KR20230052249A - 조직재생용 초분자 자기조립 하이드로젤 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 피부 조직 재생을 위한 초분자 자기조립 하이드로젤에 관한 것이다.
본 발명에 따른 초분자 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 및 아다만테인-히알루론산 유도체로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 초분자 자기조립 하이드로젤은 성장 호르몬의 높은 전달 효율을 유지한 상태로 체내에 전달할 수 있으며, 담지된 세포와 주변 세포의 증식 및 분화 그리고 분비된 성장인자를 통해 손상된 조직 재생 효율을 높일 수 있다.
본 발명에 따른 초분자 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 및 아다만테인-히알루론산 유도체로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 초분자 자기조립 하이드로젤은 성장 호르몬의 높은 전달 효율을 유지한 상태로 체내에 전달할 수 있으며, 담지된 세포와 주변 세포의 증식 및 분화 그리고 분비된 성장인자를 통해 손상된 조직 재생 효율을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 조직재생용 초분자 가가조립 하이드로젤에 관한 것이다.
조직 재생은 성장인자와 호르몬을 통해 세포와 세포외기질(ECM) 사이의 신호 전달을 기반으로 한다(참고문헌 1,2). 신체의 세포 메커니즘을 모방하는 조직 공학 지지체(scaffolds)는 조직 재생을 위해 널리 조사되었다(참고문헌 3-6). 특히, ECM에 캡슐화된 섬유아세포는 피부 재생에 중요한 역할을 하여, 관련 단백질 생산으로 다른 세포를 활성화한다. 생체분자의 구성과 구조는 섬유아세포의 세포 행동에 영향을 미치는 ECM의 물리적 및 생화학적 특성을 결정한다(참고문헌 7-9).
콜라겐(Col)과 히알루론산(HA)은 서로 다른 물리화학적 특성을 가지는 피부 조직 ECM을 형성하는 1차 바이오폴리머 백본이다. 콜라겐의 RGD 펩타이드는 세포 행동과 형태를 조절한다. 성장호르몬(GH)과 인자(factors)를 포함하는 단백질은 세포 증식과 조직 재생을 자극한다. 따라서, 피부 조직 재생을 가속화하기 위해서는 구조적 특성뿐만 아니라, ECM의 RGD 및 단백질과 같은 생화학적 성분을 모방한 조직 공학 지지체가 강력하게 필요하다.
초분자 호스트-게스트 조립 하이드로젤은 조직 재생을 위한 세포 전달 지지체로 제안되었다(참고문헌 10-12). 호스트와 게스트 분자 사이의 무-독성 및 가역적인 강력한 상호작용은 캡슐화된 세포의 높은 생존력과 주입을 통한 하이드로젤의 최소 침습 이식(minimally invasive transplantation)을 가능하게 한다. 특히, 히알루론산과 같은 생체고분자로 구성된 초분자 하이드로젤은 생분해성과 높은 팽윤비를 나타내어, 세포 전달 및 배양 개발에 적합하다.
그러나, 피부 조직 ECM의 구조 및 생화학적 신호는 초분자 하이드로젤에서 완전하게 모방되지 않았다. 콜라겐의 복잡한 구조와 낮은 용해도는 폴리머 백본에 대한 호스트-게스트 분자의 접합(conjugation) 및 초분자 가교 하이드로젤의 개발을 방해한다(참고문헌 13,14). 한편, 하이드로젤에서 세포로의 단백질 전달은 파열 방출(burst release), 낮은 안정성 및 낮은 세포 흡수(cellular uptake)로 인해 어려움을 겪었다.
이러한 문제를 극복하기 위하여, 단백질을 하이드로젤 지지체(참고문헌 15,16)에 결합하거나, 나노입자(참고문헌 17,18) 또는 미셀(참고문헌 19)에 로딩하어, 하이드로젤로부터 단백질을 지속적으로 방출하고 생리학적 조건 하에서 안정성을 증가시켰다. 그러나, 조직 공학 적용을 위한 트리거 및 제어된 단백질 전달에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여, 성장 호르몬의 지속적인 전달과 담지된 세포의 조직 재생 효율을 높이기 위한 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체로 이루어진 초분자 자기조립 하이드로젤을 제공한다.
본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 및 아다만테인-히알루론산 유도체로부터 제조된 초분자 자기조립 하이드로젤을 제공한다.
또한, 본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 아다만테인-히알루론산 유도체; 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체로부터 제조된 초분자 자기조립 하이드로젤을 제공한다.
또한, 본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체를 혼합하는 단계를 포함하는 초분자 자기조립 하이드로젤의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체, 아다만테인-히알루론산 유도체 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 혼합하는 단계를 포함하는 초분자 자기조립 하이드로젤의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체, 아다만테인-히알루론산 유도체 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 포함하는 약물전달체를 제공한다.
본 발명의 초분자 자기조립 하이드로젤은 성장 호르몬의 높은 전달 효율을 유지한 상태로 체내에 전달할 수 있으며, 담지된 세포와 주변 세포의 증식 및 분화 그리고 분비된 성장인자를 통해 손상된 조직 재생 효율을 높일 수 있다.
도 1은 가속화된 피부 조직 재생을 위한 초분자 자기조립 하이드로젤의 모식도이다.
도 2는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 특성을 나타낸다.
구체적으로, (a)는 천연 GE 및 GE-CD 유도체의 1H NMR 스펙트럼을 나타내고, (b)는 GE, CD 및 GE-CD 유도체의 FT-IR 스펙트럼을 나타내며, (C)는 원편광이색성에 의해 분석된 GE 및 GE-CD 유도체의 타원율 데이터를 나타낸다. 또한, (d)는 GE-CD 유도체와 Ad-HA 유도체를 1:2의 비율로 혼합하여 형성된 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 주파수 스윕(Frequency sweep)을 나타내고, (e)는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 연속 흐름을 나타내며, (f)는 28 일 동안 히알루로니다제가 있거나 또는 없는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 효소 분해 결과를 나타낸다(n = 4).
도 3은 Ad-HA-hGH 접합체의 특성을 나타낸다.
구체적으로, (a)는 Ad-HA-hGH(위쪽) 및 Ad-HA(아래쪽)의 1H NMR 결과(삽입 이미지)를 포함하는 HPLC를 나타내고, (b)는 원편광이색성 결과를 나타내며, (c)는 ELISA/ Bradford 분석 결과를 나타낸다.
(d)는 hGH 및 Ad-HA-hGH 접합체에 의해 자극된 Nb2-11 세포의 증식 속도를 나타내고, (e)는 GH 및 Ad-HA-hGH 접합체의 혈청 안정성을 나타내며(n = 4), (f)는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤로부터 hGH 및 Ad-HA-hGH의 시험관내 방출을 나타내고(n = 4), 이때, 하이드로젤에 남아 있는 hGH는 과량의 CD 용액을 첨가하여 분해 후 정량화되었다. 또한, (g)는 섬유아세포로 흡수된 FITC 개질 hGH, Ad-HA, Ad-HA-hGH의 형광 이미지(scale bars: 200 μm)를 나타내고, (h)는 형광 강도 분석에 의해 흡수된 hGH, Ad-HA 및 Ad-HA-hGH의 상대적 정량화 결과를 나타낸다(n = 4).
도 4에서 (a)는 4 일 및 10 일째에 초분자 자기조립 하이드로젤에서 염색된 섬유아세포의 live/dead 분석을 위한 공초점 Z-스택 형광 이미지를 나타내고(크기: 600×600×300 μm), (b)는 공초점 형광 이미지에서 세포 생존력의 정량적 분석 결과를 나타내며(n=5), (c)는 10 일 동안 CCK-8 분석에 의해 초분자 하이드로젤에 캡슐화된 섬유아세포의 증식률을 나타낸다(n = 4).
도 5에서 (a)는 섬유아세포의 공초점 Z-스택(600×600×300 μm) 및 단면(하이드로젤의 중간 및 바닥) 이미지(파란색: 핵, 녹색: F-액틴, scale bars: 50 μm)를 나타내고, (b) 및 (c)는 4 일 및 10 일째에 공초점 이미지에서 150×150 μm에 대한 정량 분석에 의해 결정된 초분자 하이드로젤에 분포된 세포 수의 비율을 나타낸다(n = 7).
