KR20230075197A - 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 반려동물의 피부에 보습을 공급하여 촉촉하게 유지시켜 주고 반려동물의 피부 상처를 치유하며 피부 상처 흔적을 케어할 수 있는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함할 수 있다.
Description
본 발명은 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 반려동물의 피부에 보습을 공급하여 촉촉하게 유지시켜 주고 반려동물의 피부 상처를 치유하며 피부 상처 흔적을 케어할 수 있는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 병풀 추출물(Centella Asiatica Extract)은 병풀(Centella asiatica)의 전초에서 추출한 것으로, 말굽풀, 조개풀로도 불려진다. 병풀 추출물은 해열제, 피부궤양, 외상치료, 결핵, 원형탈모증 등에 효과가 있는 것으로 보고되어 있으며, 인도 및 아시아 지역의 전통요법을 통해 오래전부터 약용으로 이용되고 있다.
병풀 추출물의 주요성분인 아시아티코사이드(asiaticoside)와 마데카소사이드(madecassoside)는 피부 상처 및 만성 궤양 치료 활성 등을 나타내고, 나병균(Mycobacterium leprae)의 세포벽을 용해할 수 있다.
특히, 아시아티코사이드는 항박테리아, 항균 및 항염증 활성을 가지고 있어 피부 상처와 위 궤양은 물론 다양한 피부질환, 정신질환, 결핵, 정맥질환, 치매 등의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 병풀 추출물은 아시아티코사이드와 마데카소사이드, 아시아틱산, 마데카식산, 발레린과 미량의 알칼로이드 등을 함유함에 따라 상처 치료에 탁월하고, 피부조직의 재생력을 갖는 물질들로 콜라겐 생성을 촉진시켜 실제 임상에서는 상처 치료 목적의 연고제를 구성하는 주성분으로 사용되고 있다.
한편, 고령화, 1인 생활자 등의 증가로 국내 반려동물 시장은 해마다 상당한 폭으로 증가하고 있으며, 반려동물을 가족 이상으로 생각하는 의식의 전환으로 의약품 구매, 동물병원 진료 빈도 등이 늘어나고 있다.
특히 반려동물에게 부작용이 없는 안전한 의약품 공급을 원하는 수요자 계층이 증가함으로써 천연물을 이용한 반려동물용 약학 조성물을 개발할 필요성이 대두되고 있다.
따라서 본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로서, 본 발명은 끈적임 없는 사용감으로 반려동물의 피부에 보습을 공급하여 촉촉하게 유지시켜 주고 반려동물의 피부 상처를 치유하며 피부 상처 흔적을 케어할 수 있는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 다른 목적들은 이하에 서술되는 실시예를 통하여 더욱 명확해질 것이다.
본 발명의 일 측면에 따른 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물은 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함할 수 있다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%는, 아시아티코사이드 46.24중량%, 마데카소사이드 25.08중량% 및 덱스트린 28.68중량%를 포함할 수 있다.
또한, 지방산 성분은 아라키딜알코올, 베헤닐알코올 및 아라키딜글루코사이드 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 병풀 추출물 및 상기 덱스트린을 제외한 나머지 95중량%에 대하여 3.5이상~4.5이하 중량%를 포함할 수 있다.
또한, 오일 성분은 올리브오일, 포도씨오일 및 아보카도오일 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 병풀 추출물 및 상기 덱스트린을 제외한 나머지 91.5중량%에 대하여 7이상~8이하 중량%를 포함할 수 있다.
또한, 컨디셔닝제는 해수 및 부틸렌글라이콜 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 병풀 추출물 및 상기 덱스트린을 제외한 나머지 98중량%에 대하여 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물은 다음과 같은 효과를 제공한다.
본 발명은 끈적임 없는 사용감으로 반려동물의 피부에 보습을 공급하여 촉촉하게 유지시켜 주고 반려동물의 피부 상처를 치유하며 피부 상처 흔적을 케어할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물의 보습력 개선 효과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 2 내지 4는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 보습인자 발현에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 5 내지 7은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 피부 장벽 기능에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 경피수분증발량 개선에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물의 염증 개선 효과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 11 내지 13은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 NO와 PGE2 생성에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 염증성 cytokine 생성에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 16 및 도 17은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 MAPKs와 NF-?B 활성에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 18 및 도 19는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 염증성 cytokine 및 chemokine의 발현에 미치는 효과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 20 및 도 21은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 각질형성세포에서 TNFα/IFNγ로 활성화되는 신호전달인자에 대한 효과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물의 피부 감작성을 평가한 결과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 23 및 도 24는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림의 피부 투과도 평가를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 2 내지 4는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 보습인자 발현에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 5 내지 7은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 피부 장벽 기능에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 경피수분증발량 개선에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물의 염증 개선 효과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 11 내지 13은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 NO와 PGE2 생성에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 염증성 cytokine 생성에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 16 및 도 17은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 MAPKs와 NF-?B 활성에 미치는 영향을 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 18 및 도 19는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 염증성 cytokine 및 chemokine의 발현에 미치는 효과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 20 및 도 21은 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물이 각질형성세포에서 TNFα/IFNγ로 활성화되는 신호전달인자에 대한 효과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물의 피부 감작성을 평가한 결과를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
도 23 및 도 24는 본 발명의 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림의 피부 투과도 평가를 설명하기 위한 실험 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들을 상세히 설명하기로 하며, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어 도면 부호에 상관없이 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 참조번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 실시예에 따른 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물은 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로 본 실시예에 따른 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물은 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%에서 병풀 추출물이 1중량%일 때 가장 우수한 보습 및 상처 치유 효과를 나타낼 수 있다.
여기서 병풀 추출물은 아시아티코사이드 46.24중량%, 마데카소사이드 25.08중량% 및 덱스트린 28.68중량%를 포함할 수 있다.
