KR20230038627A - 원형 rna 및 그의 이용 - Google Patents

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KR20230038627A
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박영근
조병문
무투마니 카
조영란
허훈
김신영
송민아
김보영
정지윤
이지원
조현준
정미선
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Abstract

본 발명은 원형 RNA 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 내에서 선형 RNA보다 안정한 원형 RNA에 관한 것이다. 본 발명에 따른 원형 RNA는 RNase를 처리하였음에도 선형 RNA보다 안정성이 높고, 오랜시간 보관하여도 선형 RNA보다 안정성이 높은 것을 실험적으로 확인하였다. 이는 본 발명의 원형 RNA가 시험관 내 또는 생체 내에서 안정성이 높은바, 시험관 내 또는 생체 내에서 목적 단백질의 발현을 오랫동안 유지할 수 있음을 의미한다. 따라서 본 발명의 원형 RNA는 목적 질환의 예방 또는 치료를 위한 플랫폼; 또는 목적 질환의 감염 예방을 위한 백신 플랫폼;으로 다양하게 활용될 수 있다.

Description

원형 RNA 및 그의 이용{circular RNA and use thereof}
본 발명은 원형 RNA 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생체 내에서 선형 RNA보다 안정한 원형 RNA에 관한 것이다.
Circular RNA(circRNA)라고 불리는 새롭게 기술된 RNA는 최근 몇 년 동안 높은 처리량의 RNA 시퀀싱 기술의 발달로 인해 많은 주목을 받고 있다. 기존의 선형 RNA와 비교하여 circRNA는 3'-5' 공유적으로 닫힌 고리이며, 안정적으로 유지하기 위해 5'-캡 또는 3'-폴리 A 꼬리가 필요없다. 상기 circRNA는 광범위한 세포에서 발견되었으며 대부분은 비암호화 RNA(noncoding RNA, ncRNA)이다. circRNA의 구성 요소에 따라 circRNA는 exonic RNA(ecircRNA), exon-intron RNA(EIcircRNA) 또는 intronic RNA(ciRNA)으로 분류된다. 그 중 ecircRNA는 주요 circRNA로, 주로 in vivo에서 backsplicing이라는 과정에 의해 생성된다. EcircRNA는 주로 세포질에 위치하며 다양한 기능을 한다. circRNA의 가장 잘 알려진 기능은 circRNA CDR1as 및 Sry와 같은 microRNA(miRNA) 스폰지이다. circRNA는 또한 단백질 복합체에 대한 단백질 스폰지 및 스캐폴드 역할을 하는 것으로 입증되었다. 또한 circRNA는 mRNA 수준의 번역 및 안정성과 단백질의 활성을 조절하는 역할도 한다. 최근 바이오 마커로서 circRNA는 초파리의 연령의존적 신경 축적과 관련이 있는 것으로 입증되었으며, 암이나 다른 질병에도 관여할 수 있다고 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 기존 플랫폼에 비해 안정성이 향상된 원형 RNA 플랫폼을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 프로모터; 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site, IRES); 단백질 코딩 영역; 3' UTR(Untranslated Region); 폴리 A(poly A); 및 5' 스플라이싱 부위(5' splicing site)를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편(5' group I intron fragment)을 포함하는 원형 RNA의 생산을 위한 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 내부 리보솜 진입 부위; 단백질 코딩 영역; 3’ UTR; 폴리 A; 및 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편;을 포함하는 원형 RNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 원형 RNA 생산을 위한 벡터; 또는 상기 원형 RNA;를 포함하는, 목적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 원형 RNA 생산을 위한 벡터; 또는 상기 원형 RNA;를 포함하는 목적 질환 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 원형 RNA의 생산을 위한 벡터 또는 상기 원형 RNA;를 세포에 형질도입시키는 단계를 포함하는, 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 원형 RNA의 생산을 위한 벡터를 제공한다:
1) 프로모터;
2) 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site, IRES);
3) 단백질 코딩 영역;
4) 3' UTR(Untranslated Region);
5) 폴리 A(poly A); 및
6) 5' 스플라이싱 부위(5' splicing site)를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편(5' group I intron fragment).
