された。M160およびM89は、アミノ酸とdPEG24の間のアミド結合の加水分解後のM1444およびM1288からの代謝物であった。代謝プロファイルは、ラットの血漿、尿、および胆汁について得られたが、放射能が低いため、糞便については得られなかった。低用量群および高用量群の間で、PIC1-dPEG24の代謝について有意差が観察されなかった。
低用量群（群3）および高用量群（群4）についてのラットの血漿の放射性プロファイルは、定性的に同様であった。0～24時間AUCのプール試料では、親PIC1-dPEG24およびその脱水素産物M2768は、それぞれ、低用量群および高用量群において、約12％および16％の血漿放射能を一緒に示した。代謝物M89/M160、M2018、M2244/M2357/M2470、M2583、およびM2654は、比較的高い量で検出され、低用量群において、それぞれ、約7％、12％、52％、4％、および10％の血漿放射能を示し、高用量群において、それぞれ、9％、7％、44％、7％、および12％の血漿放射能を示した。他の代謝物は微量であり、それぞれ、3％未満の血漿放射能を示した。AUC0～24時間のプール血漿の各放射性ピークの推定濃度は、0～24時間以内の平均濃度を示した。低用量群では、親PIC1-dPEG24およびその脱水素産物M2768は、187ng Eq/gとして一緒に計算された。代謝物M89/M160、M2018、M2244/M2357/M2470、M2583、およびM2654は、それぞれ、114、183、252、65、および161ng Eq/gの推定濃度を有していた。高用量群では、親PIC1-dPEG24およびその脱水素産物M2768は、2225ng Eq/gとして一緒に計算された。代謝物M89/M160、M2018、M2244/M2357/M2470、M2583、およびM2654の計算濃度は、それぞれ、1237、981、3024、953、および1678ng Eq/gであった。8時間まで試料をプールした時点で、親、すなわちPIC1-dPEG24、およびその脱水素産物M2768のパーセントは、低用量群において約5％から40％まで、および高用量群において7％から60％まで、経時的に一緒に増加し、これは、PIC1-dPEG24の代謝物が、低用量および高用量でPIC1-dPEG24よりも速く排出されることを示す可能性がある（表1ならびに図13および14を参照されたい）。主な代謝物（>10％の血漿放射能）は、M89/M160、M2357、M2470、およびM2018として観察され、それらの計算濃度は0.5時間～8時間まで経時的に減少した。
結論として、20または200mg/kgの[14C]-PIC1-dPEG24の単回IV投与後の雄の無処置ラットまたはBDCラットにおいて、[14C]-PIC1-dPEG24の代謝、薬物動態、および排泄量バランスを研究した。投与された放射能は急速に排泄され、用量の大部分（用量の>70％）は投与から24時間後以内に主に尿を介して回収され、糞便および／または胆汁中に少量から微量の用量しか見出されず、一方で、168時間までに用量の約82％～91％が排泄物中に見出された。本研究の結果によって、20および200mg/kgの単回IV投与後の雄のBDCラットおよび無処置ラットにおいて、尿排泄が[14C]-PIC1-dPEG24関連放射能の排出の主な経路であることが示された。無処置ラットにおける同じIV投与下で、血漿PKパラメーターは、全放射能について排出半減期が長い（≧40時間）と特徴づけられた。雄のBDCラットにおいて、[14C]-PIC1-dPEG24は複数の加水分解／脱水素代謝物に急速に加水分解された。M89/M160、M2018、M2244/M2357/M2470は血漿で観察された主な代謝物であり、一方で、不変の親化合物およびその脱水素産物M2768は一緒に、プールされた血漿において小さな放射性ピークとしてIV注射から30分後に観察されたが、これは、8時間の時点で依然として検出可能であった。尿中で検出された主な代謝物はM1444/M1701/M1573、M2018、M1288、M1217、M2244/M2357、およびM2470であり、不変の親化合物は、20および200mg/kg用量において、検出不可能であった。加水分解および脱水素は、単回IV投与後のラットにおいて、[14C]-PIC1-dPEG24の主な代謝経路であった。雄のラットにおける20または200mg/kgのIV投与の間で、[14C]-PIC1-dPEG24の代謝、薬物動態、および排泄について有意差は観察されなかった。
溶液、ラットの血漿、およびラットの尿におけるPIC1-dPEG24の安定性
脱水素産物M2768は、-20℃の冷凍庫で6日間保存した後に、水に希釈された用量溶液中で検出された。本データによって、PIC1-dPEG24が安定でないことが示された。ラットの血漿および尿におけるPIC1-dPEG24の安定性を探究するために、対照ブランクラットの血漿および投与前の尿試料に[14C]-PIC1-dPEG24をスパイクした。ラットの血漿と尿のスパイクされた試料の両方で脱水素産物M2768の量が有意に増加した。これらのデータによって、PIC1-dPEG24は、ラットの血漿／尿で安定でないか、または試料の処理中に脱水素産物に分解する可能性があるかのいずれかであることが示された。したがって、これらのデータに基づいて、M2768とPIC1-dPEG24の統合をラットの血漿プロファイルのために組み合わせた、なぜならば、酵素の関与なしでM2768が形成される可能性があるからである。さらに、M1905、M2018、M2244、M2357、M2470、M2583、およびM2654を含めた他の脱水素代謝物は、加水分解後にM2768から形成される可能性があるか、または最初に加水分解によって形成され、次いで、対応する脱水素代謝物に分解される可能性がある。脱水素は、Cys-Cysジペプチド残基でのジスルフィド形成であることが提案された。
プールされた血漿の代謝物プロファイル
低用量群および高用量群からのプールされた血漿試料（0～24時間AUCのプール）ならびに0.5、1、2、および8時間の時点のプールのラジオクロマトグラムを図13および14に示す。放射性ピークのパーセントとして表される分布パーセントを表1に示す。ラットの血漿中に合計で15種の代謝物が観察された。低用量群および高用量群についてのラットの血漿試料の放射性プロファイルは、定性的に同様であった。
（表１）[14C]-PIC1-dPEG24の20または200mg/kgの単回IV投与後の雄のラットのプールされた血漿試料におけるPIC1-dPEG24&代謝物のピーク分布
Figure 2023548001000008
低用量群（群3）および高用量群（群4）についてのラットの血漿の放射性プロファイルは、定性的に同様であった。0～24時間AUCのプール試料では、親PIC1-dPEG24およびその脱水素産物M2768は、それぞれ、低用量群および高用量群において、約12％および16％の血漿放射能を一緒に示した。代謝物M89/M160、M2018、M2244/M2357/M2470、M2583、およびM2654は、比較的高い量で検出され、低用量群において、それぞれ、約7％、12％、52％、4％、および10％の血漿放射能を示し、高用量群において、それぞれ、9％、7％、44％、7％、および12％の血漿放射能を示した。他の代謝物は微量であり、それぞれ、3％未満の血漿放射能を示した。AUC0～24時間のプール血漿の各放射性ピークの推定濃度は、0～24時間以内の平均濃度を示した。低用量群では、親PIC1-dPEG24およびその脱水素産物M2768は、187ng Eq/gとして一緒に計算された。代謝物M89/M160、M2018、M2244/M2357/M2470、M2583、およびM2654は、それぞれ、114、183、252、65、および161ng Eq/gの推定濃度を有していた。高用量群では、親PIC1-dPEG24およびその脱水素産物M2768は、2225ng Eq/gとして一緒に計算された。代謝物M89/M160、M2018、M2244/M2357/M2470、M2583、およびM2654の計算濃度は、それぞれ、1237、981、3024、953、および1678ng Eq/gであった。8時間まで試料をプールした時点で、親PIC1-dPEG24およびその脱水素産物M2768のパーセントは、低用量群において約5％から40％まで、および高用量群において7％から60％まで経時的に一緒に増加し、これにより、PIC1-dPEG24の代謝物が、低用量および高用量でPIC1-dPEG24よりも速く排出されることが示された。主な代謝物（>10％の血漿放射能）は、M89/M160、M2357、M2470、およびM2018として観察され、それらの計算濃度は0.5時間から8時間まで経時的に減少した。
考察
ラット、イヌ、およびサル（別々の研究）におけるPKモデリング研究によって、PA-DPEG24は血流から急速に排除され、排出されない物質は別のコンパートメント（組織層）に滞留することが示される。経時的にペプチドは循環中に緩徐に放出されて戻される。これは、循環中の低レベルペプチドの非常に長いテールを示すPKプロファイルに反映される。