또한, 본 실시예에 따른 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물은 병풀 추출물 외에, 정제수, 세테아릴알코올, 시어버터, 지방산 성분, 글리세린, 오일 성분, 글리세릴스테아레이트, 컨디셔닝제, 라이소자임, 1,2-헥산다이올, 포트마리골드꽃추출물, 황벽나무껍질추출물, 솔비탄스테아레이트, 솔비탄세스퀴올리에이트, 소듐하이알루로네이트, 잔탄검, 다이포타슘글리시리제이트, 토코페롤, 다이소듐이디티에이, 알지닌, 하이드록시아세토페논을 더 포함할 수 있다.
구체적인 예로, 본 실시예에 따른 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물은 병풀 추출물 1중량% 외에, 정제수 65.559중량%, 세테아릴알코올 6중량%, 시어버터 4중량%, 지방산 성분 3.5이상~4.5이하 중량%(바람직하게는 4중량%), 글리세린 4중량%, 오일 성분 7이상~8이하 중량%(바람직하게는 7.5중량%), 글리세릴스테아레이트 1중량%, 컨디셔닝제 0.5이상~1.5이하 중량%(바람직하게는 1중량%), 라이소자임 1중량%, 1,2-헥산다이올 1중량%, 포트마리골드꽃추출물 0.001중량%, 황벽나무껍질추출물 1.3중량%, 솔비탄스테아레이트 0.8중량%, 솔비탄세스퀴올리에이트 0.6중량%, 소듐하이알루로네이트 0.5중량%, 잔탄검 0.1중량%, 다이포타슘글리시리제이트 0.05중량%, 토코페롤 0.05중량%, 다이소듐이디티에이 0.03중량%, 알지닌 0.01중량%, 하이드록시아세토페논 0.5중량%를 더 포함할 수 있다.
지방산 성분은 아라키딜알코올, 베헤닐알코올 및 아라키딜글루코사이드 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
또한, 오일 성분은 올리브오일, 포도씨오일 및 아보카도오일 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
이하에서 병풀 추출물, 세테아릴알코올, 시어버터, 지방산 성분, 글리세린, 오일 성분, 글리세릴스테아레이트, 컨디셔닝제, 라이소자임, 1,2-헥산다이올, 포트마리골드꽃추출물, 황벽나무껍질추출물, 솔비탄스테아레이트, 솔비탄세스퀴올리에이트, 소듐하이알루로네이트, 잔탄검, 다이포타슘글리시리제이트, 토코페롤, 다이소듐이디티에이, 알지닌, 하이드록시아세토페논 각각의 성분에 대한 효과를 설명한다.
병풀 추출물의 추출물은 병풀의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 추출액들의 희석액이나 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 추출액의 조제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함할 수 있다.
또한, 추출물은 병풀의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출할 수 있다.
병풀 추출물의 추출 용매 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 병풀 추출물의 추출 용매는 물, 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 핵산, 디클로로메탄 또는 이들의 혼합 용매일 수 있다.
본 실시예에 따른 병풀 추출물에 포함된 아시아티코사이드(Asiaticoside)는 병풀(Centella asiatica, 센텔라아시아티카)에 함유되어 있는 성분으로, 병풀의 4가지 핵심 유효 성분 중 하나이며 피부 주름 개선 및 피부 탄력을 증가시키는 성분이다.
아시아티코사이드는 천연 유기화합물이자 불용성 약산성 화합물로 피부에 자생력을 더하여 건강하고 탄력있는 피부를 제공할 수 있고, 우수한 안정성으로 부작용이 없기 때문에 건성, 지성, 복합성 피부 등과 같은 피부 타입에 관계 없이 모든 피부 타입에 사용 가능한 특징이 있다.
본 실시예에 따른 병풀 추출물에 포함된 마데카소사이드(Madecassoside)는 아시아티코사이드와 마찬가지로 병풀(Centella asiatica, 센텔라아시아티카)에 함유되어 있는 성분으로, 병풀의 4가지 핵심 유효 성분 중 하나이며 피부 주름 개선 및 피부 탄력을 증가시키는 성분이다.
마데카소사이드는 콜라겐 생성 촉진으로 상처 주변의 피부세포를 재생시키는데 도움을 주는 피부 손상 개선 기능, 염증이 생기면 신체에서 분비되는 염증성 사이토카인(Cytokine) 성분을 억제하여 피부 자극을 완화시키고 피부를 진정시키는 기능, 피부 장벽 강화 기능, 피부 탄력 기능 및 피부 주름 개선 기능이 있다.
그 외에도 마데카소사이드는 건성이나 백반증, 아토피성 피부염과 같은 자가면역 질환 및 만성 염증성 피부 질환 등의 피부 조직 정상화를 도와주고, 멜라닌 생성 억제 효과로 미백에 관련된 화장품에도 사용될 수 있다.
본 실시예에 따른 병풀 추출물에 포함된 덱스트린(Dextrin)은 녹말을 산, 열 및 효소 등으로 가수분해시킬 때 녹말에서 말토오스에 이르는 중간 단계에서 생성되는 여러가지 가수분해 산물이다.
덱스트린은 수용성으로 사용되는 접착제에 들어가며, 인쇄 증점제, 식품 가공용 선명도 개선제, 섬유 마감재 및 코팅제, 의약품 및 종이 코팅제의 농축제 등으로 사용될 수 있으며, 화장품에서는 흡착제 및 접착제로 사용되거나 점도 향상을 위한 점증제로 사용될 수 있다.
본 실시예에 따른 세테아릴알코올(Cetearyl Alcohol)은 코코넛 지방 알코올로, 화장품에서 오일과 물이 분리되지 않고 잘 섞일 수 있도록 하는 유화 안정제, 투명한 제품을 불투명하게 만드는 불투명화제, 계면활성제, 점증제 등의 목적으로 배합될 수 있다. 세테아릴알코올은 식물성 원료에서 추출하여 피부에 자극을 유발하지 않으며, 발림성이 좋아 끈적임 없는 흡수를 도와주며 매끄럽고 부드러운 피부를 만들어줄 수 있다.
또한, 시어버터(Butyrospermum Parkii(Shea) Butter)는 식물성 지방으로 보습 효과가 뛰어나 보습제나 연화제로 많이 사용되고 있다.
