KR20230063836A - Hla-b*5801 대립유전자 검출용 핵산 분자 및 이를 이용한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HLA-B*5801 대립유전자 검출용 핵산 분자, 이를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 검출용 PCR 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 서열 특이성이 높은 프라이머 및 이중 프로브를 이용하여 우수한 특이도 및 민감도로 HLA-B*5801 대립유전자를 검출할 수 있다.
Description
본 발명은 HLA-B*5801 대립유전자 검출용 핵산 분자, 이를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 검출용 PCR 조성물 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 서열 특이성이 높은 프라이머 및 이중 프로브를 이용하여 우수한 특이도 및 민감도로 HLA-B*5801 대립유전자를 검출할 수 있다.
고단백, 고칼로리 음식의 섭취, 음주량 증가 및 활동량 감소 등 생활 습관의 급격한 변화로 인해 고요산혈증(hyperuricemia) 및 이에 따른 통풍 환자가 증가하는 추세이다. 연구에 따르면, 통풍은 퓨린(purine) 물질 대사 장애로 인해 발생하며, 요산 배설이 잘 되지 않거나 요산이 너무 많이 생성되어 요산이 과다하게 축적되면서(고요산혈증) 요산 결정을 생성하여 발생한다. 이들 결정은 관절의 연골, 인대 및 주변 조직에 주로 침착되며 염증반응을 촉발하는 것으로 알려져 있으며, 특히 이때 동반되는 극심한 통증으로 인해 통풍은 환자의 삶의 질을 심각하게 저해한다.
통풍의 치료는 기본적으로 식이 조절과 약제 처방으로 이루어진다. 1차 약제로 많이 사용되는 알로푸리놀(allopurinol)은 통풍에 대한 치료 효과가 높아 오랜 기간 동안 치료 임상 분야에 사용되어 왔으나, 심한 경우 생명을 위협할 수 있는 중증피부약물이상반응(severe cutaneous adverse reactions, SCARs)과 같은 부작용이 있어 사용에 매우 유의해야 한다.
알로푸리놀 약물의 이상 반응 유무는 환자의 HLA-B*5801 유전자 보유 여부와 높은 상관성이 있음이 보고되고 있어, 안전한 알로푸리놀 처방에 있어 정확하고 간편한 HLA-B*5801 유전자 검사가 요구되고 있다. 특히, 한국인, 중국인, 일본인 및 태국인 등을 포함한 동아시아인의 HLA-B*5801의 보유 비율은 약 8~13% 정도로, 1~6% 수준인 서양인 대비 높게 나타나 알로푸리놀 약물에 대한 이상반응의 발생 가능성이 높으므로, 이러한 검사가 더 절실한 상황이다.
본 발명자들은 서열 특이성이 높은 프라이머 및 프로브를 디자인하였으며, 이들 프라이머 및 이중 프로브를 이용하여 우수한 특이도 및 민감도로 HLA-B*5801 대립유전자를 검출할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 발명의 목적은 HLA-B*5801 대립유전자를 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 이를 통해 알로푸리놀 약물 처방 전에 중증피부약물이상반응의 가능성을 효과적으로 판단함으로써 안전한 처방이 이루어질 수 있도록 할 수 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 서열번호 3의 염기서열로부터 선택된 연속된 15 NT 이상의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머; 및 서열번호 17의 염기서열로부터 선택된 연속된 15 NT 이상의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 제공한다.
여기서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프라이머는 서열번호2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 일실시예는 전술한 프라이머 세트에 의해 증폭된 HLA-B*5801 대립유전자 증폭산물과 특이적으로 결합하며, 서열번호 7의 염기서열로부터 선택된 연속된 20 NT 이상의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 제1 프로브; 및 서열번호 12의 염기서열로부터 선택된 연속된 20 NT 이상의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 제2 프로브;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 프로브 세트를 제공한다.
