KR20230049591A - 지질 나노 입자 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지질 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이온화 지질(ionizable lipid)과 폴리에틸렌글리콜 유도체 모이어티(PEG moiety)-분해가능 연결 작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트(conjugate)를 포함하는 입자로서, 생체내 부작용을 최소화하고, 나노 입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하여 약리 효능 물질을 세포질로 효율적으로 운반하는 것을 특징으로 한다.

Description

지질 나노 입자 및 그 제조방법{Lipid Nano-particles and Method of Preparing the Same}
본 발명은 지질 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 이온화 지질(ionizable lipid)과 폴리에틸렌글리콜 유도체 모이어티(PEG moiety)-분해가능 연결 작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트(conjugate)를 포함함으로써 생체내 부작용을 최소화하고, 나노 입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하여 약리 효능 물질을 세포질로 효율적으로 운반하는 지질 나노 입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
똑같은 약물이라도 전달하는 방법에 따라 효능은 천차만별 달라진다. 이처럼 의약품의 부작용을 최소화하면서 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달하는 투여 경로와 약의 형태를 약물전달시스템(DDS, Drug Delivery System)이라고 한다. 의약 제제 산업에 있어 약물전달시스템은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있으면서 성공 가능성이 큰 고부가가치 핵심기술이라고 할 수 있다.
약물전달시스템의 핵심기술 중 하나인 약물흡수 촉진 기술에 속하는 난용성 약물의 가용화 기술은 신약 물질의 개발비용을 줄이는 것과 함께 의약품의 부가가치를 높일 수 있는 가장 합리적인 방법으로 여겨지고 있다. 특히, 우리나라와 같이 신약개발 여건이 열악한 상황에서 약물의 가용화 기술의 개발을 통한 개량 신약의 개발은 적은 비용으로 막대한 부가가치를 창출할 수 있다.
최근, 다양한 약물전달시스템 중에서 유전자 약물전달시스템을 이용한 유전자 치료법 개발이 점차 확대되고 있는 추세이다. 유전자 치료법을 성공적이고 안전하게 수행하기 위해서는, 유전자 또는 유전자 조절 인자를 원하는 조직으로 전달하는 것이 중요하다. 이러한 유전자 또는 유전자 조절 인자로 대표적인 것이 mRNA와 siRNA 등을 들 수 있다. mRNA 등의 핵산은 특정 단백질을 발현시키는 기능을 수행하기 때문에 유전적 요인에 의하여 결핍된 단백질을 보완하는 역할이 가능하다. 뿐만 아니라, 암 표지자, 바이러스의 표면 단백질을 발현시키는 mRNA를 사용하게 되면 생체내의 면역 반응을 활성화하는 방식의 항암제 및 백신 등의 개발이 가능하다. 또한, siRNA 등의 핵산은 생체 내에서 특정 단백질의 발현을 억제할 수 있는 물질로, 암, 유전병, 감염질병, 자가면역 질환 등의 치료에 중요한 도구로 각광받고 있다. 그러나 mRNA, siRNA와 같은 핵산은 세포 내로 직접 전달하는 것이 어렵고, 혈액 내에서 효소에 의해 쉽게 분해되므로 이를 극복하기 위한 연구들이 많이 진행되고 있다.
양이온성 리포좀 또는 양이온성 폴리머 기반의 나노 입자의 특성과 한계.
이러한 물질들을 효과적으로 전달하기 위하여 양이온성 리포좀 및 중합체와 같은 비-바이러스성 유전자 담체가 개발되었고, 향상된 안정성 프로파일 및 중합체 전달체의 제조와 조작의 용이성으로 인하여 효과적이고 안전한 유전자 전달용 비독성 및 생분해성 중합체 담체의 디자인 및 합성에 대한 연구를 가속화시켰다. 폴리(L-라이신), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 스타버스트(starburst), 폴리아미도아민(polyamidoamine) 덴드리머 및 양이온성 리포좀 등은 음이온성의 올리고와 결합하여 자발적으로 자가 조립가능하고 플라스미드 DNA(pDNA)를 엔도사이토시스를 통해 세포로 진입시키기에 충분히 작은 구조로 압축할 수 있기 때문에 비-바이러스성 유전자 전달체로서 널리 연구되어 왔다.
하지만, 양이온성 리포좀 방식 또는 양이온성 폴리머를 사용하는 방식으로 제조된 나노 입자는 치료제로 개발하기에는 적합하지 않은 한계가 있다. 이 방식의 특징은 양이온의 리포좀 또는 폴리머를 음이온의 올리고와 혼합하여 정전기적 인력에 의한 밀집 방식으로 나노 입자를 제조하기 때문에, 안정적인 입자를 제조하기 위해서는 음이온 전하량 대비 과량의 양이온 물질을 사용하여야 한다. 동일한 몰비의 양이온과 음이온을 사용하면 나노 입자가 형성될 수 없기 때문에, 적게는 수 배에서 많게는 수 십배의 양이온을 과량으로 사용하게 된다. 따라서, 이러한 방식으로 제조된 나노 입자는 음이온과의 상호 작용에 의하여 중화되고 남은 양이온이 나노 입자에 여전히 과량으로 존재하기 때문에 생성된 나노 입자는 양이온 전하를 상시적으로 유지하게 된다. 그러나, 양성 전하를 띠는 나노 입자는 생체내에서 면역 세포를 포함한 다양한 세포들과의 불필요한 상호 작용을 하여 부작용을 유발하는 단점이 있다는 것은 널리 알려져 있기 때문에 이러한 나노 입자를 사용하여 치료제를 개발하는 것은 어려움이 있다.
이온화 지질을 사용하는 지질 나노 입자의 특성과 그의 제조 방법
최근, 이러한 양이온성 나노 입자의 단점을 극복하는 비-바이러스성 유전자 전달체로서 새로운 형태의 지질 나노 입자를 사용하여 효과적인 치료제가 개발되었다(비특허문헌 1-9). 지질 나노 입자는 생체 내에 존재하는 물질인 인지질과 콜레스테롤 등을 사용하기 때문에 생체 이용률 및 친화도가 높으며 약물의 방출 및 제어가 가능하며 효소 등에 의한 분해에 대해서 높은 안정성을 가지는 입자성 약물전달체이다. 특히, 이러한 지질 나노 입자가 기존의 양이온성 나노 입자와 구별되는 본질적인 차별점은 이온화 지질을 구성 성분으로 포함하는 것이라고 할 수 있다. 이온화 지질은 산성 pH에서는 양이온 상태이지만, 중성 pH에서는 전기적으로 중성 상태를 유지하는 특징이 있다. 따라서, 이온화 지질을 사용하여 제조된 나노 입자는 중성 pH 상태인 혈류에서 전기적으로 중성 상태이기 때문에 양이온성 폴리머 또는 양이온성 리포좀의 양이온 성질에 의해 발생하는 생체내의 부작용을 획기적으로 제거할 수 있다.
또 다른 차이점은 지질 나노 입자의 제조 방법에 있다. 보다 구체적으로 지질 나노 입자의 제조 방법을 기술하면 다음과 같다. 지질 나노 입자는 유기상에 용해된 지질 성분과 버퍼 수용액에 용해된 올리고를 혼합하는 방식으로 제조한다. 유기상과 수용액이 혼합되면서 용매의 극성이 변하기 때문에, 유기상에 포함된 지질 성분은 혼합 용액상에서 자발적으로 입자를 형성하게 된다. 이 때, 유기상에 포함된 이온화 지질이, 올리고를 포함한 산성 조건의 버퍼 수용액과 혼합되면, 이온화 지질이 양이온 상태로 전이되기 때문에 양이온의 이온화 지질과 음이온의 올리고가 정전기적 인력으로 결합하면서 올리고를 함입한 나노 입자를 형성하게 된다.
이온화 지질을 사용하는 지질 나노 입자의 또 다른 특징은 나노 입자를 제조할 때 나노 입자 응집 방지용 지질을 유기상에 포함시켜 제조한다는 것이다. 응집 방지용 지질은 지질 성분과 친수성의 물질이 결합된 형태의 분자 구조를 갖는다. 친수성 물질로는 탄수화물, 단백질 등의 생물학적 물질을 사용할 수 있고, 폴리올, PEG 등의 합성 물질을 사용할 수 있는데, 대표적으로는 PEG-지질 컨쥬게이트 형태의 물질로 사용한다. PEG-지질 컨쥬게이트 물질에서 지질 성분은 소수성이기 때문에 지질 나노 입자를 형성할 때 입자의 내부로 향하게 되고, PEG 부분은 친수성이기 때문에 지질 나노 입자의 표면에 위치하여 입자의 외부로 향하게 된다(비특허문헌 11-12). 만일 이 과정에서 나노 입자의 표면을 구성하는 PEG-지질 컨쥬게이트와 같은 입자 응집 방지용 지질을 구성 성분으로 포함시키지 않으면 나노 입자들이 서로 지속적으로 응집하는 현상이 발생한다. 따라서, 나노 입자를 비교적 균일한 크기로 제조하기가 매우 어렵고, 불균일한 나노 입자에 의한 효능 또한 기대하기 어렵다.
응집 방지용 지질의 친수성 물질로서 PEG를 대표적으로 사용하는 또 다른 이유는 지질 나노 입자의 표면을 구성하는 PEG가 지질 나노 입자의 생물학적 특성에도 영향을 미치기 때문이다. 일반적으로 나노 입자를 생체내에 주입하면 혈류내의 단백질, 지질, 면역 성분과의 흡착을 통한 대식세포의 식작용에 의한 손실 등의 단점을 가지고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 생체 친화성이 우수한 친수성 고분자인 PEG을 표면에 수식하여 이러한 단점을 극복할 수 있다는 것이 알려져 있다(미국등록특허 US 9,999,673 B2; 한국공개특허 10-2018-0032652, WO 2020/061284). PEG는 생체에 부작용이 없으며 쉽게 지질 나노 입자 및 그 밖에 약물 전달체에 적용하기가 용이하여 가장 대표적으로 사용된다(비특허문헌 10).
PEG-지질 컨쥬게이트 사용의 단점과 기존 해결 방안의 한계점
PEG는 지질 나노 입자의 제조 과정상 필수적으로 필요한 구성 성분임과 동시에 생체내에서 나노 입자가 다른 물질과의 비특이적 상호 작용을 억제함으로써 많은 부작용을 경감시킬 수 있는 뚜렷한 장점에도 불구하고, 근본적인 한계를 가지고 있다. PEG가 생체내에서 나노 입자와 다른 생체 구성 물질과의 비특이적 상호 작용을 감소시킨다는 것은, 결국 나노 입자와 타겟 세포와의 상호 작용도 억제되는 결과를 초래한다. 따라서, PEG는 나노 입자를 타겟 세포 안으로 전달하는 것을 어렵게 하고, 이러한 결과로 약리 효율도 현저히 떨어뜨리게 된다(비특허문헌 13-15).
PEG가 나노 입자와 타겟 세포의 상호 작용을 억제하기 때문에, 이를 해결하기 위하여 두 가지 방법이 고안되었다. 하나는, 나노 입자가 생체내에 주입된 이후에 PEG를 지질 나노 입자로부터 분리되도록 하는 방법이다. 일반적으로 PEG-지질 컨쥬게이트의 지질 성분은 두 가닥의 지방산으로 구성되는데, 지방산을 구성하는 탄소의 개수를 적게 하여 지방산의 소수성 성질을 감소시키면, 나노 입자가 생체 내에서 순환하는 동안 나노 입자로부터 PEG-지질 컨쥬게이트가 분리되어 쉽게 제거된다. 결과적으로 PEG에 의한 방해 효과가 제거되기 때문에 나노 입자의 효율을 유지할 수 있다. 만일, 지방산을 구성하는 탄소의 개수가 증가하게 되면, 나노 입자로부터 PEG-지질 컨쥬게이트가 제거되지 않아 효능이 감소하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 14-16). 하지만, 이러한 방식으로 나노 입자 구성 요소인 PEG-지질 컨쥬게이트를 제거하게 되면, 입자 자체가 불안정해지기 때문에 입자를 구성하는 다른 요소들도 유실되는 단점이 있다(비특허문헌 17).
PEG로 인하여 지질 나노 입자가 타겟 세포로 전달되는 효능이 저하되는 문제를 해결하기 위하여 사용할 수 있는 두 번째 방법으로 PEG의 한 쪽 말단에 세포 수용체와 결합할 수 있는 리간드를 연결하여 사용하는 것이다(비특허문헌 16). PEG 말단의 리간드가 특정 세포의 수용체와 결합하기 때문에 리간드를 포함하는 나노 입자는 수용체에 의하여 세포 내의 엔도좀으로 전달될 수 있다. 하지만, 리간드를 사용하여 나노 입자를 세포 내의 엔도좀까지 효과적으로 전달할 수 있다고 하더라도, 약리 효능을 발생시키기 위해서는 나노 입자에 포함되어 있는 약리 효능 물질인 핵산 등이 엔도좀으로부터 세포질 안으로 전달되어야 한다. 이를 위해서는 지질 나노 입자와 엔도좀 지질막과 상호 작용을 통한 융합 과정이 필요한데, 나노 입자 외부를 싸고 있는 PEG는 이러한 역할을 방해하게 된다. 결과적으로 PEG의 말단에 리간드를 부착하면, 타겟 세포의 엔도좀 안으로 나노 입자를 전달할 수는 있으나, 엔도좀으로부터 세포질로 효능 물질을 전달하기 어렵기 때문에 효능 개선 측면에 있어서 큰 효과를 보기 어렵다(비특허문헌 16).
PEG-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트의 이온화 지질 나노 입자에 적용
엔도좀 안에서의 PEG로 인한 효능 저하를 해결하기 위하여 통상적으로 엔도좀 안에서 지질 입자 표면을 싸고 있는 PEG를 제거하는 방법을 사용한다. 엔도좀 내부는 pH가 산성을 띠기 때문에 PEG를 지질 성분과 연결하는 부위에 산성 조건에서 가수분해 될 수 있는 작용기를 포함하도록 PEG-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트 형태의 물질을 구성 요소로 포함하는 것이다. 이렇게 하면 엔도좀 안에서 나노 입자의 표면을 구성하는 PEG가 효과적으로 제거될 수 있음이 알려져 있다(비특허문헌 18-19).
