KR20230040171A - 동백나무에서 분리된 신규 류코노스톡 메센테로이데스 균주 - Google Patents
동백나무에서 분리된 신규 류코노스톡 메센테로이데스 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 신규 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) DB3 균주는 동백나무에서 분리된 균주로서, 수탁번호 KACC 92362P로 기탁되어 있으며, 우수한 항균 활성, 내산성, 담즙산 내성 및 뮤신 부착능을 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 동백나무에서 분리된 신규 류코노스톡 메센테로이데스 균주에 관한 것이다. 구체적으로 대장균, 살모넬라균, 세레우스균, 황색포도상구균, 칸디다 알비칸스 및 클라비박터 미시가넨시스에 대해 우수한 항균 활성을 나타내며, 우수한 내산성 및 담즙산 내성을 나타내고, 뮤신에 대해 우수한 부착능을 나타낼 수 있는 신규 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria, LAB)은 다양한 환경, 즉, 식물, 곤충, 토양, 물, 유제품, 발효물, 사일리지(silage), 동물의 위장관, 호흡기관 등에서 발견된다[George et al., 2018; Yu et al., 2020]. 이들의 광범위한 서식지는 다양한 스트레스 조건과 영양적 조건들을 유도하는데, 단백질분해효소(protease) 및 지방분해효소(lipase)의 특이 생리적 및 생화학적 특성, 식물 파이토알렉신(phytoalexin)에 대한 내성, 위장관에서의 생존을 위한 담즙산 내성 등과 같은 특수성을 부여한다. 따라서 LAB는 발효식품, 음료, 사일리지 등의 3,500종 이상의 발효에 관여하여 필수적인 역할을 수행한다[Tamang et al., 2016].
자연계의 다양한 유산균들 중 산업적으로 유용한 유산균을 발굴하여 이를 활용하고자 하는 많은 연구들이 이루어지고 있다. 특히 프로바이오틱스로서 유용한 유산균을 발굴하고 이를 프로바이오틱스 제제뿐만 아니라 다양한 식품에 적용함으로써 소비자의 장내 환경을 개선하거나 보호하여 궁극적으로는 건강을 유지할 수 있도록 하기 위한 많은 관련 연구가 이루어지고 있다.
유용한 다양한 유산균들이 발굴 및 연구되었지만, 여전히 다른 유용한 유산균을 새롭게 발굴하여 이용가능한 유용 유산균의 풀(pool)을 늘리는 것이 필요하며, 특히 보다 우수한 특성을 나타낼 수 있는 유산균의 발굴이 필요하다.
이에 본 발명자들은 다양한 자연계 시료로부터 유용하고 우수한 특성, 특히 프로바이오틱스로서의 우수한 특성을 나타낼 수 있는 새로운 유산균을 발굴하고자 하였다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 자연계의 시료로부터 발굴된 유용하고 우수한 특성을 갖는 새로운 유산균을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유산균의 특성을 활용한 물품을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 수탁번호 KACC 92362P로 기탁된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) DB3 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균용 조성물에 있어서, 상기 항균용 조성물은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라균(Salmonella enterica serovar. Typhimurium), 세레우스균(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 항균용인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에 있어서, 상기 식물병은 토마토 궤양병인 것이 바람직하다.
본 발명의 균주는 대장균, 살모넬라균, 세레우스균, 황색포도상구균, 칸디다 알비칸스 및 클라비박터 미시가넨시스에 대해 우수한 항균 활성을 나타내며, 우수한 내산성 및 담즙산 내성을 나타내고, 뮤신에 대해 우수한 부착능을 나타낼 수 있다. 이에 따라 프로바이오틱스로서 활용될 수 있으며, 항균 및 식물병 방제의 용도로도 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 미생물 수탁증을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 살모넬라균(Salmonella enterica serovar. Typhimurium)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 세레우스균(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 배양 온도에 따른 성장력을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 배양 시간에 따른(배양 온도 : 30℃) pH 변화, 성장 곡선 및 젖산 생산능을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 내산성을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 내담즙성을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 뮤신 부착능을 세레우스균(B. cereus)(BC), 살모넬라균(S. Typhimurium)(ST) 및 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다. PBS, 인산 완충 염수(대조군).
