KR20230061387A - 발효 브로스로부터 소포제를 제거하는 방법 - Google Patents

발효 브로스로부터 소포제를 제거하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 방법은 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 발효 브로스를 여과하는 단계, 및 그렇게 함으로써 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계를 포함하며, 여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다. 본 발명은 추가로 상기 방법을 포함하는 발효 브로스로부터 대상 분자를 정제하는 공정에 관한 것이다.

Description

발효 브로스로부터 소포제를 제거하는 방법
본 발명은 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 발효 브로스를 여과하는 단계, 및 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 적어도 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계를 포함하며, 여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다. 본 발명은 추가로 상기 방법을 포함하는 발효 브로스로부터 대상 분자를 정제하는 공정에 관한 것이다.
산업적 발효에서, 배양 동안 발효 브로스의 원치 않는 발포는 종종 발효 브로스에 소포제의 첨가에 의해 감소되거나 방지된다. 원치 않는 발포를 감소시키기 위해 필요하지만, 소포제는 발효 공정에서 생산된 대상 분자를 정제하기 위한 다운스트림 공정을 방해하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 소포제의 효율적인 제거가 바람직하다. 특히, 소포제는 정밀여과 및 한외여과 멤브레인을 포함하는 여과 멤브레인의 파울링 (fouling), 및 멤브레인 통과 플럭스의 감소와 같은 후속 여과 단계에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 잔류 소포제는 최종 제품 제형의 혼탁을 야기할 수 있고, 최종 제품의 명시된 요건을 충족시키지 않는 물질의 역할을 할 수 있다. 전체적으로, 소포제의 비효율적인 제거는 최종 제품의 품질 저하를 초래할 수 있다.
US 4,931,397 은 열 불안정성 대상 분자를 생산하는 미생물 발효 브로스의 가공 동안 소포제를 제거하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 발효 브로스에 대한 광물 점토의 첨가 및 생성된 점토/소포제 복합체를 분리하기 위한 후속적인 고체/액체 분리 기술을 포함한다. 그러나, 광물 점토의 첨가 및 이의 제거는 노동 집약적이고 부가적인 비용을 수반하는 것으로 보인다. 대상 분자에 따라, 대상 분자 또는 그 일부의 원치 않는 복합체화가 발생할 수 있기 때문에 광물 점토 첨가는 문제가 될 수 있다.
소포제를 제거하는 통상적 방법은 소포제를 제거하기 위해 발효 브로스를 약 60 ℃ 의 온도로 가열하는 것을 필요로 한다. 그러나, 대상 분자에 따라 발효 브로스를 약 60 ℃ 의 온도로 가열하는 것은 바람직하지 않을 수 있다. 특히, 열 불안정성 효소 및/또는 다른 열 불안정성 분자의 생산을 위한 발효 브로스와 관련하여 대상 분자가 손상될 수 있고 그 기능을 (부분적으로) 상실할 수 있기 때문에 약 60 ℃ 의 온도는 문제가 될 수 있다.
WO2010/043520 A1 은 소포제의 운점보다 위의 온도에서 정밀여과에 의해 하이드로포빈을 발현하는 효모 세포 배양물로부터 소포제를 제거하는 것을 개시한다. 적용된 온도는 소포제의 운점보다 위로 약 25 ℃, 즉 약 50 ℃ 이다. 열 불안정성 대상 분자, 예컨대 효소의 생산에서, 통상적으로 대상 분자를 손상시키거나 그 기능을 부여할 수 있기 때문에 약 50 ℃ 의 온도는 너무 높다.
그러므로, 종래 기술의 단점 및 문제점을 극복하고 열 불안정성 대상 분자를 생산하는 발효 브로스에 특히 적합한, 발효 브로스으로부터 소포제를 제거하는 신규한 방법이 요망된다.
본 발명의 근본적인 기술적 과제는 상기에서 언급한 필요성을 충족시키기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것으로 볼 수 있다. 이것은 하기의 청구항 및 본원에서 특징지어지는 구현예에 의해 해결될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 상기 발효 브로스를 여과하는 단계; 및
(b) 그렇게 함으로써 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계, 바람직하게는 그렇게 함으로써 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 단계,
여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다.
따라서, 바람직하게는, 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법은 하기 단계를 포함한다
(a) 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 상기 발효 브로스를 여과함으로써 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계; 및
(b) 그렇게 함으로써 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 단계,
여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다.
본 발명에 따른 방법에서 사용되는 소포제는 폴리알킬렌 글리콜 (PAG) 계 소포제이다. 본 발명의 방법에 적합한 소포제는 운점이 15 ℃ 내지 40 ℃ 범위, 바람직하게는 20 ℃ 내지 35 ℃ 범위, 더욱 바람직하게는 25 ℃ 내지 30 ℃ 범위일 수 있다.
적합한 (PAG) 계 소포제가 당해 기술분야에서, 예를 들어 Junker, Biotechnol. Prog., 2007, Vol. 23, 767-784 에서 알려져 있다. 바람직하게는, 소포제는 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 예컨대 Polyglycol P-2000 (Dow), Pluriol® P2000 (BASF), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 Pluracol E (BASF), PEG Typ 300 (Carl Roth); 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 예컨대 Struktol® J 647 (Schill+Seilacher), KFOTM 673 (DyStar), UCONTM LB-625 (Dow), KFOTM 402 (DyStar), 에틸렌/프로필렌 옥사이드 블록 공중합체, 예컨대 Pluronic® PE6100 (BASF), Pluronic® PE10100 (BASF), Pluronic® PE3100 (BASF), Pluronic® PE8100 (BASF), Pluronic® F68 (BASF), EO/PO 블록 공중합체계 폴리알코올, 예컨대 Struktol® J 650 (Schill+Seilacher), 알콕시화된 지방산 에스테르, 예컨대 Strukol® J 673 (Schill+Seilacher), 폴리프로필렌-폴리에틸렌 글리콜 공중합체 (PPG-PEG), 이의 혼합물 및 유도체, 및 다른 비-이온성 계면활성제 소포제로부터 선택된다. "이의 유도체" 는, 예를 들어 상술된 것, 특히 PAG 유도체의 에테르 및/또는 공중합체, 예컨대 Disfoam GD (Nihon Yushi/BASF); PAG-계 폴리에테르 예컨대 Breox FMT30 (Intl. Specialty Chemicals/Cognis); PPG-계 폴리에테르 분산물 예컨대 Antifoam 204 (Sigma); 알킬 폴리(알킬렌 글리콜) 에테르 블렌드 Bioquest 1110/1120a (Baker Hughes) 를 포함하며, 바람직하게는 이들을 지칭한다. "이의 혼합물" 은, 바람직하게는, 예를 들어 상술된 것의 블렌드 예를 들어 PAG-계 블렌드 예컨대 Antifoam 289, 286 (Sigma), VP1133 (Wacker-Chemie); XFO-371 (Ivanhoe); Sag 5693, 5698 (Union Carbide, OSI specialities) 을 포함하며, 바람직하게는 이들을 지칭한다. 더욱 바람직하게는, 소포제는 PPG, PEG, PAG, 에틸렌/프로필렌 옥사이드 블록 공중합체, EO/PO 블록 공중합체계 폴리알코올, 알콕시화된 지방산 에스테르, PPG-PEG, 또는 임의의 상술된 것의 혼합물 및/또는 유도체이다. 여전히 더욱 바람직하게는, 소포제는 PPG, PEG, PAG, 에틸렌/프로필렌 옥사이드 블록 공중합체, EO/PO 블록 공중합체계 폴리알코올, 알콕시화된 지방산 에스테르, 또는 PPG-PEG 이다. 가장 바람직하게는, 소포제는 PPG, PEG, PAG, 또는 PPG-PEG 이다.
바람직하게는, 소포제는 평균 몰 질량이 500 내지 5000 g/mol 범위, 더욱 바람직하게는 1000 내지 3000 g/mol 범위, 여전히 더욱 바람직하게는 약 2000 g/mol, 가장 바람직하게는 2000 g/mol 이다. 특히 바람직한 소포제는 평균 몰 질량이 500 내지 5000 g/mol 범위, 더욱 바람직하게는 1000 내지 3000 g/mol 범위, 여전히 더욱 바람직하게는 약 2000 g/mol, 가장 바람직하게는 2000 g/mol 인 PPG, 예를 들어 평균 몰 질량이 대략 2000 g/mol 인 Pluriol® P2000 (BASF) 이다.
대안적으로, 실리콘계 오일 및/또는 실리콘계 에멀전을 포함하는 소포제가 사용될 수 있다. 전형적으로, 이는 폴리(디메틸실록산)을 다양한 양, 예를 들어 10 % 내지 100 % (v/v) 로 포함한다. 이의 전형적인 예는 Sag M-10 (Dow Corning); Sag 471 (Union Carbide); DC-A, A (Dow Corning); Antifoam A (농축물) (Sigma); Mazu DF100, DF1005 (Noveon, Mazur); FD 101 (Stepan); Q7-2243 LVA (Dow Corning); C100F (Basildon); S184 (Wacker Chemie); Q10-335 (Dow Corning); TMA812 (Toshiba); Antaphron NM40 (UK); Biospumex FDA 165K (Cognis); KM-70, M-7W-0 (Shinetsu Kogaku); Mazu DF 210, 210 S, 2105 (Mazur/Basf/Noveon); 1510 (Dow Corning); 1520 (Dow Corning); AF (Dow Corning); C (Dow Corning) DC-B (Dow Corning); FG-10 (Dow Corning); DSP (Dow Corning); RD (Dow Corning); M30 (Dow Corning); Q7-2587 (Dow Corning); Hodag FD-62 (Lambent); Hodag FD-82 K (Lambent); A (A-5758) (Sigma); B (Sigma, JT Baker); C (Sigma); Chemax DF-10 (Rutgers); Chemax DF-30 (Rutgers); SE15 (Sigma); SE9 (Wacker Chemie); Sag 10 (Union Carbide); Sag 30 (Union Carbide); Silcolapse 5001 (ACC/Rhodia); Silcolapse 5000 (ICI/Ambersil/Rhodia); GE 60 (GE); Roth 0865 (Carlroth.de); PD30 (Basildon); RS-70426 (Rhodia); 1705-W (Lion); Assaff III (Rhone-Poulenc) 을 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법을 포함하는 발효 브로스로부터 대상 분자를 정제하는 공정에 관한 것이다.