그러나, 산성 조건에서 분해되는 분해가능작용기를 포함하는 PEG-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트 형태의 물질을 구성 성분으로 사용할 수 있는 나노 입자의 제조 조건은 제한적일 수 밖에 없다. 왜냐하면, PEG-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트의 분해가능작용기는 산성 조건에서는 불안정하기 때문에, 나노 입자의 제조 조건이 중성 pH 또는 알칼리성 조건에서 제조하는 나노 입자에만 적용할 수 있기 때문이다. 그런데, 최근 다양한 올리고 기반 치료제 개발에 널리 사용하는 지질 나노 입자는 이온화 지질을 구성 성분으로 사용하고 있고, 전술한 바와 같이, 이온화 지질을 사용하여 올리고 성분을 포함하는 지질 나노 입자를 제조할 때는 반드시 산성 pH 에서 제조해야만 한다. 이러한 이유로 이온화 지질 성분을 포함하는 지질 나노 입자를 제조할 때, 산성 조건에서 가수 분해되는 작용기를 포함하는 형태, 즉 PEG-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 구성 성분으로 사용하는 것은 본질적으로 불가능한 것으로 간주되어 왔으며, 현재까지 시도되어 본 적이 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 이온화 지질 성분을 하나의 구성 성분으로 하는 지질 나노 입자를 제조할 때 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 사용하여 입자를 안정적으로 제조할 수 있음을 확인하였다. 특히, PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트는 지질 나노 입자를 제조하는 산성 조건의 공정에서는 안정적으로 유지되지만, 엔도좀의 산성 조건에서는 효과적으로 가수 분해되어 엔도좀 지질막과 지질 나노 입자의 융합을 촉진시키는 역할을 하고, 그 결과로서 올리고 전달 효율을 획기적으로 향상시키며, 이러한 지질 나노 입자를 제조하여 치료제로 사용할 경우, 나노 입자의 구성 성분으로 인한 생체내 부작용을 최소화하고, 나노 입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하며, 타겟 세포내의 엔도좀을 효율적으로 탈피하여 핵산 등의 약리 효능 물질을 세포질로 운반하기에 적합한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
미국등록특허 9,999,673 B2 한국공개특허 10-2018-0032652 국제공개특허 WO 2020/061284
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본 발명의 목적은 나노 입자의 구성 성분으로 인한 생체내 부작용을 최소화하고, 나노 입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하며, 타겟 세포내의 엔도좀을 탈피하여 핵산 등의 약리 효능 물질을 세포질로 효율적으로 운반하는 지질 나노 입자를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 이온화 지질 및 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능 작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물; 및 (b) 상기 지질 배합물 내에 봉입된 약물, 핵산 또는 이들의 조합을 포함하는 지질 나노 입자를 제공한다.
본 발명은, 또한 (a) 이온화 지질 및 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능 작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물을 함유하는 유기 용액과 약물, 핵산 또는 이의 조합을 함유하는 버퍼 용액을 혼합하여 pH를 조정하는 단계; 및 (b) 상기 혼합 용액의 용매를 제거하는 단계를 포함하는 상기 지질 나노 입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 지질 나노 입자를 이용한 치료제는 나노 입자의 구성 성분으로 인한 생체내 부작용을 최소화하고, 나노 입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하며, 타겟 세포내의 엔도좀을 탈피하여 핵산 등의 약리 효능 물질을 세포질로 효율적으로 운반할 수 있다.
본 발명에 따른 지질 나노 입자는 입자의 외부가 PEG로 코팅되어 있어 비특이적인 상호작용을 억제할 수 있다. 또한, PEG 말단에 리간드를 부착하여 표적 세포로만 전달할 수 있다. 리간드와 세포의 수용체에 의하여 엔도좀 안으로 포섭된 지질 나노 입자는 엔도좀 안에서 분해 가능 작용기가 분해되어 나노 입자 외부의 PEG가 제거되기 때문에 지질 나노 입자의 표면과 엔도좀 지질막의 상호작용을 증가시킬 수 있다. 또한, PEG를 연결하는 지방 성분에 상대적으로 길이가 긴 사슬의 지방산을 포함시킬 수 있기 때문에 지질 나노 입자에 구조적 안정성을 부과하여 세포에 처리하는 동안 입자가 안정적으로 유지될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG2K-Hz-DSG 또는 PEG2K-PE-DSG 를 나노 입자 구성 총지질 대비 1, 2, 5몰%를 포함하는 지질 나노 입자를 제조하여 DLS로 사이즈를 측정한 그래프(A) 및 이를 수치화된 그래프(B)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 지질 나노 입자에 루시퍼라제 (luciferase)를 타겟으로 하는 siRNA 포함시켜 제조하고, 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포에 처리하여 루시퍼라제 발현 억제 효능을 측정한 그래프이다. A는 PEG2K-Hz-DSG 또는 PEG2K-PE-DSG를, B는 PEG1K-Hz-DSG 또는 PEG1K-PE-DSG를 각각 1, 2, 5몰%를 포함하는 지질 나노 입자를 사용하였고, C는 PEG600-Hz-DSG를 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40몰%를 포함하는 지질 나노 입자를 사용하여 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 지질 나노 입자에 포함된 PEG 함량이 세포의 업테이크(uptake) 효율에 미치는 영향을 측정한 도면이다. A는 PEG-DMG 을 총 지질 대비 2, 5, 10 몰% 비율의 함량별로 포함한 지질 나노 입자를 사용하여 세포 업테이크 효율을 유세포 분석기(FACS)로 분석한 도면이고, B는 PEG-DMG 를 각각 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10몰%를 포함하는 나노 입자에 루시퍼라제(luciferase)를 타겟으로 하는 siRNA 포함시켜 제조하고, 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포에 처리하여 루시퍼라제 발현 억제 효능을 측정한 그래프이다. C, D 는 PEG-DMG 또는 PEG600-Hz-DSG를 각각 1, 2, 5, 10몰% 포함하는 지질 나노 입자를 제조하여 서로 다른 세포주에서 루시퍼라제 발현 억제 효능을 측정한 그래프이고, E, F 는 EC50 를 구한 자료이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG-DMG 1.5몰%(A) 또는 PEG600-Hz-DSG 10몰%(B)를 포함하는 지질 나노 입자의 크기를 산성 조건에서 시간별로 측정한 자료이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG600-Hz-DSG를 5 또는 10 몰% 포함하는 지질 나노 입자를 제조하여 pH 4 또는 7에서 전처리 후 세포주에 처리하여 루시퍼라제 발현 억제 효능을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 각각 PEG600-Hz-DSG, PEG600-Ester-DSG, 또는 PEG600-PhHz-DSG를 1, 2, 5, 10 몰% 포함하는 지질 나노 입자를 제조하여 세포주에 처리하고 루시퍼라제 발현 억제 효능을 측정한 그래프(A)와 해당 지질 나노 입자를 중성 또는 산성 조건에서의 크기를 측정한 자료이다(B).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG600-Hz-DSG 10몰% 또는 PEG-DMG 1.5몰%와 형광 염료를 포함하는 지질 나노 입자를 제조하여 해당 pH 조건에서 리포좀 지질막과의 융합 세기를 측정한 자료 (A)와 GalNAc-PEG600-Hz-DSG 또는 PEG-DMG를 5 또는 10 몰% 함유하는 지질 나노 입자를 사용하여 pH 4.5와 pH 7.4 조건에서 용혈 반응(hemolysis)을 측정한 자료(B)이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG-DMG를 총 지질 대비 각 1.5 몰%, 5 몰%를 포함하는 지질 나노 입자와 GalNAc-PEG2K-Hz-DSG 를 총 지질 대비 5 몰%를 포함하는 지질 나노 입자를 제조할 때 FRET 형광 염료를 포함하여 제조하고, 이를 랫트의 혈장에 담지하여 나노 입자에 포함된 형광 세기 변화를 시간별로 측정한 자료이다.
도 9는 GalNAc-PEG600-Hz-DSG를 10 몰% 포함하는 지질 나노 입자를 랫트에서 분리한 말초 혈액 단핵세포(PBMC)와 혼합하고 사이토킨(cytokine)의 상대적 발생량을 q-PCR로 분석한 자료이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG2K-PE-DSG 또는 PEG2K-Hz-DSG를 포함하는 지질 나노 입자를 마우스에 투여하여 혈청의 Factor7 의 함량을 측정한 자료이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG600-Hz-DSG 10몰% 또는 PEG600-Hz-DSG 9.5 몰%와 GalNAc-PEG2K-Hz-DSG 0.5 몰% 혼합 지질을 포함하는 지질 나노 입자를 마우스에 투여하여 혈청의 Factor7의 함량을 측정한 자료이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 PEG-DMG 또는 PEG-Hz-DSG 를 포함하는 지질 나노 입자를 각 세포주에 처리하고 세포주의 상대적 생존율을 측정한 자료이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 화학식 1의 폴리에틸렌글리콜 유도체 모이어티-분해 가능 작용기-지질과 이온화 지질을 구성 성분으로 포함하는 지질 나노 입자를 제조하여 치료제로 사용할 경우, 나노 입자의 구성 성분으로 인한 생체내 부작용을 최소화하고, 나노 입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하며, 타겟 세포내의 엔도좀을 효율적으로 탈피하여 핵산 등의 약리 효능 물질을 세포질로 운반하기에 적합한 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 이온화 지질 및 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능 작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물; 및 (b) 상기 지질 배합물 내에 봉입된 약물, 핵산 또는 이들의 조합을 포함하는 지질 나노 입자에 관한 것이다.
본 발명은, 다른 관점에서 본 발명은, 또한 (a) 이온화 지질 및 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능 작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물을 함유하는 유기 용액과 약물, 핵산 또는 이의 조합을 함유하는 버퍼 용액을 혼합하여 pH를 조정하는 단계; 및 (b) 상기 혼합 용액의 용매를 제거하는 단계를 포함하는 상기 지질 나노 입자의 제조방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본원에 사용되는 용어, '폴리에틸렌글리콜', 'PEG', 'PEG 모이어티' 및 'PEG 유도체'는 폴리에틸렌글리콜에 해당되는 작용기를 포함하는 것으로서, 서로 치환가능한 개념으로 사용될 수 있다. 본원에서 달리 표시되지 않거나 또는 문맥상 달리 명백히 모순되지 않는 한 모든 가능한 변형에서 전술된 요소의 조합이 포함된다.
본 발명에 의한 지질 나노 입자는 (a) 이온화 지질 및 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물; 및 (b) 상기 지질 배합물 내에 봉입된 약물, 핵산 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트는 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
화학식 1에서
a는 0 또는 1이고,
L은 타겟팅 리간드(targeting ligand)이며,
M은 H, OH, 단일결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이고,
P는 CH2O(CH2CH2O)qCH2 또는 CH2CH2O(CH2CH2O)qCH2이고, 여기서, q는 2~120의 정수이며,
L6은 C(O)NH-N=CR4, R4C=N-NHC(O), NH-N=CR4, R4C=N-NH, C(O)O, OC(O), OC(O)O, O-N=CR4, R4C=N-O, S-S, S 또는 trans-사이클로옥텐(trans-cyclooctene), 또는
Figure pat00002
이고, 여기서, R4는 H, C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐, C2-C20 알키닐, C3-C10 사이클로알킬, C6-C20 아릴 또는 불소, 산소, 황 및 질소 중에서 선택된 헤테로원자를 함유하는 라디칼인 헤테로사이클릭이고, Z는 NH, O 또는 S이고, d는 1~10의 정수이며, e는 1~10의 정수이고,
T는 단일결합 또는 1,4-C6H4O-이며,
R1 및 R3은 각각 독립적으로 -Y-R이고, R2는 -CH2-Y-R이며, 여기서, Y는 단일결합, O, S, C(O), C(O)O, OC(O), C(O)NH, 또는 NHC(O)이고, R은 H, C10~C20 알킬, 알케닐 또는 스테롤이다.
또한 본 발명은 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트의 한 쪽 말단에는 리간드를 포함할 수 있다.
상기 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트의 리간드(L)는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00003
화학식 2에서
a, b 및 c는 0 또는 1이되, a, b 및 c 중 하나 이상은 반드시 1이며,
X1, X2 및 X3는 타겟팅 리간드이고,
L1, L' 1 및 L" 1은 단일결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이며,
L2, L' 2 및 L" 2는 (CH2)n 또는 (OCH2CH2)m이고, 여기서, n은 1~20의 정수이고, m은 1~10의 정수이며,
L3, L' 3 및 L" 3은 단일결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이고,
L4, L' 4 및 L" 4는 (CH2)n 이고, 여기서, n은 1~20의 정수이며,
L5, L' 5 및 L" 5는 단일결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이다.
본 발명에 있어서, 상기 X1, X2, X3는 N-아세틸-D-갈락토사민(N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc), N-아세틸-D-갈락토스(N-acetyl-D-galactose), D-갈락토스(D-galactose), N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine), N-아세틸-D-글루코사민, D-글루코스, D-만노스, L-푸코스, 탄수화물 유도체, 엽산(folate), 트랜스페린(transferrin), RGD 펩티드, 사이클릭 RGD 펩티드, TAT 펩티드, R9 펩티드, CADY 펩티드, HA2 펩티드, 단일 클론 항체, 항원 결합 단편(antigen-binding fragment) 또는 항체 단편, 단일 사슬 가변 단편(single-chain variable fragment. scFv) 및 압타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 여기서, 항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, 리간드로 사용할 수 있는 항체의 예시로서 anti-CD3, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD33, anti-CD38, anti-CD54, anti-CD74, anti-CD138, anti-CD166, anti-CD209, anti-cMET, anti-EGFR, anti-HER2, anti-HIV-gp120, anti-HLA-DR, anti-transferrin receptor (TfRscFv) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG) 모이어티-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 바람직하게는 하기 화학식 3(PEG-Hz-lipid)으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00004
화학식 3에서 n 은 2~120의 정수이다.
본 발명에 있어서, 상기 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트는 바람직하게는 리간드-PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트(화학식 1에서 a가 1임)로서, 보다 바람직하게는 화학식 4(GalNAc-PEG-Hz-Lipid)로 표시될 수 있다.
