KR20230059263A - 바위손 기내 식물체의 토양 순화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화장품 소재로 활용 가능한 바위손(Selaginella tamariscina Spring)을 식물 기내 배양 기술(in vitro culture, explantation Tech.)을 이용하여 대량 증식한 다음 토양에서 재배하기 위한 순화(acclimatization) 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 바위손(Selaginella tamariscina)의 기내 배양묘를 토양에 이식하는 이식단계; 및 상기 이식된 배양묘를 재배하는 재배단계를 포함하는 바위손의 토양 순화 방법을 제공한다.
Description
본 명세서는 바위손 기내 식물체를 토양에서 재배하기 위한 토양 순화 방법에 관한 것이다.
바위손은 바위 또는 암벽에 붙어 자라는 상록성의 약용 양치식물로, 오랫동안 민간 요법으로 지혈, 혈액순환, 월경불순, 월경통, 타박상, 혈변을 개선하는 데 사용되어왔다. 바위손은 플라본(flavone), 페놀(phenol)성 성분, 아미노산(amino acid), 트레할로스 (trehalose) 등의 다당류 및 소량의 탄닌 (tannin)을 함유하고 있다고 알려져 있어 의학적 활용도가 높고, 화장품 소재나 건강기능식품 등의 다양한 분야에 사용되는 등 산업적 가치가 높으나, 체계적인 증식법이 개발되지 않은 실정이다. 종래 산업군에 사용되는 바위손 원물은 야생에서 채취하여 이용해 왔고, 이에 따라 바위손의 무분별한 남획으로 인해 생태계 파괴의 우려가 있으며, 외부 환경에 대한 높은 의존도로 인해 균일한 원료 생산에 어려움이 있다.
이러한 어려움에 근거하여 최근 바위손을 기내 환경 조건에서 증식시키는 방법에 대한 연구가 활발히 이어지고 있는데, 기내 증식된 바위손 식물체를 토양에서 대량으로 재배하기 위해서는 반드시 토양 순화 과정을 거쳐야 한다. 이 토양 순화 방법에 따라 바위손 식물체의 생존율에 현저한 차이가 발생한다.
이에 청정 조건에서 자연환경의 훼손 없이 정확한 수확 시기와 수확량의 예측이 가능하고, 기상이변이나 자연재해에 영향을 받지 않는 연중 균일한 품질의 바위손 원물을 기내 무균, 다습한 조건에서 대량 증식시키고, 이러한 방법으로 증식된 식물체를 일반 자연환경에서 생존이 가능하도록 적응시키는 토양 순화 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
일 측면에서, 본 발명의 목적은 바위손의 기내 식물체의 토양 순화 방법을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 재배된 바위손 식물체를 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 바위손(Selaginella tamariscina)의 기내 배양묘를 토양에 이식하는 이식단계; 및 상기 이식된 배양묘를 재배하는 재배단계를 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 단계들 중 하나 이상 또는 상기 단계들 전 또는 후에 상기 토양에 공기를 공급하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 공기 공급은 상기 토양에 공기를 0.7 내지 1.4 vvm(air volume/culture volume per min)로 일정하게 공급하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 이식단계는 바위손의 기내 배양묘를 1/4 내지 3/4로 절단하여 상기 토양에 이식하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 토양은 코코피트를 50 내지 53 중량%, 피트모스를 7 내지 13 중량%, 질석을 10 내지 16 중량%, 펄라이트를 12 내지 18 중량%, 제오라이트를 7 내지 13 중량%, 및 부식산을 0.07 내지 0.14 중량%로 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 재배단계는 상기 이식된 바위손 기내 배양묘 및 토양을 12일 내지 16일간 비닐막으로 덮어 습도를 유지하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 재배단계는 상기 습도를 유지한 후 10일 내지 18일간 상기 이식된 바위손의 기내 배양묘 및 토양을 기 설정된 주기로 환기시키는 것을 포함하고, 상기 기 설정된 주기는 5일 1회 내지 1일 5회 범위에서 점차 짧아지는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 재배단계는 상기 환기 후 상기 이식된 바위손의 기내 배양묘 및 토양을 완전히 공기 중에 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 전기전도도가 0.7 내지 1.3 dS/m인 양액을 공급하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 배양묘 이식 후 10일간 내지 18일간 광도를 40 내지 60 PPFD로 유지하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 광도를 유지하는 기간 후 10일간 내지 18일간 광도를 점차 증가시켜 90 내지 110 PPFD까지 도달하게 하는 것을 포함 할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 광도를 증가시키는 기간 후 광도를 90 내지 110 PPFD로 유지하는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 3주간 내지 8주간 수행하는 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 방법으로 재배된 바위손 식물체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명에 의해 제공되는 바위손의 토양 순화 방법은 기상이변이나 자연재해에 영향을 받지 않고 연중 균일한 품질의 바위손 원물을 확보할 수 있다.
