KR20230057325A - 자궁경부암의 조기 진행 진단을 위한 정보 제공 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들로부터 치료 전/후의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 마이크로 RNA들로 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p), 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p), 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p), 및 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p)를 발굴하고, PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA, 및 FCGR1A(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA와 관련됨을 확인하였는 바, 상기 마이크로 RNA들 및 mRNA를 포함하는 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커 조성물, 자궁경부암의 조기 진행 진단용 조성물, 자궁경부암 조기 진행 진단용 키트, 자궁경부암의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
자궁경부암(cervical cancer)은 여성에게 빈번하게 발생되는 악성 종양으로, 매년 전세계적으로 35만 명 이상의 환자가 자궁경부암으로 사망하고 있다. 자궁경부암은 0기에서 4기까지 나뉘고 0기 암을 상피내암이라고도 하며, 1기부터 4기 암을 침윤성 자궁경부 암이라고 한다. 상피내암은 침윤성 자궁경부암보다 10년 정도 빠르게 35~40세 정도에서 발병하며 침윤성 자궁경부암은 30세 이후부터 증가하기 시작하여 50대에 정점에 달한 후 급격히 감소하는 경향을 보이는 것으로 알려져 있다. 국내의 경우 자궁경부암의 유병률 수준은 10만 명당 31명 정도이고 사망률은 10만 명당 6.8명 수준으로 지난 10년간 큰 변화를 보이지 않았다. 발생률과 유병률의 빈도를 연령별로 보면 50대, 60대, 40대의 순이며, 발생률은 미국의 3배, 일본의 2.5배, 브라질의 1/3 수준이며 자궁경부암으로 인한 사망률이 암 사망률에서 차지하는 비율이 6%로 미국, 일본, 스위스 등의 2% 내외에 비하여 높은 실정이다. 현재 자궁경부암 발생에 관해서는 성적 접촉성 감염질환 모델이 가장 널리 인정되고 있으며 조기에 시작된 성적 활동, 다수의 성교 상대자, 남성 요인, 인유두종 바이러스(human papillomavirus, HPV) 감염, 에이즈 바이러스(human immunodeficiency virus) 감염 등이 자궁경부암 발생의 위험 요인으로 알려져 있다.
자궁경부암의 치료 후 재발률은 1년 내 50%, 2년 내 25%, 3년 내 15% 정도로서, 약 85%의 환자가 3년내 재발을 한다. 특히 자궁경부암의 방사선 치료 후의 재발율 또한 55%가 넘는다. 재발한 자궁경부암의 치료는 기존에 받았던 치료의 종류와 환자의 상태에 따라 다르게 결정되는데, 일반적으로 1차 치료로 수술을 했다면 재발시에는 방사선 치료를, 1차 치료로 방사선 치료를 했다면 수술을 고려하며, 두 가지 치료가 모두 불가능할 경우 항암화학요법을 시행하게 된다. 그러나 표준적인 치료법은 없으며 재발부위에 따라 각각에 대한 적절한 치료를 실시하는데, 일반적으로 병을 고치는 것보다 증상을 경감시기는 것을 목적으로 하는 치료법이다.
자궁경부암으로 항암방사선 치료를 시행하는 환자들의 치료 결과는 병의 진행 정도에 따라 예상할 수 있지만, 때론 우리가 전혀 예상한 시점 보다 훨씬 빠르게 진행하며 안 좋은 결과로 이어지는 경우가 발생한다. 이러한 현상은 암의 3대 치료 요법인 수술, 항암, 방사선 치료에서 모두 보고되고 있다. 하지만 현재까지 이에 대한 명확한 설명은 없다. 이를 설명할 수 있는 한가지 가정은 치료 환자들이 염증 및 스트레스에 정상적으로 반응하지 못하는 경우이다. 방사선 치료는 특히 강한 염증과 스트레스 반응을 동반하므로 정상적인 급성 스트레스 반응을 유지하기 어려운 경우 조절되지 않은 염증반응으로 인해 암세포를 부양하는 결과로 이어질 수 있다. 따라서 임상적으로 상기의 문제들을 해결하기 위해서는 이를 예측하기 위한 정확한 예후 및 치료 반응 예측 도구가 필요하다. 임상결과들은 단순하지만 그 이면에는 복잡한 생물학적인 의미를 내포하고 있으므로 좀 더 유의미한 상위 레벨의 접근방법이 필요하다.
한편, 엑소좀(Exosome)은 암세포 혹은 다른 정상세포에 분비되는 40-150 nm의 세포외 소포(extracellular vesicles)로써, 세포와 세포간의 신호전달을 통한 여러 생리적 기능을 수행하며 암의 발생, 전이, 면역력, 염증 그리고 스트레스 반응의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들은 특이 non coding/coding RNA들을 포함하고 있으며 여러 coding RNA를 조절하는 miRNA가 이러한 기능들을 조절하는 핵심역할을 한다. 따라서 exosome miRNA는 현 시점에서 생각해 볼 수 있는 상위 레벨의 조절인자로서 고려될 수 있다. 특히 혈액 안에는 암세포뿐만 아니라 정상세포에서 기원한 exosome들도 풍부하기 때문에 암환자들의 신체적 반응과 암세포 간의 관련성을 알기 용이하며 동시에 miRNA와 coding gene 사이의 연관성을 살펴보는 것도 가능하다.
본 발명은 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명자들은 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들 중에서 치료 전/후로 혈액 샘플을 채취하고, 이로부터 혈장 엑소좀(exosome) RNA를 분리한 후, NGS 분석을 통해 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 마이크로 RNA들을 검출하고, 이들을 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커로 제공하는 것이다.