[화학식 4]
Figure pat00005
화학식 4에서 n은 2~120의 정수이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티 조성으로 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트(화학식 1에서 a가 0임)와 리간드-PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트(화학식 1에서 a가 1임)의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 화학식 1에서 a가 0인 화합물과 a가 1인 화합물의 몰비는 (0.01~99.9):(0.01~99.9), 바람직하게는 (50~99.9):(0.01~50), 더욱 바람직하게는 (70~99):(1~30), 가장 바람직하게는 (90~95):(5~10)일 수 있다. 즉, 상기 리간드-PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트는 리간드-PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트와 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트 혼합물의 0.01-100 몰%, 바람직하게는 0.01-20 몰%, 더욱 바람직하게는 5~10몰%을 구성할 수 있다. 이 때, 리간드-PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트는 결합되는 리간드에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 실시예에 사용한 N-아세틸-D-갈락토사민(N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc)의 경우에는 그 양(5~10몰%)을 적게 포함시켜 사용하여도 지질 나노 입자의 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지질 나노 입자의 크기는 20~200 nm, 바람직하게는 30~200 nm일 수 있다.
본 발명에 의한 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트에서 PEG 모이어티의 구조적인 특징은 다음과 같다.
1. PEG 모이어티는 100 내지 5000의 분자량을 가지며, 단일 또는 가지 형태의 화학 구조를 갖는다. 상기 PEG 모이어티의 함량은 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질 성분의 0.5~50몰%, 바람직하게는 0.5~40몰%, 더욱 바람직하게는 0.5~30몰%일 수 있다. 상기 PEG 모이어티의 함량이 0.5몰% 미만일 경우에는 지질 나노 입자를 제조할 때 균일한 크기의 나노 입자를 얻기 어려운 점과 나노 입자를 구성하는 다른 지질 성분이 표면에 노출되어 비특이적인 상호 작용을 유발하기 쉬운 문제점이 있고, 50몰%를 초과할 경우에는 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트 성분이 지질 나노 입자에 포함되지 못하고 독립적인 미셀(micelle)을 형성하는 문제점이 있다. 또한, PEG 분자량과 지질 나노 입자 함유량은 서로 역의 상관 관계에 있다. 5000 부근의 큰 분자량의 PEG를 사용하는 경우 지질 나노 입자에 포함되는 함유량은 20 몰% 이하이지만, PEG 분자량이 100인 경우는 지질 나노 입자에 포함되는 함유량이 50 몰%까지 증가시키는 것이 가능하다. 분자량의 크기가 증가할수록 PEG에 의한 입체 방해 효과 (steric effect)에 의하여 균일한 지질 나노 입자를 형성하기가 어렵고, 또한 친수성인 PEG 부분이 소수성인 지질 부분보다 상대적으로 증가하기 때문에 지질 나노 입자와 결합하지 않고 독립적인 미셀을 형성하려는 경향이 강하기 때문이다.
2. 폴리에틸렌글리콜(PEG) 모이어티-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트의 일부 또는 전부를 PEG 모이어티의 한 쪽 말단에 세포의 수용체에 결합할 수 있는 리간드와 결합하여 사용할 수 있다. 리간드는 N-아세틸갈락토사민(acetylgalactosamine), 글루코스(glucose), 만노스(mannose), 푸코스(fucose) 등으로 구성된 당 또는 탄수화물 형태, RGD 등을 포함하는 펩타이드 형태, 폴레이트(folate) 등의 작은 분자 형태, 앱타머 등의 핵산 형태, 항체 또는 항원 인식 부분 항체 등의 단백질 형태 등으로 특정 세포에 발현되어 있는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 보다 구체적으로는 N-아세틸-D-갈락토사민(N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc), N-아세틸-D-갈락토스(N-acetyl-D-galactose), D-갈락토스(D-galactose), N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine), N-아세틸-D-글루코사민, D-글루코스, D-만노스, L-푸코스, 탄수화물 유도체, 엽산(folate), 트랜스페린(transferrin), RGD 펩티드, 사이클릭 RGD 펩티드, TAT 펩티드, R9 펩티드, CADY 펩티드, HA2 펩티드, 단일 클론 항체, 항원 결합 단편(antigen-binding fragment) 또는 항체 단편, 단일 사슬 가변 단편(single-chain variable fragment. scFv) 또는 압타머(aptamer) 등을 포함한다.
3. PEG 모이어티의 반대쪽 말단은 링커(linker)로 연결되는데, 링커는 특정 조건에서 분해되는 화학 작용기 또는 생물학적 가수분해 효소의 기질(substrate)을 포함한다. 예를 들면, -C(O)-NH-N=CR-, -RC=N-NH-C(O)-, -NH-N=CR-, -RC=N-NH-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-N=CR-, -RC=N-O-, -S-S-, -S- 또는 -trans-cyclooctene-을 포함한다. 여기서 R 은 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클릭 등이다.
4. 링커는 지방산 형태의 지질(lipid) 또는 스테롤 등의 소수성 물질과 연결되어 있다.
본 발명에 의한 지질 나노 입자의 구성 요소 중 이온화 지질은 지질 성분과 결합된 이온화 가능한 화합물로서, 약물(예를 들면, 음이온성 약물 및/또는 핵산)과의 정전기적 상호작용을 통하여 상기 약물이 지질 나노 입자 내에 높은 효율로 봉입되도록 하는 역할을 수행할 수 있다. 이온화 지질은 중성 pH 에서는 중성 전하를 띠고, 산성 pH 에서는 양전하를 띤다.
본 발명에 있어서, 상기 이온화 지질은 (6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-헤프타트리아콘타 6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA), [(4-히드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315), 8-[(2-히드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노]-옥탄산(SM-102), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일 카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLin-DAP), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레일 옥시) 프로필아민(DODMA), 지오크타데시르아미드그리시르카르보키시스페르민(DOGS), 스페르민코레스테리르카르바메이트(GL-67);비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤(BGTC), 3β-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일) 콜레스테롤(DC-Chol), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시데실) 아미노) 에틸)(2-하이드록시데실) 아미노) 에틸) 피페라진-1-일) 에틸아잔디일) 디도데칸-2-올(C12-200), N-t-부틸-N'-테트라데실 아미노-프로피온아미딘(디C14-아미딘);지메치르지오크타데시르안모니움브로미드(DDAB), N-(1,2-디미리스틸 옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 디올레일 옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DORIE), N-(1-(2,3-디올레일 옥실) 프로필)-N-2-(스페르민카르보키사미드)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-디올레오일 트리메틸암모늄 프로판 클로라이드(DOTAP), N-(1-(2,3-디올레일 옥시) 프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 아미노프로필-디메틸-비스(도데실옥시)-프로판 아미늄 브로마이드(GAP-DLRIE)로 구성된 군에서 1종 이상 선택될 수 있다.
바람직하게는 화학식 5 (DLin-MC3-DMA), 화학식 6 (ALC-0315) 또는 화학식 7 (Lipid H (SM-102))로 표시되는 화합물일 수 있다.
[화학식 5]
Figure pat00006
[화학식 6]
Figure pat00007
[화학식 7]
Figure pat00008
본 발명에 의한 지질 나노 입자는 스테롤 지질과 중성 지질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 지질 나노 입자의 구성요소 중 중성 지질은 지질 나노 입자 내에서 이온화 지질 및 약물이 상호작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행하며, 타겟 세포의 지질 이중층과 결합하여 약물의 세포내 전달시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출을 용이하게 한다. 본 발명에 의한 지질 나노 입자의 구성요소 중 상기 중성 지질은 지질 입자의 융합을 촉진할 수 있는 인지질 또는 스핑고지질(sphingolipids)이면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DSPC (distearoylphosphatidylcholine), POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine), EPC (egg phosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG (dioleoylphosphatidylglycerol), DPPG (dipalmitoylphosphatidylglycerol), DSPE (distearoylphosphatidylethanolamine), PE (Phosphatidylethanolamine), DPPE (dipalmitoylphosphatidylethanolamine), DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]), 세라미드(ceramide), 또는 스핑고마이얼린(sphingomyelin)일 수 있다.
본 발명에 의한 지질 나노 입자의 구성요소 중 스테롤 지질은 지질 나노 입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노 입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노 입자의 안정성을 향상시키는 역할을 하는데, 콜레스테롤, 콜레스테릴 에스터를 포함한 콜레스테롤 유도체를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥(single-stranded) siRNA, 이중 가닥(double-stranded) siRNA, rRNA, DNA, cDNA, 플라스미드(plasmid), 앱타머(aptamer), mRNA, tRNA, lncRNA, piRNA, circRNA, saRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, siRNA는 비알콜성 지방간염을 포함한 대사성 질환의 ACACA, ANGPTL3, AOC3, MAP3K5, CCR2, CCR5, DGAT2, DPP4, FASN, HSD17B13, KHK, LGALS3, LOXL2, METAP2, MPC, NOX1, NOX4, PNPLA3, SCD, SGLT1, SGLT2 등의 유전자, 바이러스 질환의 예로서 B형 간염 바이러스 (HBV) 의 HBV-S, HBV-P, HBV-X 등의 유전자, TTR-매개 아밀로이드증(TTR-mediated amyloisosis) 질환의 TTR 유전자, 급성 간 포피리아(Acute hepatic porphyrias) 질환의 ALAS1 유전자, 원발성 수산과잉뇨증(primary hyperoxaluria) 질환의 HAO1 유전자, 과콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 질환의 PCSK9 유전자, 혈우병(hemophilia)의 AT 유전자, 보체=매개 질환(complement-mediated disease)의 C5 유전자, Alpha-1 간 질환의 AAT 유전자, 고혈압의 AGT 유전자, Alpha-1 항트립신(antitrypsin) 결핍 질환의 AAT 유전자, 고중성지질혈증(hypertriglyceridemia) 질환의 APOC3 유전자, 고중성지질혈증(hypertriglyceridemia) 질환의 ANGPTL3 유전자, 심혈관 질환의 LA 유전자, 특발성 폐 섬유화증 질환의 HSP47 유전자, 원발성 수산과잉뇨증(primary hyperoxaluria) 질환의 LDHA 유전자, 기후성 및 켈로이드 반흔 질환의 CTGF, 암 질환의 CTNNB1, HSP90, KRAS, EPHA2, BCL2L12, PKN3, HIF-2alpha 유전자, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 질환의 alphaENaC 유전자 등을 타겟으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA는 항원을 발현하는 mRNA 사용하는 백신, 항체를 발현하는 mRNA 를 사용하는 면역 치료제, 유전자의 변이 등으로 인한 결핍 단백질을 발현하는 mRNA, 특정 DNA 유전자 편집을 위한 CRISPR 기술을 적용하는 Cas 단백질 및 가이드(guide) RNA를 발현하는 mRNA 및 sgRNA 등이 있다. 백신 개발을 위한 항원 발현 mRNA의 예시로서 광견병 백신을 위한 광견병 바이러스의 당단백질(glycoprotein) mRNA, 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytical virus) 백신의 당단백질(glycoprotein) mRNA, 안정화 융합전(stabilized prefusion) F 단백질 mRNA, 지카 바이러스 백신의 지카 바이러스 구조 단백질 mRNA, 치쿤군야 바이러스 백신의 바이러스 항원 단백질 mRNA, 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 백신의 페타머릭 바이러스 항체(petameric viral antigen), gB 단백질 mRNA, 인플루엔자(influenza) 백신의 HA 단백질 mRNA, HIV 백신의 T 세포 활성 발생을 위한 HIV 면역원(immunogen) 단백질 mRNA 등이 있다. 항암제 또는 항암 백신 개발을 위한 mRNA의 예시로서 환자 유래의 특정 과발현 단백질 항원을 발현하는 mRNA, 전립선 암의 PAP, PSA, PSCA, PSMA, STEAP1 등을 포함하는 항원 발현 mRNA, Renal cancer 의 MUC1, CEA, Her-2neu, 텔로머레이즈(telomerase), 서바이빈(surviving), MAGE-A1 mRNA, 흑생종의 Melan-A, 티로시나아제(tyrosinase), gp100, MAGE-A1, MAGE-A3, 서바이빈(surviving) mRNA, 그리고 다양한 고형암 또는 혈액암 백신 또는 치료제로서 IL-23, IL-36, IL-12, IL-15, GM-CSF, INF-alpha, IL-7, IL-2 등을 포함하는 싸이토카인 mRNA 등이 있다. 또, 항체를 발현하는 mRNA를 사용하여 생체 내에서 항체를 직접 발현하는 mRNA의 예시로서 치쿤군야 바이러스 중화 단일 클론(monoclonal) 항체를 발현하는 mRNA 등이 예시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 상기 지질 나노 입자는 (a) 이온화 지질 및 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능 작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물을 함유하는 유기 용액과 약물, 핵산 또는 이의 조합을 함유하는 버퍼 용액을 혼합하여 pH를 조정하는 단계; 및 (b) 상기 혼합 용액의 용매를 제거하는 단계를 수행함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 의한 지질 나노 입자는 유기상에 용해된 지질 성분과 버퍼 수용액에 용해된 올리고를 혼합하는 방식으로 제조할 수 있다. 유기상과 수용액이 혼합되면서 용매의 극성이 변하기 때문에, 유기상에 포함된 지질 성분은 혼합 용액상에서 자발적으로 입자를 형성하게 된다. 이 때, 유기상에 포함된 이온화 지질이, 올리고를 포함한 산성 조건의 버퍼 수용액과 혼합되면, 이온화 지질이 양이온 상태로 전이되기 때문에 양이온의 이온화 지질과 음이온의 올리고가 정전기적 인력으로 결합하면서 지질 나노 입자 내에 올리고를 봉입한 나노 입자를 형성하게 된다.
본 발명에 의한 지질 나노 입자의 제조방법에서 상기 유기 용액과 상기 버퍼 용액의 혼합비(부피비)는 1:1 내지 1~100 일 수 있다.
지질 나노 입자에 포함된 PEG 함량에 따른 효율
지질 나노 입자를 제조할 때 PEG-지질 컨쥬게이트 성분을 1 내지 2 몰% 비율로 포함시켜 제조하는 것이 일반적이다. PEG를 포함시키지 않고 지질 나노 입자를 제조하게 되면 생성되는 입자들끼리 서로 뭉치는 현상이 발생하기 때문에 이를 억제하기 위하여 일정양의 PEG-지질 컨쥬게이트 성분을 포함시켜 제조하여야 한다. 포함된 PEG-지질 컨쥬게이트의 지질 부분은 생성되는 나노 입자의 내부를 구성하는 소수성 환경에 배치되고, 친수성인 PEG 부분은 입자의 표면에 배치되어 나노 입자 간의 뭉침 현상을 억제하게 된다. 반면, PEG 함량이 과다하게 높은 나노 입자의 경우는 입자 표면에 노출된 PEG의 입체적(steric) 효과로 인하여 지질 나노 입자와 세포와의 상호작용 또한 억제하게 된다. 그 결과로서 지질 나노 입자는 세포 안으로 효과적으로 전달되지 못하는 부작용이 발생한다.