8時間まで試料をプールした時点で、親、すなわちPIC1-dPEG24、およびその脱水素産物M2768のパーセントは、低用量群において約5％～40％まで、および高用量群において7％～60％まで、経時的に一緒に増加した。すなわち、PIC-dPEG24インタクト分子が、プールされた血漿においてIV注射から30分後に小さな放射性ピークとして最初に検出され、これは、8時間の時点でも依然として検出可能であった。この驚くべき結果によって、投与された分子の一部は、組織層内の中央血管構造外に滞留し、ここで、該分子は分解から保護され、次いで、インタクトで血流に放出されて戻されることが示される。これは、ペプチドが周知のように血流中で不安定であることを考慮すれば、新規かつ完全に予想外の発見である。
実施例5：PA-dPEG24は単球細胞上のC1q受容体へのC1q－抗体複合体の結合を妨げない
C1qは、補体の古典的経路の最初の補体成分である。C1qはセリンタンパク質四量体C1s-C1r-C1r-C1sとともに、C1複合体として公知である。抗体でコーティングされた病原体がC1qの球状頭部に結合する際に、C1qは、C1qコラーゲン様ドメインの疎水性ポケットに位置するC1s-C1r-C1r-C1s四量体の活性化を可能にするコンホメーション変化を起こす。次いで、活性化されたC1s-C1r-C1r-C1sはC4、その後にC2を切断して、古典的補体経路の増幅を引き起こし、C3aおよびC5aの生成、C3bのオプソニン作用、ならびに膜攻撃複合体形成などのエフェクター機能をもたらす（Cooper, 1985）。
血流中では、循環C1複合体と遊離C1qが両方存在する。古典的経路の活性化とともに、C1qは、細胞残屑、例えば、アポトーシス小体および免疫複合体などの排除において重要な恒常性の役割も果たす。この排除は、アポトーシス性カーゴまたは免疫複合体カーゴに結合し、次いで、C1qのコラーゲン様領域を認識する食細胞（すなわち、好中球および単球／マクロファージ）上のC1q受容体に結合するC1qの球状頭部を介して起こる。これらの複合体は最終的に貪食される。このプロセスは、アポトーシス性残屑／免疫複合体の蓄積および自己免疫の発生（例えば、全身性エリテマトーデス）を防止する。
PA-dPEG24は、コラーゲン様領域の疎水性ポケットに結合し、C1q分子の球状頭部には結合しないことが示されている（Sharp et al., 2015）。PA-dPEG24がC1qと食細胞上のC1q受容体との相互作用を妨げないことを検証するために、以下の実験を行った。新しく精製されたヒト単球を96ウェル組織培養プレートに接着させ、非接着性リンパ球を除去した。次いで、単独の、または漸増濃度のPA-dPEG24の存在下のC1qをウェルに添加し、インキュベートした。未結合のC1qを洗い流し、オボアルブミンウサギ免疫複合体を添加し、インキュベートした。未結合の免疫複合体を洗い流し、抗ウサギHRP抗体を使用して、結合した免疫複合体を検出し、その後、TMBで発色させ、1N H2SO4で反応をクエンチし、プレートリーダー中で450nmで検出した。別に、C1qのインキュベーションの後に抗C1q抗体を使用して、単球へのC1qの結合を確認した。漸増量のPA-dPEG24の存在は、C1q免疫複合体のレベルを低減させなかった。驚いたことに、検出されるC1qの量は漸増量のPA-dPEG24とともに増大した（図15）。これらの結果によって、PA-dPEG24が単球上のその同種受容体へのC1q免疫複合体の結合を妨げず、したがって、C1qの恒常性機能（すなわち、免疫複合体／アポトーシス性残屑の排除）を妨げることは予想されないであろうことが示唆された。実際に、PA-dPEG24は、驚いたことに、単球へのC1q結合を増加させることが示された。この発見により、PA-dPEG24はインビボで免疫複合体のC1q媒介性排除を増加させることができる可能性があることが示唆される。したがって、理論に拘束されることを望むものではないが、この増加は、多数の炎症性の眼科的疾患（例えば、ブドウ膜炎または網膜炎）を含めて、免疫複合体が発病に寄与する疾患に影響があり、これは、免疫複合体の迅速性が増すことが疾患の重症度を小さくすることができる可能性がある状況である。
実施例5：硝子体内（IVT）注射によって送達されたPA-dPEG24の安全性および薬物動態プロファイル
方法
安全性研究。最大送達可能用量のRLS-0071（全体積5マイクロリットル中に160mg/ml）を4匹の雄のウィスターラットの右眼に硝子体内送達した。食塩水対照を左眼に投与した。この手順のために、イソフルランで動物に麻酔をかけ、該動物に局所麻酔剤プロパラカインも与えた。さらに、該動物に局所抗生物質トブラマイシンを注射後に与えた。注射から72時間後までの指定された時点で細隙灯検査を行い、以下のスコアリングスケールを用いて、改変MacDonald-Shadduck眼段階分けシステムを使用して、病状を段階分けした：0、無病状；1、軽微な病状；2、中程度の病状；3/4、重症の病状。
薬物動態研究。最大送達可能用量のRLS-0071（160mg/ml、全体積5μl）を雄のウィスターラットの右眼および左眼に硝子体内投与した。5分（n=4匹のラット）、1時間（n=3匹のラット）、4時間（n=2匹のラット）、24時間（n=2匹のラット）、4日（n=4匹のラット）および10日（n=3匹のラット）で、CO2窒息によって動物を安楽死させた。安楽死時に眼を摘出し、-80℃の条件で直ちに保存した。24時間後、凍結した眼を解剖学的なコンパートメントに区分し、今後の処理のために-80℃の条件で再び保存した。
RLS-0071サンドイッチELISA法。RLS-0071の半減期を決定するために、試料が粘性であり、ピペット中に容易に吸い込むことができなかったので、（標準的な公知の分量と比較して）マイクロチューブ中の試料のメニスカスに基づいて、各試料の硝子体液の体積を推定し、記録した。次に、100μlの1％BSA／PBSを各試料に添加し、これを4℃で一晩振盪機中に入れた。翌日、5,000rpmで5分間試料をスピンし、上清を収集し、RLS-0071サンドイッチELISA法に適用し、該ELISA法は、ペプチドを捕獲するための、RLS-0071に対する結合した一次ニワトリポリクローナル抗体、およびプレートに結合した任意のペプチドを検出するための、RLS-0071に対する一次ウサギポリクローナル抗体を利用した。次いで、HRPにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体でウサギ抗体をプローブし、TMBで発色させ、分光光度法によって450nmでプレートを読み取った。図22A～22Dに示されるデータは、4つの独立の実験の平均値である。エラーバーは平均値の標準誤差（SEM）を表す。
眼組織におけるRLS-0071に対するDAB染色。網膜におけるRLS-0071の組織分布を決定するために、上記のように、硝子体内投与される食塩水（対照）またはRLS-0071を受けた動物を、食塩水動物についてIVTから5分後に、RLS-0071を受けた動物についてIVTから1時間後に、安楽死させた。次いで、眼を採取し、眼組織を単離し、組織診断およびRLS-0071に対する一次ウサギポリクローナル抗体を使用するDABによる染色のために処理した。
結果
RLS-0071の硝子体内注射は安全である。160mg/kg（最大送達可能用量）のRLS-0071をラットに硝子体内注射し、以下の時点で、細隙灯によって病状について眼を調べた：IVT前、0.5、2、24、48、および72時間。無病状を示す0および重症の病状を示す3/4のスコアを用いて、改変MacDonald-Shadduck眼段階分けシステムを使用して、病状を判定した。食塩水対照と同様に、4匹の動物すべてについてRLS-0071関連毒性は観察されなかった（表2）。これらの結果によって、3日まで有害作用なしでRLS-0071をラットの眼の硝子体に安全に送達することができることが示される。
（表２）ラットにおけるRLS-0071のIVT投与の安全性評価
Figure 2023548001000009
硝子体内送達されたRLS-0071は半減期が延長される。IVT送達されたRLS-0071の薬物動態を評価するために、5マイクロリットルの全量で160mg/mlのRLS-0071をラットの眼にIVT注射した。注射から5分、1時間、4時間、1日、4日、および10日後に、安楽死時に動物の眼を取り出し、硝子体液を解析のために処理して、サンドイッチELISA法でRLS-0071を検出した。驚いたことに、RLS-0071はIVT注射から10日後まで検出することができ、24時間で0.12mg/mlで検出された（図22A～22B）。比較すると、200mg/ml（800mg/kg）のRLS-0071でIV注入されたラットは、24時間で0.07mg/mlのレベルを示し、その後は検出不可能であった（図22C～22D）。これらのデータによって、IVT送達されたRLS-0071が、予想外に、静脈内送達されたペプチドよりもはるかに長い眼内半減期を有していることが示された。