또한 본 발명은 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 원형 RNA를 제공한다:
1) 내부 리보솜 진입 부위;
2) 단백질 코딩 영역;
3) 3' UTR;
4) 폴리 A; 및
5) 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편.
또한 본 발명은 상기 원형 RNA 생산을 위한 벡터; 또는 상기 원형 RNA;를 포함하는, 목적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 원형 RNA 생산을 위한 벡터; 또는 상기 원형 RNA;를 포함하는 목적 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 원형 RNA의 생산을 위한 벡터 또는 상기 원형 RNA를 세포에 형질도입시키는 단계를 포함하는, 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 원형 RNA는 RNase를 처리하였음에도 선형 RNA보다 안정성이 높고, 오랜시간 보관하여도 선형 RNA보다 안정성이 높은 것을 실험적으로 확인하였다. 이는 본 발명의 원형 RNA가 시험관 내 또는 생체 내에서 안정성이 높은바, 시험관 내 또는 생체 내에서 목적 단백질의 발현을 오랫동안 유지할 수 있음을 의미한다. 따라서 본 발명의 원형 RNA는 목적 질환의 예방 또는 치료를 위한 플랫폼; 또는 목적 질환의 감염 예방을 위한 백신 플랫폼;으로 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 전기영동을 통해 선형 RNA인 mRNA-S 및 원형 RNA인 circRNA-S를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 RNase 처리에 따른 선형 RNA인 mRNA-S 및 원형 RNA인 circRNA-S의 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 시간에 따른 선형 RNA인 mRNA-S 및 원형 RNA인 circRNA-S의 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 Splicing junction site sequencing을 통해 3’ splicing site가 없는 pCircRNA의 splicing site를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하였다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 원형 RNA의 생산을 위한 벡터를 제공한다:
1) 프로모터;
2) 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site, IRES);
3) 단백질 코딩 영역;
4) 3' UTR(Untranslated Region);
5) 폴리 A(poly A); 및
6) 5' 스플라이싱 부위(5' splicing site)를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편(5' group I intron fragment).
본 발명에 있어서, "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 벡터(vector)는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 사용 가능한 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pGLS, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, ME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λCharon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
또한 본 발명의 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 TK 프로모터가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명에 있어서, 단백질 코딩 영역은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 의미한다. 단백질 코딩 영역은 치료 효능을 갖는 단백질, 항원 단백질, 항체 등을 코딩하는 영역일 수 있으며, 어떠한 목적 단백질을 암호화하는 유전자라도 적용 가능하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 벡터는 내부 리보솜 진입 부위의 상류(upstream)에 3' 스플라이싱 부위(3’ splicing site)를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 벡터의 구조는 도 4의 pCircRNA-ver2.0 로 나타내었다.
본 발명의 구체예에서, 상기 벡터는 상기 1) 내지 6)의 요소가 순차적으로 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 벡터는 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 것이 바람직하다:
1) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터;
2) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 내부 리보솜 진입 부위;
3) 단백질 코딩 영역;
4) 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 3' UTR;
5) 폴리 A; 및
6) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편.
또한, 전술한 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 염기서열의 변이체는 서열목록에 기재된 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 서열목록에 기재된 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편은 Anabaena pre-tRNA 유래인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 내부 리보솜 진입 부위는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 유래일 수 있고, 동질의 활성을 나타내는 내부 리보솜 진입 부위라면 제한없이 적용 가능하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 폴리 A는 50 내지 300bp인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 100 내지 200bp일 수 있으며, 가장 바람직하게는 151bp인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 벡터는 변형된 핵산, 천연 핵산 또는 비천연 핵산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 벡터는 자가 스플라이싱(self-splicing)에 의해 원형 RNA를 생산할 수 있고, 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 자가 스플라이싱에 의해 절단되는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 자가 스플라이싱에 의해 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단의 1 내지 50 nt가 절단되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 28 nt가 절단되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 벡터의 내부 리보솜 진입 부위는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 중첩되는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 1 내지 10 nt 중첩되는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 7 nt 중첩되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 원형 RNA를 제공한다:
1) 내부 리보솜 진입 부위;
2) 단백질 코딩 영역;
3) 3' UTR;
4) 폴리 A; 및
5) 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편.
