KR20230050952A - 광열 치료 및 광역학 치료가 가능한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents
광열 치료 및 광역학 치료가 가능한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 향상된 광열 치료와 광역학 치료를 동시에 수행할 수 있는 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드-실리카(rGO-MSN) 나노 복합체와 그의 제조방법에 관한 것이다. 기존의 rGO의 담지용량은 약물의 화학적 구조에 따라 달라지는 문제를 가지고 있다. 이를 개선하기 위해서 rGO 표면에 다공성 실리카층을 도입하여 약물 담지 효율을 개선시켰다. 그 후 rGO-MSN 나노 복합체가 특정 암세포를 표적할 수 있도록 folic acid (FA)를 결합했다. 마지막으로 근적외선을 조사하였을 때, 높은 열과 활성산소를 형성시킬 수 있는 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)를 rGO-MSN-PEG-FA에 봉입하였다. 투과전자 현미경과 다양한 방법 (FT-IR, zeta-potential)을 이용하여 rGO-MSN 나노 복합체의 구조를 규명하였다. 향상된 광열 치료와 광역학 치료의 여부를 확인하기 위해, ICG@rGO-MSN-PEG-FA에 808nm 근적외선 레이저를 조사하여서 광열효과와 활성산소의 형성을 평가하였다. rGO-MSN 나노복합체를 NIH-3T3와 CT-26 세포에 처리하여 세포독성을 평가하였으며, 레이저 공초점 현미경을 이용하여 rGO-MSN-PEG-FA의 암세포 표적 능력을 확인하였다. 마지막으로, ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 광열, 광역학 치료 효과를 평가하였다. 이를 통해 특정 수용체가 과발현된 암세포를 표적할 수 있을 뿐만 아니라, 근적외선 조사 때문에 열과 활성산소로 암세포를 사멸시킬 수 있는 rGO-MSN 나노 복합체를제조하였다.
Description
본 명세서는 향상된 광열 치료와 광역학 치료를 동시에 수행할 수 있는 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드-실리카 (rGO-MSN) 나노복합체와 그의 제조방법에 관한 것이다.
*이 발명을 지원한 연구개발 사업
(1) 본 연구는 한국연구재단의 주관 하에 이루어진 것으로, 연구과제명은 '다기능성 나노입자 및 3차원 마이크로칩 시스템을 이용한 신경재생 연구' (과제번호: 2019R1A2C2008863; 연구기간: 2021.03.01~2022.02.28)이다.
(2) 본 연구는 나노종합기술원의 주관 하에 이루어진 것으로, 연구과제명은 '넥스트 웨이브 (포스트 코로나) 대응 언컨택트 디지털 PCR 개발' (과제번호: CSM2105M101; 연구기간: 2021.01.01~2021.12.31)이다.
(3) 본 연구는 한국연구재단의 주관 하에 이루어진 것으로, 연구과제명은 '퇴행성 신경 질환 조기 진단을 위한 다기능성 나노 복합체 개발' (과제번호: 2020R1I1A1A01068810; 연구기간: 2021.03.01~2022.02.28)이다.
암을 치료하는 데 있어서 나노 의약품은 향상된 침투력 및 유지력(Enhanced Permeability and Retention, EPR) 효과를 통해 종양 부위에 효과적으로 축적되어 비특이적 조직에서 화학 요법 약물의 분포를 줄이고 과도한 국소 약물 농도로 인한 부작용을 개선할 수 있다고 알려져 있다.
최근 암 치료법으로 광열 치료 및 광역학 치료 등의 새로운 암 치료법이 등장하였다.
광열 치료는 정상세포보다 열에 약한 암세포의 약점을 이용해 체외에서 근적외선을 적용하여 암세포를 제거하는 방법이며, 광열 작용제가 근적외선 하에서 빛을 열로 변환하여 암을 사멸시키는 방식이다. 광열 작용제로서 환원 그래핀 옥사이드(rGO)를 사용할 수 있는데, 이는 근적외선을 효과적으로 흡수하여 광 치료용 열로 변환할 수 있으나, 분산성이 떨어지는 등의 단점이 있고, 환원 그래핀 옥사이드를 통해 약물 또는 작용제 등을 전달하고자 할 경우 비공유결합의 일종인 ππstacking을 통해 약물을 전달할 수 있지만, 약물 봉입용량은 약물의 화학적 구조에 따라 달라지는 문제가 있다.