다르게 언급되지 않으면, 본원에서 사용되는 용어는 통상의 기술자에 의한 관습적 사용법에 따라 이해되어야 한다.
본 명세서에서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 바와 같은, 단수형 "하나" 및 "한" 은 문맥이 명백히 다르게 명시하지 않으면 당해 복수형을 또한 포함한다. 따라서, "하나" 또는 "한" 은 그것이 사용되는 문맥에 따라 하나 이상을 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포" 의 언급은 적어도 하나의 세포가 이용될 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "약" 및 "대략" 은 통상의 기술자가 문제의 특색의 기술적 효과를 여전히 보장하는 것으로 이해할 정확도의 간격을 의미한다. 이 용어는 전형적으로 명시된 수치로부터 ±20 %, 바람직하게는 ±15 %, 더욱 바람직하게는 ±10 %, 및 더욱더 바람직하게는 ±5 % 의 편차를 나타낸다.
용어 "포함하는" 은 제한적이지 않은 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 목적을 위해 용어 "이루어지는" 은 용어 "포함하는" 의 바람직한 구현예인 것으로 여겨진다. 이하에서 그룹이 적어도 특정한 수의 구현예를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 또한 바람직하게는 이들 구현예로만 이루어지는 그룹을 포함하는 것을 의미한다.
게다가, 명세서 및 청구범위에서 용어 "제 1", "제 2", "제 3" 또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)" 등은 유사한 요소들을 구별하기 위해 사용되며, 반드시 순차적 또는 시간적 순서를 설명하기 위한 것은 아니다. 그렇게 사용되는 용어는 적절한 상황 하에 호환가능하고, 본원에서 기재된 본 발명의 구현예는 본원에서 기재되거나 예시된 것과 다른 순서로 작업될 수 있다고 이해될 것이다. 용어 "제 1", "제 2", "제 3" 또는 "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", "i", "ii" 등이 방법 또는 사용 또는 분석의 단계와 관련되는 경우에, 본원에서 상기 또는 하기와 같이 다르게 명시되지 않으면, 단계 사이에 시간 또는 시간 간격 일관성이 없으며, 즉, 단계는 동시에 수행될 수 있거나 또는 이러한 단계 사이에 초, 분, 시간, 일, 주, 월 또는 심지어 년의 시간 간격이 있을 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 설명된 특정 방법, 프로토콜, 시약 등이 변할 수 있으므로 이들에 제한되지 않는다고 이해되어야 한다. 또한 본 출원에서 사용되는 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구항에 의해서만 한정될 것이라는 것이 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명자들은 놀랍게도 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 것이 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 여과에 의해 달성될 수 있다는 것을 발견했다. 바람직하게는 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위는 20 ℃ 내지 45 ℃ 범위 내의 온도를 지칭한다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 대상 분자를 발효 브로스로부터 정제하는 공정에서 이용될 수 있는 다운스트림 공정에 관한 것이다. "다운스트림 공정" 은 발효 브로스의 배양 후에, 예를 들어 대상 분자의 미리 정해진 또는 바람직한 역가에 도달되었을 때 수행되는 방법 또는 방법 단계로서 이해될 수 있다.
용어 "회수" 또는 "정제" 는 호환되게 사용될 수 있으며 "더욱 순수하게 만드는 것" 을 의미하기 위한 것이다. 그들은 대상 분자가 발효 브로스에 존재하는 다른 화합물 또는 세포로부터 분리되는 공정을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상 분자의 역가" 는 발효 브로스의 리터 단위의 부피 당 대상 분자의 g 단위의 양 또는 발효 브로스의 ㎏ 당 대상 분자의 g 으로서 이해된다. 발효 공정의 마지막에, 예를 들어 수확 시간에 대상 분자의 역가는 2 내지 100 g 분자 / ㎏ 발효 브로스에 도달할 수 있다. 바람직하게는, 수확 시간에 대상 분자의 역가는 최대 60 g 산물 / ㎏ 발효 브로스에 도달한다. 더욱 바람직하게는, 수확 시간에 대상 분자의 역가는 5 내지 30 g 산물 / ㎏ 발효 브로스에 도달하며, 더욱 바람직하게는 수확 시간에 대상 분자의 역가는 8 내지 20 g 산물 / ㎏ 발효 브로스에 도달한다. 용어 "수확 시간" 은 특히 발효 마지막, 더욱 특히 대상 분자의 미리 정해진 또는 바람직한 역가, 예컨대 2 내지 100 g 대상 분자 / ㎏ 발효 브로스에 도달되었을 때의 시점을 지칭할 수 있다. 더욱더 특히 수확 시간은 본 발명에 따른 방법의 단계 (a) 전의 시점을 지칭한다.
이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 발효 브로스의 온도를 소포제의 운점보다 위의 온도로 선택하는 것은 소포제의 응집을 초래하는 소포제의 상 전이를 이용하는 것으로 생각된다. 그 후 소포제는 여과 또는 심지어 다른 분리 수단 예컨대 침강 또는 원심분리에 의해, 바람직하게는 본원의 다른 곳에서 더 상세히 설명되는 바와 같은 여과에 의해 분리될 수 있다.
바람직하게는 소포제의 운점 (CP) 보다 위의 온도에서 일어날 수 있는, 발효 공정 동안 이미 소포제의 상 분리가 일어날 수 있다고 여겨진다. 그러나, 발효 브로스는 통상적으로 현탁액이므로, 상 분리는 결과 없이 유지될 수 있다. 다운스트림 가공 동안 소포제의 일부는 바이오매스 위로 부착될 수 있고 그와 함꼐 분리될 수 있으나, 소포제의 또다른 일부는 가용화될 수 있고 따라서 추가의 다운스트림 가공 단계로 의도치 않게 전달될 수 있다. 다운스트림 가공 동안 정밀여과 또는 한외여과 멤브레인의 파울링 또는 높은 수준의 소포제의 다른 원치 않는 효과를 피하기 위해 적절한 제거가 필요하다.
그러므로, 본 발명은 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
(a) 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 상기 발효 브로스를 여과하는 단계; 및
(b) 그렇게 함으로써 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계, 바람직하게는 그렇게 함으로써 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 단계,
여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다.
용어 "소포제" 는 발효 과정 동안, 특히 세포를 배양할 때, 거품의 형성을 억제하거나 거품의 양을 감소시킬 수 있는 화학 분자를 의미한다. 본 발명에 따른 전형적인 소포제는, 바람직하게는 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌/프로필렌 옥사이드 블록 공중합체, EO/PO 블록 공중합체계 폴리알코올, 알콕시화된 지방산 에스테르, 폴리프로필렌-폴리에틸렌 글리콜 공중합체 (PPG-PEG), 이의 혼합물 및 유도체, 더욱 바람직하게는 PPG, PEG, 또는 PPG-PEG; 더욱더 바람직하게는 평균 몰 질량이 500 내지 5000 g/mol 범위인 PPG, PEG, 또는 PPG-PEG 로부터 선택되는, 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다. 본 발명에 따른 여전히 더욱더 바람직한 소포제는 PPG 이며, 여전히 더욱더 바람직한 소포제는 평균 몰 질량이 약 2000 g/mol 인 PPG, 예컨대 BASF 로부터 상업적으로 입수가능한 Pluriol® P2000 이다.
대안적으로, 본 명세서의 다른 곳에 명시된 바와 같은, 실리콘계 오일 및/또는 실리콘계 에멀전을 포함하는 소포제가 사용될 수 있다.