여기서, 상기 상기 제1 프로브는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프로브는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프로브는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프로브는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
제 1 프로브 및 제2 프로브는 용융온도(melting temperature, Tm)는 제1프라이머 및 제2프라이머의 용융 온도보다 높은 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 및 제2 프로브는 탐지 가능한 표지 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 및 제2 프로브는 서로 다른 표지 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 표지 물질은 형광 물질이고, 상기 제1 및 제2 프로브는 ??처(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 표지 물질은 FAM, HEX, ROX, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, IABkFQ, fluorescene, TAMRA, Texas Red, JOE, Oregon green, rhodamine, coumarin, pyrene, TET, BODIPY, Cal, Yakima Yellow, Redmond Red, Pulsar, Quasar 및 IAbRQSp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지 물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 ??처는 SFCQ-1, Dabcyl, BHQ-0, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ-650, QSY21, QSY 35, QSY 7, QSY 9, Eclipse, ElleQuencher, Iowa Black, 및 MGB 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 ??처인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 일실시예는 전술한 HLA-B*5801 대립유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트; 및 전술한 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 프로브 세트를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 조성물을 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 일실시예는 전술한 HLA-B*5801 대립유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 이용하여 시료 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지 방법을 제공한다.
여기서, 상기 증폭단계에는 하우스키핑 유전자 중 하나 이상을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 중합효소연쇄반응용 대조구 프라이머 세트를 추가로 포함하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 검출단계는 전술한 프로브 세트를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트 및 프로브 세트와 이를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법은 HLA-B*5801 대립유전자의 존재 여부를 중합효소연쇄반응를 이용하여 높은 민감도와 특이도로 신속하게 결정할 수 있도록 한다. 이는 특히 알로푸리놀(allopurinol) 복용으로 인한 통풍 또는 고요산혈증 환자의 중증 피부 이상반응 가능성을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 이 외에도, 본 발명은 상기 대립유전자와 상관성이 높은 질병, 약물 반응 등이 있다면 이를 예측하고 관련 증상을 예방하고 치료하는 데에도 이용될 수 있을 것이다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 프라이머 및 제1프라이머로 사용될 수 있는 게놈영역 핵산 서열과 이의 HLA-B*5801 대립유전자 및 상기 대립유전자와 동일 게놈위치 상에 존재하는 여러 다른 대립유전자와의 상동성을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1프로브 및 제1프로브로 사용될 수 있는 게놈영역 핵산 서열과 이의 HLA-B*5801 대립유전자 및 상기 대립유전자와 동일 게놈위치 상에 존재하는 여러 다른 대립유전자와의 상동성을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2프로브 및 제2프로브로 사용될 수 있는 게놈영역 핵산 서열과 각각에 대하여 HLA-B*5801 대립유전자 및 상기 대립유전자와 동일 게놈위치 상에 존재하는 여러 다른 대립유전자와의 상동성을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 제2프라이머 및 제2프라이머로 사용될 수 있는 게놈영역 핵산 서열과 각각에 대하여 HLA-B*5801 대립유전자 및 상기 대립유전자와 동일 게놈위치 상에 존재하는 여러 다른 대립유전자와의 상동성을 분석한 결과이다.
도 5는 본 별명의 실시예에 따른 제1프라이머, 제1프로브, 제2프로브 및 제2프라이머 범위서열 위치를 HLA-B*5801 대립유전자의 CDS(Coding DNA sequence) 상의 위치와 대비하여 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1프로브 및 제1프로브로 사용될 수 있는 게놈영역 핵산 서열과 이의 HLA-B*5801 대립유전자 및 상기 대립유전자와 동일 게놈위치 상에 존재하는 여러 다른 대립유전자와의 상동성을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 제2프로브 및 제2프로브로 사용될 수 있는 게놈영역 핵산 서열과 각각에 대하여 HLA-B*5801 대립유전자 및 상기 대립유전자와 동일 게놈위치 상에 존재하는 여러 다른 대립유전자와의 상동성을 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 제2프라이머 및 제2프라이머로 사용될 수 있는 게놈영역 핵산 서열과 각각에 대하여 HLA-B*5801 대립유전자 및 상기 대립유전자와 동일 게놈위치 상에 존재하는 여러 다른 대립유전자와의 상동성을 분석한 결과이다.
도 5는 본 별명의 실시예에 따른 제1프라이머, 제1프로브, 제2프로브 및 제2프라이머 범위서열 위치를 HLA-B*5801 대립유전자의 CDS(Coding DNA sequence) 상의 위치와 대비하여 분석한 결과이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 상에서 사용되는 용어 “핵산 단편”은 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 단편을 의미하며, 본 발명의 프라이머와 프로브가 이러한 핵산 단편을 포함하는 물질이다. 이들 핵산 단편의 길이는 뉴클레오타이드(nucleotide)의 잔기 수(이하 NT)로 표현될 수 있다. 상기 핵산 단편은 두 개의 말단(end)을 가지며, 각 말단은 노출된 말단 뉴클레오타이드 잔기의 인산기 위치에 따라 5'-말단 또는 3'-말단으로 불린다.