본 실시예의 지방산 성분 중 아라키딜알코올(Arachidyl Alcohol)은 지방족 알코올로 화장품의 유화 보조와 유화 안정을 도울 수 있고, 베헤닐알코올(Behenyl Alcohol)은 지방족 알코올로 화장품에 유화제, 완충화제, 점증제 등으로 다양하게 사용되며, 아라키딜글루코사이드(Arachidyl Glucoside)는 천연 식물성 지방산 성분을 가지고 있어 화장품에서 계면활성제 및 유화제로 사용되고 있다.
글리세린(Glycerin)은 관장, 윤활, 보습 등의 목적으로 사용되는 약물로, 공기중의 수분을 흡수하는 능력이 우수하다.
본 실시예의 오일 성분 중 올리브오일(Olea Europaea (Olive) Fruit Oil)은 올리브를 압착하거나 추출하여 얻은 식물성 기름으로 비타민E가 함유되어 있어 피부에 수분을 공급하여 피부를 촉촉하게 만들어주고, 피부에 자극을 주지 않고 노폐물을 제거할 수 있도록 도와주며, 피부 건조나 가려움증, 피부 염증 등에 바르면 피부 자극을 완화해 주는 역할을 할 수 있다.
오일 성분 중 포도씨오일(Vitis Vinifera (Grape) Seed Oil)은 포도의 씨앗에서 추출한 식물성 기름으로 피부에 콜라겐이 형성되도록 도움을 주고 피부 산화를 방지하여 피부 주름을 예방하는 효과가 있다. 또한, 포도씨오일은 피부에 광택을 부여하고 컨디셔닝을 부여하여 피부를 더욱 맑게 해주기 때문에 주로 피부 컨디셔닝제로 이용되며, 카테킨이 함유되어 있어 살균 작용 및 항염 효과가 있다.
오일 성분 중 아보카도오일(Persea Gratissima (Avocado) Oil)은 씨앗이 아닌 과육에서 냉각 압착법으로 추출한 식물성 기름으로, 지방 함유량이 풍부하고 미네랄 성분과 레시틴, 비타민A, 비타민E, 피토스테롤, 리놀렌산, 올레인산을 함유하고 있다. 아보카도오일은 다른 식물성 오일보다 피부 침투력이 매우 높아 에센셜 오일과 블렌딩하여 사용하면 좋은 성분이 피부에 잘 흡수되도록 도와주고, 건조한 피부, 노화 피부, 습진 피부에 보습 기능이 있으며, 가려움증을 완화하는 효능이 있다.
본 실시예에서 글리세릴스테아레이트(Glyceryl Stearate)는 야자 열매와 콩 오일을 기반으로 만들어진 천연 성분으로 유화제의 목적으로 만들어졌으며 유화시 물질의 표면장력과 유분감을 감소시켜 계면활성제의 역할도 수행할 수 있다. 또한, 글리세릴스테아레이트는 피부 컨디셔닝제로도 사용되어 피부에 탄력과 윤기를 부여하여 매끄럽고 부드러운 피부를 가꾸는데 도움을 줄 수 있다.
컨디셔닝제에 포함되는 해수(Sea Water)는 마그네슘, 칼륨, 칼슘 등 유용 미네랄을 다량 함유하고 있고 영양 염류가 함유되어 있어 피부 재생에 도움을 주고, 부틸렌글라이콜(Butylene Glycol)은 사탕수수를 발효시켜 추출하고 부드러운 발림성과 피지 흡착 및 피지 조절에 큰 효능을 가지고 있으며 다른 알코올 제품 대비 입자가 커 수분을 보전해주는 보습제 역할을 수행할 수 있다.
라이소자임(Lysozyme)은 향균성의 효소로, 세균의 세포벽에 들어 있는 무코 다당류 등을 가수분해함으로써 세균의 감염을 막는 역할을 하고, 지혈 및 항바이러스 작용을 할 수 있다.
1,2-헥산다이올(1,2-Hexanediol)은 방부제, 보습제, 컨디셔닝제 역할을 할 수 있다.
포트마리골드꽃추출물(Calendula Officinalis Flower Extract)은 카렌둘라의 꽃에서 추출하고, 비타민E가 함유되어 있어 피부 재생 및 상처 치료에 탁월한 항산화 효능이 있고, 테르페노이드, 카로티노이드, 폴라보노이드, 베타카로인, 루테인 등 소염 작용을 하는 성분이 다량 함유되어 있어 햇빛으로 인한 화상, 피부 가려움증, 여드름 등 손상된 피부를 진정시켜주고 치유하는 효능이 있다. 또한, 포트마리골드꽃추출물은 콜라겐의 재생과 증식을 도와주기 때문에 안티에이징에도 효과적이다.
황벽나무껍질추출물(Phellodendron Amurense Bark Extract)은 황벽나무의 껍질에서 추출하고, 베르베린을 함유하고 있어 피부에 해로운 물질이 활동하거나 성장하는 것을 억제하여 문제성 피부를 개선할 수 있도록 하고, 피부 노화의 원인인 활성산소를 억제하여 피부 노화를 방지하며, 활력 있고 건강한 피부 관리에 도움을 주는 컨디셔닝 역할을 할 수 있다.
솔비탄스테아레이트(Sorbitan Stearate)와 솔비탄세스퀴올리에이트(Sorbitan Sesquioleate)는 물과 기름이 잘 섞이게 하는 유화제 역할을 하고, 소듐하이알루로네이트(Sodium Hyaluronate)는 피부 보습에 도움을 주며, 잔탄검(Xanthan Gum)은 점착성 및 점도를 증가시켜 유화 안정성을 증진시키는 역할을 할 수 있다.
다이포타슘글리시리제이트(Dipotassium Glycyrrhizate)는 감초 뿌리에서 추출한 식물성 활성 성분으로, 항염 효과가 있어 민감성 피부에 사용하기 좋고 유해 산소로부터 피부를 보호해주며 피부 표피 장벽의 손상을 회복하여 피부 개선을 도움을 줄 수 있다. 또한 다이포타슘글리시리제이트는 피부 자극을 완화 및 진정시키고 피부 보습력을 유지시켜줄 수 있다.