도 2는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 살모넬라균(Salmonella enterica serovar. Typhimurium)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 세레우스균(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis)에 대한 항균 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 배양 온도에 따른 성장력을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 배양 시간에 따른(배양 온도 : 30℃) pH 변화, 성장 곡선 및 젖산 생산능을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 내산성을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 내담즙성을 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명 류코노스톡 메센테로이데스 DB3 균주의 뮤신 부착능을 세레우스균(B. cereus)(BC), 살모넬라균(S. Typhimurium)(ST) 및 표준 균주(류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505)(LM)와 비교하여 나타낸 것이다. PBS, 인산 완충 염수(대조군).
본 발명의 신규 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) DB3 균주는 전라남도 영광군 불갑면 모악리 불갑산(불갑사)의 동백나무(Camellia japonica L.)의 꽃에서 분리되어 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 수탁번호 KACC 92362P로 기탁되어 있다(도 1).
본 발명의 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 서열을 가지며(도 2), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라균(Salmonella enterica serovar. Typhimurium), 세레우스균(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis)에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있고, 우수한 내산성 및 담즙산 내성을 나타낼 수 있고, 뮤신에 대해 우수한 부착능을 나타낼 수 있다.
프로바이오틱스 미생물은 섭취된 후 위장을 통과할 때 낮은 pH의 위산과 담즙산에 내성을 갖고 높은 비율로 생존하여 대장으로 이동하고 대장 상피세포에 부착하여 유해 미생물과 경쟁하여 생존하는 등 대사산물의 기능성 뿐만 아니라 장내환경에서의 생존률이 중요한 판단기준이 된다. 본 발명의 균주는 상기와 같이 병원성 세균들에 대한 항균활성을 나타낼 수 있고 낮은 pH와 높은 담즙산에 대한 우수한 생존률을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 장내 부착능도 뛰어나 프로바이오틱스로서의 덕목을 골고루 갖추고 있다. 따라서 본 발명의 균주는 프로바이오틱스로서 유용할 것이며, 우수한 효과를 발휘할 수 있을 것이다.
특히 본 발명의 균주는 매우 우수한(표준 균주인 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505에 비해서도 더욱 우수한) 내산성을 나타낼 수 있으며, 매우 우수한(표준 균주인 류코노스톡 메센테로이데스 KCTC 3505에 비해서도 더욱 우수한) 뮤신 부착력을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 균주는 클라비박터 미시가넨시스에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있어, 식물병 방제를 위해서도 활용할 수 있다. 클라비박터 미시가넨시스는 식물(예를 들어 토마토)에 궤양병을 일으키는 병원균으로, 이의 저해를 통해 관련 식물병을 효과적으로 방제할 수 있다.
본 발명의 균주는 유산균, 특히 류코노스톡 속의 유산균, 특히 류코노스톡 메센테로이데스 종의 유산균을 배양하는데 사용하는 통상의 배양 방법에 따라 배양할 수 있다. 예를 들어, 배지로 MRS 배지를 사용하여 20 내지 40℃의 온도 조건으로 배양할 수 있다. 온도 조건은 보다 바람직하게는 25 내지 37℃, 보다 바람직하게는 28 내지 32℃, 보다 바람직하게는 29 내지 31℃로 한다. 이는 배양 온도를 달리하여 실험한 결과를 바탕으로 하며, 약 30℃에서 최적의 생장을 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명의 프로바이오틱스(probiotics) 조성물은 본 발명의 균주를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때 본 발명의 균주는 균체의 건조물, 예를 들어 동결건조물의 형태일 수 있다. 상기와 같은 균체의 건조물은 균체를 건조시켜 건조물, 예를 들어 동결건조분말의 형태로 제조하는 통상의 처리방법을 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 조성물 중 본 발명의 균주를 다양한 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 본 발명 균주의 균체 동결건조분말을 0.01 내지 100중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 프로바이오틱스 조성물에는, 실질적으로, 본 발명의 균주만이 프로바이오틱스로서 포함된다. 다시 말해, 본 발명의 프로바이오틱스 조성물 중 본 발명의 균주만이 유일한 프로바이오틱스로서 포함되고, 다른 프로바이오틱스는 포함되지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 프로바이오틱스 조성물에는 본 발명의 균주 이외에도 다른 프로바이오틱스가 함께 포함된다. 이때 다른 프로바이오틱스에는 다른 속의 프로바이오틱스, 같은 속이지만 종이 다른 프로바이오틱스, 및 속 및 종이 같지만 다른 균주의 프로바이오틱스가 포함된다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물에는 본 발명의 균주 이외에 첨가제, 예를 들어 완충제, 희석제, 부형제 등의 프로바이오틱스 제제에 통상적으로 사용되는 첨가제가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때 본 발명의 균주는 위에서 언급한 바와 같이 균체의 건조물, 예를 들어 동결건조물의 형태일 수 있다.