硝子体内送達されたRLS-0071は網膜組織を強く染色する。ラットの吸収、分布、代謝、および排泄（ADME）研究によって、放射標識されたRLS-0071は、IV送達された場合に、様々な組織層において有意な組織分布を有することが以前に示された。さらに、RLS-0071は、プレート結合アッセイにおいてICAM1、3、4、および5に結合することが示されており；これらの接着分子は、内皮および上皮細胞に様々な程度に存在し、これにより、RLS-0071が網膜組織に結合することができることが示唆される。RLS-0071が、ペプチドのIVT注射を受けたラットにおいて網膜組織に結合するかどうかを評価するために、網膜組織を組織診断のために処理し、ポリクローナルウサギ抗RLS-0071抗体とともにインキュベートし、その後DAB染色を行った。食塩水でIVT注射したラットの眼と比較して、RLS-0071のIVT注射を受けた眼は、注射から1時間後に有意なDABシグナルを示した（図23）。眼のすべての組織レベルの強い染色は予想外であり、なぜならば、眼の層は、感染粒子および他の非栄養分子を区画化し、これらがある層から次の層へ横断するのを遮断するためのバリアを有するからである。まとめると、これらの発見によって、IVT投与されたRLS-0071はラットの眼に対して有害作用がなく、半減期の延長および網膜の組織浸透を示すことが示される。理論に拘束されることを望むものではないが、RLS-0071は、補体および好中球媒介性炎症が病原性の役割を果たす眼の急性疾患の阻害において治療的恩恵を有し得ることが示唆される。
実施例7：2ヒットラット急性肺傷害（ALI）モデルにおける低用量での血液対組織における補体活性化のRLS-0071阻害
背景および結果
ALIの2ヒットラットモデルでRLS-0071を試験した。第1の侵襲はリポ多糖（LPS）での好中球刺激であり、続いて30分後に、不適合赤血球で古典的補体活性化の第2の侵襲を行う。このモデルは、肺胞壁中への劇的な好中球浸潤をもたらし、壁を肥厚させ、肺胞気腔を85％低減させることができる。本明細書において示すように、10mg/kg～160mg/kgまでの単回IV投与として与えられたRLS-0071は、肺損傷からの同様の保護をもたらした。NET生成を血漿中の遊離DNAの定量化によって測定し、これは、10mg/kgは、160mg/kgと比較して同様の低減をもたらすことを示した。炎症促進性サイトカイン産生（IL-1、IL-6、IL-17、およびTNFα）の低減が、RLS-0071で処置した動物で示された。第2のヒットから5および60分後の10mg/kgのRLS-0071について、ラットの血漿中のC5aの測定値によって補体阻害がきわめて明らかであった（図24）。C5aの短い5分の半減期を考慮すれば、60分での上昇したC5aの測定値は、組織で生成されたC5aと一致する。これらのデータによって、RLS-0071が、低用量、例えば10mg/kg IVで、末梢組織において補体の活性化を阻害することができることが示された。
2ヒットALIモデルにおけるラットの血流中の補体阻害を2つの異なる方法によって測定した。第1の方法は、輸血された不適合赤血球の血管内溶血を測定することによって、ラットの血漿中の遊離ヘモグロビンを経時的に測定した。図25に見られるように、不適合輸血を受けたラットは、経時的に血管内溶血の増大を示し、1時間までにほぼ最大レベルに達した。10mg/kg IVで与えられたRLS-0071は、食塩水処置と比較して、古典的補体経路媒介性溶血の阻害を示さなかった（図25）。血漿試料はエクスビボでmCH50によっても解析し、不適合輸血による古典的経路の活性化によって生じる補体成分の消費が理由でmCH50の一過的な低下を5分で示し、1時間でほとんど正常なmCH50値へリバウンドした（図26）。10mg/kg IVのRLS-0071は、食塩水処置対照と比較して、mCH50を阻害しなかった（図26）。これらの2つのアッセイによって、10mg/kg IVのRLS-0071は、食塩水対照と比較して血流において測定可能な古典的補体阻害をもたらさなかったことが示される。この結果は、組織においてC5a産生の50％の低下をもたらした10mg/kg IVのRLS-0071と対照的である。
これらの動物データによって、RLS-0071が、血流中の補体活性化を阻害しない低用量（例えば、10mg/kg IV）で、複数の動物モデルにおいて、炎症性組織損傷だけでなく組織内の補体活性化も阻害することができるという驚くべき発見が示される。
実施例8：RLS-0071および重症の喘息の処置
好中球性喘息は、高用量の吸入コルチコステロイドおよびβ2-アゴニストに不応性であり、頻繁な増悪および入院につながり得る、重症型の喘息である。現在、ステロイド抵抗性喘息に対してFDAに承認された療法はない。本発明者らは、最近、0および7日目の腹腔内オボアルブミン（OVA）感作、その後の、14および15日目の鼻腔内OVA抗原投与、および21～23日目の鼻腔内OVA/LPS（リポ多糖）抗原投与によってもたらされ、24日目に動物を安楽死させる、好中球性喘息ウィスターラットモデルを適合させた。このレジメンは、肺への好中球浸潤、肺血管透過性を示唆するタンパク質蓄積、およびMPOのレベルの増加、ならびに気管支肺胞洗浄液（BALF）における好中球活性化および好中球細胞外トラップ形成（NETosis）を示す遊離DNAを有する好中球性喘息患者で観察される疾患プロセスを模倣する。本研究の目的は、この動物モデルにおいてRLS-0071の役割を評価することであった。21～23日目（予防投与）または22および23日目（レスキュー投与）に、このプロトコールに供した青年期の雄のウィスターラットに160mg/kgのRLS-0071を静脈内投与した。RLS-0071を受けていない動物と比較して、RLS-0071で処置した動物のBALFは、好中球数およびタンパク質レベルならびにBALF中のMPOおよび遊離DNAの低減を示した。これらの結果によって、RLS-0071が、このラットモデルにおいて好中球媒介性喘息をモジュレートすることができることが示される。
材料および方法
動物実験
好中球性喘息のOVA/LPSラットモデルを以前に公開されたげっ歯類モデル［An TJ, Rhee CK, Kim JH, Lee YR, Chon JY, Park CK, et al (2018) Effects of Macrolide and Corticosteroid in Neutrophilic Asthma Mouse Model. Tuberc Respir Dis (Seoul). Jan;81(1):80-87. doi: 10.4046/trd.2017.0108; Thakur VR, Khuman V, Beladiya JV, Chaudagar KK, Mehta AA (2019) An experimental model of asthma in rats using ovalbumin and lipopolysaccharide allergens. Heliyon. Nov 19;5(11):e02864. doi: 10.1016/j.heliyon.2019.e02864］から適合させた。実験計画を図27に示す。
0および7日目のOVA（MilliporeSigma, Burlington, MA, USA）投与について、5％イソフルラン（MWI Animal Health, Boise, ID, USA）でラットを鎮静させ、2mg Al(OH)3溶液中の1.83mg/kgのOVAを腹腔内（IP）投与した。14および15日目のOVA（0.92mg/kg）の鼻腔内（IN）投与について、5％イソフルラン、その後の75mg/kgのケタミン（McKesson, Las Colinas, TX, USA）および7mg/kgのキシラジン（Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA, USA）のIP投与でラットを鎮静させた。21、22、および23日目に、イソフルランおよびケタミン／キシラジンでラットを鎮静させ、0.92mg/kgのOVAおよび0.18mg/kgのリポ多糖（食塩水中で再構成し、OVA Al(OH)3溶液中に希釈した、大腸菌（Escherichia coli）O111:B4由来のLPS［MilliporeSigma, Burlington, MA, USA］）をIN投与した。上記のように24日目に動物を安楽死させた。RLS-0071処置を受ける実験群について、ペプチドは、HPLCおよび質量解析によって検証した場合に≧95％の純度に、PolyPeptide Group（San Diego, CA）によって製造された。凍結乾燥したRLS-0071を0.05Mのヒスチジン緩衝液中に可溶化し、pHを6.5に調整した。OVA/LPS抗原投与から4時間後に、21、22、および23日目（予防投与）または22および23日目（レスキュー投与）に、イソフルランで鎮静させた動物に留置頚静脈カテーテルを通して160mg/kgでRLS-0071をIV投与した（図1）。ビヒクル対照動物にペプチドIVなしで食塩水を与えた。RLS-0071およびビヒクル対照を受けた動物を24日目に屠殺した。