본 실시예의 토코페롤(Tocopherol)은 생물학적 항산화제로써 산소 및 다른 유리 라디칼들을 제거하는 역할을 하여 세포막 지질의 산화를 막아 세포 손상을 감소시킬 수 있다.
다이소듐이디티에이(Disodium EDTA)는 금속이온봉쇄제 역할을 하여 화장품이 개봉되었을 때 금속이온, 공기 유입 등으로부터 화장품의 부식 및 산패를 방지하여 화장품의 품질 저하를 방지하고, 화장품에 들어가는 여러가지의 유효한 성분들이 피부에 잘 스며들 수 있게 도와주는 촉매제 역할을 하며, 제품의 점도를 조절할 수 있는 점도 조절제 역할을 할 수 있다.
알지닌(Arginine)은 피부 속 콜라겐을 증가시켜 피부 탄력도를 증가시키고, 제품의 ph를 조절하여 피부를 촉촉하게 하는 항노화 기능을 수행할 수 있다.
또한, 하이드록시아세토페논(Hydroxyacetophenone)은 천연 산화방지제로 사용되고, 단일 성분으로 방부력은 약하지만 다른 방부제와 호환성이 좋기 때문에 방부 효능을 증가시켜 주는 방부 부스터 역할을 할 수 있다. 하이드록시아세토페논은 인터류킨-1 생성을 저해해 염증 자극을 완화해주고, 콜라겐 합성을 증가시켜 주름 개선에 탁월한 효과가 있다.
이하에서 실험 데이터를 기초로 본 실시예에 따른 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물(이하, 반려동물용 화장료 조성물)의 보습 효과와 염증 개선 효과에 대해 설명한다. 아래 실험은 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에 관한 것으로, 중앙피부과학연구소에서 진행되었다.
실험예 1. 반려동물용 화장료 조성물의 보습력 개선 효과(인간 피부)
본 실험예는 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%, 정제수 65.559중량%, 세테아릴알코올 6중량%, 시어버터 4중량%, 지방산 성분 3.5이상~4.5이하 중량%(바람직하게는 4중량%), 글리세린 4중량%, 오일 성분 7이상~8이하 중량%(바람직하게는 7.5중량%), 글리세릴스테아레이트 1중량%, 컨디셔닝제 0.5이상~1.5이하 중량%(바람직하게는 1중량%), 라이소자임 1중량%, 1,2-헥산다이올 1중량%, 포트마리골드꽃추출물 0.001중량%, 황벽나무껍질추출물 1.3중량%, 솔비탄스테아레이트 0.8중량%, 솔비탄세스퀴올리에이트 0.6중량%, 소듐하이알루로네이트 0.5중량%, 잔탄검 0.1중량%, 다이포타슘글리시리제이트 0.05중량%, 토코페롤 0.05중량%, 다이소듐이디티에이 0.03중량%, 알지닌 0.01중량%, 하이드록시아세토페논 0.5중량%로 이루어진 반려동물용 화장료 조성물을 이용하여 진행되었다.
또한, 이하의 다른 실험예도 동일한 반려동물용 화장료 조성물을 이용하여 진행되었다.
1-1. 세포 생존률(세포 독성)
인간 피부 각질형성세포(Normal human epidermal keratinocytes, NHEK)에 대한 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 세포 독성을 확인하기 위하여 CCK-8 assay를 수행하였다. 도 1을 참조하면 대조군은 시료를 처리하지 않았고, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5μg/mL의 농도 순으로 처리하여 세포 생존율을 측정하였다.
실험 결과, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 2.5μg/mL 농도 이상 처리했을 때 인간 피부 각질형성세포의 생존율이 유의성 있게 감소한 것으로 나타났다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 인간 피부 각질형성세포의 생존율이 유의성 있게 감소한 것으로 나타났다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 인간 피부 각질형성세포의 생존율이 유의성 있게 감소하지 않은 것으로 나타났다.
1-2. 보습인자 발현에 미치는 영향
인간 피부 각질형성세포에 대한 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 24h 또는 48h 처리하여 인간 피부 각질형성세포가 발현하는 보습인자인 Aquaporin3(AQP3)와 Hyaluroninc acid synthase(HAS1, HAS2, HAS3)의 mRNA 및 단백질 발현양을 실시간으로 PCR과 western blotting, immunocytochemistry(ICC) 방법을 통하여 확인하였다.
AQP3와 HAS1, HAS2, HAS3는 인간 피부 각질형성세포에서 발현되는 유전자로 보습에 관여하는 표지인자로 알려져 있다.
도 2는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 농도별(25, 50, 100ng/mL)로 24h 처리하고, 인간 피부 각질형성세포에서 RNA의 추출을 위해 균질화시켰으며, qRT-PCR을 이용하여 AQP3, HAS1, HAS2, HAS3의 mRNA 수준을 정량화한 후 진행한 실험 그래프이다.
도 2를 참조하면, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 처리는 농도의존적으로 AQP3 및 HAS의 발현을 증가시켰으며 mRNA 수준에서 50ng/mL 처리군에서 AQP3의 발현이 약 19배, 100ng/mL 처리군에서 HAS1, HAS2, HAS3의 발현이 각각 2배 2.5배 1.8배 증가하는 효과를 보였다.
도 3은 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 배양 48시간 후 cell lysates에 대해 각각 anti-AQP3, HAS1, HAS2, HAS3, 
-actin 항체를 이용하여 western blot analysis를 실시하고, 
-actin을 전체 단백질 lysate에 대한 internal control로 사용한 후 진행한 실험 이미지이다.
도 4는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 배양 48시간 후 인간 피부 각질형성세포에서 anti-AQP3의 형광 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 3 및 도 4를 참조하면 Protein에서도 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 처리는 농도의존적으로 AQP3와 HAS들의 발현이 증가하였다. 피부 연고의 성분으로 사용되는 dexamethasone(Dex)의 경우 100ng/mL 처리시 AQP3와 HAS들의 발현이 조금 증가하였으나 유의미한 차이를 보이지 않았다.