도 1은 도 1은 배양 4주 후, 배지 내 무기물 농도에 따른 바위손 식물체의 생장 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 배양 4주 후, 배양 방법에 따른 바위손 식물체의 생장 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 토양에 이식된 바위손 기내 식물체를 2주간 비닐막으로 덮어 습도를 유지하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 4는 바위손 기내 식물체를 완전히 공기중에 노출시켜 재배하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 5는 순화 6주 경과 후, 재배 환경에 따른 바위손 식물체의 생장 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 배양 4주 후, 배양 방법에 따른 바위손 식물체의 생장 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 토양에 이식된 바위손 기내 식물체를 2주간 비닐막으로 덮어 습도를 유지하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 4는 바위손 기내 식물체를 완전히 공기중에 노출시켜 재배하는 모습을 나타내는 사진이다.
도 5는 순화 6주 경과 후, 재배 환경에 따른 바위손 식물체의 생장 결과를 나타낸 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 바위손(Selaginella tamariscina)의 기내 배양묘의 토양 순화 방법을 제공한다.
상기 바위손의 기내 배양묘는 다음과 같은 방법:
바위손(Selaginella tamariscina) 기내 식물체를 유도하는 유도단계; 및 상기 유도된 바위손 기내 식물체를 증식시키는 증식단계를 포함하는 방법으로 배양 증식될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 유도단계는 바위손 포자체의 정단부(shoot tip)를 배지에 가로로 접종하는 것을 포함하며, 바위손 포자체가 스스로 분주하게 함으로써 총 배양 기간을 단축할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 방법은 MS(Murashige and Skoog) 배지에 바위손 포자체 또는 식물체를 배양할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 유도단계 및/또는 증식단계에 사용되는 배지는 대량원소, 미량원소, 비타민 및 유기물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 대량원소는 질산암모늄 (NH4NO3), 염화칼슘 (CaCl2·2H2O), 황산마그네슘 (MgSO4·7H2O), 인산일칼륨 (KH2PO4), 및 질산칼륨 (KNO3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 미량 원소는 붕산 (H3BO3), 염화코발트 (CoCl2·6H2O), 망간(II)황산염 (MnSO4·4H2O), 요오드화칼륨 (KI), 몰리브덴산나트륨 (Na2MoO4·2H2O), 황산아연 (ZnSO4·7H2O), 에틸렌디아민테트라아세트산 제2철 나트륨 (FeNaEDTA), 및 황산구리 (CuSO4·5H2O)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로 상기 비타민 및 유기물은 미오-이노시톨, 니코틴산, 피리독신, 티아민, 글리신, 트립톤, 인돌 아세트산, 및 키네틴으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 유도단계는 0.7배 초과 내지 1.3배 농도의 MS배지에 바위손 포자체를 배양하는 단계일 수 있다.
구체적으로, 상기 유도단계에 사용되는 MS배지는 0.7배 초과, 0.8배 이상, 또는 0.9배 이상이면서, 1.0배 이하, 1.1배 이하, 1.2배 이하, 또는 1.3배 이하일 수 있다.
더 구체적으로 상기 유도단계에 사용되는 배지는 질산암모늄을 1155 mg/L 초과, 1320 mg/L 이상, 또는 1485 mg/L 이상이면서, 1650 mg/L 이하, 1815 mg/L 이하, 1980 mg/L이하, 또는 2145 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 염화칼슘을 232.4 mg/L 초과, 265.6 mg/L 이상, 또는 298.8 mg/L 이상이면서, 332.0 mg/L이하, 365.2 mg/L 이하, 398.4 mg/L 이하, 또는 431.6 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 황산마그네슘을 126.4 mg/L 초과, 144.4 mg/L 이상, 또는 162.5 mg/L 이상이면서, 180.5 mg/L 이하, 198.6 mg/L 이하, 216.6 mg/L 이하, 또는 234.7 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 인산일칼륨을 119 mg/L 초과, 136 mg/L 이상, 또는 153 mg/L 이상이면서, 170 mg/L 이하, 187 mg/L 이하, 204 mg/L 이하, 또는 221 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 질산칼륨을 1330 mg/L 초과, 1520 mg/L 이상, 또는 1710 mg/L 이상이면서, 1900 mg/L 이하, 2090 mg/L 이하, 2280 mg/L 이하, 또는 2470 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 붕산을 4.34 mg/L 초과, 4.96 mg/L 이상, 또는 5.58 mg/L 이상 이면서, 6.20mg/L 이하, 6.82 mg/L 이하, 7.44 mg/L 이하, 또는 8.06 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 염화코발트를 0.018 mg/L 초과, 0.020 mg/L 이상, 또는 0.023 mg/L 이상이면서, 0.025 mg/L 이하, 0.028 mg/L 이하, 0.030 mg/L 이하, 또는 0.033 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 망간(II)황산염을 11.83 mg/L 초과, 13.52 mg/L 이상, 또는 15.21 mg/L 이상 이면서, 16.90 mg/L이하, 18.59 mg/L 이하, 20.28 mg/L 이하, 또는 21.97 mg/L이하로 포함될 수 있다. 