본 명세서 상에서 “프라이머” (primer) 및 “프로브” (probe)는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하며, 이에 따라 시료 핵산에 표적 서열이 존재하는 경우 표적 서열에 특이적으로 결합(annealing)할 수 있다.
핵산 중합 반응에서, 시료의 핵산 분자에 결합된 프라이머의 3'-말단에 상기 핵산 분자에 상보적인 뉴클레오티드가 중합되며 상기 프라이머가 연장된다. 중합효소연쇄반응으로 시료 핵산 내 증폭하고자 하는 구간이 있는 경우, 해당 구간의 양 끝 또는 이들과 바로 인접한 부분의 서로 상보적인 가닥에 각각 결합할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하게 된다.
프로브는 표적 서열에 결합할 수 있는 핵산 분자로서, 일반적으로 특정 검출 시스템에 의해 검출될 수 있는 표지 물질(reporter molecule)로 표지(label)되어, 표적 서열을 포함하는 핵산 분자의 존재 및/또는 양을 검출할 수 있도록 제조된다. 상기 표지 물질은 예컨대 효소, 형광(fluorescent) 물질, 방사성(radioactive) 물질, 발광성(luminescent) 물질 등일 수 있다.
사용 목적에 따라 상기 프라이머의 서열이 표적 서열과 완전히 상보적이지 않을 수 있으나, 본 발명의 프라이머 및 프로브는 몇 개의 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism)을 포함하는 대립유전자를 높은 특이도와 민감도로 검출하기 위해 이용되므로, 100% 상보성을 가지도록 디자인되었다. 프라이머 및 프로브의 길이는 용융 온도(melting temperature, Tm), GC 비율(GC content), 말단 조성, 한 반응 튜브 내에 들어가는 프라이머 및 프로브 서로 간의 서열 상보성 및 Tm 차이 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 일반적으로 15 NT 내지 30 NT 수준으로 디자인된다. 이러한 변수를 고려한 프라이머 및 프로브 디자인에 관해서는 당업계의 기술자에게 알려져 있으므로, 자세한 내용은 생략한다.
본 명세서 상의 “대립유전자” (allele)는 염색체 상 동일한 좌위(locus)에 위치하며, 서로 다른 특정 형질을 나타내는 대립인자의 DNA 서열을 의미한다. 이배체(diploid)의 상동염색체는 동형접합체(homozygote)와 이형접합체(heterozygote)일 수 있다. HLA-B*5801 대립유전자의 경우, 동형접합체인 경우와 이형접합체인 경우 모두 알로푸리놀에 의한 이상반응을 나타내는 것으로 보고되어 있다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일측면은 서열번호 3의 염기서열로부터 선택된 연속된 15 NT 이상의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머; 및 서열번호 17의 염기서열로부터 선택된 연속된 15 NT 이상의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 바람직하게 17 NT 이상일 수 있다.
여기서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프라이머는 서열번호2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일측면은 전술한 프라이머 세트에 의해 증폭된 HLA-B*5801 대립유전자 증폭산물과 특이적으로 결합하며, 서열번호 7의 염기서열로부터 선택된 연속된 20 NT 이상의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 제1 프로브; 및 서열번호 12의 염기서열로부터 선택된 연속된 20 NT 이상의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 제2 프로브;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 프로브 세트를 제공한다. 상기 제1 프로브 및 제2 프로브는 바람직하게 25 NT 이상일 수 있다.
여기서, 상기 제1 프로브는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프로브는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프로브는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프로브는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제2프라이머 범위서열과 제2프로브 범위서열은 도5에서 보이는 바와 같이 겹쳐 있으나, 디자인 및 선정 시 제2 프라이머 및 제2 프로브의 서열이 서로 겹치지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 프로브 및 제2 프로브는 용융온도(melting temperature, Tm)는 제1프라이머 및 제2프라이머의 용융 온도보다 높은 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1 및 제2 프로브는 탐지 가능한 표지 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 프로브의 5' 말단, 3' 말단, 또는 중간에 연결될 수 있으며, 이는 직접 또는 링커를 통해 결합되는 것일 수 있다.