지질 나노 입자 제조에 통상적으로 많이 사용되는 PEG-지질 컨쥬게이트인 PEG-DMG (1,2-dimyristoyl-3-PEG-glycerol)를 사용하여 지질 나노 입자를 제조하면, PEG 함량이 증가할 경우 세포로 업테이크(uptake)되는 효율이 감소하고 siRNA에 의한 mRNA 분해 능력도 저하된다. 그러나 본 발명에 의한 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트의 일부 또는 전부는 특정 세포에 발현된 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드를 PEG의 한 쪽 말단에 포함하고 있기 때문에, 본 발명에 의한 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트를사용하여 제조된 지질 나노 입자는 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트의함유량과 상관없이 세포의 업테이크 효율이 높은 것을 확인할 수 있다. 즉, PEG의 입체적 효과에 의한 세포 업테이크 저해를 리간드를 사용하여 극복할 수 있음을 알 수 있다.
지질 나노 입자의 PEG 제거 확인
지질 나노 입자가 핵산 등의 효능 물질을 세포 안으로 전달하여 효능을 발생시키기 위해서는 두 단계의 전달 과정을 거쳐야 한다. 첫째로 지질 나노 입자가 세포의 업테이크 과정을 통하여 세포의 엔도좀으로 진입하여야 한다. 두 번째 단계에서 효능 물질을 효과적으로 엔도좀에서 탈출 시켜 세포질로 전달하는 것이 필수적이다. 지질 나노 입자는 세포와의 상호작용으로 인하여 세포의 엔도좀에 포섭되고, 지질 나노 입자의 지질 성분이 엔도좀을 구성하는 지질막과 융합을 진행함과 동시에 효능 물질을 세포질로 전달할 수 있다는 것은 널리 알려진 사실이다. 그런데, 지질 나노 입자 표면이 PEG로 싸여 있으면, 엔도좀 지질막과의 상호작용이 억제되어 세포질로의 전달이 어렵게 된다. 따라서, 지질 나노 입자 표면의 PEG는 세포와의 상호작용을 저해하여 지질 나노 입자의 세포 업테이크 효율을 떨어뜨릴 뿐만 아니라, 엔도좀에 성공적으로 포섭된 나노 입자와 엔도좀 지질막 사이의 상호작용 또한 방해하는 요소로 작용하기 때문에, 나노 입자의 효율 측면에서 보자면 PEG는 입자의 효율을 이중으로 저해하는 역할을 하게 된다.
따라서, 엔도좀 지질막과 지질 나노 입자의 효과적인 상호작용을 위하여 엔도좀 안에서 PEG를 제거하는 것이 유리하다. 하지만, 통상적으로 많이 사용하는 PEG-DMG 와 같은 PEG-지질 컨쥬게이트를 사용하는 나노 입자는 PEG 를 제거할 수 있는 작용기가 없기 때문에 엔도좀 내에서도 PEG가 입자 표면에 여전히 존재하게 된다. 반면, 본 발명에서 서술하는 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트는 PEG와 지질 사이에 산성 조건에서 가수분해 되는 화학적 작용기를 포함하고 있다. 예를 들어, 화학식 3에 제시된 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트는 두 가닥의 지질과 PEG가 히드라존(hydrazone) 작용기(-C=NNH-)로 연결되어 있다. 히드라존 작용기는 중성 pH에서는 안정적이지만 산성 조건에서는 가수분해되는 성질이 있다. 본 발명에 의한 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트를 사용하여 제조한 지질 나노 입자의 크기를 산성 조건에서 시계열 변화를 관찰하면, 히드라존 작용기가 가수분해되면서 입자 표면의 PEG가 제거되고, 입자들을 구성하는 지질 성분들의 융합 현상으로 크기가 점차 증가되는 것을 알 수 있다. 또한, 시간의 경과에 따라 입자들 간의 융합 현상은 지속적으로 진행되어 크기가 점점 증가하는 것을 알 수 있다. 이것은 산성 조건에서 히드라존 작용기가 성공적으로 가수분해되어 입자들 사이의 융합을 촉발하는 현상이며, 이는 또한 엔도좀 지질막과 나노 입자 간의 융합을 원활하게 유인하는 요인으로도 작용한다.
지질 나노 입자의 용혈 반응(hemolysis) 유발
지질 나노 입자와 엔도좀 지질막의 상호작용을 평가하기 위한 방법으로 나노 입자를 적혈구와 접촉시켜 적혈구가 파괴되는 정도, 즉 용혈되는 정도를 측정하는 방법은 잘 알려져 있다. 여기서 적혈구 세포막은 엔도좀의 지질막 대용으로 간주된다. 용혈 현상이 많이 발생하는 것은 지질 나노 입자가 보다 효율적으로 엔도좀 지질막과 융합하는 것으로 해석할 수 있다.
지질 나노 입자의 구성 성분 중 하나인 이온화 지질(ionizable lipid)은 엔도좀 지질막과의 상호작용에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이온화 지질은 중성 pH에서는 전하를 띠지 않고, 엔도좀 내의 환경인 산성 조건에서는 양전하를 띠도록 아민기(amine group)를 포함하는 경우가 많은데, 아민기의 최적 pKa는 5 내지 7 미만 정도가 적당한 것으로 알려져 있다. 따라서, 지질 나노 입자가 엔도좀 지질막과 융합하는 정도를 알기 위해서 아민기의 pKa보다 낮은 pH 조건에서 적혈구와 나노 입자를 혼합하고 용혈 반응을 측정하여 평가한다. 본 실시예에 사용된 이온화 지질은 DLin-MC3-DMA인데, 이 물질의 아민기 pKa는 대략 6.5로서 pH 4 조건에서는 아민기가 양전하를 띠게 된다. 양전하는 엔도좀의 지질막의 음전하와 정전기적 인력에 의하여 보다 수월하게 융합이 진행될 수 있게 도와준다. 그러나, 나노 입자의 표면에 PEG가 분포하게 되면, 정전기적 인력을 PEG가 약화시키는 가림 효과를 발생시킬 뿐만 아니라, 나노 입자의 표면과 엔도좀의 지질막의 직접적인 접촉 또한 방해하는 효과가 있다.
따라서, 분해 가능 작용기를 포함하지 않는 일반적인 PEG-DMG를 구성 성분으로 포함하는 지질 나노 입자는 PEG의 함량이 증가할수록 용혈 반응이 억제되는 반면에 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트는 산성 조건에서 가수분해를 통하여 PEG가 제거되기 때문에 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트를 구성 성분으로 포함하는 지질 나노 입자는 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트의 함량과 상관없이 용혈 반응을 효과적으로 유발한다.
PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트를 구성하는 지질의 길이와 지질 나노 입자의 구조적 안정성 관계
지질 나노 입자 표면을 둘러 싸고 있는 PEG는 지질 나노 입자 제조 과정에서는 필요하지만 약리적 효능 측면에서는 불리하게 작용한다. 따라서, 지질 나노 입자가 생체 내에서 혈류를 타고 순환하는 동안 PEG가 지질 나노 입자로부터의 자발적으로 제거되기 쉽도록 PEG에 연결된 지질은 일반적으로 탄소수가 14개로 구성된 미리스틱산(myristate) 등을 사용한다. 지질 부분의 탄소수가 적을수록 지질 나노 입자를 구성하는 다른 지질 성분들과의 상호 작용 크기를 줄일 수 있기 때문에, 생체 내에서 비교적 수월하게 지질 나노 입자로부터 PEG-지질 컨쥬게이트가 분리되어 제거되기 때문이다. 팔미틱산(palmitate, 탄소수 16개), 스테아릭산(stearate, 탄소수 18개) 등으로 지방산의 길이가 상대적으로 긴 물질을 사용하여 제조된 지질 나노 입자는 혈류를 통한 순환 과정에서 PEG 제거가 원활하지 않아 세포의 엔도좀 진입이 어렵고, 따라서 효능이 저하된다.
하지만, 이와 같이 순환 과정 중에 PEG 제거하는 방식은 지질 나노 입자의 구조적 안정성 측면을 고려하면 매우 불안정한 요소로 작용한다. 지질 나노 입자로부터 PEG--지질이 분리되어 제거되기 시작하면, 입자 자체의 안정성 저하로 인하여 지질 나노 입자를 구성하고 있는 다른 지질 성분들 또한 유실되기 시작하기 때문이다. 지질 나노 입자가 적절한 효율을 가지기 위해서 PEG를 제거하는 것이 필수적이지만, 이와 같이 지방 길이가 짧은 PEG를 사용하여 제조된 지질 나노 입자는 입자의 안정성이 취약하게 된다.
반면, 본 발명에서 서술하는 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트는 산성 조건에서 PEG 를 제거하는 분해 가능 작용기를 포함하고 있기 때문에, 상대적으로 긴 탄화 수소, 예를 들면 탄소수 18개로 구성된 지질을 사용할 수 있다. 분해 작용기가 분해될 수 있는 엔도좀의 산성 조건에 도달하기 전까지는 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트가 나노 입자의 구성 성분으로 남아있기 때문에 혈류를 통한 순환 과정 속에서 입자의 안정성을 유지할 수 있다.
지질 나노 입자의 면역 반응 유발
지질 나노 입자를 구성하는 이온화 지질(ionizable lipid)은 면역 세포를 자극하여 면역 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 지질 나노 입자의 PEG 함량을 증가시키면 면역 세포와 지질 나노 입자 사이의 직접적인 상호작용을 억제하여 지질 성분에 의한 면역 부작용을 최소화시킬 수 있다. 하지만, PEG 함량 증가는 필연적으로 세포에 의한 나노 입자의 업테이크 효율과 세포 내의 엔도좀 탈출을 심각하게 저해하는 효과가 있기 때문에 PEG 함량을 필요 최소량 이상으로 증가시키기 어렵다.
그러나 본 발명의 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 포함하는 지질 나노 입자는 리간드를 사용하여 세포 업테이크 효율을 증가시킬 수 있고, 엔도좀 안에서의 PEG를 제거할 수 있는 분해 가능 작용기를 포함하고 있다. 따라서, 본 발명에서 제시하는 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 사용하게 되면, PEG 함량을 증가시켜도 제조된 지질 나노 입자는 효능이 저하되지 않으며, 동시에 면역 반응 유발을 억제할 수 있다. 따라서, PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 사용한 지질 나노 입자를 말초 혈액 단핵세포(PBMC)와 혼합하여 지질 나노 입자가 사이토킨(cytokine)을 유발하는 정도를 측정하면, 음성 대조군으로 사용한 PBS 완충용액 처리군과 유사한 수준임을 알 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 폴리에틸렌글리콜(PEG) 모이어티-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트의 합성
실시예 1-1: 2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에탄올
Figure pat00009
2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에탄올(2.00 g, 11.86 mmol) 수용액(40mL) 에 소디움 아자이드(1.54 g, 23.72 mmol)를 첨가하고 90 ℃에서 18시간 교반하였다. 반응물을 디클로로메탄으로 3회 추출하고 황산 마그네슘 및 감압 건조하여 화합물(2.22 g)을 98.5% 수득율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.75-3.70 (m, 2H), 3.69-3.65 (m, 6H), 3.63-3.59 (m, 2H), 3.42-3.36 (m, 2H), 2.31 (s, 1H).
실시예 1-2: 2-메틸-3,4,5-트리-O-아세틸-1,2-데옥시-알파-D-갈락토피라노[2,1,d]-2-옥사졸린
Figure pat00010
DCE (22 mL)에 녹인 과아세틸화갈락토사민(400 mg, 1.03 mmol) 용액에 트리메틸시릴트리플루오로메탄설폰산 염(0.2 mL, 1.13 mmol)을 상온에서 첨가 시킨 뒤 50℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 반응 온도를 상온으로 낮추고 트리에틸아민을 천천히 첨가시킨 뒤 15분 동안 교반시켰다. 반응이 종결된 후 물과 CH2Cl2을 가하여 추출한 유기용매층을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 감압 증류하였다. 감압 증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2: MeOH = 40:1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물(260 mg, 0.77 mmol)을 78% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.99 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.46 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 4.90 (dd, J = 7.5, 3.3 Hz, 1H), 4.26-4.08 (m, 3H), 3.99 (m, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.05 (d, J = 1.2 Hz, 3H).
실시예 1-3: 5-아세트아미노-2-(아세톡시메틸)-6-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-파이란-3,4-다이일다이아세테이트
Figure pat00011
DCE(7.2 mL)에 녹인 2-메틸-3,4,5-트리-O-아세틸-1,2-데옥시-알파-D-갈락토피라노[2,1,d]-2-옥사졸린(390 mg, 1.18 mmol)과 2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에탄올(228 mg, 1.30 mmol) 혼합 용액에 4 Å 분자체(190 mg) 넣어주고 5분 교반시켰다. 트리메틸시릴트리플루오로메탄설폰산 염(104 μL, 0.59 mmol)을 상온에서 첨가 시킨 뒤 16시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결된 후 여과하여 4 Å 분자체를 제거하고, 물과 CH2Cl2을 가하여 추출한 유기용매층을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 감압 증류하였다. 감압 증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(EA:MeOH = 9:1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물(460 mg, 0.91 mmol)을 77% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.14 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.32 (dd, J = 3.4, 1.1 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.22 (dt, J = 11.2, 8.9 Hz, 1H), 4.19-4.10 (m, 2H), 3.93-3.83 (m, 3H), 3.76-3.65 (m, 4H), 3.63 (dd, J = 7.1, 3.2 Hz, 4H), 3.51-3.39 (m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.98 (s, 3H).
실시예 1-4: 2-(2-(2-아미노에톡시)에톡시)에틸 2-아세트아미노-3,4,6-트리-O-아세틸-2-디옥시-α-D-갈락토피라노사이드
Figure pat00012
THF (10 mL)에 녹인 5-아세트아미노-2-(아세톡시메틸)-6-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-파이란-3,4-다이일다이아세테이트(240 mg, 0.476 mmol) 용액에 PPh3 (150 mg, 0.571 mmol)을 상온에서 첨가 시킨 뒤 48시간 동안 교반시켰다. H2O (26 μL, 1.427mmol)을 첨가시킨 뒤 24시간 동안 교반시켰다. 그 후 톨루엔(10mL)를 첨가하고 트리플루오로아세트산(73 μL, 0.951 mmol)를 첨가하여 염을 생성하였다. 물과 CH2Cl2을 가하여 추출한 물층을 감압 증류하여 원하는 화합물(270 mg, 0.91 mmol)을 98% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.35 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 11.2, 3.2 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.16-3.96 (m, 4H), 3.64-3.74 (m, 10H), 3.24 (m, 2H), 2.14 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.94 (s, 3H).