본 발명 균주의 배양물은 위에서 설명한 바와 같은 방법에 따라 본 발명의 균주를 배양하여 수득할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명 균주의 배양물은 액체배지에서 배양한 배양물에서 균체를 제거한 배양액이다. 다른 실시형태에서, 본 발명 균주의 배양물은 상기 배양액을 동결건조한 동결건조분말이다. 균체의 제거는 원심분리, 여과 등의 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 본 발명 균주의 배양물에는 이 밖에도 배양물을 추출 등의 방법으로 추가 가공한 물질도 포함된다.
본 발명의 항균용 조성물은 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 다양한 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 본 발명 균주의 균체 동결건조분말을 0.01 내지 100중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 예를 들어, 조성물 중 본 발명 균주 배양액의 동결건조분말을 0.01 내지 100중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항균용 조성물에는, 실질적으로, 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 만이 항균 물질로서(항균의 유효성분으로서) 포함된다. 다시 말해, 본 발명의 항균용 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 만이 항균 활성을 나타내는 유일한 물질로서 포함되고, 다른 항균 물질은 포함되지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항균용 조성물에는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에도 다른 항균 물질이 함께 포함된다. 이때 다른 항균 물질에는 통상적인 항균성 화합물, 항균 활성을 갖는 다른 미생물 또는 이의 배양물이 포함된다.
본 발명의 항균용 조성물에는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 첨가제, 예를 들어 완충제, 희석제, 부형제 등의 항균 제제에 통상적으로 사용되는 첨가제가 더 포함될 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 균주는 대장균, 살모넬라균, 세레우스균, 황색포도상구균, 칸디다 알비칸스 및 클라비박터 미시가넨시스에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 항균용 조성물은 상기 미생물들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 항균용인 것이 바람직하다.
본 발명의 식품 조성물 또한 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때 본 발명의 균주 및 이의 배양물에 관한 사항은 위에서 프로바이오틱스 조성물 및 항균용 조성물에서 언급한 사항과 동일할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 다양한 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 본 발명 균주의 균체 동결건조분말을 0.001 내지 10중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 예를 들어, 조성물 중 본 발명 균주 배양액의 동결건조분말을 0.001 내지 10중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태, 예를 들어 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수와 같은 형태의 식품 조성물일 수 있으며, 바람직하게는 유가공품 형태의 식품 조성물이다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물 또한 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때 본 발명의 균주 및 이의 배양물에 관한 사항은 위에서 프로바이오틱스 조성물 및 항균용 조성물에서 언급한 사항과 동일할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물은 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물을 다양한 함량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물 중 본 발명 균주의 균체 동결건조분말을 0.01 내지 10중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 예를 들어, 조성물 중 본 발명 균주 배양액의 동결건조분말을 0.01 내지 10중량%로 함유할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 식물병 방제용 조성물에는, 실질적으로, 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 만이 식물병 방제 활성 물질로서(식물병 유발 병원체에 대한 항균의 유효성분으로서) 포함된다. 다시 말해, 본 발명의 식물병 방제용 조성물 중 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 만이 식물병 방제 효과를 나타내는 유일한 물질로서 포함되고, 다른 식물병 방제 활성 물질은 포함되지 않는다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 식물병 방제용 조성물에는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에도 다른 식물병 방제 활성 물질이 함께 포함된다. 이때 다른 식물병 방제 활성 물질에는 통상적인 식물병 방제 활성 화합물, 식물병 방제 활성을 갖는 다른 미생물 또는 이의 배양물이 포함된다.