상기 제1 및 제2 프로브는 서로 다른 표지 물질을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 표지 물질은 형광 물질이고, 상기 제1 및 제2프로브는 ??처(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
??처(quencher)는 형광 강도를 낮추는 물질로서, FRET(Foerster resonance energy transfer), 정적 ??칭(static quenching) 등 다양한 기작을 통해 일어날 수 있는 것으로 알려져 있으며, ??칭(quenching) 대상과의 거리가 가까워야 그 효과를 낼 수 있다. 예컨대 상기 표지 물질은 상기 프로브의 한쪽말단에 연결되고, 상기 ??처(quencher)는 나머지 말단에 연결된 것일 수 있으며, 이 때 상기 프로브가 표적서열에 결합하면서 2차구조를 형성하기 어려워질 수 있고, 따라서 상기 표지 물질과 ??처 사이 거리가 멀어질 수 있으며, 이로서 형광신호가 검출가능해질 수 있다. 구체적인 기작 및 적합한 형광 물질-??처 쌍을 선택하는 방법에 대해서는 Johansson (Methods Mol Biol, 2006;335:17-29)과 같은 다양한 문헌에서 다루고 있으므로, 이에 대한 설명은 생략한다.
상기 표지 물질은 형광 물질인 FAM, HEX, ROX, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, IABkFQ, fluorescene, TAMRA, Texas Red, JOE, Oregon green, rhodamine, coumarin, pyrene, TET, BODIPY, Cal, Yakima Yellow, Redmond Red, Pulsar, Quasar 및 IAbRQSp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 ??처는 SFCQ-1, Dabcyl, BHQ-0, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ-650, QSY21, QSY 35, QSY 7, QSY 9, Eclipse, ElleQuencher, Iowa Black, 및 MGB 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 ??처일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일측면은 전술한 HLA-B*5801 대립유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트; 및 전술한 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 프로브 세트를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 전술한 HLA-B*5801 대립유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 이용하여 시료 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지 방법을 제공한다.
여기서, 상기 증폭단계는 하우스키핑 유전자 중 하나 이상을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 중합효소연쇄반응용 대조구 프라이머 세트를 추가로 포함하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)는 세포 생존에 필수불가결한 유전자로 세포 종류나 환경에 따른 발현량의 변동이 적으며, 다형성 빈도가 낮아 중합효소연쇄반응을 통한 핵산 검출 시 안정적인 검출이 가능한 것으로 알려져 있다. 대조구 프라이머 세트는 일반적으로 핵산 추출부터 증폭까지, 전 과정이 제대로 실험이 되었는지 확인할 수 있는 내부 대조군(internal control, IC) 결과를 낼 수 있도록 하여 실험상 신뢰도를 높이기 위해 사용된다.
상기 검출단계는 전술한 프로브 세트를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 후술할 실시예에서는 HLA-B*5801 대립유전자 서열에 각각 특이적인 프라이머 및 2종의 프로브를 이용하고, 특히 상기 프로브가 서로 다른 표지 물질을 포함하는 경우, 각 표지 물질에 의한 신호 모두 양성을 나타내어야 HLA-B*5801 대립유전자를 보유하는 것으로 판정되도록 함으로써, 높은 민감도와 특이도를 가질 수 있음을 확인하였다.
<실시예 1. HLA-B*5801 대립 유전자 검출용 프라이머 및 프로브 디자인>
HLA-B*5801 대립유전자 검출에 핵심적인 시퀀스를 도출하기 위해서 IPD-IMGT/HLA 데이터베이스의 3450 (2021-07-12) 버전의 자료를 사용하였다. 총 8464 개의 HLA-B 유전자 시퀀스 데이터를 BWA 프로그램을 사용하여 alignment를 수행하고, HLA-B*5801 대립유전자와 다른 HLA-B 대립유전자 간의 차이가 검출되는 부분을 도출하여 총 4군데 주요 범위서열 위치를 확인하였다.
이러한 과정으로 도출된 주요 서열 위치를 포함하는 HLA-B*5801 대립 유전자 서열 특이적인 프라이머 및 프로브를 디자인하였으며, 이들 서열 및 범위 서열과 각 HLA-B 대립유전자 서열을 정렬하여 비교한 결과가 도 1 내지 도 5와 같다.