본 발명은 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p) 및 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p) 및 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 조기 진행 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조기 진행 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 조기 진행 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p) 또는 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 항암방사선 치료를 받는 자궁경부암 환자들로부터 치료 전/후의 혈액에서 분리한 엑소좀 내에 포함된 microRNA를 분석한 결과, 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 마이크로 RNA들로 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p), 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p), 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p), 및 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p)를 발굴하고, PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA, 및 FCGR1A(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA와 관련됨을 확인하였는 바, 상기 마이크로 RNA들 및 mRNA를 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)을 진단하는 수단으로 활용될 수 있으며, 치료 및 수술 후의 예후를 예측하는데 유용한 바이오 마커로써 임상에서 효율적으로 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 마이크로 RNA들 및 mRNA의 메커니즘을 나타내는 그림이다.
도 2은 항암 방사선 치료를 시행한 자궁경부암 환자들에 대한 치료과정, 혈액의 채취 시점, MRI 촬영 시점, 및 추적 관찰 과정을 설명한 모식도이다.
도 3는 항암 방사선 치료를 시행한 자궁경부암 환자들에 대하여 추적관찰 및 진행시간에 따른 자궁경부암 환자들을 표시하고 이른 진행, 진행 부위, 2차 치료, 그리고 생존 여부등에 대해서 설명하였다.
도 4은 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 유의한 연관성을 가진 miRNA(log2FC)들의 서브그룹(Subgroup) 분석을 통한 miRNA의 선별 결과이다.
도 5는 상기 도 4에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 6는 선별된 miRNA 군 및 그들과 연관된 miRNA들을 네트워크 서브그룹(network subgroup)으로 나누어 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 7은 선별된 miRNA 군과 연관 mRNA들 간의 구조를 파악한 network 분석한 결과이다.
도 8은 각 임상 요소와 높은 관련성이 있는 mRNA (A) 및 네트워크(network) 분석을 통해 얻어진 miRNA 및 mRNA(B)를 포함하여 관련 유전자들을 선별한 결과다.
도 9은 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)에 관련된 miRNA와 mRNA들을 IPA(Ingenuity pathway analysis) 분석한 결과이다.
도 10는 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 4개의 함수 범주(function category)들의 벤다이어그램을 그린 결과이다.
도 11은 상기 도 10에서 재선별된 mRNA 및 miRNA들을 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 12은 상기 도 11에 포함된 RNA들의 log2FC 값들을 IPA database로 분석하여 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP) 여부에 따라 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 범주들을 분석한 결과이다.
도 13는 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 주 miRNA에 대하여 선별된 범주들의 상대적 비율을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 14은 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화된 mRNA 및 miRNA들을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 15는 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화하는 RNA들의 함수(function)를 정리한 표이다.
도 16는 주변 HPA 축(Peripheral HPA axis) 및 주 miRNA 사이의 연관성을 분석한 결과이다.
도 17은 도 11의 mRNA들을 대상으로 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)에 대한 서브그룹을 분석한 결과이다.
도 18은 상기 도 17에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 2은 항암 방사선 치료를 시행한 자궁경부암 환자들에 대한 치료과정, 혈액의 채취 시점, MRI 촬영 시점, 및 추적 관찰 과정을 설명한 모식도이다.
도 3는 항암 방사선 치료를 시행한 자궁경부암 환자들에 대하여 추적관찰 및 진행시간에 따른 자궁경부암 환자들을 표시하고 이른 진행, 진행 부위, 2차 치료, 그리고 생존 여부등에 대해서 설명하였다.
도 4은 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 유의한 연관성을 가진 miRNA(log2FC)들의 서브그룹(Subgroup) 분석을 통한 miRNA의 선별 결과이다.
도 5는 상기 도 4에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 6는 선별된 miRNA 군 및 그들과 연관된 miRNA들을 네트워크 서브그룹(network subgroup)으로 나누어 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 7은 선별된 miRNA 군과 연관 mRNA들 간의 구조를 파악한 network 분석한 결과이다.
도 8은 각 임상 요소와 높은 관련성이 있는 mRNA (A) 및 네트워크(network) 분석을 통해 얻어진 miRNA 및 mRNA(B)를 포함하여 관련 유전자들을 선별한 결과다.
도 9은 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)에 관련된 miRNA와 mRNA들을 IPA(Ingenuity pathway analysis) 분석한 결과이다.
도 10는 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 4개의 함수 범주(function category)들의 벤다이어그램을 그린 결과이다.
도 11은 상기 도 10에서 재선별된 mRNA 및 miRNA들을 네트워크(network)로 분석한 결과이다.
도 12은 상기 도 11에 포함된 RNA들의 log2FC 값들을 IPA database로 분석하여 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP) 여부에 따라 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 범주들을 분석한 결과이다.
도 13는 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 주 miRNA에 대하여 선별된 범주들의 상대적 비율을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 14은 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화된 mRNA 및 miRNA들을 그래프로 나타낸 결과이다.
도 15는 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)과 관련된 주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화하는 RNA들의 함수(function)를 정리한 표이다.
도 16는 주변 HPA 축(Peripheral HPA axis) 및 주 miRNA 사이의 연관성을 분석한 결과이다.
도 17은 도 11의 mRNA들을 대상으로 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)에 대한 서브그룹을 분석한 결과이다.