본 발명의 식물병 방제용 조성물에는 본 발명의 균주 또는 이의 배양물 이외에 첨가제, 예를 들어 완충제, 희석제, 부형제 등의 식물병 방제용 제제에 통상적으로 사용되는 첨가제가 더 포함될 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 균주는 클라비박터 미시가넨시스에 대해 우수한 항균 활성을 나타낼 수 있다. 그리고 이 클라비박터 미시가넨시스는 식물 궤양병, 특히 토마토 궤양병을 주로 유발한다. 따라서 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 식물 궤양병 방제용인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 토마토 궤양병 방제용이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1. 균주 분리
전라남도 영광군 불갑면 모악리 불갑산(불갑사)에서 채집한 동백나무의 꽃(동백꽃) 한 송이를 균주 분리를 위한 시료로 사용하였다. 시료를 500㎖ 멸균수로 3회 세척하고 물기가 제거된 시료에 20㎖ 멸균수를 첨가하여 막자사발에서 완전히 으깬 후, 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액은 연속희석법으로 10-1 ~ 10-5으로 희석하였으며, 10-5 희석액 1㎖에서 200㎕씩을 분취하여 MRS 고체배지에 도말하고 30℃에서 24시간 동안 호기 조건에서 배양하였다. 생성된 콜로니 중에서 24개의 콜로니를 새로운 MRS 고체배지에 옮겨 희석식 계대법으로 순수배양하여 단일 균주 DB3를 확보하였다. 단일 균주로 확보된 DB3 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 1㎖씩 분취하여 13,500rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 취하여 0.2㎛ 시린지 필터로 여과한 후 -20℃에 보관하면서 다음 실험의 시료로 사용하였다.
실시예 2. 균주의 특성 평가
2-1. 실험 방법
2-1-1. 항균 활성 평가
마이크로티터 플레이트(microtiter plate) 방법을 사용하여 DB3 균주의 Escherichia coli ATCC 10536(EC), Salmonella enterica serovar. Typhimurium KCTC 12401(ST), Bacillus cereus ATCC 11778(BC), Staphylococcus aureus ATCC 6538(SA), Candida albicans KCTC 7122(CA) 및 식물병원성 Clavibacter michiganensis(CM)에 대한 항균 활성을 측정하였다.
항균 활성 분석을 위해 DB3 균주를 MRS 액체배지에 30℃, 12 ~ 16시간(overnight, O/N) 전배양하고 배양 상등액을 항균 활성 평가 시료로 사용하였다.
마이크로티터 플레이트에 실험 미생물인 E. coli, S. Typhimurium, B. cereus, S. aureus 및 C. michiganensis는 5㎖ LB 액체배지에 1%로 접종하여 37℃에서 12 ~ 16시간(overnight, O/N) 전배양한 후 106 CFU/㎖로 조정하여 실험에 사용하였고, C. albicans는 5㎖ YM 액체배지에 1%로 접종하여 30℃에서 12 ~ 16시간(overnight, O/N) 전배양한 후 106 CFU/㎖로 조정하여 실험에 사용하였다. DB3 배양 상등액을 첨가(10, 12.5, 25 또는 50㎕)하고, 각 실험 미생물을 106 CFU/㎖로 조정한 액을 50㎕ 첨가한 후, 나머지는 LB 또는 YM 배지로 200㎕로 조정하였다. 조성된 반응액을 37℃ 또는 30℃에서 24시간 배양한 후 600㎚에서 흡광도를 측정하여 실험 미생물의 성장률을 측정하였다. 이때 DB3 배양 상등액을 첨가하지 않은 대조군을 함께 사용하였으며, 대조군의 실험 미생물 성장률을 기준(100%)으로 설정하여 이에 대한 실험군의 상대적인 실험 미생물 성장률을 확인하였다.