상기 배지는 요오드화칼륨을 0.58 mg/L 초과, 0.66 mg/L 이상, 또는 0.75 mg/L 이상 이면서, 0.83 mg/L이하, 0.91 mg/L 이하, 1.00 mg/L 이하, 또는 1.08 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 몰리브덴산나트륨을 0.18 mg/L 초과, 0.20 mg/L 이상, 또는 0.23 mg/L 이상 이면서, 0.25 mg/L이하, 0.28 mg/L 이하, 0.30 mg/L 이하, 또는 0.35 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 황산아연을 6.02 mg/L 초과, 6.88 mg/L 이상, 또는 7.74 mg/L 이상 이면서, 8.60 mg/L이하, 9.46 mg/L 이하, 10.32 mg/L 이하, 또는 11.18 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 에틸렌디아민테트라아세트산 제2철 나트륨을 25.69 mg/L 초과, 29.36 mg/L 이상, 또는 33.03 mg/L 이상 이면서, 36.70 mg/L 이하, 40.37 mg/L 이하, 44.04 mg/L 이하, 또는 47.71 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 황산구리를 0.01 mg/L 초과, 0.02 mg/L 이상, 또는 0.023 mg/L 이상 이면서, 0.025 mg/L 이하, 0.028 mg/L 이하, 0.03 mg/L 이하, 또는 0.033 mg/L이하로 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 유도단계에 사용되는 배지는 수크로오스를 27 g/L 내지 33g/L 및 겔화제는 2.0 g/L 내지 6.5 g/L로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 수크로오스는 27 g/L 이상, 28 g/L 이상, 또는 29 g/L 이상 이면서, 30 g/L이하, 31 g/L이하, 32 g/L이하, 또는 33 g/L이하로 포함될 수 있다. 상기 겔화제는 다당류인 것으로, 예를 들어 천연 다당류이며, 또한 예를 들어 박테리아의 발효에 의해 얻어진 천연 다당류(예를 들어, GelriteTM) 또는 조류에서 얻어진 천연 다당류 (예를 들어, agar)일 수 있다. 구체적으로, 박테리아의 발효에 의해 얻어지는 천연 다당류의 겔화제는 2.0 g/L 이상, 2.1 g/L 이상, 또는 2.2 g/L 이상 이면서, 2.3 g/L이하, 2.4 g/L g/L이하, 또는 2.5 g/L이하로 포함될 수 있거나 또는 조류에서 얻어진 천연 다당류는 6.0 g/L 이상, 6.1 g/L 이상, 또는 6.2 g/L 이상 이면서, 6.3 g/L이하, 6.4 g/L g/L이하, 또는 6.5 g/L이하로 포함될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 증식단계는 0.2배 내지 0.7배 농도의 MS배지에 바위손 포자체를 배양하는 단계일 수 있다.
구체적으로, 상기 증식단계에 사용되는 MS배지는 0.2배 이상, 0.3배 이상, 또는 0.4배 이상 이면서, 0.5배 이하, 0.6배 이하, 또는 0.7배 이하일 수 있다.
더 구체적으로 상기 증식단계에 사용되는 배지는 질산암모늄을 330 mg/L 이상, 495 mg/L 이상, 또는 660 mg/L이상이면서, 825 mg/L이하, 990 mg/L 이하, 또는 1155 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 염화칼슘을 66.4 mg/L 이상, 99.6mg/L 이상, 또는 132.8 mg/L 이상이면서, 166.0 mg/L 이하, 199.2 mg/L 이하, 또는 232.4 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 황산마그네슘을 36.1 mg/L 이상, 54.2 mg/L 이상, 또는 72.2 mg/L 이상 이면서, 90.3 mg/L 이하, 108.3 mg/L 이하, 또는 126.4 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 인산일칼륨을 34 mg/L 이상, 51 mg/L 이상, 또는 68 mg/L 이상이면서, 85 mg/L 이하, 102 mg/L 이하, 또는 119 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 질산칼륨을 380 mg/L 이상, 570 mg/L 이상, 또는 760 mg/L 이상이면서, 950 mg/L 이하, 1140 mg/L 이하, 또는 1330 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 붕산을 1.24 mg/L 이상, 1.86 mg/L 이상, 또는 2.48 mg/L 이상이면서, 3.10 mg/L 이하, 3.72 mg/L 이하, 또는 4.34 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 염화코발트를 0.005 mg/L 이상, 0.008 mg/L 이상, 또는 0.01 mg/L 이상 이면서, 0.013 mg/L 이하, 0.015 mg/L 이하, 또는 0.018 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 망간(II)황산염을 3.38 mg/L 이상, 5.07 mg/L 이상, 또는 6.76 mg/L 이상이면서, 8.45 mg/L 이하, 10.14 mg/L 이하, 또는 11.83 mg/L이하로 포함될 수 있다. 상기 배지는 요오드화칼륨을 0.17 mg/L 이상, 0.25 mg/L 이상, 또는 0.33 mg/L 이상이면서, 0.42 mg/L 이하, 0.50 mg/L 이하, 또는 0.58 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 몰리브덴산나트륨을 0.05 mg/L 이상, 0.08 mg/L 이상, 또는 0.10 mg/L 이상이면서, 0.13 mg/L 이하, 0.15 mg/L 이하, 또는 0.18 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 황산아연을 1.72 mg/L 이상, 2.58 mg/L 이상, 또는 3.44 mg/L 이상이면서, 4.30 mg/L 이하, 5.16 mg/L 이하, 또는 6.020 mg/L이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 에틸렌디아민테트라아세트산 제2철 나트륨을 7.34 mg/L 이상, 11.01 mg/L 이상, 또는 14.68 mg/L 이상이면서, 18.35 mg/L 이하, 22.02 mg/L 이하, 또는 25.69 mg/L 이하로 포함할 수 있다. 