도 18은 상기 도 17에서 선별된 miRNA의 상관관계를 분석한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 혈장 엑소좀 miRNA가 항암방사선 치료를 시행한 환자들에게서 나타나는 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)을 예측할 수 있는 바이오 마커인지 확인하기 위해, 방사선 치료 전/후(2주)간의 혈장 엑소좀 miRNA를 분석하여 fold change를 통해 임상 변수가 나타나는 miRNA를 검출하였다.
본 발명은 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p) 및 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 자궁경부암의 조기 진행 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
암을 진단시 암세포가 퍼진 정도에 따라 암의 진행단계를 결정할 때에 TNM법에 의한 암의 상태가 1기, 2기, 3기, 4기로 진행단계가 결정되며, 상기 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)은 암의 진행단계가 1기에 해당되는 것으로 자궁경부에만 암조직이 존재하고, 림프절이나 다른 장기로 퍼지지 않은 상태로 수술 등의 치료 후 완치 등 좋은 예후를 보일 것으로 예상되는 상태이다.
그러나 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP) 상태임에도 불구하고, 적절한 항암방사선 치료 후에도 6-7개월, 진단 후 1년 이내에 치료 부위를 제외한 부위에서 암의 진행이 이루어지기도 하며, 이는 치료부위를 포함할 수도 그렇지 않을 수도 있다. 이는 통상적으로 병기에 따라 진행 자궁경부암에서 항암방사선 치료를 진행하였을 때 기대되는 무진행생존기간보다 짧은 기간내에 병의 진행이 이루어지면서 2차적 치료에 반응하지 않거나 2차적 치료를 시도해 볼 시간도 없이 죽음에 이를 가능성이 높아진다. 표 1 및 도 3을 참고하면, 7명의 이른 진행 환자들 중 3명이 진단 후 1년 이내에 사망하는 것으로 나타났다.
상기 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p)는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p)는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진다.
상기 바이오 마커 조성물은 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p), 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p), PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA, 및 FCGR1A(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p)는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p)는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어지고, 상기 FCGR1A(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진다.
또한, 본 발명은 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p) 및 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 자궁경부암의 조기 진행 진단용 조성물을 제공한다.
상기 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 마이크로 RNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
상기 프라이머는 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기 프로브는 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 진단용 조성물은 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p), 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p), PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA, 및 FCGR1A(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조기 진행 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 조기 진행 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다. 예컨대, 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p) 또는 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀이다.
상기 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
상기 제공 방법은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p), 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p), PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA, 및 FCGR1A(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
상기 대상체는 자궁경부암을 치료하기 위한 방사선 치료를 받는 환자일 수 있다.
상기 진단은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 상기 예후는 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다.
상기 진단을 위한 정보 제공 방법은 진단 또는 예후 예측을 위한 예비적 단계로써 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
1. 환자 및 검체
자궁경부암이 진단된 후 항암 방사선 치료를 받은 환자들 중에서 방사선 범위 및 범위 이외에 다발성으로 암이 진행된 환자들을 임상 종료점(Clinical end point)으로 선정하였다. 1년 이내라도 방사선 치료 범위 내에 국소적으로 암이 진행되는 경우는 포함하지 않았다. 아주 대학교 병원 연구위원회 (Institutional Review Board)는 기증자로부터 정보제공에 대한 동의를 받고, 이 연구를 승인하였다.
자궁경부암의 병기는 FIGO 2018(The 2018 International Federation of Gynecology and Obstetrics) 단계를 기준으로 설정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 항암 방사선 치료를 시행한 28명의 자궁경부암 환자들에 대한 치료과정, 혈액의 채취 시점, MRI 촬영 시점, 및 추적 관찰 과정을 실시하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 전체 환자들의 median f/u은 16.9 개월로 그래프의 상단의 7명은 조기 진행(Early progression, EP)을 겪은 환자들이며, 병의 진행은 방사선 치료를 시행한 부위 외에서 (out-field) 모두 진행하는 양상이었으며, 진행의 시기는 진단 후 10개월 미만이었다. 이들 중 2명은 항암치료를 시행하기 전에 죽었으며, 1명은 항암 이후 자의로 치료를 포기하였으며, 1명은 빠른 진행으로 3차항암을 시행 중에 죽었다. 2명은 2차 항암으로 부분적인 치료반응을 보였으며 나머지 1명은 완전 관해 이후 잘 유지되고 있다.
치료부위에서 1년이 지난 이후에 국소 재발한 환자들이 있었으나(in filed only) 이는 조기 진행(Early progression, EP)의 범주에 포함되지 않는다. 이들 중 1명은 근접치료(brachytherapy)를 본인 거부로 시행하지 않아 재발 확인 후 재시행 하였으며 다른 1명은 림프절로 전이된 커다란 종양이 조절이 안된 경우였다. 환자들의 임상 결과는 하기 표 1과 같다.
자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)을 겪은 환자들은 상대적으로 평편상피세포암 보다는 선암에서 우세했으며 사망에 이른 경우가 많았다. 이 외에 방사선 치료 이후에도 추가적으로 스테로이드를 처방한 경우가 더 많았으며 편이었으며 모두 급성 치료 반응이 좋았다. 자궁경부암의 조기 진행(Early progression, EP)을 겪은 환자들은 병기에서는 유의한 차이를 보이지 않았으며 IVB의 경우는 더 많이 포함되어 있었지만 국소 병기에서도 골고루 분포했었다.