본 발명의 구체예에서, 상기 원형 RNA는 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 원형 RNA인 것이 바람직하다:
1) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터;
2) 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 내부 리보솜 진입 부위;
3) 단백질 코딩 영역;
4) 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 3' UTR;
5) 폴리 A; 및
6) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편.
본 발명의 구체예에서, 상기 원형 RNA는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단의 1 내지 50 nt가 절단된 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 28 nt가 절단된 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 원형 RNA는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 중첩된 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 상기 원형 RNA는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 1 내지 10 nt 중첩된 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 7 nt 중첩된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 원형 RNA는 RNase 처리 조건 및 장기 보관 조건에서 선형 RNA보다 안정성이 매우 높은 것을 실험적으로 확인하였다. 이는 본 발명의 원형 RNA가 다양한 조건에서도 목적 단백질을 안정적이고 지속적으로 발현시킬 수 있음을 의미한다. 따라서 본 발명의 원형 RNA는 목적 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약 용도; 목적 질환의 감염 예방을 위한 백신 용도; 및 목적 단백질의 발현 방법;을 포함한 다양한 분야에서 플랫폼 기술로 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 원형 RNA의 생산을 위한 벡터; 또는 원형 RNA;를 포함하는 목적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 원형 RNA의 생산을 위한 벡터 및 원형 RNA는 단백질 코딩 영역을 포함한다. 상기 단백질 코딩 영역은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 의미하는데, 상기 목적 단백질이 특정 질환(즉, 목적 질환)의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 경우 목적 질환에 대한 의약 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 원형 RNA 생산을 위한 벡터; 또는 상기 원형 RNA;를 포함하는 목적 질환 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 원형 RNA 생산을 위한 벡터; 및 원형 RNA;에 포함된 단백질 코딩 영역은 항원 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 항원 단백질을 코딩하는 유전자는 본 발명의 실시예에서 사용한 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 스파이크 유전자일 수 있으며, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 백신은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, 목적 질환에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 PCV2는 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 유효 성분인 원형 RNA 생산을 위한 벡터; 및 원형 RNA; 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역 증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전 일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판(Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 원형 RNA의 생산을 위한 벡터 또는 상기 원형 RNA를 세포에 형질도입시키는 단계;를 포함하는, 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 원형 RNA의 생산을 위한 벡터 및 원형 RNA는 단백질 코딩 영역을 포함하는데, 상기 단백질 코딩 영역에는 다양한 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 원형 RNA는 RNase 처리 조건 및 장기 보관 조건에서 선형 RNA보다 안정성이 매우 높은바, 이는 본 발명의 원형 RNA가 세포 내에서 목적 단백질을 안정적이고 지속적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 원형 RNA의 생산을 위한 벡터 또는 상기 원형 RNA를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 목적 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 개체는 목적 단백질이 치료 효능을 나타내는 질환이 발병할 것으로 예상되는 개체; 발병한 개체; 또는 완치판정을 받은 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 목적 단백질은 원형 RNA 생산을 위한 벡터 또는 원형 RNA에 포함된 ‘단백질 코딩 영역’으로 암호화되는 단백질을 의미한다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하였다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. In vitro transcription(IVT)을 통한 linear 및 circular RNA 준비
본 실험에서는 원형 RNA 생산을 위한 벡터로 pCircDNA-S 및 pCircDNA-eGFP를 이용하였으며, 이를 이용하여 원형 RNA(CircDNA-S, CircDNA-eGFP)를 생산하였다. 원형 RNA 생산을 위한 벡터는 1) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터; 2) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 내부 리보솜 진입 부위; 3) 단백질 코딩 영역; 4) 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 3' UTR; 5) 폴리 A; 및 6) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편;이 순차적으로 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 한다. 본 실험의 pCircDNA-S는 상기 단백질 코딩 영역 부분에 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 스파이크 유전자를 적용하였고, pCircDNA-eGFP는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 eGFP 유전자를 적용하였다. 상기 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편은 Anabaena pre-tRNA 유래이고, 상기 내부 리보솜 진입 부위는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 유래이다. 또한 상기 벡터에 포함된 폴리 A는 151 bp이다.