安楽死後に気管支肺胞洗浄液（BALF）を収集した。正中切開によって気管を露出させ、その後に、22ゲージの0.5インチのルアースタブ（Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA, USA）を気管輪を通して挿入した。1mLシリンジを使用して1mLの無菌食塩水を肺に導入し、ラットの胸部を軽くマッサージした後にこれを回収した。これを5回繰り返して、全量5mLの無菌食塩水とした。回収した洗浄液（およそ4mL）を1,500rpmで4℃で5分間遠心分離して、細胞をペレットにした。BALF上清を収集し、等分し、さらなる解析まで-20℃で保存した。2mLのRPMI1640培地（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に細胞を再懸濁し、次いで、トリパンブルー色素（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で細胞を染色した後、自動細胞計数器（Countess Automated Cell Counter, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で細胞濃度を決定した。さらなる解析のために、100,000細胞／スライドの終濃度で細胞をスライド上にサイトスピンした。
BALF中の白血球の定量化
Romanowsky-Geisma染色（Dade Behring, Deerfield, IL, USA）で、サイトスピンしたスライド上の細胞を染色することによって、BALF中に存在する白血球の数を決定し、次いで、スライドを水道水で徹底的にすすいだ。40倍の拡大率で顕微鏡（BX50, Olympus）を使用して細胞を可視化し、スライド全体にわたって無作為の視野において異なるタイプの白血球（すなわち、好中球、好酸球、リンパ球、およびマクロファージ）を合計で600細胞に達するまで計数した。次いで、各白血球タイプの相対パーセンテージを決定した。計数中の任意のバイアスを低減させるために、研究者を盲検化し、実験群を無作為化した。
BALF中のタンパク質の測定
BCAプロテインアッセイ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を使用して、BALF上清中の全タンパク質濃度を測定した。手短に言えば、25μLの希釈試料を96ウェルプレート中の200μLのワーキング試薬溶液と混合した。37℃で30分間試料をインキュベートし、8分間冷却し、次いで、BioTekマイクロプレートリーダーを用いて562nmで吸光度を読み取った。すべての試料を2連でアッセイし、公知の濃度のウシ血清アルブミン（BSA）の検量線から各試料のタンパク質濃度を決定した。
BALF中のMPOの測定
比色定量アッセイでBALF上清中のMPOレベルを測定した。手短に言えば、100μLの試料をマルチウェルプレートに2連で添加し、その後50μLのTMB（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を添加した。反応を室温で3分間インキュベートし、次いで、50μLの2N硫酸で停止した。BioTekマイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸光度を読み取った。公知の濃度のMPOを使用して検量線を作成し、これを使用して試料中のMPOレベルを計算した。
BALF中のDNAの測定
BALF上清中の遊離DNAをPicoGreenによって測定した。手短に言えば、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0（TE）緩衝液にBALF試料を希釈し、50μLの1:200希釈のPicoGreen（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）とともに50μLの各試料をウェルに添加し、遮光して室温で10分間インキュベートした。TE緩衝液中でDNA検量線を調製した。次いで、BioTekマイクロプレートリーダーを使用して485nmの励起波長および520nmの発光波長で蛍光を読み取った。すべての遊離DNAの測定は2連で行った。
統計解析
データは、平均値および平均値の標準誤差として示す。スチューデントのt検定を使用してデータの統計解析を行って、実験群間で有意性を比較した。すべての統計的検定は、GraphPad Prism（San Diego, CA）を使用して行った。すべての検定は両側であり、有意性レベルを0.05に設定した。
結果
RLS-0071はBALF中の好中球レベルを低減させる
RLS-0071は、古典的補体経路の活性化と好中球エフェクター機能（MPO活性とNETosis）の両方を阻害することができる二重ターゲティング抗炎症性分子である。RLS-0071が好中球性喘息を緩和する能力を評価するために、本発明者らは、OVA/LPSの腹腔内（IP）および鼻腔内（IN）注入を利用する好中球喘息の既存のマウスモデルを適合させた（図27）。OVA/LPSを受けた動物の好中球のレベルを決定するために、24日目にラットを屠殺し、BALFを収集し、顕微鏡によって白血球を定量化した。シャム動物は、予想通り、BALF中に>95％の肺胞マクロファージを示した（図28）。これに対して、OVA/LPSレジメンを受けた動物は、BALF中に>40％の好中球および>5％のリンパ球の増加があった。このモデルにおいてRLS-0071が肺への好中球の滞留をモジュレートするかどうかを決定するために、予防投与レジメンを模倣するように21、22、および23日目に、またはレスキュー投与シナリオをシミュレートするように22および23日目に、160mg/kg IVのボーラス用量としてRLS-0071ペプチドを投与した。両方の投与レジメンは、パイロット実験で決定された22日目のピーク好中球蓄積に基づいていた。RLS-0071の予防投与は、ペプチドを受けていない動物と比較して、BALF中の好中球蓄積の有意な低減を示した（P<0.03）。レスキュー投与も好中球の低減を示したが、統計的有意性に達しなかった（P<0.1844）。これらの結果によって、RLS-0071のIV投与が、予防投与シナリオまたはレスキュー投与シナリオで、好中球性喘息に供したラットの肺において好中球蓄積を低減させることができることが示される。
RLS-0071はBALF中のタンパク質レベルを低減させる
OVA/LPSレジメンを受けた動物において肺血管漏出のレベルを確認するために、20～24日目に動物を屠殺し、BALFを収集し、全タンパク質濃度を決定した。シャムラットと比較して、OVA/LPSプロトコールを受けた動物は、20～23日目にBALF中のタンパク質のレベルの増加を示し、24日目に低下し、これは、血管組織中へのタンパク質の再吸収を示す可能性が最も高い（図29）。これらの発見と一致して、RLS-0071の予防投与またはレスキュー投与を受けた動物は、24日目に喘息ラットと同様のタンパク質レベルを有していた。
RLS-0071はBALF中のMPOレベルおよび遊離DNAを低減させる
OVA/LPSプロトコールを受けた動物のBALF中のMPOレベルに対するRLS-0071の効果を確認するために、20～24日目に動物を屠殺し、BALFを収集し、全MPO濃度を決定した。シャムラットおよびOVA/LPSレジメンを受けた動物は、20～22日目にBALFを収集した場合に、バックグラウンドレベルの遊離MPOを示した（図30）。MPOレベルは、喘息ラットにおいて、23日目に劇的に増加し、24日目まで漸減した。予防レジメンとしてRLS-0071を受けた動物は、ペプチドを受けていない24日目の動物と比較して統計的有意性に達していないMPOレベルの低減（p=0.12）を示したが、レスキュー投与は、MPOレベルの有意な低減（P=0.05）を示した。