2. 엑소좀 miRNA 및 mRNA에 대한 dataset 구성
방사선 치료 전과 방사선 치료 2주차일 때, 환자들로부터 혈액을 5-10cc 채집하였다. 채집된 혈액으로부터 혈장을 분리하고, 추가적으로 인체 유래물 보관소에 보관되어 있던 29명의 혈장 샘플 3-5cc를 분양 받아 실험에 사용하였다. 혈장 샘플들로부터 엑소좀(exosome)을 분리하고, NGS(Next Generation Sequencing) 분석을 시행하였다. 혈장으로부터 발현량이 낮은 샘플은 분석에서 제외하였다.
2-1. Small RNA 라이브러리 구축 및 시퀀싱
혈장을 Exo2D RNA 용액(Exosomeplus)과 혼합하여 엑소좀을 분리하였다. 제조사의 지침에 따라 miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 혈장 유래 엑소좀의 엑소좀 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 농도는 Quant-IT RiboGreen (Invitrogen)에 의해 계산되었다. RNA의 크기는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Boblingen, Germany)에서 Agilent RNA 6000 Pico Kit 및 Small RNA Kit를 사용하여 확인하였다.
각 샘플에서 분리된 10ng의 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina 용 SMARTer smRNA-Seq 키트로 시퀀싱 라이브러리를 구성하는 데 사용되었다. 입력 RNA는 올리고 (dT) 프라이머에 대한 프라이밍 서열을 제공하기 위해 먼저 폴리아데닐화되었다. cDNA 합성은 각 RNA 주형의 5 '끝에 어댑터 서열을 통합하는 3'smRNA dT Primer에 의해 프라이밍되며, LNA(locked nucleic acid) 기술로 강화된 SMRT smRNA Oligo에 의해 결합된 비주형 뉴클레오티드를 추가되었다. 템플릿 전환 단계에서 PrimeScript RT는 SMART smRNA Oligo를 각 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 3 '말단에 두 번째 어댑터 시퀀스를 추가하기위한 템플릿으로 사용하였다. 이 후, PCR 증폭 중에 샘플 멀티플렉싱용 인덱스 시퀀스를 포함하는 전체 길이 Illumina 어댑터를 추가하였다. Forward PCR Primer는 SMART smRNA Oligo에 의해 추가된 서열에 결합하는 반면 Reverse PCR Primer는 3’smRNA dT Primer에 의해 추가된 서열에 결합하였다.
증폭된 라이브러리를 6% Novex TBE-PAGE 겔(Thermo Fisher, MA)에서 정제하여 138bp(cDNA 18bp 이상 + 어댑터 120bp 이상) 이상의 분획을 절제하였다. 결과 라이브러리 cDNA 분자에는 Illumina 플로우 셀의 클러스터링에 필요한 시퀀스를 포함시켰다.
라이브러리는 겔 정제되었으며 Agilent Bioanalyzer에서 크기, 순도 및 농도를 확인하여 검증되었다. 라이브러리는 qPCR Quantification Protocol Guide (Illumina Sequecing 플랫폼 용 KAPA Library Quantificatoin 키트)에 따라 qPCR을 사용하여 정량화되었고, TapeStation D1000 ScreenTape (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)를 사용하여 검증되었다. 라이브러리를 등 몰량으로 풀링하고 Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, USA) 기기에서 시퀀싱하여 51 개의 염기 읽기를 생성하였다. 이미지 분해 및 품질 값 계산은 Illumina 파이프 라인의 모듈을 사용하여 수행되었다.
2-2. 어댑터 트리밍(Adapter trimming)
서로 다른 실험 샘플에서 얻은 small RNA의 raw 서열 read은 miRDeep2로 전처리하고 분석되었다. 어댑터 트리밍은 cutadapt 프로그램을 사용하여 smRNA 라이브러리 구축 과정에서 miRNA이 부착된 어댑터 서열이 존재하면 제거하였다. 모든 read의 첫 번째 3nt는 SMART template-switching 활동 프로세스 중에 삽입된 추가 염기를 제거하기 위해 트리밍되었다. 어댑터 서열과 어댑터의 모든 3’도 제거되었다. 읽기가 3’어댑터 서열의 처음 5 bp 이상 일치하는 경우, 서열이 실제로 어댑터 서열인 것으로 간주한 후, read에서 트리밍되었다. 분석을 위해, 트리밍된 read이 최소 18bp 이상인 경우만 신뢰하는 것으로 간주하였다. 나머지는 어댑터 서열은 비 어댑터 읽기로 분류하였다. 이 분석에서 트리밍 및 비 어댑터 읽기가 결합되고 다운 스트림 분석을 위해 처리된 read으로 간주되었다.
2-3. 클러스터링(Clustering)
서열 특이성(sequence uniqueness) 및 계산 강도를 최소화하기 위해 어댑터 서열로 처리된 read을 수집하여 클러스터를 형성하였다. 이 클러스터에는 서열 ID 및 read 길이와 100% 일치하는 read을 포함하며, 임시 클러스터 ID 및 보유 read 수가 제공되었다.
2-4. 리보솜 RNA 필터링
대부분의 RNA 구성은 rRNA로 알려져 있다. 다량의 rRNA의 효과를 제거하기 위해 읽기를 Homo sapiens의 45S pre-rRNA 및 미토콘드리아 rRNA에 정렬하고 일치시켰다.