실험 결과, 세포 외부의 수분을 세포 내로 수송하는 기능을 담당하는 AQP3와 히알루론산을 생성하는 효소인 HAS1, HAS2, HAS3의 mRNA와 protein 발현을 증가시키는 결과를 바탕으로, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물이 피부 보습에 긍정적인 기능이 있는 것으로 나타났다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 피부 보습에 긍정적인 기능이 있는 것으로 나타났다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물 대비 피부 보습 효과가 저하되는 것으로 나타났다.
한편, 도 2 내지 도 4에서 Scale bar, 100μm, 그래프의 결과는 각 시험군별 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation)로 나타냈다.
1-3. 피부장벽 기능(각질형성세포 분화)에 미치는 영향
피부장벽은 각질형성세포의 분화 말기 과정에서 분비되는 분화 촉진인자들에 의해 각질세포막을 형성함으로써 물리적 장벽의 정상적인 기능을 유지하게 된다. 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물이 피부 장벽 기능에 미치는 영향을 살펴보기 위해 각질형성세포의 분화 촉진시에 분비되는 filaggrin(FLG), involucrin(INV), loricrin(LOR)의 발현을 RT-PCR과 western blot, IHC를 이용하여 측정하였다.
각질형성세포에 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 filaggrin, involucrin, loricrin의 mRNA와 protein 발현을 확인하였다.
실험 결과, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물 100ng/mL 처리시 mRNA 발현양이 각각 2.4배 2.8배 1.5배 증가하였으며(도 5), 단백질 발현에서도 모든 처리군이 대조군에 비해 증가한 발현율을 보였다(도 6 및 도 7).
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 mRNA 발현양이 증가하였으며, 단백질 발현에서도 모든 처리군이 대조군에 비해 증가한 발현율을 보였다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 mRNA 발현양과 단백질 발현이 대조군에 비해 증가하지 않은 것으로 나타났다.
여기서, 도 5는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 농도별(25, 50, 100ng/mL)로 24h 처리하고, 인간 피부 각질형성세포에서 RNA의 추출을 위해 균질화시켰으며, qRT-PCR을 이용하여 filaggrin(FLG), involucrin(INV), loricrin(LOR)의 mRNA 수준을 정량화한 후 진행한 실험 그래프이다.
도 6은 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 배양 48시간 후 cell lysates에 대해 각각 anti-FLG, INV, LOR, β-actin 항체를 이용하여 western blot analysis를 실시하고, β-actin을 전체 단백질 lysate에 대한 internal control로 사용한 후 진행한 실험 이미지이다.
도 7은 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 배양 48시간 후 인간 피부 각질형성세포에서 anti-FLG의 형광 염색 이미지를 나타내고 있다.
한편, 도 5 내지 도 7에서 Scale bar, 100μm, 그래프의 결과는 각 시험군별 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation)로 나타냈다.
실험예 2. 반려동물용 화장료 조성물의 보습력 개선 효과(인공피부)
2-1. 경피수분증발량(Transepidermal water loss) 개선 평가
인공 피부모델(3D skin equivalent)에서 TEWL, 각질 내 moisture 등 in vivo 효능 평가시 활용 측정되는 기능성 지표를 Tewameter® TM 300 probe(Courage + Khazaka Electronic GmbH, Kφln, Germany)를 이용하여 확인 하였다.
표피 투과 장벽을 가로 지르는 수증기압의 차이로 인해 물은 피부를 통해 증발 한다. 증발을 통해 피부를 통해 손실되는 수분의 양은 일반적으로 경피수분손실(TEWL)이라고 하며, 이는 표피 투과성 장벽 기능의 좋은 지표이다.
TEWL 측정은 인간과 설치류의 투과성 장벽 상태를 평가하는 데 널리 사용되며 체외 시스템의 투과성 장벽 기능을 모니터링하는데 사용할 수 있다.
도 8은 3D skin equivalent에 5% SDS를 1시간 처리 한 후 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물이 1%, 5% 각각 함유된 크림을 도포하고, 이후 48시간 뒤 측정한 tranepidermal water loss(TEWL)의 측정값을 나타낸 실험 그래프이다.
도 9는 3D skin equivalent에 5% SDS를 처리한 후, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 처리하여 48시간 뒤 hematoxylin and eosin(H&E) 염색이미지를 나타낸 이미지이다.
한편, 도 8 및 도 9에서 Scale bar, 50μm, 그래프의 결과는 각 시험군별 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation)로 나타냈다.
실험 결과, 도 8을 참조하면 5% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate, 음이온 계면활성제)에 의한 장벽 손상과 보습능 저하가 Tewameter 측정을 통해 약 153% 증가함이 나타났다. 반면에 5% SDS 처리 후 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 1%와 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 5%를 처리한 그룹은 장벽 손상과 보습능 저하 수치(TEWL)가 SDS 처리군 대비 각각 73%, 74% 낮아지면서 정상군의 수치와 비슷한 수치를 보여주어 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림이 보습력 개선에 효과가 있음을 확인하였다. SDS에 Vehicle 크림을 처리한 그룹은 유의한 감소를 보이지 않았다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림이 보습력 개선에 효과가 있음을 확인하였다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림에서는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 대비 보습력 개선 효과가 저조한 것으로 나타났다.
도 9를 참조하면 5% SDS와 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 처리에 따른 조직학적 분석을 H&E 염색을 통해 확인한 결과, 5% SDS에 의하여 손상되었던 피부조직이 1%와 5%의 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 처리 후 배양 2일째 회복되는 현상을 확인하였다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 처리 후 SDS에 의하여 손상되었던 피부조직이 회복되는 현상을 확인하였다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림은 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 대비 SDS에 의하여 손상되었던 피부조직이 회복되는 시간과 회복 정도가 저조한 것으로 나타났다.
실험예 3. 반려동물용 화장료 조성물의 염증 개선 효과(대식세포)
3-1. 세포 생존률(세포 독성)
대식세포(macrophage)는 동물 체내 모든 조직에 분포하며 인체 내에서 선천적 면역반응을 담당하는 면역 세포로, 인체 면역체계에서 중요한 역할을 하는 백혈구이다. 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 대식세포 독성에 관해 알아보기 위하여 Raw264.7 세포에 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 여러 농도(50, 100, 250, 500ng/mL, 1, 2.5, 5μg/mL)로 처리하여 24시간 후에 세포의 생존율을 측정하였다.