MPOは、好中球細胞外トラップ（NET）の生成の中心的存在である。これは、好中球顆粒中で過酸化水素と結合してNETosisを媒介し、RLS-0071は、インビトロでNETの形成を阻害することが示されている。NETは、好中球性喘息を含めて、様々な自己免疫性、代謝性、および炎症性疾患において病原性の役割を果たすことが以前に示された［Lachowicz-Scroggins ME, Dunican EM, Charbit AR, Raymond W, Looney MR, Peters MC, et al. (2019) Extracellular DNA, Neutrophil Extracellular Traps, and Inflammasome Activation in Severe Asthma. Am J Respir Crit Care Med. 199(9):1076-1085; Varricchi G, Modestino L, Poto R, Cristinziano L, Gentile L, Postiglione L, et al. (2021) Neutrophil extracellular traps and neutrophil-derived mediators as possible biomarkers in bronchial asthma. Clin Exp Med. 2021 Aug 3. doi: 10.1007/s10238-021-00750-8］。OVA/LPS処置動物においてNET形成に対する効果を確認するために、BALFからの遊離DNAを測定した。遊離または細胞外DNAは、自己免疫性疾患および炎症性疾患におけるNET形成のバイオマーカーとしてしばしば使用されている。20および21日目に単離したシャム動物および喘息動物からのBALF中で低レベルの遊離DNAが観察され、22、23、および24日目に、喘息動物から採取したBALF中で遊離DNAが増加した（図31）。予防的に、またはレスキュー投与レジメンで、RLS-0071が投与された動物において、22～24日目に、喘息ラットの遊離DNAレベルと比較して、遊離DNAの減少が観察されたが、遊離DNAのレベルは、シャム動物で見られるようなベースラインレベルに戻らなかった。理論に拘束されることを望むものではないが、MPOおよび遊離DNAレベルの低減は、RLS-0071が、好中球性喘息に供した動物のBALF中で好中球媒介性エフェクター機能を低減させることができることを示す可能性がある。
考察
本実施例の目的は、抗炎症性分子RLS-0071が、文献［An TJ, Rhee CK, Kim JH, Lee YR, Chon JY, Park CK, et al (2018) Effects of Macrolide and Corticosteroid in Neutrophilic Asthma Mouse Model. Tuberc Respir Dis (Seoul). Jan;81(1):80-87. doi: 10.4046/trd.2017.0108; Thakur VR, Khuman V, Beladiya JV, Chaudagar KK, Mehta AA (2019) An experimental model of asthma in rats using ovalbumin and lipopolysaccharide allergens. Heliyon. Nov 19;5(11):e02864. doi: 10.1016/j.heliyon.2019.e02864］から適合させたOVA/LPSマウスモデルにおいて、重症の喘息または好中球性喘息を緩和することができるかどうかを決定することであった。他の人が述べたように、OVA/LPSレジメンは、放出MPOおよびNET形成を示す遊離DNAによって証明されるように、肺への好中球流入、血管炎症、および好中球活性化をもたらした。RLS-0071は、インビトロ、インビボ、およびエクスビボ研究において古典的補体活性化を阻害すること、ならびにインビトロおよびエクスビボ研究においてMPOの阻害を介してNET形成を阻害することが示されている。補体阻害および好中球モジュレーションの二重抗炎症活性を考慮して、本発明者らは、RLS-0071がこの動物モデルにおいて好中球性喘息を阻害するであろうという仮説を立てた。本明細書において提示される結果によって、予防的に、またはレスキュー用量として送達されたRLS-0071が、肺における好中球の滞留および活性化を低減させることができたことが示される。これは、肺の好中球数の減少、ならびにタンパク質、MPO、およびBALF中でNETosisのバイオマーカーとして働く遊離DNAのレベルの低下によって示された。
喘息は、病的な役割を果たす様々な炎症細胞（好酸球、好塩基球、好中球、単球、マクロファージ、および活性化肥満細胞）をともなう慢性の複雑な炎症性疾患である。炎症細胞から放出されるインターロイキン、サイトカイン、およびロイコトリエンなどのいくつかの炎症性メディエーターは、喘息に特徴的な炎症に寄与し、アレルゲンによるタイプ1ヘルパーT細胞（Th1）およびタイプ2ヘルパーT細胞（Th2）の活性化が顕著な役割を果たすと考えられている［P.J. Barnes (1996) Pathophysiology of asthma, Br. J. Clin. Pharmacol. 42 (1) 3-10］。OVAおよびLPSの二重アレルゲン抗原投与を使用する動物モデルは、TLR-4のLPS活性化によって媒介される、おそらく媒介されるTh1ヘルパーT細胞応答が、好中球の活性化によって引き起こされる重症型の喘息につながることを示した。この好中球によって引き起こされる疾患プロセスは、ステロイドまたはb2-アゴニストに不応性であるヒトで見られる重症の喘息を模倣する。理論に拘束されることを望むものではないが、RLS-0071がこのげっ歯類モデルにおいて好中球性喘息を緩和する能力は、RLS-0071がステロイド不応性好中球性喘息のための臨床的治療剤としての有用性について潜在性を有することを示すことが示唆される。さらに、これは、COPDなどの調節不全になった免疫応答を特徴とする他の急性の好中球媒介性肺増悪で有効性を有する可能性がある。
実施例9：血管新生およびVEGFへの結合のRLS-0071およびRLS-0088媒介性モジュレーション
細胞ベースのバイオアッセイにおけるVEGFへのRLSペプチドの結合およびVEGFシグナル伝達の阻害
血管内皮増殖因子（VEGF）は、上皮細胞、腫瘍細胞、およびマクロファージから分泌される重要なシグナル伝達タンパク質である。これは、血管新生の刺激、血管透過性の増大、腫瘍の浸潤および生存の増強、ならびにTreg細胞における抗腫瘍応答の阻害を含めて、多くの機能を有する。いくつかのVEGF受容体サブタイプ－VEGFR1、VEGFR2、およびVEGFR3が存在する。VEGFR2（KDRとしても公知である）は、VEGFに対する公知の受容体細胞応答のほとんどすべてを媒介する。VEGFファミリーのすべてのメンバーは、受容体型チロシンキナーゼという受容体、すなわち、VEGFR-1（Flt-1）およびVEGFR-2（Flk-1/KDR）への結合によって細胞応答を刺激する。VEGFがKDRに結合する場合、受容体は二量体化し、トランスリン酸化によって活性化される。
RLS-0071は、本明細書において、本発明者らの2ヒットラット急性肺傷害モデルにおいてVEGFをダウンレギュレートすることが示される（図4）。本発明者らは、RLS-0071およびRLS-0088が、ELISAベースのアッセイにおいてヒトVEGFと直接的に相互作用することができるかどうかを決定したいと考えた。VEGFをマイクロタイタープレート上にコーティングし、漸増濃度のRLS-0071とともにインキュベートし、続いて、これをペプチドに対する抗体、その後の二次抗体－HRPコンジュゲートで検出した。次いで、HRPコンジュゲートから生成されるシグナルを450nmのODでプレートリーダー中で読み取った。図32に示すように、RLS-0071は、C1q（陽性対照）よりも大きな程度まで、ヒトVEGFに用量依存的に結合する。VEGFへのRLS-0071のかなりの結合があるが、RLS-0088の結合はそれほど明白ではなかった（図33）。VEGFの結合が機能活性と相関するかどうかを決定するために、本発明者らは、読み出し情報としてルシフェラーゼを使用してVEGF刺激およびKDR（VEGFR-2）の阻害を測定する生物発光性の細胞ベースのアッセイであるVEGFバイオアッセイ（Promega）を利用した。このアッセイは、VEGF応答を誘導するかまたは阻害するかのいずれかを目的とした新規な生物学的療法の発見および開発のために使用される。VEGF応答性細胞は、luc2Pの上流の応答エレメント（RE）および外来性VEGF受容体を発現するように操作されている。VEGFがVEGF応答性細胞に結合する場合、受容体が細胞内シグナルを伝達し、発光をもたらす。生物発光シグナルは、Bio-Glo（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムおよび標準的なルミノメーターを使用して検出および定量化する。アッセイでは、VEGFは陽性対照であり、漸増濃度のVEGFは、VEGFがVEGFR-2に結合し、細胞内シグナル伝達に影響を及ぼすことを示す、発光の用量依存的増加をもたらす（図34。ひし形で印を付けた線）。RLS-0071およびRLS-0088は、両方ともVEGFR-2へのVEGF結合を阻害し、細胞内シグナル伝達の用量依存的阻害をもたらすことができた（図34。それぞれ、正方形および三角形で印を付けた線）。これらの結果によって、RLS-0071およびRLS-0088がVEGF媒介性シグナル伝達を阻害することができるという驚くべき発見が示される。理論に拘束されることを望むものではないが、RLS-0071およびRLS-0088が様々なVEGF媒介性疾患プロセスを阻害するための治療分子としての有用性を有し得ることが示唆される。