도 6에서 (a)는 21 일 동안 이식된 초분자 하이드로젤에서 섬유아세포의 생체 내 이미지를 나타내고, (b)는 21 일 동안 이식된 세포의 세포 증식을 반영하는 상대 형광 강도를 나타낸다(n = 4).
도 7은 21 일째에 H&E 염색에 의해 수집 및 시각화된 이식된 초분자 하이드로젤에서 섬유아세포의 조직학적 분석 결과를 나타낸다(scale bars: 500 μm(위쪽 이미지), 100 μm(아래쪽 이미지)).
도 2는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 특성을 나타낸다.
구체적으로, (a)는 천연 GE 및 GE-CD 유도체의 1H NMR 스펙트럼을 나타내고, (b)는 GE, CD 및 GE-CD 유도체의 FT-IR 스펙트럼을 나타내며, (C)는 원편광이색성에 의해 분석된 GE 및 GE-CD 유도체의 타원율 데이터를 나타낸다. 또한, (d)는 GE-CD 유도체와 Ad-HA 유도체를 1:2의 비율로 혼합하여 형성된 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 주파수 스윕(Frequency sweep)을 나타내고, (e)는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 연속 흐름을 나타내며, (f)는 28 일 동안 히알루로니다제가 있거나 또는 없는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 효소 분해 결과를 나타낸다(n = 4).
도 3은 Ad-HA-hGH 접합체의 특성을 나타낸다.
구체적으로, (a)는 Ad-HA-hGH(위쪽) 및 Ad-HA(아래쪽)의 1H NMR 결과(삽입 이미지)를 포함하는 HPLC를 나타내고, (b)는 원편광이색성 결과를 나타내며, (c)는 ELISA/ Bradford 분석 결과를 나타낸다.
(d)는 hGH 및 Ad-HA-hGH 접합체에 의해 자극된 Nb2-11 세포의 증식 속도를 나타내고, (e)는 GH 및 Ad-HA-hGH 접합체의 혈청 안정성을 나타내며(n = 4), (f)는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤로부터 hGH 및 Ad-HA-hGH의 시험관내 방출을 나타내고(n = 4), 이때, 하이드로젤에 남아 있는 hGH는 과량의 CD 용액을 첨가하여 분해 후 정량화되었다. 또한, (g)는 섬유아세포로 흡수된 FITC 개질 hGH, Ad-HA, Ad-HA-hGH의 형광 이미지(scale bars: 200 μm)를 나타내고, (h)는 형광 강도 분석에 의해 흡수된 hGH, Ad-HA 및 Ad-HA-hGH의 상대적 정량화 결과를 나타낸다(n = 4).
도 4에서 (a)는 4 일 및 10 일째에 초분자 자기조립 하이드로젤에서 염색된 섬유아세포의 live/dead 분석을 위한 공초점 Z-스택 형광 이미지를 나타내고(크기: 600×600×300 μm), (b)는 공초점 형광 이미지에서 세포 생존력의 정량적 분석 결과를 나타내며(n=5), (c)는 10 일 동안 CCK-8 분석에 의해 초분자 하이드로젤에 캡슐화된 섬유아세포의 증식률을 나타낸다(n = 4).
도 5에서 (a)는 섬유아세포의 공초점 Z-스택(600×600×300 μm) 및 단면(하이드로젤의 중간 및 바닥) 이미지(파란색: 핵, 녹색: F-액틴, scale bars: 50 μm)를 나타내고, (b) 및 (c)는 4 일 및 10 일째에 공초점 이미지에서 150×150 μm에 대한 정량 분석에 의해 결정된 초분자 하이드로젤에 분포된 세포 수의 비율을 나타낸다(n = 7).
도 6에서 (a)는 21 일 동안 이식된 초분자 하이드로젤에서 섬유아세포의 생체 내 이미지를 나타내고, (b)는 21 일 동안 이식된 세포의 세포 증식을 반영하는 상대 형광 강도를 나타낸다(n = 4).
도 7은 21 일째에 H&E 염색에 의해 수집 및 시각화된 이식된 초분자 하이드로젤에서 섬유아세포의 조직학적 분석 결과를 나타낸다(scale bars: 500 μm(위쪽 이미지), 100 μm(아래쪽 이미지)).
피부 조직은 피부 세포, 세포외기질(ECM) 및 생리활성 분자의 조합 기능에 의해 재생된다. 인공 ECM으로서, 히알루론산-사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산을 사용한 HA 하이드로젤이 개발되었다. 이러한 HA 하이드로젤은 ECM의 물리적 특성을 모방하는 능력을 나타내었으나, 생리활성 분자의 부재로 생화학적 기능이 부족하였다. 따라서, 효과적인 조직 재생에 제한적이었다.
본 발명은 이러한 문제점을 개선하기 위하여, 새로운 생체모방 초분자 자기조립 하이드로젤을 개발하였다.
이하, 본 발명의 초분자 자기조립 하이드로젤을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 명시적인 기재가 없는 한, "하이드로젤(hydrogel)"은 물을 분산매로 하는 젤을 의미한다. 상기 하이드로젤은 하이드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성될 수 있다. 전해질 고분자의 하이드로젤은 고흡수성을 나타내는 것이 많으며 흡수성 고분자로서 다방면에 실용화되어 있다. 하이드로젤 중에는 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화하는 것도 있다.
본 발명에서 “초분자(supramolecule)”란 수소결합, 정전기적 상호작용 또는 반데르발스 인력과 같은 비공유 결합을 통해 분자나 이온이 모여 형성된 분자복합체(또는 포집복합체)를 의미한다. 초분자의 구조를 형성하는 대표적인 비공유결합들은 공유결합에 비해 매우 약하기 때문에 초분자 물질은 주변의 환경에 따라 구조가 쉽게 변할 수 있으며, 이러한 특징을 이용하면 물질의 모양을 임의적으로 조절할 수 있다. 초분자 구조를 형성하는 대표적인 원리로 자기조립(self-assembly)이 있다. 자기조립은 자발적인 상호작용으로 분자들이 조립되는 현상을 의미한다.
본 발명에서 “초분자 자기조립 하이드로젤”은 본 발명에 따른 제조 방법에 의해 제조되는 하이드로젤로서, 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체로부터 제조되며, 사이클로덱스트린 및 아다만테인의 초분자 반응에 의해 제조되는 하이드로젤을 의미한다.
본 발명에 따른 초분자 자기조립 하이드로젤(이하, 초분자 하이드로젤 또는 하이드로젤이라 할 수 있다.) 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체로부터 제조될 수 있다. 본 발명에서는 이러한 초분자 자기조립 하이드로젤을 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤이라 표현할 수 있다.
본 발명에서 젤라틴-사클로덱스트린 유도체(이하, GE-CD 유도체)는 젤라틴과 사이클로덱스트린이 아마이드 결합을 통해 결합된 유도체를 의미한다.
본 발명에서 젤라틴은 콜라겐의 가수분해된 형태로 RGD를 포함하는 펩타이드 서열로 구성된다. 젤라틴은 콜라겐과 유사한 구조적 및 생물학적 특성을 나타내고, 높은 용해도, 생분해성 및 생체 적합성을 가지며 체내에서 면역 반응을 유발하지 않으므로, 하이드로젤의 백본으로 사용될 수 있다. 또한, 젤라틴은 그 구조 내에 RGD 펩타이드를 포함하므로, 인테그린-RGD 결합에 의한 세포 부착을 통해, 세포들이 3차원 형태로 하이드로젤에 퍼져서 잘 자랄 수 있게 할 수 있다.
일 구체예에서, 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체는 젤라틴의 카르복실기와 사이클로덱스트린의 아민기가 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 이때, 사이클로덱스트린 중의 하나 이상의 하이드록실기는 아민기로 치환되어, 상기 아민기가 결합을 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체는 젤라틴과 사이클로덱스트린을 반응시켜 제조할 수 있다.