본 실험의 대조군은 선형 RNA 생산을 위한 벡터 pDNA-S 및 pDNA-eGFP를 이용하여 생산된 선형 RNA(mRNA-S, mRNA-eGFP)를 사용하였다. 상기 선형 RNA 생산을 위한 벡터 pDNA-S 및 pDNA-eGFP는 각각 서열번호 15 및 17의 염기서열로 표시되고, 이를 이용하여 생산된 선형 RNA인 mRNA-S 및 mRNA-eGFP는 각각 서열번호 15 및 17의 염기서열로 표시된다.
1-1. pDNA-S와 pDNA-eGFP, pCircDNA-S, pCircDNA-eGFP의 linearization
IVT를 수행하기 앞서 plasmid DNA를 사용하여 각 시료의 linearization을 진행하였다. 구체적으로, 각각의 시료 30 μg을 사용하여 restriction enzyme(2U/μg), 5x enzyme reaction buffer, nuclease free water를 시료의 총 부피가 300 μL가 되도록 혼합하였다. 각각의 시료를 37°C, overnight incubation을 실시하였다. 시료의 정제를 위해 UltraPure™ Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1, v/v)(Invitrogen)을 시료와 동일한 부피로 넣어 inverting한 후, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 수층을 따서 새로운 E.P tube에 옮겨 담은 후, 수층 volume의 2.5배 100% EtOH와 1/10 3M NaOAc(pH5.2)를 넣어 inverting 한 후, 가능한 최대 속도로 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고, washing을 위해 70% EtOH 500 μl를 넣고 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. EtOH를 완벽하게 제거한 후, RNase-free water로 DNA pellet을 resuspension하였다. Nanodrop(Thermo-fisher scientific)을 이용하여 농도와 순도를 측정하였다.
1-2. In vitro transcription(IVT)
IVT는 Linearization 된 주형 DNA를 이용하여 시험관 내에서 T7 RNA polymerase를 사용하여 RNA를 합성하는 과정이다. EZ™ MEGA T7 Transcription Kit(Enzynomics)의 제조업체의 지침에 따라 linearization DNA를 이용하여 IVT를 실시하였다. pDNA-S와 pDNA-eGFP는 linear RNA form이기 때문에 mRNA 안정성을 위해 IVT 과정에 ARCA(8mM)(New England Biolabs)를 혼합하여 반응시켰다. 각 시료는 37°C에서 1시간 40분 반응시키고, DNase I(2 μl/1 rxn)을 넣어 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. EZ™ MEGA T7 Transcription Kit(Enzynomics)에 포함되어 있는 Lithium Chloride(LiCl) Precipitation Solution을 이용하여 RNA를 정제하였다. LiCl Precipitation Solution을 반응액의 절반 부피만큼 넣고 완전히 혼합하였고, -20℃에서 30분 이상 유지하였다. 그 후 가능한 최대 속도로 4℃에서 15분간 원심분리하였고, 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 세척을 위해 70% EtOH 700 μl를 넣고 위와 같은 조건으로 재 원심분리하였다. EtOH를 완벽하게 제거한 후 RNase-free water로 RNA pellet을 resuspension하였다. Nanodrop(Thermo-fisher scientific)을 이용하여 수득된 circRNA-S(서열번호 11), circRNA-eGFP(서열번호 13), mRNA-S(서열번호 15) 및 mRNA-eGFP(서열번호 17)의 농도와 순도를 측정하였다.