細胞ベースのアッセイにおける非VEGF媒介性血管新生のRLSペプチド阻害
RLS-0071およびRLS-0088がVEGF非依存的様式で血管新生を阻害することができるかどうかを確認するために、本発明者らは、ヒト臍血管内皮細胞（HUVEC）3次元培養システムを利用した。このシステムにおいて、HUVEC細胞をCellTrace色素で染色し、37℃で1時間ペプチドで前処理し、10μg/mlのリポ多糖（LPS）を含む細胞外基質（Sigma）と混合し、プレーティングし、次いで、加湿インキュベーター中で37℃で18時間インキュベートした。LPSは細胞に非VEGF媒介性血管新生を起こさせることができ、その結果、顕微鏡によって観察することができる内皮の出芽の形成および管形成がもたらされる。図35および36に示すように、LPSを受けていない細胞（非刺激（LPSなし））は血管新生の観察可能な徴候がなかったが、LPSおよびペプチドなし（0mg/ml RLS-0071パネル）で処理した細胞は、血管新生を示す出芽および新生管形成を示す。漸増量のRLS-0071の存在下で、血管新生の用量依存的低減が観察された。RLS-0088も10mg/mlのペプチドの濃度で血管新生の低減を示した。異なる細胞外基質（Geltrex、Sigma）を使用し、CellTrace色素を使用しない異なるHUVEC細胞システムにおいて、RLS-0071を用いて同じ結果を得た。これらのアッセイのそれぞれにおけるRLS-0071およびRLS-0088の相対活性を示す表3も参照されたい。これらの結果によって、RLS-0071およびRLS-0088が非VEGF媒介性血管新生を阻害することができるという驚くべき発見が示される。理論に拘束されることを望むものではないが、RLS-0071およびRLS-0088は、抗血管新生治療分子としての潜在性を有し得る可能性がある。
（表３）RLS-0071およびRLS-0088の相対活性
Figure 2023548001000010
実施例10：眼用製剤の投与
眼部の疾患または状態を処置するために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2を含む眼用組成物を対象の眼に投与する。投与は、局所（例えば、軟膏、点眼剤、フォーム、アイパック）でもよく、注射（例えば、硝子体内注射、房水内注射、結膜下注射）を介してもよく、または眼内もしくは硝子体内インプラントの埋め込みを介することによってもよい。眼部の疾患または状態は、細胞表面受容体、例えば、インテグリンまたはICAM、例えば、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／もしくはICAM-5の発現の変化を特徴とし得る。非限定な例示的な眼部の疾患または状態としては、自己免疫性および感染性ブドウ膜炎、網膜炎、AMD、DED、感染性および非感染性角膜炎、角膜の傷害および修復、未熟児網膜症（ROP）、眼移植片対宿主病（GvHD）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（RVO）後の黄斑浮腫、ならびに糖尿病黄斑浮腫（DME）が挙げられる。
実施例11：経鼻製剤の投与
喘息を処置するために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2を含む経鼻組成物を対象に投与する。投与は、吸入、吹送、または噴霧を介してもよい。組成物は、スプレー、溶液、ゲル、クリーム、ローション、エアロゾル、もしくはネブライザー用の溶液の形態であってもよく、または吹送用の超微粒粉末としてであってもよい。喘息は、細胞表面受容体、例えば、インテグリンまたはICAM、例えば、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／もしくはICAM-5の発現の変化を特徴とし得る。喘息の非限定な例示的なタイプとしては、重症の喘息、ステロイド不応性喘息、および好中球性喘息が挙げられる。
実施例11：薬学的製剤の投与
疾患または状態を処置するために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3を含む薬学的組成物をその必要がある対象に投与する。投与は、任意の適切な経路（例えば、注射、注入、埋め込み、局所投与、経鼻投与）によってもよい。疾患または状態は、細胞表面受容体、例えば、インテグリンまたはICAM、例えば、ICAM1、ICAM-3、ICAM-4、および／もしくはICAM-5の発現の変化を特徴とし得る。
対象において補体系を調節するために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3を含む薬学的組成物をその必要がある対象に投与する。投与は、任意の適切な経路（例えば、注射、注入、埋め込み、局所投与、経鼻投与）によってもよい。
対象においてサイトカインの発現を変化させるために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3を含む薬学的組成物をその必要がある対象に投与する。投与は、任意の適切な経路（例えば、注射、注入、埋め込み、局所投与、経鼻投与）によってもよい。
対象において好中球の結合および／または接着を阻害するかまたは変化させるために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3を含む薬学的組成物をその必要がある対象に投与する。投与は、任意の適切な経路（例えば、注射、注入、埋め込み、局所投与、経鼻投与）によってもよい。
対象において好中球の生存を向上させるために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3を含む薬学的組成物をその必要がある対象に投与する。投与は、任意の適切な経路（例えば、注射、注入、埋め込み、局所投与、経鼻投与）によってもよい。
対象において細胞表面受容体への好中球の結合を阻害するかまたは変化させるために、治療的に有効な量のSEQ ID NO:2および／または3を含む薬学的組成物をその必要がある対象に投与する。投与は、任意の適切な経路（例えば、注射、注入、埋め込み、局所投与、経鼻投与）によってもよい。細胞表面受容体の非限定例としては、インテグリンならびにICAM、例えば、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、およびICAM-5が挙げられる。
以下は本発明に包含される項目の非網羅的リストである。
1．
SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、サイトカインの発現を変化させる方法。
2．
SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の結合および／または接着を阻害するかまたは変化させる方法。
3．
SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の生存を向上させる方法。
4．
SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、細胞表面受容体への好中球の結合を阻害するかまたは変化させる方法。
5．
SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、細胞表面受容体の発現の変化を特徴とする疾患または状態を処置する方法。
6．
SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、急性肺傷害および／または急性呼吸窮迫症候群を処置および／または防止する方法。
7．
SEQ ID NO:2を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、調節不全になった補体活性化および／または好中球モジュレーションを特徴とする眼の疾患および／または状態を処置および／または防止する方法。
8．
SEQ ID NO:2を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、喘息を処置する方法。
9．
SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、血管新生をモジュレートする方法。
10．
前記組成物が、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、安定化剤、または賦形剤をさらに含む、項目1～9のいずれかの方法。
11．
SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が約10mg/kg～約160mg/kgである、項目1～10のいずれかの方法。