구체적으로, 젤라틴 및 사이클로덱스트린을 용매에 용해시킨 후, 커플링 시약의 존재하에서 반응시켜 제조할 수 있다.
상기 용매로 물, 2-(n-morpholino)-ethanesulfonic acid(MES), DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 PBS(Phosphate-buffered saline)를 사용할 수 있고, 커플링 시약으로 DMTMM(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride), EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, NHS(N-Hydroxysuccinimide), Pyridine, HBTU(N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate) 또는 BOP((Benzotriazol-1-yloxy)tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate)를 사용할 수 있다. 반응은 10 내지 40℃, 20 내지 30℃ 또는 상온에서 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체에서 젤라틴 및 사이클로덱스트린의 질량비는 1:0.1 내지 1:0.8일 수 있다. 일반적으로 유도체에서 사이클로덱스트린의 질량비가 낮으면 제조되는 초분자 자기조립 하이드로젤의 기계적 물성이 저하된다. 또한, 질량비가 클 경우 사이클로덱스트린의 내부 소수성 특성이 증가하여, 고분자의 물에 대한 용해도를 낮추고, 젤라틴 골격 자체가 가진 구조적 특성이 변화할 우려가 있다.
본 발명에서 아다만테인-히알루론산(이하, Ad-HA) 유도체는 히알루론산과 아다만테인이 에스터 결합을 통해 결합된 유도체를 의미한다.
일 구체예에서, 히알루론산은 생체 적합성 및 생분해성 특성을 가질 뿐만 아니라 경피 전달 특성을 가지고 있어, 인체에 안전하게 적용할 수 있으며 항원 단백질을 비롯한 다양한 단백질 의약품 및 화학 의약품의 경피 약물 전달 시스템에 적용 가능하다는 장점을 가진다.
본 발명에서 명시적인 기재가 없는 한, '히알루론산(Hyaluronic acid, HA)'은 하기 일반식 1로 표현되는 반복단위를 갖는 고분자를 지칭하며, 히알루론산의 염 또는 유도체 형태를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
[일반식 1]
상기 일반식 1에서, n은 50 내지 10,000 의 정수일 수 있다.
본 발명에서 히알루론산의 염으로 예를 들어, 히알루론산의 테트라부틸암모늄염(HA-TBA)을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 히알루론산, 히알루론산의 염, 또는 히알루론산의 유도체는 그 구성의 한정은 없으나, 바람직하게는 분자량이 10,000 내지 3,000,000 달톤(Da)일 수 있다.
일 구체예에서, 아다만테인은 아다만테인의 염 또는 유도체 형태를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 예를 들어, 아다만테인으로 카르복실기가 치환된 Adamantaneacetic acid(Ada-acetic acid) 또는 (1-adamantyl)phenol을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 아다만테인-히알루론산 유도체는 히알루론산의 하이드록실기와 아다만테인의 카르복실기가 에스터 결합을 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 아다만테인-히알루론산 유도체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 n은 25 내지 8,000 또는 25 내지 1,000의 정수일 수 있다.
일 구체예에서, 아다만테인-히알루론산 유도체는 히알루론산과 아다만테인(Ada-acetic acid)을 반응시켜 제조할 수 있다.
구체적으로, 히알루론산, 히알루론산의 염 또는 히알루론산의 유도체와 아다만테인을 용매에 용해시킨 후, 반응 시약의 존재하에서 반응시켜 제조할 수 있다.
상기 용매로 물, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 또는 PBS(Phosphate-buffered saline)를 사용할 수 있다. 반응 시약은 에스터 반응을 일으키는 시약으로서, 4-DMAP(4-Dimethylaminopyridine), DVA(Divinyl acetate), N,N'-dicyclohexylcarbodiimide(N,N'-dicyclohexylcarbodiimide;DCC), Adamantane anhydride 또는 Di-tert-butyl dicarbonate를 사용할 수 있다. 또한 반응 시, 버퍼로 PBS 혹은 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 사용할 수 있다. 상기 반응은 진공 상태에서 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 아다만테인-히알루론산 유도체에서 아다만테인의 치환도는 10 내지 50% 또는 10 내지 35%일 수 있다. 상기 범위에서 기계적 강도가 우수한 초분자 자기조립 하이드로젤을 제조할 수 있다. 이때 치환도는 하기와 같이 계산할 수 있다.
치환도 = (아다만테인이 결합된 히알루론산 반복 단위의 몰량) * (아다만테인이 결합 및 결합되지 않은 히알루론산 반복 단위의 몰량) * 100
본 발명에서 초분자 자기조립 하이드로젤은 전술한 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 및 아다만테인-히알루론산 유도체로부터 제조될 수 있으며, 구체적으로 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 아다만테인의 초분자 반응에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에서는 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 사용하여 초분자체, 즉, 하이드로젤을 제조할 수 있다. 사이클로덱스트린은 6~8개의 포도당 분자의 α-1,4 결합을 통해 형성된 소수성 공동을 갖는 고리형 올리고사카라이드(oligosaccharide)로 포도당 분자의 개수가 6개인 α-사이클로덱스트린, 7개인 β-사이클로덱스트린, 및 8개의 포도당 분자로 이루어진 γ-사이클로덱스트린으로 구분된다. 이때 사이클로덱스트린을 형성하고 있는 포도당 분자의 개수에 따라 사이클로덱스트린의 분자량, 소수성 공동의 크기, 용해도 등이 달라질 수 있다.
사이클로덱스트린의 구조는 X-ray분석에 의하면 C2와 C3에 결합해있는 hydroxyl기가 바깥쪽으로 펼쳐져 있고, C6 에 결합해있는 hydroxyl기 역시 반대방향으로 펼쳐져 있기 때문에 링의 외곽은 전체적으로 친수성을 띄고 있다. 반면 C3 와 C5의 수소이온과 에테르의 산소가 사이클로덱스트린 구조 안쪽에 위치하고 있어 내부 공동은 소수성을 띈다. 따라서 전체 구조의 친수성 외각은 물과 같은 극성용매에 잘 녹을 수 있게 하면서 구조체 내부에는 외곽과 반대되는 성격의 소수성 기공을 형성한다. 이는 사이클로덱스트린의 가장 큰 특성인 호스트-게스트 상호작용을 통해 복합체 형성을 가능하게 한다.
게스트 물질은 일정한 사이즈를 갖는 사이클로덱스트린의 기공 안에 들어가면서 구조적 fitting에 의해 복합체를 형성하는데, 사이클로덱스트린의 종류에 따라 기공의 높이는 같지만 직경과 부피가 서로 달라지게 된다. 본 발명에서는 게스트 물질로 아다만테인을 사용한다. 상기 아다만테인은 사이클로헥세인 환 4개가 바구니 모양으로 축합된 구조를 갖고 대칭성이 높으며 안정한 화합물로, 사이클로덱스트린과 호스트-게스트 상호작용을 통해 결합을 형성할 수 있다.
즉, 본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 아다만테인의 호스트-게스트 상호작용을 통해 하이드로젤이 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 함량비는 1:0.1 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:2.5 또는 1:1일 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 물리적 혼합에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 초분자 자기조립 하이드로젤은 유용 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 유용 물질의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 세포, 약물, 기능성 화장료의 유용 물질, 형광물질, 방사성 동위원소, 표적 지향성 물질, 이미징 물질, 세포 배양에 필요한 배양액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
유용 물질을 포함하는 하이드로젤은, 상기 유용 물질의 전달을 위한 약물전달체로서 기능할 수 있다.
상기 세포는 섬유아세포(fibroblasts) 및 각질세포(keratinocytes) 등을 사용할 수 있다.