광역학 치료는 암 조직에만 선택적으로 광감작제가 축적이 되고 이에 맞는 특정 파장의 빛을 조사하여 광감각제를 활성화시키면, 활성 산소를 생성하여 표적 암 세포에 작용하여 암 조직만을 특이적으로 제거하는 방법이다.
단일 광열 치료나 단일 광역학 치료 각각으로는 암을 완벽하게 치료하는 것에 제한이 되기 때문에, 최근 암 치료 경향은 단독적인 방법으로만 시술하는 것을 벗어나 광열 치료와 광역학 치료 각자의 장점을 증대시키고 단점을 보완하는 융합치료가 연구되고 있다.
광열 치료와 광역학 치료가 동시에 가능하다고 알려진 치료물질인 인도시아닌 그린(Indocyanine green, ICG)는 낮은 친수성, 농도 의존적인 응집, 체내에서 급속한 대사, 암세포에 대한 선택성 부족으로 인해 암 치료에 활용하는 데 있어서 제한이 있다.
본 발명의 목적은 광열 치료 및 광역학 치료가 가능한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체를 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 광열 치료 및 광역학 치료를 위한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체로서, 그래핀 옥사이드; 다공성 실리카; 및 엽산을 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 나노 복합체에 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)을 더 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 광열 치료 및 광역학 치료를 위한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법으로서, 그래핀 옥사이드에 다공성 실리카층을 도입하여 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체를 제공하는 제 1 단계; 상기 그래핀 옥사이드 실리카를 환원시켜 환원 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체를 제공하는 제 2 단계; 및 상기 환원 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체에 엽산을 결합시키는 제 3 단계;를 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 나노 복합체에 인도시아닌 그린을 담지시키는 단계를 더 포함하는 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명에서는 환원 그래핀 옥사이드 표면에 다공성 실리카층을 도입하여 높은 용량의 인도시아닌 그린의 담지가 가능하도록 하였다. 또한, 효과적인 암 치료를 위해 상기 나노 복합체를 엽산으로 개질하여 특정 암세포만 표적할 수 있도록 하며, 정상 세포에는 영향을 끼치지 않도록 하였다. 본 발명은 기존 환원 그래핀 옥사이드의 낮은 약물 봉입량의 단점을 개선할 뿐만 아니라, 광열 치료와 광역학 치료를 동시에 구현하여 단일 광열 치료보다 향상된 항암효과를 검증하였다.
도 1A는 다공성 환원 그래핀 옥사이드-다공성 실리카 나노 복합체의 합성 과정의 개요이다.
도 1B는 광열-광역학 치료의 개요를 나타낸다.
도 2A는 rGO-MSN, rGO-MSN-PEG-FA, ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 2B는 rGO-MSN EDS-mapping 분석 결과이다.
도 2C는 rGO-MSN의 EDS 스펙트럼이다.
도 2D는 rGO-MSN 복합체의 입자 사이즈 분석 결과이다.
도 3은 rGO-MSN 나노복합체의 분석 결과로서, A는 푸리에변환 적외선 스펙트럼에 의한 분석, B는 합성된 나노복합체의 제타전위 분석, C는 질소 흡수/탈착 등온곡선, 및 D는 자외선-가시광선 스펙트럼에 의한 분석 결과이다.
도 4는 rGO-MSN 나노복합체의 광열효과 분석 결과로서, A는 ICG 담지 유무에 따른 광열효과 평가, B는 rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 적외선 열화상 이미지, C는 다양한 농도의 ICG@rGO-MSN-PEG-FA, 및 D는 근적외선 인가 유무에 따른 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 광열효과의 재현성 분석 결과이다.
도 5A는 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 처리 후 808nm 근적외선 레이저를 조사한 DPBF 스펙트럼이다.