12．
SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が約20mg/kg～約160mg/kgである、項目1～10のいずれかの方法。
13．
SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が約40mg/kg～約160mg/kgである、項目1～10のいずれかの方法。
14．
SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が少なくとも1つの用量で投与され、第1の用量が約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む、項目1～10のいずれかの方法。
15．
SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量を含む第2の用量が投与され、該第2の用量が約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む、項目14の方法。
16．
SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が2つの用量で投与され、第1の用量が約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含み、かつ第2の用量が約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む、項目1～10のいずれかの方法。
17．
前記組成物が眼部投与のために製剤化される、項目1～16のいずれかの方法。
18．
前記組成物が眼科的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、項目17の方法。
19．
前記眼部投与が、局所投与、眼周囲注射、結膜下注射、房水内注射、眼内注射、硝子体内注射、または角膜内もしくは眼内インプラントの導入を含む、項目17または18の方法。
19．
前記細胞表面受容体が、インテグリンまたは細胞間接着分子（ICAM）を含む、項目4の方法。
20．
前記ICAMが、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／またはICAM-5を含む、項目19の方法。
21．
前記疾患または状態が、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／またはICAM-5の少なくとも1つの増加を特徴とする、項目5の方法。
22．
前記眼の疾患または状態が、補体阻害および／またはミエロペルオキシダーゼ活性もしくはNETosisの阻害を特徴とする、項目7の方法。
23．
前記眼の疾患または状態が、自己免疫性および感染性ブドウ膜炎、急性黄斑変性（AMD）、ドライアイ疾患（DED）、感染性および非感染性角膜炎、角膜の傷害および修復、未熟児網膜症（ROP）、眼移植片対宿主病（GvHD）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（RVO）後の黄斑浮腫、ならびに糖尿病黄斑浮腫（DME）である、項目7の方法。
24．
前記喘息が、重症の喘息、ステロイド不応性喘息、または好中球性喘息である、項目8の方法。
25．
前記組成物が、経鼻投与のために製剤化される、項目1～16のいずれかの方法。
26．
前記経鼻投与が、吸入、吹送、または噴霧を含む、項目25の方法。
27．
前記組成物が、スプレー、溶液、ゲル、クリーム、ローション、エアロゾル、もしくはネブライザー用の溶液の形態であるか、または吹送用の超微粒粉末としてである、項目25の方法。
配列表
Figure 2023548001000011
いくつかの可能性のある態様が上に開示されるが、本発明の態様は、そのようには限定されない。これらの例示的な態様は、網羅的であること、または本発明の範囲を不必要に限定することを意図するものではなく、代わりに、他の当業者が本発明を実施することができるように本発明の原理を説明するために、選択され、記載された。実際に、本明細書に記載されるものに加えて、本発明の様々な修正が前述の説明から当業者に明らかとなると考えられる。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲に入ることが意図される。
本明細書において引用されるすべての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書中に物理的に存在するかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
参考文献
Figure 2023548001000012
Figure 2023548001000013
Figure 2023548001000014
Figure 2023548001000015
Figure 2023548001000016

Claims (28)

  1. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、サイトカインの発現を変化させる方法。
  2. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の結合および／または接着を阻害するかまたは変化させる方法。
  3. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、好中球の生存を向上させる方法。
  4. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、細胞表面受容体への好中球の結合を阻害するかまたは変化させる方法。
  5. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、細胞表面受容体の発現の変化を特徴とする疾患または状態を処置する方法。
  6. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、急性肺傷害および／または急性呼吸窮迫症候群を処置および／または防止する方法。
  7. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、調節不全になった補体活性化および／または好中球モジュレーションを特徴とする眼の疾患および／または状態を処置および／または防止する方法。
  8. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、喘息を処置する方法。
  9. SEQ ID NO:2および／または3を含む合成ペプチドの治療的に有効な量を含む組成物を投与する段階を含む、血管新生をモジュレートする方法。
  10. 前記組成物が、少なくとも1つの薬学的に許容される担体、希釈剤、安定化剤、または賦形剤をさらに含む、請求項1～9のいずれか一項記載の方法。
  11. SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が約10mg/kg～約160mg/kgである、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  12. SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が約20mg/kg～約160mg/kgである、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  13. SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が約40mg/kg～約160mg/kgである、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  14. SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が少なくとも1つの用量で投与され、第1の用量が約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  15. SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量を含む第2の用量が投与され、該第2の用量が約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む、請求項14記載の方法。
  16. SEQ ID NO:2および／または3の治療的に有効な量が2つの用量で投与され、第1の用量が約10mg/kg～約160mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含み、かつ第2の用量が約40mg/kg～約60mg/kgのSEQ ID NO:2および／または3を含む、請求項1～10のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記組成物が眼部投与のために製剤化される、請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記組成物が眼科的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む、請求項17記載の方法。