상기 원형 RNA인 circRNA-S 및 circRNA-eGFP는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단의 28 nt가 절단되고, 내부 리보솜 진입 부위의 5’ 말단이 5’ 스플라이싱 부위와 7 nt가 중첩된 것을 특징으로 한다.
1-3. RNA denatured gel electrophoresis
(1) Running Buffer 및 Gel components
IVT가 완료된 mRNA의 integrity를 확인하기 위해 Mupid-One(mupid)의 Gel 상에서 분리하였다. 구체적으로, Running buffer를 총 1L의 부피로 D.W 948 mL, 1M sodium phosphate 10 mL, 37% HCHO(formaldehyde) 42 mL를 혼합하여 제조하였다. Agarose gel은 아래의 표 1과 같은 조성으로 제조하였다.
1 ea
Agarose 0.5 g
1M sodium phosphate 1 mL
37% HCHO 4 mL
D.W 45 mL
(2) mRNA-S 와 circRNA-S의 준비
RiboRuler High Range RNA Ladder(Thermo-fisher scientific) 2 μL와 2x RNA loading dye(Thermo-fisher scientific) 4 μL의 부피로 혼합하여 준비하였다. 시료는 0.5 - 2μg을 준비하여 2X RNA loading dye, nuclease free water를 총 8 μL의 부피가 되도록 혼합하여 70°C에서 5분간 반응시켰다. 각각의 시료를 gel에 loading한 후 100 V로 1시간 전기영동 실시하였다. 전기영동 밴드를 확인하기 위해 Agarose gel을 Gel-doc system(Azure)으로 확인하였다. 전기영동 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, linear RNA form인 mRNA-S 및 circular RNA form인 circRNA-S를 확인하였다.
실시예 2. RNase R 처리에 따른 circRNA와 linearRNA의 비교
각각의 시료 20 μg을 물에 희석(43 μl 최종 부피)한 다음 65 ℃에서 3분 동안 가열하고, 3분 동안 냉각하였다. 20U RNase R 및 10μL의 10x RNase R buffer(Epicenter)를 첨가하고, 반응물을 37 ℃에서 15 분 동안 반응시켰다. 그 후 추가 10U RNase R을 반응 중간에 첨가하였다. 반응이 끝난 시료는 RNA cleanup kit(NEB)로 purification을 수행하였다. 정제한 3종의 RNA sample을 nanodrop(Thermo Fisher Scientific) 으로 농도를 측정하였다. 또한 실시예 1-3과 동일한 방법으로 RNA 전기영동을 수행하였다. 본 실험의 대조군은 mRNA-S 및 CircRNAR-S를 사용하였다. 상기 CircRNAR-S는 휴스턴 메소디스트 리딩 메드신 (Houston Methodist Leading Medicine)으로부터 compact하게 붙여진 형태로 합성된 circular form의 RNA이다. RNA 전기영동 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, linear RNA form인 mRNA-S는 RNase R 처리에 따라 분해된 것을 확인하였다. 그러나 circular RNA form인 CircRNA-S 및 pCircRNAR-S은 RNase R 처리에도 불구하고 밴드가 확인되었다. 상기 결과는 in vitro에서 circular RNA가 mRNA보다 더 오래 유지된다는 것을 의미한다.