도 10은 세포 독성 및 세포 성장율을 CCK-8을 이용하여 72시간 동안 측정한 실험 데이터로, 도 10을 참조하면 5μg/mL까지 세포 독성은 나타나지 않았고, 인간 피부 각질형성세포와 동일하게 25, 50, 100ng/mL농도에서 이후 실험을 진행하였다.
3-2. Nitric oxide(NO), prostaglandinE2(PGE2) 생성에 미치는 영향
병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 항염증 작용을 알아보기 위하여 RAW264.7 세포에서 내독소의 하나인 lipopolysaccharide(LPS) 자극에 의해 분비되어 염증 관련 질병을 유발하는 nitric oxide(NO), prostaglandinE2(PGE2) 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
실험 결과, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 다양한 농도(25, 50, 100ng/mL)로 1시간 전처리하고 LPS(1μg/mL)로 자극하였다. 12시간 후 세포에서 NO를 생성하는 효소인 NO synthase(iNOS)와 다양한 prostaglandins(PGs)의 생합성을 매개하는 효소인 cyclooxygenase(COX-2)의 mRNA 발현양을 측정한 결과 LPS에 의해 COX-2, iNOS의 발현은 모두 약 3.5배 증가하였으나, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 처리는 COX-2와 iNOS의 발현을 유의하게 감소시켰으며, 100ng/ml 처리군에서 LPS 처리군 대비 각각 약 62%, 34% 수준으로 감소시켰다(도 11).
또한 LPS에 의해 증가한 COX-2와 iNOS의 단백질 발현량도 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에 의해 유의하게 감소하였다(도 12).
LPS 처리 24 시간 후 상층액에서 PGE2 및 nitrite의 생성을 측정한 결과 LPS 자극은 대식세포에서 PGE2 및 nitrite의 생성을 각각 증가시켰으며, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 전처리한 실험군에서는 PGE2와 nitrite의 생성이 유의하게 억제되었다(도 13).
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 COX-2와 iNOS의 발현을 유의하게 감소시켰고, COX-2와 iNOS의 단백질 발현량도 유의하게 감소시켰으며, PGE2와 nitrite의 생성이 유의하게 억제되었다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 COX-2와 iNOS의 발현이 유의하게 감소하지 않았고, COX-2와 iNOS의 단백질 발현량도 유의하게 감소하지 않았으며, PGE2와 nitrite의 생성이 유의하게 억제되지 않았다.
여기서 도 11은 Raw264.7 세포를 RNA 추출을 위해 균질화시키고, qRT-PCR을 이용하여 COX-2, iNOS의 mRNA 수준을 정량화한 후 진행한 실험 그래프이다.
도 12는 cell lysates에 대해 각각 anti-COX-2, iNOS, β-actin 항체를 이용하여 western blot analysis를 실시하고, β-actin을 전체 단백질 lysate에 대한 internal control로 사용한 후 진행한 실험 이미지이다.
도 13은 배양 상층액의 PEG2, NO의 양을 ELISA로 측정한 실험 그래프이다.
3-3. 염증성 cytokine 생성에 미치는 영향
염증성 cytokine으로 대표되는 IL-1β, IL-6 및 TNFα는 염증반응을 매개하는 물질로 특히 초기 염증반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물이 LPS로 염증이 유도된 Raw264.7 대식세포가 분비하는 염증성 cytokine의 생성억제 효과를 측정하기 위해 RT-PCR과 ELISA 방법을 이용하여 염증성 cytokine의 생성양을 측정하였다.
도 14는 Raw264.7 세포에서 RNA 추출을 위해 균질화시키고, qRT-PCR을 이용하여 IL-1β, IL-6, TNFα의 mRNA 수준을 정량화한 후 진행한 실험 그래프이고, 도 15는 배양 상층액의 IL-1β, IL-6, TNFα의 양을 ELISA로 측정한 실험 그래프이다.
실험 결과, 도 14 및 도 15를 참조하면, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 처리는 LPS로 염증이 유도된 Raw264.7 대식세포에서 증가된 TNFα, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 및 생성을 효과적으로 감소시켰다.
병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 처리는 LPS 단독 처리군(187.6pg/mL)에 비해 유의적으로 IL-1β 생성량을 감소시켰고, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물은 농도의존적으로 15~54%의 생성 저해 효과를 나타냈다. 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물 100ng/mL 농도에서는 양성대조군 dexamethasone 100ng/mL와 비슷한 저해 효과를 보였다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 LPS 단독 처리군(187.6pg/mL)에 비해 유의적으로 IL-1β 생성량을 감소시켰고 농도의존적으로 생성 저해 효과를 나타냈다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에 비해 IL-1β 생성량의 감소율이 낮았고 농도의존적으로 생성 저해 효과도 저조하게 나타났다.
병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물 25, 50, 10ng/mL 처리 농도에 따라 유의적으로 IL-6의 생성이 억제되었고 100ng/mL 농도에서 44%(244.5pg/mL)로 가장 높은 IL-6의 생성 억제 효과를 나타냈다. 또한, 양성대조군 dexamethasone 100ng/mL와 비슷한 저해 효과를 보였다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 유의적으로 IL-6의 생성이 억제된 것으로 나타냈다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에 비해 IL-6의 생성 억제율이 저조하게 나타났다.
병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물 25, 50, 10ng/mL 처리 농도에 따라 유의적으로 TNFα의 생성이 억제되었고 100ng/mL 농도에서 46%(163.8pg/mL) 로 가장 높은 TNFα 생성 억제효과를 나타냈다. 또한, 양성대조군 dexamethasone 100ng/mL와 비슷한 저해 효과를 보였다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 유의적으로 TNFα의 생성이 억제된 것으로 나타냈다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에 비해 TNFα의 생성 억제율이 저조하게 나타났다.
3-4. MAPKs와 NF-kB 활성에 미치는 영향
병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물이 Raw264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증 억제 기전을 알아보기 위해 MAPK family인 ERK, JNK, p38의 활성화 정도를 알아보기로 하였다. MAPKs는 다양한 염증매개 물질들과 염증성 cytokine들의 발현을 매개하는 것으로 알려져 있고 이는 각각의 신호 매개분자의 인산화를 통해 이루어진다.