디자인된 프라이머 및 프로브 세트 #1 내지 #4의 서열은 순서대로 표 1 내지 표 4와 같았으며, 각 프라이머 및 프로브의 범위서열의 예시는 표 5와 같았다.
| 영역 | 이름 | 서열 (5'>3') |
| 1 | 제1프라이머 | GCGAGTCCGA GGACGGA |
| 2 | 제1프로브 | FAM-CGGGGAGACA CGGAACATGA AGGCCTC- SFCQ1 |
| 3 | 제2프로브 | HEX-GCAGCCATAC ATCCTCTGGA TGATGTGAGA-SFCQ1 |
| 4 | 제2프라이머 | GCGCCCGTCG GGCCCCAG |
| 영역 | 이름 | 서열 (5'>3') |
| 1 | 제1프라이머 | GCGAGTCCGA GGACGGA |
| 2 | 제1프로브 | FAM-CGGGGAGACA CGGAACATGA AGGCCTC- SFCQ1 |
| 3-1 | 제2프로브-1 | HEX-CATACATCCT CTGGATGATG TGAGAC- SFCQ1 |
| 4-1 | 제2프라이머-1 | TCGGGCCCCA GGTCGCAG |
| 영역 | 이름 | 서열 (5'>3') |
| 1-1 | 제1프라이머-1 | AGTCCGAGGA CGGAGCCC |
| 2-1 | 제1프로브-1 | FAM-CGGGGAGACA CGGAACATGA AGGCCTCCGC GC-SFCQ1 |
| 3-2 | 제2프로브-2 | HEX-AGGTCGCAGC CATACATCCT CTGGATGATG TG- SFCQ1 |
| 4-2 | 제2프라이머-2 | GGAGGAGGCG CCCGTCG |
| 영역 | 이름 | 서열 (5'>3') |
| 1-1 | 제1프라이머-1 | AGTCCGAGGA CGGAGCCC |
| 2-2 | 제1프로브-2 | FAM-TGGGACGGGG AGACACGGAA CATGAAGGCC TC-SFCQ1 |
| 3-3 | 제2프로브-3 | HEX-ATACATCCTC TGGATGATGT GAGACCCGG-SFCQ1 |
| 4-3 | 제2프라이머-3 | GGGCCCCAGGTCGCAGC |
| 영역 | 이름 | 서열 (5'>3') |
| 1 | 제1프라이머 범위서열 | GCGAGTCCGA GGACGGAGCC C |
| 2 | 제1프로브 범위서열 | TGGGACGGGG AGACACGGAA CATGAAGGCC TCCGCGC |
| 3 | 제2프로브 범위서열 | AGGTCGCAGC CATACATCCT CTGGATGATG TGAGACCCGG |
| 4 | 제2프라이머 범위서열 | GGAGGAGGCG CCCGTCGGGC CCCAGGTCGC AGC |
본 실시예에서는 하우스키핑 유전자 중 GADPH 유전자를 선택하여, 이를 기준으로 서열 특이적으로 내부 참조용 프라이머 및 프로브를 하기 표 6과 같이 디자인하였다.
| 영역 | 이름 | 서열 (5'>3') |
| 1 | GAPDH제1프라이머 | CATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA |
| 2 | GAPDH프로브 | CY5-ATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGGTGAGGA- SFCQ2 |
| 3 | GAPDH 제2 프라이머 | CTTGGCCAGGGGTGCTAAGC |
본 명세서의 서열번호는 하기 표 7과 같다.
| 서열 번호 |
이름 | 서열 (5'>3') |
| 1 | 제1프라이머 | GCGAGTCCGA GGACGGA |
| 2 | 제1프라이머-1 | AGTCCGAGGA CGGAGCCC |
| 3 | 제1프라이머 범위서열 | GCGAGTCCGA GGACGGAGCC C |
| 4 | 제1프로브 | CGGGGAGACA CGGAACATGA AGGCCTC |
| 5 | 제1프로브-1 | CGGGGAGACA CGGAACATGA AGGCCTCCGC GC |
| 6 | 제1프로브-2 | TGGGACGGGG AGACACGGAA CATGAAGGCC TC |
| 7 | 제1프로브 범위서열 | TGGGACGGGG AGACACGGAA CATGAAGGCC TCCGCGC |
| 8 | 제2프로브 | GCAGCCATAC ATCCTCTGGA TGATGTGAGA |
| 9 | 제2프로브-1 | CATACATCCT CTGGATGATG TGAGAC |
| 10 | 제2프로브-2 | AGGTCGCAGC CATACATCCT CTGGATGATG TG |
| 11 | 제2프로브-3 | ATACATCCTC TGGATGATGT GAGACCCGG |
| 12 | 제2프로브 범위서열 | AGGTCGCAGC CATACATCCT CTGGATGATG TGAGACCCGG |
| 13 | 제2프라이머 | GCGCCCGTCG GGCCCCAG |
| 14 | 제2프라이머-1 | TCGGGCCCCA GGTCGCAG |
| 15 | 제2프라이머-2 | GGAGGAGGCG CCCGTCG |
| 16 | 제2프라이머-3 | GGGCCCCAGGTCGCAGC |
| 17 | 제2프라이머 범위서열 | GGAGGAGGCG CCCGTCGGGC CCCAGGTCGC AGC |
| 18 | GAPDH 제1 프라이머 | CATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA |
| 19 | GAPDH 프로브 | ATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGGTGAGGA |
| 20 | GAPDH 제2 프라이머 | CTTGGCCAGGGGTGCTAAGC |
<실시예 2. HLA-B*5801 대립유전자 검출 반응 및 분석>
HLA-B*5801 대립유전자를 검출하기 위하여, 차세대 염기서열 분석 (NGS, Next Generation Sequencing) 방법으로 이미 HLA-B 유전자형이 밝혀진 샘플을 사용하였다.