도 5B는 rGO-MSN 나노복합체의 420nm 파장 흡수 스펙트럼 분석 결과이다.
도 6은 다양한 농도에 따른 rGO-MSN 나노복합체의 세포독성 평가를 나타내며, A는 NIH-3T3 세포, B는 CT-26 세포에 대한 독성 평가 결과이다.
도 7은 ICG@rGO-MSN 나노복합체의 folate receptor 표적 능력 평가 (NIH-3T3: folate receptor non-expressed cell, CT-26: folate receptor overexpressed cell) 결과이다.
도 8은 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 세포 내 활성산소 형성 평가 결과로, A는 형광 이미지, B는 CG@rGO-MSN-PEG-FA의 근적외선 조사 전후 활성산소 정량 평가 결과를 나타낸다.
도 9는 다양한 농도에 따른 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 광열 광역학 치료평가 A는 MTT assay를 이용한 세포사멸 평가결과, B는 CT-26 세포의 광열-광역학 치료 후 형광 이미지(초록: 생존, 빨강: 사멸)를 나타낸다.
도 1B는 광열-광역학 치료의 개요를 나타낸다.
도 2A는 rGO-MSN, rGO-MSN-PEG-FA, ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 2B는 rGO-MSN EDS-mapping 분석 결과이다.
도 2C는 rGO-MSN의 EDS 스펙트럼이다.
도 2D는 rGO-MSN 복합체의 입자 사이즈 분석 결과이다.
도 3은 rGO-MSN 나노복합체의 분석 결과로서, A는 푸리에변환 적외선 스펙트럼에 의한 분석, B는 합성된 나노복합체의 제타전위 분석, C는 질소 흡수/탈착 등온곡선, 및 D는 자외선-가시광선 스펙트럼에 의한 분석 결과이다.
도 4는 rGO-MSN 나노복합체의 광열효과 분석 결과로서, A는 ICG 담지 유무에 따른 광열효과 평가, B는 rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 적외선 열화상 이미지, C는 다양한 농도의 ICG@rGO-MSN-PEG-FA, 및 D는 근적외선 인가 유무에 따른 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 광열효과의 재현성 분석 결과이다.
도 5A는 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 처리 후 808nm 근적외선 레이저를 조사한 DPBF 스펙트럼이다.
도 5B는 rGO-MSN 나노복합체의 420nm 파장 흡수 스펙트럼 분석 결과이다.
도 6은 다양한 농도에 따른 rGO-MSN 나노복합체의 세포독성 평가를 나타내며, A는 NIH-3T3 세포, B는 CT-26 세포에 대한 독성 평가 결과이다.
도 7은 ICG@rGO-MSN 나노복합체의 folate receptor 표적 능력 평가 (NIH-3T3: folate receptor non-expressed cell, CT-26: folate receptor overexpressed cell) 결과이다.
도 8은 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 세포 내 활성산소 형성 평가 결과로, A는 형광 이미지, B는 CG@rGO-MSN-PEG-FA의 근적외선 조사 전후 활성산소 정량 평가 결과를 나타낸다.
도 9는 다양한 농도에 따른 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 광열 광역학 치료평가 A는 MTT assay를 이용한 세포사멸 평가결과, B는 CT-26 세포의 광열-광역학 치료 후 형광 이미지(초록: 생존, 빨강: 사멸)를 나타낸다.
용어의 정의
본 명세서의 rGO는 환원 그래핀 옥사이드 (reduced graphene oxide)를 의미한다.
본 명세서의 rGO-MSN은 환원 그래핀 옥사이드-다공성 실리카 나노 복합체(reduced graphene oxide-mesoporous silica nanocomposite)를 의미한다.
본 명세서의 PEG는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 의미한다.
본 명세서의 FA는 엽산(folic acid)를 의미한다.
본 명세서의 ICG는 인도시아닌 그린(indocyanine green)을 의미한다.
본 명세서의 rGO-MSN-PEG-FA는 엽산으로 개질된 환원 그래핀 옥사이드-다공성 실리카 나노 복합체를 의미한다.