  19. 前記眼部投与が、局所投与、眼周囲注射、結膜下注射、房水内注射、眼内注射、硝子体内注射、または角膜内もしくは眼内インプラントの導入を含む、請求項17または18記載の方法。
  20. 前記細胞表面受容体が、インテグリンまたは細胞間接着分子（ICAM）を含む、請求項4記載の方法。
  21. 前記ICAMが、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／またはICAM-5を含む、請求項20記載の方法。
  22. 前記疾患または状態が、ICAM-1、ICAM-3、ICAM-4、および／またはICAM-5の少なくとも1つの増加を特徴とする、請求項5記載の方法。
  23. 前記眼の疾患または状態が、補体阻害および／またはミエロペルオキシダーゼ活性もしくはNETosisの阻害を特徴とする、請求項7記載の方法。
  24. 前記眼の疾患または状態が、自己免疫性および感染性ブドウ膜炎、急性黄斑変性（AMD）、ドライアイ疾患（DED）、感染性および非感染性角膜炎、角膜の傷害および修復、未熟児網膜症（ROP）、眼移植片対宿主病（GvHD）、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症（RVO）後の黄斑浮腫、ならびに糖尿病黄斑浮腫（DME）である、請求項7記載の方法。
  25. 前記喘息が、重症の喘息、ステロイド不応性喘息、または好中球性喘息である、請求項8記載の方法。
  26. 前記組成物が、経鼻投与のために製剤化される、請求項1～16のいずれか一項記載の方法。
  27. 前記経鼻投与が、吸入、吹送、または噴霧を含む、請求項25記載の方法。
  28. 前記組成物が、スプレー、溶液、ゲル、クリーム、ローション、エアロゾル、もしくはネブライザー用の溶液の形態であるか、または吹送用の超微粒粉末としてである、請求項25記載の方法。
JP2023520207A 2020-09-30 2021-09-27 ペプチドおよび使用方法 Pending JP2023548001A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063085556P 2020-09-30 2020-09-30
US63/085,556 2020-09-30
US202163185831P 2021-05-07 2021-05-07
US63/185,831 2021-05-07
PCT/US2021/052174 WO2022072272A2 (en) 2020-09-30 2021-09-27 Peptides and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023548001A true JP2023548001A (ja) 2023-11-15

Family

ID=80951791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023520207A Pending JP2023548001A (ja) 2020-09-30 2021-09-27 ペプチドおよび使用方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20240010681A1 (ja)
EP (1) EP4222168A2 (ja)
JP (1) JP2023548001A (ja)
KR (1) KR20230078733A (ja)
AU (1) AU2021355358A1 (ja)
BR (1) BR112023005783A2 (ja)
CA (1) CA3193565A1 (ja)
IL (1) IL301441A (ja)
MX (1) MX2023003700A (ja)
WO (1) WO2022072272A2 (ja)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009152944A1 (en) * 2008-05-29 2009-12-23 Hanall Pharmaceutical Co., Ltd Modified erythropoietin (epo)polypeptides that exhibit increased protease resistance and pharmaceutical compositions thereof
IL287308B2 (en) * 2018-01-09 2024-03-01 Realta Holdings Llc PIC1 inhibition of myeloperoxidase oxidative activity in an animal model

Also Published As

Publication number Publication date
US20240010681A1 (en) 2024-01-11
MX2023003700A (es) 2023-04-21
EP4222168A2 (en) 2023-08-09
BR112023005783A2 (pt) 2023-04-25
CA3193565A1 (en) 2022-04-07
IL301441A (en) 2023-05-01
WO2022072272A3 (en) 2022-05-12
KR20230078733A (ko) 2023-06-02
AU2021355358A1 (en) 2023-06-08
WO2022072272A2 (en) 2022-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7359396B2 (ja) 細胞外ヒストンによって媒介される病理を処置及び予防するための化合物
WO2015096756A1 (zh) 一种多肽及其衍生物在制备抗肺纤维化药物中的应用
KR20170140383A (ko) 펩티드 조성물 및 사용 방법
EP2925341B1 (en) Peptide compounds and methods of production and use thereof
JP2023548001A (ja) ペプチドおよび使用方法
RU2737799C1 (ru) Ингаляционный гексапептид для лечения респираторных заболеваний, связанных с интерлейкином-6
AU2019200592A1 (en) BPI and its congeners as radiation mitigators and radiation protectors
US20240041977A1 (en) Annexin a1 n-terminal peptide formulations and methods
JP6503085B2 (ja) ドライアイ疾患を治療及び／又は予防するための短い合成ペプチドの使用
CN116528883A (zh) 肽及其使用方法
JP2009511610A (ja) 過敏症治療
WO2023116574A1 (zh) 一种分离的抗C5a抗体及其制剂与应用
WO2024099346A1 (zh) 吲唑类化合物在治疗炎症小体激活介导的疾病中的应用
US20230127198A1 (en) Compositions and methods for the treatment of toxic gas exposure
TWI540141B (zh) 短合成胜肽及其治療和／或預防乾眼症之用途
WO2023064373A1 (en) Targeting slc46a2-mediated muropeptide transport to treat psoriasis
WO2021211006A1 (en) Inhaled hexapeptide for treating interleukin-6 related respiratory diseases
WO2001003724A1 (en) Therapeutic uses of bpi protein products for inhibiting h+/k+ atpase activity
US20150031617A1 (en) Use of thymosin alpha for treatment of purulent rhinosinusitis

Legal Events

Date Code Title Description
RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20230825