KR20230068277A - 노화세포 제거용 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시는 노화세포 제거에 유용한 노화세포 제거용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 노화세포의 사멸을 유도하여 노화세포로부터 야기되는 각종 노화관련 질환 및 장애의 개선, 치료 및 예방에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 노화세포로부터 야기되는 노화관련 질환 및 장애와 관련해서 의약품, 화장품, 건강기능식품, 동물용제품 등으로 유용하게 적용될 수 있다.

Description

노화세포 제거용 화합물 및 이의 용도{Compounds for removing senescent cells and uses thereof}

본 발명은 노화세포 제거 효능이 있는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 노화세포 제거용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 다양한 용도에 관한 것이다.

노화(aging)는 인간이 태어나서 일정 기간 성장한 후, 나이가 들면서 점차 신체적 및 인지적으로 쇠퇴하여 죽음에 이르는 과정을 의미한다. 세계보건기구(WHO)가 2018년 고령(old age) 자체에 대한 질병코드(MG2A)를 부여하면서 노화를 치료하기 위한(예를 들어, 늦추기 위한) 여러 연구개발 및 임상 시험이 수행되고 있다.

특히, 다양한 연구개발 결과를 통해서 노화의 타깃을 '개체'에서 ‘세포’로 좁혀가고 있다. 이에 따라 노화관련 다양한 질환 및 장애를 야기하는 근본적인 원인이 '노화세포(senescent cell)'임이 밝혀졌다. 나이듦, 약물 부작용, 스트레스, 비만, 당뇨, 상처, 이식, 감염 등 여러 요인에 의해 인체에 노화세포가 발생한다. 이러한 노화세포는 체내의 면역세포에 의해 제거되지만, 노화에 따라 여러 원인에 의해 면역세포들이 제 기능을 하지 못하거나, 보다 근본적으로 면역세포들도 함께 노화되기 때문에 제 기능을 하지 못하여 결국 노화세포가 인체에 축적하게 된다.

축적된 노화세포는 노화-촉진(senescence-promoting) 인자와 더불어 노화-염증(senescence-associated inflammation), 노화-섬유화증(senescence-associated fibrosis) 등 노화와 관련된 병적인(senescence-associated pathogenic) 인자 등을 다수 분비한다. 이러한 노화관련 분비인자(SASP; senescence-associated secretory phenotype)의 역할은 (i) 주위의 정상세포를 노화세포로 변화시켜 노화세포를 점차 확산시켜서, (ii) 이에 따라 전체 장기와 조직에서 구조적 및 기능적인 변이를 진행시키고, (iii) 노화에 따른 만성적인 염증(immuno-aging), 섬유화증(fibro-aging) 등의 여러 병적인 기저 이상 증상(underlying pathological phenotypes)을 야기시켜서, (iv) 이에 따라 결국에는 전신에 걸쳐서 여러 노화관련 질환 및 장애를 발생시키는 것으로 알려졌다.

이에, 최근 암세포를 제거해서 암을 치료하듯이, 노화세포를 제거해서 노화관련 질환 및 장애를 치료하고자 하는 다양한 연구개발이 진행되고 있다(Robbins PD et al., Annual Review of Pharmacological Toxicology 61, 779-803, 2021). 예를 들어, 이러한 혁신적인 안티에이징 치료제로서 ABT-263, ABT-737 등이 최근 보고된 바 있지만, 독성 등 많은 부작용이 문제점으로 존재한다.

Robbins PD et al., Annual Review of Pharmacological Toxicology 61, 779-803, 2021.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 노화세포 제거에 유용한 화합물 및 이러한 화합물의 노화세포 제거 용도를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하여 노화세포를 제거시킴으로써 다양한 노화세포 관련 질환을 개선, 치료 또는 예방할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위해, 본 발명의 일 양태는 (a) 하기 표의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; (b) 하기 표의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포의 분비액; 또는 (c) 하기 표의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포를 유효성분으로 포함하는, 노화세포 제거용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 노화세포 제거 효과를 가진 화합물은 Auranofin, Aurothiomalate, Aurothiosulfate, Aurothioglucose, Auroptopanolsulfonate, 4-amino-2-aurothiosalicylate, TVB-2640, PX-12, MK-8245, ML210, Isopropyl-ML210, ML162, JKE1674, JKE1716, Altretamine, DMOCPTL, RSL3, FIN56, FINO2, Eprenetapopt, 2-Methylene-3-quinuclidinone, APR-017 (PRIMA-1), 2,2,2-trifluoro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, 2,2,2-trichloro-N-ethyl-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, 2,2,2-trichloro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, N-ethyl-2,2,2-trifluoro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, 2,2-difluoro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, Erastin2, Erastin, Piperazine Erastin, Imidazole Ketone Erastin, PRLX 93936, iFSP1, Siramesine, 5-Aminolevulinic Acid, Methylaminolevulinate, Hexylaminolevulinate, Benzylaminolevulinate, Triphenylphosphonium, Artesunate, Mitotane, Phenethyl Isothiocyanate, Sulfasalazine, Tolperisone, Disulfiram, Brequinar, Leflunomide, ME-344, Lapatinib, Neratinib, Eperisone, Lanperisone, Ferroptocide, VLX600, Fenretinide, Pralsetinib, Erdafitinib, Nelfinavir, Omaveloxolone, ATN-224, Ezatiostat, Ethacrynic Acid, Polyunsaturated Fatty Acid, Lercanidipine, Atovaquone, Ivosidenib, MitoCDNB, Roblitinib, Lenvatinib, IFNgamma, CTLA4 저해제(inhibitor), PD-1 저해제, 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이다.

본 발명의 더욱 바람직한 일 양태에서, 상기 노화세포 제거 효과를 가진 화합물은 Auranofin, Aurothiomalate, TVB-2640, PX-12, MK-8245, ML210, ML162, JKE1674, JKE1716, Altretamine, DMOCPTL, RSL3, FIN56, FINO2, Eprenetapopt, 2-Methylene-3-quinuclidinone, Erastin2, PRLX 93936, iFSP1, Siramesine, 5-Aminolevulinic Acid, Triphenylphosphonium, Artesunate, Mitotane, Phenethyl Isothiocyanate, Sulfasalazine, Tolperisone, Disulfiram, Brequinar, Leflunomide, ME-344, Lapatinib, Neratinib, Eperisone, Lanperisone, Ferroptocide, VLX600, Fenretinide, Pralsetinib, Erdafitinib, Nelfinavir, Omaveloxolone, ATN-224, Ezatiostat, Ethacrynic Acid, Polyunsaturated Fatty Acid, Lercanidipine, Atovaquone, Ivosidenib, MitoCDNB, Roblitinib, Lenvatinib, IFNgamma, CTLA4 저해제, PD-1 저해제, 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상이다. 본 발명의 여러 목적상 이러한 화합물들이 더욱 바람직하였다.

본 발명의 일 양태에 있어, 상기 CTLA4 저해제(inhibitor)로는 예를 들어, KN046, AK104, BMS-986288, MK-1308, ADG116, AGEN1181, ALPN-202, MEDI5752, MGD019, ONC-392, Alpha-D-Mannose, Fucose, Tremelimumab, Concatameric CTLA4Ig, CTLA-4-XTEN, AGEN1884, Ipilimumab, BCD-217 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 있어, 상기 PD-1 저해제로는 예를 들어, Pembrolizumab, Cemiplimab, Nivolumab, AMP-224, CBT-501, Dostarlimab, Sintilimab, Tislelizumab, Sasanlimab, INCSHR1210, Retifanlimab, Balstilimab, AK104, JTX-4014, Vopratelimab, RO7121661, 609A, ADPT01, AMG 404, APL-501, BI 754091, CDX-527, GSK2661380, IBI318, MEDI5752, MGD019, RG6139, 1,2,4-oxadiazole derivative 1, 1,2,4-oxadiazole derivative 2, 1,3,4-oxadiazole derivative 1, 1,3,4-oxadiazole derivative 2, Cyclic compound 1, Cyclic compound 2, Cyclic compound 3, PMID30107136-Compound-Example 15/16, AUNP-12, PDR001, CC-90006, PMID30247903-Compound-General Structure 13/14/15/16/17/20/21/22/23/24/25, BCD-217, BCD-100 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 있어, 상기 PD-L1 저해제로는 예를 들어, Bavencio, KN046, CX-072, INCB86550, M7824, GS-4224, ALPN-202, BMS-986189, CA-170, FAZ053, IBI318, INBRX-105, KD033, LY3415244, CA-327, PMID30107136-Compound-Example 1/2, PMID30247903-Compound-General Structure 5/6/7/8/9/10/12, Durvalumab, MEDI4736, MPDL-3280A, NM21-1480, Anti-PD-L1 CSR T cells, C-Met/PD-L1 CAR-T cells 등이 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 일 양태는 (a) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, (b) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포의 분비액, 또는 (c) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포의 노화세포 제거를 위한 의약품, 건강기능식품, 화장품 또는 동물용제품 용도를 제공한다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 (a) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, (b) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포의 분비액; 또는 (c) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포의 치료적으로, 건강개선측면에서, 또는 화장학적으로 유효한 양을 노화세포와 관련된 질환 및 장애의 치료, 개선, 또는 화장학적 효과가 필요한 개체에게 투여 또는 적용하는 것을 특징으로 하는 노화세포와 관련된 질환 및 장애의 개선, 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 그 목적에 따라 약학 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물 또는 동물용제품 조성물이 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 상기 (a), (b), 및/또는 (c) 유효성분의 노화세포와 관련된 질환 및 장애의 개선, 치료 또는 예방에 유용한 의약품, 건강기능식품, 화장품 또는 동물용제품의 제조를 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 있어, 노화는 시간의 경과에 의한 자연적인 노화; 항암제, 방사선치료 등의 스트레스로 인한 노화; 고지방, 고당분, 고염분 등의 식이섭식 또는 영양 결핍으로 인한 노화; 바이러스, 박테리아 등의 감염으로 인한 노화; 비만, 당뇨, 암, 섬유화증 등의 질환에 의해 발생하는 생리적 교란으로 야기되는 노화 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어 노화는 노화세포의 생성 및 축적을 촉진하거나 노화세포의 작용을 활발하게 하는 체내 현상을 의미한다.

상기 노화세포는 체세포, 줄기세포, 질병으로 비정상적으로 변한 세포 등 다양한 세포에서 유래할 수 있다. 상기 노화세포는 또한, 간, 신장, 비장, 뇌, 폐, 근육, 피부, 지방 등으로부터 유래하는 장기 조직의 세포일 수 있다. 상기 질병은 염증, 섬유화증, 암 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 노화세포는 하기의 여러 특징들 중 임의의 하나 이상의 특징을 나타낼 수 있다. (i) 세포의 분열 및 성장이 거의 영구적으로 정지되어 있다. (ii) 노화되지 않은 정상세포에 비해서 전체적으로 세포 등의 크기가 증가되어 있다. 특히, 리소좀의 내용물이 증가되어 있고, 비정상적인 미토콘드리아가 증가되어 있다. (iii) Lamin B1 등 핵의 구조 단백질 및 HMGB1 등 크로마틴의 결합 단백질이 감소되어 있다. (iv) 노화에 따른 β-갈락토시데이즈(SA-β-gal)를 발현한다. (v) 리포푸신(Lipofuscin)을 생성한다. (vi) p16 및 p21 등 CDK(cyclin-dependent kinase) 억제 인자를 활성화 및 많이 발현한다. (vii) 지속적인 스트레스 반응으로서 DDR(DNA damage response)에 따른 p53 등의 신호 전달 체계가 활성화되어 있고, 이에 따라 관련 타깃 유전자들의 발현이 조절되어 있다. 이와 같이, 노화세포가 공히 나타내는 특징으로서 세포의 분열 및 성장이 멈추며, 더불어 노화관련 표지인자(senescence-associated marker)로 SA-β-gal, 리포푸신, p16, p21, p53 등을 나타낸다고 할 수 있다(https://doi.org/10.1016/j.tcb.2018.02.001 참조).

본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 노화세포의 사멸을 촉진하거나, 또는 노화관련 표지인자, 노화촉진 인자, 또는 노화관련 분비인자의 발현 및 분비를 억제한다. 본 발명의 일 양태에서, 이러한 인자들은 노화세포에서 발현 및 분비되므로, 노화세포가 제거됨에 따라서 근원적으로 이러한 인자들의 발현 및 분비가 차단될 수 있다. 또한, 노화세포가 제거됨으로써 개체가 다양한 스트레스로부터 회복 탄력성(resilience) 및 저항성을 유지하게 한다.

