KR20230065116A - 신규한 김 유래 NtNDPK1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230065116A
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국립해양생물자원관
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Abstract

본 발명은 신규한 김 유래 NtNDPK1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 김 유래 NtNDPK1 유전자가 형질전환된 미세조류는 환경 스트레스 저항성 및 항산화능이 증가되어, 옥외 배양하기 불리한 조건에서도 수확량 및 바이오매스 생산 증대를 위해 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 김 유래 NtNDPK1 유전자 및 이의 용도{Novel NtNDPK1 gene from Neopyropia sp. and Uses Thereof}
본 발명은 신규한 김 유래 NtNDPK1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 화석연료의 사용증가로 인해 대기 중의 이산화탄소 농도가 증가하여, 지구온난화 등 환경 문제가 심각해지고 있다. 이로 인해 각 나라에서는 경제적이며, 친환경적인 바이오 연료 연구가 활발하게 진행 중이다. 바이오연료는 석유에너지의 대체연료로서 바이오디젤, 바이오에탄올 등이 있다. 바이오디젤은 조류의 지질과 콩, 유채 등의 농작물 그리고 동물성 유지에서 생산된다. 이 중에 미세조류를 이용한 바이오디젤이 농작물이나 동물성 유지에 비해 친환경적이고 경제적 지속성을 갖는 것으로 알려져 있다.
이러한 미세조류는 50마이크로미터 이하의 단세포 조류로 고등식물에 비해 성장속도가 빠르고 광합성을 통해 증식하므로 이산화탄소를 고정화하는 능력을 가지고 있으며 바이오디젤의 원료가 되는 오일을 생산한다. 미세조류는 곡식 경작이 어려운 지역에서도 배양이 가능하고 광합성 효율이 높아 단위 면적당 오일의 생산성이 우수하다. 오일 중에서 지방산의 함량이 바이오디젤의 특성을 결정하는데, 미세조류가 생산하는 지방산은 불포화 정도가 높아 어는점이 낮아 낮은 온도에서도 사용 가능하여 바이오디젤의 좋은 원료가 될 수 있다. 미세조류의 오일은 에스테르교환반응(transesterification)을 통해 바이오디젤로 전환되는데 에스테르교환반응은 산 또는 알카리 촉매하에서 트리글리세리드와 알콜을 결합시켜 지방산메틸에스터로 전환시키는 반응이며 이때 부산물로 글리세롤이 생성된다. 알콜로는 주로 메탄올을 사용하는데 다른 알콜은 경제성이 떨어진다.
지구의 수권에는 10만종에 달하는 미세조류가 존재하는 것으로 추정되고 있는데 1970년대 석유파동을 계기로 미세조류를 이용한 신재생에너지 생산연구가 시작되었다. 교토의정서 이후 각국은 지구온난화 주범인 이산화탄소저감과 탄소배출권 거래에 대비하여 미세조류 연구에 많은 투자를 하고 있다.
이중 클라미도모나스(Chlamydomonas)는 진핵생물로 담수 및 해수에 분포하는 단세포 녹조류(Chlorophyta)이며 증식속도가 다른 미세조류보다 빠르고 생리, 생화학적 연구가 많이 축적되어 있으며, 게놈 분석이 완료되어 유전자 재조합이 쉽게 가능하여 유용물질 생산을 위한 균주로 사용가능하다.
한편, 김(Neopyropia sp.)은 한국, 일본, 중국에서 재배되는 상업적으로 가치 있는 중요한 해양 홍조류 중 하나이다. 김은 썰물 동안 공기에 노출되어 80~95% 수분이 손실되었다가 밀물 때 수분이 보충되는 등 반복적이고 극단적인 스트레스 환경 조건에 노출되어 있다.
따라서, 김은 각종 스트레스 조건 하에서 생존을 위해 다양한 전략과 메커니즘을 보유하고 있을 것이라 예상할 수 있다.