실시예 3. 시간에 따른 circular RNA의 stability 확인
3-1. Cell culture 및 transfection
HEK293T 세포를 10% FBS(Gibco), 1% penicillin/streptomycin, Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) high glucose 배지에서 37 ℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 제조업체의 지침에 따라 HEK293T 세포에 mRNA-eGFP 또는 circRNA-eGFP를 각각 1μg씩 첨가하였다. 그 후 Lipofectamine2000(Invitrogen)과 Opti-MEM(Gibco)을 사용하여 6 well plate에 well당 500,000 Cell/1mL로 transfection하였다. Transfection 4시간 이후에 처음 배양 배지인 DMEM high glucose 배지로 변경하였다. Day1, Day3 일 차에 Trizol(Invitrogen)을 사용하여 RNA 추출을 위한 cell lysis를 하였다. Trizol(Invitrogen)의 제조업체 지침에 따라 Lysis된 세포로부터 RNA를 추출하였다. Lysis된 세포로부터 추출된 RNA는 linear RNA form인 mRNA-eGFP(서열번호 17) 및 circular RNA form인 circRNA-eGFP(서열번호 13)이다.
3-2. RNA Reverse transcription
추출된 RNA 1μg을 사용하여 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)의 제조업체 지침에 따라 cDNA를 합성하였다.
3-3. Realtime qPCR
Target gene에 따른 유전자 발현양을 확인하기 위해 합성된 cDNA를 이용하여 realtime qPCR을 진행하였다. Faststart SYBR green master(Roche), 10X concentrated solution of the PCR primer를 준비하였다. Forward 및 reverse primer는 0.4μM의 농도로 사용하고, target gene은 eGFP, housekeeping gene은 b-actin을 사용하였다. 1.5mL E.P tube를 ice에 두고, well에 표 2와 같이 총 20μl PCR Mix를 준비하였다.
1 rxn
FastStart SYBR Green Master 10 μL
cDNA(10ng) 2 μL
Primer-F(0.4μM) 0.8 μL
Primer-R(0.4μM) 0.8 μL
D.W 6.4 μL
Total 20 μL
PCR MIX를 잘 섞어 준비된 plate에 loading 한 후, Lightcycler96 기기(Roche)를 사용하여 qPCR을 수행하였다. 각 샘플에 대한 Ct값을 비교하여 계산하고, 유전자 발현 수준을 housekeeping gene인 b-actin으로 normalization을 하였다. qPCR 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, linear RNA form인 mRNA-eGFP는 시간이 지남에 따라 농도가 감소(즉, 분해)된 것을 확인하였다. 그러나 circular RNA form인 CircRNA-eGFP는 시간이 지났음에도 농도가 유지되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 circular RNA가 mRNA보다 더욱 안정하다는 것을 의미한다.
실시예 4. Splicing junction site sequencing
본 실험에서는 5’ 스플라이싱 사이트만 포함하는 pCircRNA-ver2.0로 생산된 원형 RNA의 스플라이싱 사이트를 분석하였다. 본 실험의 대조군으로는 3’ 및 5’ 스플라이싱 사이트를 모두 포함하는 벡터(pCircRNA-ver1.0)를 사용하였다.
4-1. 역전사 및 cDNA 합성과 PCR
스플라이싱 접합 시퀀싱을 위해, RNase R로 circRNA를 컬럼 정제한 스플라이싱 반응물 10 μL과 oligodT(invitrogen) 1 μL, dNTP(Enzynomics) 1 μL, nuclease free water 1 μL(13 μL 최종 부피)을 65 ℃에서 5 분 동안 가열하고 얼음에서 3 분 동안 냉각하여 2차 구조를 표준화하였다. 역전사 반응을 추정 circRNA 내부 영역에 SuperiorScript III reverse transcriptase(Enzynomics) 1 μL을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였으며, 구체적인 조건은 하기 표 3에 나타내었다.
.
Temperature(℃) Time(min)
25 20
50 60
70 15
4 ∞
2X topsimple Dyemix - Tenuto(Enzynomics)와 스플라이스 접합부에 걸쳐있는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 위한 PCR 산물을 합성하였다. 구체적인 PCR 조건은 표 4에 나타내었다.