본 발명에 관한 용어 "운점" 은 소포제, 특히 이의 용액 또는 혼합물이 상 분리되기 시작하고 두 개의 상이 보이게 될 수 있는 온도 또는 온도 범위에 관한 것이다. 따라서, 운점의 온도 또는 온도 범위에서, 소포제, 특히 이의 수성 용액 또는 혼합물은 탁해지기 시작할 수 있다. 이는 혼탁의 개시로 지칭될 수 있다. 운점 및 그보다 위의 온도에서, 소포제의 분자는 광을 산란시켜 혼탁을 초래하는 응집물을 형성하는 것으로 생각된다. 이러한 거동은 특히 폴리알킬렌 사슬을 함유하는 비-이온성 계면활성제의 특징이며, 이는 물에서 역 용해도 대 온도 거동을 나타내므로 온도가 상승함에 따라 어떤 지점에서 "클라우드 아웃 (cloud out)" 을 나타낸다. 더욱 특히, "운점" 은 소포제의 용액이 혼탁을 보이는 온도를 지칭할 수 있다. 전형적으로, 용액의 온도를 소포제의 운점보다 위의 온도로 상승시킬 때 혼탁의 개시가 일어난다. 이러한 혼탁은 가역적인 과정이며, 따라서 냉각시에 용액이 다시 맑아진다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 소포제의 운점은 바람직하게는 15 ℃ 내지 40 ℃ 범위, 바람직하게는 20 ℃ 내지 35 ℃ 범위의 온도를 지칭하며, 더욱 바람직하게는 소포제는 운점이 25 ℃ 내지 30 ℃ 일 수 있다. 더욱더 바람직하게는, 소포제의 운점은 예를 들어 특정 온도가 아닌 온도 범위, 예를 들어 20 ℃ 내지 28 ℃ 범위를 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 운점의 온도 범위는 용액에 존재하는 소포제의 농도에 따라 좌우될 수 있으며, 예를 들어 0.1 g/l 의 농도에서, 운점은 27 ℃ 내지 28 ℃ 일 수 있으며, 및/또는 1.0 g/l 의 농도에서, 운점은 22 ℃ 내지 23 ℃ 일 수 있으며 및/또는 2.5 g/l 의 농도에서, 운점은 20 ℃ 내지 21 ℃ 일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 적합한 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제를 지칭할 수 있고 위에서 명시된 바와 같은 운점을 가질 수 있다. 소포제의 운점의 확인 방법은 당해 기술분야에서 알려져 있고, 당해 값은 통상적으로 제조자 또는 배급자에 의해 제공된다. 바람직하게는, 운점은 본 명세서에서 실시예에서 명시된 바와 같이 확인된다; 바람직하게는, 운점은 발효 브로스에서 사용되는 소포제의 농도에서, 더욱 바람직하게는 1 g/L 의 농도에서 확인된다; 가장 바람직하게는 소포제의 운점은 1 g/L 의 탈이온수 중 소포제의 농도에서 확인된다; 또한 바람직하게는, 측정된 탁도의 적어도 100%, 바람직하게는 적어도 200%, 바람직하게는 적어도 300% 의 증가가 관찰되는 온도 또는 온도 범위가 운점이며, 바람직하게는 탁도의 증가는 탈이온수 중 소포제의 용액에서 측정된다.
통상적으로, 발효 브로스는 소포제를 발효 브로스의 총 중량에 기초하여 0.1 내지 50 g/㎏, 바람직하게는 발효 브로스의 총 중량에 기초하여 0.50 내지 10 g/㎏, 더욱 바람직하게는 0.50 내지 3 g/㎏ 의 양으로 함유할 수 있다. 소포제는 발효 브로스 내로 발효 공정 전에 및/또는 동안에 투입될 수 있다.
용어 "발효 브로스" 또는 "배양 브로스" 는 적어도 대상 분자 및 소포제를 포함하는 그의 다운스트림 산물 뿐만 아니라 그의 분취물 및 분획을 포함하는 발효 동안 또는 발효 후에, 즉, 재조합 및/또는 비-재조합 세포와 접촉 동안 또는 접촉 후에 임의의 및 모든 발효 배지를 포함하는 넓은 의미로 사용된다. 바람직하게는, 발효 브로스는 대상 분자를 발현 또는 생산하도록 배양되는 재조합 및/또는 비-재조합 세포를 포함하는 발효 배지이다. 특히, 재조합 또는 비-재조합 세포는 대상 분자를 발효 배지 내로 분비할 수 있다. 따라서, 대상 분자를 포함하는 발효 브로스는 대상 분자를 생산하는, 특히 세포의 배양 동안 또는 발효 공정 동안 대상 분자를 생산하는 세포를 포함하는 발효 브로스를 지칭할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 명시된 방법 및 공정에서, 발효에서 수득되는 발효 브로스의 완전한 부피, 그러나 또한 그의 일부가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 발효 브로스는 임의의 추가의 처리 없이 발효 공정의 마지막에 수득되는 액체이다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같은, 상기 용어는 또한 발효 공정에서 수득되는 발효 브로스, 뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 단편의 제거에 의해 그로부터 수득되는 산물을 포함한다; 후자는 또한 "세포-비함유 발효 브로스" 로 지칭될 수 있다. 따라서, 용어 "발효 브로스" 또는 "배양 브로스" 는 또한 발효 브로스의 분취물, 즉 하위부분, 뿐만 아니라 발효 브로스의 분획, 즉 그것의 구성성분의 일부의 제거에 의해 수득되는 발효 브로스의 일부를 포함한다; 따라서 발효 브로스는 또한 초기에 수득된 발효 브로스의 세포-비함유 분획일 수 있다. 바람직하게는, 발효 브로스는 세포-함유 발효 브로스, 세포-비함유 발효 브로스, 또는 및 그의 분취물 및/또는 분획이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발효 브로스는 소포제의 복합체화, 결합 또는 제거를 위한 임의의 광물 점토 및/또는 추가의 화합물을 함유하지 않는다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 발효 브로스에 소포제의 복합체화, 결합 또는 제거를 위한 광물 점토 및/또는 추가의 화합물이 첨가되지 않는다.
따라서, 용어 "발효 브로스의 분획" 또는 "배양 브로스의 분획" 은 그것의 구성성분의 일부의 제거에 의해 수득되는 발효 브로스의 일부만을 지칭할 수 있다. 상기 발효 브로스의 분획(들)은 여과에 의해, 바람직하게는 정밀여과에 의해, 또는 원심분리에 의해, 바람직하게는 디캔터 원심분리, 디스크 스택 원심분리 또는 노즐 분리기에 의해 수득될 수 있다. 발효 브로스의 분획은 발효 브로스의 원심분리에 의해 상청액, 액체 부분을 포함하는 분획, 및 스핀 다운 분획을 초래하여 수득될 수 있다. 용어 "발효 브로스의 스핀 다운 분획" 또는 "배양 브로스의 스핀 다운 분획" 은 세포, 불용성 기질, 및 불용성 발효 산물을 포함하는 원심분리 후에 수득되는 발효 브로스의 분획을 지칭한다. 대안적으로, 발효 브로스의 분획은 발효 브로스의 여과에 의해 액체 분획을 포함하는 여과물 또는 투과물 및 세포를 포함하는 바이오매스 및 그의 일부 및/또는 다른 불용성 물질 (고체 분획) 을 포함하는 보유물을 초래하여 수득될 수 있다. 대상 분자의 회수를 위해 발효조에 존재하는 완전한 발효 브로스가 수확되지 않는 경우에, 분획은 또한 발효 브로스의 일부를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법에서, 예를 들어 단계 (a) 에서 여과 후에, 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획은 액체 분획인 여과물일 수 있고, 적어도 소포제 및/또는 바이오매스 또는 바이오매스의 일부를 포함하는 제 2 분획인 보유물은 고체 분획일 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 소포제는 바람직하게는 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획으로부터 여과에 의해 분리될 수 있다. 바람직하게는, 발효 브로스의 분획(들)은 (i) 발효 브로스의 원심분리에 의해 수득되는 스핀 다운 분획 (고체 분획), 및 (ii) 발효 브로스의 원심분리에 의해 수득되는 상청액 (액체 분획) 으로부터 선택될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 발효 브로스의 분획은 발효 브로스의 여과에 의해 수득되는 (i) 여과물로도 지칭되는 액체 통과 분획 및 (ii) 보유물로도 지칭되는 보유되는 분획으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 보유물은 고체 분획이다; 그것은, 그러나, 여과 조건에 따라, 또한 액체일 수 있다.
"발효 공정" 은 "배양 배지" 로도 지칭되는 적합한 발효 배지에서의 세포의 배양을 포함한다. "세포의 배양" 또는 "세포의 성장" 은 지수적 성장기로 한정되는 것으로 이해되지 않지만, 접종 후 성장의 시작 시 및 정지기 동안 세포의 생리학적 상태를 또한 포함할 수 있다. 전형적으로 배양은 세포의 성장을 지지하기에 적합한 배양 온도에서 수행될 수 있다. 더욱 전형적으로, 배양 온도는 25 ℃ 내지 45 ℃ 범위 내에 있을 수 있다. 추가적인 세부사항은 본 명세서의 다른 곳에서 명시된다. 발효 공정은 통상적으로 발효조에서, 바람직하게는 적어도 1 ㎥ 의 부피 규모를 갖는 발효조에서 수행될 수 있다.
본 발명은 실험실 및 산업 규모의 발효 공정 둘 모두에서 미생물 세포를 배양하는데 적용될 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 언급되는 "산업적 발효" 는 초기 발효 배지 1 리터 당 탄소 공급원 적어도 200 g 이 첨가되는 배양 방법을 지칭한다. 바람직하게는, 산업적으로 관련된 발효 공정은 공칭 발효조 크기에 관하여 1-500 ㎥, 바람직하게는 5-500 ㎥, 더욱 바람직하게는 10-500 ㎥, 더욱더 바람직하게는 25-500 ㎥, 가장 바람직하게는 50-500 ㎥ 인 부피 규모의 발효 공정을 망라한다. 다시 말하면, 산업적으로 관련된 발효 공정은 공칭 발효조 크기에 관하여 바람직하게는 적어도 1000 L, 바람직하게는 적어도 5,000 L, 더욱 바람직하게는 적어도 10,000 L, 더욱더 바람직하게는 적어도 25,000 L, 여전히 더욱더 바람직하게는 적어도 50,000 L 및 가장 바람직하게는 50,000-500,000 L 인 부피 규모의 발효 공정을 망라한다.