HLA-B*5801 대립유전자를 검출하기 위하여, 실시예 1에 따른 HLA-B*5801 및 내부 참조 유전자 서열 특이적 프라이머 및 형광프로브를 핵산 시료와 혼합하여 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 기기에서 증폭하였다. 상기 반응을 위한 조성은 표8과 같았으며, PCR 반응 조건은 표9와 같이 하여 진행하였다.
| 성분 | 1회 반응 조건 |
| PCR 주형 (ng/reaction) | 20 |
| qPCR 2x Master Mix (ul) | 10 |
| 제1 프라이머 그룹 중 택 1(nM/reaction) | 500 |
| 제2 프라이머 그룹 중 택 1(nM/reaction) | 500 |
| 제1 프로브 그룹 중 택1(nM/reaction) | 250 |
| 제2 프로브 그룹 중 택1(nM/reaction) | 250 |
| GAPDH 제1프라이머 (nM/reaction) | 500 |
| GAPDH 제2 프라이머(nM/reaction) | 500 |
| GAPDH 프로브 (nM/reaction) | 250 |
| Total volume (ul) | 20 |
| 온도 | 시간 | Cycle |
| 50 °C | 10 min | 1 |
| 95 °C | 10 min | 1 |
| 95 °C | 15 sec | 40 |
| 65 °C*형광검출 | 1 min |
이때, 내부 참조 유전자 형광은 실시간 중합효소연쇄반응이 안정적으로 이루어졌음을 보여주는 지표이므로 내부 참조 유전자의 증폭 곡선이 검출되며, 2개의 HLA-B*5801 대립유전자 증폭 곡선이 각 형광 프로브에서 동시에 검출되어야만 HLA-B*5801 대립 유전자를 가지고 있는 것으로 판별하였다.
좀더 상세하게, 본 발명의 실시예 1에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 HLA-B*5801 검출 시 판정 기준은 표 10과 같이, FAM 형광 신호, HEX 형광 신호 각각이 모두 기준치(threshold) 이상으로 검출될 시 HLA-B*5801 대립 유전자를 가지고 있는 것으로 판별하였다.
| 이름 | 형광 검출 유무 |
| 제1프로브 | + |
| 제2프로브 | + |
| 내부 참조 유전자 | +/- * |
* 상기 표10에서 내부 참조 유전자 결과는 이의 검출용 프라이머 및 프로브를 포함한 샘플 및 포함하지 않은 샘플의 형광 신호를 대비하여 도출한 값을 의미한다.
이미 HLA-B 유전자형을 알고 있는 핵산 시료에 대하여 HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 내지 #4를 각각 이용하여 HLA-B의 대립유전자를 분석한 결과는 하기 표11및 표12와 같았다. 표 11및 표 12의 그래프에서 파란색은 제1프로브에 의한 FAM 신호, 초록색은 제2프로브에 의한 HEX 신호, 붉은색은 내부 참조 유전자에 대한 프로브에 의한 CY5 신호이며, 이는 이하 RT-PCR 결과 RFU-Cycle 그래프에서 모두 공통적이다.
