KR20230065884A - 토마토황화잎말림태국바이러스를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스(TYLCTHV)에 대한 감염성 클론을 제작하고 이를 담배(​​Nicotiana benthamiana) 및 토마토(Solanum lycopersicum)에 접종하여 감염을 일으킴을 확인하였다. 이 감염성 클론은 TYLCTHV의 감염 가능한 기주 범위를 확인하고, 바이러스의 특성 규명 등의 연구에 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도에 관한 것이다.
토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)는 베고모바이러스 과, 제미니바이러스 속에 속하는 식물 바이러스이다. TYLCTHV는 2개의 원형 단일 가닥 DNA 분자인 DNA-A와 DNA-B를 가진 이분자 베고모바이러스이나, 미얀마에서는 DNA-A만으로 병을 내는 경우가 관찰되고 있다. 이 바이러스는 태국, 대만, 미얀마, 중국에서 보고되었다. 토마토, 고추 등 다양한 숙주 식물에서 TYLCTHV 감염이 확인되었다.
본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)에 대한 감염성 클론을 제작하고 이를 담배(​​Nicotiana benthamiana) 및 토마토(Solanum lycopersicum)에 접종하여 감염을 일으킴을 확인하였다. 이 감염성 클론은 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 감염 가능한 기주 범위를 확인하고, 바이러스의 특성 규명 등의 연구에 활용할 수 있다.
본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 감염성 클론을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
마지막으로, 본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 감염성 클론을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 클론은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 pCAMBIA1303 벡터에 도입한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 클론은 토마토황화잎말림태국바이러스의 기주 범위 및 바이러스 특성을 규명시키는 것에 사용될 수 있는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 토마토황화잎말림태국바이러스는 수탁번호 MT108193로 표시되는 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 토마토황화잎말림태국바이러스는 수탁번호 MT108193로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
마지막으로, 본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스의 진단용 조성물을 포함하는 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 토마토황화잎말림태국바이러스(TYLCTHV)에 대한 감염성 클론을 제작하고 이를 담배(​​Nicotiana benthamiana) 및 토마토(Solanum lycopersicum)에 접종하여 감염을 일으킴을 확인하였다. 이 감염성 클론은 TYLCTHV의 감염 가능한 기주 범위를 확인하고, 바이러스의 특성 규명 등의 연구에 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, TYLCTHV 감염성 클론 제작의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 담배 및 토마토에서 TYLCTHV의 접종 확인을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 담배 및 토마토에서 TYLCTHV의 접종 확인을 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 수 있다. 상기 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "키트"에는 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는, 상기 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
<실시예 1> 시료의 확보 및 바이러스 염기서열 분석
미얀마에서 잎이 말리고 노랗게 변한 토마토 샘플이 관찰되고 수집되었다. 전체 DNA는 Viral Gene-Spin Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON Biotology)을 사용하여 잎 조직 샘플에서 추출되었다. 모든 과정은 제조사의 지시에 따라 수행되었다. 각 검체의 전체 DNA는 TempliPhi™ 키트(GE Healthcare, IL, USA)와 함께 Rolling-circle amplification(RCA) 반응 및 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV) 특이적 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 통해 확인되었다. 본 실험에 사용된 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV) 프라이머는 Beg-F(5′-CCGTGCTGCTGCCCCCATTGTCCGCGTCAC-3′) and Beg-R(5′-CTGCCACAACCATGGATTCACGCACAGGG-3′)와 같다(표 1). 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 존재는 PCR 증폭을 사용해 확인하였으며, 이후 제한효소 KpnI로 처리한 RCA 산물을 이용해 바이러스의 전체 서열을 추출한 뒤 마크로젠의 염기서열 분석 서비스를 통해 염기서열을 확인했다. 전체 길이 시퀀스가 GenBank에 제출되었으며 할당된 접근 번호는 MT108193이다.