상기 약물은 인간을 포함한 동물에서 질병 또는 증상을 저해, 억제, 경감, 완화, 지연, 예방 또는 치료할 수 있는 물질로서, 그 예로는 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오레우라실(5-fluoreuracil), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 베르베린(berberine), 에피루비신(epirubicin), 독시사이클린(doxycycline), 겜시타빈(gemcitabine), 라파마이신(rapamycin), 타목시펜(tamoxifen), 헤르셉틴(herceptin), 아바스틴(avastin), 티사브리(tysabri), 에르비툭스(erbitux,) 캠패트(campath), 제발린(zevalin), 휴미라(humira), 밀로타르그(mylotarg), 졸레어(Xolair), 벡사르(bexxar), 랩티바(raptiva), 레미카데(remicade), siRNA, 앱타머(aptamer), 인터페론(interferon), 인슐린, 레오프로(reopro), 리툭산(rituxan), 제나팍(zenapax), 시물렉트(simulect), 오르토클론(orthoclone), 시나기스(synagis), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 표피 성장 인자(EGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 티오레독신(thioredoxin), Fel d1, Api m1, 마이엘린 염기성 단백질(myelin basic protein), Hsp60 및 dnaJ 등을 사용할 수 있다.
상기 기능성 화장료의 유용 물질로 주름 기능성 성분, 미백 기능성 성분, 자외선 차단 기능성 성분, 천연물 유래 성분, 피부 마이크로바이옴, 기능성 균주, 및 피부 마이크로바이옴 및 기능성 균주의 발효물 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 또한, 화장품 제형에 들어가는 점착제, 점증제, pH 조절제, 향미제, 습윤제 및 방부제를 추가로 사용할 수 있다.
상기 형광물질은 본 발명이 속하는 당업계에서 일반적으로 사용되는 형광 물질일 수 있으며, 그 예로는 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rodamine), 단실(Dansyl), Cy 및 안트라센(antracene) 등을 사용할 수 있다.
상기 방사성 동위원소는 3H, 14C, 22Na, 35S, 33P, 32P 및 125I일 수 있다.
상기 표적 지향성 물질은 특정 표적 물질을 선택적으로 인지, 결합 또는 전달할 수 있는 임의의 물질을 의미하며, 그 예로는 RGD(알지닌-루신-아스파틱산), TAT(트레오닌-알라닌-트레오닌) 및 MVm(메티오닌-발린-D메티오닌) 등의 펩티드, 특정 세포를 인지하는 펩티드, 항원, 항체. 엽산, 핵산, 앱타머, 또는 탄수화물(예, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스 등)을 사용할 수 있다.
또한, 이미징 물질은 이미징 물질은 NMR(Nuclear Resonance Spectrometer), MRI(자기공명이미지), PET(Positron Emission Tomography), CT(Nuclear Resonance Spectrometer)와 같은 스펙트로스코피나, 형광 현미경, 공촛점 레이져 주사 현미경 등의 현미경을 통해 감지할 수 있는 임의의 물질로서, 그 예로는 Ga-콤플렉스, 나노 입자 및 탄소 나노 재료 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 Ga-콤플렉스로는 Ga-DTPA, Ga-DTPA-BMA, Ga-DOT 및 Ga-cyclam등이 있으며, 상기 나노 입자로는 금, 은, 망간, 카드뮴, 셀레늄, 텔루륨 및 아연 등이 있으며, 바람직하게는 1~200 nm 크기의 나노 입자이며, 상기 탄소 나노 재료로는 단일벽 나노 튜브, 다중벽 나노 튜브, 플러린 및 그라핀 등을 사용할 수 있다.
또한, 세포 배양에 필요한 배양액으로 당업계에서 사용되는 성분을 제한없이 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 아다만테인-히알루론산 유도체; 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체로부터 제조된 초분자 자기조립 하이드로젤에 관한 것이다. 본 발명에서는 이러한 초분자 자기조립 하이드로젤을 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤이라 표현할 수 있다.
본 발명에서 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체 각각은 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이르도젤에서 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 초분자 자기조립 하이드로젤은 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 포함하여, 이를 통해 상기 하이드로젤 내에 인간성장호르몬(hGH)을 포함할 수 있다.
성장인자 및 호르몬과 같은 생리활성 단백질은 세포 성장을 자극하고 세포 행동을 제어하여 생체 내 조직 형성에 중요한 역할을 한다. 특히, 인간성장호르몬(hGH)은 섬유아세포 및 각질세포를 포함한 세포의 증식을 촉진할 수 있다. 따라서, 세포로의 인간성장호르몬의 시공간적으로(spatiotemporally) 제어된 전달은 효과적인 피부 조직 재생을 유도할 수 있다.
일 구체예에서, 하이드로젤 내에서 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체의 함량은 0.0001 ng/ml 내지 1000 ng/ml일 수 있다.
일 구체예에서, 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체는 아다만테인-히알루론산에 도입된 알데하이드기와 hGH의 N-말단 아민기가 결합을 형성할 수 있다.
구체적으로, 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체는 아다만테인-히알루론산(Ad-HA) 유도체에 알데하이드기를 도입하고, amine-aldehyde 반응을 통해 Ad-HA 유도체에 hGH을 결합시켜 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 초분자 가지조립 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 아다만테인의 호스트-게스트 상호작용; 및 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체의 아다만테인의 호스트-게스트 상호작용을 통해 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 하이드로젤 내에서 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 함량비는 1:0.1 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:2.5 또는 1:1일 수 있다. 또한, 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체는 하이드로젤 내에서 함량이 0.0001 ng/ml 내지 1000 ng/ml이 되도록 첨가할 수 있다.
일 구체예에서, 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 아다만테인-히알루론산 유도체; 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체의 물리적 혼합에 의해 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 초분자 자기조립 히알루론산은 유용 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유용 물질은 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤에서 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 전술한 초분자 자기조립 하이드로젤의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 초분자 자기조립 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체를 혼합하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 상기 단계를 통해 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤을 제조할 수 있다.
본 발명에서는 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 아다만테인의 초분자 반응, 즉, 호스트-게스트 상호작용을 통해 하이드로젤이 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 함량비는 1:0.1 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:2.5 또는 1:1일 수 있다.
일 구체예에서, 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 물리적 혼합에 의해 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 초분자 자기조립 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체, 아다만테인-히알루론산 유도체 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 혼합하는 단계를 통해 제조될 수 있다. 상기 단계를 통해 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤을 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤은 하기 방법 중 하나에 의해 제조될 수 있다.
(1) 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 용액, 아다만테인-히알루론산 유도체 용액 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체 용액을 혼합하여 하이드로젤 제조
(2) 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 용액 및 아다만테인-히알루론산 유도체 용액을 혼합하여 제1 하이드로젤을 제조한 다음, 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체 용액을 혼합하여 제2 하이드로젤 제조
(3) 아다만테인-히알루론산 유도체 용액에 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 첨가하여 혼합 용액을 제조한 다음, 상기 혼합 용액에 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 용액을 혼합하여 하이드로젤 제조
일 구체예에서, 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 아다만테인의 호스트-게스트 상호작용; 및 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체의 아다만테인의 호스트-게스트 상호작용을 통해 제조될 수 있다.
일 구체예에서, 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 함량비는 1:0.1 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:2.5 또는 1:1일 수 있다. 또한, 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체는 하이드로젤 내에서 함량이 0.0001 ng/ml 내지 1000 ng/ml이 되도록 첨가할 수 있다.
일 구체예에서, 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 아다만테인-히알루론산 유도체; 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체의 물리적 혼합에 의해 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 초분자 자기조립 히알루론산은 유용 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유용 물질은 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤에서 전술한 바와 같다.
상기 유용 물질은 하이드로젤의 형성 전 유도체 용액에 혼합되어 하이드로젤에 담지되거나, 또는 하이드로젤의 형성 후에 담지될 수 있다.
또한, 본 발명은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체, 아다만테인-히알루론산 유도체 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 초분자 자기조립 하이드로젤은 전술한 유도체들/접합체의 자기조립을 통해 제조되므로 상기 초분자 하이드로젤 내부에 hGH를 포함할 수 있다.
상기 약물전달체는 추가의 유용 물질을 담지할 수 있으며, 이러한 유용 물질로는 세포 또는 약물을 사용할 수 있다.