2-5. miRNA read
miRDeep2 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 microRNA의 서열 정렬 및 검출을 수행하였다. 서열 정렬을 수행하기 전에 Homo sapiens reference genome release hg19를 UCSC 게놈 브라우저에서 검색하고 시퀀싱 read을 참조 서열에 정렬하기 위한 Bowtie (1.1.2)를 사용하여 인덱싱하였다. miRBase v21에서 얻은 전구체 miRNA을 참조 서열과 정렬하였다. miRDeep2 알고리즘은 miRNA biogenesis 모델을 기반으로 하며, Dicer 처리와 일치하는 방식으로 잠재적인 헤어핀 구조에 읽기를 정렬하고 헤어핀이 진정한 miRNA 전구체일 가능성을 나타내는 점수를 할당하였다.
2-6. miRNA 및 기타 RNA 범주 비율
클러스터링 된 읽기는 알려진 miRNA 및 기타 유형의 RNA를 식별하기 위해, 참조 게놈, miRBase v21 및 비 코딩 RNA 데이터베이스 RNAcentral release 10.0에 순차적으로 정렬되었다.
모든 데이터 및 시각화는 R 4.0.2 version(www.r-project.org)을 이용하여 수행되었으며 모든 비교 분석은 비모수를 가정하였다. 상기 NGS data는 small RNA, non- mRNA, 및 mRNA을 포함하고 있었으며, 이 중 miRNA 및 mRNA을 분석에 이용하였다. 이 중 14명이상에서 read count가 0인 경우는 분석에서 제외되었다. 분석에 이용된 miRNA는 586건, mRNA은 15324 건으로 통계되었다. 모든 전사체 데이터의 값들은 치료 전의 혈장 엑소좀의 read count값들 대비 방사선 치료 시작 2주 후의 read count 값들의 log2 fold change (log2FC) 값을 사용하였다. 28명의 환자들에 각 각에 대해 방사선 치료 전의 read count 값을 control로 사용하였고, 방사선 치료 후 2주의 read count 값의 변화를 log2 fold change (log2FC) 값으로 계산하였다. edgeR을 사용하여 TMM normalization 하고 log2FC 값을 구하였다.
3. 분석과정 및 결과
바이오마커를 선별하기 위한 분석 과정 및 결과는 다음의 단계로 진행되었다.
I 단계
임상 종료점(Clinical end point)을 예측할 수 있는 miRNA들을 선별하고,이들의 상관관계를 분석하였다(도 4 및 4). 상관 관계(Correlation) 분석은 다음 3단계로 이루어졌다.
1 단계: Hmisc package - rcorr function - pearson’s correlation
2 단계: Leaps package - regsubsets function - exhaustive algorithm (최대 변수 설정 10 또는 7)
3 단계: Mean comparison (Wincoxon rank sum test or Kruskal-Wallis test) and boxplots
도 4에 나타난 바와 같이, miRNA(log2FC)들의 서브그룹(Subgroup) 분석을 통해 조기 진행(Early progression, EP)과 유의한 연관성(|R|>0.4)을 가진 miRNA를 선별하였다. Adjusted R 값을 기준으로 가능한 모든 경우의 조합을 연산했을 때 지속적으로 포함되는 miRNA들을 선별하였다. miR-501-3p도 선별되었으나 Wilcoxon test 에서 포함하지 않았을 경우가 EP 그룹과 non- EP 그룹간의 차이가 더 커서 제외하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 선별된 miRNA 변수들의 다중선현회귀 조합으로 방향성을 얻은 후, 선별된 각 miRNA (log2FC) 값들을 miR-1228-5p + miR-33a-5p + miR-6815-5p + miR-3200-3p - miR-146a-3p 순으로 더하고 빼어서 값을 계산해본 결과, 그 값이 조기 진행(Early progression, EP)을 겪은 환자들에서 현저히 적게 나타났다.
II 단계
주 miRNA 군 및 그들과 연관된 miRNA들을 네트워크 서브그룹(network subgroup)으로 나누어 네트워크(network) 분석하였다. 임상 종료점(Clinical end point)에 따라 주 miRNA 군의 및 서브그룹의 영향력을 기술하였다.
Network 분석은 Igraph package - prim algorithm을 사용하고, 모든 network에서 붉은 색 edge는 양의 방향, 푸른색 edge는 음의 방향을 의미하도록 시각화 하였다.
miRNA 그룹 층화는 A group은 주 miRNA 군을 의미하고, B group은 여러 주 miRNA 군과 연관된 miRNA 군을 의미하고, C group은 방사선 치료에 따른 음성 되먹임을 보이는 miRNA들이 조기 진행(Early progression, EP)에 미치는 영향을 보기 위해, 치료 전 miRNA와 log2FC 사이에 음의 연관성을 보이는 miRNA들 (R<-0.7) 가운데 outlier (평균값의 4배가 넘는 cook distance 값으로 정의)를 보이는 경우를 선별하고, 선별된 그룹 중에서 조기 진행(Early progression, EP)을 겪은 환자들의 miRNA를 포함한 군을 의미한다.
조기 진행(Early progression, EP)에 관련된 miRNA들을 이용한 network로 주 miRNA가 포함된 community 마다 EP 와 non EP에 따라 각 level의 miRNA가 증가한 갯수와 감소한 갯수를 비교하였다 (증가: log2FC>1.5, 감소: log2FC <-1.5).