상기 노화관련 분비인자(SASP)는 다양한 노화관련 병적인 인자 등을 포함하며, 예를 들어, IL1α, IL1β, IL6, IL10, MCP1, PAI1 VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, MMP13, TGFβ, ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1, CXCL1, CXCL10, GM-CSF, GROα, GROβ, GROγ, IGFBP7, IL7, IL8, MIP1α, ENA78, GCP2, GITR, HGF, ICAM1, IGFBP2, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6, IL13, MCP4, MIF, MIP3α, MMP14, NAP2, PIGF, RANTES, sgp130, TIMP2, TRAILR3, Acrp30, Axl, bFGF, BLC, BTC, CTACK, EGFR, Fas, FGF7, GCSF, GDNF, HCC4, I309, IFNγ, IGFBP1, IGFBP3, IL11, IL15, IL2Rα, IL6R, ITAC, Leptin, LIF, MSPα, PAI2, PDGF-BB, SCF, SDF1, sTNF-RI, sTNF-RII, TIMP-1, tPA, uPA, uPAR, VEGF, MCP3, IGF1, TGFβ3, MIP1, IL4, FGF7, PDGF-BB, IL16, BMP4, MDC, MCP4, IL10, TIMP1, ICAM1, Axl, CNTF, INFγ, EGF, BMP6 등일 수 있다(http://www.saspatlas.com 참조).

본 발명의 일 양태는 또한 본 개시에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸되는 세포에서 분비되는 분비액 또는 물질이 노화세포의 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 유도 및/또는 촉진하거나, 또는 노화관련 표지인자, 노화촉진 인자 또는 노화관련 분비인자(SASP)의 발현 및 분비를 직접적으로 또는 간접적으로 차단 및/또는 억제해서 노화세포와 관련된 다양한 질환의 개선, 치료 또는 예방에 유용하다는 발견에 기초한다.

본 발명에 있어, "분비액"이란 본 개시에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸되는 세포로부터 분비 및 방출되는 성분을 포함한다. 본 발명의 분비액은, 세포를 배양한 배양액(예를 들어, 배지)에서 본 개시의 화합물을 제거한 배양여액, 이의 분리정제액, 농축액 또는 건조물일 수 있다. 본 발명에 있어, “배양여액”은 세포를 배지에 접종하고 본 개시의 화합물을 처리하여 배양한 후, 해당 세포 및 화합물 등을 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 배양여액은 세포와 화합물 등을 제거한 배양액을 (초)원심분리하고, 얻어진 상등액을 (한외)여과, 크로마토그래피 등을 사용한 분리정제를 통하여 얻을 수 있다. 인체 등 체내에 투입할 시에는 분비액을 포함하는 배양여액 또는 분비액을 생산하는 사멸되는 세포를 투여할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어, 상기 분비액은 배양여액에 포함되거나, 사멸되는 세포로부터 생산 및 분비된다.

즉, 본 발명은 (a) 노화세포를 죽이는 화합물 또는 이의 염, (b) 죽어가는 노화세포로부터의 분비액, 및/또는 (c) 죽어가는 노화세포 자체를 이용하여 (다른) 노화세포를 억제 또는 제거할 수 있다는 점에 기초한다. 체내에서 분비액(물질)과 죽어가는 노화세포가 면역세포들을 activation 및/또는 recruitment하는 면역반응의 활성화를 통해서도 노화세포를 사멸을 유도할 수도 있으나, 본 발명은 이러한 이론적 기전에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어, "약학적으로 허용 가능한 염"은 약학적으로 허용 가능한 유리 산(free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 상기 유리 산으로는 무기 산 또는 유기 산을 사용할 수 있으며, 이때 무기 산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등일 수 있고, 유기 산은 아세트산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마르산, 말레산, 말론산, 프탈산, 석신산, 락트산, 시트르산, 글루콘산, 타르타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파트산, 글루탐산 등일 수 있다. 상기 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 본 개시의 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조될 수 있다. 또한, 본 개시의 화합물이 산성일 경우 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 다양한 양이온과 염기부가염을 형성할 수 있다. 그러한 염기의 예로는 알칼리 금속 또는 알칼린 토금속 염일 수 있으며, 예를 들어, 특히, 칼슘, 마그네슘, 소디움, 리튬, 아연, 포타슘 및 철 염일 수 있다. 상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은 본 개시의 화합물을 과량의 알칼리금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 미용해된 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발 및 건조시켜 얻을 수 있다. 이밖에 염기부가염은 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디사이클로헥실아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 프로카인(procaine), 메글루민(meglumine), 에틸렌디아민, 콜린, N,N-디벤질에틸렌디아민, 벤자틴, 베네타민, 피리딘, 피콜린, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 벤질트리메틸암모늄, 벤질트리에틸암모늄, 벤질트리부틸암모늄, 메틸트리옥틸암모늄, 테트라부틸암모늄, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 등의 유기 염일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어인 "본 발명의 화합물"은 상기 표 1의 각각의 화합물들뿐만 아니라, 이들의 프로드럭, 클라드레이트(clathrates), 수화물, 용매화물, 또는 다형체를 포함하는 의미이다. 또한 용어 “본 발명의 화합물”은 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 언급되지 않을 경우 본 발명 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함하는 의미이다. 일 실시예에 본 발명의 화합물은 입체이성질체적으로 순수한 화합물들(예를 들어, 다른 입체이성질체가 실질적으로 없는(예를 들어, 85% ee 이상, 90% ee 이상, 95% ee 이상, 97% ee 이상, 또는 99% ee 이상))로 존재할 수 있다. 즉, 본 개시의 화합물 또는 그의 염이 호변이성적(tautomeric) 이성질체 및/또는 입체이성질체(예를 들어, 기하이성질체(geometrical isomer) 및 배좌 이성질체(conformational isomers))일 경우 그들의 분리된 이성질체 및 혼합물 각각 또한 본 발명의 화합물의 범주에 포함된다. 본 발명의 화합물 또는 그의 염이 구조 내에 비대칭 탄소(asymmetric carbon)를 가지고 있는 경우에, 그들의 광학 활성 화합물 및 라세믹 혼합물들 또한 본 발명의 화합물의 범위에 포함된다.

만약 어떠한 화합물(프로드러그(prodrug))이 체내에서 분리되어 본 개시의 화합물 또는 이의 염을 생성하게 된다면, 그러한 화합물 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에서 사용되고 다르게 지적되지 않는다면, 용어 "프로드러그(prodrug)"는 활성 화합물, 특히, 본 발명의 화합물을 공급하기 위해 가수분해되고, 산화되고, 생물학 조건(생체 외 또는 생체 내)하에 다른 반응을 할 수 있는 본 발명의 화합물을 의미한다. 프로드러그의 예들은, 생가수분해될수 있는(biohydrolyzable) 아미드, 생가수분해될수 있는 에스테르, 생가수분해될수 있는 카르바메이트(carbamates), 생가수분해될수 있는 탄산염, 생가수분해될수 있는 우레이드(ureides), 그리고 생가수분해될수 있는 인산염 유사체들 같은 생가수분해될수 있는 부분을 포함하는, 생가수분해되어 본 발명의 화합물을 생성하는 화합물들을 포함하나, 이러한 구체적 태양에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 카르복시기 작용기를 가지고 있는 화합물의 프로드러드는 카르복실릭 산의 저급 알킬 에스테르이다. 카르복실릭 에스테르는 분자에 존재하는 카르복실릭 산 일부분을 에스테르화 함으로서 통상적으로 형성된다. 프로드러그는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용될 경우, 용어 "결정다형(polymorph)"은 본 발명의 화합물의 고체 결정 형태 또는 그것의 복합체를 의미한다. 같은 화합물의 다른 결정다형은 다른 물리적, 화학적 그리고/또는 스펙트럼적 특성을 보인다. 물리적 특성 측면의 차이점으로는 안정성(예를 들어, 열 또는 빛 안정성), 압축성과 밀도(제제화 및 생산물 제조에 중요함), 그리고 용해율(생물학적 이용률에 영향을 줄 수 있음)을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 안정성에서 차이는 화학반응성 변화들(예를 들어, 또 다른 다형으로 구성되었을 때보다 하나의 다형으로 구성되었을 때 더 빠르게 변색이 되는 것 같은 차별적 산화) 또는 기계적인 특징들(예를 들어 동역학적으로 선호된 다형체로서 저장된 정제 파편들이 열역학 적으로 더 안정된 다형으로 변환) 또는 둘 다(하나의 다형의 정제는 높은 습도에서 더 분해에 예민)를 야기한다. 결정다형의 다른 물리적 성질들은 그들의 가공에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 한 결정다형은 또 다른 결정다형에 비하여, 예를 들어, 그것의 형태 또는 입자의 크기 분포에 기인하여 용매화합물을 형성할 가능성이 많을 수 있거나, 여과 또는 세척이 더 어려울 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "용매 화합물"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 용매를 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다. 바람직한 용매들은 휘발성이고, 비독성이며, 인간에게 극소량 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "수화물(hydrate)"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 물을 포함하는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "클라드레이트(clathrate)"은 게스트 분자(예를 들어, 용매 또는 물)를 가두어 놓은 공간(예를 들어, 채널(channel))을 포함한 결정 격자의 형태의 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.

본 발명에 따른 (a) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, (b) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포의 분비액; 또는 (c) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포는 노화세포를 사멸시키거나 노화세포의 작용을 차단하는 효과가 있으며, 이를 통해 노화세포와 관련된 다양한 질환 및 장애의 개선, 치료 또는 예방에 유용하다.