본 명세서의 ICG@rGO-MSN-PEG-FA는 인도시아닌 그린을 담지한 환원 그래핀 옥사이드-다공성 실리카 나노 복합체를 의미한다.
본 명세서의 FA-PEG-COOH는 나노 복합체를 엽산으로 개질 시키기 위한 엽산-폴리에틸렌글리콜-카르복실산 화합물을 의미한다.
예시적인 구현예들의 설명
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 광열 치료 및 광역학 치료를 위한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체로서, 그래핀 옥사이드; 다공성 실리카; 및 엽산을 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체를 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 다공성 실리카는 환원 그래핀 옥사이드 표면에 도입될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 엽산은 다공성 실리카 표면에 결합될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 나노 복합체의 크기는 145 내지 185 nm일 수 있고, 바람직하게는 150 내지 180 nm일 수 있으며, 더 바람직하게는 155 내지 175 nm일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 나노 복합체의 표면적은 275 내지 290 m2/g일 수 있고, 바람직하게는 280 내지 285 m2/g일 수 있으며, 더 바람직하게는 283 내지 284 m2/g일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 나노 복합체의 기공 부피는 1.0 내지 1.5 cm3/g일 수 있고, 바람직하게는 1.1 내지 1.4 cm3/g일 수 있으며, 더 바람직하게는 1.3 내지 1.4 cm3/g일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 나노 복합체에 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)을 더 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체를 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 인도시아닌 그린은 다공성 실리카의 기공에 담지될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 인도시아닌 그린은 나노 복합체 총 중량을 기준으로 15 내지 20 중량%으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 16 내지 19 중량%로 포함될 수 있으며, 더 바람직하게는 16.5 내지 18.5 중량%로 포함될 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 나노 복합체의 인도시아닌 그린 담지 효율은 수식 
을 이용하여 계산했을 때, 20 내지 25%일 수 있고, 바람직하게는 21 내지 24%일 수 있으며, 더 바람직하게는 22 내지 23%일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 인도시아닌 그린이 담지된 나노 복합체의 크기는 170 내지 215nm일 수 있고, 바람직하게는 175 내지 210nm 일 수 있으며, 더 바람직하게는 180 내지 205 nm일 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 나노 복합체에 근적외선을 조사할 때, 나노 복합체의 온도가 15 내지 25℃ 상승할 수 있다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 나노 복합체는 CT-26 세포를 표적하여 세포에 내재될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 광열 치료 및 광역학 치료를 위한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법으로서, 그래핀 옥사이드에 다공성 실리카층을 도입하여 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체를 제공하는 단계;
상기 그래핀 옥사이드 실리카를 환원시켜 환원 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체를 제공하는 단계; 및 상기 환원 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체에 엽산을 결합시키는 단계;를 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법을 제공한다.
예시적인 일 구현예에서, 상기 엽산을 결합시키는 단계는 나노 복합체 표면에 아미노기(-NH2)를 도입한 뒤, 엽산-폴리에틸렌글리콜-카복실산(FA-PEG-COOH)과 결합시켜 엽산을 도입하는 것일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 나노 복합체에 인도시아닌 그린을 담지시키는 단계를 더 포함하는 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법을 제공한다.
이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
[실시예]
환원 그래핀 옥사이드 다공성 실리카 나노 복합체의 제조
그래핀 옥사이드 (GO), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)와 수산화나트륨 (NaOH)을 넣고 교반한 뒤, 테트라에틸 오르토실리케이트 (tetraethyl orthosilicate, TEOS)를 첨가하여 GO-MSN을 합성한 뒤, 디이민(N2H2)을 이용하여 환원시켜서 rGO-MSN을 획득하였다. 그 후, (3-아미노프로필)트리에톡시실란 (3-Aminopropyl)triethoxysilane, APTES)을 이용하여 나노복합체 표면에 질산기 (-NH2)를 도입한 뒤, FA-PEG-COOH와 결합하여 rGO-MSN-PEG-FA를 합성하였다. 마지막으로 ICG를 로딩하여, ICG@rGO-MSN-PEG-FA를 획득하였다 (도 1).