"배양 배지" 로도 지칭되는 용어 "발효 배지" 는 세포의 성장을 지지할 수 있는 하나 이상의 화학적 화합물을 함유하는 수계 용액에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발효 배지는 복합 발효 배지 또는 화학적으로 정의된 발효 배지이다. 특정 세포의 배양에 적합한 임의의 배지가 발효 배지로 사용될 수 있다. 발효 배지는 이전에, 예를 들어, WO 98/37179 에 기재된 바와 같은 최소 배지일 수 있거나, 발효 배지는 복합 질소 및/또는 탄소 공급원을 포함하는 복합 배지일 수 있고, 여기서 복합 질소 공급원은 WO 2004/003216 에 기재된 바와 같이 부분적으로 가수분해될 수 있다. 게다가, 발효 배지는 포스페이트 및/또는 카보네이트 공급원을 함유할 수 있다. 본 발명에 따르면, 발효 배지는 바람직하게는 적어도 하나의 소포제를 포함할 수 있다.
용어 "발효 브로스에서 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 것" 은 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획으로부터 소포제를 적어도 부분적으로 분리하는 것을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 바람직하게는, 이 용어는 대상 분자 대 소포제의 몰비 및/또는 질량비가 분리 전 성태에 비해 증가된 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 적어도 하나의 분획을 수득하는 것에 관한 것이다. 따라서, 이 용어는 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획 중 소포제의 상대 농도를 감소시키는 것, 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획 중 대상 분자의 상대 농도를 증가시키는 것, 또는 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획 중 소포제의 상대 농도를 감소시키는 것 및 대상 분자의 상대 농도를 증가시키는 것 둘 모두에 관한 것일 수 있다. 특히, 이 용어는 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획 및 적어도 소포제 및 바람직하게는 바이오매스, 또는 바이오매스의 일부를 포함하는 제 2 분획을 수득하는 것을 지칭할 수 있다. 더욱 특히, 예를 들어 운점보다 높은 온도에서의 정밀여과가 적용될 때, 발효 브로스에서 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 것은 대상 분자를 함유하는 투과물로도 지칭되는 여과물 및 소포제 및/또는 바이오매스를 포함하는 보유물, 또는 필터 케이크를 수득하는 것을 초래할 수 있다. 대안적으로, 적용되는 여과의 유형에 따라, 예를 들어 운점보다 아래의 온도에서의 한외여과의 경우에 발효 브로스에서 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 것은 소포제를 함유하는 투과물로도 지칭되는 여과물 및 대상 분자를 함유하는 보유물을 수득하는 것을 초래할 수 있다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 소포제를 포함하는 분획은 또한 일부 대상 분자를 포함할 수 있고; 따라서, 바람직하게는, 대상 분자를 포함하는 분획은 당해 단계에서 입수가능한 더 높은 대상 분자 대 소포제 몰비 및/또는 질량비를 포함하는 분획이고; 2개 초과의 분획이 수득되는 경우에, 대상 분자를 포함하는 분획(들)은 바람직하게는 당해 단계에서 입수가능한 가장 높은 대상 분자 대 소포제 몰비 및/또는 질량비를 포함하는 적어도 하나의 분획(들)이다. 따라서, 바람직하게는, 소포제를 포함하는 분획(들)은 바람직하게는 당해 단계에서 입수가능한 가장 낮은 대상 분자 대 소포제 몰비 및/또는 질량비를 포함하는 분획(들)이다.
적어도 소포제를 포함하는 제 2 분획은 여과 단계 (a) 전에 발효 브로스에 초기에 존재하는 소포제의 총량의 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 60 % 더욱 바람직하게는 적어도 70 %, 더욱더 바람직하게는 적어도 80 %, 적어도 85% 또는 적어도 90 % 를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 제 2 분획은 또한 바이오매스 또는 그의 일부를 포함할 수 있으며, 특히 바이오매스 또는 그의 일부는 여과 단계 (a) 전에 발효 브로스에 초기에 존재하는 바이오매스의 총량의 적어도 50 %, 바람직하게는 적어도 60 % 더욱 바람직하게는 적어도 70 %, 더욱더 바람직하게는 적어도 80 %, 적어도 85% 또는 적어도 90 % 를 지칭할 수 있다. 용어 "초기에 존재하는" 은 특히 수확 시점의 바이오매스 및/또는 소포제의 양을 지칭할 수 있다.
용어 "바이오매스" 는 발효 브로스에 존재하는 원하는 대상 분자를 생산하는 재조합 또는 비-재조합 세포 및 이들 세포의 단편 또는 일부를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 발효 브로스는 대상 분자를 생산하는 재조합 및/또는 비-재조합 세포를 포함할 수 있다; 바람직하게는 세포는 미생물 세포이다.
본 발명에 따른 적합한 미생물 세포는 예를 들어 고세균, 진균, 예를 들어 효모, 및 박테리아를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 특히 적합한 것은 박테리아 세포이다.
여전히 대안적으로, 대상 분자를 생산하는 세포는 또한 진핵생물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포일 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 세포에 관한 "재조합" (또는 트랜스제닉) 은 유전자 기술에 의해 인간에 의해 도입되는 폴리뉴클레오티드를 세포가 함유하는 것을 의미하고, 폴리뉴클레오티드에 관한 용어 "재조합" 은 유전자 기술 / 재조합 DNA 기술에 의해 인간에 의해 야기되는
(a) 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부의 서열, 또는
(b) 프로모터를 포함하나 그에 한정되지 않는, 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 하나 이상의 유전자 조절 서열, 또는
(c) a) 및 b) 둘 모두가 그들의 야생형 유전 환경에 위치하지 않거나 또는 변형된 모든 구성물을 포함한다.
용어 "비-재조합" (또는 천연 또는 야생형 또는 내인성) 세포 및 "비-재조합" (또는 천연 또는 야생형 또는 내인성) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 자연에서 발견되는 세포 및 그것의 자연 형태 및 유전 환경에서의 세포에서 발견되는 (즉, 임의의 인간 개입이 없는) 문제의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
박테리아 세포는 그램-양성 또는 그램-음성 박테리아를 포함할 수 있다. 박테리아 세포는 에스케리키아 (Escherichia), 부티옥셀라 (Buttiauxella) 및 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 락토바실루스 (Lactobacillus), 락토코쿠스 (Lactococcus), 클로스트리디움 (Clostridium), 게오바실루스 (Geobacillus), 및 오세아노바실루스 (Oceanobacillus) 세포로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따르면 바실루스 세포가 바람직할 수 있다; 더욱더 바람직한 것은 바실루스 알칼로필루스 (Bacillus alkalophilus), 바실루스 아밀로리쿠에파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스 시르쿨란스 (Bacillus circulans), 바실루스 클라우시이 (Bacillus clausii), 바실루스 코아굴란스 (Bacillus coagulans), 바실루스 피르무스 (Bacillus firmus), 바실루스 라우투스 (Bacillus lautus), 바실루스 렌투스 (Bacillus lentus), 바실루스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), 바실루스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 바실루스 메틸로트로피쿠스 (Bacillus methylotrophicus), 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실루스 파라리체니포르미스 (Bacillus paralicheniformis), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 및 바실루스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 바실루스 세포이다. 여전히 더욱더 바람직하게는, 세포는 바실루스 아밀로리쿠에파시엔스, 바실루스 렌투스, 바실루스 리체니포르미스, 바실루스 스테아로테르모필루스 또는 바실루스 서브틸리스 세포이다. 대안적으로, 박테리아 세포는 바실루스 리체니포르미스 세포 또는 바실루스 서브틸리스 세포이다. 여전히 더욱더 바람직하게는, 바실루스 세포는 바실루스 서브틸리스, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 리체니포르미스, 또는 바실루스 렌투스의 바실루스 세포이다. 가장 바람직하게는, 세포는 바실루스 리체니포르미스 세포이다. 더욱더 바람직하게는, 바실루스 리체니포르미스 세포는 American Type Culture Collection 번호 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53926, ATCC 53757, ATCC 55768 하에, 및 DSMZ 번호 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259, 및 DSM 26543 하에 기탁된 바실루스 리체니포르미스 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
전형적으로, 숙주 세포는 American Type Culture Collection 번호 ATCC 14580 (이는 DSM 13 과 동일하며, Veith et al. "The complete genome sequence of DSM 13, an organism with great industrial potential." J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2004) 7:204-211 을 참고한다) 하에 기탁된 바실루스 리체니포르미스 균주의 숙주 세포와 같이 바실루스 리체니포르미스 종에 속한다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 바실루스 리체니포르미스리체니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 31972 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53757 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 53926 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 ATCC 55768 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 394 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 641 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 1913 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 11259 의 숙주 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 바실루스 리체니포르미스 균주 DSM 26543 의 숙주 세포일 수 있다.
바람직하게는, 바실루스 리체니포르미스 균주는 바실루스 리체니포르미스 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53757, ATCC 53926, ATCC 55768, DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259, 및 DSM 26543 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
대안적으로, 미생물 세포는 문 아스코미코타 (Ascomycota), 바시디오미코타 (Basidiomycota), 키트리디오미코타 (Chytridiomycota), 자이고미코타 (Zygomycota), 및 오오미코타 (Oomycota), 뿐만 아니라 모든 유사분열포자 (mitosporic) 진균 및 사카로마이코이데애 (Saccharomycoideae) 로부터 선택되는 진균 세포일 수 있다. 바람직하게는, 진균 세포는 아스페르길루스 (Aspergillus), 페니실리움 (Penicillium), 칸디다 (Candida), 트리코데르마 (Trichoderma), 테르모텔로미세스 (Thermothelomyces), 특히 테르모텔로미세스 테르모필라 (Thermothelomyces thermophila) (미셀리오프토라 테르모필라 (Myceliophthora thermophila) 로도 지칭됨), 및 피키아 (Pichia) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 대상 분자는, 바람직하게는 정밀여과에 의해, 여과될 수 있다. 따라서, 대상 분자는 바람직하게는 평균 외경이 2 ㎛ 미만, 바람직하게는 0.2 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎛ 미만이다. 따라서, 대상 분자는 바람직하게는 평균 분자 질량이 5000 kDa 미만, 바람직하게는 1000 kDa 미만, 더욱 바람직하게는 500 kDa 미만이다. 이해되는 바와 같이, 대상 분자는 또한 비-공유적으로 연결된 분자의 복합체, 예를 들어 동종- 또는 이종다합체 폴리펩티드일 수 있다.