서열번호 1(Beg-F 프라이머 서열) : CCGTGCTGCTGCCCCCATTGTCCGCGTCAC
서열번호 2(Beg-R 프라이머 서열) : CTGCCACAACCATGGATTCACGCACAGGG
서열번호 3(TYLCTHV의 전체 염기서열(MT108193 Tomato yellow leaf curl Thailand virus isolate M5)) : ACCGGATGGCCGCGATTTTTTTAAAGTGGTCCCCTTGATGTGATGTCTCATCCAATCAGAACTCTGTCTCAAAGCTTAATTATTTATGGTCCCCTATATATACTTGGTCCCTAAGTTTCGGCGAAATTCAAAATGTGGGATCCACTTCTAAACGAATTTCCAGAAAACGTCCACGGTTTTCGTTGTATGCTAGCCGTGAAGTACCTGCAAGCGGTCGAAAAGACGTATTCCCCTGATACACTAGGGTTTGATCTCATCCGTGATCTCATCAGCGTAATTCGTGCGAAGAACTATGTCGAAGCGTCCAGCAGATATTCTCATTTCCACGCCCGTCTCGAAAGTACGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCATACAACAGCCGTGCTGCTGTCCCCACTGTCCGCGTCACAAAAGGGCATATATGGAAGAACCGACCTGCATACAGAAAGCCCAGGATCTACAGAATGTATAGAAGCCCTGATGTCCCTAAGGGATGTGAAGGCCCATGTAAGGTCCAATCTTTCGATGCGAAGAATGATATTGGGCATATGGGTAAGGTGATTTGTTTGTCTGACGTTACACGTGGTATTGGGCTTACCCATCGAGTTGGCAAGCGCTTCTGTGTCAAGTCACTTTATTTTGTTGGCAAGATATGGATGGATGAAAATATTAAAGTTAAGAATCACACTAACACCGTTTTGTTTTGGATAGTTAGGGATCGGCGTCCTACTGGAACGCCTTATGATTTTCAGCAGGTCTTCAATGTTTATGATAATGAGCCTTCCACGGCAACTGTGAAAAACGACCAGCGTGATCGTTTCCAGGTGATCAGGAGATTCCAGGCTACGGTGACCGGCGGGCAATATGCAGCGAAGGAGCAGGCGATTATTAGAAAGTTTTATCGTGTTAATAATTATGTAGTGTATAATCACCAGGAAGCTGGGAAGTATGAGGACCATACTGAAAATGCGTTGTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCCTCTAATCCCGTGTATGCTACTTTGAAAGTCAGGAGTTATTTTTATGACTCAGTGACTAATTAATAAATATTAAATTTTATATCATGTTCTTCAGTTACAGCAATTGTTCCTTCTAATACATTGTACAATACATGAGATATTGCCCTAATTACATTGTTTATACTAATTACTCCTAATCTATCTAAATATTTAATACATTGATATTTAAATACTCTTAAGAAACGCGAGGTCTGAGGATGTAAATGAGTCCAGATTTTGCAGACTAGAAAACATTTGTGTATCCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATTTGCAACGTGATTATGTCGTGGTTCCTCATGAATGGTCTCTCTAGGTGCTTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTATGACCGTCCAGATATATACGCCACTCTCTGACTGAGTTGCAGTGAGTAGTTCCCCGGTGCGTGAATCCATTATTGTGACAGCCTATGGCGACGAAGTACGAACATCCACAGGGTAGATCAACTCTCCTCCGTCTGGTTGCCCTCTTGGCTATTTGGTGTTGCACCTTGATAGGTACCTGAGTAGAGTGGACCTTGGAGGGTGACGAAGATCGCATTCTTTATGGCCCAGTTTTTAAGTGCGGAGTTCTTTTCCTCTTCCAAGTATTCTTTATAGCTGGAGTTTGGTCCAGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGGAATTCCGCCTTTAATTTGAACTGGTTTTCCGTATTTCGTGTTGCTTTGCCAGTCCCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGTTTTAGATAATGCGGATCGACGTCATCGATGACGTTGAACCATGCATCATTATTATACACTTTTGGACTTAAATCTAAATGGCCACATAGATAATTATGTGGTCCCAAAGACCTAGCCCACATCGTCTTCCCCGTTCTGCTATCACCCTCTATGACTATACTTATTGGTCTTAATGGCCGCGCAGCGGCATTGAGAACATTATTACAAGCCCAATCTTCAAGTTCTTCGGGAACTTGATTAAAAGAAGAAGAAGAAAAAGGAGAAATATATTCCTCTATTGGAGGAGTAAAAATCCTATCTAAATTATTGTTTAAATTATGAAATTGTAAAACAAAATCTTTAGGGGCCTTTTCCCTCAGTATATTGAGGGCCGAAGCTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATATGCGTCGTTGGCAGACTGGCAACCTCCTCTAGCCGATCTTCCATCGATCTGGAAAATTCCATGATCAAGTACGTCTCCGTCTTTTTCCATGTATGATTTAACATCTGTTGAGCTTTTAGCTCCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATGTGAGGTCGAAGAATCTTTGATTTTTACACTGGAATTTTCCTTCGAATTGGATGAGGACATGCAGGTGAGGAGTCCCATCTTCATGGAGTTCCCTGCAGATTCTAATGAATAATTTATTAGTTGGTGTTTCTAGTGCTAGAATTTTGGAAAGTGCTTCTTCTTTAGTGAGAGAGCAGTGTGGGTATGTGAGAAAATAATTCTTGGCATTTATTCTAAATTTATTAAGGGGAGCCATGTTGACTTGGTCAATCGGTGTCTCTCAAACTTGGCTATGCAATCGGTGTCTGGTGTCTTATTTATACCTGGAAACTAAATGGCATTATTGTAAATTAGTAAAGGAAATTCAAAATTCAAAATCCAATCGTGGCCATCCGTATAATATT
<실시예 2> 감염성 클론의 제작
TYLCTHV의 감염성 클론은 숙주 식물에서의 감염성을 검사하기 위해 제작되었다. 가장자리의 제한 부위를 포함하는 2개의 부분 게놈은 TYLCTHV의 염기서열을 기반으로 설계된 프라이머 세트를 사용하여 증폭되고 제조사 지침에 따라 TA 복제 기술을 사용하여 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 결합되어 염기서열 확인(Macrogen, Korea)이 이루어졌으며 제한 효소 처리 기법을 통해 확인되었다. TYLCTHV의 2개의 부분 게놈은 pCAMBIA1303 벡터에 도입되었다(서열번호 6). 열충격 방법을 사용하여 대장균 균주 DH5α로 형질전환한 다음 GV3101 아그로박테리움 균주로 형질전환하고, 제한 효소 처리 및 검출 프라이머 세트를 사용한 PCR로 재조합 DNA를 포함하는 형질전환체를 확인하였다(도 1).
서열번호 4(TYLCTHV_IC1) : CCTTCGAATTGGATGAGGACATGCAAGTGAGGAGTCCCATCTTCATGAAGTTCTCTGCAGATTCTGATGAATAATTTATTAGTTGGGGTTGAAAGGTTTATAATTTGGGAAAGTGCTTCTTCTTTGGTGAGTGAGCAGTGTGGGTATGTGAGGAAATAATTCTTGGCATTTATTAGAAATTTCTTGGAAGGAGGCATGTTGACTTGGTCAATCGGGTCCTCTCAAACTTGTCTAAGCAATCGGGGAATGGGTCCTTATTTATAGTTGAGGACCTAAATGGCATAATTGTAAATAAATATATGAAATTCAAAATTCACAATTTAATCGTGGCCATCCGTATAATATTACCGGATGGCCGCGATTTTTTTAAAGTGGTCCCCTTGATGTGATGGTTCAACCAATCAAAACGCTCTCTCAAAGCTTAATTATTTATGGTCCCCTATATATACTTGGTCCCTAAGTCTCGTGGAAATTGAAAATGTGGGATCCACTTTTAAACGAATTCCCAGAAAACGTCCACGGTTTCCGTTGTATGCTAGCCGTGAAGTATCTGCAAGCGGTCGAGAAGACTTATTCCCCTGATACCCTAGGGTTTGATCTCATCCGTGACCTCATTGGTGTAATTCGTGCAAAGAACTATGTCGAAGCGTCCAGCAGATATTCTCATTTCCACGCCCGTCTCGAAAGTACGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCATACAACAGCCGTGCTGCTGTCCCCACTGTCCGCGTCACAAAAGGGCAGATATGGAAGAACCGACCTGCATACAGAAAGCCCAGGATCTACAGAATGTATAGAAGCCCTGATGTCCCTAAGGGATGTGAAGGCCCATGTAAGGTCCAATCTTTTGATGCGAAAAATGATATTGGGCATATGGGTAAGGTGATCTGTTTGTCTGACGTTACACGTGGTATTGGGCTTACCCATCGAGTTGGCAAGCGCTTCTGTGTCAAGTCACTTTATTTTGTTGGCAAGATATGGATGGATGAAAATATTAAAGTTAAGAATCACACTAACACCGTTTTGTTTTGGATAGTTAGGGATCGGCGTCCTACTGGAACGCCTTATGATTTtCAGCAGGTCTTCAATGTTTATGATAATGAgCCTTCCACGGCAACTGTGAAAAACGACCAGCGTGATCGTTTCCAGGTGATCAGGAGATTCCAGGCTACGGTGACtGGTGGgCAATATGCAgCGAAGGAGCAGGCGATTATTAGAAAGTTTTATCGTGTTAATAATTATGTAGTGTATAATCAtCAGGAAGCTGGGAAGTATGAGAACCATaCTGAAAATGCGTTGTTGTTGTATATGGCATGTACTCATGCcTCTAATCCCGTGTATGCTACTTTGAAAGTCAGGAGTTATTTCTATGACtCAGTGACgAATTAATAAATATTAAATTTTATATCATGTTCTTCAGTTACAtCAATTGTTCCTTCTAATACATTGTAcAATACATGAGATATTGCCCtAATTACATTGTTTATACTAATTACgCCTAATCTATCTAAATATTTAaTACATTGATATTTAAATACTCTTAAGAAACGCGAGGTCTGAGGATGTAAATGAGTCCAGATTTTGCAGACTAGAAAACATTTGTGTATCCCCAACGCTTTCCTCAGGTTGTAGTTGAACTGGATTTGCAACGTGATTATGTCGTGGTTCCTCATGAATGGTCTCTCtAgGTGCTTGGTTATCTTGAAATATAGGGGATTTTTGACCGTCCACATATATACGCCACTCTCTGATTGAGTTGCAGTGAGTAGTTCCCCGGTGCGTGAATCCATGATTGTTACAGCCTATTGCGACGAAGTACGAACATCCACAAGGTAGATCAACTCTCCGTCGTCTGGTTGCCCTCTTGGCTATTCGGTGTTGCACCTTGATGGGTACC
서열번호 5(TYLCTHV_IC2) : GGTACCTGAGTAGAGTGGGCCTTGGAGGGTGACGAAGATTGCATTCTTTATGGCCCAGTTTCGAAGTGCGGAGTTCTTTTCCTCTTCCAAGTACTCTTTATAGCTGGAGTTTGGTCCAGGATTGCAGAGGAAGATAGTGGGAATTCCGCCTTTAATTTGAACTGGTTTTCCGTATTTGGTGTTGCTTTGCCAGTCCCTTTGGGCCCCCATGAACTCTTTAAAGTGTTTTAGATAATGCGGATCGACGTCATCGATGACGTTGAACCATGCATCATTATTGTACACTTTTGGACTTAAATCTAAATGGCCACATAGATAATTATGTGGTCCCAAAGACCTAGCCCACATCGTCTTCCCCGTTCTGCTATCACCCTCTATTACTATACTTACTGGTCTTAACGGCCGCGCAGCGGCAGTGACAACATTTTCAGAAGCCCACTCTTCAAGTTCATCAGGAACTTGATCAAAAGAAGAAGAACAAAAAGGAGAAATATATTCCTCTTTTGGAGGAGTAAAAATCCTATCTAAATTACTATTTAAATTATGAAATTGTAAAACAAAATCTTTTGGTGCCTTTTCTCTCAATATATTGAGGGCCGAAGCTTTGGACCCTGAATTGATTGCCTCGGCATATGCGTCGTTTGCAGTTTGGCAACCTCCTCTAGCCGATCTTCCATCGATTTGGAAAATTCCATGATCAAGCACGTCTCCGTCTTTATCCATGTATGTTTTAACATCTGTTGAGCTTTTAGCTCCCTGAATGTTCGGATGGAAATGTGCTGACCTGGTTGGGGATGTGAGATCGAAGAATCGGTTGTTTTGGCACTTGAATTTTCCTTCGAATTGGATGAGGACATGCAAGTGAGGAGTCCCATCTTCATGAAGTTCTCTGCAGATTCTGATGAATAATTTATTAGTTGGGGTTGAAAGGTTTATAATTTGGGAAAGTGCTTCTTCTTTGGTGAGTGAGCAGTGTGGGTATGTGAGGAAATAATTCTTGGCATTTATTAGAAATTTCTTGGAAGGAGGCATGTTGACTTGGTCAATCGGGTCCTCTCAAACTTGTCTAAGCAATCGGGGAATGGGTCCTTATTTATAGTTGAGGACCTAAATGGCATAATTGTAAATAAATATATGAAATTCAAAATTCACAATTTAATCGTGGCCATCCGTATAATATTACCGGATGGCCGCGATTTTTTTAAAGTGGTCCCCTTGATGTGATGGTTCAACCAATCAAAACGCTCTCTCAAAGCTTAATTATTTATGGTCCCCTATATATACTTGGTCCCTAAGTCTCGTGGAAATTGAAAATGTGGGATCCACTTTTAAACGAATTCCCAGAAAACGTCCACGGTTTCCGTTGTATGCTAGCCGTGAAGTATCTGCAAGCGGTCGAGAAGACTTATTCCCCTGATACCCTAGGGTTTGATCTCATCCGTGACCTCATTGGTGTAATTCGTGCAAAGAACTATGTCGAAGCGTCCAGCAGATATTCTCATTTCCACGCCCGTCTCGAAAGTACGTCGCCGTCTGAACTTCGACAGCCCATACAACAGCCGTGCTGCTGTCCCCACTGTCCGCGTCACAAAAGGGCAGATATGGAAGAACCGAC
서열번호 6(TYLCTHV-IC(complete)) : CATGGTAGATCTGACTAGTTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCTGTGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTGTGCGTCACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTGTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCCAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTACGTGGCAAAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGCTTTCAGCTGTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCGTGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAAGCTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATACGGAAAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCGTGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCAAGATACCCAGATCATATGAAGCGGCACGACTTCTTCAAGAGCGCCATGCCTGAGGGATACGTGCAGGAGAGGACCATCTTCTTCAAGGACGACGGGAACTACAAGACACGTGCTGAAGTCAAGTTTGAGGGAGACACCCTCGTCAACAGGATCGAGCTTAAGGGAATCGATTTCAAGGAGGACGGAAACATCCTCGGCCACAAGTTGGAATACAACTACAACTCCCACAACGTATACATCATGGCCGACAAGCAAAAGAACGGCATCAAAGCCAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAAGACGGCGGCGTGCAACTCGCTGATCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCCACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACAGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAACTATACAAAGCTAGCCACCACCACCACCACCACGTGTGAATTGGTGACCAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACG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<실시예 3> 아그로박테리아를 이용한 감염성 클론의 접종
비슷한 크기의 생후 4주 된 담배 및 토마토 식물을 선별해 감염 여부 확인 실험에 이용했다. 아그로박테리움 GV3101 균주(형질전환된 것과 형질전환되지 않은 것 모두)는 pCAMBIA1303가 있는 LB 배지에 배양되었다. 선택 항생제, 즉 카나마이신(50 mg/L)과 균주 특이 선택 항생제인 젠타마이신과 리팜피신(50 mg/L)을 포함하였고 아그로박테리움은 OD값이 0.8에서 1.0이 되도록 30시간 동안 교반 배양하였다. 아그로박테리움 감염은 핀 찌르기 방법에 의해 수행되었다. 잎 조직 샘플은 감염 여부를 확인하기 위해 감염 28일 후에 대조군과 감염시킨 식물에서 수집되었다.