이러한 상황하에서, 본 발명자들은 우수한 바이오매스의 고효율 생산을 위해 옥외 배양이 가능하도록 외부 환경에 저항성있는 미세조류를 개발하고자 예의 연구노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 김(Neopyropia tenera)으로부터 유래된 NDPK1 ( N ucleoside d i p hosphate k inase 1) 유전자(NtNDPK1)를 최초 동정하였고, 이를 도입시킨 미세조류는 고성장 미세조류 형질전환체로서 비생물학적 스트레스(특히, 산화 및 저온)에 대한 내성이 증가될 뿐만 아니라, 수확량(성장률) 및 바이오매스 생산성이 증가된다는 사실을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 NtNDPK1 유전자를 이용한 미세조류의 항산화능 및 환경 스트레스 저항성 증진 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 NtNDPK1 유전자를 이용한 미세조류의 수확량 증진 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 NtNDPK1 유전자를 이용한 미세조류의 바이오매스 생산성 증진 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 NtNDPK1 유전자를 이용하여 야생형에 비해 항산화능, 환경 스트레스 저항성, 수확량 및 바이오매스 함량이 증가된 형질전환 미세조류의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조되어 항산화능, 환경 스트레스 저항성, 수확량 및 바이오매스 함량이 증가된 형질전환 미세조류를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명은 상기 NtNDPK1 유전자를 포함하는 미세조류의 항산화능 및 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 NtNDPK1 유전자를 포함하는 미세조류의 수확량 및 바이오매스 함량 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환시켜 NtNDPK1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류의 항산화능 및 환경 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.
상기 NtNDPK1 유전자는, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 해양 홍조식물 김 속(Neopyropia sp.)에 속하는 임의의 것으로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는, Neopyropia tenera로부터 유래된 것이나, 이에 한정되지 않는다.
상기 NtNDPK1 유전자는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한 다유전자군(multigene family)으로 존재할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 NtNDPK1 단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드 및 이의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로, 예를 들면, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 미세조류의 항산화능, 환경 스트레스 저항성, 바이오매스와 생산성(수확량)을 증가시키는 활성을 의미한다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 서열번호 2의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 2의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다.
또한 상기 서열 동질성은 두개의 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두개의 폴리펩타이드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
본 발명에 있어서, 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 상기 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성방법에 따라 제조될 수 있으며, 바람직하게는 고체상 합성기술에 따라 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서 상기 환경 스트레스는 저온, 고온, 염 및 가뭄 스트레스로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는, 저온 스트레스이다.
본 명세서의 용어 "미세조류"는 광합성 색소를 가지고 광합성을 하는 단세포생물들에 대한 통칭으로, 화장품, 제약 산업 및 농식품업에서 이용될 수 있는 생물학적 활성을 갖는 화합물을 공급할 수 있는 잠재력을 가진 광범위한 군을 의미하며 대체 에너지원으로 사용될 수 있는 생물을 의미한다. 상기 미세조류는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 NtNDPK1 과발현에 의해 비생물학적 스트레스(예컨대, 산화 스트레스 및 저온 스트레스) 저항성, 생장 및 바이오매스 생산능이 촉진될 수 있는 미세조류는 모두 포함될 수 있으며, 그 예로 녹조류, 규조류, 남조류, 홍조류, 착편모조류 또는 와편모조류가 있다.
본 발명의 미세조류는 바람직하게는 클라미도모나스(Chlamydomonas) 속, 에틀리아(Ettlia) 속, 두날리엘라(Dunaliella) 속, 클로렐라(Chlorella) 속, 난노클로롭시스(Nannochloropsis) 속, 고렌키니아(Golenkinia) 속, 스피룰리나(Spirulina) 속, 사이클로텔라(Cyclotella) 속, 테트라셀미스(Tetraselmis) 속, 모노라피디엄(Monoraphidium) 속, 보트리오코커스(Botryococcus) 속, 스티코쿠스(Stichococcus) 속, 해마토코커스(Haematococcus) 속, 패오닥틸룸(Phaeodactylum) 속, 이소크리시스(Isochrysis) 속, 니츠쉬아(Nitzschia) 속, 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) 속, 크루코커스(Chroococcus) 속, 채토세로스(Chaetoceros) 속, 아크난테스(Achnanthes) 속 및 엠포라(Amphora) 속으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 클라미도모나스 속 미세조류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 클라미도모나스 속은 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)이나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 클라미도모나스 속 미세조류를 이용할 수 있다.