상기 약물전달체는 인간을 포함한 동물에게 생체내 또는 시험관내로 유용 물질을 전달하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약물전달체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 경구, 비경구 투여, 예컨대 주사, 주입, 이식될 수 있다. 비경구 경로의 예로는 혈관내, 종양내, 암 주변부, 경점막, 경피, 근육내, 비내, 정맥내, 피내, 피하, 복강내, 뇌실내(intraventricularly), 두개강내(intracranially), 질내, 흡입, 직장 등이 있다.
상기 약제학적 조성물은 제조된 하이드로젤을 그대로 사용하거나, 또는 투여 경로에 적합한 형태, 즉, 고체 제제, 액체 제제, 또는 수화젤로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 도 1은 가속화된 피부 조직 재생을 위한 초분자 자기조립 하이드로젤의 모식도를 나타낸다.
상기 초분자 자기조립 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 아다만테인-히알루론산 유도체; 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체로부터 제조된 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤로, 상기 초분자 하이드로젤 내에 hGH를 포함하는 구성을 가진다.
도 1에 나타난 바와 같이, 초분자 하이드로젤은 인테그린-RGD 결합을 통해 세포 부착이 증가되며, 또한, hGH에 의해 세포 성장 자극이 유도될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 초분자 하이드로젤은 피부 조직의 ECM을 구조적 및 생화학적으로 모방하는 조직 공학 지지체이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
[참고] 재료
돼지 피부 유래의 젤라틴(GE), Streptomyces hyalurolyticus 유래의 히알루로니다제, 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4), 과요오드산 나트륨, 에틸 카바제이트, 시아노보로하이드라이드 나트륨 및 인간 혈청은 Sigma-Aldrich(St.Louis, MO)에서 구입하였다. 소듐 히알루로네이트(HA, 100 kDa)는 Lifecore Co.(Chaska, MN)에서 구입하였고, 재조합 인간 성장 호르몬(hGH)은 코러스팜(춘천, 한국)에서 구입하였다. Fluorescein 5-isothiocyanate(FITC)는 Tokyo Chemical Industry(도쿄, 일본)에서 구입하였고, 3A-아미노-3A-덱소이-(2AS,3AS)-b-사이클로덱스트린 하이드레이트(β-CD 아민), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸-모르폴리늄 클로라이드(DMTMM) 및 2-(n-모르폴리노)-에탄설폰산(MES) 모노하이드레이트는 Georgiachem(Norcross, GA)으로부터 구입하였다. Dulbecco's modified eagle medium(DMEM) 및 RPMI 1640 배지는 GIBCO(Grand Island, NY)에서 구입하였다.
[통계 분석]
통계 분석은 SigmaPlot 12.0(Systat Software Inc, San Jose, CA)을 사용하여 수행되었다. 모든 결과는 평균 표준±편차로 표시된다. 모든 실험에서 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001은 통계적으로 의미 있는 것으로 간주되었다.
제조예 1. 젤라틴-사이클로덱스트린(GE-CD) 유도체 제조
젤라틴(GE)을 커플링 시약인 DMTMM을 사용하여 아마이드 결합을 통해 젤라틴-사이클로덱스트린(GE-CD) 유도체로 제조하였다.
구체적으로, GE(1 g)를 MES 완충액(100 mM, pH 5.5)에 20 mg/mL 농도로 용해시키고, β-CD 아민(3.84g)을 첨가하였다. 용해 후, DMTMM(468 mg)을 첨가하고 24 시간 동안 교반하였다. 100 mM 염화나트륨 용액으로 2 일, 증류수로 1 일 투석한 후, 동결건조하여 GE-CD 유도체 분말을 얻었다.
실험예 1. 젤라틴-사이클로덱스트린(GE-CD) 유도체의 특성
제조예 1에서 제조된 GE-CD 유도체의 화학 구조를 1H NMR(DRX500, Bruker, Germany), FT-IR (PerkinElmer, Waltham, MA)로 분석하였다.
도 2의 (a)는 천연 GE 및 GE-CD 유도체의 1H NMR 결과를 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, GE-CD 유도체는 δ=7.2-7.5 ppm에서 GE의 방향족 아미노산 신호를 유지하면서 δ=5.0-5.3 ppm에서 CD-아민의 피크가 관찰되었다.
도 2의 (b)는 GE, CD 및 GE-CD 유도체의 FT-IR 결과를 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, κ = 900-1200 cm-1에서 CD-아민의 피크가 확인되어, GE-CD 유도체가 형성되었음을 확인할 수 있다.
또한, GE-CD 유도체의 원편광이색성(Circular dichroism)을 circular dichroism(J-815, JASCO)로 분석하였다.
도 2의 (c)는 GE 및 GE-CD 유도체의 200 nm 내지 250 nm에서의 원편광이색성 분석 결과를 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, GE-CD 유도체 합성 과정에서 GE의 3차원 구조에 변성 없이 상기 GE-CD 유도체가 제조됨을 확인할 수 있다.
제조예 2. 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤 제조
종래의 기술에 따라 Ad-HA 유도체를 합성하였다(참고문헌 20).
1H NMR 결과, Ad-HA 유도체는 δ=1.50-1.70 ppm에서 Ad의 피크가 확인되었으며, 변형율은 23±2 mol%로 관찰되었다.
그 다음, 제조예 1에서 제조된 GE-CD 분말(200 mg/ml) 및 Ad-HA 분말(50 mg/ml)을 PBS에 용해시키고(GE-CD 용액 및 Ad-HA 용액 제조), 다른 혼합비(1:1.5, 1:2, 1:2.5)로 수동 혼합하여 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤을 제조하였다.
실험예 2. 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 특성
제조예 2에서 제조된 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 특성을 분석하였다. 본 실험예에서는 GE-CD 용액 50μL 및 Ad-HA 용액 100μL을 혼합하여(혼합비율: 1:2) 제조한 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 특성을 분석하였다.
먼저, MCR 92 레오미터(Anton Paar, Torrance, CA)를 25 mm 평행 플레이트와 함께 사용하여 초분자 하이드로젤의 유변학적 특성을 분석하였다. 상기 초분자 하이드로젤의 저장 및 손실계수는 0.1에서 100 rad/s의 각주파수(angular frequency)의 변화하에서 1% 전단 변형률에서 모니터링하였다. 또한, 연속흐름시험은 전단속도를 0에서 100 1/s로 변화시키면서 수행하였다.
본 발명에서 도 1의 (d) 및 (e)는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 주파수 스윕(Frequency sweep) 및 연속흐름실험 결과를 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 주파수 스윕 및 연속흐름실험 결과는 생체 내 적용을 위한 초분자 하이드로젤의 충분한 기계적 강도를 보여주었다.
실험예 3. 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 분해 실험
제조예 2에서 제조된 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤(GE-CD 용액 및 Ad-HA 용액의 혼합비율: 1:2)의 효소 분해를 평가하였다.
구체적으로, 초분자 하이드로젤을 37℃에서 히알루로니다제(400U/mL)가 있거나 또는 없는 PBS 용액에서 인큐베이션하였다. 소정의 시간 간격으로 초분자 하이드로젤을 증류수로 세척하고 동결건조하여 초분자 하이드로젤의 잔여 중량을 측정하였다.
본 발명에서 도 1의 (f)는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤의 효소 분해 실험 결과를 나타낸다. 상기 초분자 하이드로젤의 효소 분해는 21 일 동안 관찰되었다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 초분자 하이드로젤은 히알루로니다제가 없는 PBS 용액에서 매우 천천히 분해되는 반면, 히알루로니다제가 있는 PBS 용액에서는 21 일째에 완전히 분해되는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터, 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤은 표적 부위에 안정적으로 남아 있고, 생체 내에서 생물학적 기능 후에 분해되는 것을 확인할 수 있다.
제조예 3. Ad-HA-hGH 접합체의 제조
Ad-HA 유도체(100 mg, 1.0 equiv)를 증류수(10 mg/mL)에 용해시키고, 과요오드산 나트륨(107 mg, 2.0 equiv)을 첨가하였다. 어두운 곳에서 교반하면서 6 시간 동안 반응시킨 후, 에틸렌글리콜(50 μL)을 첨가하여 2 시간 동안 반응을 종결시켰다. 반응 용액을 100 mM 염화나트륨 용액으로 2 일 및 증류수로 1 일 동안 투석하였다. 그 후, 용액을 동결건조하여 알데하이드기가 도입된 Ad-HA(Ad-HA-ALD)를 얻었다.