실시예 1-5: 트리스{[2-(터셔리부톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸아민
Figure pat00013
DMSO (2.0 mL)에 녹인 트리스(1.21 g, 10.00 mmol) 용액에 5.0 M 수산화나트륨(0.2 mL)를 15 ℃에서 첨가시킨 뒤 5분 동안 교반시켰다. Tert-부틸 아크릴레이트 (5.0 mL, 34 mmol)을 천천히 적가시켰다. 그후 물(0.2 mL)를 첨가한 뒤 아르곤 하 상온에서 24시간동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 감압증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(EA : Hex = 2 : 1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물(2.5 g, 5.00 mmol)을 50% 수득률로 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 3.65 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 3.32 (s, 6H), 2.46 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 1.45 (s, 27H).
실시예 1-6: (R)-((2,3-bis(옥타데실록시)프로폭시)메틸)벤젠
Figure pat00014
Toluene (2.5 mL)에 녹인 (R)-3-벤질록시-1,2-프로판디올 (106 mg, 0.55 mmol) 용액에 1-브로모옥타데케인 (732 mg, 2.20 mmol), 수산화칼륨(123 mg, 2.20 mmol)을 상온에서 첨가 시킨 뒤 110 ℃에서 24시간 동안 환류시켰다. 반응이 종결된 후 물과 CH2Cl2을 가하여 추출한 유기용매층을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 감압 증류하였다. 감압 증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(Hex : EA = 10 : 1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물(300 mg, 0.44 mmol)을 80% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.32-7.21 (m, 5H), 4.55 (s, 2H), 3.64-3.48 (m, 7H), 3.43 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.61-1.51 (m, 4H), 1.39-1.21 (m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 1-7. (S)-2,3-bis(옥타데실록시)프로판-1-올
Figure pat00015
CH2Cl2 (4 mL)에 (R)-((2,3-bis(옥타데실록시)프로폭시)메틸)벤젠(50 mg, 0.07 mmol)을 용해시킨 후 Pd/C(10 mg)를 적가시켰다. 수소 하 상온에서 20시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 셀라이트 545를 사용하여 에틸 아세테이트 용매로 여과한 후 감압 증류하여 원하는 화합물(40 mg, 0.07 mmol)을 92% 수득률로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 3.75-3.37 (m, 9H), 2.17 (m, 1H), 1.55 (m, 4H), 1.38-1.21 (m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 1-8: (R)-2,3-bis(옥타데실록시)프로판알
Figure pat00016
CH2Cl2 (3.7 mL)에 녹인 데스-마틴 페리오디난 (88 mg, 0.206 mmol)용액을 CH2Cl2 (1.3 mL)에 녹인 (S)-2,3-bis(옥타데실록시)프로판-1-올(110 mg, 0.184 mmol)용액에 0 ℃에서 천천히 적가 시킨 뒤 상온에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결된 후 물과 CH2Cl2, 탄산수소나트륨수용액을 가하여 추출한 유기용매층을 물과 CH2Cl2, 싸이오황산나트륨을 가하여 추출한 유기용매층을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 감압 증류하였다. 감압 증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(Hex : EA = 20 : 1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물(83 mg, 0.15 mmol)을 80% 수득률로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 3.81-3.37 (m, 9H), 1.65-1.51 (m, 4H), 1.38-1.21 (m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 1-9: 3,6-다이옥소-1-페닐-2,8,11,14-테트라옥사-4,5- 다이아자헥사데칸 -16-오익 엑시드 Mn = 600
Figure pat00017
DMF (5.8 mL)에 폴리(에틸렌 글리콜)비스 카복시메틸)에테르(1g, 1.72 mmol)를 용해시킨 후, 0 ℃에서 CbzNHNH2 (300 mg, 1.81 mmol), 하이드록시벤조트리아졸(244 mg, 1.81 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(320 μL, 1.81 mmol)를 적가시켰다. 아르곤 하 상온에서 18시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 물과 CH2Cl2, 탄산수소나트륨수용액을 가하여 물층으로 추출한 뒤 다시 물과 CH2Cl2, H3PO4 를 가하여 추출한 유기층을 감압증류하여 얻어진 생성물을 40% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.10 (s, 2H), 3.73-3.60 (m, 70H).
실시예 1-10: 1-벤질 21-(tert-부틸) 16,16-bis((3-(tert-부톡시)-3옥소프로폭시)메틸)-4,14-다이옥소-6,9,12,18-테트라옥사-2,3,15-트리아자헤니코산디오에이트 M n = 600
Figure pat00018
DMF (4 mL)에 3,6-다이옥소-1-페닐-2,8,11,14-테트라옥사-4,5-다이아카헥사디칸-16-오익 엑시드 혼합물(870mg, 1.16 mmol), 트리스{[2-(터셔리부톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸아민(526 mg, 1.04 mmol)을 용해시킨 후, 0 ℃에서 하이드록시벤조트리아졸(157 mg, 1.16 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(248 μL, 1.40 mmol), 디아이소프로필에틸아민(243 μL, 1.40 mmol)를 적가시켰다. 아르곤 하 상온에서 18시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 물과 CH2Cl2, 인산을 가하여 유기용매층을 추출하였다. 추출한 유기용매층에 물과 CH2Cl2, 탄산수소나트륨수용액을 가하여 추출한 유기용매층을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 감압 증류하였다. 감압 증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 : MeOH = 15 : 1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물을 40% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz; CD3OD) δ 7.38-7.31 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.30-4.13 (m, 3H), 4.13 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.77-3.60 (m, 70H), 2.46 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 1.46 (s, 27H).
실시예 1-11: 18,18-bis((2-카복시에톡시)메틸)-3,6,16-트리옥소-1-2,8,11,14,20-펜타옥사-4,5,17-트리아카트리코산-23-오익 엑시드 M n = 600
Figure pat00019
1-벤질 21-(tert-부틸) 16,16-bis((3-(tert-부톡시)-3옥소프로폭시)메틸)-4,14-다이옥소-6,9,12,18-테트라옥사-2,3,15-트리아자헤니코산디오에이트 Mn = 600 (570mg, 0.46 mmol)를 85% 포름 산 (4.0 mL)에 녹이고 상온에서 18시간 교반시켰다. 반응이 종결된 후, 50 ℃에서 감압 증류하여 원하는 화합물을 99% 수득률로 얻었다.
1H NMR (CD3OD) δ 7.38-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.30-4.17 (m, 3H), 4.13 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.78-3.63 (m, 70H), 2.53 (t, J = 6.0 Hz, 6H).
실시예 1-12: 트리-아세틸갈낙-PEG600-Cbz히드라자이드
Figure pat00020
DMF (4.4 mL)에 18,18-bis((2-카복시에톡시)메틸)-3,6,16-트리옥소-1-2,8,11,14,20-펜타옥사-4,5,17- 트리아자트리코산-23-오익 엑시드, 트리스{[2-(터셔리부톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸아민(1.58 mmol)을 용해시킨 후, 0 ℃에서 하이드록시벤조트리아졸(214 mg, 1.58 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(280 μL, 1.58 mmol), 디아이소프로필에틸아민(550 μL, 3.16 mmol)를 적가시켰다. 아르곤 하 상온에서 18시간 동안 교반 시켜 주었다. 추가적으로 아르곤 하 상온에서 디아이소프로필에틸아민(550 μL, 3.16 mmol)를 적가 시키고 상온에서 24시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 물, CH2Cl2, 인산을 가하여 유기용매층을 추출하였다. 추출한 유기용매층을 물과 CH2Cl2, 탄산수소나트륨수용액을 가하여 유기용매층을 추출한 뒤 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 감압 증류하였다. 잔류 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 : MeOH = 10 : 1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물을 23% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.31 (m, 5H), 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 3H), 5.16 (s, 2H), 4.64 (t, J = 8.5 Hz, 3H), 4.16-4.02 (m, 16H), 3.95-3.91 (m, 6H), 3.77-3.61 (m, 106H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 3.38 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 2.45 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 2.14 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.93 (s, 9H).
실시예 1-13: 트리-아세틸갈낙-PEG600-히드라자이드
Figure pat00021
MeOH (2 mL)에 트리-아세틸갈낙-PEG600-Cbz히드라자이드(373mg, 0.16 mmol)을 용해시킨 후 Pd/C(13 mg), 아세트산(28 μL, 0.48 mmol)를 적가시켰다. 수소 하 상온에서 20시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 셀라이트 545를 사용하여 메탄올 용매로 여과한 후 감압 증류하여 원하는 화합물(120 mg, 0.05 mmol)을 99% 수득률로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.94 (s, 9H), 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 3H), 4.64 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.17-3.91 (m, 16H), 3.77-3.61 (m, 106H), 3.56 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 3.39 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 2.46 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.94 (s, 9H).
실시예 1-14: 디옥타데실옥시-프로필리덴 트리-아세틸갈낙-PEG600-아실히드라존
Figure pat00022
EtOH (1 mL), CH2Cl2 (0.1 mL) 혼합용액에 트리-아세틸갈낙-PEG600-히드라자이드(0.05 mmol), (R)-2,3-bis(옥타데실록시)프로판알(39 mg, 0.06 mmol)을 용해시킨 후 아르곤 하 상온에서 3시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 감압 증류하였다. 감압 증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2 : MeOH = 10 : 1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물을 26% 수득률로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 9.92 (s, 1H), 7.43 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.03 (s, 1H), 6.6 (s, 1H), 5.32 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.16 (dd, J = 11.3, 3.0 Hz, 3H), 4.78 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.15-3.40 (m, 134H), 2.45 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.13 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.98 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.54-1.48 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 1-15: 디옥타데실옥시-프로필리덴 트리-갈낙-PEG600-아실히드라존 (GalNAc-PEG600-Hz-DSG)
Figure pat00023
MeOH(1 mL) CH2Cl2 (0.1 mL) 혼합용액에 디옥타데실옥시-프로필리덴 트리-아세틸갈낙-PEG600-아실히드라존 (0.013 mmol)을 용해시킨 후, 메톡사이드나트륨(0.7 mg, 0.013 mmol)를 적가시켰다. 아르곤 하 상온에서 2시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 앰벌라이트 IR-120 이온교환수지로 처리 후 감압 증류하여 원하는 화합물을 26% 수득률로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 9.97(s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.90(m, 2H), 7.72 (m, 1H), 4.47 (m, 3H), 4.15-3.44 (m, 144H), 2.47 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.00 (s, 9H), 1.55 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz , 6H).
실시예 1-16: 3,6-다이옥소-1-페닐-2,8,11,14-테트라옥사-4,5- 다이아자헥사데칸-16-오익 엑시드 M n = 2000
Figure pat00024
실시예 1-9에서와 같은 방법으로 수득률 40%로 원하는 화합물을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.13 (s, 2H), 4.10 (s, 2H), 3.73-3.68 (m, 190H).
실시예 1-17: 1-벤질 21-(tert-부틸) 16,16-bis((3-(tert-부톡시)-3옥소프로폭시)메틸)-4,14-다이옥소-6,9,12,18-테트라옥사-2,3,15-트리아자헤니코산디오에이트 M n = 2000
Figure pat00025
실시예 1-10에서와 같은 방법으로 수득률 30%로 원하는 화합물을 얻었다.
1H NMR (400 MHz; CD3OD) δ 7.38-7.31 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.30-4.13 (m, 3H), 4.13 (s, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.77-3.60 (m, 190H), 2.46 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 1.46 (s, 27H).
실시예 1-18: 18,18-bis((2-카복시에톡시)메틸)-3,6,16-트리옥소-1-2,8,11,14,20-펜타옥사-4,5,17-트리아카트리코산-23-오익 엑시드 M n = 2000
Figure pat00026
실시예 1-11에서와 같은 방법으로 수득률 99%로 원하는 화합물을 얻었다.
1H NMR (CD3OD) δ 7.38-7.30 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.12 (s, 4H), 3.78-3.96 (m, 190H), 2.53 (t, J = 6.0 Hz, 6H).
실시예 1-19: 트리-아세틸갈낙-PEG2K-Cbz히드라자이드
Figure pat00027
실시예 1-12 에서와 같은 방법으로 수득률 30%로 원하는 화합물을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.40-7.31 (m, 5H), 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.16 (s, 2H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.3 Hz, 3H), 4.64 (t, J = 8.5 Hz, 3H), 4.16-4.02 (m, 16H), 3.95-3.91 (m, 6H), 3.77-3.61 (m, 226H), 3.55 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 3.38 (t, J = 5.6 Hz, 6H), 2.45 (t, J = 6.0 Hz, 6H), 2.14 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.93 (s, 9H).
실시예 1-20: 트리-아세틸갈낙-PEG2K-히드라자이드
Figure pat00028
실시예 1-13 에서와 같은 방법으로 수득률 99%로 원하는 화합물을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 5.34 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.07 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz 3H), 4.64 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.17-3.91 (m, 16H), 3.77-3.60 (m, 226H), 3.56 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 3.39 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 2.46 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.15 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.95 (s, 9H), 1.94 (s, 9H).
실시예 1-21: 디옥타데실옥시-프로필리덴 트리-아세틸갈낙-PEG2K-아실히드라존
Figure pat00029
실시예 1-14에서와 같은 방법으로 수득률 37%로 원하는 화합물을 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 9.95 (s, 1H), 7.43 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.03 (s, 1H), 6.6 (s, 1H), 5.32 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 5.16 (dd, J = 11.3, 3.0 Hz, 3H), 4.78 (d, J = 8.5 Hz, 3H), 4.15-3.40 (m, 226H), 2.45 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.13 (s, 9H), 2.03 (s, 9H), 1.98 (s, 9H), 1.94 (s, 9H), 1.54-1.48 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 1-22: 디옥타데실옥시-프로필리덴 트리-갈낙-PEG2K-아실히드라존 (GalNac-PEG2K-Hz-DSG)
Figure pat00030
실시예 1-15에서와 같은 방법으로 수득률 26%로 원하는 화합물을 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ 9.93 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 7.90 (m, 2H), 7.72 (m, 1H), 4.47 (m, 3H), 4.15-3.44 (m, 236H), 2.47 (t, J = 5.9 Hz, 6H), 2.00 (s, 9H), 1.55 (m, 4H), 1.24 (m, 60H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 6H).