즉, 본 발명에서는 NtNDPK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미세조류에 형질전환하여 제작된 고성장 미세조류 형질전환체의 바이오매스 및 수확량(성장률)이 야생형에 비해 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 NtNDPK1을 이용한 형질전환 미세조류는 동일한 바이오매스에서 보다 많은 양의 바이오디젤을 생산할 뿐만 아니라, 옥외 배양과 같이 불리한 환경 조건에서도 야생형에 비해 높은 바이오매스 증가량을 보여줌으로써 궁극적으로 높은 바이오디젤 생산성을 나타내기 때문에, 본 발명의 NtNDPK1는 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1 (Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환시켜 NtNDPK1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류의 수확량 또는 바이오매스 생산성 증진 방법을 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 NtNDPK1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
NtNDPK1 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, SWPA2 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환시켜 NtNDPK1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 항산화능, 환경 스트레스 저항성, 수확량 및 바이오매스 함량이 증가된 형질전환 미세조류의 제조 방법; 및 상기 방법에 의해 제조된, 항산화능, 환경 스트레스 저항성, 수확량(고성장) 및 바이오매스 함량이 증가된 형질전환 미세조류를 제공한다.
본 발명의 방법에 따라 형질전환된 NtNDPK1 과발현 미세조류는 10 내지 25℃에서 배양될 수 있으며, 특히, 15℃와 같은 저온 상태에서도 우수한 기능을 나타내므로 옥외 배양에도 적합하다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 미세조류의 항산화능 및 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 미세조류의 수확량 및 바이오매스 함량 증진용 조성물을 제공한다.
상기 조성물들은 유효성분으로 김 유래 NtNDPK1 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 목적 대상인 미세조류에 형질전환시킴으로써 미세조류의 항산화능, 환경 스트레스 저항성, 수확량 및 바이오매스 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 조성물들은 상기 NtNDPK1를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 김 유래 NtNDPK1 유전자가 형질전환된 미세조류는 환경 스트레스 저항성 및 항산화능이 증가된 특징이 있고, 이러한 미세조류는 옥외 배양하기 불리한 조건에서도 수확량 및 바이오매스 생산 증대를 위해 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a은 H2O2 농도별 처리에 따른 김(Neopyropia tenera thallus) 단포자 방출 결과를 보여준다. 도 1b는 산화 스트레스에 대해 선별된 유전자인 김 유래 NtNDPK1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 보여준다.
도 2a는 김에서의 산화 스트레스에 대한 NtNDPK1 유전자 발현 수준을 보여준다. 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험의 평균+표준편차(SD)로 나타냈다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001). 도 2b는 NDPK1을 넉아웃시킨 애기장대(Arabidopsis thaliana)에 NtNDPK1를 과발현시킨 형질전환체에서의 산화 스트레스에 의한 생리적 분석 결과를 보여준다.
도 3a는 본 발명의 NtNDPK1 과발현 미세조류 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii) 형질전환체 생산을 위한 벡터 맵을 보여준다. 도 3b는 야생형(CC278) 및 NtNDPK1 과발현 미세조류 클라미도모나스 형질전환체(NtNDPK1)의 게놈 PCR 분석 결과를 보여준다. 도 3c는 정량적 실시간 PCR에 의한 NtNDPK1 과발현 형질전환 미세조류에서 NtNDPK1의 발현 수준을 보여준다. 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험의 평균+표준 편차(SD)로 나타냈다(*, p < 0.05). 도 3d는 항-EGFP를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의한 NtNDPK1 과발현 형질전환 미세조류에서 NtNDPK1의 발현 수준을 보여준다. M, 마커; WT, 야생형(CC278 균주); NtNDPK1; 형질전환 미세조류.