나노 복합체의 물성 분석
투과 전자 현미경 (transmission electron microscopy, TEM)을 이용하여, rGO, rGO-MSN, rGO-MSN-PEG-FA, ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 형태와 크기를 분석하였다 (도 2A). 다공성 실리카 코팅이 없는 rGO는 매끄러운 표면을 가지고 있으며 기공을 확인할 수 없었다. 다공성 실리카를 도입한 뒤, TEM 이미지를 확인한 결과, 뚜렷하게 다공성 실리카가 형성된 165 ± 5.3 nm 크기의 rGO-MSN을 관측할 수 있었다. rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA는 rGO-MSN과 유사한 형상을 띄나, 나노 복합체의 크기는 PEG-FA와 ICG로 인해 191.7 ± 9.2nm로 상승하였다.
rGO-MSN 나노복합체의 원소 구성을 에너지 분산 X선 분광법(energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDS)을 이용하여 분석하였다 (도 2B 및 C). EDS mapping 이미지를 보게 되면 C, Si, O 원소가 중첩되어 있음을 보여주며, 이는 rGO-MSN에 실리카층이 구성되었음을 나타낸다.
동적광산란 입도분석기(dynamic light scattering, DLS)를 이용하여 rGO-MSN, rGO-MSN-PEG-FA, 및 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 크기를 측정하였다. rGO-MSN의 크기는 290nm로 측정되었으며, PEG-FA를 결합한 뒤, 크기가 344nm로 커진 것을 확인하였다. 마지막으로 ICG를 담지하고 나서 나노 복합체의 크기는 384nm로 증가하였다(도 2D). TEM 이미지와 크기 차이를 보이는 이유는 TEM 이미지로부터 제공된 rGO-MSN 복합체의 크기는 건조된 상태에서 측정된 반면에, DLS로 측정된 크기는 수상 용매에 분산된 상태로 크기를 측정하여, rGO-MSN 나노복합체와 이의 수화층의 크기가 포함되어 있다는 것에 유의해야 한다.
나노 복합체의 화학적 분석
GO-MSN의 화학적 결합을 확인하기 위해서 FT-IR 스펙트럼 분석을 수행하였다 (도 3A). GO-MSN의 스펙트럼을 보면 Si-O-Si 신축진동에 해당하는 955 및 1100cm-1가 확인되었다. GO-MSN의 환원 후에, OH 신축진동에 해당하는 3400cm-1의 피크가 감소하였다. 마지막으로 rGO-MSN-PEG-FA 스펙트럼에서 새로운 아미드 I과 아미드 II에 해당하는 피크가 1540 및 1650cm-1에서 발견되었다. 추가로 1350 및 1450cm-1에서 PEG의 특징적인 피크가 확인되었다. 그러나 FA는 PEG와 화학적 구조가 유사하여 FT-IR로 확인이 어렵다.
따라서, FA의 존재를 확인하기 위하여 rGO-MSN-PEG와 rGO-MSN-PEG-FA의 자외선-가시광선(UV-vis) 스펙트럼을 측정하였다(도 3D). rGO-MSN-PEG에서는 FA에 관련된 피크를 발견할 수 없었으나, rGO-MSN-PEG-FA의 스펙트럼에서는 FA의 특징적인 피크가 270nm에서 나오는 것을 확인할 수 있었다.
표면 개질을 평가하기 위해, rGO-MSN 나노 복합체의 제타 전위를 측정하였다(도 3B). GO-MSN의 제타 전위는 -33.6mV로 측정되었고, GO-MSN을 환원시킨 뒤는 rGO-MSN의 -16.5mV로 증가하였다. 표면의 OH기를 NH2기로 바꾸었을 때, 제타 전위는 +27.5mV로 역전되었고, PEG-FA로 결합한 뒤에 +22.2mV로 제타 전위가 약간 감소한 것이 관찰되었다. 마지막으로 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 제타 전위를 측정하였을 때, -23mV로 측정되었다. 이는 rGO-MSN-PEG-FA 내에 강한 음전하를 띄고 있는 ICG가 함유되어 있음을 의미한다.