도 6에 나타난 바와 같이, A level은 상기 도 4과 같은 방향성으로 유의미하게 증가 혹은 감소한 갯수가 더 많은 것으로 나타났다. 이는 level A의 miRNA들이 각각 독립적으로 EP에 기여하고 있음을 의미한다. 좌측 상단의 miR-1228-5p/33a-5p community는 B level에서도 EP에서 유의하게 감소하는 경향을 보고 있으며, 그 옆의 miR-146a-3p community는 B level은 없이 C level에서 유의하게 EP에서 이상치가 많은 것으로 나타났다. 이 두 그룹은 영향을 끼치는 miRNA 들이 다수 존재하므로 유의미한 하부 miRNA들로 생각해볼 수 있다. 반대로 나머지 miR-6815-5p와 miR-3200-3p를 중심의 community들은 하부 level에 대한 연관성이 적어 적절한 miRNA의 연결이 아니었거나 다른 기능을 동시에 수행하였을 가능성이 있다.
III 단계
network 분석을 통해 주 miRNA 군, 연관 mRNA들 및 II 단계에 포함된 miRNA를 포함하여 전체적인 miRNA-mRNA 간의 구조를 파악하였다. 주 miRNA 간을 연결하는 가장 짧은 pathway를 기술하고, II 단계의 network 상에서 임상적 연관성이 있는 subgroup miRNA들의 위치를 확인하였다. Network 분석은 상기 II 단계와 동일한 조건으로 시각화하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, A level의 miRNA와 연관된 (|R| >0.6) mRNA들과 도 6의 miRNA들을 합쳐 network를 구성하였으며, A level miRNA들 (화살표) 상의 최단 거리는 붉은 선으로 표시되었다. miR-1228-5p, miR-146a-3p, miR-33a-5p는 PDE3A (별 표시)를 중심으로 연결되어 있으며, miR-6815-5p 및 miR-3200-3p로 연관되는 것으로 나타났다. TTPAL, E2F2, PLAUR, PDE3A, CLIP2, TNIK, hsa.miR.590.3p, PIGX, TNIP1, TYMP 이상 10개를 통해 연결되는 것으로 나타났다. B/C level의 일부가 network 상에서 관찰됨을 알 수 있으며 이를 통해 miRNA-mRNA의 구조가 적절함을 알 수 있다.
IV 단계
임상 종료점(Clinical end point)과 관련성 있는 mRNA들과 III 단계의 network에 포함된 miRNA 및 mRNA들이 포함되도록 선별(도 8)하고, 기존 IPA (Ingenuity Pathway Analysis) database로부터 유의한 질환(disease)/ 함수 범주(function category) 및 하위 범주(subcategories) 들을 추출(도 9)하였다.
도 9에 나타난 바와 같이, 조기 진행(Early progression, EP)에 관련된 miRNA 및 mRNA들로 IPA 분석을 시행한 후, 유의한 함수 범주(function category) 30개 중 관련된 영역들로 염증 반응(inflammatory response), 염증성 질환(inflammatory disease), 대사성 질환(metabolic disease), 암(cancer), 및 세포의 성장과 증식(cellular growth and proliferation)을 선택하였다. 상기 항목들의 구체적 하위 기능으로써 중증 염증성 장애(severe inflammatory disorder), 대식세포의 항원 제시(antigen presentation of macrophages), Th2 면역 반응(Th2 immune response), 및 조절 T 세포의 화학 주성(Chemotaxis of regulatory T cells)을 선택하였다.
V 단계
유의성 정도 및 임상 종료점(Clinical end point)과의 연관 가능성이 있는 질환(disease)/ 함수 범주(function category)를 선별하고, 각 그룹에 해당하는 mRNA 및 miRNA들을 이용 벤다어그램을 도시하였다(도 10). 도시된 벤다이어그램을 통해 암과 특정기능에 공통적으로 연관된 mRNA 및 miRNA들을 재선별 하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 조기 진행(Early progression, EP)과 관련되어 선별된 4개의 함수 범주(function category)들의 벤다이어그램을 그리고 cancer 영역과 중복된 항목들의 mRNA 및 miRNA를 선택하였다.
VI 단계
도 7의 주 miRNA의 short pathway를 이용하여 재선별된 mRNA 및 miRNA들을 network로 형성하였다. Network 분석은 상기 II 단계와 동일한 조건으로 시각화하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 도 10에서 선별된 miRNA 및 mRNA들과 주 miRNA들을 포함한 short pathway를 이용하여 network를 형성하였고, 각 주 miRNA의 변화 (log2FC>1.5 (up), log2FC < -1.5 (down), others - no change)에 따라 통계적의 유의미하게 변화한 mRNA 및 miRNA들을 표시하였다(붉은색 숫자는 감소, 푸른색 숫자는 증가를 의미). miR-3200-3p와 miR-1228-5p는 SLAMF1을 통하여 PCK1에 연관되었으며, miR-146a-3p는 CCNO를 통해 PCK1에 강하게 연관되어 있는 것을 나타났다. miR-1228-5p는 FCGR1A의 변화와 연관되었으며, miR-146a-3p, miR-33a-5p, 및 miR-1228-5p를 통합하는 PDE3A는 PCK1과 연관되어 있는 것으로 나타났다(edge는 붉은색은 양의 방향, 푸른 색은 음의 방향을 의미).
VII 단계
VI 단계의 network를 구성하는 RNA들의 log2FC 값들을 28명 별로 IPA database에 올리고, 유의미한 질환(disease)/ 함수 범주(function category)의 z-score를 구하였다. 모든 환자들에서 유의미한 z score가 구해진 항목만을 선별하여 clinical end point에 따라 통계적으로 유의하게 차이가 있었던 항목들을 분석하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 도 11의 network에 포함된 RNA들의 log2FC 값들을 모두 각 환자 별로 IPA database에서 분석하여 카테고리 별로 z score를 얻은 후, 조기 진행(Early progression, EP) 여부에 따라 통계적으로 유의한 차이를 보이는 범주들을 기술한 결과, 현재의 임상 결과 및 가정과 연관된 항목은 나오지 않았다.