아세트산나트륨 완충액(3 mg/mL, pH 5.5)을 이용하여 Ad-HA-ALD 용액을 제조하고, 상기 용액에 HA 사슬 당 3 hGH 분자를 첨가하였다. 시아노보로하이드라이드 나트륨(5M 과량)을 용액에 첨가하고 24 시간 동안 교반하였다. Ad-HA-ALD에서 미반응 알데하이드 모티프(motif)는 5 M 과량의 에틸 카바제이트 및 시아노보로하이드라이드 나트륨을 첨가하여 차단되었다. 용액을 PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 정제하여 PBS 중의 Ad-HA-hGH 용액을 얻었다.
실험예 4. Ad-HA-hGH 접합체의 특성
제조예 3에서 제조된 Ad-HA-hGH 접합체를 워터스 717 플러스 오토샘플러(Waters 717 plus autosampler), 워터스 1525 이원 HPLC 펌프(Waters 1525 binary HPLC pump), 워터스 2487 이중 λ 흡광도 검출기(Waters 2487 dual 
absorbance detector), Ultrahydrogel™ 250 컬럼과 연결된 Ultrahydrogel™ 500을 사용한 HPLC로 분석하였다.
PBS 용액(pH 7.4, 유속: 0.5 mL/min)을 이동상으로 사용하고, Ad-HA-hGH 접합체를 280 nm 파장에서 검출하였다. Ad-HA-hGH 접합체의 단백질 구조는 원편광이색성으로 분석하였다. Ad-HA-hGH 접합체의 생물학적 활성은 ELISA/Bradford 분석으로 평가하였다. Ad-HA-hGH 접합체와 hGH의 함량은 hGH ELISA kit(Invitrogen)와 Coomassie blue staining으로 비교하였다.
본 발명에서 도 3의 (a)는 Ad-HA-hGH(위쪽) 및 Ad-HA(아래쪽)의 1H NMR(삽입 이미지)을 포함하는 HPLC 분석 결과를 나타낸다.
hGH의 N-말단 아민기는 Ad-HA에 도입된 알데히드기와 선택적으로 접합되어, hGH의 생물학적 활성을 유지할 수 있다. hGH의 새로운 피크 모양은 1H NMR 스펙트럼에서 관찰되며, Ad-HA-hGH 접합체의 제조는 천연 hGH와 비교하여 HPLC에서 관찰된 체류 시간(retention time) 감소로부터 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에서 도 3의 (b)는 Ad-HA-hGH 접합체의 원편광이색성 분석 결과를 나타내고, (c)는 ELISA/Bradford 분석 결과를 나타낸다.
원편광이색성 및 Bradford 분석을 통해, Ad-HA-hGH 접합체의 2차 구조 및 면역학적 생리활성의 유지를 확인할 수 있다.
또한, 본 실험예에서는 Nb2-11 세포를 사용하여 시험관 내 세포 실험을 통해 Ad-HA-hGH 접합체의 생물활성을 평가하였다.
Nb2-11 세포를 10% 말 혈청, 10% 우태아 혈청(FBS), 10-4 M 2-메르캅토에탄올 및 1% antibiotic-antimycotic(AA)를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배지를 10% 말 혈청, 1% FBS, 10-4 M 2-메르캅토에탄올, 1% AA를 포함하는 RPMI 1640으로 변경하고, 24 시간 동안 배양하여 세포 증식 속도를 늦췄다. 세포를 수집하고 FBS가 없는 배지(1.5 x 105 cells/mL)에 재현탁하였다. 세포 배양 플레이트를 0.1 mL의 세포 현탁액으로 채우고, 0.1 mL의 hGH 또는 Ad-HA-hGH 용액(0.2-2,000,000 pg/mL)으로 처리하였다. 72 시간 동안 배양한 후, WST assay를 수행하여 세포의 증식 속도를 측정하였다.
Nb2-11 세포는 hGH 활성에 대한 높은 특이성과 민감도를 가지고 있기 때문에, Nb2-11 세포를 사용하여 Ad-HA-hGH에 의한 세포 활성을 추정할 수 있다.
본 발명에서 도 3의 (d)는 hGH 및 Ad-HA-hGH 접합체에 의해 자극된 Nb2-11 세포의 증식 속도를 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 세포 증식을 자극하는 Ad-HA-hGH 접합체의 최소 농도는 천연 hGH와 유사하므로, Ad-HA-hGH의 생물학적 활성이 보존되었음을 확인할 수 있다.
실험예 5. hGH 전달에 대한 Ad-HA 접합의 효과 평가
hGH 및 Ad-HA-hGH 접합체의 혈청 안정성은 인간 혈청에서 50 μg/mL의 농도에서 37℃ 및 72 시간 동안 인큐베이션하여 평가하였다.
본 발명에서 도 3의 (e)는 Ad-HA-hGH 접합체의 혈청 안정성을 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 인간 혈청에서 72 시간 동안 인큐베이션한 후 Ad-HA-hGH 접합체의 생물학적 활성은 약 80% 이나, hGH의 생물학적 활성은 약 60%에 불과한 것을 확인할 수 있다. 즉, Ad-HA-hGH 접합체의 안정성이 우수한 것을 확인할 수 있다.
한편, 본 실험예에서는 소정의 시간 간격으로 샘플을 채취하여 PBS로 1,000배 희석하고 hGH ELISA 키트로 분석하였다. HGH, Ad-HA 및 Ad-HA-hGH 접합체는 FITC와 접합되어 hGH-FITC, Ad-HA-FITC 및 Ad-HA-hGH-FITC를 형성하였다. 상기 HGH-FITC 및 Ad-HA-hGH-FITC를 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤에 로딩하고(제조 방법은 후술할 실험예 6의 GE-CD/Ad-HA+hGH 젤 및 GE-CD/Ad-HA-hGH 젤의 제조 방법과 같음), 1 mL PBS에서 21 일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고 hGH 및 Ad-HA-hGH 접합체의 양을 미리 결정된 시간 간격으로 HPLC로 분석하여 Ad-HA-hGH 접합체의 지속 방출을 평가하였다. 과량의 CD 용액을 첨가하여 초분자 하이드로젤을 분해시킨 후, 초분자 하이드로젤 내 hGH 및 Ad-HA-hGH 접합체의 잔류량을 분석하였다.
도 3의 (f)는 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤로부터 hGH 및 Ad-HA-hGH 접합체의 시험관내 방출 평가 결과를 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, GE-CD 유도체와 Ad-HA-hGH 접합체 사이의 호스트-게스트 상호작용은 초분자 하이드로젤에서 hGH의 버스트 방출을 방지하는 것을 확인할 수 있다. 천연 hGH의 70% 이상이 5 일 동안 초분자 하이드로젤에서 방출되었지만, Ad-HA-hGH는 약 45% 만이 초분자 하이드로젤에서 방출되었다.
또한, 본 실험예에서는 Ad-HA-hGH 접합체의 세포 흡수(cellular uptake)를 평가하였다. 구체적으로, 세포 흡수는 96 웰 세포 배양 플레이트에서 10% FBS 및 1% AA를 포함하는 고글루코오스 DMEM 세포 배양 배지에서 배양된 NIH3T3 섬유아세포에서 평가하였다. 24 시간 후, 배지에 세포를 hGH-FITC, Ad-HA-FITC 또는 Ad-HA-hGH-FITC로 처리한 후 4 시간 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고, fluorometer plate reader(Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystem, Beverly, MA) 및 형광 현미경으로 분석하였다.