실시예 1-23. 벤질 4-옥소-6,9,12-트리옥사-2,3-디아자트리데카노에이트 -PEG600
Figure pat00031
2.7 mL DMF 에 2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)아세트산(150mg, 0.27 mmol) 용해시킨 후, CbzNHNH2 (50 mg, 0.3 mmol), EDCI (58 μL, 0.33 mmol)와 HOBt (44 mg, 0.33 mmol)를 0 ℃에서 첨가하고, 실온에서 하루동안 교반하였다. 반응 종결 후 반응물을 DCM (40mL)로 옮기고 희석한 H3PO4 (1 M, 40 mL), NaHCO3 (1 M, 40 mL) 수용액(40 mL)으로 세척한 후, 황산 마그네슘으로 건조하였다. 반응물을 실리카겔 컬럼에서 DCM/메탄올(10/1, v/v)으로 분리하여 화합물 175 mg을 91% 수득율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.68-3.52 (m, 50H). 3.37 (s, 3H)
실시예 1-24: 2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)아세토히드라자이드 - PEG600
Figure pat00032
메탄올(2.8 mL)에 Cbz히드라자이드(175mg, 0.25mmol)를 용해하고 Pd/C (18mg, 10w/w%)를 첨가하고, 수소 하에서 20시간 교반하였다. 반응 종결 후 셀라이트 545로 여과하여 화합물 147 mg 을 95% 수득율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.14-4.01 (m, 2H), 3.61 (m, 50 H), 3.34 (s, 3H)
실시예 1-25: 디옥타데실옥시-프로필리덴 PEG600-아실히드라존(PEG600-Hz-DSG)
Figure pat00033
1.3 mL 에탄올에 실시예 1-24의 결과물(79 mg, 0.127 mmol)을 용해하고, 실시예 1-8의 결과물 알데히드(113 mg, 0.19 mmol)를 첨가하였다. 혼합물은 50 ℃에서 18시간 동안 교반하여 반응을 종결시켰다. 반응물을 컬럼으로 정제하여 화합물 123 mg을 85%의 수율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.97(s, 1H), 7.38 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.15 (m, 3 H), 3.65-3.40 (m, 56 H), 3.36(s, 3H), 1.52(m, 4H), 1.23 (m, 60 H), 0.86 (t, J = 6.4 Hz, 3H).
실시예 1-26: 벤질 4-옥소-6,9,12-트리옥사-2,3-디아자트리데카노에이트 - PEG2K
Figure pat00034
실시예 1-23과 같은 방법으로 화합물 160 mg 을 95% 수득율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, MeOH-d4) δ 7.39-7.30 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.20 (s, 2H), 3.68-3.52 (m, 190H). 3.36 (s, 3H)
실시예 1-27: 2-(2-(2-메톡시에톡시)에톡시)아세토히드라자이드 - PEG2K
Figure pat00035
실시예 1-24 와 같은 방법으로 화합물 110 mg을 75% 수율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.14-4.01 (m, 2H), 3.61 (m, 190 H), 3.34 (s, 3H)
실시예 1-28: 디옥타데실옥시-프로필리덴 PEG2K-아실히드라존 (PEG2K-Hz-DSG)
Figure pat00036
실시예 1-25 와 같은 방법으로 화합물 57 mg을 53% 수득율로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.95(s, 1H), 7.36 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.14 (m, 3 H), 3.60-3.40 (m, 200 H), 3.34(s, 3H), 1.51(m, 4H), 1.21 (m, 60 H), 0.84 (t, J = 6.4 Hz, 3H).
실시예 1-29: (R)-1-(4-(2,3-비스(옥타데실옥시)프로폭시)페닐)에탄-1-온
Figure pat00037
2mL THF에 실시예 1-7의 결과물(59.8 mg, 100 umol)을 용해하고, 4-히드록시아세토페논(15.0 mg, 110 umol), PPh3 (39.4 mg, 150 umol), DIAD (30 uL, 150 umol)을 0 ℃에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 12 시간 교반하고 반응을 종결시켰다. 반응물을 디클로로메탄으로 3회 추출하고 소금물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산 마그네슘을 건조하고 감압에서 건조하였다. 실리카 크로마토그래피로 결과물을 정제하여 55.0 mg을 77%의 수율로 얻었다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.92 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.19-4.05 (m, 2H), 3.79 (quin, J = 5.1 Hz, 1H), 3.64-3.57 (m, 4H), 3.46 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.55 (s, 3H), 1.61-1.50 (m, 4H), 1.32-1.21(m, 60H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz).
실시예 1-30: (R,E)-N'-(1-(4-(2,3-bis(옥타데실옥시)프로폭시)페닐)에틸리덴)-2-(2-메톡시에톡시)아세토히드라자이드 (PEG600-PhHz-DSG)
Figure pat00038
에탄올(4mL)에 m-PEG-hydrazide Mn = 550 (CreativePEGworks) (200 mg, 364 umol)를 용해하고, 실시예 1-29의 결과물(260 mg, 364 umol), 아세트산 (100 uL, 3.64 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 85 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 컬럼 정제 방식으로 정제하여 결과물 265 mg을 66% 수득율로 얻었다.
실시예 1-31: (2R)-2,3-비스(옥타데실옥시)프로필 2-(메톡시폴리에틸렌글리콜550)아세테이트 (PEG600-Ester-DSG)
Figure pat00039
DCM (30.0 mL)에 2-(메톡시폴리에틸렌글리콜550)카르복실산(100 mg, 0.156 mmol)을 용해시킨 후, (S)-2,3-비스(옥타데실옥시)프로판-1-올(187mg 0.312mmol), 4-디메틸 아미노피리딘(23mg, 0.187mmol)과 디사이클로헥실카보디이미드(37mg, 0.180mmol)을 적가시켰다. 질소 하 상온에서 24시간 동안 교반시켜 주었다. 반응이 종결된 후, 반응물을 Celite545로 필터 후, 물과 CH2Cl2을 가하여 유기층으로 3번 추출한 뒤 추출한 유기용매층을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 후 감압 증류하였다. 감압 증류하여 얻어진 혼합물은 컬럼 크로마토그래피(DCM : MeOH = 20 : 1)로 분리 한 뒤 원하는 화합물(68 mg, 0.64 mmol)을 41% 수득률로 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.24 (t, 2H), 3.60-3.70 (m, 33H), 3.42 (s, 2H), 1.96-1.98 (d, 3H), 1.75-1.76 (d, 3H), 1.29 (s, 60H), 0.92 (t, 6H)
실시예 2: 지질 나노 입자의 제조
본 발명에서 서술하는 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트, 즉 산성 조건에서 분해되는 성질이 있는 작용기를 포함하는 PEG 유도체가 지질 나노 입자를 제조하는 산성 조건에서 안정적으로 나노 입자를 형성할 수 있는지를 확인하기 위하여 두 종류의 나노 입자를 제조하였다. 하나는 산성 조건에서 가수 분해되는 hydrazone 작용기를 포함하는 PEG2K-Hz-DSG (화학식 3)를 포함하고 있으며, 다른 하나는 산성 조건에서 가수 분해되지 않는 PEG2K-PE-DSG (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)]-2000, Avanti)를 사용하는 나노 입자를 제조하였다.　이온화 지질을 포함하는 나노 입자를 제조하는 통상적인 방법에 따라 제조하기 위하여 두 가지 용액을 준비하였다. 하나는 지질 성분을 함유하는 유기 용액으로서 에탄올에 지질 나노 입자를 구성하는 지질 성분을 용해하여 준비하였다. PEG2K-Hz-DSG 또는 PEG2K-PE-DSG 1 몰%를 포함하는 지질 나노 입자를 제조하기 위하여 DLin-MC3-DMA, DSPC (distearoylphosphatidylcholine), 콜레스테롤, PEG2K-Hz-DSG 또는 PEG2K-PE-DSG 를 각각 50:10:39:1 몰비를 유지하면서 총 4.5 mg/mL의 농도가 되도록 준비하였다. PEG2K-Hz-DSG 또는 PEG2K-PE-DSG를 각 2, 5몰% 비율로 포함하는 지질 나노 입자 제조를 위해서는 상기 PEG 1 몰% 지질 나노 입자 제조에 사용된 PEG 함량의 2, 5배의 PEG를 포함시켜 용액을 준비하였다.
한편, siRNA를 pH 4의 시트르산 완충 용액에 0.046 mg/mL의 농도가 되도록 준비하였다. 마이크로 믹서칩 또는 T-line 칩을 이용하여 에탄올 용액과 버퍼 수용액을 3:1의 부피비로 혼합하여 지질 나노 입자를 제조하는데, 혼합 용액의 유속은 4 mL/min이 되도록 하였다. 칩을 통과하여 나온 용액에 추가로 1:1의 부피비로 버퍼를 혼합하여 pH 7로 변경시킨 후, 이를 pH 7.5 PBS 완충 용액에서 24시간 투석을 진행하였다. 제조된 지질 나노 입자를 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 장치를 사용하여 입자의 크기를 측정하였다. 만일, PEG2K-Hz-DSG 의 히드라존(hydrazone)이 지질 나노 입자를 제조하는 산성 조건에서 PEG와 지질(DSG)로 가수 분해된다면, PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트를 포함하지 않는 나노 입자의 제조와 마찬가지로 지질 성분이 불균일한 크기의 침전물로 석출되어야 한다. 하지만, 도 2에서 알 수 있는 바와 같이 PEG2K-Hz-DSG를 구성 성분으로 포함하는 나노 입자는 PEG2K-PE-DSG를 포함하는 나노 입자와 같이 균일한 크기의 나노 입자를 형성하며, PEG 함량이 증가할수록 작은 크기의 나노 입자를 형성함을 알 수 있다. 이 실시예를 통하여 산성 조건에서 분해되는 성질이 있는 작용기를 포함하는 PEG 모이어티-분해 가능 작용기-지질 컨쥬게이트가 지질 나노 입자를 제조하는 산성 조건에서 분해되지 않고 안정적으로 나노 입자를 형성할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: PEG-Hz-DSG 또는 PEG-PE-DSG를 포함하는 지질 나노 입자의 효능 비교
PEG-Hz-DSG 또는 PEG-PE-DSG를 포함하는 지질 나노 입자의 효능을 확인하기 위하여 루시퍼라제(luciferase)를 타겟으로 하는 siRNA를 포함하여 실시예 2에 기재한 방식으로 지질 나노 입자를 제조하였다. 이를 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포주에 siRNA 농도 기준으로 다양한 농도에서 지질 나노 입자를 처리하여 루시퍼라제 활성 억제 정도를 평가하였다.
지질 나노 입자에 포함되는 PEG의 분자량과 함유량이 효능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 PEG2000 (PEG2K-Hz-DSG 또는 PEG2K-PE-DSG) 또는 PEG1000 (PEG1K-Hz-DSG 또는 PEG1K-PE-DSG)를 각 1, 2, 5몰% 포함하도록 제조하였다. PEG600-Hz-DSG의 경우는 보다 다양한 함유량을 포함하도록 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40 몰% 포함하는 지질 나노 입자도 제조하여 평가하였다.
PEG-PE-DSG를 포함하는 지질 나노 입자는 PEG 함량과 상관없이 효능이 없거나(도 2A), 함량이 증가할수록 효능이 저하됨(도 2B)을 알 수 있지만, PEG-Hz-DSG는 함량과 상관없이 효과적으로 루시퍼라제 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다. 특히, PEG600-Hz-DSG를 포함하는 지질 나노 입자는 함유량이 20 몰% 에 도달할 때까지 보다 효과적으로 루시퍼라제의 발현을 억제하여 효능이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 지질 나노 입자에 포함된 PEG 함량에 따른 세포 업테이크(uptake) 및 타겟 저해 효율 비교 확인
지질 나노 입자 제조에 통상적으로 많이 사용되는 PEG-DMG를 사용하여 지질 나노 입자를 제조하면, PEG 함량이 증가할 경우 세포로 업테이크 되는 효율이 감소하는 것이 알려져 있다. 이를 확인하기 위하여 PEG-DMG를 각 2, 5, 10 몰% 함유하는 지질 나노 입자를 제조할 때, 형광 염료 DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)를 0.2 몰% 포함시켜 제조한 후, HepG2 세포주에 24시간 처리하였다. 나노 입자의 세포 업테이크 효율을 유세포분석기(FACS)를 사용하여 분석한 결과, PEG 함유량이 증가할수록 세포의 업테이크가 저하되는 것을 확인할 수 있다(도 3, A).
저하된 업테이크(uptake)의 결과는 지질 나노 입자의 효능 저하를 초래한다. 상기 PEG-DMG를 각 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 몰%의 함량별로 포함하는 지질 나노 입자를 제조할 때 루시퍼라제(luciferase)를 타겟으로 하는 siRNA 를 포함하여 제조하였다. 이를 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포에 처리하고 루시퍼라제의 활성도를 측정하였다. 도 3의 B 그래프에서 확인할 수 있는 바와 같이 PEG 의 함량이 0.5 내지 2 몰% 구간에서 가장 우수한 효율을 보였다. 0 내지 0.2 몰%의 PEG를 포함하는 지질 나노 입자에서는 효능이 관찰되지 않았고, 2몰% 이상의 구간에서는 PEG의 함량이 증가할수록 루시퍼라제의 활성 저해 효율이 감소하는 것을 알 수 있다. 매우 낮은 PEG 를 포함하면 입자 형성 자체가 불균일하게 되고, PEG 함량이 일정 수준을 넘어가면 세포로의 업테이크(uptake) 및 엔도좀 탈출을 어렵게 하기 때문이다.