나노 복합체의 다공성 분석
합성한 rGO-MSN 나노복합체의 표면적, 기공 부피, 기공 크기를 질소 흡-탈착 분석을 이용하여 측정하였다. 도 3C를 보면, 대조군으로 측정한 rGO에서는 질소의 흡-탈착을 확인할 수 없었으나, rGO-MSN에서는 높은 질소 흡-탈착 등온곡선을 통해, rGO-MSN이 다공성 구조로 되어 있었음이 확인되었으며, 표면적, 기공 부피 및 기공 크기는 각각 283.05m2/g, 1.33cm3/g, 및 3.8nm로 측정되었다.
나노 복합체의 인도시아닌 그린(ICG) 봉입 효율
rGO-MSN-PEG-FA 내에 ICG의 담지 여부를 확인하기 위해서, ICG, rGO-MSN-PEG-FA, ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 광학 특성을 자외선-가시광선 스펙트럼을 이용하여 측정하였다 (도3D). ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 스펙트럼을 보면 780nm에서 ICG의 특이적인 피크가 발견되었다. 이를 통해 rGO-MSN-PEG-FA 내에 ICG가 성공적으로 담지되었다는 것을 확인할 수 있었다.
ICG의 담지 효율(drug loading efficiency, DLE)과 봉입량(drug loading capacity, DLC)은 각각 다음과 같은 수식으로 계산하였다.
대조군인 rGO-PEG-FA에 ICG를 로딩하였을 때, 표 1과 같이, 봉입효율 및 봉입량은 각각 6중량% 및 7중량%로 계산되었다. 반면, rGO-MSN-PEG-FA의 봉입효율 및 봉입량은 각각 22중량% 및 17중량%로, 약 3.6배 및 2.5배 가량 상승한 것을 확인하였다.
이는 대조군인 rGO-PEG-FA는 π-π interaction으로 ICG가 내재화 되었으나, rGO-MSN-PEG-FA의 경우 rGO의 π-π interaction와 MSN의 hydrophobic interaction이 작용하여 ICG가 나노 복합체 안으로 담지되었기 때문에 rGO-MSN-PEG-FA가 rGO-PEG-FA보다 더 높은 ICG 담지 효율 및 봉입량을 가지고 있음을 확인할 수 있다.
나노 복합체의 광열 특성 분석
ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노복합체의 광열특성을 분석하기 전에 ICG의 유무에 의한 온도상승을 평가하였다. rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노복합체를 0.5 mg/mL의 농도로 분산시킨 뒤에 808nm 근적외선 레이저 (1.0W/㎠)를 10분간 조사하여 온도를 평가하였다(도 4A 및 B). rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 온도는 12.8℃와 22.0℃에 도달하였다. 이는 rGO-MSN-PEG-FA 뿐만 아니라 ICG도 근적외선에 노출되면 발열하기 때문에 순수한 rGO-MSN-PEG-FA보다 더 높은 광열효과를 가진다는 것을 의미한다. 추가로 이를 적외선 열화상 카메라로 측정하였을 때 역시 유사한 경향을 보였다.
다양한 농도의 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체 (0.25-1.0mg/mL)를 808nm 근적외선 레이저를 1.0 W/cm2의 세기로 10분 동안 조사하여 온도변화를 측정하였다(도 4C). 합성된 나노복합체는 15℃에서 25℃까지 온도가 농도 의존적으로 상승하는 것을 확인하였다.
마지막으로 근적외선 레이저에 대한 나노복합체의 안정성을 평가하기 위해서 10분 간격 근적외선 레이저를 인가하였다. 도 4D를 보면 사이클마다 43℃까지 균일하게 도달하는 것을 확인할 수 있다. 이 결과들은 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노복합체가 효과적으로 광열치료에 활용할 수 있음을 시사한다.