Step Temperature(℃) Time
1 98 3:00
2 98 0:10
3 64 0:30 touch down(-0.5℃)
4 72 0:30
5 GOTO STEP2 9X
6 98 0:10
7 59 0:30
8 72 0:30
9 GOTO STEP 14X
10 72 2:00
11 4 ∞
DNA cleanup kit(New England Biolabs)의 제조업체의 지침을 따라 합성된 DNA를 정제하였다. Sanger-sequencing을 업체에 의뢰하여 splicing junction site를 확인하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 3’ splicing site가 없는 pCircRNA(CircRNA-ver2.0)는 스플라이싱이 정상적으로 일어난 것을 확인하였다. 보다 상세하게는, 스플라이싱 결과로 생성된 원형 RNA는 IRES 부위의 절단이 관찰되었고, IRES 및 5’ splicing site가 7 nt 중첩된 것을 확인하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (20)

  1. 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 원형 RNA의 생산을 위한 벡터:
    1) 프로모터;
    2) 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site, IRES);
    3) 단백질 코딩 영역;
    4) 3' UTR(Untranslated Region);
    5) 폴리 A(poly A); 및
    6) 5' 스플라이싱 부위(5' splicing site)를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편(5' group I intron fragment).
  2. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 내부 리보솜 진입 부위의 상류(upstream)에 3' 스플라이싱 부위(3’ splicing site)를 포함하지 않는 것인, 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 상기 1) 내지 6)의 요소가 순차적으로 작동가능하게 연결된 것인, 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 벡터는 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는, 벡터:
    1) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터;
    2) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 내부 리보솜 진입 부위;
    3) 단백질 코딩 영역;
    4) 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 3' UTR;
    5) 폴리 A; 및
    6) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편은 Anabaena pre-tRNA 유래인, 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 내부 리보솜 진입 부위는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 유래인, 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리 A는 50 내지 300bp인, 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 변형된 핵산, 천연 핵산 또는 비천연 핵산을 포함하는 것인, 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 자가 스플라이싱(self-splicing)에 의해 원형 RNA를 생산할 수 있고, 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 자가 스플라이싱에 의해 절단되는 것인, 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터의 내부 리보솜 진입 부위는 자가 스플라이싱에 의해 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단의 1 내지 50 nt가 절단되는 것인, 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 벡터의 내부 리보솜 진입 부위는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 중첩되는 것인, 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 벡터의 내부 리보솜 진입 부위는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 1 내지 10 nt 중첩되는 것인, 벡터.
  13. 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는 원형 RNA:
    1) 내부 리보솜 진입 부위;
    2) 단백질 코딩 영역;
    3) 3' UTR;
    4) 폴리 A; 및
    5) 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 원형 RNA는 작동 가능하게 연결된 하기 요소를 포함하는, 원형 RNA:
    1) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프로모터;
    2) 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 내부 리보솜 진입 부위;
    3) 단백질 코딩 영역;
    4) 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 3' UTR;
    5) 폴리 A; 및
    6) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 5' 스플라이싱 부위를 포함하는 5' 그룹 I 인트론 단편.
  15. 제13항에 있어서, 상기 원형 RNA는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단의 1 내지 50 nt가 절단된 것인, 원형 RNA.
  16. 제13항에 있어서, 상기 원형 RNA는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 중첩된 것인, 원형 RNA.
  17. 제16항에 있어서, 상기 원형 RNA는 내부 리보솜 진입 부위의 5' 말단이 5' 스플라이싱 부위와 1 내지 10 nt 중첩된 것인, 원형 RNA.
  18. 제1항의 원형 RNA의 생산을 위한 벡터; 또는 제13항의 원형 RNA;를 포함하는 목적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제1항의 원형 RNA의 생산을 위한 벡터; 또는 제13항의 원형 RNA;를 포함하는 목적 질환 예방용 백신 조성물.
  20. 제1항의 원형 RNA의 생산을 위한 벡터 또는 제13항의 원형 RNA를 세포에 형질도입시키는 단계를 포함하는, 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키는 방법.

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