| B*58:01 양음성 유무 |
프로브 검출 판정 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
| 양성 | 제1; 검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #3 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #4 | ||
 |
 |
||
| 양성 | 제1; 검출 제2; 검출 IC; 검출 |
HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
 |
 |
||
| HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #3 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #4 | ||
 |
 |
||
| 양성 | 제1; 검출 제2; 검출 IC; 검출 |
HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
 |
 |
||
| HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #3 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #4 | ||
 |
 |
||
| 음성 | 제1; 미검출 제2; 미검출 IC; 검출 |
HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
 |
 |
||
| HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #3 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #4 | ||
 |
 |
||
| 음성 | 제1; 미검출 제2; 미검출 IC; 검출 |
HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
 |
 |
||
| HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #3 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #4 | ||
 |
 |
||
| 음성 | 제1; 미검출 제2; 검출 IC; 검출 |
HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
 |
 |
||
| HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #3 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #4 | ||
 |
 |
| 유전자형 | 프로브 검출 판정 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
| B*58:01 Homo |
제1; 검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| B*58:01/ B*51:01 hetero |
제1; 검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| B*35:01 / B*59:01 hetero |
제1; 미검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| B*15:01 / B*35:02 hetero |
제1; 미검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| B*35:03/ B*40:01 hetero |
제1; 미검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| B*35:01/ B*35:03 hetero |
제1; 미검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
표 13에서는 실시예 1에 따른 프라이머 #1 및 프로브 세트 #2를 이용한 검출 결과를 더욱 상세하게 나타내었다. 프라이머 및 프로브 중 일부 또는 전부가 일치하는 경우 검출 형광 신호가 어떻게 달라지는지 확인할 수 있다.
| HLA-B*5101 (제1 프라이머만 일치) | |||
| 유전자형 | 프로브 검출 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #1 | HLA-B*5801 서열 특이적 프라이머 및 프로브 세트 #2 |
| 결과 | 검출 판정 | B*5101/B*3701 hetero | B*5101/B*6701 hetero |
| B*58:01 아님. |
제1; 미검출 제2; 미검출 IC; 검출 |
 |
 |
| HLA-B*3501 (제1 프라이머, 제2 프라이머, 제2 프로브 일치) | |||
| 결과 | 프로브 검출 판정 | B*3501/B*4002 hetero | B*3501/B*5401 hetero |
| B*58:01 아님 |
제1; 미검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| 결과 | 프로브 검출 판정 | B*3501/B*5502 hetero | B*3501 homo |
| B*58:01 아님 |
제1; 미검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
| HLA-B*1502 (제2 프로브만 일치) | |||
| 결과 | 프로브 검출 판정 | B*1502/B*1507 hetero | B*1502/B*4402 hetero |
| B*58:01 아님. |
제1; 미검출 제2; 미검출 IC; 검출 |
 |
 |
| HLA-B*5801 (제1 프라이머, 제1 프로브, 제2 프라이머, 제2 프로브 일치) | |||
| 결과 | 프로브 검출 판정 | B*58:01 Homo | B*58:01 hetero |
| B*58:01 | 제1; 검출 제2; 검출 IC; 검출 |
 |
 |
본 발명의 실시예에 따른 HLA-B*5801 대립유전자 분석 결과를 모두 종합한 결과 하기 표14와 같았으며, HLA-B*5801를 보유한 경우 모두 양성으로 판정되어 위음성은 나타나지 않았으며, HLA-B*5801를 보유하지 않은 경우 모두 음성으로 판정되어 위음성은 나타나지 않았다.
|
|
HLA-B*5801 양성 | HLA-B*5801 음성 | |
| 테스트 결과 | HLA-B*5801 양성 | 54 | 0 |
| HLA-B*5801 음성 | 0 | 416 | |
표14의 결과를 이용하여 민감도, 특이도, 양성 예측도 및 음성 예측도를 분석한 결과 각각 모두 100%로 나타나, 본 발명의 일실시예에 따른 HLA-B*5801 대립유전자 분석 방법은 높은 민감도와 특이도를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
| % | 95% CI | |
| 민감도 | 100 | 93.40% to 100.00% |
| 특이도 | 100 | 99.12% to 100.00% |
| 양성 예측도 | 100 | - |
| 음성 예측도 | 100 | - |
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> LABGENOMICS CO.,LTD.