나노 복합체의 광역학 특성 분석
1,3-디페닐이소벤조푸란(1,3-Diphenylisobenzofuran, DPBF)는 활성산소와 반응하게 되면 구조가 변하는 특징을 가지고 있으므로 활성산소 감지 염료로 활용되고 있다. 이 특성을 이용하여, 808nm 근적외선 레이저에 노출된 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 활성산소 형성능력을 DPBF 분석을 이용하여 평가하였다 (도 5A 및 B). 100μg/mL의 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체에 5μg/mL의 DPBF 용액을 희석한 뒤에 근적외선 레이저를 조사하였다. 도 5A 및 B를 보면 DPBF와 rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체는 420nm에서의 흡광도의 변화가 없는 반면에 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체를 처리하였을 때, 레이저 조사시간이 증가할수록 420nm의 피크가 감소함을 확인할 수 있다. 이를 통해 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체가 광역학 치료에 적합함을 확인하였다.
나노 복합체의 세포 독성 평가
rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 NIH-3T3와 CT-26 세포에 대한 독성을 MTT assay를 통해 평가하였다. 도 6A 및 B를 보면 세포종류와 농도에 상관없이 90% 이상의 세포가 살아남아 있는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체가 NIH-3T3와 CT-26 세포에 대해서 우수한 생체적합성이 있음을 시사한다.
나노 복합체의 암세포 표적 능력 평가
나노 복합체의 암세포를 표적 능력을 평가하기 위해서 NIH-3T3와 CT-26 세포에 ICG@rGO-MSN-PEG와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA를 처리한 뒤 레이저 공초점 현미경으로 관찰하였다(도 7). NIH-3T3 세포에 나노 복합체를 처리하였을 때는 rGO-MSN-PEG, rGO-MSN-PEG-FA 모두 ICG의 적색 형광을 확인하지 못하였다. CT -26 세포의 경우 대조군인 rGO-MSN-PEG에서는 어떠한 적색 형광도 보이지 않았으나, rGO-MSN-PEG-FA에서는 ICG의 적색 형광이 확인되었다. 이러한 결과들은 rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체가 수용체 매개 세포 내 이입 (endocytosis) 기전을 통해 CT-26 세포로 내재화되었음을 입증한다.
나노 복합체의 활성산소 형성 평가
2',7'-디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트 (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFDA)는 세포 내에서 활성산소와 반응하여 초록색 형광을 내는 염료이다. 이를 이용하여 ICG@rGO-MSN-PEG-FA가 세포 내에서 활성산소를 형성할 수 있는지를 평가하였다.
도 8A를 보면, 근적외선에 노출되기 전에 ICG에 유무에 상관없이 녹색 형광이 확인되지 않았다. 또한, rGO-MSN-PEG-FA에 근적외선을 조사하였을 때도 녹색 형광은 보이지 않았다. 반면에 근적외선에 노출된 ICG@rGO-MSN-PEG-FA는 녹색 형광을 보였다. 추가로 획득한 형광 이미지를 Image J 소프트웨어를 이용하여 평균 형광 강도 (mean fluorescent intensity)를 측정하였다 (도 8B). 근적외선 조사전 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 형광이 거의 보이지 않았으나, 근적외선이 노출된 ICG@rGO-MSN-PEG-FA의 형광이 근적외선 노출 전보다 31배 이상인 것으로 나타났다. 이 결과를 통해, 근적외선에 노출된 ICG@rGO-MSN-PEG-FA가 CT-26 세포 안에서 활성산소를 형성할 수 있음을 입증하였다.
나노 복합체의 광열, 광역학 치료 특성 평가
ICG@rGO-MSN-PEG-FA 나노 복합체의 광열, 광역학 치료 특성을 평가하기 위해서, 다양한 농도의 rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA (20-140μg/mL)를 CT-26 세포에 처리한 뒤, 근적외선 레이저 (3.0 W/cm2, 5 min)를 조사하였다. 그리고 세포 생존율을 MTT assay를 이용하여 정량화 하였다. 광열 치료만 수행하였을 때 (rGO-MSN-PEG-FA), 약 50%의 암세포가 사멸한 것을 확인할 수 있었다. 광열 치료와 광역학 치료를 동시에 수행하였을 때 (ICG@rGO-MSN-PEG-FA), CT-26 세포가 7%만 살아남았다.