2-1-2. 균주 동정
DB3 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하고 이 서열을 토대로 NCBI BLAST를 수행하였다.
2-1-3. 성장 특성 분석
먼저 DB3 균주의 온도별 생장 특성을 조사하였다. 이때 비교를 위한 표준 균주로 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) KCTC 3505를 사용하였으며, 이 표준 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양받아 사용하였다.
DB3 균주 및 표준 균주를 25, 30 및 37℃에서 배양하면서, 배양액의 600㎚ 흡광도를 측정하여 각 온도에서의 성장력을 비교하였다.
DB3 균주 및 표준 균주를 100㎖ 배지에 1/100로 접종하고, 30℃에서 배양하면서 3시간 간격으로 샘플링하였다. 샘플링된 시료의 pH를 측정하여 성장에 따른 pH 변화를 조사하였다.
또한 샘플링된 시료의 젖산 함량을 HPLC 분석법으로 측정하였다. 이때 Aminex 87H 컬럼(300x10㎜, Bio-Rad, USA)을 이용한 Ultimate3000(Thermo Dionex, USA)을 사용하였고, RI(ERC, RefractoMAX520, Japan)로 UV 210㎚에서 검출하였으며, 이동상은 0.01N H2SO4를 사용하여 0.5㎖/분의 유속으로 30분간 수행하였다. 표준품으로 젖산나트륨염(lactic acid sodium salt, Fluka)을 사용하였다.
2-1-4. 내산성 및 내담즙성 분석
내산성 및 내담즙성 분석은 이전에 수행된 연구 방법에서 약간 수식한 방법을 사용하여 수행하였다[Ji et al, 2015; Mohd Yusof et al., 2020].
간략히 서술하면, 내산성 분석의 경우 9㎖ MRS 배지의 pH를 HCl로 pH 2.5 ~ 4.0으로 조정한 후, 12 ~ 16시간 배양된 1㎖의 균주 배양액을 첨가하고 30℃에서 4시간 동안 배양 후 생존 개체수를 조사하였다.
내담즙성 분석은 상기 내산성 분석과 동일한 방법으로 수행하되, pH를 조절하는 대신 0.6 ~ 1.2%(0.3% 간격)가 되도록 oxgall(Oxoid, Bstingstoke, UK)을 첨가하여 수행하였다.
2-1-5. 뮤신 부착 능력 평가
돼지 위 type III 뮤신(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 10㎎/㎖의 농도로 PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.5)에 용해시켰다. 제조된 뮤신 용액을 사용하고, 이전 수행된 연구 방법을 약간 수식한 방법을 사용하였다[Radziwill-Bienkowska et al., 2016]. 간략히 서술하면, 1㎎/㎖ 뮤신을 마이크로티터 플레이트에 처리하여 30℃에서 30분 처리한 후, 4℃에서 16시간 방치하여 부착하였다. PBS 완충액으로 3회 세척한 후 107 CFU/㎖의 시험대상 균주를 첨가하여 실온에서 3시간 또는 30℃에서 24시간 반응하였다. 부착되지 않은 균주는 PBS 완충액으로 3회 세척하여 제거한 후, 100㎕ 0.1% crystal violet을 첨가하여 실온에서 30분 반응한 후, PBS 완충액으로 3회 세척하였다. 100㎕ 30% 초산을 첨가하여 미생물에 부착된 crystal violet을 용출하여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 뮤신 결합력을 평가하였다.
2-1-6. 통계분석
반복 실험을 통하여 얻은 결과는 SAS 프로그램(V. 9.2, Cary, NC, USA)을 사용하여 분산분석하였으며, 시료에 대한 결과는 평균ㅁ표준편차로 나타내었다. 각 시료의 분석결과에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test(DMRT)를 실시하였다.
2-2. 실험 결과
2-2-1. 항균 활성 분석 결과
DB3 균주의 배양 상등액의 첨가에 의해 E. coli, S. Typhimurium, B. cereus, S. aureus, C. albicans 및 C. michiganensis의 성장이 유의적으로 저해되며, 이러한 성장 저해는 농도의존적인 것으로 나타났다(도 3 내지 8).