노화세포 제거 또는 노화세포의 작용을 억제하여 개선, 치료 및 예방될 수 있는 질환 및 장애는 암(cancer), 초기암(pre-cancerous/pre-malignant condition), 암재발(relapse), 암전이(metastasis), 암저항성(resistance), 암악성화, 각종 증식이상질병 등의 증식 질환 및 장애; 관절염(arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 퇴행성관절연골(degenerative articular cartilage), 염증성장질병(inflammatory bowel disease), 궤양성대장염(ulcerative colitis), 크론병(crohn's disease), 점막염(mucositis), 구강점막염(oral mucositis), 만성췌장염(chronic pancreatitis), 건병증(tendinopathy), 건증(tendinosis), 건염(tendinitis), 노화염증(inflamm-aging), 과다증폭성염증(amplified hyperinflammation), 코로나바이러스감염증/합병증(COVID19 infection/complication) 등의 염증 또는 자가면역 질환 및 장애; 기억감퇴, (경도)인지장애(cognitive decline dysfunction), 퇴행성뇌질병, 치매(dementia), 알츠하이머병(alzheimer's disease), 파킨스병(parkinson’s disease), 헌팅턴병(huntington's disease), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 근위축성측색경화증, 원발측삭경화증, 운동신경질병장애, 진행성핵상(성)마비(progressive supranuclear palsy), 진행성구마비, 가성구마비, 진행성근육위축증, 하위운동신경증, 척수성위축증, 척수손상(spinal cord injury), 만성통증(chronic pain), 폴리오후증후군, 강직성하반신마비, 불안(anxiety), 우울증(depression), 신경정신병적장애(neuropsychiatric dysfunction), (외상후)스트레스장애(post-traumatic stress disorder), 수면장애 등의 신경 질환 및 장애; 비만(obesity), 당뇨(diabetes), 당뇨성궤양(diabetic ulcer), 골다공증(osteoporosis), 장내마이크로바이옴장애(intestinal bowel disease, intestinal bowel microbiome disorder), 지방이영양증, 각종 대사증후군 등의 대사 질환 및 장애; 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 심부전증(heart failure), 울혈성심부전증(congestive heart failure), 심근경색(myocardial infarction), 심근증(cardiomyopathy), 심근비대증(cardiomyocyte hypertrophy), 심장기능장애(cardiac dysfunction), 심장저항성감소(loss of cardiac stress tolerance), 심장부하저항, 심방세동이상, 협심증, 관상동맥류(coronary artery aneurysm), 대동맥류(aortic aneurysm), 부정맥, 경동맥협착증(carotid artery stenosis), 경막동정맥루(AV fistulae), 관상동맥질병, 말초혈관질병, 신장혈관협착증(renal artery stenosis), 죽상경화증, 신생내막증식증(neointimal hyperplasia), 고혈압(hypertension), 혈관기능장애(age-related vascular dysfunction), 혈관석회화(vascular hyporeactivity/calcification), 혈액응고장애, 뇌동맥류(brain aneurysm), 뇌졸증(stroke), 혈전증(thrombosis), 심내막염, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 승모판탈출증 등의 심혈관 질환 및 장애; 만성폐쇄성폐질병(chronic obstructive pulmonary disease), 만성폐염증, 폐부전증, 폐기능저하, 폐기종(emphysema), 기관지확장증(bronchiectasis), 과산소성폐손상(hyperoxic lung injury), 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia), 호흡곤란증후군(respiratory distress syndrome), 폐고혈압(pulmonary hypertension), 천식(asthma), 바이러스성폐렴(viral pneumonia) 등의 폐 질환 및 장애; 신장병증(nephropathy), 면역글로블린A신병증(immunoglobulin A nephropathy), 신장부전증(renal failure/dysfunction), 사구체경화증(glomerulosclerosis), 만성신장질병(chronic kidney disease), 당뇨성(만성)신장질병(diabetic chronic kidney disease), 신장결석(kidney stone disease) 등의 신장 질환 및 장애; 간병증(cirrhosis), 지방간(fatty liver), 간염, 간지방증(hepatic steatosis), 비알콜성지방간(nonalcoholic fatty liver disease), 비알콜성지방간염(nonalcoholic steatohepatitis), 간장병(hepatopathy), 간경변증, 원발경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 원발성담즙성경변증(primary biliary cirrhosis), 간성뇌증(hepatic encephalopathy) 등의 간 질환 및 장애; 백내장(cataract), 녹내장(glaucoma), 황반변성(macular degeneration), 황반부종, 망막퇴행성질병(retinal degenerative disease), 당뇨성망막질병(diabetic retinopathy), 당뇨성황반부종(diabetic macular edema), 노안, 안구건조증(dry eye disease), 시력손실(age-related vision loss), 충혈(hyperemia) 등의 안구 질환 및 장애; 피부노화(skin aging), 주름(wrinkle), 탄력저하, 표피위축(epidermal atrophy), 탈모(hair loss, allopecia), 모피악화, 기미(melasma), 잡티, 모반(skin naevi), 반점(liver spot), 반색, 색소침착(pigmentation), 사마귀, 두드러기, 모공악화, 상처치유저하, 건선(psoriasis), 포진, 소양증, 감각장애, 습진, 발진, 피부염, 호산구피부병, 면역수포성피부병, 포창, 천포창, 유천포창, 낭창(lupus), 수포, 켈로이드, 피부섬유조직구증식, 아토피성피부염, 피부림프종, 피부루푸스, 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 홍색피부증, 편평태선, 태선모양피부병, 반응성호중구피부병, 딸기코, 백반증, 보통비늘증, 잇몸노화(senescence in gingival tissues), 피부근염, 광선각화증, 광감각 및 광노화 관련 질병 등의 피부 질환 및 장애; 줄기세포/골수/장기/조직의 재생유지 질환 및 장애, 골수저형성증, 골수증, 염증 등 면역조절 질환 및 장애, 근감소증(sarcopenia) 등 각종 장기/조직의 파손 및 기능저하 등의 재생유지 관련 질환 및 장애; 이식편대숙주질병 등 줄기세포/골수/장기/조직/세포의 이식(transplantation) 질환 및 장애, 이식거부반응 등 외래물질/소재의 이식 질환 및 장애, 염증 등 면역조절 질환 및 장애, 각종 장기/조직의 파손 및 기능저하 등의 외래이식 관련 질환 및 장애; 특발성폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis), 낭포성섬유화증(cystic fibrosis), 폐섬유화증(pulmonary fibrosis), 신장섬유화증(renal fibrosis), 신장세뇨관섬유화증(tubulointerstitial fibrosis), 간섬유화증(liver fibrosis), 심장섬유화증(cardiac fibrosis), 췌장섬유화증(pancreatic fibrosis), 자궁섬유화증(uterine fibrosis), 구강점막하섬유증, 근섬유화증(muscle fibrosis), 신경교섬유화증, 복막후섬유화증, 골수섬유화증, 종격동섬유화증, 켈로이드, 진행성골화섬유형성이상(fibrodysplasia ossificans progressiva) 등의 섬유화증 질환 및 장애; 피부경화증, 전신경화증(systemic sclerosis), 다발성경화증(multiple sclerosis) 등의 경화증 질환 및 장애; 조로증(progerias), 위드만-라우텐스트라우취증후군, 워너증후군(werner syndrome), 허친슨-길포드조로증증후군(hutchinson-gilford progeria syndrome), 로트문드-톰슨증후군, 코케인증후군, 다운증후군(down-syndrome), 각화부전증, 선천성근무력증, 재생불량성빈혈, 관절연골변성 등의 β-갈락토시데이즈 관련 질환 및 장애; 건강수명단축(reduced lifespan/healthspan), 노쇠(frailty), 노화염증(inflammaging), 근감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular dystrophy), 근섬유화증(muscle fibrosis), 골다공증(osteoporosis), 근육피로장애, 운동실조(ataxia), 골관계장애, 만성염증, 상처치유장애(delayed wound healing), 골절치유장애(delayed fracture healing), 지방이상증(lipodystrophy), 지방위축증(adipose atrophy), 추간판변성증(intervertebral disc degeneration), 추간판탈출증, 척추후만증(kyphosis), 진행성골화섬유형성이상(fibrodysplasia ossificans progressiva), 폐경(menopause), 수전증(tremor), 요실금(urinary incontinence), 배뇨장애, 비장비대증, 전립선비대증(prostatic hypertrophy), 난청/청력상실(hearing loss), 후각/미각기능장애(olfactory dysfunction), 치주질환(periodontal disease) 등의 기타 노인성 질환 및 장애; 방사선/화학/표적/면역요법 등 항암제, 독성 및 부작용이 강한 약물/물질, 비만/당뇨 등 생리적인 교란, 고지방/고당분/고염분 등 식이섭식, 출혈성쇼크, 심근색, 저산소증, 영양결핍, 전쟁, 사고, 흡연, 바이러스/박테리아 등의 감염, 외래이식, 염증, 조직상처, 고열증 등 다양한 급성 및 만성적인 스트레스 요인으로 인한 독성 등을 비롯한 부작용 및 후유증 그리고 이로 인한 질환 및 장애로서, 피로, 쇠약(fatigue), 권태감, 체중감소(weight loss), 신체활동저하, 불안(anxiety), 우울증(depression), 무기력증, 운동실조(ataxia), 악액질(cachexia), 만성염증, 점막염(mucositis), 혈소판감소증(thrombocytopenia), 방사선궤양(radiation ulcers), 골수기능장애, 심장장애(heart functional disorder), 면역장애(immune disorder), 호르몬체계장애, 간/신장합병증(hepato/nephrocomplication), 스트레스신경장애, 간/신장/심장/위장/난소/혈관계/피부독성, 방사선궤양(radiation ulcers), 구역질, 구토, 설사, 말초신경병증(peripheral neuropathy), 실신, 빈혈, 탈모(hair loss, allopecia), 통증, 체액저류, 발진, 피부염, 과색소침착(hyperpigmentation), 거식증, 두드러기, 지방이영양증, 지방위축증(adipose atrophy), 공황장애, 심장근육병증, 울혈성심부전(congestive heart failure), 폐경(menopause), 골다공증(osteoporosis), 불임(infertility), 자간전증(preeclampsia), 임신중독증, 인지장애(cognitive decline dysfunction), 암재발(cancer relapse), 암전이(metastasis), 시력/청력손실(hearing loss), 폐용량감소 등 노화에 따른 상기 각종 노화관련 질환 및 장애 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 있어, 노화세포의 제거 또는 노화세포의 작용을 억제하여 개선, 치료 및 예방될 수 있는 질환 및 장애는 암(선노화 항암 치료법(prosenescence anti-cancer therapy)을 통해 노화된 암세포를 제거함으로써 억제 및 치료되는 것이고, 이를 통해서 암뿐만 아니라 초기암, 암의 예방, 재발, 전이, 저항성, 악성화 또는 후유증 등을 포함), 염증(노화세포에 의해 야기되는 노화염증(inflamm-aging, immuno-senescence, senescence-associated inflammation)이고, 이로 인해 노인층에서 관찰되는 지속적으로 점진적인 만성 및 퇴행성 염증 또는 바이러스 등의 감염 등으로 인해 노인층에서 관찰되는 사이토카인 폭풍을 동반하는 과다증폭성 염증 등을 포함), 섬유화증 및 경화증(간, 폐 또는 신장 등에서의 섬유화증 및 경화증을 포함), 노인성 질환(예를 들어, 활동성, 지구력, 근력, 및/또는 악력의 저하를 포함한 노쇠, 근감소증, 골다공증 또는 지방위축증), 신장 손상, 간 손상, 피부 노화와 관련된 질환 및 장애(예를 들어, 주름, 탄력저하, 탈모, 모피악화, 기미, 잡티, 모반, 반점, 반색, 색소침착, 사마귀, 두드러기, 모공악화, 상처치유저하 등을 포함), 항암제 또는 비만에 의한 스트레스로 인한 부작용 및 후유증(피로, 쇠약, 체중 감소, 불안, 우울증, 무기력증, 지방간 등을 포함) 등이다.

상기 노쇠와 관련해서, 노쇠는 예컨대, 최근 R54 코드가 부여된 구체적인 질병으로서, 노화에 따라 인지 및 기억 장애를 동반하거나 또는 동반하지 않은 상태에서 발생하는 노년피로, 쇠약, 무력증, 비활동성, 근력약화, 보행장애 등의 증상이 나타난다. 증상 지표(https://en.wikipedia.org/wiki/Frailty_syndrome)에 의해서 노쇠를 분석할 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어 "치료"는 본 발명 유효성분의 투여로 노화 관련 질환 및 장애의 증상이 개선, 호전 및 이롭게 변경되는 모든 행위(alleviate, reverse or treat)를 의미하며, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 노화 관련 질환 및 장애를 차단, 억제 및 진행을 지연시키는 모든 행위(prevent, inhibit or delay)를 의미한다.

본 발명의 (a) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, (b) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하여 사멸하는 세포의 분비액, 또는 (c) 상기 표 1의 화합물 또는 이의 염을 처리해서 사멸하는 세포는 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 환자에 투여될 수 있다.

여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 또한, 상기 "유효한 양"은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 어떤 쪽이든 노화관련 질환에서 노화세포의 활성을 억제 또는 줄이기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 설명된 질병 또는 상태(condition)의 치료를 위하여, 본 명세서에서 설명된 상기 유효성분은 다음과 같이 투여될 수 있다.

구강 투여(Oral administration)

본 발명의 유효성분은 구강으로 투여될 수 있으며, 구강은 연하(swallowing)를 포함하는 개념이다. 구강 투여에 의하여 본 발명의 유효성분이 위장관(gastrointestinal tract)에 들어가거나, 예를 들어, 구강(buccal) 또는 설하(sublingual) 투여와 같이, 입으로부터 혈류로 직접적으로 흡수될 수 있다.

구강 투여를 위한 적합한 조성물은 고형상, 액상, 겔(gel), 또는 파우더 형상일 수 있으며, 정제(tablet), 로젠지(lozenge), 캡슐(capsule), 과립제, 산제 등의 제형을 가질 수 있다.

액체 제형은 용액, 시럽 및 현탁액을 포함할 수 있으며, 이러한 액상 조성물은 연질 또는 경질 캡슐 내에 함유된 형태일 수 있다. 이러한 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 또는 오일(oil)을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다.

정제(tablet) 제형에서, 활성 성분인 유효성분의 양은 정제 총 중량 대비 약 0.05 중량% 내지 약 95 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 50 중량%로 존재할 수 있다. 또한, 정제는 약 0.5 중량% 내지 약 35 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 25 중량%를 포함하는 붕해제를 함유할 수 있다. 붕해제의 예로는 유당, 전분, 소디움스타치글리콜레이트, 크로스포비돈, 크로스카멜로스소디움(croscarmellose sodium), 말토덱스트린 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

정제로 제조하기 위해 포함되는 적합한 활택제는 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 양으로 존재할 수 있고, 탈크(talc), 이산화규소, 스테아린산, 칼슘, 아연 또는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트 등이 활택제로 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.

정제로 제조하기 위한 결합제(binder)로는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 당(sugar), 검(gum), 녹말(starch), 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등이 사용될 수 있으며, 정제로 제조하기 위한 적합한 희석제로는 만니톨, 자일리톨, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 녹말(starch), 미결정셀룰로오스 등이 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다.

선택적으로 정제에 포함될 수 있는 가용화제는 정제 총 중량 대비 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 양이 사용될 수 있고, 예를 들어, 폴리소르베이트, 소디움 라우릴설페이트, 소디움 도데실설페이트, 프로필렌 카보네이트, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, 폴리옥시에틸렌글리콜화된 천연 또는 수소화 피마자유, HCOR^TM(Nikkol), 올레일에스테르, 젤루시어(Gelucire^TM), 카프릴릭/카프릴산 모노/디글리세리드, 소르비탄지방산에스테르, 솔루톨HS^TM 등이 본 발명에 따른 약학 조성물에 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 가용화제의 구체적 종류에 한정되는 것은 아니다.