추가로, rGO-MSN 나노복합체의 광열, 광역학 치료 특성을 가시화하기 위해서 live/dead assay를 수행하였다. 근적외선을 조사하지 않았을 때, 모든 세포가 녹색 형광을 보였다. 이를 통해 rGO-MSN-PEG-FA와 ICG@rGO-MSN-PEG-FA가 독성이 거의 없음을 시사한다. 반면에 근적외선을 조사하였을 때, rGO-MSN-PEG-FA에서는 녹색 형광과 적색 형광이 동시에 보였다. 이는 광열효과로 인해 암세포가 일부만 사멸한 것을 의미한다. 마지막으로 ICG@rGO-MSN-PEG-FA에서는 모든 세포가 적색 형광을 띄는 것을 통해 전부 사멸하였음을 확인하였다. 이 결과들은 광열 및 광역학 치료가 동시에 가능한 ICG@rGO-MSN-PEG-FA가 광열 치료만이 가능한 rGO-MSN-PEG-FA보다 더 많은 세포를 사멸로 이끌 수 있음을 입증하였다.
Claims (17)
- 광열 치료 및 광역학 치료를 위한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체로서,
상기 나노 복합체는 환원 그래핀 옥사이드; 다공성 실리카; 및 엽산을 포함하는,
다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 다공성 실리카는 환원 그래핀 옥사이드 표면에 도입되는 것을 특징으로 하는,
다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 엽산은 다공성 실리카 표면에 결합된 것을 특징으로 하는,
다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 나노 복합체의 크기는 145 내지 185nm인 것을 특징으로 하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 나노 복합체의 표면적은 275 내지 290m2/g 인 것을 특징으로 하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 나노 복합체의 기공 부피는 1.0 내지 1.5cm3/g인 것을 특징으로 하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 나노 복합체의 기공 크기는 3.3 내지 4.3 nm인 것을 특징으로 하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 나노 복합체는 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)을 더 포함하는,
다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제8항에 있어서,
상기 인도시아닌 그린은 다공성 실리카 기공에 담지되는 것을 특징으로 하는,
다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제8항에 있어서,
상기 나노 복합체는 인도시아닌 그린을 나노 복합체 총 중량을 기준으로 15 내지 20 중량%로 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제8항에 있어서,
상기 나노 복합체의 인도시아닌 그린 담지 효율은 20 내지 25%이고,
상기 담지 효율은 수식
을 이용하여 계산된 것을 특징으로 하는,
다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제8항에 있어서,
상기 나노 복합체의 크기는 170 내지 215 nm인 것을 특징으로 하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제8항에 있어서,
상기 나노 복합체에 근적외선을 조사할 때, 15 내지 25℃의 온도가 상승하는 것을 특징으로 하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 나노 복합체는 CT-26세포를 표적하는 것을 특징으로 하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체. - 광열 치료 및 광역학 치료를 위한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법으로서,
상기 방법은 그래핀 옥사이드에 다공성 실리카층을 도입하여 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체를 제공하는 제1단계;
상기 그래핀 옥사이드 실리카를 환원시켜 환원 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체를 제공하는 제2단계; 및
상기 환원 그래핀 옥사이드 실리카 나노 복합체에 엽산을 결합시키는 제3단계;를 포함하는, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법. - 제15항에 있어서,
상기 나노 복합체에 인도시아닌 그린(indocyanine green, ICG)을 담지시키는 단계를 더 포함하는 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법. - 제15항에 있어서,
제3단계는 나노 복합체 표면에 아미노기(-NH2)를 도입한 뒤, 엽산-폴리에틸렌글리콜-카복실산(FA-PEG-COOH)과 결합시켜 엽산을 도입하는 것인, 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체의 제조 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020210134347A KR20230050952A (ko) | 2021-10-08 | 2021-10-08 | 광열 치료 및 광역학 치료가 가능한 암세포 표적 다공성 환원 그래핀 옥사이드 나노 복합체 및 이의 제조방법 |
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