2-2-2. 균주 동정 결과
16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 NCBI BLAST를 수행한 결과, DB3 균주는 Leuconostoc mesenteroides 균주들과 99% 이상(<99.79%)의 높은 상동성을 보였다. 특히, 표준균주 L. mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum DSM 20484와 99.60%, L. mesenteroides subsp. jonggajibkimchi DRC 1506 및 L. mesenteroides subsp. cremoris JCM 20044와 99.53%의 상동성을 보였다. 따라서 DB3 균주를 Leuconostoc mesenteroides의 한 균주로 동정하여, L. mesenteroides DB3으로 명명하였다.
2-2-3. 성장 특성 분석 결과
DB3 균주의 생육 최적 온도를 조사하기 위해, DB3 균주를 각각 25, 30 및 37℃에서 배양하였다. 이의 결과, DB3 균주는 30℃에서 생육이 가장 우수한 것으로 나타났다(도 9).
30℃에서 배양 시간에 따른 성장력을 분석해 본 결과, DB3 균주는 성장력이 지연되는 양상을 보인 18시간에 정지기에 접어드는 것으로 나타났다(도 10). 표준 균주는 배양시간 12시간째에 정지기에 도달되는 것으로 관찰되어 DB3 균주에 비교하여 빠른 시간에 정지기에 도달되는 것으로 관찰되었다. 배양 시간에 따른 pH 변화는 DB3 균주의 pH가 표준 균주에 비교하여 더 빠르게 감소되는 것으로 나타났다(도 10). DB3 균주의 젖산 생산은 초기에 표준 균주보다 빠른 속도로 높아지는 경향을 보였다(도 10).
2-2-4. 내산성 및 내담즙성 분석 결과
위액에 대한 내산성과 담즙산에 대한 내성은 프로바이오틱스 미생물이 갖춰야 할 기본적인 특성 중 하나이다. 보통 위에서 분비되는 염산은 pH 0.78 ~ 0.9를 유지하지만 음식물이 유입되면 pH 2.0 ~ 3.0으로 상승하는데, 미생물의 생존은 pH에 대한 저항성에 따른 것으로 알려져 있다. 실험 결과, pH 3.0 ~ 4.0의 조건에서는 DB3 균주와 표준 균주 L. mesenteroides KCTC 3505의 생존 개체수에서 큰 차이가 없었으나, pH 2.5의 조건에서는 DB3 균주의 생존 개체수가 5.2×107 CFU/㎖, 표준 균주의 생존 개체수가 5.6×106 CFU/㎖로, DB3 균주의 생존 개체수가 표준 균주의 생존 개체수에 비해 상당히 높은 것으로 나타났다(도 11). 이는 pH 2.5의 산성 조건에서 DB3 균주가 보다 잘 생존할 수 있다는 것을 의미하며, 이에 따라 산성 조건의 위를 지나 장까지 안전하게 도달하는데 보다 유리할 것으로 판단된다.
담즙산은 소장의 상부에서 분비되어 장내 음식물의 소화와 흡수를 촉진할 뿐만 아니라 외부 미생물을 침입을 막는 살균작용을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 프로바이오틱스 미생물을 선별하는데 담즙산 내성을 평가하고 있으며, 그 농도는 장내 담즙산 농도 0.3%를 기준으로 하고 있다. DB3 균주의 담즙산 내성은 처리된 모든 oxgall 농도에서 표준 균주 L. mesenteroides KCTC 3505와 비슷한 수치를 보였으며, 최종 농도 1.2%에서도 높은 생존률을 보였다(도 12). DB3 균주가 장내 담즙의 농도인 0.3%보다 훨씬 높은 1.2% oxgall의 농도에서 높은 생존률을 보인 내담즙성 결과를 토대로, DB3 균주는 소장을 통과할 때 담즙산의 영향을 받지 않고 대장으로 이동할 수 있을 것으로 판단된다.