PEG-DMG와 PEG600-Hz-DSG를 함량별로 포함하는 지질 나노 입자의 효능을 직접적으로 비교하기 위하여 해당 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트 성분을 각각 1, 2, 5, 10몰%이고, 루시퍼라제를 타겟으로 하는 siRNA 포함하는 지질 나노 입자를 제조하였다. 지질 나노 입자를 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 HEPG2와 HEK293 세포주에 처리하고 24시간 후에 루시퍼라제 발현량을 측정한 결과, PEG-DMG 를 포함하는 지질 나노 입자는 PEG 의 함량이 증가할수록 효율이 감소하는 반면, PEG600-Hz-DSG를 포함하는 지질 나노 입자는 PEG 함량이 증가할 때 효율에 변동이 없거나 오히려 향상됨을 확인할 수 있었다(도 3, C, D). 이 자료를 바탕으로 EC50 를 계산한 결과를 도 3의 E와 F에 수록하였는데, HEPG2 세포주에서 PEG-DMG 와 PEG600-Hz-DSG 를 10%씩 포함하는 지질 나노 입자의 EC50 는 각각 8.9 nM과 0.2 nM로 대략 45배의 차이가 있으며, HEK293 세포주에서는 각각 26 nM 과 0.72 nM 로 대략 36배의 차이가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 지질 나노 입자의 PEG 제거 확인
지질 나노 입자가 세포의 엔도좀 안으로 진입한 이후에는 엔도좀 지질막과 지질 나노 입자의 효과적인 상호작용을 위하여 엔도좀 안에서 PEG를 제거하는 것이 효율 측면에서 유리하다. 분해가능작용기가 없는 일반적인 PEG-지질 컨쥬게이트을을 사용하는 지질 나노 입자는 엔도좀의 내부 환경을 모사하는 산성 조건에서 입자의 구조가 상대적으로 안정적이다. 반면, PEG-Hz-DSG와 같이 산성 조건에서 분해되는 작용기를 포함하는 지질 나노 입자는 산성 조건에서 PEG가 제거되어 불안정해지게 된다. 이를 확인하기 위하여 통상적인 지질 나노 입자 제조 비율인 1.5 몰% PEG-DMG을 포함하는 나노 입자와 본 발명에서 사용하는 PEG600-Hz-DSG를 10 몰% 포함하는 지질 나노 입자를 pH 7.4, 5.5, 5.0, 4.5의 완충 용액에서 크기 변화를 측정하였다.
PEG-DMG를 사용하여 제조된 나노 입자를 각 pH 조건에서 입자 크기의 변화를 시계열로 관찰하면 큰 변화가 없음을 알 수 있다(도 4, A). 반면, PEG600-Hz-DSG를 포함하는 지질 나노 입자의 크기는 중성 조건인 pH 7.4에서는 안정적인 크기를 유지하지만, 산성 pH 환경에서는 입자간의 융합이 활성화 되는 것을 알 수 있다(도 4, B). 뿐만 아니라, 각 산성 조건에서는 시간의 경과에 따라 입자들 간의 융합 현상은 지속적으로 진행되어 크기가 점점 증가하는 것을 알 수 있다. 즉, 나노 입자 표면을 구성하고 있는 PEG가 산성 조건에서 효과적으로 제거되는 것을 알 수 있다.
따라서, 히드라존과 같이 산성 조건에서 가수 분해되는 작용기를 포함하는 PEG-Hz-DSG는 지질 나노 입자를 제조할 때의 산성 조건(pH 4, 에탄올 20 내지 40% 완충 용액)에서는 구조적 안정성을 유지하지만(도 1), 에탄올을 제거한 이후에는 산성 pH에서 히드라존이 빠르게 가수 분해되어 PEG와 지질 부분이 분리된 것을 확인할 수 있다.
실시예 6: 분해가능작용기의 가수 분해 시점 확인
지질 나노 입자 표면의 PEG를 제거하는 시점에 따라 효능 차이가 발생하는지 여부를 확인하기 위하여 PEG600-Hz-DSG를 5 또는 10 몰% 함유하는 지질 나노 입자를 제조할 때, 루시퍼라제를 타겟으로 하는 siRNA를 포함하여 제조하였다. 지질 나노 입자를 pH 7 또는 4 완충 용액에서 24 시간 처리한 후 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포주에 72시간 처리하여 루시퍼라제 발현양을 측정하였다.
pH 7의 완충 용액에서 전처리된 지질 나노 입자는 효과적으로 루시퍼라제 발현을 억제할 수 있지만, pH 4 완충 용액에서 PEG 가 제거된 지질 나노 입자는 전혀 효능을 관찰할 수 없었다(도 5). 즉, 지질 나노 입자가 세포의 엔도좀 안으로 진입한 이후에 PEG가 제거되어야 효능을 발생시키지만, 세포로 업테이크 되기 전에 PEG가 제거된 나노 입자는 효능을 상실한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 7: 분해가능작용기의 화학 구조가 효능에 미치는 영향 평가
PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트 성분에서 분해가능작용기를 이루는 화학적 구조에 따라 산성 조건에서의 가수 분해 반감기의 차이가 발생한다. 산성 조건에서의 가수 분해 민감도가 지질 나노 입자의 효능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 분해가능작용기를 에스터(PEG600-Ester-DSG, 화학식 5) 또는 아릴히드라존(PEG600-PhHz-DSG, 화학식 6)으로 하는 PEG 유도체를 1, 2, 5, 10 몰% 포함하는 지질 나노 입자를 제조하였다.
해당 지질 나노 입자에 루시퍼라제를 타겟으로 하는 siRNA 포함하여 제조하고, 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포주에 24시간 처리 후, 루시퍼라제 활성을 측정하였다(도 6, A).
PEG600-Hz-DSG와 PEG600-Ester-DSG의 함유량이 증가할수록 지질 나노 입자의 효율이 향상되는 것을 알 수 있었고, 히드라존 작용기가 에스터 작용기 보다 우수한 효율을 보임을 확인할 수 있었다.
이러한 결과와 각 작용기의 산성 조건 가수 분해 민감도와의 상관 관계를 확인하기 위하여 해당 PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트를 10몰% 함유하는 지질 나노 입자를 PBS pH 7.4 또는 시트르산 pH 4.5 완충 용액으로 옮긴 후 입자의 크기 변화를 동적광산란 방식으로 측정하였다(도 6, B). 작용기가 히드라존, 에스터, 아릴히드라존 순으로 입자의 크기가 증가하였는데, 이것은 각 작용기가 상기의 순서대로 산성 조건에서 가수 분해가 잘된다는 것을 의미한다. 즉, 가수 분해가 활발하여 PEG가 효과적으로 제거될수록 우수한 효율을 보인다는 것을 도 6의 A 와 B를 통하여 확인할 수 있었다.
실시예 8: 지질 나노 입자의 지질막 융합 및 용혈 반응(hemolysis) 유발 평가
지질 나노 입자가 엔도좀 지질막과 융합하는 정도를 알기 위해서 이온화 지질의 pKa보다 낮은 pH 조건에서 리포좀 지질막 또는 적혈구와 나노 입자를 혼합하고 지질막 융합 반응 또는 용혈 반응을 측정하여 평가하였다. 본 실시예에 사용된 이온화 지질은 DLin-MC3-DMA인데, 이 물질의 아민기 pKa는 대략 6.5로서 pH 4 조건에서는 아민기가 양전하를 띠게 된다. 양전하는 엔도좀의 지질막의 음전하와 정전기적 인력에 의하여 보다 수월하게 융합이 진행될 수 있게 도와준다. 그러나, 나노 입자의 표면에 PEG가 분포하게 되면, 정전기적 인력을 PEG가 약화시키는 가림 효과를 발생시킬 뿐만 아니라, 나노 입자의 표면과 엔도좀의 지질막의 직접적인 접촉 또한 방해하는 효과가 있다.
지질 나노 입자와 엔도좀 지질막의 융합 효율을 평가하기 위하여 PEG600-Hz-DSG 10몰% 또는 지질 나노 입자 제조에 통상적으로 사용되는 PEG-DMG 1.5몰% 를 포함하는 지질 나노 입자를 제조하였는데, 이 때 각 나노 입자에 18:1 NBD PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt))와 18:1 Liss Rhod PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt))를 0.5 몰% 포함시켰다.
엔도좀 지질막을 모사하기 위하여 리포좀을 제조하여 사용하였다. Soy PS:DOPC:DOPE를 25:25:50 몰% 비율로 클로로포름에 총 1 mM 농도가 되도록 용해하고 둥근 플라스크에서 클로로포름을 감압 건조 방식으로 제거하였다. 여기에 1 mL의 PBS를 투입하고 소니케이션을 진행하여 리포좀을 생성하였다.
pH 7.4, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5 완충 용액에서 각 지질 나노 입자와 리포좀을 혼합하였다. 지질 나노 입자에 포함된 NBD와 Liss Rhod가 근접한 위치에 있을 때는 형광 신호를 측정할 수 없지만, 나노 입자가 리포좀의 지질막과 융합하여 형광 지질들의 상대적 거리가 멀어지면 NBD의 형광 신호가 증가하기 때문에 이를 이용하여 지질막 융합 효율을 측정할 수 있다. ex 475/em 540 파장 조건에서 NBD의 형광 신호를 측정하여 나노 입자의 지질막 융합 효율을 측정하였다.
형광 신호 발생을 측정하여 PEG-DMG 또는 PEG600-Hz-DSG를 포함하는 지질 나노 입자는 산성 조건에서 리포좀의 지질막과 융합되는 것을 확인할 수 있었다(도7, A). 특히, PEG 를 1.5% 포함하는 PEG-DMG 지질 나노 입자보다 높은 함량인 10% PEG600-Hz-DSG를 포함하는 지질 나노 입자에서 상대적으로 더 높은 pH에서 지질막과 융합을 시작하고 더 강한 형광 신호를 발생하는 것을 확인하였다. 즉, 두 나노 입자 모두 동일한 이온화 지질을 사용하였기 때문에 이온화 지질의 양전하에 의한 효과는 동일하지만 PEG-DMG 지질 나노 입자의 PEG 는 입자 표면에 그대로 존재하는 반면, PEG600-Hz-DSG의 PEG는 히드라존기의 가수 분해로 제거되기 때문에 상대적으로 우수한 지질막 융합 효율을 보이는 것을 확인하였다.
지질 나노 입자와 지질막 융합 효율은 적혈구를 사용한 용혈 실험을 통해서도 확인할 수 있다. 도 7의 B는 지질 나노 입자 제조에 통상적으로 사용하는 PEG-DMG를 각 5, 10 몰% 포함하는 지질 나노 입자를 제조하고, 이를 사용하여 pH 4.5 또는 7.4 조건에서 용혈 유발 반응을 측정한 결과를 보여 준다. PEG의 함량이 5%에서 10%로 증가하면 용혈 반응이 억제되는 것을 확인할 수 있다. 즉, PEG 함량이 증가하면 PEG 에 의한 가림 효과 때문에 지질막 융합 능력이 저해됨을 알 수 있다. 반면, 리간드를 포함하는 PEG600-Hz-DSG를 사용하여 제조한 지질 나노 입자는 산성 조건에서 가수분해를 통하여 PEG가 제거되기 때문에 PEG 유도체의 함량이 10%로 증가된 지질 나노 입자도 용혈 반응을 효과적으로 유발하는 것을 알 수 있다.
참고로, pH 7.4의 중성 조건에서는 이온화 지질의 아민기가 전기적으로 중성 상태이기 때문에 두 종류의 지질 나노 입자 모두 용혈 반응을 유발하지 않는 것을 알 수 있다. 즉, pH가 중성 상태에서는 지질 나노 입자 주위의 다른 세포와 상호작용을 진행하지 않지만, 지질 나노 입자가 엔도좀에 도달한 경우는 PEG 유도체를 포함한 지질 나노 입자가 상대적으로 수월하게 엔도좀 지질막과 융합 과정을 발생시키는 것을 알 수 있다.
실시예 9: PEG 모이어티-분해가능 작용기-지질 컨쥬게이트를 구성하는 지질의 길이와 지질 나노 입자의 구조적 안정성 관계
상기 실시예를 통해 확인한 바와 같이 지질 나노 입자 표면을 둘러 싸고 있는 PEG는 지질 나노 입자 제조 과정에서는 필요하지만 약리적 효능 측면에서는 불리하게 작용한다. 따라서, 지질 나노 입자가 생체 내에서 혈류를 타고 순환하는 동안 PEG가 지질 나노 입자로부터의 자발적으로 제거되기 쉽도록 PEG를 탄소수가 14개로 구성된 미리스틱산(myristate) 등의 탄화수소 지방에 연결한 물질인 PEG-DMG를 통상적으로 사용한다. 팔미틱산(palmitate, 탄소수 16개), 스테아릭산(stearate, 탄소수 18개) 등으로 지방산의 길이가 상대적으로 긴 물질을 사용하여 제조된 지질 나노 입자는 혈류를 통한 순환 과정에서 PEG 제거가 원활하지 않아 세포의 엔도좀 진입이 어렵고, 따라서 효능이 저하된다.
하지만, 지방산의 길이가 짧은 PEG-지질 컨쥬게이트를 사용하여 순환 과정 중에 PEG 제거하는 방식은 지질 나노 입자의 구조적 안정성 측면을 고려하면 매우 불안정한 요인으로 작용한다. 지질 나노 입자로부터 PEG-지질 컨쥬게이트가 분리되어 제거되기 시작하면, 입자 자체의 안정성이 저하되기 때문에 지질 나노 입자를 구성하고 있는 다른 지질 성분들 또한 유실되기 시작한다. 이를 확인하기 위하여 PEG-DMG (lipid의 탄소 길이 14)를 1.5% 또는 5% 함유하는 지질 나노 입자와 지방산의 길이가 18로 구성된 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트 (화학식 4) 5%를 함유하는 지질 나노 입자의 구조적 안정성을 비교하였다.
지질 나노 입자를 제조할 때 형광을 띠는 18:1 NBD PE와 18:1 Liss Rhod PE를 각 1 몰% 포함시켰다. 지질 나노 입자를 37 ℃의 랫트 혈장에 넣고 지정된 시각에 시료를 채취하여 NBD의 형광 세기를 측정하였다(도 8). 입자가 안정적으로 유지되는 경우는 두 형광 염료가 나노 입자 안에서 비교적 근접한 거리에 있기 때문에 NBD 형광 염료의 형광 신호가 작게 측정된다. 만일 나노 입자 구조 불안정해지면, 나노 입자의 구성 성분 유출을 유발하며, 이 경우 각 형광 염료가 표지된 지방산도 유출이 되면서 형광 신호가 증가하게 된다. 자료에서 보이는 바와 같이 지방산의 길이가 짧은 PEG-DMG를 사용하여 제조된 지질 나노 입자는 입자의 안정성이 취약하여 빠른 시간에 형광 신호가 증가하는 반면, 지방산의 길이가 긴 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트는 형광 신호 증가가 상대적으로 느림을 알 수 있다. 즉, 지질 나노 입자로부터 PEG를 제거하기 위하여 의도적으로 짧은 길이의 지방산으로 이루어진 PEG-지질 컨쥬게이트를 사용하는 지질 나노 입자는 혈류를 통한 순환 과정에서 PEG가 제거됨과 동시에 다른 지질 성분들도 빠르게 유실되지만, 본 발명에서 서술하는 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 사용하여 제조된 지질 나노 입자는 비교적 안정적인 구조를 유지할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 10: 지질 나노 입자의 면역 반응 유발 측정
지질 나노 입자를 구성하는 이온화 지질은 면역 세포와의 상호 작용을 통하여 불필요한 면역 반응을 유발할 수 있다. 이러한 부작용을 최소화하기 위하여 PEG 가 사용될 수 있는데, 상기 실시예에서 나타낸 바와 같이 PEG 함량 증가는 불필요한 상호작용을 억제하여 면역 반응을 효과적으로 경감시킬 수 있지만 필연적으로 세포에 의한 나노 입자의 업테이크 효율과 세포 내의 엔도좀 탈출을 심각하게 저해하는 효과가 있기 때문에 PEG 함량을 필요 최소량 이상으로 증가시키기 어렵다.