HA-CD44와 hGH-GH 수용체 결합의 시너지 효과는 Ad-HA-hGH 접합체가 섬유아세포로 흡수되는 것을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 도 3의 (g)는 섬유아세포로 흡수된 FITC 개질 hGH, Ad-HA, Ad-HA-hGH 접합체의 형광 이미지(scale bars: 200 μm)를 나타내고, (h)는 형광 강도 분석에 의해 흡수된 hGH, Ad-HA 및 Ad-HA-hGH 접합체의 상대적 정량화를 나타낸다
상기 도면에 나타난 바와 같이, Ad-HA-hGH 접합체의 개선된 세포 흡수는 형광 영상화를 통해 확인할 수 있다. Ad-HA-hGH 접합체의 형광 강도가 가장 강했고 Ad-HA와 hGH의 형광 강도가 뒤를 잇는 것을 확인할 수 있다.
제조예 4. 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤 제조
제조예 2에서 제조된 Ad-HA 유도체(50 mg/ml) 용액에 제조예 3에서 제조된 Ad-HA-hGH 접합체를 혼합하여 HA 용액을 제조하였다. 또한, 제조예 1에서 제조된 GE-CD 유도체(200 mg/ml)를 포함하는 용액(GE 용액)을 제조하였다.
상기 HA 용액 및 GE 용액을 혼합하여 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤을 제조하였다.
이때, Ad-HA-hGH 접합체는 하이드로젤의 부피에 따라 50 ng/ml의 농도를 유지할 수 있도록 첨가하였다.
실험예 6. 초분자 하이드로젤의 시험관 내 세포 적합성 및 세포 증식 평가
조직 공학으로의 응용을 위하여, 초분자 하이드로젤에 캡슐화된 섬유아세포를 세포적합성(cytocompatibility) 및 세포 증식(proliferation) 측면에서 평가하였다.
섬유아세포를 분리하고 HA-CD 또는 GE-CD 유도체 용액에 각각 재현탁한 다음, 최종 농도 1.0 x 105 cells/mL에서 Ad-HA 유도체 용액 또는 Ad-HA 유도체와 Ad-HA-hGH 접합체의 혼합 용액과 혼합하였다. 이를 통해, 4가지 유형의 초분자 하이드로젤이 형성되었다.
- HA-CD/Ad-HA 젤,
- GE-CD/Ad-HA 젤,
- GE-CD/Ad-HA+hGH(100 ng/mL) 젤
- GE-CD/Ad-HA-hGH(100 ng/mL) 젤
여기서, GE-CD/Ad-HA+hGH 젤은 GE-CD 유도체 용액 및 hGH를 포함하는 Ad-HA 유도체 용액을 혼합하여 제조된 초분자 하이드로젤이고, GE-CD/Ad-HA-hGH 젤은 GE-CD 유도체 용액 및 Ad-HA 유도체와 Ad-HA-hGH 접합체의 혼합 용액을 혼합하여 제조된 초분자 하이드로젤(제조예 4 참조)이다.
상기 4개의 초분자 하이드로젤 각각을 세포 배양 배지에서 10 일 동안 인큐베이션하고 배지를 2 일마다 교환하였다. 세포를 calcein AM 및 ethidium homodimer-1(EthD-1)를 사용하여 각각 녹색(살아있는 세포)과 적색(죽은 세포)으로 염색하고, Z-stack 공초점 현미경(Fluoview FV500, Olympus, Tokyo)으로 관찰하였다. 세포 생존율은 공초점 이미지에서 살아있는(녹색) 세포와 죽은(적색) 세포를 계산하여 정량화하였다.
도 4에서 (a)는 4 일 및 10 일째에 초분자 하이드로젤에서 염색된 섬유아세포의 공초점 Z-스택 형광 이미지를 나타낸다(크기: 600×600×300 μm). 또한, (b)는 공초점 형광 이미지에서 세포 생존력의 정량적 분석 결과를 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 94% 이상의 세포가 4 일 및 10 일에 모든 종류의 초분자 하이드로젤에서 생존했는데, 이는 초분자 하이드로젤의 높은 세포적합성을 의미하는 것이다.
한편, 초분자 하이드로젤에서 세포 증식률은 미리 결정된 시간 간격으로 fluorometer plate reader를 사용하여 CCK-8 분석을 통해 분석하였다.
HA-CD/Ad-HA 젤 그룹의 경우, 초분자 하이드로젤 지지체에 RGD 펩타이드가 없기 때문에, 10 일째에 세포를 조직 배양 플레이트(TCP)로 이동시켰다. 그러나, 다른 초분자 하이드로젤 그룹은 GE 백본의 RGD가 인테그린-RGD 결합 및 세포 부착을 유도하여, 세포를 3D 하이드로젤의 전체 부분으로 분배했다.
본 발명에서 도 4의 (c)는 10 일 동안 초분자 하이드로젤에 캡슐화된 섬유아세포의 증식률을 나타낸다. 상기 도면에 나타난 바와 같이, 초분자 하이드로젤의 세포 수 증가는 모든 그룹에서 관찰되었다.
구체적으로, 7 일째에 HA-CD/Ad-HA 젤 그룹은 초분자 하이드로젤로부터 이동된 TCP 상의 세포 성장으로 인해 증식률이 갑자기 증가하였지만, 10 일째에 TCP 상의 과도한 세포 컨플루언시(confluency)에 의해 증식이 저해되었다. 반면, GE-CD 기반 초분자 하이드로젤은 피부 조직 ECM을 모방한 3D 배양 환경을 만들어 10 일째에 더 높은 세포 증식률을 보였다. GE-CD/Ad-HA-hGH 젤 그룹은 GE-CD/Ad-HA+hGH 젤 및 다른 젤 그룹과 비교하여 7 일째부터 유의하게 향상된 세포 증식을 나타내었다. GE-CD/Ad-HA-hGH 젤로부터 Ad-HA-hGH 접합체의 시공간적으로 제어된 전달은 지속적인 섬유아세포 성장 및 증식을 자극할 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명에서는 GE의 RGD 펩타이드와 초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 젤이 ECM 유사 환경을 만들어, 하이드로젤의 Ad-HA-hGH가 효과적인 섬유아세포 성장을 가지는 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. 초분자 하이드로젤에서 섬유아세포의 면역염색.
세포-지지체 상호작용 및 세포 분포를 평가하기 위해, 초분자 하이드로젤에 캡슐화된 섬유아세포에 대해 면역염색을 수행하였다.
섬유아세포는 실험예 6에서 전술한 바와 같이 초분자 하이드로젤에서 배양되었다. 4 일과 10 일째에 초분자 하이드로젤을 4% 포름알데하이드 용액에 15 분 동안 고정하고 세포막을 0.1% Triton-X100으로 12 분 동안 처리하였다. 3% 소혈청알부민(BSA) 용액으로 30 분 동안 차단한 후, 하이드로젤을 Phalloidin-iFluor 488(1:300)로 1 시간 동안 처리하였다. 세포의 핵을 DAPI 용액으로 15 분 동안 염색하였다. 염색 후, 초분자 하이드로젤을 Z-stack 공초점 현미경으로 관찰하고 각 층의 세포 수를 정량화하였다.
RGD 펩타이드는 인테그린-RGD 결합을 통해 세포 부착을 촉진하여, 하이드로젤 지지체에서 세포 형태 및 분포의 변화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
도 5에서 (a)는 섬유아세포의 공초점 Z-스택(600×600×300 μm) 및 단면(하이드로젤의 중간 및 바닥) 이미지(파란색: 핵, 녹색: F-액틴, scale bars: 50 μm)를 나타낸다. 또한, (b) 및 (c)는 4 일 및 10 일째에 공초점 이미지에서 150×150 μm에 대한 정량 분석에 의해 결정된 하이드로젤에 분포된 세포 수의 비율을 나타낸다
상기 도면에 나타난 바와 같이, 4 일째에, HA-CD/Ad-HA 젤의 경우 세포의 약 60%가 젤 지지체에 위치했고, 세포 지지체 부착이 없기 때문에 둥근 모양을 보였다. 한편, GE-CD 기반 젤을 사용할 경우 85% 이상의 세포가 세포와 지지체 사이의 인테그린-RGD 결합에 의해 신장된 형태로 지지체에 위치하였다.