기존 보고(Kang et al., 2012)에 의하면 L. carnosum KCTC 3525와 L. citreum KCTC 3526는 pH 2.0에서 생존률이 각각 0.0%와 0.01%이었고, 0.3%의 oxgall 존재하에서 각각 33.1%와 47.5%의 생존률을 보인 것으로 보고하였다. 이를 토대로 DB3 균주는 Leuconostoc 속 다른 균주들 보다 프로바이오틱스로서 적용가능성이 높을 것으로 기대된다.
2-2-5. 뮤신 부착 능력 평가
뮤신 부착능 평가 결과, DB3 균주는 비교 균주로 사용된 S. Typhimurium과 B. cereus 보다 약 4배 이상 부착능이 높았으며, 표준 균주 Leuconostoc mesenteroides KCTC 3505와 비교하여 약 1.25배 부착능이 우수한 것으로 나타났다(도 13).
<110> National Institute of Biological Resources
<120> Novel Leuconostoc mesenteroides strain isolated from Camellia
japonica L.
<130> ALP21018
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Leuconostoc mesenteroides DB3
<400> 1
agacttcacc ccagtcatct gtcctgcctt agacggctcc ttcctaaaag gttaggccac 60
cggctttggg cattacaaac tccccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa 120
asgttwttca cccgcggcgt gctgatccgc gattactagc gattccgact tcatgtagtc 180
gagttgcaga ctacaatccg aactgagacg tactttaaga gattagctca ccctcgcggg 240
ttggcaactc gttgtatacg ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat aaggggcatg 300
atgatctgac gtcgtccccg ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctcg ctagagtgcc 360
catctgaatg ctggcaacta acaataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat 420
ctcacgacac gagctgacga cgaccatgca ccacctgtca ctttgtctcc gaagagaaca 480
cttctatctc taaaagcttc aaaggatgtc aagacctggt aaggttcttc gcgttgcttc 540
gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggtccccgt caattccttt gagtttcaac 600
cttgcggtcg tactccccag gcggaacact taatgcgtta gcttcggcac taagaggcgg 660
aaacctccta acacctagtg ttcatcgttt acggtgtgga ctaccagggt atctaatcct 720
gtttgctacc cacactttcg agcctcaacg tcagttgcag tccagtaagc cgccttcgcc 780
actggtgttc ttccatatat ctacgcattc caccgctaca catggagttc cacttacctc 840
tactgcactc aagttaacca gtttccaatg ccattccgga gttgagctcc gggctttcac 900
atcagactta ataaaccgtc tgcgctcgct ttacgcccaa taaatccgga taacgctcgg 960
gacatacgta ttaccgcggc tgctggcacg tatttagccg tccctttctg gtatggtacc 1020
gtcaaactaa aatcatttcc tattctagct gttcttccca tacaacagtg ctttacgacc 1080
cgaaagcctt catcacacac gcggcgttgc tccatcaggc tttcgcccat tgtggaagat 1140
tccctactgc agcctcccgt aggagtttgg gccgtgtctc agtcccaatg tggccgatca 1200
gtctctcaac tcggctatgc atcattgtct tggtaggcct ttaccccacc aactaactaa 1260
tgcaccgcgg atccatctct aggtgacgcc gaagcgcctt ttaactttgt gtcatgcgac 1320
actaagtttt attcggtatt agcatctgtt tccaaatgtt atccccagcc ttgaggcagg 1380
ttgtccacgt gttactcacc cgttcgccac tcacttgaaa ggtgcaagca cctttcgctg 1440
tgcgttcgac ttgcatgtat taggcacgcc gccagcgttc atcctgag 1488
Claims (7)
- 수탁번호 KACC 92362P로 기탁된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) DB3 균주.
- 제1항의 균주를 포함하는 프로바이오틱스 조성물.
- 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 항균용 조성물.
- 제3항에 있어서,
상기 항균용 조성물은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라균(Salmonella enterica serovar. Typhimurium), 세레우스균(Bacillus cereus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 항균용인, 항균용 조성물. - 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식품 조성물.
- 제1항의 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 식물병 방제용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 식물병은 토마토 궤양병인, 식물병 방제용 조성물.
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Non-Patent Citations (1)
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| Appl. Environ. Microbiol., Vol.77(22), pp.8164-8170(2011.11.) * |
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