도 4는 야생형 미세조류 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii)에서의 산화 스트레스에 의한 생리학적 반응을 보여준다. 다른 문자는 유의한 통계적 차이를 나타낸다(P = 0.05).
도 5는 NtNDPK1이 과발현된 형질전환체 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii)에서의 산화 스트레스에 의한 생리학적 반응을 보여준다.
도 6a 내지 6d는 NtNDPK1이 과발현된 형질전환체 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii)의 저온 스트레스 10℃(도 6a), 15℃(도 6b), 20℃(도 6c) 및 25℃(도 6d)에 의한 생리학적 반응을 보여준다. 도 6e는 WT(CC278)과 NtNDPK1의 생장 표현형을 비교한 결과를 보여준다. 도 6f는 대한민국 4대강의 5년간 평균 수온을 보여준다.
도 7a(0 mM H2O2 조건) 및 7b(1 mM H2O2 조건)는 NtNDPK1이 과발현된 형질전환체 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii)에서의 바이오매스 생산성을 보여준다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 김-유래 NDPK1 유전자의 선별
본 발명자들은 해양홍조류의 생장조절 관련 유전자를 개발하기 위하여, 해양홍조류인 김(Neopyropia tenera)에 산화스트레스를 일으키는 H2O2를 농도별로 처리한 후, 김 단포자 방출 시기별 발현 유전체를 분석하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 0.25 mM H2O2 농도에서 스트레스 자극에 의해 단포자를 발생시키는 것을 확인하였다. 더 높은 농도에서는 단포자가 발생하지 않았으며, 이는 높은 스트레스 조건으로 인해 김 세포가 활성을 잃었거나 죽은 것으로 판단된다.
이러한 분석을 바탕으로, 산화적 처리 후 발현이 급격하게 증가되는 유전자들 중에서 해양홍조류의 생장에 관련된 고발현 유전자로서 NtNDPK1을 선별하였다. 상기 NtNDPK1 유전자의 염기서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)은 도 1b에 나타내었다.
실시예 2. NtNDPK1 의 비생물학적 스트레스 저항성 확인
본 발명자들은, NtNDPK1에 의한 비생물학적 스트레스 저항성을 규명하기 위하여, 김 엽체를 대상으로 0.25 mM의 H2O2를 시간별(0, 1, 6, 12, 24 시간)로 처리한 후 NtNDPK1 유전자 발현 수준을 qPCR로 확인하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, NtNDPK1 유전자의 발현 수준이 현저하게 증가하였고, 이는 NtNDPK1 유전자가 산화적 스트레스에 반응하는 유전자임을 의미한다.
따라서, 김 식물체의 NtNDPK1 유전자가 산화 스트레스 조건에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 확인할 수 있다.
또한, 본 발명자들은, 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 대상으로 NtNDPK1를 과발현시킨 형질전환체를 제작하여 기능을 분석하였다.
간략하게는 다음과 같다:
먼저, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 Arabidopsis NDPK1이 넉아웃(knockout)된 ndpk1 돌연변이체(mutant)를 TAIR(The Arabidopsis Information Resource)로부터 분양 받아, 상기 ndpk1 돌연변이체에 NtNDPK1을 삽입하여 NtNDPK1를 과발현하는 형질전환체 애기장대를 제작하였다. NtNDPK1 발현양 분석을 통해 NtNDPK1-고발현 형질전환체들(NtNDPK1-OX1 내지 NtNDPK1-OX5)임을 확인한 후, 산화 스트레스 저항성을 확인하기 위해, H2O2를 처리하여 스트레스 물질인 MDA(과산화지질) 함량을 조사하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 대조군인 ndpk1 돌연변이체에 비해, NtNDPK1이 삽입된 형질전환체(NtNDPK1-OX1 내지 NtNDPK1-OX5)에서 MDA의 함량이 전반적으로 낮게 나왔다. 즉, NtNDPK1이 삽입된 형질전환체에서 외부 스트레스에 대한 지질과산화 정도가 ndpk1 돌연변이체에 비해 낮음을 의미한다.