반면, 본 발명에서 서술하는 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 포함하는 지질 나노 입자는 리간드를 사용하여 세포 업테이크 효율을 증가시킬 수 있고, 엔도좀 안에서의 PEG를 제거할 수 있는 화학 작용기를 포함하고 있다. 따라서, PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 사용하게 되면, PEG 함량을 증가시켜도 제조된 지질 나노 입자는 효능이 저하되지 않으며, 동시에 면역 반응 유발을 억제할 수 있다. 이를 확인하기 위하여 리간드를 포함하는 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트 10몰%를 사용한 지질 나노 입자를 랫트에서 추출한 말초 혈액 단핵세포(PBMC)와 혼합하여 지질 나노 입자가 사이토킨(cytokine)을 유발하는 정도를 측정하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 사용한 지질 나노 입자의 면역 반응 유발 정도는 음성 대조군으로 사용한 PBS 완충용액 처리군과 유사한 수준임을 알 수 있다.
실시예 11: 동물을 이용한 지질 나노 입자의 효능 평가
세포 실험에서 효능을 보이는 지질 나노 입자를 사용하여 생체 내에서의 효과를 확인하기 위하여 동물 실험을 진행하였다. 이를 위하여 PEG2K-PE-DSG 또는 PEG2K-Hz-DSG를 5 몰% 포함하는 지질 나노 입자를 제조하였고, 각 지질 나노 입자는 Factor 7을 타겟으로 하는 siRNA를 포함하였다. 각 지질 나노 입자를 8 주령의 C57BL/6 female 마우스(라온바이오)에 PBS 또는 각 지질 나노 입자를 siRNA 기준으로 0.3 또는 1 mg/kg 용량을 정맥 주사 방식(I.V. injection)으로 주입하였다. 주입시 물질의 투여 부피는 10mL/kg을 유지하였다. 주입 후 48시간 후 혈청 내의 Factor 7의 함량을 Factor 7 분석 키트(Abcam) 을 사용하여 정량하고 PBS 를 투입한 음성대조군 대비 함량을 측정하였다(도 10).
세포를 이용한 실험 결과(도 2, A)와 유사하게 분해가능작용기인 히드라존을 포함하고 있는 지질 나노 입자에서는 용량 의존적으로 Factor 7의 발현을 억제하였지만, 분해가능작용기를 포함하지 않은 지질 나노 입자에서는 효능을 확인할 수 없었다.
실시예 12: 리간드를 포함하는 지질 나노 입자의 효능 평가
특정 수용체를 발현하는 조직에 나노 입자를 선택적으로 전달하기 위하여 해당 수용체와 특이적으로 결합하는 리간드를 지질 나노 입자에 포함하여 제조할 수 있다. 리간드를 포함한 지질 나노 입자 효과를 확인하기 위하여 PEG600-Hz-DSG를 10몰% 포함하는 지질 나노 입자와 간 조직에 특이적인 전달을 위하여 0.5 몰%의 GalNac-PEG2K-Hz-DSG와 9.5 몰%의 PEG600-Hz-DSG를 혼합 사용한 지질 나노 입자를 각각 제조하였다. siRNA 기준으로 0.1 mg/kg의 용량을 마우스에 투여하였는데, 실시예 11에 기재된 바와 동일한 방식으로 동물 실험을 진행하였다.
결과로서, 간 특이적인 리간드를 포함하는 지질 나노 입자가 리간드를 포함하지 않은 지질 나노 입자 대비 상대적으로 우수한 효능을 보임을 알 수 있었다(도 11).
실시예 13: 지질 나노 입자의 세포 독성 평가
통상적으로 사용되는 PEG-DMG를 포함한 지질 나노 입자와 본 발명에서 사용하는 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 포함한 지질 나노 입자의 상대적 독성을 평가하였다. 이를 위하여 PEG-DMG를 1.5 몰% 포함하는 지질 나노 입자와 GalNAc-PEG2K-Hz-DSG 와 PEG600-Hz-DSG를 각각 1 및 9 몰%의 혼합물을 포함하는 지질 나노 입자를 제조하였다. 지질 나노 입자에 포함된 siRNA 농도를 기준으로 HepG2, HEK293, H460, A549 등의 세포주에 처리하고 72 시간 후에 각 세포주의 활성을 CellTiter-Glo 키트(프로메가)를 사용하여 측정하였다(도 12).
PEG-DMG를 포함하는 지질 나노 입자를 고농도로 세포에 처리하면 세포들이 많이 죽는 반면, 본 발명에서 사용하는 PEG 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트를 10 몰% 포함하는 지질 나노 입자는 상대적으로 세포의 사멸을 유발하지 않는다는 것을 확인하여 독성이 매우 낮다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (27)

  1. 다음을 포함하는 지질 나노 입자:
    (a) 이온화 지질 및 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물; 및
    (b) 상기 지질 배합물 내에 봉입된 약물, 핵산 또는 이들의 조합,
    여기서, 상기 이온화 지질은 산성 pH에서는 양이온 상태이나, 중성 pH에서는 전기적으로 중성인 지질이고,
    상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 화학식 1로 표시되며,
    [화학식 1]
    Figure pat00040

    화학식 1에서
    a는 0 또는 1이고,
    L은 타겟팅 리간드(targeting ligand) 또는 H이며,
    M은 단일결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이고,
    P는 CH2O(CH2CH2O)qCH2 또는 CH2CH2O(CH2CH2O)qCH2이고, 여기서, q는 2~120의 정수이며,
    L6은
    Figure pat00041
    , 여기서 Z는 NH, O 또는 S이고, d는 1~10의 정수이며, e는 1~10의 정수이고,
    T는 단일결합 또는 1,4-C6H4O-이며, R1 및 R3은 각각 독립적으로 -Y-R이고, R2는 -CH2-Y-R이며, 여기서, Y는 단일결합, O, S, C(O), C(O)O, OC(O), C(O)NH, 또는 NHC(O)이고, R은 H, C10-C20 알킬, C10-C20 알케닐이고,
    상기 타겟팅 리간드 L은 화학식 2로 표시되며,
    [화학식 2]
    Figure pat00042

    화학식 2에서
    a, b 및 c는 0 또는 1이되, a, b 및 c 중 하나 이상은 반드시 1이며,
    X1, X2 및 X3는 타겟팅 리간드로, N-아세틸-D-갈락토사민(N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc), N-아세틸-D-갈락토스(N-acetyl-D-galactose), D-갈락토스(D-galactose), N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine), D-글루코스, D-만노스, F-푸코스, 탄수화물 유도체, 엽산(folate), 트랜스페린(transferrin), RGD 펩티드, 사이클릭 RGD 펩티드, TAT 펩티드, R9 펩티드, CADY 펩티드, HA2 펩티드, 단일 클론 항체, 항원 결합 단편(antigen-binding fragment) 또는 항체 단편, 단일 사슬 가변 단편(single-chain variable fragment. scFv) 및 압타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택되고,
    L1, L'1 및 L"1은 단일 결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이며,
    L2, L'2 및 L"2는 (CH2)n 또는 (OCH2CH2)m이고, 여기서, n은 1~20의 정수이고, m은 1~10의 정수이며,
    L3, L'3 및 L"3은 단일결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이고,
    L4, L'4 및 L"4는 (CH2)n이고, 여기서, n은 1~20의 정수이며,
    L5, L'5 및 L"5는 단일결합, O, S, C(O), NHC(O), C(O)NH, OC(O) 또는 C(O)O이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
    [화학식 3]
    Figure pat00043

    화학식 3에서 n은 2~120의 정수이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
    [화학식 4]
    Figure pat00044

    화학식 4에서 n은 2~120의 정수이다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 화학식 1에서 a가 0인 화합물과 a가 1인 화합물의 혼합물인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 a가 0인 화합물과 a가 1인 화합물의 몰비는 0.01~99.9:0.01~99.9인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노 입자에서 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티-분해가능작용기-지질 컨쥬게이트의 함량은 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질 성분의 0.5~50 몰%인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 지질 나노 입자의 크기는 20~200 nm인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 이온화 지질은 (6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-헤프타트리아콘타 6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA), [(4-히드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315), 8-[(2-히드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노]-옥탄산(SM-102), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일 카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLin-DAP), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레일 옥시) 프로필아민(DODMA), 지오크타데시르아미드그리시르카르보키시스페르민(DOGS), 스페르민코레스테리르카르바메이트(GL-67);비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤(BGTC), 3β-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일) 콜레스테롤(DC-Chol), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시데실) 아미노) 에틸)(2-하이드록시데실) 아미노) 에틸) 피페라진-1-일) 에틸아잔디일) 디도데칸-2-올(C12-200), N-t-부틸-N'-테트라데실 아미노-프로피온아미딘(디C14-아미딘);지메치르지오크타데시르안모니움브로미드(DDAB), N-(1,2-디미리스틸 옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 디올레일 옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DORIE), N-(1-(2,3-디올레일 옥실) 프로필)-N-2-(스페르민카르보키사미드)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-디올레오일 트리메틸암모늄 프로판 클로라이드(DOTAP), N-(1-(2,3-디올레일 옥시) 프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 아미노프로필-디메틸-비스(도데실옥시)-프로판 아미늄 브로마이드(GAP-DLRIE)로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  9. 제1항에 있어서, 스테롤 지질과 중성 지질을 추가로 포함하는 지질 나노 입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 스테롤 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 에스터인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  11. 제9항에 있어서, 상기 중성 지질은 인지질 또는 스핑고지질인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 인지질은 DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DSPC (distearoylphosphatidylcholine), POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine), EPC (egg phosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG (dioleoylphosphatidylglycerol), DPPG (dipalmitoylphosphatidylglycerol), DSPE (distearoylphosphatidylethanolamine), PE (Phosphatidylethanolamine), DPPE (dipalmitoylphosphatidylethanolamine), DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]), 세라미드(ceramide), 스핑고마이얼린(sphingomyelin) 및 그 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자.
  13. 다음 단계를 포함하는 제1항의 지질 나노 입자의 제조방법:
    (a) 이온화 지질 및 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트를 포함하는 지질 배합물을 함유하는 유기 용액과 약물, 핵산 또는 이의 조합을 함유하는 버퍼 용액을 혼합하여 pH를 산성으로 조정하는 단계; 및
    (b) 상기 혼합 용액의 용매를 제거하는 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유기 용액과 상기 버퍼 용액의 혼합비는 1:1 내지 1~100의 부피비인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
    [화학식 3]
    Figure pat00045

    화학식 3에서 n은 2~120의 정수이다.
  16. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
    [화학식 4]
    Figure pat00046


    화학식 4에서 n은 2~120의 정수이다.
  17. 제13항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티(PEG moiety)-분해가능작용기-지질(lipid) 컨쥬게이트는 화학식 1에서 a가 0인 화합물과 a가 1인 화합물의 혼합물인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 a가 0인 화합물과 a가 1인 화합물의 몰비는 0.01~99.9:0.01~99.9인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 지질 나노 입자에서 상기 폴리에틸렌글리콜 모이어티의 함량은 지질 나노 입자를 구성하는 전체 지질 성분의 0.5~50 몰%인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 지질 나노 입자의 크기는 20~200 nm인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  21. 제13항에 있어서, 상기 이온화 지질은 (6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-헤프타트리아콘타 6,9,28,31-테트라엔-19-일4-(디메틸아미노) 부타노에이트(DLin-MC3-DMA), [(4-히드록시부틸)아잔디일]디(헥산-6,1-디일)비스(2-헥실데카노에이트)(ALC-0315), 8-[(2-히드록시에틸)[6-옥소-6-(운데실옥시)헥실]아미노]-옥탄산(SM-102), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일 카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLin-DAP), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLin-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레일 옥시) 프로필아민(DODMA), 지오크타데시르아미드그리시르카르보키시스페르민(DOGS), 스페르민코레스테리르카르바메이트(GL-67);비스-구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤(BGTC), 3β-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일) 콜레스테롤(DC-Chol), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-하이드록시데실) 아미노) 에틸)(2-하이드록시데실) 아미노) 에틸) 피페라진-1-일) 에틸아잔디일) 디도데칸-2-올(C12-200), N-t-부틸-N'-테트라데실 아미노-프로피온아미딘(디C14-아미딘);지메치르지오크타데시르안모니움브로미드(DDAB), N-(1,2-디미리스틸 옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), 디올레일 옥시프로필-3-디메틸하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DORIE), N-(1-(2,3-디올레일 옥실) 프로필)-N-2-(스페르민카르보키사미드)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-디올레오일 트리메틸암모늄 프로판 클로라이드(DOTAP), N-(1-(2,3-디올레일 옥시) 프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 아미노프로필-디메틸-비스(도데실옥시)-프로판 아미늄 브로마이드(GAP-DLRIE)로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  22. 제13항에 있어서, 스테롤 지질과 중성 지질을 추가로 포함하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 스테롤 지질은 콜레스테롤 또는 콜레스테릴 에스터인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 중성 지질은 인지질인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 인지질은 DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), DSPC (distearoylphosphatidylcholine), POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine), EPC (egg phosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG (dioleoylphosphatidylglycerol), DPPG (dipalmitoylphosphatidylglycerol), DSPE (distearoylphosphatidylethanolamine), PE (Phosphatidylethanolamine), DPPE (dipalmitoylphosphatidylethanolamine), DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]), 세라미드(ceramide), 스핑고마이얼린(sphingomyelin) 및 그 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  26. 제13항에 있어서, 상기 약물은 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
  27. 제13항에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥(single-stranded) siRNA, 이중 가닥(double-stranded) siRNA, rRNA, DNA, cDNA, plasmid, 앱타머(aptamer), mRNA, tRNA, lncRNA, piRNA, circRNA, saRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질 나노 입자의 제조방법.
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