병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 다양한 농도로 전처리한 후 LPS로 자극하였다.
도 16은 cell lysates에 대해 각각 anti-p-ERK, ERK, pJNK, JNK, p-p38, p38, β-actin 항체를 이용하여 western blot analysis를 실시한 실험 이미지이고, 도 17은 cell lysates에 대해 각각 anti-p-IkB, IkB, β-actin 항체를 이용하여 western blot analysis를 실시한 실험 이미지로, β-actin은 전체 단백질 lysate에 대한 internal control로 사용되었다.
실험 결과, 도 16을 참조하면 1시간 후 인산화 정도를 측정한 결과 LPS로 자극한 RAW264.7 세포에서는 ERK, JNK, p38의 활성이 증가하였다. 반면에 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 처리한 군에서는 ERK, JNK, p38의 인산화가 유의성 있게 감소하는 결과를 나타냈다. 이는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물이 LPS처리에 의한 MAPKs의 인산화를 억제하여 염증반응을 감소시킨다는 것을 의미한다.
도 17을 참조하면 LPS에 의해 유도되는 염증성 매개물질인 iNOS와 COX-2 및 염증성 cytokine들은 전사 인자인 NF-kB에 의해서도 발현된다. 이 과정에서 세포질 내 IkBα가 인산화 되면 결합되어 있던 복합체가 분해되면서 NF-kB가 활성화되어 핵 내로 전위된다. 이는 억제인자 IkBα의 phosphorylation에 의해 조절된다. 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물은 이러한 IkBα의 인산화를 유의성 있게 억제함을 보여주었다. 이는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물이 IkBα의 인산화 억제를 통하여 NF-kB의 핵 전위를 제어하여 염증발생을 억제할 수 있음을 나타낸다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 ERK, JNK, p38, IkBα의 인산화가 유의성 있게 감소한 것으로 나타났다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 ERK, JNK, p38, IkBα의 인산화가 유의성 있게 감소하지 않은 것으로 나타났다.
실험예 4. 반려동물용 화장료 조성물의 염증 개선 효과(피부각질분화세포)
4-1. 염증성 cytokine 및 chemokine의 발현에 미치는 효과
아토피피부염과 같은 피부염증이 발생한 부위에서 손상된 피부를 통해 항원이 침투하면 피부각질형성세포에서 TSLP를 비롯한 염증성 사이토카인(IL-4, IL-13) 및 chemokine(CCL5(RANTES), CCL17(TARC))들이 분비하며, 이를 이용하여 면역에 관련된 세포들에 신호를 전달한다. 그리고 IFNγ와 TNFα는 각질형성세포에 노출되었을 때 많은 양의 cytokine과 chemokine의 발현을 유도하고, 피부에서 염증 부위로 단핵구/T 세포의 침투를 증가시킨다.
도 18을 참조하면, 피부각질형성세포에서 TNFα/IFNγ로 염증을 유도한 세포에서 TSLP, IL-4, IL-13, CCL5, CCL17의 mRNA 발현이 각각 약 150배, 5배, 3배, 5000배, 70배 이상 증가하였다.
반면에, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 농도에 25, 50, 100ng/mL의 농도로 처리함에 따라 TSLP, IL-4, IL-13, CCL5, CCL17의 발현이 모든 농도에서 유의적으로 감소하였고, 100ng/mL 처리군에서 각각 약 41%, 77%, 81%, 31%, 53% 감소하였다. 이는 양성대조군인 dexamethasone과 동등한 효과를 나타냈다.
도 19를 참조하면, ELISA 방법을 이용하여 TSLP, IL-4의 분비량은 확인한 결과 대조군에 비해 TNFα/IFNγ를 처리한 세포에서 TSLP, IL-4 IL-13의 분비량이 각각 약 4.5배, 5배 증가하였으나, 이것은 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 처리에 의해 농도의존적으로 현저히 감소되었다. 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물 100ng/mL의 농도에서 TSLP는 65%, IL-4는 64% IL-13은 46% 감소하였다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 TSLP, IL-4, IL-13, CCL5, CCL17의 발현이 모든 농도에서 유의적으로 감소한 것으로 나타났다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 TSLP, IL-4, IL-13, CCL5, CCL17의 발현이 모든 농도에서 유의적으로 감소하지 않은 것으로 나타났다.
여기서 도 18은 피부각질형성세포에서 RNA 추출을 위해 균질화시키고, qRT-PCR을 이용하여 TSLP, IL-4, IL-13, CCL5, CCL17의 mRNA 수준을 정량화한 후 진행한 실험 데이터이고, 도 19는 배양 상층액의 TSLP, IL-4, IL-13의 양을 ELISA로 측정한 실험 그래프이다.
4-2. 각질형성세포에서 TNFα/IFNγ로 활성화되는 신호전달인자에 대한 효과
IFNγ는 세포막에 존재하는 IFNGR1와 R2에 결합하여 작용을 하고, 이후에 Janus kinase/signal transducers and activators of transcription(JAK/STAT), mitogen-activated protein kinases(MAPKs; ERK and p38), nuclear factor kB(NF kB)와 같은 다양한 신호전달 경로를 활성화시킨다.
도 20 및 도 21을 참조하면, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에 의한 농도의존적인 cytokine 및 chemokine의 생성 억제가 STAT1, 3의 신호전달기전과 관련이 있는지 확인하기 위하여 STAT1, 3의 인산화를 western blot으로 확인하였다.
각질형성세포에 TNFα와 IFNγ(20ng/mL)를 처리했을 때 인산화된 STAT1, 3이 증가하였으나 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 농도별로 처리한 군에서는 증가된 STAT1, 3의 인산화가 농도 의존적 감소를 나타내었다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 증가된 STAT1, 3의 인산화가 농도 의존적 감소를 나타내었다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 증가된 STAT1, 3의 인산화가 농도 의존적 감소를 나타내지 않았다.