이는, NtNDPK1의 발현을 통해 스트레스에 대한 저항성이 증가되어 스트레스에 대처하는 능력이 회복된 것으로 해석될 수 있다.
실시예 3. NtNDPK1 과발현 형질전환체 생산
본 발명자들은 상기 실시예 1 및 2에서 선별된 본 발명의 NtNDPK1 유전자의 기능을 검증하기 위하여, 미세조류 모델인 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)를 대상으로 NtNDPK1가 과발현된 형질전환체를 제작하였다(도 3a 및 3b).
간략하게는 다음과 같다:
김(Neopyropia tenera)은 해조류 특성에 따라 핵산 추출시 끈적임이 심하고 색소가 함께 회수되는 경우가 있다. 이러한 불순물을 제거하기 위하여 RNA 회수시 70% EtOH를 추가하여 세척하였다. pOpt-Clover-Hyg 벡터는 제한효소자리(Multi cloning site)가 제한적이며 NdeI-BglII-AatII(CATATGAGATCTGACGTC) 3 종이 연속되어 있다. NtNDPK1의 클로닝을 위한 프라이머 제작시 -5'방향에 NdeI(CATATG) 앞쪽 방향에 추가서열(additional sequence)로 3 염기를 두고, -3'방향에 BglII(AGATCT) 뒤쪽으로 3 염기를 삽입하여 제한효소를 이용하여 절단 시 효율을 높였다. NtNDPK1은 해조류의 특성상 GC 함량이 높아 PCR mixture 제조 시 10% DMSO를 추가하여 PCR을 수행하였다. 이어서, -5'NdeI과 -3'BglII로 절단하여 준비된 NtNDPK1과 pOpt-Clover-Hyg 벡터를 라이게이션하여 컨스트럭션(NtNDPK1::pOpt-Clover-Hyg)을 완성하였다.
이를 클라미도모나스(Chlamydomonas)에 형질전환하기 위하여 CC278을 TAP 배지에 접종하여 25℃에서 연속광(continuous light, 50-70 μmol photons m-2 s-1) 하에서 100 rpm으로 배양하였다. 현미경과 hemocytometer를 이용하여 세포의 밀도를 측정하면서 OD750에서 0.3-0.5까지 도달할 때까지 배양하였다. 튜브에 5 x 105 cells을 원심분리기(2,000g, 3분, 상온)를 이용하여 수확하였다. 상등액을 버린 후 TAP sucrose 용액 250 ㎕를 넣고 파이펫팅하였다. NtNDPK1::pOpt-Clover-Hyg 컨스트럭션 플라즈미드 DNA를 NtNDPK1 내에 없는 제한효소를 이용하여 선형으로 만든 후, 1-2 ㎍으로 분취(aliquot)하여 준비하였다. TAP sucrose에 클라미도모나스를 혼탁시킨 용액과 준비된 선형의 플라즈미드를 포함하여 총 250 ㎕가 되도록 하여 전기천공 큐벳(electroporation cuvette)으로 옮겨 상온에서 5분간 방치하였다. 전기천공 장치(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 600 V, 50 μF capacity, infinity resistance 조건에서 충격을 준 후 파이펫팅하고 750 ㎕의 TAP sucrose 용액을 넣어서 최종 1 ㎖을 만들었다. 15 ㎖ 튜브에 형질전환 mixture를 옮기고 4 ㎖의 TOP-agar를 넣고 25 ㎎/㎖ 하이그로마이신(Hygromycin)이 들어간 1.5% TAP agar 플레이트에 도말하였다. 28℃의 연속광 하에서 콜로니가 보일 때까지 인큐베이션하였다.
그 결과, 도 3c 및 3d에 나타낸 바와 같이, NtNDPK1 유전자 발현 수준(도 3c) 및 단백질 발현 수준(도 3d)을 분석했을 때, 발현 수준이 현저한 것을 확인하였다.
실시예 4. NtNDPK1 과발현 형질전환체의 산화스트레스 저항성 확인
본 발명자들은 상기 실시예 3에서 제작된 NtNDPK1 유전자가 과발현된 형질전환체 미세조류의 산화스트레스 저항성을 확인하기 위하여, 야생형(WT, CC278) 및 NtNDPK1 형질전환체를 대상으로 산화 스트레스를 농도별로 처리하여 배양한 후 세포수를 측정하였다.