바람직하게는, 대상 분자는 열 불안정성이다. 더욱 바람직하게는, 대상 분자는 단백질, 아미노산, 지방산, 비타민, 조효소, 폴리하이드록시알카노에이트, 유기산, 항생제, 알코올, 테르펜, 뉴클레오티드, 스테로이드, 카로티노이드, 및 다당류, 소분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 대상 분자는 단백질, 더욱더 바람직하게는 효소, 여전히 더욱더 바람직하게는 열 불안정성 효소이다. 대상 분자는 발효 산물, 예를 들어 발효 브로스에서 재조합 또는 비-재조합 세포에 의해 생산되는 산물로 지칭될 수 있다.
용어 "열 불안정성 대상 분자" 는 45 ℃ 초과의 온도, 더욱 바람직하게는 50 ℃ 초과의 온도, 더욱더 바람직하게는 60 ℃ 초과, 또는 70 ℃ 초과의 온도에 노출될 때 불안정하거나 기능이 손상되는 대상 분자를 지칭한다.
바람직하게는, 대상 분자는 효소이다. 효소는 하이드롤라아제 (EC 3) 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 글리코시다아제 (EC 3.2), 에스테라아제 (EC 3.1) 펩티다아제, 또는 및 프로테아제 (EC 3.4) 이다. 더욱 바람직하게는 효소는 아밀라아제, 특히 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1), 글루코아밀라아제, 풀룰라나아제, 메탈로프로테아제, 리파아제 (EC 3.1.1.3), 쿠티나아제, 아실 트랜스페라아제, 셀룰라아제 (EC 3.2.1.4), 엔도글루카나아제, 셀루비오하이드롤라아제, 자일라나아제, 자일로글루칸트랜스페라아제, 자일로시다아제, 만난아제 (EC 3.2.1.25), 피타아제 (EC 3.1.3.8), 뉴클레아제 (EC 3.1.11 내지 EC 3.1.31), 포스파타아제, 자일로스 이소메라아제, 글루코스 이소메라아제, 락타아제 (EC 3.2.1.108), 아세토락테이트 데카르복시라아제, 펙티나아제, 펙틴 메틸에스테라아제, 폴리갈락투로니다아제, 리아제, 펙테이트 리아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 갈락타나아제, 락카아제, 퍼옥시다아제 및 아스파라기나아제로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 효소는 아밀라아제 (특히 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1)), 셀룰라아제 (EC 3.2.1.4), 락타아제 (EC 3.2.1.108), 만난아제 (EC 3.2.1.25), 락타아제 (EC 3.2.1.108), 리파아제 (EC 3.1.1.3), 피타아제 (EC 3.1.3.8), 뉴클레아제 (EC 3.1.11 내지 EC 3.1.31), 및 프로테아제 (EC 3.4) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소; 특히 아밀라아제, 프로테아제, 리파아제, 만난아제, 피타아제, 자일라나아제, 포스파타아제, 글루코아밀라아제, 뉴클레아제, 및 셀룰라아제, 바람직하게는, 아밀라아제 또는 프로테아제, 바람직하게는, 프로테아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소이다. 더욱 바람직하게는, 효소는 프로테아제, 아밀라아제, 락타아제, 및 만난아제로부터, 특히 바람직하게는, 프로테아제, 아밀라아제, 및 락타아제로부터 선택된다. 가장 바람직한 것은 프로테아제, 바람직하게는, 세린 프로테아제 (EC 3.4.21), 바람직하게는 서브틸리신 프로테아제이다.
대상 분자는 발효 브로스 내로 분비될 수 있거나, 또는 다른 수단에 의해 용액으로 될 수 있다. 바람직하게는, 대상 분자는 재조합 또는 비-재조합 세포에 의해 발효 브로스 내로 분비된다. 발효 배지 내로의 대상 분자의 분비는 발효 브로스로부터 대상 분자의 분리를 허용할 수 있다. 특히, 대상 분자가 단백질인 경우에, 재조합 또는 비-재조합 세포에서 대상 단백질을 발현시키기 위해 사용되는 핵산 구축물은 발효 배지 내로 대상 단백질의 분비를 지시하는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 신호 펩티드가 당해 기술분야에 알려져 있다. 바람직한 신호 펩티드는 바실루스 서브틸리스로부터의 AprE 단백질의 신호 펩티드 또는 바실루스 서브틸리스로부터의 YvcE 단백질의 신호 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 방법은 소포제의 존재 하에 발효 브로스를 배양하는 것, 특히 대상 분자를 생산하는 발효 브로스에서 재조합 또는 비-재조합 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 유리하게는, 소포제의 존재로 인해 배양 동안 거품의 형성이 억제 또는 감소된다. 바람직하게는, 배양은 소포제의 운점보다 위의 배양 온도에서 일어난다. 더욱 바람직하게는, 소포제의 운점보다 위의 배양 온도는 25℃ 내지 45℃ 범위, 더욱더 바람직하게는 27℃ 내지 40℃ 범위, 여전히 더욱더 바람직하게는 27℃ 내지 37℃ 범위의 배양 온도를 지칭한다.
바람직하게는, 발효 브로스의 배양, 특히 대상 분자를 생산하는 발효 브로스에서의 세포의 배양은 단계 (a) 및/또는 (b) 전에 수행될 수 있다.
발효 브로스의 pH 는 미생물 세포에 따라 조정될 수 있다. 통상적으로, pH 는 pH 6.6 내지 9, 바람직하게는 6 으로 조정될 수 있다. 예로서, 바실루스 세포가 사용되는 경우에, pH 는 pH 6.8, pH 7.0, pH 7.2, pH 7.4, 또는 pH 7.6 또는 그 이상으로 조정된다. 바람직하게는, 바실루스 세포의 배양 동안 발효 브로스의 pH 는 pH 6.8 내지 9, 바람직하게는 pH 6.8 내지 8.5, 더욱 바람직하게는 pH 7.0 내지 8.5, 가장 바람직하게는 pH 7.2 내지 pH 8.0 로 조정된다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (a) 는 적어도 소포제 및 대상 분자를 포함하는 발효 브로스 또는 이의 분획을 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 여과하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 오직 발효 브로스의 일부가 수확될 때 단계 (a) 에 관한 발효 브로스의 분획은 오직 발효 브로스의 일부를 지칭한다. 더욱 바람직하게는, 단계 (a) 에 적용되는 발효 브로스 또는 이의 분획은 바이오매스로도 지칭되는 대상 분자를 생산하는 세포를 여전히 포함한다.
단계 (a) 에서 여과에 의해 소포제는 고체 분획과 함께 분리될 수 있으며, 한편 대상 분자는 액체 분획 중에 수득될 수 있다. 바람직하게는, 제 2 분획, 즉 보유물 분획은 소포제 및 바이오매스를 포함한다. 이는 발효 브로스로부터 바이오매스 및 소포제 둘 모두를 제거하고 대상 분자로부터 발효 브로스로부터의 소포제를 효율적으로 분리하기 위해 단일 여과 단계만이 요구되기 때문에 유리하다.
운점보다 위의 온도는 소포제의 운점보다 위로 적어도 1 ℃, 바람직하게는 소포제의 운점보다 위로 적어도 2 ℃, 더욱 바람직하게는 적어도 5 ℃, 더욱더 바람직하게는 적어도 10 ℃ 인 온도로서 이해될 수 있다. 단계 (a) 에서 여과는 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서, 바람직하게는 소포제의 운점보다 위로 5 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서, 더욱 바람직하게는 소포제의 운점보다 위로 7 ℃ 내지 12 ℃ 범위, 더욱더 바람직하게는 소포제의 운점보다 위로 10 ℃ 내지 12 ℃ 범위의 온도에서 수행된다. 특히, 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도는 20 ℃ 내지 45 ℃ 범위의 온도를 지칭하며, 더욱 특히 그것은 25 ℃ 내지 40 ℃ 범위의 온도, 더욱더 특히 28 ℃ 내지 35 ℃ 범위의 온도를 지칭한다. 여과 단계 (a) 에서 45 ℃ 초과의 온도는 대상 분자 또는 그것의 기능을 손상시킬 수 있으므로 바람직하지 않다.