<실시예 4> 바이러스 진단용 프라이머의 제작 및 바이러스 진단
TYLCTHV의 전체 염기서열을 기반으로 약1400bp길이의 산물을 증폭하는 특이적 프라이머(TYLCTHV-F 5'-CCACGTGTCATCATCTTAGG-3'; 서열번호 7 및 TYLCTHV-R 5'-TAGTCCCGGTCAATTTCTTG-3'; 서열번호 8)를 진단에 용이하도록 설계하고 사용하였다. 모든 샘플에서 검출을 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 표준 증폭 조건에 따라 처리되었다. 94°C에서 변성(3분), 그 다음 94°C에서 30초, 58°C에서 30초, 72°C에서 1분의 35 사이클, 72°C에서 최종 신장(5분). 이 프라이머 세트를 이용하여 감염성 클론으로 접종한 식물로부터 진단을 수행한 결과, 바이러스가 감염되었음을 확인하였다.
서열번호 7(TYLCTHV-F 프라이머 서열) : CCACGTGTCATCATCTTAGG
서열번호 8(TYLCTHV-R 프라이머 서열) : TAGTCCCGGTCAATTTCTTG
TYLCTHV 감염성 클론은 담배 및 토마토에 접종되었다. 3개 중 2개의 접종된 담배 식물에서 TYLCTHV F/R프라이머를 사용한 PCR을 통해 TYLCTHV 감염이 성공적으로 검출되었다. 3개 중 3개의 토마토 식물에서 TYLCTHV F/R프라이머를 사용한 PCR을 통해 TYLCTHV 감염이 성공적으로 확인되었다(도 2).
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 본 발명 분야의 통상의 기술자들은 동일한 기술적 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
Claims (7)
- 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 감염성 클론.
- 제1항에 있어서,
상기 클론은 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 pCAMBIA1303 벡터에 도입한 것인, 토마토황화잎말림태국바이러스의 감염성 클론. - 제1항에 있어서,
상기 클론은 토마토황화잎말림태국바이러스의 기주 범위 및 바이러스 특성을 규명시키는 것에 사용될 수 있는 것인, 토마토황화잎말림태국바이러스의 감염성 클론. - 제1항에 있어서,
상기 토마토황화잎말림태국바이러스는 수탁번호 MT108193로 표시되는 것인, 토마토황화잎말림태국바이러스의 감염성 클론. - 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 진단용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 토마토황화잎말림태국바이러스는 수탁번호 MT108193로 표시되는 것인, 토마토황화잎말림태국바이러스의 진단용 조성물. - 제5항 또는 제6항의 조성물을 포함하는 토마토황화잎말림태국바이러스(Tomato yellow leaf curl Thailand virus; TYLCTHV)의 진단 키트.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20210150490 | 2021-11-04 | ||
| KR1020210150490 | 2021-11-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230065884A true KR20230065884A (ko) | 2023-05-12 |
Family
ID=86385841
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220109554A KR20230065884A (ko) | 2021-11-04 | 2022-08-31 | 토마토황화잎말림태국바이러스를 접종할 수 있는 감염성 클론 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230065884A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130023217A (ko) | 2010-04-08 | 2013-03-07 | 데쿠세리아루즈 가부시키가이샤 | 보호 소자, 배터리 제어 장치 및 배터리 팩 |
-
2022
- 2022-08-31 KR KR1020220109554A patent/KR20230065884A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130023217A (ko) | 2010-04-08 | 2013-03-07 | 데쿠세리아루즈 가부시키가이샤 | 보호 소자, 배터리 제어 장치 및 배터리 팩 |
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