상기 배지는 황산구리를 0.005 mg/L 이상, 0.008 mg/L 이상, 또는 0.01 mg/L 이상이면서, 0.013 mg/L 이하, 0.015 mg/L 이하, 또는 0.018 mg/L이하로 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 증식단계에 사용되는 배지는 수크로오스를 27 g/L 내지 33g/L로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 수크로오스는 27 g/L 이상, 28 g/L 이상, 또는 29 g/L 이상이면서, 30 g/L이하, 31 g/L이하, 32 g/L이하, 또는 33 g/L이하로 포함될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 증식단계에 사용되는 배지가 고체인 경우, 상기 배지는 겔화제는 2.0 g/L 내지 6.5 g/L로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 겔화제는 다당류인 것으로, 예를 들어 천연 다당류이며, 또한 예를 들어 박테리아의 발효에 의해 얻어진 천연 다당류(예를 들어, GelriteTM) 또는 조류에서 얻어진 천연 다당류 (예를 들어, agar)일 수 있다. 구체적으로, 박테리아의 발효에 의해 얻어지는 천연 다당류의 겔화제는 2.0 g/L 이상, 2.1 g/L 이상, 또는 2.2 g/L 이상 이면서, 2.3 g/L이하, 2.4 g/L g/L이하, 또는 2.5 g/L이하로 포함될 수 있거나 또는 조류에서 얻어진 천연 다당류는 6.0 g/L 이상, 6.1 g/L 이상, 또는 6.2 g/L 이상 이면서, 6.3 g/L이하, 6.4 g/L g/L이하, 또는 6.5 g/L이하로 포함될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 증식단계의 배양은 액체 배양일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 증식단계의 배양은 침지 형태일 수 있다. 여기서 침지는 바위손 식물체를 액체 배지에 완전히 침지하여 배양하는 형태로 식물체의 양분 흡수율을 높이는 배양 방식을 의미한다.
일 구현예에 있어서, 상기 증식단계의 배양은 래프트 타입일 수 있다. 예컨대, 필터 페이퍼를 사용하지 않는 래프트 타입일 수 있다. 여기서 래프트 타입은 배양 용기 내부에 망을 설치하여 바위손 식물체가 공기와 접촉하도록 하여 식물체의 호흡률을 높게 하는 배양 방식이다.
일 구현예에 있어서, 상기 증식단계의 배양은 1주 내지 10주 이내에 이루어질 수 있고, 2주 내지 8주 이내로 이루어질 수 있으며, 3주 내지 5주 이내에 이루어질 수 있다. 기존 기내 배양 증식 방법은 12주 이상의 시간이 소요되는 데 비해 본 발명의 방법으로는 4주 이내에 균일한 품질의 바위손 식물체를 증식시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 기내 배양 증식된 바위손의 기내 배양묘를 토양에 이식하는 이식단계; 및 상기 이식된 배양묘를 재배하는 재배단계를 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 단계들 중 하나 이상 또는 상기 단계들 전 또는 후에 상기 토양에 공기를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 예시적으로, 바위손 기내 배양묘를 토양에 이식 전부터 순화시키는 전체 기간 동안 일정하게 공급하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 공기 공급은 상기 토양에 공기를 0.7 내지 1.4 vvm(air volume/culture volume per min)로 일정하게 공급하는 것일 수 있다. 또는 구체적으로, 상기 공급되는 공기는 0. 7 vvm 이상, 0. 8 vvm 이상, 0. 9 vvm 이상, 또는 1.0 vvm 이상이면서, 1.1 vvm 이하, 1.2 vvm 이하, 1.3 vvm 이하, 또는 1.4 vvm 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 이식단계는 바위손의 기내 배양묘를 1/4 내지 3/4로 절단하여 상기 토양에 이식하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 기내 배양된 바위손 배양묘를 1/4 이상 또는 1/2 이상이면서, 3/4 이하의 크기로 절단한 후 상기 토양에 절단된 배양묘를 이식하는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 코코피트를 50 내지 53 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 코코피트는 50.0 중량% 이상, 50.5 중량% 이상, 51.0 중량% 이상, 또는 51.5 중량% 이상이면서, 52.0 중량% 이하, 52.5 중량% 이하, 또는 53.0 중량% 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 토양은 코코피트를 50 내지 53 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 코코피트는 50.0 중량% 이상, 50.5 중량% 이상, 51.0 중량% 이상, 또는 51.5 중량% 이상이면서, 52.0 중량% 이하, 52.5 중량% 이하, 또는 53.0 중량% 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 토양은 상기 피트모스를 7 내지 13 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 피트모스는 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상이면서, 11 중량% 이하, 12 중량%이하, 또는 중량% 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 토양은 질석을 10 내지 16 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 질석은 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 또는 13 중량% 이상이면서, 14 중량% 이하, 15 중량% 이하, 또는 16 중량% 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 토양은 펄라이트를 12 내지 18 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 펄라이트는 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량%, 또는 15 중량% 이상이면서, 16 중량% 이하, 17 중량% 이하, 또는 18 중량% 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 토양은 제오라이트를 7 내지 13 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제오라이트는 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 또는 10 중량% 이상이면서, 11 중량% 이하, 12 중량% 이하, 또는 13 중량% 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 토양은 부식산을 0.07 내지 0.14 중량%로 포함할 수 있다. 구체적으로 부식산은 0.07 중량% 이상, 0.08 중량%이상, 0.09 중량% 이상, 또는 0.1 중량% 이상이면서, 0.11 중량% 이하, 0.12 중량% 이하, 0.13 중량% 이하, 또는 0.14 중량% 이하일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 재배단계는 상기 이식된 바위손 기내 배양묘 및 토양을 10일간 내지 18일간 비닐막으로 덮어 습도를 유지하는 것을 포함할 수 있다. 도 3에서 보이는 바와 같이, 바위손의 기내 식물체를 상기 토양에 이식한 후 식물체가 시들지 않도록 육묘 트레이 상부를 비닐막으로 완전히 덮어 습도를 유지하는 것이다. 구체적으로, 상기 습도유지는 10일간, 11일간, 12일간, 13일간, 14일간, 15일간, 16일간, 17일간 또는 18일간 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 재배단계는 상기 습도를 유지한 후 10일 내지 18일간 상기 이식된 바위손의 기내 배양묘 및 토양을 기 설정된 주기로 환기시키는 것을 포함하고, 상기 주기는 점차 짧아지는 것일 수 있다. 습도유지 후 비닐막을 열었다 덮었다를 반복하여 조금씩 공기에 노출시키는 것이다. 구체적으로 상기 기 설정된 주기는 5일 1회, 4일 1회, 3일 1회, 2일 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 또는 1일 5회일 수 있고, 상기 설정된 주기는 점차 짧아질 수 있다. 또한 구체적으로, 상기 환기는 10일간, 11일간, 12일간, 13일간, 14일간, 15일간, 16일간, 17일간 또는 18일간 수행될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 재배단계는 상기 환기 후 상기 이식된 바위손의 기내 배양묘 및 토양을 완전히 공기 중에 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 전기전도도가 0.7 내지 1.3 dS/m인 양액을 공급하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 양액의 전기전도도는 0.7 dS/m 이상, 0.8 dS/m 이상, 0.9 dS/m 이상, 또는 1.0 dS/m 이상이면서, 1.1 dS/m 이하, 1.2 dS/m 이하, 또는 1.3 dS/m 이하일 수 있다. 상기 양액은 MS(Murashige and Skoog)배지를 이용하여 전기전도도를 조정할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 배양묘 이식 후 10일간 내지 18일간 광도를 45 내지 55 PPFD로 유지하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 순화 초기 10일간, 11일간, 12일간, 13일간, 14일간, 15일간, 16일간, 17일간, 또는 18일간 광도를 유지하는 것일 수 있고, 상기 광도는 45 PPFD 이상, 46 PPFD 이상, 47 PPFD 이상, 48 PPFD 이상, 49 PPFD 이상, 또는 50 PPFD 이상이면서, 51 PPFD 이하, 52 PPFD 이하, 53 PPFD 이하, 54 PPFD 이하, 또는 55 PPFD 이하로 광도를 일정하게 유지할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 광도를 유지하는 기간 후 10일간 내지 18일간 광도를 점차 증가시켜 90 내지 110 PPFD까지 도달하게 하는 것을 포함할 수 있다. 상기 순화 초기 10일간 내지 18일간 광도 유지를 한 후, 추가적인 10일간 내지 15일간 광도를 점차 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 기간은 10일간, 11일간, 12일간, 13일간, 14일간, 15일간, 16일간, 17일간, 또는 18일간의 기간일 수 있고, 상기 광도는 45 PPFD 이상, 46 PPFD 이상, 47 PPFD 이상, 48 PPFD 이상, 49 PPFD 이상, 50 PPFD 이상, 51 PPFD 이상, 52 PPFD 이상, 53 PPFD 이상, 54 PPFD 이상, 또는 55 PPFD 이상으로부터 90 PPFD 이하, 91 PPFD 이하, 92 PPFD 이하, 93 PPFD 이하, 94 PPFD 이하, 95 PPFD 이하, 96 PPFD 이하, 97 PPFD 이하, 98 PPFD 이하, 99 PPFD 이하, 100 PPFD 이하, 101 PPFD 이하, 102 PPFD 이하, 103 PPFD 이하, 104 PPFD 이하, 105 PPFD 이하, 106 PPFD 이하, 107 PPFD 이하, 108 PPFD 이하, 109 PPFD 이하, 또는 110 PPFD 이하까지 점차 증가시키는 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 광도를 점차 증가시키는 기간 후 광도를 90 내지 110 PPFD로 유지하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 광도는 90 PPFD 이상, 91 PPFD 이상, 92 PPFD 이상, 93 PPFD 이상, 94 PPFD 이상, 95 PPFD 이상, 96 PPFD 이상, 97 PPFD 이상, 98 PPFD 이상, 99 PPFD 이상, 또는 100 PPFD 이상이면서, 101 PPFD 이하, 102 PPFD 이하, 103 PPFD 이하, 104 PPFD 이하, 105 PPFD 이하, 106 PPFD 이하, 107 PPFD 이하, 108 PPFD 이하, 109 PPFD 이하, 또는 110 PPFD 이하로 유지하는 것일 수 있다.
예를 들어, 순화 초기 14일간은 광도를 50 PPFD으로 유지시키다가, 점차 광도를 높여 순화 28일 이후에는 100 PPFD로 유지시킬 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 방법은 3주간 내지 8주간 수행하는 것일 수 있다. 구체적으로, 총 3주간, 4주간, 5주간, 6주간, 7주간, 또는 8주간 수행하는 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 방법으로 재배된 바위손 식물체를 제공한다.
이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
[실시예 1]
(1)
바위손 기내 식물체의 유도
바위손(Selaginella tamariscina, 대한민국) 식물체를 2% 치아염소산 나트륨(Sodium Hypochlorite) 용액으로 20분간 표면 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 수크로오스 30g/L, GelriteTM 2.3g/L(Duchefa, 네덜란드)가 첨가된 1.0 MS 배지(Murashige and Skoog Medium, Duchefa, 네덜란드)를 이용하여 23±1℃가 유지되는 명조건에서 기내 식물체를 유도하였다. 이때 배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후 121℃ 1.2 기압에서 멸균한 것을 사용하였으며, 배양실 내 광환경은 24시간 주기로 명조건 16시간, 암조건 8시간으로 조정하였다.
(2)
바위손 기내 식물체의 증식
4주 간격으로 유지/증식 시키는 바위손 기내 식물체를 한 절편체(explant)당 0.03g 내외로 분리하여 120ml의 1/2 MS배지가 분주 된 500ml 배양 용기(125 x 110 mm, GAOOZE 1011C, Korea Scientific Technique Industry, Korea)에 12개체씩 접종하였다. 한 배양병 당 접종된 초기 12개체의 접종 밀도는 0.4g/120ml로 고정하였으며, 기타 배지 조성과 환경조건은 식물체 유도 조건과 동일하게 관리하였다.
[실시예 2]
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 바위손 기내 식물체를 유도하고 증식시키되, 바위손 기내 식물체의 증식 시, 겔화제인 GelriteTM를 제외한 액체 상태의 0.5 MS배지를 이용하고, 배양용기 내부에 필터 페이퍼 없이 망을 설치하여 바위손 식물체 일부가 공기와 접촉하도록 한 환경에서 바위손 기내 식물체를 증식시켰다.
[실시예 3]
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 바위손 기내 식물체를 유도하고 증식시키되, 배양 용기 내부에 필터 페이퍼를 사용하고, 망을 설치하여 바위손 식물체 일부가 공기와 접촉하도록 한 환경에서 바위손 기내 식물체를 증식시켰다.
[비교예 1 내지 5]
비교예 1은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 바위손 기내 식물체를 유도하고 증식시키되, MS배지 없이, 즉 무기물이 없는 겔화제(GelriteTM)만으로 만들어진 고체 배지를 이용하였다.
비교예 2,3 및 4는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 바위손 기내 식물체를 유도하고 증식시키되, MS배지의 농도를 각각 0.25, 1.0, 2.0배로 하였다.
비교예 5는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 바위손 기내 식물체를 유도하고 증식시키되, 바위손 식물체를 배양액에 완전히 침지하여 공기와 접촉하지 않도록 한 환경에서 증식시켰다.
표 1에서 각 실시예 및 비교예의 바위손 기내 식물체 증식 조건을 비교하였다. 이때 사용된 배양 배지는 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조성의 MS배지를 기준으로, 여기에 포함되는 모든 무기물의 농도를 0.25배, 0.5배, 1.0배 및 2.0배로 조절하여 배지를 제조하였다.