<120> NUCLEIC ACID MOLECUES FOR DETECTING HLA-B*5801 ALLELE AND METHODS
USING THE SAME
<130> P20220151KR
<150> KR 10/2021/0148602
<151> 2021-11-02
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer1
<400> 1
gcgagtccga ggacgga 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer1
<400> 2
agtccgagga cggagccc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer1 range
<400> 3
gcgagtccga ggacggagcc c 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe1
<400> 4
cggggagaca cggaacatga aggcctc 27
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe1
<400> 5
cggggagaca cggaacatga aggcctccgc gc 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe1
<400> 6
tgggacgggg agacacggaa catgaaggcc tc 32
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe1 range
<400> 7
tgggacgggg agacacggaa catgaaggcc tccgcgc 37
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe2
<400> 8
gcagccatac atcctctgga tgatgtgaga 30
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe2
<400> 9
catacatcct ctggatgatg tgagac 26
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe2
<400> 10
aggtcgcagc catacatcct ctggatgatg tg 32
<210> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe2
<400> 11
atacatcctc tggatgatgt gagacccgg 29
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe2 range
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aggtcgcagc catacatcct ctggatgatg tgagacccgg 40
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer2
<400> 13
gcgcccgtcg ggccccag 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer2
<400> 14
tcgggcccca ggtcgcag 18
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer2
<400> 15
ggaggaggcg cccgtcg 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer2
<400> 16
gggccccagg tcgcagc 17
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer2 range
<400> 17
ggaggaggcg cccgtcgggc cccaggtcgc agc 33
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control primer1
<400> 18
catgttcgtc atgggtgtga acca 24
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control probe
<400> 19
atgacaacag cctcaagatc atcaggtgag ga 32
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control primer2
<400> 20
cttggccagg ggtgctaagc 20
Claims (20)
- 서열번호 3의 염기서열로부터 선택된 연속된 15 NT 이상의 염기서열로 이루어진 제1 프라이머; 및 서열번호 17의 염기서열로부터 선택된 연속된 15 NT 이상의 염기서열로 이루어진 제2 프라이머;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자의 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 프라이머는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 프라이머는 서열번호2의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 제1항의 프라이머 세트에 의해 증폭된 HLA-B*5801 대립유전자 증폭산물과 특이적으로 결합하며, 서열번호 7의 염기서열로부터 선택된 연속된 20 NT 이상의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 제1 프로브; 및 서열번호 12의 염기서열로부터 선택된 연속된 20 NT 이상의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 제2 프로브;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 프로브 세트.
- 제6항에 있어서,
상기 제1 프로브는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제6항에 있어서,
상기 제1 프로브는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제6항에 있어서,
상기 제1 프로브는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제6항에 있어서,
상기 제1 프로브는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 제2 프로브는 서열번호11의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제6항에 있어서,
상기 제1 프로브 및 제2 프로브는 용융온도(melting temperature, Tm)는 제1항의 제1프라이머 및 제2프라이머의 용융 온도보다 높은 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제6항에 있어서,
상기 제1 및 제2 프로브는 탐지 가능한 표지 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제12항에 있어서,
상기 제1 및 제2 프로브는 서로 다른 표지 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제12항에 있어서,
상기 표지 물질은 형광 물질이고,
상기 제1 및 제2 프로브는 ??처(quencher)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제12항에 있어서,
상기 표지 물질은 FAM, HEX, ROX, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, IABkFQ, fluorescene, TAMRA, Texas Red, JOE, Oregon green, rhodamine, coumarin, pyrene, TET, BODIPY, Cal, Yakima Yellow, Redmond Red, Pulsar, Quasar 및 IAbRQSp로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지 물질인 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제14항에 있어서,
상기 ??처는 SFCQ-1, Dabcyl, BHQ-0, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ-650, QSY21, QSY 35, QSY 7, QSY 9, Eclipse, ElleQuencher, Iowa Black, 및 MGB 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 ??처인 것을 특징으로 하는, 프로브 세트.
- 제1항의 프라이머 세트; 및 제6항의 프로브 세트를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지용 조성물.
- 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 시료 핵산을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭산물을 검출하는 단계;를 포함하는 HLA-B*5801 대립유전자 탐지 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 증폭단계는 하우스키핑 유전자 중 하나 이상을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 중합효소연쇄반응용 대조구 프라이머 세트를 추가로 포함하여 수행하는 것을 특징으로 하는, HLA-B*5801 대립유전자 탐지 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 검출단계는 제6항의 프로브 세트를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, HLA-B*5801 대립유전자 탐지 방법.
Priority Applications (1)
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020220058511A KR20230063836A (ko) | 2021-11-02 | 2022-05-12 | Hla-b*5801 대립유전자 검출용 핵산 분자 및 이를 이용한 방법 |
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2022
- 2022-05-12 KR KR1020220058511A patent/KR20230063836A/ko unknown
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