유리하게는, 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서의 여과는 소포제의 효율적 제거 및 따라서 대상 분자로부터 소포제의 효율적 분리를 초래하는 것으로 밝혀졌다. 여과 동안의 온도는 통상적으로 소포제의 운점보다 위로 최대 15 ℃ 일 수 있고, 특히 온도는 45 ℃ 를 초과하지 않아야 하며, 그렇지 않으면 온도는 대상 분자, 특히 열 불안정성 대상 분자에 해를 끼칠 수 있다. 위에 명시된 온도보다 더 낮은 온도에서는, 여과 단계 (a) 에서 소포제의 효율적인 보유를 지지하고 따라서 대상 분자로부터 소포제의 효율적인 분리를 지지하기 위해 소포제의 상 분리가 충분하지 않을 수 있기 때문에 소포제의 제거가 효율적이지 않을 수 있다. 유리하게는, 단계 (b) 에서 온도의 선택은 발효 브로스에 존재하는 소포제의 운점 및 대상 분자의 온도 민감도에 따라 위에 명시된 범위 내에서 조절될 수 있다.
바람직하게는 단계 (a) 는 20 ℃ 내지 45 ℃ 범위 내의 온도에서; 더욱 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃ 의 온도에서, 더욱더 바람직하게는 28 ℃ 내지 37 ℃ 의 온도에서 수행될 수 있으며, 여전히 더욱더 바람직하게는 여과는 30 ℃ 내지 35℃ 범위에서 수행된다.
온도 조정은 통상의 기술자에게 알려진 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다; 특히, 온도 조정은 표준 절차 및 장비를 사용하여 발효조, 탱크, 공급물 및/또는 발효 브로스 또는 이의 분획을 함유하는 여과 장치를 냉각 또는 가열하는 것을 수반할 수 있다.
바람직하게는, 온도는 여과 동안 내내 원하는 범위에서 유지된다. 발효 브로스의 온도는 여과 단계 전에 여과를 위해 지정된 발효 브로스 또는 이의 분획을 포함하는 당해 탱크 또는 용기의 온도를 조정함으로써 원하는 범위로 설정될 수 있다. 여과에 필요한 시간은 충분히 짧게 유지할 수 있어, 여과 공정 동안 내내 발효 브로스 또는 이의 분획의 온도가 유지될 수 있다. 단계 (a) 에서 온도를 여과 동안 내내 원하는 범위 내에서 유지하는 것은 유리하게는 대상 분자로부터 소포제의 효율적인 분리를 초래할 수 있다.
또한, 분리 장비 예컨대 예를 들어 필터, 및/또는 발효 브로스의 분획을 분리 장비 내로 안내하는 배관은 여과 단계 (a) 에서 원하는 온도를 달성 및/또는 유지하기 위해 가열 또는 냉각될 수 있다.
소포제는 발효 브로스 내로 단계 (a) 전에 투입될 수 있고, 바람직하게는 소포제는 발효 브로스 내로 발효 공정 동안 및/또는 발효 공정 시작시에 투입될 수 있다. 발효 브로스 중 소포제의 양은 발효 브로스의 총 중량에 기초하여 0.1 내지 50 g/㎏ 의 양일 수 있다. 바람직하게는, 발효 브로스 중 소포제의 양은 발효 브로스의 총 중량에 기초하여 0.5 내지 10 g/㎏, 더욱 바람직하게는 발효 브로스의 총 중량에 기초하여 0.50 내지 3 g/㎏ 의 양일 수 있다.
단계 (a) 와 동시에 또는 단계 (a) 전에 방법은 여과 보조제의 첨가, pH 의 조정 및/또는 가열 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 임의의 응집제의 첨가를 포함하지 않는다.
또한, 완전한 혼합 및/또는 균일한 온도 조절을 보장하기 위해, 발효 브로스는 미리 정해진 인큐베이션 시간에 걸쳐 일정하게 교반될 수 있으며, 특히 발효 브로스는 본 발명에 따른 방법의 단계 (a) 및/또는 (c) 전에 교반될 수 있다. 인큐베이션 시간은 1 내지 120 분으로 다양할 수 있다. 인큐베이션 시간은 1 분, 10 분, 20 분, 30 분, 40 분, 50 분, 60 분, 70 분, 80 분, 90 분, 100 분, 110 분, 110 분, 또는 120 분일 수 있다. 바람직하게는, 인큐베이션 시간은 60-90 분이고, 가장 바람직하게는, 인큐베이션 시간은 60 분이다. 대안적으로, pH 는 염기의 인라인 첨가에 의해 조정된다.
단계 (a) 에서 여과는 바람직하게는 정밀여과를 포함한다. 정밀여과는 통상의 기술자에게 알려진 기술 및 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 단계 (a) 에서 여과는 전량 여과 또는 횡류 여과 (접선 유동 여과) 를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 정밀여과 멤브레인 또는 정밀여과 멤브레인 모듈을 수반한다. 따라서, 여과 단계 바람직하게는 횡류 정밀여과 또는 전량 정밀여과를 포함하며, 더욱 바람직하게는 횡류 정밀여과를 포함한다. 적합한 정밀여과 멤브레인 또는 멤브레인 모듈은 대상 분자를 생산하는 세포에 따라 공극 크기가 0.05 내지 10 ㎛, 바람직하게는 0.05 내지 2 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.3 ㎛ 범위인 필터 멤브레인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 대상 분자를 생산하는 세포는, 바람직하게는 본 명세서에서 다른 곳에서 명시된 바와 같은, 진핵생물 세포이고, 공극 크기는 0.05 ㎛ 내지 25 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎛ 내지 20 ㎛, 여전히 더욱 바람직하게는 0.5 ㎛ 내지 15 ㎛, 가장 바람직하게는 1 ㎛ 내지 10 ㎛ 범위이다. 더욱 바람직하게는, 대상 분자를 생산하는 세포는, 바람직하게는 본 명세서에서 다른 곳에서 명시된 바와 같은, 원핵생물 세포이고, 공극 크기는 0.02 ㎛ 내지 5 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.05 ㎛ 내지 2 ㎛, 여전히 더욱 바람직하게는 0.1 ㎛ 내지 1 ㎛, 더욱더 바람직하게는 0.15 ㎛ 내지 0.9 ㎛, 가장 바람직하게는 0.2 ㎛ 범위이다. 그러나, 다른 공극 크기가 또한 고려될 수 있으며, 예를 들어 전량 여과에서, 여과 파라미터는 결국 여과 케이크에 의해 결정될 수 있다.
방법의 단계 (b) 는 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제 및 바람직하게는 바이오매스를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계를 포함한다.
단계 (a) 에서 여과에 의해 소포제는 고체 분획과 함께 분리될 수 있으며, 한편 대상 분자는 액체 분획 중에 수득될 수 있다. 따라서, 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획은 투과물로도 지칭되는 액체 분획일 수 있고, 필터 케이크 또는 보유물로도 지칭되는 적어도 소포제를 포함하는 제 2 분획은 고체 분획일 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및/또는 공정은 단계 (b) 에서 수득된 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획을 소포제의 운점보다 아래의 온도에서, 바람직하게는 2 ℃ 내지 18 ℃ 의 온도에서, 더욱 바람직하게는 5 ℃ 내지 15 ℃ 의 온도에서 한외여과, 정용여과 및/또는 정용-한외여과에 적용하는 단계 (c) 를 추가로 포함할 수 있다.
소포제의 운점보다 아래의 온도는 소포제의 운점보다 아래로 적어도 1 ℃, 바람직하게는 소포제의 운점보다 아래로 적어도 2 ℃, 더욱 바람직하게는 적어도 5 ℃, 더욱더 바람직하게는 적어도 10 ℃ 인 온도로서 이해될 수 있다. 그러나, 발효 브로스의 세포 또는 대상 분자의 동결 손상을 피하기 위해 소포제의 운점보다 아래의 온도는 0 ℃ 보다 낮으면 안된다. 단계 (c) 에서 한외여과, 정용여과 및/또는 정용-한외여과에 적합한 소포제의 운점보다 아래의 온도는 바람직하게는 2 ℃ 내지 18 ℃ 범위의 온도, 더욱 바람직하게는 5 ℃ 내지 15 ℃ 의 온도를 지칭할 수 있다.
단계 (c) 는 단계 (b) 에 후속하여 수행될 수 있다. 단계 (c) 에 뒤이어서 단계 (c) 로부터 대상 분자를 포함하는 보유물 및 소포제의 적어도 일부를 포함하는 투과물을 수득하는 단계 (d) 가 후속될 수 있다.
단계 (c) 는 유리하게는 소포제의 제거 효율을 향상시킬 수 있다. 선택적 단계 (c) 에서 온도를 소포제의 운점보다 아래의 온도로 조절하는 것은 잔류 소포제를 가용화된 형태로 유지하고 여과물과 함께 잔류 소포제의 제거를 초래할 수 있는 것으로 가정된다. 따라서, 단계 (c) 는 대상 분자로부터의 소포제의 분리 효율을 훨씬 더 증가시킬 수 있다.
소포제의 제거는 바람직하게는 오로지 단계 (b) 및/또는 단계 (c) 에서 여과에 의해 달성된다. 더욱 바람직하게는, 소포제의 복합체화, 결합 또는 제거를 위한 광물 점토 또는 임의의 다른 화합물 또는 분자의 첨가는 본 발명에 따른 방법에서 요구되지 않는다. 유리하게는, 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 전체 방법, 예를 들어 단계 (a) 내지 (d), 및 잠재적으로 심지어는 추가의 다운스트림 가공 단계는 최대 45℃ 또는 심지어는 최대 40 ℃ 또는 30 ℃ 의 온도에서 수행될 수 있으며, 그렇게 함으로써 열 불안정성 대상 분자, 특히 열 불안정성 효소가 보호되고 그들의 기능이 보존될 수 있다. 추가의 이점은 소포제의 복합체화 또는 결합을 위한 화합물의 첨가가 요구되지 않는다는 점이다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법은 단순하고 노동 효율적이다.