도 20은 cell lysates에 대해 각각 anti-p-STAT1, STAT1, p-STAT3, STAT3, β-actin 항체를 이용하여 western blot analysis를 실시하고, β-actin을 전체 단백질 lysate에 대한 internal control로 사용한 후 진행한 실험 이미지이다.
도 21은 p-STAT1, p-STAT3의 band relative intensity에서 image J를 이용하여 분석한 실험 그래프이다.
실험예 5. in vitro 피부감작성 평가
피부감작성과 관련된 다양한 동물실험 대체법들은 유럽연합의 화장품 원료 및 완제품에 대한 동물실험 금지에 따라 이를 평가하기 위해 개발되었다. 본 실험에서는 그 중 한가지 방법인 in vitro skin sensitisation: ARE Nrf2 luciferase test method(OECD test guideline 442D)를 이용하여 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 피부 감작성을 평가하였다.
도 22는 중앙피부과학연구소 표준 작업 지침서에 따라 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물 농도별 ARE-Nrf2 luciferase induction(opencircle)과 세포 성장율(closed circle) ARE-Nrf2 vector가 삽입된 HaCaT(Immortalized human keratinocyte) 세포주에서 평가한 실험 그래프이다.
도 22를 참조하면, 시험 결과 200μg/mL까지 EC1.5(루시퍼라아제 활성을 1.5배 보다 크게 유도하는 가장 낮은 농도)가 나타나지 않고 세포생존율이 70%를 나타냈다. 이는 식품의약품안전평가위원 가이드라인(안내서-0787-0, 2017.09.07)에 맞춰 음성으로 판단되고 이로 미루어 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물은 피부자극 및 감작이 유발되지 않음을 확인하였다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에서도 피부자극 및 감작이 유발되지 않음을 확인하였다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물에서는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물에 비해 피부자극 및 감작이 일부 유발되는 것을 확인하였다.
실험예 6. 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 피부 투과도 평가
병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물의 라만 스펙트럼을 알아보기 위해 피부 위에 본 실시예에 따른 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림 1%, 5%를 각각 도포한 후 532nm를 이용하여 400~4,400cm-1 영역을 측정하였다. 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물을 측정해서 얻은 peak는 3,967cm-1에서 확인할 수 있었다.
도 23은 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림을 1% 도포 후 1분 및 30분 후 측정한 Raman spectrum이고, 도 24는 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림을 5% 도포 후 1분 및 30분 후 측정한 Raman spectrum이다.
도 23을 참조하면, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림을 1% 도포한 후 피부 위에 존재하는 양을 추출하기 위해 1분 뒤 측정한 측정값은 1201(au)이고, 30분 뒤 측정한 측정값은 491(au)이다.
도 24를 참조하면, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림을 5% 도포한 후 피부 위에 존재하는 양을 추출하기 위해 1분 뒤 측정한 측정값은 2669(au)이고, 30분 뒤 측정한 측정값은 1240(au)이다.
이를 바탕으로 약 30분 동안 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림의 피부 흡수율은 피부흡수율(30 min)=(1분AU-30분AU)/1분AU*100으로 계산하였고, 그 결과 1% 크림은 59.1%, 5% 크림은 53.5%의 피부흡수율을 나타내어 피부 도포 후 30분 이내에 50%이상 피부 투과가 이루어질 것으로 확인되었다.
또한, 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림에서도 피부흡수율이 50% 이상으로 나타났다.
다만, 병풀 추출물 0.5중량% 미만이거나 병풀 추출물 1.5중량% 초과되는 반려동물용 화장료 조성물로 제작된 크림에서는 피부흡수율이 50% 미만으로 나타났다.
결론적으로, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물은 피부 보습, 피부 장벽 보호, 피부 염증에 우수한 효과를 나타내었고, 이는 피부 보습, 피부 장벽 개선 및 피부 염증 개선에 도움을 주는 것으로 나타났다.
즉, 병풀 추출물 1중량%를 포함하는 반려동물용 화장료 조성물은 인간 피부 각질형성세포 및 인공 세포에 대한 보습 효과가 뛰어나고, 대식세포 및 피부각질분화세포에 대한 염증 개선 효과가 우수하며, 피부자극 및 감작이 발생하지 않는 것으로 나타났다.
다만, 병풀 추출물 0.5 중량% 미만인 경우와 병풀 추출물 1.5 중량% 초과인 경우에서는 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 경우에 대비하여, 인간 피부 각질형성세포 및 인공 세포에 대한 보습 효과가 저하되었고, 대식세포 및 피부각질분화세포에 대한 염증 개선 효과가 저하되었으며, 피부자극 및 감작이 일부 유발되는 것을 알 수 있었다.
상기에서는 본 발명의 일 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (5)
- 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 병풀 추출물 0.5이상~1.5이하 중량%는,
아시아티코사이드 46.24중량%, 마데카소사이드 25.08중량% 및 덱스트린 28.68중량%를 포함하는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 지방산 성분은,
아라키딜알코올, 베헤닐알코올 및 아라키딜글루코사이드 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 병풀 추출물 및 상기 덱스트린을 제외한 나머지 95중량%에 대하여 3.5이상~4.5이하 중량%를 포함하는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 오일 성분은,
올리브오일, 포도씨오일 및 아보카도오일 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 병풀 추출물 및 상기 덱스트린을 제외한 나머지 91.5중량%에 대하여 7이상~8이하 중량%를 포함하는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 컨디셔닝제는,
해수 및 부틸렌글라이콜 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 병풀 추출물 및 상기 덱스트린을 제외한 나머지 98중량%에 대하여 0.5이상~1.5이하 중량%를 포함하는 보습 및 상처 치유가 우수한 반려동물용 화장료 조성물.
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| KR102194315B1 (ko) | 2020-06-24 | 2020-12-23 | 주식회사 아미코스메틱 | 락토바실러스 람노서스 균주를 접종하여 발효시킨 병풀 발효 추출물을 포함하는 항산화용 또는 피부 마이크로바이옴 균형 유지용 화장료 조성물 |
-
2021
- 2021-11-22 KR KR1020210161551A patent/KR20230075197A/ko not_active Application Discontinuation
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