간략하게는 다음과 같다: 야생형(WT, CC278) 및 NtNDPK1 형질전환체 line을 신선한 TAP 배지에서 OD750에서 0.8~1.0까지 배양한다. 충분히 자란 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 스펙트로포토미터(Spectrophotometer)에서 OD750에서 세포수를 측정한 후, 104 cells/㎖로 정량 하였다. 50 ㎖의 T-flask에 신선한 TAP 배지와 0 mM H2O2 또는 1 mM H2O2, 마지막으로 세포수를 측정한 미세조류 세포들을 넣어 총 25 ㎖이 되도록 준비하였다. 실험의 정확성을 위해 각 실험당 3 반복을 수행하였다. 시간별(0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 168, 192. 216, 240 시간)로 배양 후 OD750에서 세포수를 측정하였다.
한편, 미세조류 모델인 야생형 클라미도모나스(Chlamydomonas reinhardtii)를 대상으로 산화 스트레스 처리 후 발현 변화를 분석한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 실제 클라미도모나스(Chlamydomonas)에 0~1 mM의 농도로 H2O2를 처리했을 때 ROS에 의한 지질과산화 정도가 상당히 증가하여 데미지가 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 기반으로 H2O2 조건을 0 내지 1mM으로 설정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 야생형(WT, CC278) 및 본 발명의 NtNDPK1 형질전환체의 생장률을 비교했을 때, 야생형보다 본 발명의 NtNDPK1 형질전환체의 생장률이 현저하게 높았다.
또한, 산화 스트레스에 대해서도 야생형보다 저항성이 더 높게 나타나는 것을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과들은 미세조류에서 NtNDPK1 유전자의 과발현이 산화 스트레스에 대한 저항성 및 생장속도를 증가시킨다는 것을 입증한다.
실시예 5. NtNDPK1 과발현 형질전환체의 저온 스트레스 저항성 확인
고농도로 배양된 미세조류는 여타의 작물에 비하여 단위 면적당 생산량 수율에서 압도적인 우위를 나타내는데, 일반 바이오 오일 생산용 작물들과 비교하여 빠른 속도로 바이오매스를 생산할 수 있다.
그러나, 우리나라와 같이 넓은 경작지의 확보가 어렵고, 사계절을 갖고 있어 기후도 바이오디젤용 작물 생산에 최적이 아닌 입지에서는, 대부분이 옥외의 필드(field) 생산이 아니라 실내의 반응기(bioreactor)에서 배양기술적 엔지니어링을 통하여 미세조류를 생산하고 있다.
따라서, 바이오매스의 옥외 생산을 위해서는 사계절의 기온차가 있는 외부 환경에 저항성이 있어 옥외 배양이 가능하도록 최적화된 미세조류의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 NtNDPK1 유전자의 저온 스트레스 내성 기능이 미세조류의 옥외 대량배양시에 효율적으로 활용 가능한지를 규명하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제작된 본 발명의 NtNDPK1 유전자가 과발현된 형질전환체인 미세조류를 다양한 수온 조건하에서 배양하였다.
이때, 상기 수온 변화 조건은 대한민국 4대강의 5년간 평균 수온 DB를 통해 약 3℃ 내지 28℃ 정도의 범위에서 수온이 변화되는 것을 확인하였고(도 6f), 이를 바탕으로 10℃, 15℃, 20℃ 및 25℃ 조건으로 적용하였다.
간략하게는 다음과 같다: 야생형(WT, CC278) 및 NtNDPK1 형질전환체 line을 신선한 TAP 배지에서 OD750에서 0.8~1.0까지 배양하였다. 충분히 자란 클라미도모나스를 스펙트로포토미터에서 OD750에서 세포수를 측정한 후, 104 cells/㎖로 정량 하였다. 50 ㎖의 T-flask에 신선한 TAP 배양액에 세포수를 측정한 미세조류 세포들을 넣어 총 25 ㎖이 되도록 준비하였다. 실험의 정확성을 위해 각 실험당 3 반복을 수행하였다. 배양기의 아래층부터 각 층마다 온도를 10℃, 15℃, 20℃, 25℃로 설정한 후 각 플라스크를 넣고 배양하여 시간별(0, 24, 48, 72시간)로 OD750에서 세포수를 측정하였다.