10 일째에, HA-CD/Ad-HA 젤 그룹에서 대부분의 세포가 TCP로 이동하였다. 반면, GE-CD 기반 젤 그룹의 세포 분포 비율은 현저하게 향상된 세포 접착력으로 80% 이상 유지된 것을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터, 초분자 하이드로젤의 GE 백본에 있는 RGD는 TCP로의 이동 대신 세포-지지체 접착 및 3D 세포 성장을 향상시키는 것을 확인할 수 있다.
실험예 8. 초분자 하이드로젤의 생체 내 세포 배양
초분자 GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤의 생체 내 피부 조직 재생에 대해 평가하였다.
Balb/c 암컷 마우스를 무작위로 4개 그룹(HA-CD/Ad-HA 젤, GE-CD/Ad-HA 젤, GE-CD/Ad-HA+hGH 젤, GE-CD/Ad-HA-hGH 젤)으로 나누었다.
적색 형광 단백질(RFP)을 생성하도록 유전자 변형된 섬유아세포를 캡슐화하는 각각의 초분자 하이드로젤을 마우스의 등에 피하 주사하였다. 주사 후, 미리 정해진 시간 간격으로 Xenogen IVIS 시스템(Caliper Life Science)으로 생체 내 형광 이미지를 얻었다. 모든 동물 실험 절차는 POSTECH의 IACUC(Institutional Animal Care and Use) 위원회의 승인을 받았다.
본 발명에서 도 6의 (a)는 21 일 동안 초분자 하이드로젤에 이식된 섬유아세포의 생체 내 이미지를 나타내고, (b)는 21 일 동안 이식된 세포의 세포 증식을 반영하는 상대 형광 강도를 나타낸다.
상기 도면에 나타난 바와 같이, RFP 신호의 정량적 분석은 이식된 세포가 21 일 이상 동안 생체 내에서 초분자 하이드로젤에서 연장된 세포 생존 및 증식을 보여준다.
특히, GE-CD/Ad-HA 젤 그룹과 GE-CD/Ad-HA-hGH 젤 그룹에서 증가된 신호는 RGD 펩타이드와 hGH를 포함하는 초분자 하이드로젤의 미세환경이 세포 성장과 피부 조직 재생을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
실험예 9. 초분자 하이드로젤의 조직학적 분석
주사 후 21 일째에, 마우스를 희생시켜 나머지 초분자 하이드로젤을 수집하였다. 수집된 샘플을 4% 포름알데하이드 용액에 고정하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색으로 조직학적 분석을 수행하였다. 또한, 광학 현미경을 사용하여 염색된 샘플을 관찰하였다.
도 7은 21 일째에 H&E 염색에 의해 수집 및 시각화된 초분자 하이드로젤에서 이식된 섬유아세포의 조직학적 분석 결과를 나타낸다(scale bars: 위쪽 이미지의 경우 500μm, 아래쪽 이미지의 경우 100μm).
상기 도면에 나타난 바와 같이, 초분자 하이드로젤은 마우스의 피하 부위에서 안정적으로 유지되었고, 섬유아세포는 초분자 하이드로젤에서 증식되는 것을 확인할 수 있다. 또한, GE-CD/Ad-HA+hGH 젤 및 GE-CD/Ad-HA-hGH 젤 군에서 기공이 관찰되어, 혈관 형성을 확인할 수 있다.
혈관 형성은 생성된 혈관으로부터 영양분을 공급받아 세포 성장을 촉진할 수 있기 때문에, 조직 재생에 매우 중요하다.
hGH는 섬유아세포의 증식뿐만 아니라 혈관신생(angiogenesis)을 촉진하는 인슐린유사 성장 인자-1(IGF-1)의 생성을 자극한다. 이를 통해, hGH 함유 그룹은 기공에 적혈구가 있는 혈관 구조를 나타내었다. 특히, Ad-HA-hGH는 hGH 단독에 비해 캡슐화된 세포에 효율적으로 전달되어 혈관 형성을 촉진하였다.
상기 결과로부터, GE-CD/Ad-HA-hGH 젤은 섬유아세포 성장과 혈관 형성을 가속화하여 생체 내 피부 조직 재생을 성공적으로 촉진함을 확인할 수 있다.
본 발명의 초분자 자기조립 하이드로젤은 피부 조직 공학을 위하여 미세환경과 같은 ECM을 제공하기 위해 개발되었다. GE-CD 유도체와 Ad-HA 유도체의 호스트-게스트 상호작용은 피부 조직 ECM과 유사한 자기조립 하이드로젤을 형성한다. GE의 백본에 있는 RGD 펩타이드에 의해, 초분자 GE-CD/Ad-HA 하이드로젤은 상기 초분자 하이드로젤 내에서 캡슐화된 세포 결합을 촉진할 수 있다. 또한, Ad-HA-hGH 접합체의 사용은 높은 세포 흡수, 혈청 안정성 및 초분자 하이드로젤로부터 hGH의 지속적인 방출을 가능하게 하여, 섬유아세포 성장 및 피부 재생을 자극할 수 있다.
RFP 발현 세포를 캡슐화하는 초분자 하이드로젤을 마우스의 피하에 주입하여 IVIS 영상화에 의해 캡슐화 세포의 성장을 평가한 결과, 이식된 세포는 초분자 하이드로젤에서 증식하고, 형광이 21일 이상 동안 검출되었다. RGD 펩타이드와 hGH를 포함하는 초분자 하이드로젤의 미세환경은 세포 성장과 피부 조직 형성을 향상시킬 수 있다. 또한, GE-CD/Ad-HA-hGH 하이드로젤에서 혈관 형성이 관찰되었는데, 이는 Ad-HA-hGH 접합체에 의한 섬유아세포로부터의 IGF-1 생성으로 인해 영양 공급에 의한 피부 조직 재생을 가속화할 수 있기 때문일 수 있다. 즉, 본 발명의 초분자 하이드로젤은 다양한 조직 공학 응용을 위해 적용될 수 있다.
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Claims (13)
- 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 및 아다만테인-히알루론산 유도체로부터 제조된 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 1 항에 있어서,
젤라틴-사이클로덱스트린 유도체는 젤라틴과 사이클로덱스트린이 아마이드 결합을 통해 결합되어 있는 것인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 1 항에 있어서,
아다만테인-히알루론산 유도체는 히알루론산과 아다만테인이 에스터 결합을 통해 결합되어 있는 것인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 1 항에 있어서,
젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 함량비는 1:0.1 내지 1:5 인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 1 항에 있어서,
초분자 자기조립 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 아다만테인의 초분자 반응에 의해 형성되는 것인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 1 항에 있어서,
유용 물질을 추가로 포함하며,
상기 유용 물질은 세포, 약물, 기능성 화장료의 유용 물질, 형광물질, 방사성 동위원소, 표적 지향성 물질, 이미징 물질 및 배양액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체; 아다만테인-히알루론산 유도체; 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체로부터 제조된 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 7 항에 있어서,
아다만테인-히알루론산-hGH 접합체는 아다만테인-히알루론산 유도체에 도입된 알데하이드기와 hGH의 N-말단 아민기가 결합을 형성하는 것인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 7 항에 있어서,
하이드로젤 내에서 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체의 함량은 0.0001 ng/ml 내지 1000 ng/ml인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 제 7 항에 있어서,
초분자 자기조립 하이드로젤은 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산 유도체의 아다만테인의 초분자 반응; 및 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체의 사이클로덱스트린 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체의 아다만테인의 초분자 반응에 의해 형성되는 것인 초분자 자기조립 하이드로젤.
- 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체 및 아다만테인-히알루론산 유도체를 혼합하는 단계를 포함하는 초분자 자기조립 하이드로젤의 제조 방법.
- 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체, 아다만테인-히알루론산 유도체 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 혼합하는 단계를 포함하는 초분자 자기조립 하이드로젤의 제조 방법.
- 젤라틴-사이클로덱스트린 유도체, 아다만테인-히알루론산 유도체 및 아다만테인-히알루론산-hGH 접합체를 포함하는 약물전달체.
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