비경구 투여(Parenteral Administration)

본 발명의 유효성분은 혈류, 근육, 또는 내장 내로 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 방법은 정맥내(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피하 동맥내(subcutaneous intraarterial), 복강내(intraperitoneal), 척추강내(intrathecal), 두개내(intracranial) 주사 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 적합한 장치는 (바늘 및 바늘 없는 주사기를 포함하는) 주사기(injector) 및 주입 방법(infusion method)을 포함한다.

대부분의 비경구 제형은 액상 조성물이며, 이러한 액상 조성물은 본 발명에 따른 약효 성분, 염, 완충제, 등장화제 등을 포함하는 수용액이다.

비경구 제형은 또한 건조된 형태(예를 들어, 동결 건조) 또는 멸균 비-수용액으로서 제조될 수 있다. 이들 제형은 멸균수(sterile water)와 같은 적합한 비히클(vehicle)과 함께 사용될 수 있다. 용해도 증강제(solubility-enhancing agents) 또한 비경구 용액의 제조에 사용될 수 있다.

국소 투여(Topical Administration)

본 발명의 유효성분은 피부 또는 경피로 국소적으로 투여될 수 있다. 특히, 본 개시의 조성물이 화장료 조성물일 경우 제형은 국소 투여 제형이 바람직하다. 국소 투여를 위한 제형은 로션, 용액, 크림, 젤, 하이드로젤, 연고, 폼(foam), 임플란트(implant), 패치 등을 포함한다. 국소 투여 제형을 위한 약학적으로 또는 화장학적으로 허용 가능한 담체는 물, 알코올, 미네랄 오일, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물일 경우 앞서 언급한 액체 제형일 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분은 노화세포를 제거시킴으로써 이러한 노화세포로부터 분비되는 다양한 노화관련 병적인 인자들의 발현 및 분비를 근원적으로 차단 및 억제시킬 수 있다. 이와 더불어, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물을 처리하여 사멸이 유도된 세포로부터의 분비액도 노화세포의 생존율을 현저하게 감소시켜서, 이러한 노화세포로부터 분비되는 다양한 노화관련 병적인 인자들의 발현 및 분비를 근원적으로 차단 및 억제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 노화관련 질환 및 장애의 개선, 치료 또는 예방에 유용하게 활용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 노화세포 제거용 조성물은 노화세포와 관련된 노화관련 질환 및 장애와 관련해서 화장품, 건강기능식품, 동물용제품 등에도 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명 화합물을 이용한 노화세포 제거 작용을 나타낸다.
도 2는 자연적으로 노화를 유도한 마우스에 노화세포 제거 대표 화합물을 처리하지 않은 및 처리한 조건에서 지방 조직의 염색 사진이다.
도 3은 독소루비신(DOX) 처리에 의해 노화를 유도한 마우스에 노화세포 제거 대표 화합물을 처리하지 않은 및 처리한 조건에서 지방 조직의 염색 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기 실시예 1 내지 9에서는 노화세포를 제거하는 예시적 화합물로 LX-112(ethaselen, 1,2-[비스(1,2-벤지소셀레나졸론-3(2H)-케톤)]에탄)을 이용하여 여러 평가를 수행하였으며, 이를 통해 노화세포 제거에 따른 노화세포 관련 질환 또는 장애의 개선, 치료 또는 예방 효과를 평가하였다.

실시예 1. 노화된 인간세포에서 노화세포 제거

실시예 1-1. 세포의 노화 유도

나이가 들어감에 따라 내부 및 외부 요인에 의해 인체에 축적되는 노화세포가 분비하는 병적인 인자(SASP)들로 인해서, 노화관련 질환 및 장애가 발생된다. 이 과정에서 근원적인 역할을 하는 노화세포를 셀레늄 화합물이 제거하는지 확인하기 위해, 노화세포를 노화관련 표지인자인 SA-β-gal로 염색하였다. 이와 같은 셀레늄 화합물의 작용을 도 1에 나타내었다.

구체적으로, 인간으로부터 유래된 포피세포(foreskin, 입수처-충남의대)를 지정된 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 구입처-ATCC; 10% FBS, 구입처-GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, 구입처-Invitrogen)에서 배양한 다음, 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹인 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 250 nM 농도로 24시간 동안 처리하고, 7일 동안 추가 배양하여, 노화를 유도하였다. 노화를 유도하지 않은 대조군(-)은 DMSO만을 처리하였다. 노화된 세포의 비율을 측정하기 위하여, 독소루비신 및 대조군을 처리한 세포를 24 well plate에 접종하고 24시간 동안 안정화시킨 다음, 노화관련 표지인자인 SA-β-gal을 키트(구입처-Cell Signaling Technology)를 사용해서 염색하고, 광학 현미경을 통해 SA-β-gal이 염색된 노화세포의 비율을 측정하여 표 63에 나타내었다.

그 결과, 표 63에 나타난 바와 같이, 대조군(-)에 비해 독소루비신(DOX)을 처리한 세포에서의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율이 크게 증가하였으며, 더 이상 세포 성장을 하지 않았다. 이로부터, 노화가 유도된 것을 확인하였다.

실시예 1-2. LX-112의 노화된 세포 제거

실시예 1-1과 동일한 방법으로 독소루비신 및 대조군을 처리하고 배양한 세포에 LX-112(구입처-BOC)를 0 μM, 1.1 μM, 3.3 μM, 10 μM의 농도로 각각 처리하고 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(구입처-Promega)를 이용해서 세포 생존률 및 성장률을 측정하여 표 2 및 표 3에 나타내었다. 이때, 표 3의 N0는 LX-112 처리 전 세포수를 100%로 산정한 것이다.

LX	0 μM	1.1 μM	3.3 μM	10 μM
Survival (%)	100.2 (±4.0)	67.2 (±7.0)	27.0 (±4.0)	1.0 (±4.0)

LX	N0	0 μM	1.1 μM	3.3 μM	10 μM
Growth (%)	100.0 (±11.0)	253.0 (±4.0)	201.0 (±8.0)	161 (±7.0)	123.3 (±8.0)

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 처리해서 노화가 유도된 세포에서 LX-112의 농도가 높을수록 세포 생존률이 급격히 감소하였다. 또한, 표 3에 나타난 바와 같이, 대조군을 처리해서 노화가 유도되지 않은 세포에서 LX-112를 다양한 농도로 처리하여도 세포 생존률에 커다란 변화가 없었고, 정상적으로 세포가 성장하였다. 이와 같은 체세포뿐만 아니라, LX-112에 의한 노화세포의 사멸은 줄기세포(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, 구입처-ATCC)에서도 10 μM의 농도에서 50% 정도로 확인하였다. 이로부터, LX-112가 노화세포의 사멸을 유도해 노화세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. 노화된 인간 암세포 및 종양에서 LX-112의 노화세포 제거

실시예 2-1. 암세포의 노화 유도

인간으로부터 유래된 골육종(osteosarcoma) 암세포주인 SAOS-2(구입처-ATCC)를 지정된 배지(DMEM, 구입처-GenDEPOT; 10% FBS, 구입처-GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, 구입처-Invitrogen)에서 배양한 다음, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 노화를 유도한 다음, 세포의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율을 측정하여 표 4에 결과를 나타내었다.

그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 대조군(-)에 비해 독소루비신(DOX)을 처리한 세포에서의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율이 크게 증가하였으며, 더 이상 세포 성장을 하지 않았다. 이로부터, 노화가 유도된 것을 확인하였다.

실시예 2-2. LX-112의 노화된 암세포 제거

골육종을 포함하는 다양한 암 치료의 표준은 반복적인 화학 요법의 시행이다. 이에, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 SAOS-2에 노화를 유도한 다음, (i) 독소루비신을 다시 처리하거나(DOX→DOX) (ii) LX-112(5 μM) 조성물을 처리하였다(DOX→LX-112). 그 후, 3일(3d) 및 7일(7d) 이후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(구입처-Promega)를 이용해서 세포 생존률을 측정하여 표 5 및 표 6에 결과를 나타내었다.

그 결과, 표 5 및 표 6에 나타난 바와 같이, 세포내 항암 유전자인 Rb 및 p53이 결손된 SAOS-2에 독소루비신을 반복 처리한 경우(DOX→DOX)보다 독소루비신과 LX-112를 병용 및 순차 처리한 경우(DOX→LX-112)가 더욱 효과적으로 암세포의 생존률을 감소시켰다. 이로부터, 화학 요법으로 항암제를 반복 처리하는 경우보다 노화를 유도하는 항암제 및 노화세포 제거용 조성물인 LX-112를 병용 및 순차 처리하는 경우에서 보다 효과적인 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 2-3. 마우스에서 LX-112의 노화된 종양 억제

7주령의 수컷 BALB/c 누드 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. 실시예 2-1과 동일한 방법으로 배양한 인간 골육종암세포주인 SAOS-2 (10⁶개 세포)를 PBS(구입처-Welgene)에 섞은 다음, 2% 아이소플루레인(isoflurane, 구입처-Sigma)을 이용하여 마취된 마우스의 피하에 투여하였다. 종양의 크기가 50 mm² 정도 되었을 때, 독소루비신을 10 mg/kg의 농도로 증류수와 PBS(pH 7.2)의 1:1 용액에 섞어서 복강으로 투여하여 종양의 노화를 유도하였다. 10일 후에 100 mg/kg 농도로 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞은 LX-112를 21일 동안 매일 경구로 투여한 다음, 종양의 크기를 측정하였다. 대조군은 독소루비신을 섞은 용액을 반복해서 투여한 다음, 종양의 크기를 측정하였다. 표 7에 이를 비교해서 결과를 나타내었다.

Tumor Diameter (mm)	DOX→DOX	15.4 (±1.2)
	DOX→LX	6.2 (±4.8)

그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 마우스에서 노화를 유도한 종양에 LX-112를 처리(DOX→LX)한 경우가 독소루비신을 반복해서 처리(DOX→DOX)한 경우에 비해서 종양의 크기를 더욱 효과적으로 억제 및 감소시켰다. 이로부터, 마우스에서 화학 요법으로 항암제를 반복 처리하는 경우보다 형성된 종양에 노화를 유도하고 노화세포 제거용 조성물인 LX-112를 처리함으로써 보다 효과적인 항암 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

실시예 3. 노화된 인간세포에서 LX-112의 노화세포 제거

실시예 3-1. 세포의 자연적 노화 유도

인간으로부터 유래된 포피세포를 지정된 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, 구입처-ATCC; 10% FBS, 구입처-GenDEPOT; 100 U/ml Penicillin & Streptomycin, 구입처-Invitrogen)에서 더 이상 성장하지 않을 때까지 계대 배양(REP; replicative senescence)하여 자연적인 노화를 유도하였다. 대조군(-)으로 자연적 노화 유도 이전의 포피세포를 사용하였다. 이후, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포의 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율을 측정하여 표 8에 결과를 나타내었다.

그 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 연속적으로 더 이상 성장하지 않을 때까지 계대 배양(REP)한 세포에서 노화관련 표지인자(SA-β-gal)의 비율이 크게 증가하였다. 이로부터, 노화가 유도된 것을 확인하였다.

실시예 3-2. LX-112의 노화된 세포 제거

실시예 3-1과 동일한 방법으로 인간유래 포피세포의 자연적 노화를 유도한 다음, LX-112를 0 μM, 1.1 μM, 3.3 μM, 10 μM의 농도로 처리하고 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(구입처-Promega)를 이용해서 세포 생존률은 표 9에, 노화가 유도되지 않은 세포에 대한 세포 성장률을 측정해 표 10에 나타내었다. 이때, 표 10에서 N0는 LX-112 처리 전 세포수를 100%로 산정한 것이다.

LX	0 μM	1.1 μM	3.3 μM	10 μM
Survival (%)	100.5 (±4.0)	59.0 (±6.0)	29.0 (±5.0)	1.0 (±9.0)

LX	N0	0 μM	1.1 μM	3.3 μM	10 μM
Growth (%)	100.0 (±6.0)	262.0 (±13.0)	206.0 (±15.0)	151.0 (±12.0)	122.7 (±16.0)

그 결과, 표 9 및 표 10에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 세포에서 LX-112의 농도가 높을수록 세포 생존률이 급격히 감소하였고, 노화가 유도되지 않은 세포에서는 LX-112를 다양한 농도로 처리하여도 세포 생존률에 변화가 없었고, 정상적으로 세포가 성장하였다. 이로부터, LX-112가 노화세포의 사멸을 유도해 노화된 세포를 효과적으로 제거하는 것을 확인하였다.

실시예 4. LX-112의 노화세포에서 발현되는 노화관련 표지인자의 양 감소

실시예 3와 동일한 방법으로, 인간 포피세포의 자연적 노화를 유도하고 3 μM의 농도로 LX-112를 처리한 다음, qRT-PCR(quantitative real-time PCR)로 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 측정하였다. 대조군으로는 노화 유도 이전의 포피세포를 사용하였다. 구체적으로, 세포를 수거해서 TRIzol Reagent(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 처리하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 전체 RNA 농도는 Nanodrop(구입처-Micro Digital)을 이용하여 정량하였다. SuperScript IV VILO Master Mix with ezDNase Enzyme(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 추출된 전체 RNA에서 지노믹(genomic) DNA를 제거하고 cDNA를 제조하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하우스키핑 유전자인 GAPDH를 표준화 잣대로 사용해서 p16 및 p21 등에 관한 qRT-PCR을 SFCgreen I qPCR Master Mix(구입처-SFC Probe)를 사용해서 수행하였고, CFX Connect Real-Time PCR Detection System(구입처-Bio Rad)을 사용해서 분석하였다. 표 11은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 12는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 12는 노화가 유도된 후의 p16 및 p21의 mRNA 양을 각각 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16 및 p21의 mRNA 양과 비교하였다. 사용된 프라이머는 바이오닉스를 통해 합성하였고, 서열은 하기 표 13에 나타내었다.

mRNA (Fold)	p16	p21
-	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.3)
REP	5.0 (±0.5)	4.0 (±0.2)

mRNA (%)	p16	p21
-	100.0 (±4.0)	100.0 (±6.0)
LX	43.0 (±4.0)	39.0 (±7.0)

Gene	Primer 1	Seq. No.	Primer 2	Seq. No.
GAPDH	GGAAGGGCTCATGACCACAG	1	ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG	2
p16	TGAGCTTTGGTTCTGCCATT	3	AGCTGTCGACTTCATGACAAG	4
p21	GAGACTAAGGCAGAAGATGTAGAG	5	GCAGACCAGCATGACAGAT	6

그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 세포에서 노화가 유도되면 p16 및 p21의 mRNA 양이 급격히 증가하였다. 또한, 표 12에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 포피세포에 LX-112를 처리하면 p16 및 p21의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 세포 노화에 따라 증가하는 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 5. LX-112의 노화세포에서 발현 및 분비되는 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)들의 양 감소

실시예 3과 동일한 방법으로, 인간 포피세포의 자연적 노화를 유도하고 3 μM의 농도로 LX-112를 처리한 다음, 수득한 배양액을 이용해서 면역 검정법(ProcartaPlex Immunoassay, 구입처-Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL1α, IL1β, IL6, IL10, MCP1, PAI1 VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, TGFβ의 발현량을 측정하였다. 표 14는 노화를 유도하기 이전(-) 및 이후(REP)에, 표 15는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 각각의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 양을 나타낸 결과이다. 표 15는 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 각각 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.

Protein (Fold)	IL1α	IL1β	IL6	IL10	MCP1	PAI1
-	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.1)
REP	14.0 (±6.0)	11.0 (±3.0)	64.0 (±6.0)	16.0 (±4.0)	25.0 (±5.0)	69.0 (±9.0)
Protein (Fold)	VCAM1	MMP1	MMP2	MMP3	MMP12	TGFβ
-	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.1)
REP	32.0 (±4.0)	3.6 (±1.0)	18.0 (±8.0)	48.2 (±8.0)	13.0 (±4.0)	151.0 (±9.0)

Protein (%)	IL1α		IL1β		IL6		IL10		MCP1		PAI1
-	100.0 (±4.0)		100.0 (±3.0)		100.0 (±6.0)		100.0 (±4.0)		100.0 (±3.0)		100.0 (±7.0)
LX	57.0 (±5.0)		46.0 (±6.0)		41.0 (±4.0)		57.0 (±7.0)		38.0 (±8.0)		41.0 (±4.0)
Protein (%)	VCAM1		MMP1		MMP2		MMP3		MMP12		TGFβ
-	100.0 (±5.0)		100.0 (±2.0)		100.0 (±8.0)		100.0 (±4.0)		100.0 (±3.0)		100.0 (±4.0)
LX	45.0 (±5.0)		43.0 (±3.0)		39.0 (±9.0)		38.0 (±8.0)		41.0 (±6.0)		49.0 (±9.0)

그 결과, 표 14에 나타난 바와 같이, 세포에서 노화가 유도되면 IL1α, IL1β, IL6, IL10, MCP1, PAI1 VCAM1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP12, TGFβ의 발현량이 급격히 증가하였다. 또한, 표 15에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 포피세포에 LX-112를 처리하면 각각의 인자의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 세포 노화에 따라 증가하는 다양한 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 6. 노화관련 분비인자(SASP)에 의한 섬유화증 유도 및 마우스에서 LX-112의 섬유화증 억제

실시예 6-1. 노화세포에서 발현 및 분비되는 노화관련 분비인자(SASP)에 의한 정상세포의 섬유화증 유도

실시예 5와 동일한 방법으로 자연적인 노화가 유도된 인간 포피세포의 배양액(REP)을 수득하여, 노화가 유도되지 않고 정상적으로 성장하는 포피세포에 1일 동안 처리하였다. 그 다음, 실시예 4와 동일한 방법으로 qRT-PCR로 노화관련 섬유화증 인자인 ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1 및 SDF1의 mRNA 양을 측정하여 표 16에 나타내었다. 대조군(-)은 노화세포의 배양액을 처리하지 않은 포피세포를 사용하였다. 사용된 프라이머는 바이오닉스를 통해 합성하였고, 서열은 하기 표 17에 나타내었다.

mRNA (Fold)	ACTA2	COL1A1	COL1A2	FN1	SDF1
-	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.2)
REP	3.3 (±0.5)	4.5 (±0.6)	3.9 (±1.0)	4.1 (±0.4)	0.2 (±0.4)

Gene	Primer 1	Seq. No.	Primer 2	Seq. No.
ACTA2	GTGAAGAAGAGGACAGCACTG	7	CCCATTCCCACCATCACC	8
COL1A1	AAGGGACACAGAGGTTTCAGTGG	9	CAGCACCAGTAGCACCATCATTTC	10
COL1A2	CTTGCAGTAACCTTATGCCTAGCA	11	CCCATCTAACCTCTCTACCCAGTCT	12
FN1	TGTCAGTCAAAGCAAGCCCG	13	TTAGGACGCTCATAAGTGTCACCC	14
SDF1	TGCCAGAGCCAACGTCAAG	39	CAGCCGGGCTACAATCTGAA	40

그 결과, 표 16에 나타난 바와 같이, 노화관련 분비인자(SASP)에 의해 조절되는 인자에는 섬유화증 및 색소침착의 조절 인자인 ACTA2, COL1A1, COL1A2, FN1 및 SDF1 등이 포함되어 존재하는 것을 확인하였다. 이로부터, 노화에 의해 섬유화증을 유도하는 인자들의 양이 증가되는 것을 확인하였다. 노화에 의해 색소침착을 억제하는 SDF1의 양이 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 6-2. 마우스에서 LX-112의 섬유화증 억제

8주령의 수컷 C57BL6J 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. 복막의 섬유화증을 유도하기 위해서 0.1% 클로르헥시딘 글루코네이트 (chlorhexidine gluconate, CHG, 구입처-Sigma)를 15% 에탄올 인산완충용액에 녹여서 10 ml/kg 농도로 2일 간격으로 20일 동안 복강으로 투여하였다. 9일째부터 LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 매일 70 mg/kg 농도로 복강으로 투여하였다. 대조군(-)은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 20일째, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액에 고정시켜 제작한 복막 조직의 파라핀(paraffin) 절편을 H/E(Hematoxylin/Eosin) 및 트리크롬(trichrome)으로 염색하고, 광학 현미경으로 복막 중피세포층의 두께를 측정하였다. 표 18은 클로로헥시딘 글루코네이트(CHG)에 의해 복막 섬유화증이 유도된 마우스에 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 복막 중피세포층의 두께를 정량적으로 나타낸 결과이다.

Submesothelial Thickness (μm)	-	-	10.0 (±1.1)
	CHG	-	69.1 (±6.4)
		LX	43.1 (±10.4)

그 결과, 표 18에 나타난 바와 같이, 클로르헥시딘 글루코네이트에 의해 복막의 두께가 증가하였고, LX-112는 증가된 두께를 억제 및 감소시켰다. 이로부터, LX-112가 섬유화증을 효과적으로 억제 및 치료함을 확인하였다.

실시예 7. 자연적으로 유도된 노화 마우스에서 LX-112의 노화세포 제거 및 관련 노화 억제 활성

실시예 7-1. 자연적으로 유도된 노화 마우스 모델의 확립

22개월령의 암컷 C57BL6J 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 노화 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. 8주령의 마우스를 노화되지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다. LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 21일 동안 매일 70 mg/kg 농도로 구강으로 투여하였다. 대조군은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 약물 투여 종료 후, 하기 각각의 실시예에 기재된 방법을 수행하였다.

실시예 7-2. LX-112의 노화관련 표지인자(p16)의 양 감소

마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 RNA를 추출하여 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, RNA 추출 과정에서 RNA의 퀄리티를 유지하기 위하여 채취한 각 부위의 조직은 즉시 30 mg 내지 50 mg 크기로 절단하여 RNA 안정화 용액(구입처-Thermo Fisher Scientific)에 넣고 1일 동안 조직에 흡수시킨 후, 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 채취한 조직은 조직 균질용 비드(bead)가 포함된 튜브(구입처-엠피바이오)에 용해액과 함께 넣고, 조직 균질(homogenization) 장비(구입처-엠피바이오)를 이용하여 균질화하였다. 균질화된 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였으며, 추출 방법은 간, 신장, 폐, 뇌 등을 포함하는 연조직(soft tissue)는 RNA 추출 키트(PureLink RNA Mini Kit, 구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하였고, 근육, 피부, 지방 등을 포함하는 경조직(hard tissue)는 TRIzol Reagent(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 추출된 전체 RNA 농도는 Nanodrop(구입처-Micro Digital) 또는 SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader(구입처-Molecular Device)를 이용하여 정량하였다. 추출된 전체 RNA는 cDNA 합성 키트(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 지노믹(genomic) DNA를 제거하고 cDNA를 제조하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하우스키핑 유전자인 β-actin을 표준화 기준으로 하여 각 유전자 별로 qRT-PCR을 Taqman Fast Abvanced Master Mix(구입처-Applied Biosystems), SFCgreen I qPCR Master Mix (구입처-SFC Probe) 또는 AmfiSure qGreen qPCR Master Mix(구입처-GenDEPOT)를 사용해서 수행하였고, CFX Connect Real-Time PCR Detection System(구입처-Bio Rad)을 사용해서 분석하였다. 표 19는 노화를 유도하기 이전(Young) 및 이후(Old)에, 표 20은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 20은 노화가 유도된 후의 p16의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16의 mRNA 양과 비교하였다. 사용된 프라이머는 바이오닉스를 통해 합성하였고, 단, p16 및 IL6는 TaqMan 프라이머(구입처-Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 21에 나타내었다.

p16 mRNA (Fold)	Liver	Kidney	Lung	Brain	eWAT	Muscle	Skin
Young	1.0 (±0.7)	1.0 (±0.6)	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.4)	1.0 (±0.5)	1.0 (±0.0)
Old	53.9 (±10.8)	18.6 (±2.4)	3.3 (±1.0)	9.0 (±3.2)	3.5 (±1.1)	11.0 (±9.8)	7.3 (±2.5)

p16 mRNA (%)	Liver	Kidney	Lung	Brain	eWAT	Muscle	Skin
-	100.0 (±4.8)	100.0 (±3.8)	100.0 (±5.7)	100.0 (±3.8)	100.0 (±9.7)	100.0 (±8.4)	100.0 (±1.5)
LX	62.0 (±3.5)	52.0 (±7.9)	69.0 (±1.0)	89.0 (±5.0)	79.0 (±2.0)	76.0 (±3.1)	74.0 (±6.7)

Gene	Primer 1	Seq. No.	Primer 2	Seq. No.
β-actin	CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC	15	ATGGAGCCACCGATCCACA	16
p21	GCAGATCCACAGCGATATCCA	17	AACAGGTCGGACATCACCAG	18
IL1α	TCCATAACCCATGATCTGGAA	19	TTGGTTGAGGGAATCATTCAT	20
IL1β	GTATGGGCTGGACTGTTTC	21	GCTGTCTGCTCATTCACG	22
CXCL1	ACCGAAGTCATAGCCACACTC	23	CTCCGTTACTTGGGGACACC	24
CXCL10	GCTGCCGTCATTTTCTGC	25	TCTCACTGGCCCGTCATC	26
MMP3	GTTGGAGAACATGGAGACTTTGT	27	CAAGTTCATGAGCAGCAACCA	28
MMP12	TGCACTCTGCTGAAAGGAGTCT	29	GTCATTGGAATTCTGTCCTTTCCA	30
MMP13	AAGGGGATAACAGCCACTACAA	31	ACCAACATAAAAATTAAGCCAAATG	32
MCP1	GCATCTGCCCTAAGGTCTTCA	33	GTGGAAAAGGTAGTGGATGCATT	34
COL1A1	CAGTCGATTCACCTACAGCAC	35	TGGAGGGAGTTTACACG	36
Agtr1a	AAGGGCCATTTTGCTTTTCT	37	AACTCACAGCAACCCTCCAA	38

그 결과, 표 19에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 뇌(brain), 부고환지방(eWAT), 근육(muscle), 피부(skin) 등의 각종 장기 조직에서 p16의 mRNA 양이 급격히 증가하였다. 또한, 표 20에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 p16의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 p16의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 7-3. LX-112의 노화관련 표지인자(SA-

-gal)의 양 감소

마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 조직 절편을 제작하고, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 노화관련 표지인자(SA-β-gal)을 염색하였다. 구체적으로, 마우스로부터 수집된 각 부위의 조직에서 지방을 제거하고 4% 포르말린(formalin)에서 24시간 이상 상온 고정하였다. 냉동 보존을 위해 30% 수크로즈(sucrose)에서 8시간 이상 두었다가 동결 절편화를 위해 동결보호제 OCT 배지에서 급속 냉동하였다. 급속 냉동한 조직을 조직병리서비스 전문업체인 히스토아에 의뢰하여 동결 절편을 제작하였다. 제작된 조직 동결 절편은 8 μm 두께로 자른 다음, 슬라이드 커버에 절편화시킨 뒤, 30분 동안 상온 건조시키고 이후 -80℃에서 사용 전까지 보관하였다. 노화관련 표지인자(SA-β-gal)을 염색한 다음, 광학 현미경을 통해 촬영한 후, 이미지 J 프로그램을 사용하여 염색된 부위의 면적를 계산하고, 전체 면적을 기준으로 표준화시켜 정량화하였다. 표 22는 노화를 유도하기 이전(Young) 및 이후(Old)에, 표 23은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 염색 면적을 나타낸 결과이다. 도 2는 지방 조직의 염색 사진 결과이다.

SA-β-gal (Fold)	Liver	Kidney	Lung	Skin	eWAT
Young	1.0 (±0.5)	1.0 (±0.6)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.3)	1.0 (±1.0)
Old	4.5 (±0.2)	3.0 (±0.4)	1.1 (±0.5)	2.8 (±0.3)	45.9 (±9.3)

SA-β-gal (%)	Liver	Kidney	Lung	Skin	eWAT
-	100.0 (±9.0)	100.0 (±8.0)	100.0 (±6.0)	100.0 (±9.0)	100.0 (±7.0)
LX	58.0 (±7.0)	55.0 (±17.0)	67.0 (±6.0)	68.0 (±9.0)	38.0 (±7.0)

그 결과, 표 22에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 피부(skin), 부고환지방(eWAT) 등의 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 23 및 도 2에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 7-4. LX-112의 노화관련 퇴행성 표지인자(리포푸신)의 양 감소

마우스를 희생시키고 실시예 7-3과 동일한 방법으로 근육(muscle) 조직에서 조직 절편을 제작하고, 노화에 따라 세포의 라이소좀에서 생성되는 단백질 및 지질 등의 퇴행성 이상복합체로서 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 양을 수단블랙비(Sudan Black B, 구입처-Sigma)을 사용해서 염색해서 촬영한 후, 이미지 J 프로그램을 사용하여 염색된 부위의 면적를 계산하고, 전체 면적을 기준으로 표준화시켜 정량화하였다. 표 24는 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 25는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 염색 면적을 나타낸 결과이다.

	Muscle
Lipofuscin (Fold)	Young	1.0 (±0.2)
	Old	1.5 (±0.4)

	Muscle
Lipofuscin (%)	-	100.0 (±8.0)
	LX	71.0 (±6.0)

그 결과, 표 24에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 근육(muscle) 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 25에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 근육 조직에서 증가하는 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 7-5. LX-112의 노화관련 염증 분비인자(SASP)(IL6)의 양 감소

마우스로부터 채취한 혈청(serum)은 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다. 혈청에서 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 MCP1의 양을 효소결합면역흡착제 검정법(ELISA Kit, 구입처-R&D Systems)를 사용하여 측정하였다. 표 26은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 27은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 MCP1의 양을 나타낸 결과이다.

Fold	IL6	MCP1
Young	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.2)
Old	4.2 (±0.3)	2.8 (±1.1)

%	IL6	MCP1
-	100.0 (±29.0)	100.0 (±27.1)
LX	63.0 (±12.8)	58.0 (±9.8)

그 결과, 표 26에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 혈청에서 IL6 및 MCP1의 양이 증가하였다. 또한, 표 27에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 IL6 및 MCP1의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 혈청에서 증가하는 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 MCP1의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 7-6. LX-112의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)들의 양 감소

실시예 7-2와 동일한 방법으로 합성된 cDNA를 이용하여 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13에 대한 qRT-PCR을 수행 및 분석하였다. 표 28은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 29는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 29는 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 mRNA 양과 비교하였다.

mRNA (Fold)	Liver	Kidney	Lung	Muscle	Skin
	MMP3	IL1β	MMP12	IL6	MMP3	MMP12	MMP13
Young	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.4)	1.0 (±0.5)	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.4)	1.0 (±0.1)
Old	2.2 (±0.2)	2.0 (±0.2)	3.6 (±1.9)	2.9 (±1.3)	1.5 (±0.2)	10.0 (±6.3)	1.3 (±0.6)

mRNA (%)	Liver	Kidney	Lung	Muscle	Skin
	MMP3	IL1β	MMP12	IL6	MMP3	MMP12	MMP13
-	100.0 (±5.1)	100.0 (±9.9)	100.0 (±15.0)	100.0 (±12.0)	100.0 (±38.0)	100.0 (±8.4)	100.0 (±49.0)
LX	75.0 (±13.0)	67.0 (±3.9)	81.0 (±13.0)	65.0 (±21.0)	92.0 (±6.0)	78.0 (±14.0)	95.0 (±2.0)

그 결과, 표 28에 나타난 바와 같이, 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 근육(muscle), 피부(skin) 등의 각종 장기 조직에서 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13 등의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 29에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 각각의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 MMP3, IL1β, MMP12, IL6, MMP13 등의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 7-7. LX-112의 노화에 따른 노쇠(활동성, 지구력, 근력 및 악력, 근감소증, 지방위축증 등) 개선

마우스에서 노화에 따른 노쇠를 분석하기 위하여 활동성 평가(open field test), 지구력 평가(wire hanging test), 근력 및 악력 평가(grip strength test)를 수행하였다. 구체적으로, 활동성 평가(open field test)에서는, 마우스를 흰색의 네모난 상자에 넣고 일정 시간 동안 움직인 궤적을 측정하였다. 중앙에 머문 시간을 움직인 전체 거리를 기준으로 표준화시켜 정량화하였다. 지구력 평가(wire hanging test)에서는, 마우스가 와이어(wire)에 매달려서 버티는 시간을 측정하였다. 근력 및 악력 평가(grip strength test)에서는, 마우스의 꼬리를 잡고 악력 측정기(구입-정도비앤피)를 앞발로 잡게 만든 뒤, 놓칠 때까지 살짝 잡아 당겨 놓치기 직전 측정기에 가해지는 힘을 측정하였다. 표 30은 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 31은 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노쇠의 판단 기준인 활동성 평가, 지구력 평가, 근력 및 악력 평가를 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 표 31은 노화가 유도된 후의 각각의 평가의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 평가의 양과 비교하였다.

그 결과, 표 30에 나타난 바와 같이, 노화가 유도됨에 따라 마우스의 활동성, 지구력, 근력 및 악력이 감소하였다. 또한, 표 31에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 활동성, 지구력, 근력 및 악력이 증가하였다. 또한, 근육 조직에서 노화관련 표지인자인 p16(표 19 및 20) 및 SA-β-gal(표 22 및 23), 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신(표 24 및 25), 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6(표 26, 27 및 29) 등도 LX-112의 처리에 의해서 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 노쇠를 개선시키는 것을 확인하였다. 이 개선 효과와 일치하는 사실로서, 표 31 결과로부터, LX-112가 노화된 마우스의 대퇴부 사두근(quadriceps)의 근육 조직 및 전반적인 지방 조직의 무게를 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예 7-8. LX-112의 노화에 따른 신장 손상 개선

마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 신장 손상 표지인자인 요소(urea) 및 크레아티닌(creatinine)의 양을 키트(구입처-BioAssay Systems 및 Sigma)를 사용하여 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. 또한, 신장 손상 표지인자인 Agtr1a mRNA의 양을 실시예 7-2에 기재된 대로 qRT-PCR로 측정하였다. 표 32는 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 신장 손상 표지인자인 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA을 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.

그 결과, 표 32에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 신장 손상 및 기능 장애를 개선시키는 것을 확인하였다.

실시예 7-9. LX-112의 노화에 따른 피부 노화 개선

피부 조직의 동결 절편을 H/E(Hematoxylin/Eosin)으로 염색하고, 광학 현미경으로 진피(dermis)의 두께를 관찰하였다. 또한, 콜라겐(COL1A1)의 mRNA 양을 실시예 7-2에 기재된 대로 qRT-PCR로 측정하였다. 표 33에 자연적으로 노화를 유도한 마우스에 LX-112를 처리하지 않은 조건 및 처리한 조건에서 피부(dermal)의 두께와 콜라겐(COL1A1) mRNA 양에 따른 피부 노화 정도를 정량적으로 나타내었다.

그 결과, 표 33에 나타난 바와 같이, 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 피부의 두께와 콜라겐의 양이 증가하였다. 또한, 피부 조직에서 노화관련 표지인자인 p16(표 19 및 20) 및 SA-β-gal(표 22 및 23), 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)이며 콜라겐 분해 효소인 MMP1, MMP12, MMP13(표 29) 등도 LX-112의 처리에 의해서 감소하였다. 이로부터, LX-112가 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 피부 노화를 개선시키는 것을 확인하였다.

실시예 8. 항암제에 의해 유도된 노화 마우스에서 LX-112의 노화세포 제거 및 관련 노화 억제 활성

실시예 8-1. 항암제에 의해 유도된 노화 마우스 모델의 확립

8주령의 수컷 C57BL6J 마우스(구입처-KRIBB 실험동물자원센터)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 항암제인 독소루비신을 10 mg/kg 농도로 복강으로 투여하고 10일 이상 노화를 유도시킨 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 21일 동안 매일 70 mg/kg 농도로 구강으로 투여하였다. 대조군은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 약물 투여 종료 후, 하기 각각의 실시예에 기재된 방법을 수행하였다.

실시예 8-2. LX-112의 노화관련 표지인자(p16)의 양 감소

실시예 7-2와 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 RNA 추출하여 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR을 수행 및 분석하였다. 표 34는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 35는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 35는 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 p16 및 p21의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16 및 p21의 mRNA 양과 비교하였다.

		Liver	Kidney	eWAT
p16 mRNA (Fold)	-	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.3)
	DOX	2.6 (±0.8)	1.3 (±0.3)	3.2 (±1.2)
p21 mRNA (Fold)	-	1.0 (±0.6)	1.0 (±0.4)	1.0 (±.0.2)
	DOX	3.8 (±2.3)	2.6 (±2.1)	3.9 (±3.0)

		Liver	Kidney	eWAT
p16 mRNA (%)	-	100.0 (±24.0)	100.0 (±9.89)	100.0 (±9.8)
	LX	70.0 (±8.3)	75.0 (±14.81)	72.0 (±18.75)
p21 mRNA (%)	-	100.0 (±18.58)	100.0 (±25.8)	100.0 (±18.51)
	LX	78 (±11.5)	83.8 (±9.5)	68.4 (±15.1)

그 결과, 표 34에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 부고환지방(eWAT) 등의 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 35에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스에 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 8-3. LX-112의 노화관련 표지인자(SA-

-gal)의 양 감소

실시예 7-3와 동일한 방법으로 기재된 마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 조직 절편을 제작하여 노화관련 표지인자인 SA-β-gal을 염색하였다. 표 36은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 37은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 염색 면적을 나타낸 결과이다. 도 3은 지방 조직의 염색 사진 결과이다.

SA-β-gal (Fold)	Liver	Kidney	Lung	eWAT
-	1.0 (±0.6)	1.0 (±0.9)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.1)
DOX	3.7 (±0.9)	4.1 (±1.5)	1.3 (±0.4)	4.2 (±0.9)

SA-β-gal (%)	Liver	Kidney	Lung	eWAT
-	100.0 (±7.2)	100.0 (±10.2)	100.0 (±6.2)	100.0 (±8.4)
LX	67.4 (±9.9)	69.2 (±10.2)	64.2 (±9.2)	51.4 (±13.4)

그 결과, 표 36에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver), 신장(kidney), 폐(lung), 부고환지방(eWAT) 등의 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 37 및 도 3에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 SA-β-gal의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 SA-β-gal의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 8-4. LX-112의 노화관련 퇴행성 표지인자(리포푸신)의 양 감소

실시예 7-4과 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 근육(muscle) 조직에서 조직 절편을 제작하여 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신을 염색하였다. 표 38은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 39는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 염색 면적을 나타낸 결과이다.

	Muscle
Lipofuscin (Fold)	-	1.0 (±0.2)
	DOX	2.2 (±0.5)

	Muscle
Lipofuscin (%)	-	100.0 (±19.3)
	LX	77.1 (±8.0)

그 결과, 표 38에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 근육(muscle) 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 39에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 근육 조직에서 리포푸신의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 근육 조직에서 증가하는 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 8-5. LX-112의 노화관련 염증 분비인자(SASP)(IL6)의 양 감소

실시예 7-5와 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6의 양을 효소결합면역흡착제 검정법(ELISA Kit, 구입처-R&D Systems)으로 측정하였다. 표 40은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 41은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6의 양을 나타낸 결과이다.

IL6 (Fold)	-	1.0 (±1.1)
	DOX	11.7 (±0.5)

IL6 (%)	-	100.0 (±38.4)
	LX	69.8 (±12.2)

그 결과, 표 40에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 혈청에서 IL6의 양이 증가하였다. 또한, 표 41에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 IL6의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 혈청에서 증가하는 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 8-6. LX-112의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)들의 양 감소

실시예 7-6과 동일한 방법으로 합성된 cDNA를 이용하여 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β 등에 대한 qRT-PCR을 수행 및 분석하였다. 표 42는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 43은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 43은 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 mRNA 양과 비교하였다.

mRNA (Fold)		IL6	CXCL1	CXCL10	IL1β
Liver	-	1.0 (±0.5)	1.0 (±0.6)	1.0 (±0.3)	1.0 (±0.5)
	DOX	1.8 (±0.3)	3.0 (±0.9)	2.6 (±0.9)	1.6 (±0.3)
eWAT	-	1.0 (±0.5)	1.0 (±0.2)	1.0 (±0.4)	1.0 (±0.5)
	DOX	3.2 (±3.3)	1.3 (±0.4)	3.0 (±1.2)	1.6 (±2.2)

mRNA (%)		IL6	CXCL1	CXCL10	IL1β
Liver	-	100.0 (±35.4)	100.0 (±38.5)	100.0 (±13.6)	100.0 (±28.4)
	LX	42.0 (±23.5)	68.0 (±21.1)	84.0 (±11.5)	42.0 (±35.2)
eWAT	-	100.0 (±38.4)	100.0 (±8.5)	100.0 (±38.7)	100.0 (±78.7)
	LX	48.6 (±12.5)	94.8 (±1.2)	74.0 (±11.0)	38.0 (±37.0)

그 결과, 표 42에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver) 및 부고환지방(eWAT) 등의 장기 조직에서 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 43에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 각각의 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의한 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 염증 및 섬유화증 분비인자(SASP)인 IL6, CXCL1, CXCL10, IL1β의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 8-7. LX-112의 항암제에 따른 피로 및 쇠약, 체중 감소 개선

실시예 7-7과 동일한 방법으로 마우스에서 항암제의 처리에 의해서 부작용으로 발생하는 피로 및 쇠약을 분석하기 위하여 활동성 평가(open field test), 지구력 평가(wire hanging test), 근력 및 악력 평가(grip strength test)를 수행하였다. 표 44는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 45는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노쇠의 판단 기준인 활동성 평가, 지구력 평가, 근력 및 악력 평가를 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 표 46은 항암제의 처리에 의해 노화를 유도하기 이전 및 이후와 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리한 조건에서 체중 결과를 나타내었다. 표 45는 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 평가의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 평가의 양과 비교하였다.

	Open Field Test Time in Center (%)	Wire Hanging Test Time (Sec)	Grip Sterenght Test Strength (N)
-	11.9 (±4.2)	69.0 (±7.0)	1.3 (±0.1)
DOX	4.9 (±2.2)	32.0 (±11.0)	0.7 (±0.1)

	Open Field Test Time in Center (%)	Wire Hanging Test Time (Sec)	Grip Sterenght Test Strength (N)
-	100.0 (±22.0)	100.0 (±25.0)	100.0 (±29.0)
LX	129.0 (±15.0)	127.0 (±15.0)	122.0 (±18.0)

Mean Body Weight (g)	-	DOX	DOX+LX
	26.5 (±5.7)	21.3 (±2.6)	22.8 (±3.1)

그 결과, 표 44 내지 46에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 활동성, 지구력, 근력 및 악력이 증가하였고, 체중 감소가 개선되었다. 또한, 근육 조직에서 노화관련 퇴행성 표지인자인 리포푸신(표 38 및 39) 등도 LX-112의 처리에 의해서 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 항암제의 처리에 의해서 부작용으로 발생하는 마우스의 피로 및 쇠약을 개선시키는 것을 확인하였다. 이 개선 효과와 일치하는 사실로서, 표 46 결과로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 노화된 마우스의 체중을 증가시키는 것을 확인하였다.

실시예 8-8. LX-112의 항암제에 따른 간 손상 개선

실시예 7-5와 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 간 손상시 혈액으로 유리되어 나오는 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine transaminase)의 양을 키트(구입처-Sigma)를 사용하여 제조사의 설명서에 기재된 방법에 따라 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. 표 47은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 48은 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 간 손상 표지인자인 AST 및 ALT의 양을 나타낸 결과이다. 표 48은 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.

Fold	AST	ALT
-	1.0 (±0.1)	1.0 (±0.1)
DOX	1.3 (±0.0)	1.4 (±0.5)

%	AST	ALT
-	100.0 (±14.4)	100.0 (±9.2)
LX	78.0 (±17.3)	72.2 (±14.1)

그 결과, 표 47에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 마우스가 노화되면 혈청에서 AST 및 ALT의 양이 증가하였다. 또한, 표 48에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 AST 및 ALT의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 간 손상 및 기능 장애를 개선시키는 것을 확인하였다.

실시예 8-9. LX-112의 항암제에 따른 신장 손상 개선

실시예 7-8과 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 신장 손상 표지인자인 요소(urea) 및 크레아티닌(creatinine)의 양을 분광광도법(spectrophotometry)으로 측정하였다. 표 49는 항암제의 처리에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 신장 손상 표지인자인 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA을 각각 정량적으로 나타낸 결과이다. 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 후의 각각의 인자의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 각각의 인자의 양과 비교하였다.

그 결과, 표 49에 나타난 바와 같이, 항암제의 처리에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 요소, 크레아티닌, Agtr1a mRNA의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 항암제의 처리에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 신장 손상 및 기능 장애를 개선시키는 것을 확인하였다.

실시예 9. 비만에 의해 유도된 노화 마우스에서 LX-112의 노화세포 제거 및 관련 노화 억제 활성

실시예 9-1. 비만에 의해 유도된 노화 마우스 모델의 확립

고지방식이로 비만이 유도된 15주령의 수컷 C57BL6J 마우스(구입처-잭슨연구소)를 1주일 동안 실험 환경에 적응시킨 후, 마우스를 실험군 및 대조군으로 무작위화하였다. LX-112는 0.5% CMC-Na 용액(구입처-Sigma)에 섞어서 21일 동안 매일 70 mg/kg 농도로 구강으로 투여하였다. 대조군은 동일한 부피로 용액만을 투여하였다. 약물 투여 종료 후, 하기 각각의 실시예에 기재된 방법을 수행하였다. 마우스를 희생시키고 각 부위의 지방 조직의 무게를 측정하였다. 표 50은 고지방식이(DIO)으로 비만을 유도한 마우스에서 비만을 유도하기 이전 및 이후에, 체중, 각각의 지방 조직인 부고환지방(eWAT), 서혜부지방(iWAT), 피하지방(asWAT), 장간막지방(mWAT), 견갑골 사이 갈색지방(iBAT)의 무게를 정량적으로 나타낸 결과이다.

	Body Weight (g)	eWAT (mg)	iWAT (mg)	asWAT (mg)	mWAT (mg)	iBAT (mg)
-	20.7 (±0.1)	169.1 (±70.1)	188.4 (±2.1)	205.6 (±88.4)	96.6 (±19.1)	100.5 (±35.9)
DIO	41.5 (±3.8)	2437.4 (±161.4)	1471.9 (±162.8)	1269.6 (±24.7)	1018.3 (±481.5)	344.7 (±140.7)

그 결과, 표 50에 나타난 바와 같이, 체중과 함께 각종 부위의 지방 조직의 무게가 증가하였다. 이로부터, 비만이 유도되었음을 확인하였다.

실시예 9-2. LX-112의 노화관련 표지인자(p16)의 양 감소

실시예 7-2와 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 각 부위의 장기 조직에서 RNA 추출하여 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 수행 및 분석하였다. 표 51은 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 52는 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 mRNA 양을 나타낸 결과이다. 표 52는 비만에 의해서 노화가 유도된 후의 p16 및 p21의 mRNA 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 p16 및 p21의 mRNA 양과 비교하였다.

그 결과, 표 51에 나타난 바와 같이, 노화에 의해서 마우스가 노화되면 간(liver), 근육(muscle), 폐(lung), 피부(skin), 부고환지방(eWAT), 서혜부지방(iWAT), 피하지방(asWAT), 견갑골 사이 갈색지방(iBAT) 등의 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 증가하였다. 또한, 표 52에 나타난 바와 같이, 노화에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 각종 장기 조직에서 p16 및 p21의 mRNA 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 따른 노화에 의해서 마우스에 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 각종 장기 조직에서 증가하는 노화관련 표지인자인 p16 및 p21의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 9-3. LX-112의 노화관련 염증 분비인자(SASP)(IL6)의 양 감소

실시예 7-5와 동일한 방법으로 마우스로부터 채취한 혈청(serum)에서 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 액티빈A(activin A)의 양을 효소결합면역흡착제 검정법(ELISA Kit, 구입처-R&D Systems)으로 측정하였다. 표 53은 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 54는 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 액티빈A의 양을 나타낸 결과이다.

Fold	IL6	Activin A
-	1.0 (±0.6)	1.0 (±0.5)
DIO	2.0 (±0.5)	2.9 (±1.2)

%	IL6	Activin A
-	100.0 (±9.2)	100.0 (±13.2)
LX	51.8 (±14.2)	64.5 (±12.3)

그 결과, 표 53에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 마우스가 노화되면 혈청에서 IL6 및 액티빈A의 양이 증가하였다. 또한, 표 54에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 혈청에서 IL6 및 액티빈A의 양이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 따른 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 혈청에서 증가하는 노화관련 염증 분비인자(SASP)인 IL6 및 액티빈A의 양을 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 9-4. LX-112의 비만에 따른 불안과 우울증 및 무기력증 개선

비만에 의한 불안 및 우울증은 증가된 체중과는 인과 관계가 없고, 노화세포의 축적이 원인임이 규명되었다. 이에, 실시예 7-7과 동일한 방법으로 마우스에서 비만에 의해서 발생하는 불안 및 우울증으로 인한 무기력증을 분석하기 위하여 활동성 평가(open field test)를 수행하였다. 표 55는 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 56은 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 불안 및 우울증으로 인한 무기력증의 판단 기준인 활동성 평가를 정량적으로 나타낸 결과이다. 표 56은 비만에 의해서 노화가 유도된 후의 활동성 평가의 양을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 활동성 평가의 양과 비교하였다.

Open Field Test Time in Center (%)	-	7.3 (±0.4)
	DIO	2.8 (±0.0)

Open Field Test Time in Center (%)	-	100.0 (±21.0)
	LX	137.0 (±15.0)

그 결과, 표 55에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에서 활동성이 감소하였다. 또한, 표 56에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 활동성이 증가하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 비만에 의해서 발생하는 마우스의 불안과 우울증 및 무기력증을 개선시키는 것을 확인하였다.