그 결과, 도 6a 내지 6d에 나타낸 바와 같이, 야생형(WT) 및 NtNDPK1 형질전환체를 대상으로 저온 스트레스((A) 10℃, (B) 15℃, (c) 20℃, (D) 25℃)를 주었을 때, 야생형보다 본 발명의 NtNDPK1 형질전환체의 생장률이 현저하게 높았다.
또한, 저온 스트레스에 대해서도 야생형보다 저항성이 더 높게 나타나는 것을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과들은 미세조류에서 NtNDPK1 유전자의 과발현이 저온 스트레스에 대한 저항성 및 생장속도를 증가시켜 옥외 대량 배양을 달성할 수 있음을 입증한다.
실시예 6. NtNDPK1 과발현 형질전환체의 바이오매스 생산성 증대 확인
본 발명자들은 NtNDPK1 과발현 형질전환체인 미세조류의 바이오매스 생산성 증대 효과를 규명하기 위하여, 바이오매스 생산성을 확인하였다.
간략하게는 다음과 같다: 신선한 TPA 배지에서 배양된 클라미도모나스(Chlamydomonas) 야생형(CC278)을 OD750에서 1.0이상으로 충분히 배양하였다. 본 실험에 사용하는 2.0 ㎖ 튜브는 60℃ 건조기에서 30분 이상 방치한 후, 데시케이터에서 여분의 수분 함량을 최대한 제거하여 준비하였다. 2.0 ㎖ 튜브를 미세저울에서 무게를 측정하여 기록하였다. 클라미도모나스(Chlamydomonas) 배양액을 OD750에서 2개의 농도에서 세포수를 측정하였다. 2.0 ㎖ 튜브에 클라미도모나스(Chlamydomonas) 배양액 2.0 ㎖을 넣고 12,000 rpm, 상온에서 1분간 원심분리하여 상등액을 최대한 제거하였다. 클라미도모나스(Chlamydomonas) 펠렛만 남은 2.0 ㎖에 뚜껑을 연 후, 파라필름으로 가볍게 밀봉하고 주사바늘로 3 군데 구멍을 내고 미세조류 펠렛을 동결건조기에서 overnight에 걸쳐 건조하였다. 동결건조가 충분히 완료된 후, 미세저울에서 튜브와 펠렛의 무게를 측정하고 튜브 무게를 빼서 펠렛 만의 무게를 계산하였다. 이를 이용하여 OD750에서 세포수를 측정한 값으로 바이오매스 양을 측정하였다.
그 결과, 도 7a(0 mM H2O2 조건) 및 7b(1 mM H2O2 조건)에 나타낸 바와 같이, 야생형(WT) 및 NtNDPK1 형질전환체 미세조류를 배양했을 때, 야생형보다 본 발명의 NtNDPK1 형질전환체가 우수한 바이오매스 생산성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로, 이러한 결과들은 본 발명의 NtNDPK1 유전자가 야생형에 비해서 생산성이 높았으며 산화 스트레스 뿐만 아니라 저온 스트레스에 대한 내성을 통해 미세조류 고성장을 촉진시키며, 이를 이용하여 옥외배양시 더 높은 바이오매스 생산성을 성취할 수 있다.