VIII 단계
모든 network에서 유의미하게 변한 RNA 그룹에 대하여 주 miRNA에 대한 상기 선별된 하위 범주(subcategories)들에 대한 RNA들의 비율 변화를 분석하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 도 11의 network는 염증성 질환/반응(inflammatory disease/response)과 연관된 RNA들이 약 65-70%정도 대사 질환(Metabolic disease)과 연관된 RNA들은 약 15-20% 정도, 세포 성장 및 증식(Cellular growth and proliferation)과 연관된 RNA들은 약 10-15% 정도의 비중이었다. 상대적으로 miR-33a-5p의 변화에 따라 유의미하게 변하는 RNA들의 기능은 염증성 질환 / 반응(inflammatory disease/response)의 비중이 높았으며 특히 중증 염증성 장애(severe inflammatory disorder)의 비중이 높았다. miR-1228-5p 및 miR-3200-3p는 metabolic disease의 비중이 높았으며 이들은 특이 대 식세포의 항원 제시(antigen presentation of macrophages)와 연관되었다. miR-6815-5p의 경우에는 세포 성장 및 증식(Cellular growth and proliferation)의 비중이 높았다.
IX 단계
주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화된 mRNA 및 miRNA들을 분석하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 같은 방향의 변화는 붉은 색으로 반대방향의 변화는 푸른 색으로 p 값의 변화를 표시하였으며, 1.5 log2FC를 넘어서는 변화는 음영으로 표시하였다. Sub-ID 는 중증 염증성 장애(severe inflammatory disorder)를 Sub-IR은 특이 대식세포의 항원 제시(antigen presentation of macrophages)를 의미한다.
X 단계
도 12에서 기존의 database에 존재하지 않는 항목에 대하여 각 주 miRNA에 따른 변화하는 항목들을 염증 신호(inflammatory signaling)/항염증 신호(anti-inflammatory signaling)/암증식(cancer proliferation) 등의 항목에 따라 정리하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 각 주 miRNA의 변화에 따라 유의미하게 변화하는 RNA들의 기능이 정리되었다.
XI 단계
말초(Peripheral) 조직에서 HPA axis 및 주 miRNA사이의 연관성을 분석하기 위해, CRH, POMC, CYP11B1, HSD11B1 값을 이용하여 miR-3200-3p와의 관련성을 기술하였다. Network 분석은 상기 II 단계와 동일한 조건으로 시각화하였다.
도 16에 나타난 바와 같이, 말초 조직(Peripheral tissue)에서의 HPA axis를 가정했을 때 mRNA CRH(Corticotropin releasing hormone), POMC(proopiomelanocortin), CYP11B1(Cytochrome P450 family 11 subfamily B member 1) 및 HSD11B1(Hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 1)의 관계를 분석한 결과, miR-3200-3p는 CRH 및 CYP11B1을 매개하는 것으로 나타났다. 염증에 의한 CRH의 증가와 miR-3200-3p의 감소 및 CYP11B1의 증가를 통하여, 코티솔(cortisol)의 증가가 나타났다. 조기 진행(Early progression, EP) 환자들에서 CRH가 유의미하게 증가하며, miR-3200-3p가 유의미하게 감소하였으나, CYP11B1은 증가하는 경향으로 나타났다. 상기의 결과는 Central HPA axis 의 영향일 것으로 추측된다.
XII 단계
도 11에서 얻어진 mRNA들을 이용하여 임상 종료점(Clinical end point)을 예측할 수 있는 mRNA들을 추출하고, 이들과 주 miRNA 들간의 임상적 유의성을 기술하여다. 상관 관계(Correlation) 분석은 상기 I 단계와 동일한 단계로 이루어졌다.
도 17에 나타난 바와 같이, Adjusted R 값을 기준으로 가능한 모든 경우의 조합을 연산했을 때 지속적으로 포함되는 mRNA들을 선별하였다. PCK1과 FCGR1A가 선별되었다.