[실험예 1]
바위손의 기내 식물체 생장에 적합한 배지 내 무기물 농도 실험
고체 MS 배지 내의 무기물 농도를 표 1과 같이 0, 0.25배, 0.5배, 1.0배 및 2.0배로 조절한 배지를 준비하고, 4주 간격으로 유지/증식 시키는 기내 배양 바위손 식물체를 한 절편체(explant)당 0.03g 내외로 분리하여 120ml의 고체 배지가 분주 된 500ml 배양 용기(115x140mm, Plant Culture Bottle ±, SPL Life Science, Korea)에 12개체씩 접종하였다. 한 배양병 당 접종된 초기 12개체의 접종 밀도는 0.4g/120ml로 고정하였으며, MS 무기물 농도를 제외하고 기타 배지 조성과 환경조건은 식물체 유도 조건과 동일하게 관리하였다.
그 결과, 바위손 지상부 생장에 적합한 배지의 최적 무기물 농도는 0.5 MS였으며, 배양 4주 후, 초기 대비 생체중이 4.3배 이상 증가함을 확인하였고, 그 결과를 표 3 및 도 1에 나타내었다.
[실험예 2] 바위손 기내 식물체 생장에 적합한 배양 방법의 선발
배지의 종류를 고체 (실시예 1), 액체로 준비하고, 액체 배지는 배양용기 내부에 필터 페이퍼가 없는 망을 설치한 래프트 타입(실시예 2), 필터 페이퍼가 있는 망을 설치한 래프트 타입(실시예 3), 망을 설치하지 않은 액체 배지(비교예 5)를 각각 준비하였다. 4주 간격으로 유지/증식 시키는 기내 배양 바위손 식물체를 한 절편체(explant)당 0.03g 내외로 분리하여 120ml의 0.5 MS배지가 분주 된 500ml 배양 용기(125 x 110 mm, GAOOZE 1011C, Korea Scientific Technique Industry, Korea)에 12개체씩 접종하였다. 한 배양병 당 접종된 초기 12개체의 접종 밀도는 0.4g/120ml로 고정하였으며, 액체 배지의 경우 gelling agent 만을 제외하고 기타 배지 조성과 환경조건은 식물체 유도 조건과 동일하게 관리하였다.
그 결과, 배양 4주 후, 필터페이퍼를 사용하지 않은 래프트 타입의 액체 배양 방식(실시예 2)에서 기존 고체 배양 방식 대비 바위손의 지상부 생장이 4배 이상 증가하였고, 뿌리 형성률 또한 우수함을 확인하였으며, 그 결과를 표 4 및 도 2에 나타내었다.
[실시예 4]
(1)
기내 배양묘의 획득
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 바위손의 기내 배양묘를 배양 증식시켰다.
(2)
순화용 상자 제조
바위손 기내 식물체를 순화시키기 위하여 29.5 cm(가로) x 23.0cm(세로) x 8.4cm(높이) 크기의 플라스틱 박스에 200구 육묘 트레이를 처리구별로 36개 설치하였다. 36개의 200구 트레이에 원예용 상토(한아름, 신성 미네랄)를 멸균하여 채워준 뒤, 트레이 하단에 공기 공급을 위하여 고무 분산기(Flexible air stone)를 설치하였다. 고무 분산기를 통하여 순화 상자에 공급되는 공기는 순화 전 기간 동안 에어플로우 미터(air flow meters, RMA series; Dwyer Instruments, Inc., 미국)를 이용하여 1.0vvm(air volume/culture volume per min)으로 일정하게 조절하였다. 사용한 토양은 원예용 상토로서, 그 원료 및 배합 비율은 코코피트 51.5 중량%, 피트모스 10 중량%, 질석 13 중량%, 펄라이트 15 중량%, 제오라이트 10 중량%, 부식산 0.1 중량%, 비료 (N,P,K 및 미량요소) 0.4 중량%로 하였다.
(3)
바위손 기내 배양묘의 토양 이식
4주간 액체 배양한 바위손 기내 배양묘를 흐르는 물에 세척 후 1/2로 절단하여, 토양이 담긴 육묘 트레이에 이식하였다. 이식 후 2주간은 묘가 시들지 않도록 비닐로 덮어 습도를 유지시켰으며, 점차 환기를 시켜 이식 4주 후 완전히 공기 중에 노출시켜 재배하였다. 모든 순화 과정은 23±1℃가 유지되는 식물 배양실에서 진행되었으며, 배양실 내 광환경은 24시간 주기로 명조건 16시간, 암조건 8시간으로 조정하였다.
(4)
바위손의 토양 순화
각 순화용 상자에 700ml의 양액(MS 배지를 이용하여 전기전도도 1.0dS/m 로 조정)을 저면 관수 방법으로 공급하였다. 광도는 최초 순화 2주간은 50PPFD(Photosynthesis Photon Flux Density)로 유지시켰으며, 그 후 점차 광도를 높여 순화 4주 후부터는 100PPFD로 유지하며 6주간 순화시켰다.