또한, 본 발명의 방법은 단계 (a) 전에 대상 분자를 생산하는 세포의 배양을 포함할 수 있다. 상기 배양은 "발효 공정" 으로 지칭될 수 있다.
발효 공정은 임의의 알려진 설정, 예컨대 통상의 기술자에게 알려진 회분식 공정, 유가식 공정 또는 연속식 발효 공정일 수 있다.
산업적 발효 공정은 전형적으로 먼저 발효조에 성장 배지를 제공하고, 발효조에 대상 분자를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 접종물을 접종하고, pH, 온도, 산소 수준 등과 같은 정해진 조건 하에서, 미리 정해진 시간에 또는 미리 정해진 조건, 예를 들어 역가, 산소 소모에 도달될 때까지 세포를 배양함으로써 수행된다.
따라서, 발효 공정 동안, 대상 분자를 생산하는 세포는 발효 배지에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 미생물이며, 더욱 바람직하게는 세포는 재조합 미생물 세포, 더욱더 바람직하게는 재조합 박테리아 세포이다.
본 발명은 산업적 규모, 즉, 적어도 1,000 리터, 더욱 바람직하게는 적어도 5,000 리터, 더욱더 바람직하게는 적어도 50,000 리터의 임의의 발효 브로스로부터 소포제를 제거하는데 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 부가적 단계를 포함할 수 있다. 부가적 단계는 여과 보조제/첨가제, 활성탄, 탈색제 등과 같은 화합물의 첨가를 포함할 수 있다.
이들 화합물은 유리하게는 대상 분자의 분리를 개선하고 산물 품질을 추가로 향상시킬 수 있다.
게다가, 본 발명은 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 방법을 포함하는 발효 브로스로부터 대상 분자를 정제하는 공정에 관한 것이다.
본 발명의 공정은 발효 브로스 또는 발효 브로스의 분획에 적용될 수 있다. 특히, 공정은 하나 이상의 부가적 단계(들)을 포함하는 본 발명에 따른 방법을 포함할 수 있다.
공정은, 바람직하게는 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획의 이온 교환에 의해, 더욱 바람직하게는 크로마토그래피에 의해, 대상 분자를 추가로 정제하는 부가적 단계 (e) 를 포함할 수 있다. 특히, 단계 (b) 에서 소포제를 대상 분자로부터 분리하여 수득되는 또는 단계 (d) 에서 수득되는 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획은 이온 교환 기술에 의해 추가로 처리될 수 있다.
이들 이온 교환 기술은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로메이트-포커싱, 및 크기 배제); 전기영동 절차 (예를 들어, 분취 등전 포커싱); 차별적 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전); 또는 추출 (예를 들어, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조) 을 수반할 수 있다.
추가로, 공정은, 바람직하게는 한외여과, 증발 (예컨대, 박막 증발), 침전, 추출, 분무-건조, 동결-건조, 또는 결정화에 의해, 대상 분자를 농축하는 단계 (f) 를 포함할 수 있다.
추가로, 공정은 대상 분자, 바람직하게는 대상 단백질을 함유하는 제형을 제조하는 단계 (g) 를 포함할 수 있다.
대상 분자의 제형, 특히 대상 단백질의 제형은 고체 또는 액체일 수 있다. 제형은 당해 기술 분야에 알려진 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지 않으나, 고체 효소 제형은 압출 또는 과립화에 의해 수득될 수 있다. 적합한 압출 및 과립화 기술은 당해 기술 분야에 알려져 있고 예를 들어 WO 94/19444 A1 및 WO　97/43482 A1 에 기재되어 있다. "대상 분자의 제형" 은 적은 수의 성분을 포함하는 임의의 비-복합 제형을 지칭할 수 있으며, 여기서 성분은 제형에 포함된 대상 분자의 안정화 및/또는 제형 자체의 안정화를 목적으로 한다. 용어 "안정성" 은 저장 또는 작업 동안 시간의 함수로서 대상 분자의 활성의 유지에 관한 것이다. 용어 "제형 안정성" 은 저장 또는 작업 동안 제형의 물리적 외관의 유지 뿐만 아니라 저장 또는 작업 동안 미생물 오염의 회피에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 대상 분자를 포함하는 정제된 또는 부분적으로 정제된 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법은 정제된 또는 부분적으로 정제된 형태의 대상 분자를 제공한다.
유리하게는, 소포제는 열 불안정성 대상 분자 예컨대 효소의 제조에 적합한 상기 방법을 사용하여 비교적 온화한 조건에서, 특히 온화한 온도에서 발효 브로스로부터 제거될 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다.
상기 용어의 설명 및 해석은 본 명세서에서 아래 기재된 구현예에 준용된다.
다음 구현예는 본 발명의 방법의 바람직한 구현예이다.
구현예 1. 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 상기 발효 브로스를 여과하는 단계; 및
(b) 그렇게 함으로써 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계,
여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다.
구현예 2. 구현예 1 에 있어서, 소포제가 운점이 15 ℃ 내지 40 ℃, 바람직하게는 운점이 20 ℃ 내지 35 ℃ 인 방법.
구현예 3. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도가 20 ℃ 내지 45 ℃ 범위의 온도를 지칭하는 방법.
구현예 4. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 소포제가 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 에틸렌/프로필렌 옥사이드 블록 공중합체, EO/PO 블록 공중합체계 폴리알코올, 알콕시화된 지방산 에스테르, 폴리프로필렌-폴리에틸렌 글리콜 공중합체 (PPG-PEG), 이의 혼합물 및 유도체로 이루어지는 목록으로부터 선택되며, 바람직하게는 유도체가 이의 에테르 및 공중합체를 포함하는 방법.
구현예 5. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 소포제가 PPG, PEG, 및 PPG-PEG 로 이루어지는 목록으로부터 선택되며; 바람직하게는 평균 몰 질량이 500 내지 5000 g/mol 범위인 PPG 인 방법.
구현예 6. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 에서 여과가 정밀여과를 포함하는 방법.
구현예 7. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b) 에서 수득된 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획을 소포제의 운점보다 아래의 온도에서, 바람직하게는 2 ℃ 내지 18 ℃ 의 온도에서, 더욱 바람직하게는 5 ℃ 내지 15 ℃ 의 온도에서 한외여과, 정용여과 및/또는 정용-한외여과에 적용하는 단계 (c) 를 추가로 포함하는 방법.
구현예 8. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 대상 분자가 효소인 방법.
구현예 9. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 대상 분자가 아밀라아제, 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제, 풀룰라나아제, 프로테아제, 리파아제, 쿠티나아제, 아실 트랜스페라아제, 셀룰라아제, 엔도글루카나아제, 글루코시다아제, 셀루비오하이드롤라아제, 락타아제, 자일라나아제, 자일로글루칸트랜스페라아제, 자일로시다아제, 만난아제, 피타아제, 포스파타아제, 자일로스 이소메라아제, 글루코스 이소메라아제, 아세토락테이트 데카르복시라아제, 펙티나아제, 펙틴 메틸에스테라아제, 폴리갈락투로니다아제, 리아제, 펙테이트 리아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 갈락타나아제, 락카아제, 퍼옥시다아제 및 아스파라기나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소이며, 바람직하게는 효소가 프로테아제, 아밀라아제, 락타아제, 또는 만난아제, 더욱 바람직하게는 프로테아제, 아밀라아제 또는 락타아제, 가장 바람직하게는 서브틸리신 프로테아제인 방법.
구현예 10. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 발효 브로스가 재조합 또는 비-재조합 미생물 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 더욱 바람직하게는 바실루스 세포를 포함하는 방법.
구현예 11. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 바실루스 세포가 American Type Culture Collection 번호 ATCC 14580, ATCC 31972, ATCC 53926, ATCC 53757, ATCC 55768 하에, 및 DSMZ 번호 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH) DSM 13, DSM 394, DSM 641, DSM 1913, DSM 11259, 및 DSM 26543 하에 기탁된 바실루스 리체니포르미스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바실루스 리체니포르미스 세포인 방법.
구현예 12. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 전에 소포제를 포함하는 발효 배지에서 미생물 세포를 배양함으로써 발효 브로스가 수득되는 방법.
구현예 13. 선행 구현예 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 가 횡류 여과 또는 전량 여과를 포함하는 방법.
구현예 14. 구현예 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 대상 분자가 미생물 세포에 의해 발효 브로스 내로 분비되는 방법.
구현예 15. 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법
(a) 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 상기 발효 브로스를 여과함으로써 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계; 및
(b) 그렇게 함으로써 대상 분자를 소포제로부터 분리하는 단계,
여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다.
구현예 16. 구현예 15 에 있어서, 구현예 2 내지 14 중 적어도 하나의 특색을 갖는 방법.
구현예 17. 선행 구현예 중 어느 하나에 따른 방법을 포함하는 발효 브로스로부터 대상 분자를 정제하는 공정.
구현예 18. 구현예 17 에 있어서, 바람직하게는 대상 분자를 포함하는 단계 (b) 의 발효 브로스의 제 1 분획의 이온 교환에 의해, 더욱 바람직하게는 크로마토그래피에 의해, 대상 분자를 추가로 정제하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
구현예 19. 구현예 15 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 대상 분자를 함유하는 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 바람직하게는 대상 분자가 효소인 공정.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 예시되며, 하기 실시예는 청구된 바와 같은 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 한정하는 것이 의도되지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 대상 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌은 구체적으로 언급된 개시내용과 관련하여 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
본 발명은 이제 작업 실시예에 의해 예시될 것이다. 이들 작업 실시예는 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
다르게 언급되지 않으면, 하기 실험은 유전공학 및 미생물 배양에 의한 화합물의 발효적 생산에서 사용되는 표준 장비, 방법, 화학물질 및 생화학 물질을 적용하여 수행되었다. 또한 Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 및 Chmiel et al. (Bioprocesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) 을 참조한다.