<110> National Marine Biodiversity Institute of Korea <120> Novel NtNDPK1 gene from Neopyropia sp. and Uses Thereof <130> NMBI1-11p-1 <150> KR 10-2021-0150338 <151> 2021-11-04 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 453 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> NtNDPK1 <400> 1 atggagcgca ccttcatcgc ggtcaagcct gatggcgtgc agcggggtct cgtcggcgcc 60 atcattgggc gctttgaggc caagggctac aagctcctcg ccctcaaggc gctggtgccg 120 tccaaggagc tcgcgtcgga gcactacgag gcgctctcgt ccaagccctt ctatgccggc 180 ctcgtcgact ttatctgcag cgggcctgtc gtggccatgg tgtggggcgg gggggatgtg 240 gtcaaggccg gccgcacgat gattggcgag acgagcccga cggcgtctgc gccgggcagc 300 attcgggggg actatggggt ggaggttggc cgcaacgttg tgcacggcag cgacgcagtg 360 gagacggcgg agcgggagat caagctgtgg tttggggacg agggggtcat ggagtgggag 420 agctcgctca acaagtgggt gtatgaggac tag 453 <210> 2 <211> 150 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> NtNDPK1 <400> 2 Met Glu Arg Thr Phe Ile Ala Val Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly 1 5 10 15 Leu Val Gly Ala Ile Ile Gly Arg Phe Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Lys Ala Leu Val Pro Ser Lys Glu Leu Ala Ser Glu His 35 40 45 Tyr Glu Ala Leu Ser Ser Lys Pro Phe Tyr Ala Gly Leu Val Asp Phe 50 55 60 Ile Cys Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Gly Gly Gly Asp Val 65 70 75 80 Val Lys Ala Gly Arg Thr Met Ile Gly Glu Thr Ser Pro Thr Ala Ser 85 90 95 Ala Pro Gly Ser Ile Arg Gly Asp Tyr Gly Val Glu Val Gly Arg Asn 100 105 110 Val Val His Gly Ser Asp Ala Val Glu Thr Ala Glu Arg Glu Ile Lys 115 120 125 Leu Trp Phe Gly Asp Glu Gly Val Met Glu Trp Glu Ser Ser Leu Asn 130 135 140 Lys Trp Val Tyr Glu Asp 145 150

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환시켜 NtNDPK1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류의 항산화능 및 환경 스트레스 저항성 증진 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 NtNDPK1 유전자는 김(Neopyropia sp.)으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 환경 스트레스는 저온, 고온, 염 및 가뭄 스트레스로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 클라미도모나스(Chlamydomonas) 속, 에틀리아(Ettlia) 속, 두날리엘라(Dunaliella) 속, 클로렐라(Chlorella) 속, 난노클로롭시스(Nannochloropsis) 속, 고렌키니아(Golenkinia) 속, 스피룰리나(Spirulina) 속, 사이클로텔라(Cyclotella) 속, 테트라셀미스(Tetraselmis) 속, 모노라피디엄(Monoraphidium) 속, 보트리오코커스(Botryococcus) 속, 스티코쿠스(Stichococcus) 속, 해마토코커스(Haematococcus) 속, 패오닥틸룸(Phaeodactylum) 속, 이소크리시스(Isochrysis) 속, 니츠쉬아(Nitzschia) 속, 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) 속, 크루코커스(Chroococcus) 속, 채토세로스(Chaetoceros) 속, 아크난테스(Achnanthes) 속 및 엠포라(Amphora) 속으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 클라미도모나스 속은 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환시켜 NtNDPK1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류의 수확량 증진 방법.
  7. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환시켜 NtNDPK1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 미세조류의 바이오매스 생산성 증진 방법.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 미세조류를 형질전환시켜 NtNDPK1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 항산화능, 환경 스트레스 저항성, 수확량 및 바이오매스 함량이 증가된 형질전환 미세조류의 제조 방법.
  9. 제8항의 방법에 의해 제조된 형질전환 미세조류.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 형질전환 미세조류는 10 내지 25℃에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 미세조류.
  11. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1)를 포함하는, 미세조류의 항산화능 및 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물.
  12. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 NtNDPK1(Neopyropia tenera nucleoside diphosphate kinase 1)를 포함하는, 미세조류의 수확량 및 바이오매스 함량 증진용 조성물.
KR1020210182121A 2021-11-04 2021-12-17 신규한 김 유래 NtNDPK1 유전자 및 이의 용도 KR20230065116A (ko)

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