[비교예 6 내지 9]
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 바위손 기내 식물체를 재배하되, 토양의 종류를 펄라이트로 사용하였다. 비교예 6 및 7의 경우, 공기의 공급없이 양액의 전기전도도를 각각 0.2 dS/m 및 1.0 dS/m으로 하여 재배하였다. 비교예 8 및 9의 경우, 공기 공급속도를 1.0 vvm으로 하였고, 양액의 전기전도도를 각각 0.2 dS/m 및 1.0 dS/m으로 하여 재배하였다.
[비교예 10 내지 12]
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 바위손 기내 식물체를 재배하되, 비교예 10 및 11의 경우, 공기의 공급없이 양액의 전기전도도를 각각 0.2 dS/m 및 1.0 dS/m으로 하여 재배하였다. 비교예 12의 경우, 공기 공급속도를 1.0 vvm으로 하였고, 양액의 전기전도도를 0.2 dS/m으로 하여 재배하였다.
표 5에서 각 실시예 및 비교예의 바위손 기내 식물체 증식 조건을 비교하였다.
토양의 종류를 펄라이트로 하여 바위손 식물체를 재배한 결과, 표 6에서 알 수 있듯이, 공기를 공급하지 않고 0.2 및 1.0 dS/m의 양액을 각각 공급한 비교예 6 및 7은 건체중이 초기 대비 각각 약 1.2배 및 1.6배 증가하였고, 공기를 공급하고 0.2 및 1.0 dS/m의 양액을 각각 공급한 비교예 8 및 9는 건체중이 초기 대비 각각 약 1.2배 및 2.8배 증가하였다.
토양을 종류를 원예용 상토로 하여 바위손 식물체를 재배한 결과, 공기를 공급하지 않고 0.2 및 1.0 dS/m의 양액을 각각 공급한 비교예 10 및 11은 건체중이 초기 대비 각각 약 2.1배 및 2.5배 증가하였고, 공기를 공급하고 0.2 dS/m의 양액을 공급한 비교예 12의 경우는 건체중이 초기 대비 약 2.3배 증가하였다. 반면에, 공기를 공급하고 1.0 dS/m의 양액을 공급한 실시예 4의 경우는 건체중이 초기 대비 약 3.5배 증가하는 결과를 보였다.
Claims (14)
- 바위손(Selaginella tamariscina)의 기내 배양묘를 토양에 이식하는 이식단계; 및
상기 이식된 배양묘를 재배하는 재배단계를 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 상기 단계들 중 하나 이상 또는 상기 단계들 전 또는 후에 상기 토양에 공기를 공급하는 것을 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법. - 제2항에 있어서,
상기 공기 공급은 상기 토양에 공기를 0.7 내지 1.4 vvm(air volume/culture volume per min)로 일정하게 공급하는 것인, 바위손의 토양 순화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 이식단계는 바위손의 기내 배양묘를 1/4 내지 3/4로 절단하여 토양에 이식하는 것을 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 토양은 코코피트를 50 내지 53 중량%, 피트모스를 7 내지 13 중량%, 질석을 10 내지 16 중량%, 펄라이트를 12 내지 18 중량%, 제오라이트를 7 내지 13 중량%, 및 부식산을 0.07 내지 0.14 중량%로 포함하는 것인,
바위손의 토양 순화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 재배단계는 상기 이식된 바위손 기내 배양묘 및 토양을 12일 내지 16일간 비닐막으로 덮어 습도를 유지하는 것을 포함하는 것인,
바위손의 토양 순화 방법. - 제6항에 있어서,
상기 재배단계는 상기 습도를 유지한 후 10일간 내지 18일간 상기 이식된 바위손의 기내 배양묘 및 토양을 기설정된 주기로 환기시키는 것을 포함하고,
상기 기설정된 주기는 5일 1회 내지 1일 5회 범위에서 점차 짧아지는 것인,
바위손의 토양 순화 방법. - 제7항에 있어서,
상기 재배단계는 상기 환기 후 상기 이식된 바위손의 기내 배양묘 및 토양을 완전히 공기 중에 노출시키는 것을 포함하는 것인,
바위손의 토양 순화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 전기전도도가 0.7 내지 1.3 dS/m인 양액을 공급하는 것을 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 상기 배양묘 이식 후 10일간 내지 18일간 광도를 45 내지 55 PPFD로 유지하는 것을 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법. - 제10항에 있어서,
상기 방법은 상기 광도를 유지하는 기간 후 10일간 내지 18일간 광도를 점차 증가시켜 90 내지 110 PPFD까지 도달하게 하는 것을 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법. - 제11항에 있어서,
상기 방법은 상기 광도를 점차 증가시키는 기간 후 광도를 90 내지 110 PPFD로 유지하는 것을 포함하는, 바위손의 토양 순화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 3주간 내지 8주간 수행하는 것인, 바위손의 토양 순화 방법. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 재배된 바위손 식물체.
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|---|---|---|---|---|
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