실시예 9-5. LX-112의 비만에 따른 지방간 개선

실시예 7-4과 동일한 방법으로 마우스를 희생시키고 간(liver) 조직에서 절편을 제작하여 지방 축적을 오일레드오(Oil Red O)로 염색하였다. 표 57은 비만에 의해서 노화를 유도하기 이전 및 이후에, 표 58은 비만에 의해서 노화를 유도하고 LX-112를 처리하지 않은 및 처리한 조건에서, 지방간의 판단 기준인 오일레드오의 염색 면적을 나타낸 결과이다. 표 58은 비만에 의해서 노화가 유도된 후의 오일레드오의 염색 면적을 100%로 산정해서, LX-112를 처리한 후의 오일레드오의 염색 면적과 비교하였다.

Oil Red O (Fold)	-	5.8 (±1.4)
	DIO	47.7 (±4.2)

Oil Red O (%)	-	100.0 (±11.3)
	LX	74.0 (±7.3)

그 결과, 표 57에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 마우스가 노화되면 오일레드오의 염색 면적이 증가하였다. 또한, 표 58에 나타난 바와 같이, 비만에 의해서 노화가 유도된 마우스에 LX-112를 처리하면 오일레드오의 염색 면적이 감소하였다. 이로부터, LX-112가 비만에 의해서 마우스의 노화에 따라 증가하는 노화세포를 제거함으로써, 마우스의 간 조직에서 축적된 지방의 양을 감소시키는 것을 확인하였다.

실시예 10. 다양한 화합물들의 노화된 인간세포 제거

실시예 1과 동일한 방법으로 독소루비신 또는 대조군(DMSO)을 처리하고 배양한 세포에 시험 화합물을 지정된 농도 별로 각각 처리하였다. 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)를 이용해서 세포 생존률을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 59에 나타내었다.

하기 시험 화합물들의 경우 Medchemexpress, Selleckchem, Cayman, Medkoo, Sigma, Molport, Enzo, TCI, Santa Cruz 사 등에서 구입하여 사용하였다.

상기 표 59에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 처리해서 노화가 유도된 세포에서 시험 화합물의 농도가 높을수록 세포 생존률이 급격히 감소하였다. 또한, LX-309(10, 20 ng/ml) 처리시 각각 17%, 32%의 노화세포의 생존율이 감소하였고, LX-209, LX-214 등의 화합물과 함께 처리시 시너지를 나타내며 노화세포의 생존율이 더욱 감소하였다. 이로부터, 본 발명의 시험 화합물은 노화세포의 사멸을 유도해서 노화세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.

반면, LX-112와 같이, 대조군을 처리해서 노화가 유도되지 않은 세포에서 시험 화합물은 노화세포에서 세포 생존률이 감소했던 정도에 비해서 세포 성장률에 커다란 변화가 없었고, 정상적으로 세포가 성장하였다.

실시예 11. 활성 산소종의 발생에 따른 노화된 인간세포 제거

시험 화합물의 노화세포 제거 기전을 확인하기 위하여 활성 산소종(ROS, Reactive Oxygen Species)을 세포 내에서 발생시키는지 여부를 평가하였다. 실시예 1과 동일한 방법으로 노화가 유도된 포피세포에 시험 화합물을 각각 세포사멸을 유도하는 최대 농도(30 μM 이상)을 처리하고 배양하였다. 그 후, DCFDA/H2DCFDA(2',7'-Dichlorofluorescein diacetate, Abcam)를 20 μM로 처리하고 37℃에서 45분간 반응시켰다. 그 다음 형광 염색된 세포를 플레이트 판독기(SpectraMax ID3, Ex/Em=485 nm/535 nm, Molecular Device)를 이용하여 활성 산소증(ROS)의 발생을 분석하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 시험 화합물이 세포사멸 유도시 화합물을 처리하기 전과 비교해서 활성 산소증이 1.7~2.9배 정도 증가시킴을 확인하였다.

실시예 12. 본 발명 화합물이 처리된 세포의 분비액에 의해 노화된 인간세포 제거

실시예 1과 동일한 방법으로 독소루비신 또는 대조군(DMSO)을 처리하고 노화를 유도하고 배양한 세포에 시험 화합물을 30 μM의 고농도로 각각 처리하고 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega) 또는 광학현미경를 이용해서 세포 생존률을 측정하였다. 측정 결과, 화합물들을 높은 농도로 처리할 경우에는 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 상기 포피세포에서 공히 거의 대부분의 세포의 사멸을 유도함을 확인하였다.

이와 같이 거의 대부분의 세포 사멸을 유도하는 높은 농도로 시험 화합물을 처리한 후, 화합물이 세포 내부로 유입되었으나 아직 세포 사멸이 유도되지 않은 시점(화합물 처리 직후, 약 1~3시간)에 PBS로 3회 세척하여 시험 화합물을 제거하고 새로운 배지로 교체하여 3시간 동안 추가 배양하였다. 이 추가 배양 동안에 세포의 사멸이 유도된 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 포피세포로부터의 분비액을 포함하는 배양한 배지 상층액(Supernatant from Death-induced Cells)을 획득했다. 획득한 배지 상층액(Supernatant)을 각각 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 포피세포의 배지와 교체해 주고, 3일 후에 세포 생존률을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 60에 나타내었다.

상기 표 60에 나타난 바와 같이, 세포사멸이 유도된 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 포피세포로부터 획득한 배지 상층액(Supernatant)이, 공히 노화가 유도된(Senescent) 세포의 사멸을 선택적으로 유도함을 확인하였으나, 이와 비교해서 정상적으로 분열하는(Proliferating) 세포의 사멸은 유도하지 못함을 확인하였다.

또한, 세포를 배양하지 않고(No Cells) 시험 화합물을 처리한 배지로부터 상기와 동일한 과정을 통해 획득한 상층액(Supernatant)에서는, 공히 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 세포의 사멸을 유도하지 못함을 확인하였다. 이로부터, 시험 화합물을 처리하여 사멸이 유도된 세포로부터의 분비액을 포함하는 배지 상층액(Supernatant)가 노화세포의 사멸을 유도해 노화세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.

실시예 13. 본 발명 화합물에 의해 노화된 암세포 제거

실시예 2-1과 동일한 방법으로 암세포의 노화를 유도하였다. 이후 독소루비신 또는 대조군(DMSO)을 처리하고 배양한 세포에 시험 화합물을 지정된 농도 별로 각각 처리하였다. 3일 후에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)를 이용해서 세포 생존률을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 61에 나타내었다.

Survival (%)	0 μM	1.1 μM	3.3 μM	10 μM	30 μM
LX-205	100.0 (±2.1)	91.8 (±5.0)	57.4 (±5.6)	42.8 (±6.4)	14.2 (±0.1)
LX-208	100.0 (±3.3)	71.6 (±3.2)	20.3 (±3.1)	10.5 (±3.4)	5.3 (±2.0)
LX-209	100.0 (±4.2)	25.6 (±1.2)	17.2 (±4.4)	9.8 (±3.3)	3.4 (±2.2)
LX-301	100.0 (±4.2)	70.0 (±4.1)	40.2 (±4.2)	43.7 (±4.4)	10.7 (±0.5)

표 61에 나타난 바와 같이, 독소루비신을 처리해서 노화가 유도된 암세포에서 시험 화합물의 농도가 높을수록 세포 생존률이 급격히 감소하였다. 반면, 대조군을 처리해서 노화가 유도되지 않은 암세포에서 시험 화합물은 노화된 암세포에서 세포 생존률이 감소했던 정도에 비해서 세포 성장률에 커다란 변화가 없었고, 정상적으로 암세포가 성장하였다. 이로부터, 시험 화합물은 노화된 암세포의 사멸을 유도해서 노화된 암세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 암은 암세포를 먼저 노화시키고 이후 노화된 암세포를 제거하는 선노화 항암 치료법(prosenescence anti-cancer therapy)에 본 발명 화합물들이 유용하게 이용될 수 있다. 즉, 본 발명의 화합물은 암 등 증식 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

실시예 14. 본 발명 화합물이 처리된 세포의 분비액에 의해 노화된 암세포 제거

실시예 2-1과 동일한 방법으로 독소루비신 또는 대조군(DMSO)을 처리하여 노화를 유도하고 배양한 세포에 시험 화합물을 30 μM의 농도로 각각 처리하였다. 실시예 12와 동일한 방법으로 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 암세포로부터의 분비액을 포함하는 배지 상층액(Supernatant)을 획득해서, 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 암세포에 처리하였다. 그 후 생존률을 측정하여 그 결과를 하기 표 62에 나타내었다.

	Cells	Supernatant from Death-Induced Cells	Supernatant- Treated Cells	Survival (%)
LX-209	A549	Proliferating Cells	Proliferating Cells	98.6 (±4.8)
			Senescent Cells	78.8 (±7.7)
		Senescent Cells	Proliferating Cells	105.2 (±4.9)
			Senescent Cells	72.5 (±5.7)
		No Cells	Proliferating Cells	101.4 (±1.3)
			Senescent Cells	98.2 (±2.8)

표 62에 나타난 바와 같이, 시험 화합물을 처리하여 사멸이 유도된 암세포로부터의 분비액을 포함하는 배지 상층액(Supernatant)이 노화된 암세포의 사멸을 선택적으로 유도해서 노화된 암세포를 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다. 실시예 12와 동일한 방법으로 시험 화합물을 처리하여 사멸이 유도된 정상적으로 분열하는(Proliferating) 및 노화가 유도된(Senescent) 포피세포로부터의 분비액을 포함하는 배지 상층액(Supernatant)에서도 동일한 결과를 확인하였다.

Claims (6)

1. Auranofin, Aurothiomalate, Aurothiosulfate, Aurothioglucose, Auroptopanolsulfonate, 4-amino-2-aurothiosalicylate, TVB-2640, PX-12, MK-8245, ML210, Isopropyl-ML210, ML162, JKE1674, JKE1716, Altretamine, DMOCPTL, RSL3,FIN56, FINO2, Eprenetapopt, 2-Methylene-3-quinuclidinone, APR-017 (PRIMA-1), 2,2,2-trifluoro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, 2,2,2-trichloro-N-ethyl-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, 2,2,2-trichloro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, N-ethyl-2,2,2-trifluoro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, 2,2-difluoro-N-((3-oxoquinuclidin-2-yl)methyl)acetamide, Erastin2, Erastin, Piperazine Erastin, Imidazole Ketone Erastin, PRLX 93936, iFSP1, Siramesine, 5-Aminolevulinic Acid, Methylaminolevulinate, Hexylaminolevulinate, Benzylaminolevulinate, Triphenylphosphonium, Artesunate, Mitotane, Phenethyl Isothiocyanate, Sulfasalazine, Tolperisone, Disulfiram, Brequinar, Leflunomide, ME-344, Lapatinib, Neratinib, Eperisone, Lanperisone, Ferroptocide, VLX600, Fenretinide, Pralsetinib, Erdafitinib, Nelfinavir, Omaveloxolone, ATN-224, Ezatiostat, Ethacrynic Acid, Polyunsaturated Fatty Acid, Lercanidipine, Atovaquone, Ivosidenib, MitoCDNB, Roblitinib, Lenvatinib, IFNgamma, CTLA4 저해제(inhibitor), PD-1 저해제, 및 PD-L1 저해제로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 이러한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포의 분비액; 또는 이러한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리해서 사멸하는 세포를 유효성분으로 포함하는, 노화세포 제거용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 증식 질환 및 장애, 염증 또는 자가면역 질환 및 장애, 신경 질환 및 장애, 대사 질환 및 장애, 심혈관 질환 및 장애, 폐 질환 및 장애, 신장 질환 및 장애, 간 질환 및 장애, 안구 질환 및 장애, 피부 질환 및 장애, 줄기세포 또는 장기 조직의 재생유지 관련 질환 및 장애, 외래이식 관련 질환 및 장애, 섬유화증 질환 및 장애, 경화증 질환 및 장애, β-갈락토시데이즈 관련 질환 및 장애, 기타 노인성 질환 및 장애, 스트레스에 의한 부작용 및 후유증 및 이로 인한 노화관련 질환 및 장애로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 노화세포와 관련된 질환 또는 장애의 개선, 치료 또는 예방용인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 염증, 섬유화증, 경화증, 암, 노쇠, 근감소증, 지방위축증, 간 손상, 신장 손상, 피부 노화, 또는 항암제 또는 비만 부작용의 개선, 치료 또는 예방용인, 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 항암제 또는 비만 부작용은 피로, 쇠약, 체중 감소, 불안, 우울증, 무기력증, 또는 지방간인, 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 노쇠는 활동성 저하, 지구력 저하, 근력 저하, 또는 악력 저하인, 조성물.
6. 제3항에 있어서, 상기 피부 노화는 주름, 탄력저하, 탈모, 모피악화, 기미, 잡티, 모반, 반점, 반색, 색소침착, 사마귀, 두드러기, 모공악화, 또는 상처치유저하인, 조성물.

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