하기 실시예 (실시예 1-3) 를 위한 발효 브로스는 서브틸리신 프로테아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 바실루스 리체니포르미스 세포를 배양하여 얻었다. 표 1 및 표 2 에 열거된 성분을 제공하는 화학적으로 정의된 발효 배지를 사용하는 발효 공정으로 바실루스 리체니포르미스 세포를 배양했다.
표 1: 발효 공정의 과정 동안 제공되는 다량 요소
Figure pct00001
표 2: 발효 공정의 과정 동안 제공되는 미량 원소
Figure pct00002
50% 글루코오스를 함유하는 용액을 공급 용액으로 사용했다. 발효 동안 암모니아를 사용하여 pH 를 조절했다. 원하는 산물 역가에서 발효를 종료했고, 산물 아밀라아제는 현미경을 사용하는 시각적 검사에 의해 확인되는 바와 같이 가용성 및 결정질 형태 둘 모두로 존재했다. 발효의 마지막에, 포스페이트 농도는 약 3 g/L 였다.
실시예 1: Pluriol® P2000 (평균 몰 질량이 대략 2000 g/mol 인 PPG) 의 운점의 실험적 확인
600 mL 의 탈이온수를 얼음조에서 약 5℃ 로 냉각시키고, 상응하는 양의 Pluriol®P2000 을 첨가하여 그것의 농도를 0.1, 1.0 또는 2.5 g/L 로 조정했다. 용액을 폴리트론 (Polytron) 균질기를 사용하여 7500 rpm 에서 10 분 동안 유화시켰다. 몇 분 후에 생성된 기포가 사라졌고, 맑은 용액을 일정한 약한 교반 하에 서서히 가온했다. 샘플 (15 mL) 을 특정 온도 포인트에서 취하고, 휴대용 탁도계 2100Q (Hach turbidity 사제) 를 사용하여 탁도를 측정했다. 온도의 함수로서 탁도의 강한 증가는 관찰된 운점 온도 (Tcp) 를 나타냈다.
표 3
Figure pct00003
실시예 2: 다양한 온도에서 소포제를 포함하는 바실루스 리체니포르미스의 발효 브로스의 정밀여과
발효 브로스에 존재하는 소포제는 상기 실시예 1 에서 확인된 운점이 20 ℃ 내지 27 ℃ 범위인 Pluriol® P2000 (BASF 로부터 상업적으로 입수가능한 폴리프로필렌 글리콜) 이었다. 전량 정밀여과를 Pall Corporation 사제 0.2 ㎛ 필터 및 디바이스 Pall Filter Supor EKV 멤브레인 - KA3EKVP6G 을 사용하여 수행했다. 바이오매스-비함유, 바실루스 리체니포르미스 의 발효 브로스의 다양한 분획을 정밀여과에 적용했다. 바이오매스를 제거하기 위한 후가공 단계를 이미 수행했음에도 불구하고, 소포제의 양은 여전히 유의하였다 (표 4 참고).
당해 분획 중 소포제의 양을 실온에서 확인했다. 소포제의 양을 Single Quad MS LCMS 디바이스를 사용하여 HPLC-MS 분석에 의해 확인했다. 디바이스는 Shimadzu Nexera; Single-Quad MS LCMS2020 였다; HPLC 칼럼은 Kinetex C18; 2.1x100mm; 1.7 ㎛ 였다; 용매는 A: 물; 0.1% HCOOH 및 B: 아세토니트릴/이소프로판올 (50/50); 0.1% HCOOH 였다; 정량화를 10 개의 최고 신호의 3 중 하전된 종을 사용하여 수행했다.
Figure pct00004
Pluriol® P2000 의 운점보다 높은 온도에서의, 예를 들어 35 ℃ 에서의 여과는 발효 브로스로부터 잔류 소포제의 효율적 고갈을 초래하며, 한편 더 낮은 온도, 예를 들어 6 ℃ 내지 15 ℃ 에서의 여과는 발효 브로스 중 잔류 소포제의 양에 대해 오직 미미한 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
실시예 3: 프로테아제를 포함하는 바실루스 리체니포르미스의 발효 브로스로부터 소포제 및 바이오매스의 고갈
Pluriol® P2000 을 소포제로서 사용했다. 소포제의 양을 실시예 2 에서와 같이 확인했다. 발효 브로스를 실험실 원심분리기에서 10000 g 로 10 분간 원심분리하여 상청액을 얻었다.
이 실시예는 소포제가 바이오매스 분리 동안 발효 브로스로부터 성공적으로 제거되거나 적어도 대부분 고갈될 수 있음을 입증한다. 따라서, 바이오매스 및 소포제는 함께 제거될 수 있다.
표 5
Figure pct00005
CP 보다 위의 온도에서 (예를 들어 30 ℃ 에서) 정밀여과 (MF) 를 수행하면 대부분의 소포제가 효율적으로 제거된다. 정밀여과의 투과물은 대상 분자 (효소) 및 발효 브로스에 비해 유의하게 더 적은 양의 소포제를 포함한다. 소포제의 CP 보다 아래의 온도에서의 후속 한외여과 (UF) 및 정용-한외여과는 투과물과 함께 잔류 소포제의 추가의 고갈을 초래하며, 한편 효소는 보유물에 보유되고 추가의 정제 단계 예컨대 크로마토그래피 또는 제 2 한외여과에 적용될 수 있다. 정밀여과의 투과물 중 및 한외여과-보유물 중 소포제의 양은 유의하게 감소된다. 추가의 이점으로서, 후속 정제 단계에서 크로마토그래피 동안 한외여과 멤브레인의 파울링이 회피될 수 있다.

Claims (16)

  1. 대상 분자 및 소포제를 포함하는 발효 브로스에서 상기 대상 분자를 상기 소포제로부터 분리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도에서 상기 발효 브로스를 여과하는 단계; 및
    (b) 그렇게 함으로써 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 제 1 분획 및 소포제를 포함하는 발효 브로스의 제 2 분획을 수득하는 단계,
    여기에서 소포제는 폴리알킬렌 글리콜계 소포제이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 소포제의 운점이 15 ℃ 내지 40 ℃, 바람직하게는 운점이 20 ℃ 내지 35 ℃ 인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (a) 에서 소포제의 운점보다 위로 1 ℃ 내지 15 ℃ 범위의 온도가 20 ℃ 내지 45 ℃ 범위의 온도를 지칭하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 소포제가 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리알킬렌 글리콜 (PAG), 에틸렌/프로필렌 옥사이드 블록 공중합체, EO/PO 블록 공중합체계 폴리알코올, 알콕시화된 지방산 에스테르, 폴리프로필렌-폴리에틸렌 글리콜 공중합체 (PPG-PEG), 이의 혼합물 및 유도체로 이루어지는 목록으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 소포제가 PPG, PEG, 및 PPG-PEG 로 이루어지는 목록으로부터 선택되며; 바람직하게는 소포제가 500 내지 5000 g/mol 범위의 평균 몰 질량을 갖는 PPG 인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 에서의 여과가 정밀여과를 포함하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 에서 수득된 대상 분자를 포함하는 발효 브로스의 분획을 소포제의 운점보다 아래의 온도에서, 바람직하게는 2 ℃ 내지 18 ℃ 의 온도에서, 더욱 바람직하게는 5 ℃ 내지 15 ℃ 의 온도에서 한외여과, 정용여과 및/또는 정용-한외여과에 적용하는 단계 (c) 를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상 분자가 효소인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상 분자가 아밀라아제, 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제, 풀룰라나아제, 프로테아제, 리파아제, 쿠티나아제, 아실 트랜스페라아제, 셀룰라아제, 엔도글루카나아제, 글루코시다아제, 셀루비오하이드롤라아제, 락타아제, 자일라나아제, 자일로글루칸트랜스페라아제, 자일로시다아제, 만난아제, 피타아제, 포스파타아제, 자일로스 이소메라아제, 글루코스 이소메라아제, 아세토락테이트 데카르복시라아제, 펙티나아제, 펙틴 메틸에스테라아제, 폴리갈락투로니다아제, 리아제, 펙테이트 리아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 갈락타나아제, 락카아제, 퍼옥시다아제 및 아스파라기나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 효소인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 브로스가 대상 분자를 생산할 수 있는 재조합 또는 비-재조합 미생물 세포, 바람직하게는 박테리아 세포, 더욱 바람직하게는 바실루스 세포를 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 전에 소포제를 포함하는 발효 배지에서 미생물 세포를 배양함으로써 발효 브로스가 수득되는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 가 횡류 여과 또는 전량 여과를 포함하는 방법.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상 분자가 미생물 세포에 의해 발효 브로스 내로 분비되는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 방법 단계를 포함하는 발효 브로스로부터 대상 분자를 정제하는 공정.
  15. 제 14 항에 있어서, 바람직하게는 대상 분자를 포함하는 단계 (b) 의 발효 브로스의 제 1 분획의 이온 교환에 의해, 더욱 바람직하게는 크로마토그래피에 의해, 대상 분자를 추가로 정제하는 단계를 추가로 포함하는 공정.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 공정이 대상 분자를 함유하는 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함하고, 바람직하게는 대상 분자가 효소인 공정.
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