도 18에 나타난 바와 같이, FCGR1A - PCK1 (log2FC)값은 조기 진행(Early progression, EP) 환자들에서 유의하게 낮음을 알 수 있다. PCK1, FCGR1A, miR-1228-5p, miR-33a-5p, miR-6815-5p, miR-3200-30, 그리고 miR-146a-3p를 이용하여 subgroup 분석을 하여 선택된 miR-1228-5p+miR-33a-5p+ miR-6815-5p + FCGR1A - PCK1(log2FC) 는 EP와 non EP에서의 차이를 더욱 크게 함을 할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
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<400> 1
gugggcgggg gcaggugugu g 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hsa-miR-3200-3p
<400> 2
caccuugcgc uacucagguc ug 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
ccucugaaau ucaguucuuc ag 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> hsa-miR-33a-5p
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gugcauugua guugcauugc a 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> hsa-miR-6815-5p
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uagguggcgc cggaggaguc auu 23
<210> 6
<211> 1869
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCK1 mRNA
<400> 6
atgcctcctc agctgcaaaa cggcctgaac ctctcggcca aagttgtcca gggaagcctg 60
gacagcctac cccaggcagt gagggagttt ctcgagaata acgctgagct gtgtcagcct 120
gatcacatcc acatctgtga cggctctgag gaggagaatg ggcggcttct gggccagatg 180
gaggaagagg gcatcctcag gcggctgaag aagtatgaca actgctggtt ggctctcact 240
gaccccaggg atgtggccag gatcgaaagc aagacggtta tcgtcaccca agagcaaaga 300
gacacagtgc ccatccccaa aacaggcctc agccagctcg gtcgctggat gtcagaggag 360
gattttgaga aagcgttcaa tgccaggttc ccagggtgca tgaaaggtcg caccatgtac 420
gtcatcccat tcagcatggg gccgctgggc tcgcctctgt caaagatcgg catcgagctg 480
acggattcac cctacgtggt ggccagcatg cggatcatga cgcggatggg cacgcccgtc 540
ctggaagcag tgggcgatgg ggagtttgtc aaatgcctcc attctgtggg gtgccctctg 600
cctttacaaa agcctttggt caacaactgg ccctgcaacc cggagctgac gctcatcgcc 660
cacctgcctg accgcagaga gatcatctcc tttggcagtg ggtacggcgg gaactcgctg 720
ctcgggaaga agtgctttgc tctcaggatg gccagccggc tggccaagga ggaagggtgg 780
ctggcagagc acatgctgat tctgggtata accaaccctg agggtgagaa gaagtacctg 840
gcggccgcat ttcccagcgc ctgcgggaag accaacctgg ccatgatgaa ccccagcctc 900
cccgggtgga aggttgagtg cgtcggggat gacattgcct ggatgaagtt tgacgcacaa 960
ggtcatttaa gggccatcaa cccagaaaat ggctttttcg gtgtcgctcc tgggacttca 1020
gtgaagacca accccaatgc catcaagacc atccagaaga acacaatctt taccaatgtg 1080
gccgagacca gcgacggggg cgtttactgg gaaggcattg atgagccgct agcttcaggt 1140
gtcaccatca cgtcctggaa gaataaggag tggagctcag aggatgggga accttgtgcc 1200
caccccaact cgaggttctg cacccctgcc agccagtgcc ccatcattga tgctgcctgg 1260
gagtctccgg aaggtgttcc cattgaaggc attatctttg gaggccgtag acctgctggt 1320
gtccctctag tctatgaagc tctcagctgg caacatggag tctttgtggg ggcggccatg 1380
agatcagagg ccacagcggc tgcagaacat aaaggcaaaa tcatcatgca tgaccccttt 1440
gccatgcggc ccttctttgg ctacaacttc ggcaaatacc tggcccactg gcttagcatg 1500
gcccagcacc cagcagccaa actgcccaag atcttccatg tcaactggtt ccggaaggac 1560
aaggaaggca aattcctctg gccaggcttt ggagagaact ccagggtgct ggagtggatg 1620
ttcaaccgga tcgatggaaa agccagcacc aagctcacgc ccataggcta catccccaag 1680
gaggatgccc tgaacctgaa aggcctgggg cacatcaaca tgatggagct tttcagcatc 1740
tccaaggaat tctgggagaa ggaggtggaa gacatcgaga agtatctgga ggatcaagtc 1800
aatgccgacc tcccctgtga aatcgagaga gagatccttg ccttgaagca aagaataagc 1860
cagatgtaa 1869
<210> 7
<211> 1125
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FCGR1A mRNA
<400> 7
atgtggttct tgacaactct gctcctttgg gttccagttg atgggcaagt ggacaccaca 60
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ttgcactgtg aggtgctcca tctgcctggg agcagctcta cacagtggtt tctcaatggc 180
acagccactc agacctcgac ccccagctac agaatcacct ctgccagtgt caatgacagt 240
ggtgaataca ggtgccagag aggtctctca gggcgaagtg accccataca gctggaaatc 300
cacagaggct ggctactact gcaggtctcc agcagagtct tcacggaagg agaacctctg 360
gccttgaggt gtcatgcgtg gaaggataag ctggtgtaca atgtgcttta ctatcgaaat 420
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agtcacaatg gcacctacca ttgctcaggc atgggaaagc atcgctacac atcagcagga 540
atatctgtca ctgtgaaaga gctatttcca gctccagtgc tgaatgcatc tgtgacatcc 600
ccactcctgg aggggaatct ggtcaccctg agctgtgaaa caaagttgct cttgcagagg 660
cctggtttgc agctttactt ctccttctac atgggcagca agaccctgcg aggcaggaac 720
acatcctctg aataccaaat actaactgct agaagagaag actctgggtt atactggtgc 780
gaggctgcca cagaggatgg aaatgtcctt aagcgcagcc ctgagttgga gcttcaagtg 840
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ctgcaggaag gggtgcaccg gaaggagccc cagggggcca cgtag 1125
Claims (5)
- 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 1228-5p(hsa-miR-1228-5p), 마이크로 RNA 3200-3p(hsa-miR-3200-3p) 및 마이크로 RNA 146a-3p(hsa-miR-146a-3p)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 자궁경부암의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장 유래 엑소좀인 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 발현 수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는 정보 제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제공 방법은 대상체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로 RNA 33a-5p(hsa-miR-33a-5p), 마이크로 RNA 6815-5p(hsa-miR-6815-5p), PCK1(Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1)의 mRNA, 및 FCGR1A(High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I)의 mRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 RNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대상체는 자궁경부암을 치료하기 위한 방사선 치료를 받는 환자인 것을 특징으로 하는 자궁경부암의 조기 진단을 위한 정보 제공 방법.
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| A107 | Divisional application of patent | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |