KR20230036061A - 폴리에틸렌이민-디옥시리보핵산 복합체 크기 및 활성의 안정화 - Google Patents
폴리에틸렌이민-디옥시리보핵산 복합체 크기 및 활성의 안정화 Download PDFInfo
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Abstract
미리 결정된 크기의 중합체-DNA 나노입자를 생산하기 위한 방법 및 시스템이 본원에 개시된다. 일 예에서, 한 방법은 디옥시리보핵산(DNA)을 포함하는 제1 용액을 양이온성 중합체를 포함하는 제2 용액과 함께 혼합하여 폴리플렉스 용액을 수득하는 단계, 및 상기 제1 용액과 제2 용액을 함께 혼합한 후 미리 결정된 시간에 폴리플렉스 안정화제를 첨가하여 폴리플렉스의 크기를 안정화시키는 단계를 포함한다. 이러한 방식으로, 중합체-DNA 나노입자의 형질주입 효능은, 특히 바이러스 벡터의 생산을 위한 부유성 세포(suspension cells)의 형질주입과 관련하여, 개선될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 제63/016,166호의 선출원일의 우선권을 주장하고, 2020년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 63/023,119호의 선출원일의 우선권을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 일반적으로 바이러스 벡터 프로세스 개발 분야, 특히, 예컨대 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)-디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 복합체의 활성 및 크기를 안정화함으로써 바이러스 벡터 역가, 생산 및/또는 수율을 개선하는 방법에 관한 것이다.
질병 및 병태를 치료하기 위해 다양한 유전자 치료 방법이 이용 가능하다. 렌티바이러스 벡터(Lentiviral vectors, LVV) 및 아데노 연관 바이러스 벡터(Adeno-associated virus vectors, AAV)는 여러 유전자 치료 프로세스에서 중추적인 역할을 한다. 많은 상업화된 LVV 생산 및/또는 AAV 프로세스는 생산을 위해 부착성 세포 배양을 사용한다. 이러한 프로세스는 상업적 수요를 충족할 수 있었지만, 일괄 처리(batch) 크기를 늘리기 위해 규모 확장이 필요하므로 최대 프로세스 규모가 제한된다. 부착성 프로세스는 또한 세포 건강을 유지하기 위해 소 태아 혈청과 같은 동물성 제품을 첨가해야 하는 경우가 많다. 동물 유래 혈청의 사용은 바이러스를 포함한 외래성 인자에 의한 오염 가능성을 증가시키고 상업화 비용을 크게 증가시킬 수 있다. 따라서, 부착성 세포 배양에 대한 의존은 임상 시험을 위한 현행 우수 제조 관리 기준(current Good Manufacturing Practices, cGMP) 등급 LVV 및/또는 AAV의 제조를 복잡하게 할 수 있으며, 이러한 문제는 상업화 노력을 더욱 악화시킬 수 있다. 보다 효율적이고 효과적인 바이러스 벡터 생산 방법을 제공하기 위해, 무혈청 현탁액 프로세스를 개발하는 것을 포함하는 이러한 유전자 요법을 제조 및/또는 조작하는 개선된 방법이 필요하다.
특히 바이러스 입자(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 및/또는 아데노 연관 바이러스 벡터)를 암호화하는 유전자의 발현과 관련하여, 형질주입 효능 및 하류 유전자 발현을 개선하기 위해, 목적하는 유체역학적 직경을 갖는 중합체-DNA 형질주입 복합체를 제공하기 위한 방법 및 시스템이 본원에 개시된다. 상기 제공된 방법 및 시스템은 유전자 요법 및/또는 세포 요법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 응용을 위한 바이러스 벡터의 생산의 규모를 확대하는 능력을 개선한다.
일 측면에서, 개시된 방법은 제1 농도의 제1 미리 결정된 양의 PEI 용액을 제2 농도의 제2 미리 결정된 양의 DNA 용액에 첨가하고 혼합하여 용액 중의 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계; 제1 미리 결정된 기간 이후에, 상기 PEI-DNA 용액에 제3 미리 결정된 양의 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제를 첨가하여 안정화된 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계; 및 상기 제1 미리 결정된 기간 다음에 제2 미리 결정된 기간 이후에, 상기 안정화된 PEI-DNA 복합체로 세포들의 집단을 형질주입시키는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 방법은 상기 제1 미리 결정된 기간이 상기 제1 농도 및 상기 제2 농도의 함수인 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 농도 및 상기 제2 농도가 감소함에 따라 상기 제1 미리 결정된 기간은 증가하고; 상기 제1 농도 및 상기 제2 농도가 증가함에 따라 상기 제1 미리 결정된 기간은 감소한다.
일 구현예에서, 상기 제1 미리 결정된 대기 시간은 상기 PEI-DNA 복합체의 목적하는 크기의 함수이다. 일부 예에서, 상기 목적하는 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이이다. 예들에서, 상기 제1 미리 결정된 대기 시간은 30초 내지 15분 사이이다. 예를 들면, 상기 제1 미리 결정된 대기 시간은 30초, 30초 내지 1분, 1 내지 2분, 2 내지 3분, 3 내지 4분, 4 내지 5분, 5 내지 6분, 6 내지 7분, 7 내지 8분, 8 내지 9분, 9 내지 10분, 10 내지 11분, 11 내지 12분, 12 내지 13분, 13 내지 14분, 또는 14 내지 15분일 수 있다. 특정 예들에서, 상기 제1 미리 결정된 대기 시간은 30초, 45초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 또는 15분이다.
일 구현예에서, 상기 DNA 용액은 하나 이상의 DNA 플라스미드를 더 포함한다. 예를 들면, 상기 하나 이상의 DNA 플라스미드는 하나 이상의 바이러스 단백질의 합성을 위한 하나 이상의 유전자를 포함하는 전달 플라스미드를 더 포함한다. 일부 예에서, 상기 하나 이상의 유전자는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부에 대한 유전자들을 포함한다. 추가적인 또는 대안적인 예들에서, 상기 하나 이상의 유전자는 아데노 연관 바이러스 게놈의 적어도 일부에 대한 유전자들을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 세포들의 집단은 포유동물 세포를 더 포함한다. 예를 들면, 상기 세포들의 집단은 인간 배아 신장(HEK) 293 부유성 세포를 더 포함한다. 다른 예들에서, 상기 포유동물 세포들의 집단에는 HeLa, U2OS, A549, HT1080, CAD, P19, NIH 3T3, L929, N2a, 재조합 중국 햄스터 난소(CHO), MCF-7, Y79, SO-Rb50, Hep G2, DUKX-X11, J558L 및/또는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포가 포함될 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
일 구현예에서, 상기 안정화된 PEI-DNA 복합체는 상기 세포들의 집단을 형질주입하기 전에 동결되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 제2 미리 결정된 기간은 상기 PEI-DNA 용액에 상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제의 첨가 후 1분 내지 18시간 사이이다.
일 구현예에서, 상기 제2 미리 결정된 기간은 5분 초과이고 2시간 미만이다.
일 구현예에서, 상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 비재조합 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
일 구현예에서, 상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 피치아 파스토리스로부터 정제된 재조합 알부민이다.
일 구현예에서, 상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 재조합 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
디옥시리보핵산(DNA)을 포함하는 제1 용액을 양이온성 중합체를 포함하는 제2 용액과 함께 혼합하여 폴리플렉스 용액을 얻는 단계, 및 상기 제1 용액과 제2 용액을 함께 혼합한 후 미리 결정된 시간에 상기 폴리플렉스 용액에 폴리플렉스 안정화제를 첨가하여 폴리플렉스의 크기를 안정화시키는 단계를 포함하는 폴리플렉스의 크기를 안정화하는 방법이 또한 제공된다.
일 구현예에서, 상기 미리 결정된 시간은 상기 폴리플렉스의 목적하는 크기에 기초하여 선택되고, 상기 목적하는 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이이다.
일 구현예에서, 상기 폴리플렉스의 크기는 상기 미리 결정된 시간이 증가함에 따라 증가하고, 상기 미리 결정된 시간이 감소함에 따라 감소한다.
일 구현예에서, 상기 폴리플렉스의 크기를 안정화하는 것은 상기 폴리플렉스 안정화제를 첨가하여 상기 폴리플렉스의 크기가 계속 증가하는 것을 방지하여 이루어진다.
일 구현예에서, 상기 폴리플렉스 안정화제는 비재조합 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
일 구현예에서, 상기 폴리플렉스 안정화제는 피치아 파스토리스로부터 정제된 재조합 인간 혈청 알부민이다.
일 구현예에서, 상기 폴리플렉스 안정화제는 재조합 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
일 구현예에서, 상기 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다.
일 구현예에서, 상기 제1 용액은 제1 농도의 DNA를 더 포함하고, 상기 제2 용액은 제2 농도의 양이온성 중합체를 더 포함하고, 상기 폴리플렉스의 크기는 상기 제1 농도, 상기 제2 농도, 및 상기 미리 결정된 시간 중 하나 이상의 함수이다.
일 구현예에서, 본 방법은 상기 제1 용액을 상기 제2 용액과 미리 결정된 온도에서 함께 혼합하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 방법은 상기 제1 용액을 상기 제2 용액과 미리 결정된 pH에서 함께 혼합하는 단계를 더 포함한다.
일 구현예에서, 본 방법은 상기 제1 용액이 상기 제2 용액과 혼합되는 속도(rate)를 제어하는 단계를 더 포함한다.
다른 측면에서, 정의된 크기의 중합체-DNA 나노입자를 생산하기 위한 시스템은 중합체 챔버 중 제1 농도의 중합체 용액; DNA 챔버 중 제2 농도의 DNA 용액; 제1 연결 라인을 통해 상기 중합체 챔버에 선택적으로 유체 결합되고 제2 연결 라인을 통해 상기 DNA 챔버에 선택적으로 유체 결합된 혼합 챔버; 상기 중합체 챔버와 상기 혼합 챔버 사이에서 상기 제1 연결 라인에 결합된 제1 펌프 및 상기 DNA 챔버와 상기 혼합 챔버 사이에서 상기 제2 연결 라인에 결합된 제2 펌프; 상기 제1 연결 라인에 결합되고 상기 제1 펌프와 상기 혼합 챔버 사이에 위치하는 제1 밸브; 상기 제2 연결 라인에 결합되고 상기 제2 펌프와 상기 혼합 챔버 사이에 위치하는 제2 밸브; 및 제3 호스를 통해 상기 혼합 챔버로부터 유체 흐름을 수용하는 ??칭 챔버(quenching chamber)―상기 ??칭 챔버는 제3 농도의 ??칭제(quenching agent)를 포함함―;를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 시스템은 비일시적 메모리에 명령들을 저장하는 컨트롤러―상기 명령들은 실행되면 상기 컨트롤러로 하여금 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프, 상기 제1 밸브, 및 상기 제2 밸브 중 하나 이상을 제어하여 상기 중합체 용액이 제1 유속으로 상기 혼합 챔버로 가도록 하고 동시에 상기 DNA 용액이 제2 유속으로 상기 혼합 챔버로 가도록 하게 하여 상기 혼합 챔버 내에서 중합체-DNA 복합체를 제공하고 이어서 ??칭 챔버로 가도록 함―를 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 ??칭제는 인간 혈청 알부민이다.
일 구현예에서, 상기 ??칭제는 재조합 인간 혈청 알부민이다.
일 구현예에서, 상기 혼합 챔버는 상기 제1 유속 및 상기 제2 유속의 함수로서 상기 중합체 용액 및 상기 DNA 용액의 일관된 혼합 및 체류 시간을 용이하게 하기 위한 모양으로 형성된 기하학적 구조이다.
일 구현예에서, 상기 중합체-DNA 복합체의 성장이 상기 혼합 챔버 내에서 일어나고, 상기 중합체-DNA 복합체의 성장은, 상기 정의된 크기의 중합체-DNA 복합체를 제공하기 위해, 상기 중합체-DNA 복합체가 상기 ??칭 챔버에 침전될 때 상기 ??칭제에 의해 안정화된다.
일 구현예에서, 상기 정의된 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이이다.
일 구현예에서, 상기 DNA 용액은 하나 이상의 바이러스 단백질의 합성을 위한 하나 이상의 유전자를 포함하는 복수의 전달 플라스미드를 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 중합체 용액은 폴리에틸렌이민을 더 포함한다.
다른 측면에서, 재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체로 세포들의 집단을 형질주입시키는 방법은 제1 농도의 DNA 용액과 제2 농도의 중합체 용액을 함께 혼합하여 용액 중 중합체-DNA 형질주입 복합체를 수득하는 단계를 포함한다. 제1 미리 결정된 시간 기간 이후, 본 방법은 ??칭제를 통해 중합체-DNA 형질주입 복합체의 크기를 안정화하여 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 수득하는 단계; 하나 이상의 동결건조제를 상기 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체에 첨가하는 단계; 및 상기 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 분말로 동결건조하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 나중 시간에, 본 방법은 상기 동결건조된 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 재구성하여 재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 수득하는 단계, 상기 재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 형질주입 용액으로 희석하는 단계, 및 상기 세포들의 집단을 상기 재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체로 형질주입하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 중합체 용액은 양이온성 중합체를 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다.
일 구현예에서, 상기 ??칭제는 인간 혈청 알부민(HSA)이다.
일 구현예에서, 상기 DNA 용액은 바이러스 게놈의 적어도 일부를 코딩하는 복수의 전달 플라스미드를 더 포함한다. 일부 예에서, 상기 바이러스 게놈은 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부를 포함한다. 다른 예들에서, 상기 바이러스 게놈은 아데노 연관 바이러스 게놈의 적어도 일부를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 분말은 상기 나중 시간까지 4°C, -20°C 또는 -80°C 중 하나에서 저장된다.
일 구현예에서, 상기 동결건조제는 만니톨 및/또는 수크로스 중 하나 이상이다.
일 구현예에서, 상기 동결건조제는 만니톨 및 수크로스 둘 모두를 포함하고, 여기서 만니톨의 농도는 25-35mg/mL(예를 들어, 30mg/mL)이고 수크로스의 농도는 15-25mg/mL(예를 들어, 20mg/mL)이다.
일 구현예에서, 상기 동결건조제는 만니톨을 포함하나 수크로스는 포함하지 않으며, 여기서 만니톨의 농도는 25-35mg/mL(예를 들어, 30mg/mL)이다.
본 개시내용의 전술한 특징들 및 다른 특징들은 첨부 도면을 참조하여 진행되는 다음의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 더욱 명백해질 것이다.
구현예들은 첨부 도면 및 첨부된 청구범위와 함께 이어지는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해 용이하게 이해될 것이다. 구현예들은 첨부 도면의 도면들에서 제한이 아니라 예로서 도시된다.
도 1a는 본 개시내용의 고수준(high-level) 무혈청 부유성 세포 생산 프로세스의 개략도이다.
도 1b는 도 1c의 그래프에 상응하는, 형질주입 전 다양한 대기 시간의 샘플에 대한 역가 값을 나타내는 표이다.
도 1c는 수확 시 렌티바이러스 벡터 역가가 폴리에틸렌이민-DNA(PEI-DNA) 형질주입 복합체 농도 및 DNA와 PEI를 혼합하고 세포를 PEI-DNA 형질주입 복합체로 형질주입시키는 사이의 대기 시간의 함수임을 보여주는 그래프이다.
도 1d는 0 - 10mg/mL HSA가 보충된 137.3μg/mL PEI-DNA 복합체에 대한 인큐베이션 시간에 따른 역가를 나타내는 그래프를 묘사한다.
도 2a는 HSA의 존재 및 부재 하에 다양한 PEI-DNA 형질주입 복합체 농도에 대한, 시간의 함수로서 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기를 시험하기 위한 조건을 예시하는 표이다. 도 2의 표에 상세히 설명된 시험 조건의 결과는 도 2b 내지 도 6에 그래프로 도시되어 있다.
도 2b는 시간에 따른 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기 증가를 시간 PEI 및 DNA 농도의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 3 내지 도 6은 다양한 PEI-DNA 형질주입 복합체 농도에 대해, HSA의 존재 및 부재하에 시간의 함수로서 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7a는 +/- HSA 하에, 복합체 대기 시간별 생물반응기 역가를 예시하는 막대 그래프를 나타낸다.
도 7b는 최대 24시간 동안 HSA 존재 및 부재 하에 대기 시간의 함수로서 PEI-DNA 복합체의 형질주입 효능을 평가하기 위해 시험한 실험 조건을 자세히 설명하는 플레이트 맵을 도시한다.
도 7c는 최대 24시간까지 형질주입 전 다양한 형질주입 복합체 대기 시간에 HSA 존재 및 부재 하에 PEI-DNA 복합체의 형질주입 후 수확 시 렌티바이러스 벡터 역가를 나타내는 그래프이다.
도 7d는 단축된 시간 프레임을 표시하기 위해 도 7c의 그래프의 일 부분을 도시한다.
도 8a는 본원에 제공된 구현예들에 따른 예시적인 중합체-DNA 복합체 설계의 고수준 흐름도이다.
도 8b는 본원에 제공된 구현예들에 따른 미리 결정된 입자 직경의 중합체-DNA 나노입자를 제공하기 위한 자동화 시스템의 개략도이다.
도 9는 안정화된 PEI-DNA 형질주입 복합체의 동결건조에 이어 재구성 및 형질주입을 위한 프로세스 흐름을 도시한다.
도 10은 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형에 대한, 동적 광 산란(DLS) 방법론을 통해 모니터링되는 백분율 강도에 대한 형질주입 복합체 크기를 도표화한 그래프이다.
도 11은 DLS를 통해 모니터링된 백분율 강도에 대한 용액(10mg/mL) 중 HSA의 유체역학적 직경을 도표화한 그래프로서, 도 10의 그래프에서 볼 수 있는 두 개의 더 작은 피크가 HSA 때문임을 예시한다.
도 12는 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형에 대한, 만니톨 농도, 수크로스 농도 및 HSA 농도 각각의 함수로서 형질주입 복합체 크기를 예시하는 3개의 상이한 그래프를 도시한다.
도 13은 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형에 대한 HSA 농도의 함수로서 형질주입 복합체 크기를 예시하는 3개의 상이한 그래프를 도시한다.
도 14는 동결건조 케이크 외관과 관련된 하나 이상의 매개변수를 설명하는 동결건조 케이크 점수의 함수로서, 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형 각각에 대한 동결건조 전 형질주입 복합체 크기를 도표화한 그래프를 도시한다.
도 15는 복합체 내의 DNA로서 아데노 연관 바이러스(AAV) 플라스미드를 포함하는 PEI-DNA 복합체 +/- HSA(1mg/mL)의 대기 시간의 함수로서 log(벡터 게놈)을 도표화한 그래프를 도시한다.
도 16은 재조합 알부민 및 HSA 이외의 다양한 단백질을 잠재적인 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제로 사용한 경우 시간에 따른 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17은 HSA와 비교하여 피치아 파스토리스 유래 재조합 알부민을 사용한 경우 시간에 따른 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기를 나타내는 그래프이다.
도 1a는 본 개시내용의 고수준(high-level) 무혈청 부유성 세포 생산 프로세스의 개략도이다.
도 1b는 도 1c의 그래프에 상응하는, 형질주입 전 다양한 대기 시간의 샘플에 대한 역가 값을 나타내는 표이다.
도 1c는 수확 시 렌티바이러스 벡터 역가가 폴리에틸렌이민-DNA(PEI-DNA) 형질주입 복합체 농도 및 DNA와 PEI를 혼합하고 세포를 PEI-DNA 형질주입 복합체로 형질주입시키는 사이의 대기 시간의 함수임을 보여주는 그래프이다.
도 1d는 0 - 10mg/mL HSA가 보충된 137.3μg/mL PEI-DNA 복합체에 대한 인큐베이션 시간에 따른 역가를 나타내는 그래프를 묘사한다.
도 2a는 HSA의 존재 및 부재 하에 다양한 PEI-DNA 형질주입 복합체 농도에 대한, 시간의 함수로서 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기를 시험하기 위한 조건을 예시하는 표이다. 도 2의 표에 상세히 설명된 시험 조건의 결과는 도 2b 내지 도 6에 그래프로 도시되어 있다.
도 2b는 시간에 따른 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기 증가를 시간 PEI 및 DNA 농도의 함수로 나타낸 그래프이다.
도 3 내지 도 6은 다양한 PEI-DNA 형질주입 복합체 농도에 대해, HSA의 존재 및 부재하에 시간의 함수로서 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기의 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7a는 +/- HSA 하에, 복합체 대기 시간별 생물반응기 역가를 예시하는 막대 그래프를 나타낸다.
도 7b는 최대 24시간 동안 HSA 존재 및 부재 하에 대기 시간의 함수로서 PEI-DNA 복합체의 형질주입 효능을 평가하기 위해 시험한 실험 조건을 자세히 설명하는 플레이트 맵을 도시한다.
도 7c는 최대 24시간까지 형질주입 전 다양한 형질주입 복합체 대기 시간에 HSA 존재 및 부재 하에 PEI-DNA 복합체의 형질주입 후 수확 시 렌티바이러스 벡터 역가를 나타내는 그래프이다.
도 7d는 단축된 시간 프레임을 표시하기 위해 도 7c의 그래프의 일 부분을 도시한다.
도 8a는 본원에 제공된 구현예들에 따른 예시적인 중합체-DNA 복합체 설계의 고수준 흐름도이다.
도 8b는 본원에 제공된 구현예들에 따른 미리 결정된 입자 직경의 중합체-DNA 나노입자를 제공하기 위한 자동화 시스템의 개략도이다.
도 9는 안정화된 PEI-DNA 형질주입 복합체의 동결건조에 이어 재구성 및 형질주입을 위한 프로세스 흐름을 도시한다.
도 10은 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형에 대한, 동적 광 산란(DLS) 방법론을 통해 모니터링되는 백분율 강도에 대한 형질주입 복합체 크기를 도표화한 그래프이다.
도 11은 DLS를 통해 모니터링된 백분율 강도에 대한 용액(10mg/mL) 중 HSA의 유체역학적 직경을 도표화한 그래프로서, 도 10의 그래프에서 볼 수 있는 두 개의 더 작은 피크가 HSA 때문임을 예시한다.
도 12는 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형에 대한, 만니톨 농도, 수크로스 농도 및 HSA 농도 각각의 함수로서 형질주입 복합체 크기를 예시하는 3개의 상이한 그래프를 도시한다.
도 13은 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형에 대한 HSA 농도의 함수로서 형질주입 복합체 크기를 예시하는 3개의 상이한 그래프를 도시한다.
도 14는 동결건조 케이크 외관과 관련된 하나 이상의 매개변수를 설명하는 동결건조 케이크 점수의 함수로서, 68.7μg/mL의 DNA, 68.7μg/mL의 PEI 및 다양한 농도의 수크로스(0-40mg/mL), 만니톨(0-30mg/mL) 및 HSA(1-10mg/mL)를 포함하는 13개의 상이한 제형 각각에 대한 동결건조 전 형질주입 복합체 크기를 도표화한 그래프를 도시한다.
도 15는 복합체 내의 DNA로서 아데노 연관 바이러스(AAV) 플라스미드를 포함하는 PEI-DNA 복합체 +/- HSA(1mg/mL)의 대기 시간의 함수로서 log(벡터 게놈)을 도표화한 그래프를 도시한다.
도 16은 재조합 알부민 및 HSA 이외의 다양한 단백질을 잠재적인 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제로 사용한 경우 시간에 따른 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17은 HSA와 비교하여 피치아 파스토리스 유래 재조합 알부민을 사용한 경우 시간에 따른 PEI-DNA 형질주입 복합체 크기를 나타내는 그래프이다.
이어지는 상세한 설명에서, 본 명세서의 일부를 형성하고 실시될 수 있는 예시적인 구현예로서 도시되는 첨부 도면을 참조한다. 범위를 벗어나지 않으면서 다른 구현예들이 활용될 수 있고 구조적 또는 논리적 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 이어지는 상세한 설명은 제한적인 의미로 받아들여서는 안 되며 구현예들의 범위는 첨부된 청구범위 및 그 균등물에 의해 정의된다.
다양한 작업을 구현예들을 이해하는 데 도움이 되는 방식으로 차례로 여러 개별 작업으로 설명할 수 있지만, 설명 순서는 이러한 작업이 순서 종속적임을 의미하도록 해석되어서는 안 된다.
설명의 목적을 위해 “A/B” 형식 또는 “A 및/또는 B” 형식의 문구는 (A), (B) 또는 (A 및 B)를 의미한다. 설명의 목적을 위해 “A, B 및 C 중 적어도 하나” 형식의 문구는 (A), (B), (C), (A 및 B), (A 및 C), (B 및 C) 또는 (A, B 및 C)를 의미한다. 설명의 목적을 위해, “(A)B” 형식의 문구는 (B) 또는 (AB)를 의미하며, 즉, A는 선택적 요소이다.
본 설명은 “구현예” 또는 “구현예들”이라는 용어를 사용할 수 있으며, 각각은 동일하거나 상이한 구현예들 중 하나 이상을 지칭할 수 있다. 또한 구현예들과 관련하여 사용될 때 “포함하는(comprising)”, “포함한, 포함되는, 포함하여(including)”, “갖는(having)” 등은 동의어이며, 일반적으로 “개방된(open)” 용어로 의도된다(예를 들어, “포함한, 포함되는, 포함하여(including)”라는 용어는 “을 포함하지만 그에 한정되지 않는”으로 해석되어야 하고, “갖는(having)”이라는 용어는 “적어도 갖는”으로 해석되어야 하고, “포함하다, 포함되다(include)”라는 용어는 “포함하지만 그에 한정되지 않는다”로 해석되어야 하는 식이다).
본원에서 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자들은 맥락 및/또는 적용에 적절한 대로 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 번역할 수 있다. 명료함을 위해 다양한 단수/복수 순열이 본원에 명시적으로 제시될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 기술 용어는 통상적인 어법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 문헌[Benjamin Lewin, Genes IX, Jones and Bartlet 발행, 2008년(ISBN 0763752223); Kendrew 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 1994년 Blackwell Science Ltd. 발행(ISBN 0632021829);및 Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 발행, 1995(ISBN 9780471185710); 및 기타 유사한 참고문헌]에서 찾을 수 있다.
단수 용어(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 유사하게, “또는(or)”이라는 단어는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 “및(and)”을 포함하도록 의도되었다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이며 설명을 위해 제공되는 것으로 추가로 이해되어야 한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료를 아래에서 설명한다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 충돌하는 경우, 용어의 설명을 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 없다.
I. 여러
구현예의
개요
LVV 생산(및/또는 AAV 생산)을 위한 효과적인 세포 현탁액 시스템 개발과 관련된 주요 과제는 규모 확장 시 배양 생산성을 유지하는 것이다. 형질주입 단위 조작은 현탁액 프로세스를 개발하는 데 있어 중요한 단계이며 배양 생산성에 큰 영향을 미친다. 양이온성 중합체 매개(예를 들어, 폴리에틸렌이민) 일시적 형질주입은 바이러스 생산 시스템에서 숙주 세포에 관심 유전자를 도입하는 데 사용되는 방법이며 현탁액 생산 프로세스에 효과적인 형질주입 기술이다. LVV 생산을 위한 무혈청 현탁액 프로세스를 개발하는 동안 PEI/DNA 복합체 대기 시간이 제조 규모 확대 동안 문제를 일으킬 수 있는 매우 시간에 민감한 프로세스 매개변수라는 것이 예기치 않게 발견되었다. 동적 광 산란(DLS)을 사용하여, 형성 시간이 증가함에 따라 폴리플렉스(polyplex)(예를 들어, 양이온성 중합체와 DNA의 복합체) 크기가 증가하고 DNA와 PEI의 농도가 높을수록 입자 크기가 더 빠르게 증가하는 것으로 나타났다. 예를 들면, 제3세대 LVV의 구성요소를 공동 형질주입시킬 때, 최대 LVV 역가는 특정 크기의 폴리플렉스에 의해 달성되었으며, 폴리플렉스 크기가 이 최적 크기를 넘어 증가함에 따라 역가는 감소했다.
이 연구들에 기초하여, 바이러스 벡터 성분(예를 들어, LVV 성분 및/또는 AAV 성분)의 무혈청 현탁액 일시적 형질주입에서와 같은 형질주입에서 프로세스 제어 및 역가 출력을 개선하는 방법 및 시스템이 본원에 개시된다. 개시된 방법 및 시스템은 효율적인 형질주입 및 바이러스 생산을 촉진하며 수많은 이점과 연관된다. 예를 들면, 개시된 방법 및 시스템은 규모 확장보다는 단일 통 규모 확대를 허용하고 동물 유래 원재료의 사용을 필요로 하지 않음으로써 바이러스 입자 생산 비용을 감소시키는 것을 포함하여 다양한 이유로 이점이 있다. 개시된 방법 및 시스템은 플라스미드 DNA를 포유동물 세포에 전달하기 위한 형질주입 시약으로서 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 양이온성 중합체를 사용하는 바이러스 벡터 또는 단백질 생산 프로세스에서 임의의 일시적 형질주입 단위 조작에 적용될 수 있음이 고려된다. 본 개시내용의 범위 내의 다른 양이온성 중합체는 폴리리신, 폴리오르니틴, 폴리브렌, 시클로덱스트린, 키토산, 히스톤, 콜라겐, 활성화 및/또는 비활성화된 덴드리머 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
개시된 시스템 및 방법은 미리 결정된 크기 범위 내의 크기(예를 들어, 유체역학적 입자 직경)를 갖는 중합체-DNA 나노입자를 제공한다. 미리 결정된 크기 범위는 중합체-DNA 형질주입 복합체 크기가 미리 결정된 크기 범위 밖에 있는 경우보다 중합체-DNA 형질주입 복합체를 사용한 세포들의 집단의 형질주입이 더 효율적 및/또는 효과적인 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미리 결정된 크기 범위 내의 치수를 갖는 이러한 중합체-DNA 형질주입 복합체를 이용한 세포들의 집단의 형질주입은 미리 결정된 크기 범위 밖의 치수를 갖는 중합체-DNA 형질주입 복합체로 형질주입된 세포들의 집단과 비교하여 수확 시 바이러스 벡터 역가(예를 들어, LVV 역가, AAV 역가 등)를 증가시킨다. 실시예들에서, 미리 결정된 크기 범위는 직경이 200 내지 1400nm이다. 예를 들면, 직경이 400-1000nm 사이이다. 구체적으로, 직경 400-450nm, 또는 직경이 450-500nm, 또는 직경 500-550nm, 또는 직경 550-600nm, 또는 직경 600-650nm, 또는 직경 650-700nm, 또는 직경 700-750nm, 또는 직경 750-800nm, 또는 직경 800-850nm, 또는 직경 850-900nm, 또는 직경 900-950nm, 또는 직경 950-1000nm 사이이다.
일부 구현예에서, 폴리플렉스의 크기를 안정화하는 방법은 디옥시리보핵산(DNA)을 포함하는 제1 용액을 양이온성 중합체를 포함하는 제2 용액과 함께 혼합하여 폴리플렉스 용액을 얻는 단계, 및 상기 제1 용액과 제2 용액을 함께 혼합한 후 미리 결정된 시간에 상기 폴리플렉스 용액에 폴리플렉스 안정화제를 첨가하여 폴리플렉스의 크기를 안정화시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, DNA를 양이온성 중합체와 혼합할 때, DNA 및 양이온성 중합체를 포함하는 폴리플렉스는 크기가 커질 수 있고(예를 들어, 입자 직경이 시간이 지남에 따라 증가할 수 있음), 폴리플렉스 안정화제의 첨가는 폴리플렉스의 추가 성장을 방지하거나 극적으로 지연시킬 수 있다. 따라서, 제1 용액과 제2 용액을 혼합한 후 미리 결정된 시간은 특정 적용을 위한 폴리플렉스의 목적하는 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 목적하는 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터의 범위를 포함할 수 있지만, 다른 크기 범위가 적용에 따라 본 개시내용에 포함된다(예를 들어, 직경이 400nm 미만, 또는 직경이 1000nm 초과). 미리 결정된 시간은 적어도 제1 용액 및 제2 용액의 농도의 함수일 수 있다. 예를 들면, 혼합될 때 제1 용액 및 제2 용액의 농도가 더 높을수록 제1 용액 및 제2 용액의 더 낮은 농도가 혼합될 때 폴리플렉스의 덜 빠른 성장과 비교하여 폴리플렉스의 더 빠른 성장을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)일 수 있지만, 본원에 언급된 다른 양이온성 중합체도 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리플렉스 안정화제는 인간 혈청 알부민(HSA)일 수 있으며, 이는 일부 예에서 재조합 HSA를 포함할 수 있다.
또한, 제1 농도의 PEI 용액을 제공하는 단계 및 제2 농도의 DNA 용액을 제공하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 본 방법은 제1 미리 결정된 양의 PEI 용액을 제2 미리 결정된 양의 DNA 용액에 첨가하고 혼합하여 용액 중 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제1 미리 결정된 기간 이후에, 본 방법은 용액 중 PEI-DNA 복합체에 제3 미리 결정된 양의 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제를 첨가하여 안정화된 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제1 미리 결정된 기간 이후 제2 사전 결정 후, 본 방법은 안정화된 PEI-DNA 복합체로 세포들의 집단을 형질주입시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 방법의 일 구현예에서, 제1 미리 결정된 기간은 제1 농도 및 제2 농도의 함수일 수 있다. 예를 들면, 제1 미리 결정된 기간은 제1 농도 및 제2 농도가 더 높을수록 더 짧아질 수 있고, 제1 미리 결정된 기간은 제1 농도 및 제2 농도가 더 낮을수록 더 길어질 수 있다. 제1 미리 결정된 기간은 안정화된 PEI-DNA 복합체의 목적하는 크기에 기초할 수 있고, 목적하는 크기는 일부 구현예에서 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다. 예를 들면, DNA 용액이 하나 이상의 바이러스 단백질 합성을 위한 하나 이상의 유전자를 포함하는 복수의 DNA 전달 플라스미드를 포함하는 경우 목적하는 크기는 400 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다. 이러한 DNA 전달 플라스미드의 한 예로서, 하나 이상의 유전자는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부에 상응하는 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 유전자는 아데노 연관 바이러스 게놈의 적어도 일부에 상응하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 방법의 일 구현예에서, 세포들의 집단은 HEK 293 부유성 세포와 같은 포유동물 세포를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 범위 내의 다른 포유동물 세포 유형에는 HeLa, U2OS, A549, HT1080, CAD, P19, NIH 3T3, L929, N2a, 재조합 중국 햄스터 난소(CHO), MCF-7, Y79, SO-Rb50, Hep G2, DUKX-X11, J558L 및/또는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
안정화된 PEI-DNA 복합체는 일부 예에서 세포들의 집단을 형질주입시키기 전에 동결되지 않은 상태로 유지될 수 있다. PEI-DNA 복합체가 동결되지 않은 경우, 제2 미리 결정된 기간은 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제의 첨가 후 1분 내지 18시간 사이일 수 있다. 예를 들면, 제2 미리 결정된 기간은 1-2분, 또는 1-10분, 또는 10-30분, 또는 30-60분, 또는 1-2시간, 또는 2-3시간, 또는 3-4시간일 수 있고, 또는 4-5시간, 또는 5-6시간, 또는 6-7시간, 또는 7-8시간, 또는 8-9시간, 또는 9-10시간, 또는 10-11시간, 또는 11-12시간, 또는 12-13시간, 또는 13-14시간, 또는 14-15시간, 또는 15-16시간, 또는 16-17시간, 또는 17-18시간 사이일 수 있다. 구체적인 구현예에서, 제2 미리 결정된 기간은 2분보다 길지만 2시간보다 짧을 수 있다.
본 방법의 일 구현예에서, PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 비재조합 HSA, 재조합 HSA 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들면, 재조합 HSA는 일부 예에서 정제된 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있지만, 다른 유기체가 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 사용될 수 있다. 예로는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae ), 한세눌라 폴리모르파 ( Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis ) 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 유기체는 피치아 파스토리스 또는 사카로미세스 세레비시아이다. 또한, 정의된 크기(예를 들어, 정의된 크기 범위 내)의 중합체-DNA 나노입자를 생산하기 위한 시스템이 본원에 개시된다. 시스템은 중합체 챔버(예를 들어, 튜브, 비이커, 용기, 통 등, 선택적으로 밀봉형) 중 제1 농도의 중합체 용액, 및 DNA 챔버(예를 들어, 튜브, 비이커, 용기, 통 등, 선택적으로 밀봉형) 중 제2 농도의 DNA 용액을 포함할 수 있다. 시스템은 혼합 챔버(예를 들어, 튜브, 비이커, 용기, 통 등, 선택적으로 밀봉형)를 더 포함할 수 있다. 혼합 챔버는 제1 연결 라인(예를 들어, 튜브, 파이프, 실린더, 호스, 도관, 덕트 등)을 통해 중합체 챔버에 선택적으로 유체 연결되고, 제2 연결 라인(예를 들어, 튜브, 파이프, 실린더, 호스, 도관, 덕트 등)을 통해 DNA 챔버에 선택적으로 유체적으로 연결될 수 있다. 본 시스템은 중합체 챔버와 혼합 챔버 사이의 제1 연결 라인에 결합된 제1 펌프(예를 들어, 양변위, 원심, 또는 축류), 및 DNA 챔버와 혼합 챔버 사이의 제2 연결 라인에 결합된 제2 펌프(예를 들어, 양변위, 원심, 또는 축류)를 더 포함할 수 있다. 본 시스템은 제1 연결 라인에 결합되고 제1 펌프와 혼합 챔버 사이에 위치된 제1 밸브(예를 들어, 솔레노이드 밸브, 공압 작동식 밸브, 압력 작동식 밸브 등), 및 제2 연결 라인에 결합되고 제2 펌프와 혼합 챔버 사이에 위치된 제2 밸브(예를 들어, 솔레노이드 밸브, 공압 작동식 밸브, 압력 작동식 밸브 등)를 더 포함할 수 있다. 본 시스템은 제3 연결 라인을 통해 혼합 챔버로부터 유체 흐름을 수용하는 ??칭 챔버(quenching chamber)를 더 포함할 수 있으며, 여기서 ??칭 챔버는 제3 농도의 ??칭제(quenching agent)를 포함한다. 시스템은 컨트롤러를 더 포함할 수 있다. 본 컨트롤러는 비일시적 메모리에 명령들을 저장할 수 있으며, 이 명령들이 실행되면 컨트롤러로 하여금 제1 펌프, 제2 펌프, 제1 밸브, 및 제2 밸브 중 하나 이상을 제어하여 중합체 용액이 제1 유속으로 혼합 챔버로 가도록 하고 동시에 DNA 용액이 제2 유속으로 혼합 챔버로 가도록 하게 하여 혼합 챔버 내에서 중합체-DNA 복합체를 제공하고 이어서 ??칭 챔버로 가도록 한다. 구현예들에서, 중합체 용액의 농도 및 DNA 용액의 농도는 동일할 수 있다. 다른 예들에서, 중합체 용액의 농도 및 DNA 용액의 농도는 상이할 수 있다. 예들에서, 제1 및 제2 유속은 (예를 들어, 중합체 용액 농도 및 DNA 용액 농도가 동일한 경우) 동일할 수 있거나, 또는 (예를 들어, 중합체 용액 농도 및 DNA 용액 농도가 상이한 경우) 상이할 수 있다.
본 시스템의 일 구현예에서, ??칭제는 비재조합 HSA, 재조합 HSA, 및/또는 기타 알부민 중 하나 이상일 수 있다. 중합체 용액은 일부 구현예에서 PEI, 및/또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 양이온성 중합체를 포함할 수 있다.
본 시스템의 일 구현예에서, 혼합 챔버는 제1 유속 및 제2 유속의 함수로서 중합체 용액 및 DNA 용액의 일관된 혼합 및 체류 시간을 용이하게 하기 위한 모양으로 형성된 기하학적 구조일 수 있다. 예를 들면, 중합체-DNA 복합체의 성장이 혼합 챔버 내에서 일어날 수 있고, 이 성장은 혼합 챔버 내 혼합과 체류 시간의 함수일 수(그리고 또한 DNA 농도 및 중합체 농도의 함수일 수) 있다. 중합체-DNA 복합체의 성장은 중합체-DNA 복합체가 ??칭 챔버에서 침전(및 혼합)될 때 ??칭제에 의해 안정화되고(예를 들어, 추가 성장이 방지되거나 지연될 수 있음), 이에 의해 정의된 크기의 중합체-DNA 복합체를 제공할 수 있다. 일부 예에서, 정의된 크기는 일부 응용의 경우 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다. 예를 들면, DNA 용액이 렌티바이러스 또는 아데노 연관 바이러스의 생산을 위한 바이러스 단백질의 합성을 위한 하나 이상의 유전자를 포함하는 복수의 전달 플라스미드를 포함하는 경우 정의된 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다.
재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체로 세포들의 집단을 형질주입시키는 방법이 또한 본원에 개시된다. 본 방법은 제1 농도의 DNA 용액과 제2 농도의 중합체 용액을 함께 혼합하여 용액 중 중합체-DNA 형질주입 복합체를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 제1 미리 결정된 기간 이후 ??칭제를 통해 중합체-DNA 형질주입 복합체의 크기를 안정화하여 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이어서, 본 방법은 하나 이상의 동결건조제를 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체에 첨가하는 단계 및 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 분말로 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 다음, 나중 시간에, 본 방법은 동결건조된 안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 재구성하여 재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 수득하는 단계, 재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 형질주입 용액으로 희석하는 단계, 및 세포들의 집단을 재구성된 중합체-DNA 형질주입 복합체로 형질주입하는 단계를 포함할 수 있다.
이러한 방법의 경우, 중합체는 양이온성 중합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 중합체는 PEI 또는 본원에 개시된 다른 양이온성 중합체일 수 있다. 일부 구현예에서, ??칭제는 HSA일 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 용액은 바이러스 게놈의 적어도 일부를 코딩하는 복수의 전달 플라스미드를 더 포함할 수 있다. 대표적인 예로서, 바이러스 게놈은 렌티바이러스 게놈일 수 있다. 다른 대표적인 예로서, 바이러스 게놈은 아데노 연관 바이러스 게놈일 수 있다.
이러한 방법의 일부 구현예에서, 분말은 상기 나중 시간까지 4°C, -20°C 또는 -80°C에 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 동결건조제는 만니톨 및 수크로스 중 하나 이상일 수 있다. 일 예에서, 동결건조제는 만니톨과 수크로스 모두를 포함할 수 있고, 여기서 만니톨은 25-35mg/mL(예를 들어, 30mg/mL)의 농도일 수 있고 수크로스는 15-25mg/mL(예를 들어, 20mg/mL)의 농도일 수 있다. 또 다른 예에서, 동결건조제는 만니톨만 25-35mg/mL(예를 들어, 30mg/mL)의 농도로 포함할 수 있다.
안정화된 중합체-DNA 형질주입 복합체를 동결건조하는 방법론은 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 본원에 개시된 방법들 및 시스템들 중 임의의 것과 함께 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
II. 용어
본 개시내용의 다양한 구현예의 검토를 용이하게 하기 위해, 특정 용어에 대한 다음 설명이 제공된다. 이러한 설명은 개시내용을 제한하거나 본원에 제공된 용어의 정의를 제공하기 위한 것이 아니다.
제제(agent): 임의의 단백질, 핵산 분자(화학적으로 변형된 핵산 포함), 화합물, 저분자, 유기 화합물, 무기 화합물 또는 기타 관심 분자. 제제에는 치료제, 진단제, 약학적 제제, 안정화제/??칭제(예를 들어, 폴리플렉스 안정화제) 및/또는 동결건조제가 포함될 수 있다. 치료제 또는 약학적 제제는 단독으로 또는 추가 화합물과 함께 목적하는 반응을 유도하는 것(예를 들어, 대상체에게 투여될 때 특정 질병 또는 병태를 억제하거나 치료하는 것을 포함하여 치료 또는 예방 효과를 유도하는 것)이다. 안정화제는 목적하는 반응이 병태 또는 복합체를 안정화시키는 것이다. 일 예에서, 안정화제는 HSA와 같은 폴리플렉스 안정화제이다. ??칭제는 반응 또는 프로세스가 발생하는 것을 ??칭/정지시키는 목적하는 반응을 유도하는 것이다. 폴리플렉스의 추가 성장을 방지하고 또한 폴리플렉스의 퇴행(degradation)을 실질적으로 방지하는 HSA와 관련하여, 예들에서 본원에서 논의된 HSA는 안정화제 및 ??칭제 모두를 지칭할 수 있다.
세포 배양: 세포의 임의의 시험관내 배양. 이 용어에는 연속계대 세포주(예를 들어, 불멸 표현형을 가짐), 1차 세포 배양, 유한 세포주(예를 들어, 형질전환되지 않은 세포) 및 시험관내에서 유지되는 기타 세포 집단이 포함된다. “세포 배양 배지”는 세포를 배양하는 데 사용되는 배지를 의미한다.
접촉: 고체 및 액체 형태를 모두 포함하여 직접적 물리적 회합에 배치하는 것. 제제와 세포의 접촉은 시험관내에서 제제를 단리된 세포에 첨가하여 발생하거나 생체내에서 제제를 대상체에게 투여함으로써 발생할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 DNA 용액과 양이온성 중합체 용액을 혼합하는 것은 DNA 용액을 양이온성 중합체 용액과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 양이온성 중합체-DNA 폴리플렉스는 ??칭제와 접촉하여 폴리플렉스의 추가 성장을 방지하거나 지연시키고/거나 크기를 안정화시킬 수 있다.
대조군: 시험 샘플과 비교하는 데 사용되는 샘플 또는 표준. 일부 구현예에서, 대조군은 과거 대조군 또는 표준 값(예를 들어, 기준선 또는 정상 값(예를 들어, 발현 값)을 나타내는 이전에 시험한 대조군 샘플 또는 샘플들의 군), 예컨대 특정 치료제를 받지 않은 대상체에서 특정 유전자 또는 유전자 산물의 기준선 또는 정상 값이다. 대조군은 치료된 샘플(예를 들어, 특정 제제로 처리된)과의 비교를 위해 치료되지 않은 샘플(예를 들어, 특정 제제의 부재)을 나타낸다.
유전자 치료: 질병을 치료하거나 자연 상태에 존재하지 않는 능력을 세포나 유기체에 부여하려는 의도로, 관심 유전자를 암호화하는 DNA를 세포 내로 전달하는 것. 바이러스(예를 들어, 감마레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 통한 유전자 치료는 바이러스가 세포에 들어가 유전 물질을 전달하는 능력에 의존한다. 감마레트로바이러스 및 렌티바이러스는 역전사 효소라고 하는 바이러스로 암호화된 효소에 의해 형질도입된 세포에서 DNA로 변환되는 RNA 게놈을 함유하는 레트로바이러스의 아형이다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 생존에 필요한 기본 유전자는 gag, pol 및 env 유전자이며; gag는 구조 단백질을 암호화하고, pol은 역전사 및 숙주 세포 게놈 내로 통합에 필요한 효소를 암호화하며, env는 바이러스 외피 당단백질을 암호화한다.
숙주 세포: 벡터가 증식되고 그 DNA가 발현되는 세포. 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 상기 용어는 또한 대상체 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 복제 중에 발생하는 돌연변이가 있을 수 있으므로 모든 자손이 부모 세포와 동일하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 다만, “숙주 세포”라는 용어를 사용하는 경우에는 이러한 자손이 포함된다.
인간 혈청 알부민( HSA ): 분자량 66,437 Da(아미노산 조성 기준)로 인간 혈장에 가장 풍부한 단백질. 상업적 조제품은 주로 66,437 내지 66,600 Da 범위의 분자량 성분을 가진 다양한 정도의 번역 후 변형 및 유전적 변이체를 함유한다. HSA는 전통적인 Cohn 방법과 열 충격 방법에서 파생된 저온 알코올 분획 프로세스를 사용하여 생산될 수 있다. 예들에서, HSA는 재조합적으로 생산될 수 있다.
증가 또는 상향조절: 어떤 것의 질이나 양이나 강도를 높이는 것. 일 예에서, 제제는 본원에 개시된 분자의 활성을 예를 들어 제제의 부재와 대비하여 증가시킨다. 구체적인 일 예에서, 제제는 분자의 활성 또는 발현을 10% 내지 95% 사이, 20% 내지 80% 사이, 30% 내지 70% 사이, 40% 내지 50% 사이를 포함하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 또는 심지어 적어도 90%, 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 증가시킨다. 이러한 증가는 본원에 개시된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 예에서, 발현의 증가는 유전자 산물 또는 유전자 산물의 활성의 증가를 지칭한다. 유전자 산물은 (mRNA, rRNA, tRNA 및 구조적 RNA 같은) RNA 또는 단백질일 수 있다.
유전자 상향조절은 유전자 산물의 생산에서 검출 가능한 모든 증가를 포함한다. 특정 예에서, 유전자 산물의 생산은 제제의 투여에 반응하여, (제제에 노출되지 않은 세포에서 유전자 발현의 양 등의) 대조군과 비교하여 적어도 2배, 예를 들어, 적어도 3배 또는 적어도 4배 증가한다. 분자의 발현을 검출하거나 측정하는 것은 샘플에 존재하는 유전자, 유전자 산물 또는 이의 조절인자의 양을 정량화하는 것을 포함한다. 정량화는 수치적이거나 상대적일 수 있다. 유전자, 유전자 산물 또는 이의 조절인자의 발현을 검출하는 것은 PCR(예를 들어, 정량적 RT-PCR)로 핵산을 측정하고 ELISA로 단백질을 측정하는 것과 같이 당업계에 알려지거나 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 정성적 또는 정량적 방식의 발현 수준에는 핵산 또는 단백질의 검출이 포함될 수 있다. 예시적인 방법에는 마이크로어레이 분석, RT-PCR, 노던 블롯, 웨스턴 블롯, 및 질량분광분석법이 포함된다.
단리된 (isolated): “단리된” 생물학적 성분(예컨대 핵산, 분자, 단백질, 또는 세포)은 유기체의 세포에서 또는 유기체 자체에서 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리되거나 정제되며, 여기서 이 성분은 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포와 같이 자연적으로 발생한다. “단리된” 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법으로 정제된 것으로 이해될 수 있다. 이 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산 분자 및 단백질뿐만 아니라 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다.
선택적(optional): “선택적(optinal)” 또는 “선택적으로(optionally)”는 이어서 설명되는 이벤트 또는 상황이 발생할 수 있지만 반드시 발생해야 할 필요는 없으며 이 설명에는 상기 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
PEI:아민기와 2개의 탄소 지방족 CH2CH2 스페이서로 구성된 반복 단위를 갖는 중합체. 선형 폴리에틸렌이민은 1차, 2차 및 3차 아미노기를 함유하는 분지형 PEI와 달리 모든 2차 아민을 함유한다. 완전히 분지된 덴드리머 형태도 보고되었다. PEI는 산업 규모로 생산되며 일반적으로 다양한 양이온 특성에서 파생된 많은 응용 분야가 있다. PEI의 화학적 구조는 (C2H5N)n이다. 본원의 구현예들에서, PEI는 형질주입제로 사용된다. PEI는 DNA를 양전하를 띤 입자로 응축하고, 이는 음이온성 세포 표면 잔기에 결합하고 세포내이입을 통해 세포 내로 유입된다. 일단 세포 내부로 들어가면 아민의 양성자화 첨가는 반대 이온의 유입과 삼투압 전위의 저하를 초래한다. 삼투성 팽윤은 세포질로 중합체-DNA 복합체(폴리플렉스)를 방출하는 소포를 파열시킨다. DNA는 “양성자 스폰지” 메커니즘에 의해 엔도솜에서 세포질로 방출되어 후속 전사를 위한 핵 수송을 허용한다. PEI-DNA 복합체의 크기, 전하 및 회합은 세포내이입/식세포작용뿐만 아니라 세포내 패키징 해제 및 수송에 영향을 미친다. PEI 기반 폴리플렉스의 물리적 및 생물학적 특성에 영향을 미치는 인자는 (예를 들어, PEI 및 DNA의) 분자량, PEI에 대한 모든 화학적 변형(예를 들어, 분기 변형) 또는 DNA, PEI-DNA 복합체를 생성하기 위한 완충액, 복합체 안정성, 복합체 크기, DNA의 표면 전하, 복합체화 효율, 복합체의 형질주입 효율, 복합체 응집, 세포독성 문제, 형질주입 복합체 흡수의 메커니즘, 면역자극 문제, 순환 반감기, 혈청 단백질과의 상호작용, 생물학적 활성, 옵소닌작용, 및 배설을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. PEI Pro(PolyPlus)는 소유권 있는 분자량을 가진 선형 PEI이다. 이것은 GMP 등급에서 사용 가능한 화학적으로 정의되고 완전히 특성화된 산물이며 일부 구현예에서 사용될 수 있다.
용어 “PEI-DNA” 복합체는 본원에서 PEI가 DNA에 결합된 조성물을 설명하기 위해 사용된다.
폴리플렉스 용액: PEI-DNA 복합체를 함유하는 용액과 같이 DNA와 양이온성 중합체를 함유하는 용액.
재조합: 재조합 핵산 또는 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 서열을 갖거나 그렇지 않으면 서열의 분리된 두개 분절의 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이 인공적인 조합은 종종 화학적 합성이나 예를 들어 유전자 조작 기술과 같은 핵산의 단리된 분절들의 인공적인 조작에 의해 달성된다. 재조합이라는 용어는 천연 핵산 분자 또는 단백질의 일부를 첨가, 치환 또는 결실함으로써만 변경된 핵산 및 단백질을 포함한다. 예를 들면, “재조합 단백질”은 동물 또는 인간에서 합성되지 않은 단백질 또는 펩타이드이다. 비제한적인 예는 재조합 HSA를 포함한다.
형질주입: 진핵 세포 내로 외래 DNA를 도임하는 것. 형질주입은 인산칼슘-DNA 공침전, DEAE-덱스트란-매개 형질주입, 폴리브렌-매개 형질주입, 전기천공법, 미세주입, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 양이온계 형질주입 및 유전자총법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 본원에 개시된 방법 및 본 기술분야에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다.
“형질주입 동안”이라는 용어는 형질주입 동안 또는 이후를 의미한다. “형질주입 시약”은 분자에 결합하고 분자를 세포로 전달 및/또는 세포에 의한 분자의 흡수를 촉진하는 물질 또는 물질의 혼합물(예를 들어, 양이온성 지질, 전하를 띤 중합체, 또는 세포에 침투하는 펩타이드)을 지칭한다. 시약 기반 형질주입은 형질주입 시약을 사용하여 수행되는 형질주입을 지칭한다. “형질주입 배지”라는 용어는 형질주입에 사용될 수 있는 배지를 지칭한다.
하기에 충분한 조건에서: 목적하는 활동을 허용하는 모든 환경을 설명하는 데 사용되는 문구. 일 예에서, 이는 형질주입과 같은 분자의 흡수를 유도하기에 충분한 조건을 포함한다.
벡터: 한 세포에서 다른 세포로 핵산(예를 들어, DNA) 분절(들)을 전달하는 핵산 분자. 예를 들면, 벡터는 바이러스 입자, 플라스미드, 트랜스포손 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 백신 벡터는 백신의 일부로서 항원 또는 항원에 대한 유전자를 전달하는 데 사용되는 바이러스, 세균 또는 기타 미생물 또는 핵산일 수 있다. 핵산 벡터는 숙주 세포에 도입되어 형질전환된 숙주 세포를 생산하는 핵산 분자이다. 재조합 DNA 벡터는 재조합 DNA를 갖는 벡터이다. 벡터는 복제 기점과 같이 숙주 세포에서 복제하도록 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선별 표지 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 하나 이상의 바이러스로부터 유래된 적어도 일부 핵산 서열을 갖는 재조합 DNA 벡터이다. 레트로바이러스 벡터는 핵산을 세포에 도입하기 위한 벡터로 사용되는 변형된 레트로바이러스와 관련하여 사용된다. 본원에 사용될 때 용어 “발현 벡터”는 목적하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 원핵생물에서 발현에 필요한 핵산 서열은 보통 다른 서열과 함께 프로모터, 작동유전자(선택 사항) 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
일부 예에서, 벡터는 LVV이다. 임상적으로 LVV는 유전 물질의 넓은 영역(예를 들어, > 9kb)을 숙주 게놈에 도입하는 능력, 분열 및 비분열 세포를 형질도입하는 LVV의 능력, 표적 세포의 게놈에 안정적으로 통합하여 해당 세포와 그 자손에 평생 교정을 제공하는 능력을 포함하되 이에 국한되지 않는 이유로 유전자 치료에 사용될 수 있다. 다른 예들에서, 벡터는 AAV이다.
바이러스: 살아있는 세포 내부에서 번식하는 미세한 감염성 유기체. 바이러스는 필수적으로 단백질 외피로 둘러싸인 핵산의 중심부로 구성되며, 살아있는 세포 내에서만 복제할 수 있는 능력을 가지고 있다. “바이러스 복제”는 적어도 하나의 바이러스 수명 주기의 발생에 의한 추가적인 바이러스의 생산이다. 바이러스는 숙주 세포의 정상적인 기능을 파괴하여 세포가 바이러스에 의해 결정된 방식으로 행동하도록 한다. 예를 들면, 바이러스 감염은 감염되지 않은 세포가 일반적으로 그렇게 하지 않을 때 사이토카인을 생성하거나 사이토카인에 반응하는 세포를 초래할 수 있다.
“레트로바이러스”는 바이러스 게놈이 RNA인 RNA 바이러스이다. 숙주 세포가 레트로바이러스에 감염되면, 게놈 RNA는 감염된 세포의 염색체 DNA에 매우 효율적으로 통합되는 DNA 중간체로 역전사된다. 통합된 DNA 중간체를 프로바이러스라고 한다. 렌티바이러스는 이의 사전 통합 복합체(바이러스 “껍질”)가 표적 세포 핵의 손상되지 않은 막을 통과할 수 있기 때문에 분열 및 비분열 세포 모두를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 한 유형이다. 렌티바이러스 기반 세포 및 유전자 요법은 미국 식품의약국(FDA)과 유럽 의약품청(European Medicines Agency)의 승인을 받았으며 추가적인 렌티바이러스 기반 세포 요법이 향후 승인될 것으로 예상된다.
III. 시스템 및 사용 방법
i. 부유성 세포 배양에서 바이러스 벡터 생산을 최적화하기 위한 미리 결정된 크기 범위 내의 형질주입 복합체를 제공하는 방법
바이러스 벡터 생산 프로세스는 특정 세포 유형에서 발현될 때 궁극적으로 목적하는 바이러스 입자를 생산하고 이어서 임상 및/또는 연구 환경에서 사용하기 위해 수확할 수 있는 유전자를 코딩하는 복수의 전달 플라스미드로 특정 세포 유형을 형질주입하는 것을 포함한다. 일 예에서, 형질주입 프로세스는 복수의 플라스미드를 양이온성 중합체(예를 들어, PEI)와 결합하여 DNA 플라스미드를 음이온성 세포 표면에 결합하는 양전하를 띤 입자로 축합하는 것을 포함한다. 일단 결합되면, 형질주입 복합체(예를 들어, PEI-DNA 형질주입 복합체)는 세포에 의해 세포내 이입될 수 있고, DNA(예를 들어, 복수의 전달 플라스미드)는 세포의 세포질로 방출될 수 있다. 이 프로세스는 소규모에서 효율적인 바이러스 벡터 생산을 초래할 수 있지만, 예를 들어 유전자 치료 방법에 적절한 규모로 프로세스를 확장하는 데는 어려움이 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 수확 시 바이러스 벡터 역가는 중합체와 DNA의 초기 혼합 사이의 시간과 중합체-DNA 형질주입 복합체가 목적하는 세포 유형으로 형질주입될 때로 정의되는 복합체화 시간이라고도 하는 대기 시간(hold time)에 민감할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같이, 중합체-DNA 대기 시간이 길수록 수확 시 바이러스 벡터 역가는 낮아질 수 있다. 이 효과는 고농도 중합체-DNA 용액이 수확 시 허용 가능한 바이러스 벡터 역가를 생성하기 위해 더 짧은 대기 시간을 요구하여, 농도 의존적일 수 있다. 구체적인 예로서, 중합체-DNA 복합체가 HEK293 세포 배양에 3% v/v 첨가되기 위해 필요한 농도에서 최적 대기 시간은 2분 이하일 수 있다. 2분 이하의 대기 시간은 대규모 생산 규모에서 달성하는 것이 불가능하지는 않더라도 어려울 수 있기 때문에 이 짧은 대기 시간은 상당한 제조상의 문제를 야기한다. 구체적으로, 현탁 플랫폼이 목표 상업 규모로 확장될 때, 중합체와 DNA를 포함하는 마스터 믹스(master mix) 부피는 혼합하기에 너무 큰 부피에 도달할 수 있고 적절한 형질주입을 달성하기에 충분히 빠르게 현탁 배양에 도입될 수 있으며, 따라서 규모에 맞는 생물반응기 부피에 도입된 형질주입 복합체가 적절하게 형성되도록 할 필요가 있다.
따라서, 제1 농도의 PEI 용액 및 제2 농도의 DNA 용액을 제공하는 단계, 제1 미리 결정된 양의 PEI 용액을 제2 미리 결정된 양의 DNA 용액에 첨가하는 단계 및 혼합하여 용액 중 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 논의된다. 일부 구현예에서, 제1 미리 결정된 기간 이후, 본 방법은 제3 미리 결정된 양의 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제를 PEI-DNA 용액에 첨가하여 안정화된 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계를 포함하고, 제1 미리 결정된 기간 다음에 제2 미리 결정된 기간 이후에, 본 방법은 세포들의 집단을 안정화된 PEI-DNA 복합체로 형질주입하는 단계를 포함한다. 이 방법론은 PEI-DNA 복합체의 성장을 목적하는 크기 또는 특정 적용을 위한 최적의 크기로 정지시켜 효율적인 형질주입을 촉진함으로써 수확 시 바이러스 벡터 역가의 수율을 향상시킨다. PEI-DNA 형질주입 복합체의 크기를 안정화시키는 능력을 통해, 더 큰 부피의 마스터 믹스(예를 들어, DNA와 중합체가 함께 혼합되는 용액)가 생성될 수 있고, 제2 미리 결정된 기간은 규모에 맞는 생물반응기 부피의 효율적인 형질주입을 가능하게 하는 기간으로 연장될 수 있다.
본원에서 그리고 아래 실시예 3과 관련하여 구체적으로 논의되는 바와 같이, 제2 미리 결정된 기간은 PEI-DNA 형질주입 복합체를 안정화하고(도 7c 참조), 여전히 수확 시 바이러스 벡터의 측정 가능한 양 및 일부 예에서 허용 가능한 양을 생산하기 위해 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제의 첨가 후 최대 18시간까지 기간으로 연장될 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 한 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 2분 내지 18시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 2분 내지 1시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 2분 내지 2시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 10분 내지 1시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 10분 내지 2시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 30분 내지 1시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 30분 내지 2시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 2시간 내지 4시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 3시간 내지 5시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 4시간 내지 6시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 6시간 내지 12시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 기간은 4시간 내지 8시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 범위는 8시간 내지 18시간 사이의 범위를 포함한다. 또 다른 예에서, 제2 미리 결정된 범위는 최대 약 18시간까지의 범위, 예컨대 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간 시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간 또는 약 18시간을 포함한다.
일부 구현예에서, PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 PEI-DNA 복합체의 추가 성장을 지연시키거나 방지하는 임의의 제제를 포함한다. 일 예로서, 이 제제는 비재조합 HSA, 재조합 HSA 또는 이들의 조합과 같은 HSA일 수 있다. 또 다른 추가 또는 대체 예로서, 이 제제는 HSA와 회합된(예를 들어, HSA를 포함하는 조성물에 포함된) 분자(예를 들어, 펩타이드, 단백질, 리보핵산, 디옥시리보핵산, 저분자 등)일 수 있다. 예를 들면, 이 제제는 일 구현예에서 HSA 플러스 분자일 수 있거나, 다른 구현예들에서 이 제제는 HSA로부터 정제되거나 단리된 분자일 수 있다. 또 다른 예에서, PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 재조합적으로 생산된 HSA를 포함한다. 대표적인 일 예에서, 재조합적으로 생산된 HSA는 피치아 파스토리스(P. pastoris)로부터 발현 및 정제될 수 있다. PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제가 재조합적으로 생산된 HSA를 포함하는 일 예에서, 이 제제는 재조합적으로 생산된 HSA 자체일 수도 있고, 또는 추가로 또는 대안적으로 재조합적으로 생산된 HSA와 회합된(예를 들어, HSA를 포함하는 조성물에 포함된) 분자(예를 들어, 펩타이드, 단백질, 리보핵산, 디옥시리보핵산, 저분자 등)일 수도 있다. 일 구현예에서, 이 제제는 재조합적으로 생산된 HSA 플러스 분자를 포함하거나, 다른 구현예들에서, 이 제제는 HSA로부터 정제되거나 단리된 분자일 수 있다.
ii.
폴리플렉스의
크기를 안정화하는 방법.
양이온성 중합체 기판 시약들은 지질 기반 시약들을 사용하여 형질주입될 때 낮은 효율을 나타내는 세포를 형질주입시키는 데 특히 유용할 수 있다. 최적의 농도들에서 사용될 때, 이 시약들은 낮은 독성을 나타낸다. 중합체 기반 형질주입 시약들은 현탁 배양, 일차 세포, 다양한 진핵 세포주, 부착성 세포 등을 형질주입하는 데 사용할 수 있다. 현재 많은 천연 및 합성 양이온성 중합체 기반 형질주입 시약을 사용할 수 있다. 그러나, 형질주입 효능, 및 결과적으로 목적하는 유전자의 발현은 일부 예에서 양이온성 중합체 및 DNA를 포함하는 형질주입 복합체(예를 들어, DNA 플라스미드 또는 복수의 DNA 플라스미드)의 비최적의 크기(예를 들어, 너무 크거나 너무 작음)에 의해 악영향을 받을 수 있다. 형질주입에 최적인 크기의 형질주입 복합체를 제공하여 형질주입 시술에서 발생하는 하류 유전자 발현을 향상시키기 위해 폴리플렉스의 크기를 안정화시키는 방법이 본원에 개시된다. 일 예에서, 본 방법은 디옥시리보핵산(DNA)을 포함하는 제1 용액을 양이온성 중합체를 포함하는 제2 용액과 함께 혼합하여 폴리플렉스 용액을 얻는 단계, 및 상기 제1 용액과 제2 용액을 함께 혼합한 후 미리 결정된 시간에 상기 폴리플렉스 용액에 폴리플렉스 안정화제를 첨가하여 폴리플렉스의 크기를 안정화시키는 단계를 포함한다.
양이온성 중합체는 일부 예에서 PEI를 포함하지만, 다른 구현예들에서, 양이온성 중합체는 다를 수 있다. 일부 구현예에서, PEI Pro는 양이온성 중합체이다. 사용될 수 있는 예시적인 양이온성 중합체에는 히스톤, 폴리-L-리신, 폴리아미도아민 덴드리머, 프로타민 및/또는 이들의 임의의 조합 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
폴리플렉스의 적절한 크기는 상이한 응용 분야마다 다를 수 있다. 일부 예에서, 폴리플렉스의 적절한 크기는 직경이 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500 나노미터를 포함하나 이에 한정되지 않는 200 내지 1500 사이 크기 범위를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 300 내지 500 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 400 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 400 내지 800 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 900 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 800 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 700 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 700 내지 1500 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 800 내지 1400 나노미터 사이일 수 있다. 논의된 크기 범위는 폴리플렉스의 유체역학적 직경과 관련이 있음을 이해할 수 있다.
특정 응용에 적합한 폴리플렉스의 크기를 결정하기 위해, 다양한 상이한 폴리플렉스 크기를 생성하여 목적하는 세포 유형으로 형질주입할 수 있으며, 이어지는 유전자 발현을 본원에 개시되고 본 기술분야에 알려진 방법들에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들어 리포터(예를 들어, 형광 리포터, 생체발광 리포터), 수확 시 바이러스 벡터, 염색 프로토콜들에 의해 모니터링된 단백질 발현량, 면역형광 염색, log(벡터 게놈들) 등을 통해 모니터링한, 목적하는 범위 내의 유전자 발현 수준은 특정 폴리플렉스 크기 범위와 상관관계가 있을 수 있다. 폴리플렉스 크기(예를 들어, 나노입자 크기)는 대표적인 예로서 동적 광 산란 방법론을 통해 결정될 수 있다. 후속적으로, 특정 응용에 최적인 유전자 발현을 달성하기 위해, 본원에서 논의된 폴리플렉스를 안정화하기 위한 방법론을 이용하여 특정 세포 유형을 형질주입하기 위해 목적하는 범위 내의 유전자 발현에 상응하는 특정 크기의 폴리플렉스들을 생성할 수 있다.
폴리플렉스의 크기를 안정화하는 방법의 대표적인 일 예에서, DNA를 포함하는 제1 용액은 복제 불능 렌티바이러스를 함께 암호화하는 복수의 전달 플라스미드를 포함할 수 있고, 제2 용액을 위한 양이온성 중합체는 PEI일 수 있다. 폴리플렉스 안정화제는 HSA를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 폴리플렉스 형성의 시작 이후 및 안정화 전 미리 결정된 시간은 유체역학적 직경 400 내지 1000 나노미터 사이 범위를 포함할 수 있는 목적하는 크기의 폴리플렉스(예를 들어, 플라스미드 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부를 암호화하는 복수의 DNA 및 PEI의 형질주입 복합체)를 제공하도록 선택될 수 있다. 미리 결정된 시간은 제1 용액(예를 들어, DNA 농도) 및 제2 용액(예를 들어, 양이온성 중합체 농도) 각각의 농도의 함수일 수 있다. 예를 들면, 폴리플렉스의 주어진 목적하는 크기에 대해, 제1 용액 및 제2 용액의 농도가 더 작을 때 미리 결정된 시간은 더 클 수 있는 반면, 제1 용액 및 제2 용액의 농도가 더 클 때 미리 결정된 시간은 더 작을 수 있다. 폴리플렉스 안정화제의 첨가 전에 폴리플렉스의 형성을 촉진하기 위해 미리 결정된 온도 및/또는 미리 결정된 pH에서 제1 용액과 제2 용액의 혼합을 수행할 수 있다. 일부 예에서, 본 방법론은 제1 용액이 제2 용액과 혼합되는 속도(rate)를 제어하는 것을 포함할 수 있다. 일 예로서, 이 속도(rate)는 제1 용액과 제2 용액이 함께 혼합되는 속력(speed)을 통해, 예를 들어, 제1 용액과 제2 용액을 혼합하는 교반 막대 또는 다른 혼합 디바이스의 속력(speed)을 제어함으로써 제어할 수 있다. 다른 예들에서, 제1 용액과 제2 용액의 혼합은 자동화 혼합 시스템을 통해 이루어질 수 있으며, 그 예는 아래에서 더 자세히 논의한다.
이러한 예에서, 일단 폴리플렉스가 목적하는 크기로 안정화되면, 폴리플렉스는 목적하는 세포들의 집단을 형질주입하는 데 사용될 수 있다. 목적하는 세포들의 집단은 예를 들어 생물반응기에서 현탁액으로 성장한 세포를 포함할 수 있다. 형질주입은 약 1분 내지 18시간 범위, 예컨대 2시간 내지 약 18시간 이하의 범위 내에서 폴리플렉스의 안정화 이후에 일어날 수 있다. 따라서, 폴리플렉스 안정화제를 통한 폴리플렉스의 안정화는 일부 예에서 목적하는 세포가 형질주입되는 기간이 최대 18시간까지 연장되도록 한다. 폴리플렉스의 안정화 후 2시간 내지 18시간 사이에 형질주입 효능(그리고 따라서 수확 시 LVV 역가)이 점진적으로 감소할 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들면, 수확 시 바이러스 벡터는 세포가 폴리플렉스 안정화 후 2시간 이하에 형질주입되는 경우와 비교하여 세포가 폴리플렉스 안정화 후 12시간에 형질주입되는 경우 더 낮을 수 있다.
상기 대표적인 예는 렌티바이러스 생산에 사용하기 위한 폴리플렉스 안정화 방법론의 사용에 초점을 맞추었지만, 유사한 방법론이 다른 바이러스 벡터 생산에도 사용될 수 있다. 예로는 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 유사 분열 활성 세포 유형만 감염시킬 수 있는 표준 레트로바이러스가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
iii. 정의된 크기의 중합체-DNA 나노입자를 생산하기 위한 시스템.
중합체(예를 들어, PEI)와 핵산으로 구성된 형질주입 복합체의 생성에는 수많은 인자가 관련될 수 있다. 간단히 말하면, 형질주입이 필요한 핵산의 관점에서, 고려 사항에는 분자량, 변형의 존재 또는 부재, 표면 전하 등이 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. 중합체의 관점에서, 고려 사항에는 무엇보다 분자량 및 분지 변형이 포함될 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. 형질주입 복합체 또는 폴리플렉스 자체의 관점에서, 고려 사항에는 복합체가 생성되는 완충액의 선택과 pH, 온도, 혼합 속도 등과 같은 관련 매개변수가 포함될 수 있지만 이에 국한되지 않는다. 형질주입 효능의 최적화, 및 그에 따른 형질주입으로부터 유래하는 유전자 발현의 목적하는 수준의 최적화 측면에서, 고려 사항에는 복합체 안정성, 복합체 크기, 응집, 세포독성 등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 따라서, 위에서 논의된 바와 같이 미리 결정된 크기 범위 내의 크기의 형질주입 복합체를 안정적으로 생산하기 위해서는, 특히 대규모 응용(예를 들어, 생물반응기)의 경우 형질주입 복합체 생산 프로세스의 자동화가 바람직할 수 있다는 점이 본원에서 인식된다.
이에 따라, 정의된 크기의 중합체-DNA 나노입자를 생산하기 위한 시스템이 본원에 개시된다. 도 8a는 본원의 구현예들에 따른 예시적인 설계를 제공한다. 간단히 말하면, 일 예에서, 시스템은 무혈청 배지에 희석된 PEI의 제1 용기, 및 무혈청 배지에 희석된 플라스미드 DNA의 제2 용기를 포함한다. 본 시스템은 통과하는 유체의 정의된 체류 시간이 있는 인라인 혼합 장치를 포함한다. 정의된 체류 시간은 일부 예에서 유체들이 인라인 혼합 장치로 전달되는 속도의 함수일 수 있다. 인라인 혼합 장치는 제1 용기 및 제2 용기 각각에 유체적으로 결합될 수 있어서, 인라인 혼합 장치는 제1 용기 및 제2 용기 각각으로부터 유체 흐름을 동시에 수용할 수 있다. 용기들과 인라인 혼합 장치는 연결 라인(예를 들어, 튜빙, 호스, 파이프 등)을 통해 유체적으로 결합될 수 있다. 구체적으로, 인라인 혼합 장치는 제1 용기 및 제2 용기 각각으로부터 용액들을 수신할 수 있으며, 용액들이 정의된 체류 시간 동안 서로 혼합되고 접촉하도록 용액들을 인라인 혼합 장치 내에서 혼합할 수 있다. 정의된 체류 시간은 또한 인라인 혼합 장치의 기하학적 구조(예를 들어, t형상), 치수(예를 들어, 인라인 혼합 장치와 관련된 튜빙 또는 채널의 직경(들)), 또는 다른 특징들 중 하나 이상의 함수일 수 있다. 본 시스템은 ??칭제(예를 들어, HSA)를 함유하는 수용 용기를 더 포함할 수 있다. 수용 백 또는 용기는 연결 라인(예를 들어, 튜빙, 호스 등)을 통해 인라인 혼합 장치에 유체적으로 결합될 수 있고 인라인 혼합 장치로부터 유체 흐름을 수용할 수 있다. PEI-DNA 형질주입 복합체가 수용 용기 내로 침착될 시, ??칭제는 인라인 혼합 장치 내에서 생성되는 PEI-DNA 형질주입 복합체를 안정화할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 일단 ??칭제에 의해 안정화되면, 안정화된 PEI-DNA 형질주입 복합체를 함유하는 용액들은 바이알들 또는 다른 허용 가능한 용기들 내로 분취되어 예를 들어 4-8°C에서 저장되고/거나 장기간 저장을 위해 동결건조될 수 있다.
일부 구현예에서, 예시적인 시스템은 중합체 용액 및 DNA 용액을 위한 2개의 분리된 챔버를 포함한다. 2개의 챔버는 상이한 용액들을 교반하기 위한 수단(예를 들어, 자기 교반 막대, 오버헤드 교반 막대 등)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 시스템은 하나의 연결 라인을 통해 DNA 용액을 혼합 챔버로 보내고 유사하게 다른 하나의 연결 라인을 통해 중합체 용액을 혼합 챔버로 보내는 복수의 펌프(예를 들어, 2개)를 포함할 수 있다. 펌프의 사용이 개시되어 있지만, 펌프에 더하여 또는 펌프 대신에 중력이 사용되는 것도 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 논의된 것과 유사하게, 연결 라인(들)은 호스, 튜빙 등을 포함할 수 있다. 일방향 또는 양방향 밸브, 연속 가변 밸브 등의 유량 제어 디바이스가 펌프들과 혼합 챔버 사이의 연결 라인들 각각에 포함될 수 있으며, DNA 용액과 중합체 용액이 혼합 챔버로 전달되는 흐름 속도를 제어하거나 수정하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 유량 제어 디바이스는 전기적을 작동할 수 있지만, 다른 예들에서는 유량 제어 디바이스가 수동으로 작동할 수 있다. 이러한 시스템의 자동화를 위해서, 컨트롤러가 포함되고 조작자를 통해 프로그래밍 가능할 수 있으며, 이는 비일시적 명령들을 포함할 수 있는데, 이 명령들은 실행될 때 컨트롤러로 하여금 적어도 펌프들 및 유량 제어 디바이스들을 제어하여 DNA 용액과 중합체 용액이 혼합 챔버로 전달되는 유속을 제어하게 한다.
이러한 시스템에서, 중합체-DNA 형질주입 복합체의 형성은 혼합 챔버에서 시작될 수 있음을 이해할 수 있다. 따라서 혼합 챔버는 혼합 챔버 내에서 두 용액의 충분한 혼합을 촉진하기 위해 정의된 기하학적 구조를 가질 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 일단 시작되면, 중합체-DNA 복합체는 시간이 지남에 따라 크기(예를 들어, 입자 직경)가 성장한다. 이에 따라, 혼합 챔버는 형질주입 복합체가 혼합 챔버를 빠져나가기 전에 성장하는 형질주입 복합체의 정의된 체류 시간이 있도록 설계될 수 있다. 체류 시간은 DNA 및 중합체 용액이 혼합 챔버로 전달되는 유속, 혼합 챔버 직경, 혼합 챔버 형상 등의 함수일 수 있다. 이러한 방식으로, 혼합 챔버 내에서 형성된 형질주입 복합체는 혼합 챔버를 빠져나가기 직전에 정의된 크기(예를 들어, 미리 결정된 크기 범위 내)에 도달하여 목적하는 크기의 형질주입 복합체를 일관되게 생산할 수 있다.
혼합 챔버를 빠져나갈 시, 목적하는 크기의 형질주입 복합체는 ??칭 챔버로 전달될 수 있다. ??칭 챔버는 ??칭제를 포함하는 ??칭 용액을 포함할 수 있다. 일부 예에서, ??칭제는 비재조합 HSA일 수 있다. 다른 추가 또는 대안적인 예들에서, ??칭제는 재조합적으로 생산된 HSA일 수 있다. ??칭제가 재조합적으로 생산된 HSA인 한 특정 예로서, HSA는 피치아 파스토리스(P. pastoris)에서 생산될 수 있다. 또 다른 추가 또는 대안적인 예들에서, ??칭제는 재조합 또는 비재조합 HSA와 회합된 분자(예를 들어, 펩타이드, 단백질, 저분자, 디옥시리보핵산, 리보핵산 등)일 수 있다. 일부 예에서, 이 분자는 재조합 또는 비재조합 HSA로부터 정제될 수 있는 반면, 다른 예들에서는 이 분자 및 HSA가 함께 ??칭제를 포함할 수 있다. ??칭 챔버는 DNA 챔버 및 중합체 챔버와 유사하게 혼합 정도가 제어될 수 있도록 용액을 혼합하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 일부 예에서, DNA 챔버, 중합체 챔버 및 ??칭 챔버 각각의 혼합 수단은 컨트롤러를 통해 제어될 수 있다.
??칭 챔버에 침착될 시, 형질주입 복합체의 성장은 정지될 수 있다. 이러한 방식으로, 정의된 크기의 형질주입 복합체들은 안정적으로 일관되게 생산될 수 있고, 이는 대규모 응용(예를 들어, 생물반응기 응용)에 특히 유리할 수 있다. 형질주입 복합체의 목적하는 크기는 상이한 응용 분야마다 다를 수 있다. 일부 예에서, 폴리플렉스의 목적하는 크기는 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 또는 1500 나노미터를 포함하나 이에 한정되지 않는 200 내지 1500 사이 크기 범위를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 300 내지 500 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 400 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 400 내지 800 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 400 내지 800 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 1000 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 900 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 800 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 500 내지 700 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 700 내지 1500 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 800 내지 1400 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 900 내지 1300 나노미터 사이일 수 있다. 또 다른 예에서, 크기 범위는 1000 내지 1200 나노미터 사이일 수 있다. 상기 언급된 크기 범위들은 형질주입 복합체의 유체역학적 직경과 관련이 있음을 이해할 수 있다.
형질주입 복합체의 안정화 이후, 형질주입 복합체를 함유한 용액은 형질주입을 수행하기 전에 가변적인 시간량 동안 유지될 수 있다. 다른 말로 하면, ??칭제를 통한 형질주입 복합체의 안정화는 ??칭제가 사용되지 않은 다른 예들과 비교하여 특정 세포 유형의 형질주입이 수행될 수 있는 기간을 증가시킬 수 있다. 이는 소규모 응용과 비교하여 더 긴 시간(예를 들어 수분 내지 수시간) 동안 형질주입 절차가 이루어질 수 있는 대규모 응용(예를 들어, 생물반응기 응용)에 특히 유리할 수 있다. 형질주입을 수행하기 위해 ??칭 용액 내의 형질주입 복합체를 먼저 형질주입 배지에 희석할 수 있음을 이해할 수 있다.
아직 논의되지 않은 이러한 시스템의 사용에 고려할 수 있는 변수들은 DNA 챔버 내의 DNA 용액의 농도; 중합체 챔버에서 중합체 용액의 농도; ??칭 챔버에서 ??칭제의 농도; 중합체 용액 및 ??칭 용액의 성분들과 DNA 용액 각각의 pH; DNA 용액, 중합체 용액 및 ??칭 용액 각각의 이온 강도; 시스템의 용액들과 구성요소들의 온도 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
대표적인 일 예에서, 이러한 시스템은 대규모 응용에서 바이러스 벡터의 생산에 사용될 수 있다. 예로는 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 및 유사 분열 활성 세포 유형만 감염시킬 수 있는 표준 레트로바이러스가 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
도 8b를 참조하면, 예시적인 시스템(800)은 본원에 개시된 구현예들에 따른 미리 결정된 크기의 중합체-DNA 형질주입 복합체를 제조하기 위한 것이다. 도시된 바와 같이, 시스템(800)은 중합체 챔버(805) 및 DNA 챔버(806)를 포함한다. 중합체 챔버(805)는 제1 농도의 중합체 용액(807)을 포함하고, DNA 챔버는 제2 농도의 DNA 용액(808)을 포함한다. 일부 예에서, 중합체 용액(807)은 PEI를 포함하나 이에 국한되지 않는 양이온성 중합체를 포함할 수 있다. 일부 예에서, DNA 용액은 세포로 형질주입될 때 복제 불능 바이러스 입자를 생성하는 바이러스 단백질을 각각 암호화하는 복수의 플라스미드를 포함할 수 있지만, 다른 예들에서, DNA 용액은 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 다른 DNA 플라스미드들을 포함할 수 있다. 일 예에서, 복수의 플라스미드는 복제 불능 렌티바이러스 입자들을 암호화할 수 있다.
시스템(800)은 혼합 챔버(810)를 포함한다. 혼합 챔버는 제1 연결 라인(811)을 통해 중합체 용액(807)을 수용하도록 구성되고, 제2 연결 라인(812)을 통해 DNA 용액(808)을 수용하도록 추가로 구성된다. 일부 예에서, 연결 라인은 호스/튜빙이다. 중합체 챔버(807)와 혼합 챔버(810) 사이의 위치에서 제1 연결 라인(811)에 제1 펌프(815)가 결합된다. DNA 챔버(806)와 혼합 챔버(810) 사이의 위치에서 제2 연결 라인(812)에 제2 펌프(818)가 결합된다. 또한, 제1 유체 제어 디바이스(820)가 제1 펌프(815)와 혼합 챔버(810) 사이의 제1 연결 라인(811)에 결합되고, 제2 유체 제어 디바이스(822)가 제2 펌프(818)와 혼합 챔버(810) 사이의 제2 연결 라인(812)에 결합된다. 제1 유체 제어 디바이스와 제2 유체 제어 디바이스 각각은 예로서 일방향 또는 양방향 밸브를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제1 유체 제어 디바이스(820)와 제2 유체 제어 디바이스(822) 중 하나 이상은 연속 가변 밸브를 포함할 수 있다. 제1 유체 제어 디바이스(820)와 제2 유체 제어 디바이스(822)는 예를 들어, 솔레노이드 액추에이터, 압력 기반 액추에이터, 진공 작동 등을 통해 작동될 수 있다.
시스템(800)은 또한 ??칭 챔버(830)를 포함한다. ??칭 챔버(830)는 제3 연결 라인(835)을 통해 혼합 챔버로부터 유체 흐름을 받아들인다. ??칭 챔버(830)는 ??칭 용액(837)을 포함한다. ??칭 용액(837)은 ??칭제를 포함할 수 있다. ??칭제는 혼합 챔버(810) 내에서 형성되는 중합체-DNA 복합체의 크기를 안정화시키는 제제를 포함할 수 있다.
일부 예에서, ??칭제는 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함할 수 있다. HSA는 일부 예에서 재조합 HSA일 수 있는 반면, 다른 예들에서 HSA는 비재조합 HSA일 수 있다.
시스템(800)은 또한 컨트롤러(801)를 포함한다. 컨트롤러(801)는 시스템(800)의 조작자를 통해 프로그래밍 가능할 수 있으며, 실행될 때 컨트롤러로 하여금 제1 펌프(815), 제2 펌프(818), 제1 유체 제어 디바이스(820), 제2 유체 제어 디바이스(822) 중 하나 이상 또는 각각을 제어하게 하는 명령들을 비일시적 메모리에 저장할 수 있다. 상기 언급된 구성요소들에 대한 제어를 행사함으로써, 컨트롤러는 중합체 용액(807)에서 혼합 챔버(810)로의 경로를 제어하고 동시에 DNA 용액(808)에서 혼합 챔버(810)로의 경로를 제어할 수 있다. 중합체 용액(807)은 제1 연결 라인(811)을 통해 제1 유속으로 혼합 챔버(810)로 흐르도록 제어될 수 있고, DNA 용액(808)은 제2 연결 라인(812)을 통해 제2 유속으로 혼합 챔버(810)로 흐르도록 제어될 수 있다. 일부 예에서, 제1 유속 및 제2 유속은 동일할 수 있으며, 하지만 다른 예들에서 제1 유속 및 제2 유속은 다를 수 있다. 제1 유속은 중합체 용액(807)의 농도의 함수일 수 있고, 또한 DNA 용액(808)의 농도의 함수일 수 있다. 유사하게, 제2 유속은 DNA 용액(808)의 농도의 함수일 수 있고, 또한 중합체 용액(807)의 농도의 함수일 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 제1 유속 및/또는 제2 유속은 각각 제1 연결 라인(811) 및/또는 제2 연결 라인(812)의 직경의 함수일 수 있다.
혼합 챔버(810)는 혼합 챔버(810) 내에서 중합체 용액과 DNA 용액 각각의 일관된 혼합 및 체류 시간을 용이하게 하기 위해 도 8b에 도시된 바와 같이 정의된 기하학적 구조, 예를 들어 T 형상일 수 있다. T 형상으로 묘사되었지만, 이러한 묘사는 예시적이며, 중합체-DNA 나노입자들이 ??칭 용액(837)에 도달할 시 정의된 크기가 되도록 기하학적 구조가 중합체 용액 및 DNA 용액의 일관된 혼합 및 체류 시간을 용이하게 하도록 선택된다면 다른 기하학적 구조들도 본 개시내용의 범위 내에 있다는 것을 이해할 수 있다. 예로서, 중합체-DNA 나노입자들은 중합체-DNA 나노입자들이 ??칭 용액(837)에 의해 안정화되는 시점에 중합체-DNA 나노입자들이 400 내지 1000 나노미터의 범위 내에 있도록 혼합 챔버(810) 내에서 400 내지 1000 나노미터를 포함하는 범위로 성장할 수 있다.
iv. 바이러스 벡터
개시된 방법들 및/또는 시스템들로부터 생산될 수 있는 예시적인 바이러스 벡터에는 렌티바이러스 또는 감마레트로바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터, 시미안 바이러스 40(SV40),아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스(AAV)에서 유래된 벡터가 포함된다. 따라서, 본 논의가 레트로바이러스 벡터에 초점을 맞추고 있지만, 다른 바이러스 벡터들이 본 개시내용의 범위에서 벗어나지 않고 생산될 수 있음은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 렌티바이러스 벡터 또는 감마-레트로바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 문헌[Koste 등 (2014) Gene Therapy 2014 Apr. 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조). 레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주 게놈에 통합하고, 많은 양의 외래 유전 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고, 특수 세포주에 패키징되는 능력 때문에 전달 벡터로 유용하다(Miller, 1992). 렌티바이러스는 다른 레트로바이러스와 달리 일부 맥락에서 특정 비분열 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 비제한적인 예로는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1), HIV-2, 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 T-세포림프친화 바이러스 1(HTLV-1), HTLV-2 또는 말 감염 빈혈 바이러스(EIAV)와 같은 렌티바이러스 유래 벡터가 포함된다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 HIV 병독성 유전자를 약화시켜 배가시킴으로써 생성되었으며, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되어 치료 목적으로 벡터를 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터는 본 기술 분야에 알려져 있으며, 문헌[Naldini 등, (1996 및 1998); Zufferey 등, (1997); Dull 등, 1998, 미국 특허 번호 6,013,516; 및 5,994,136]을 참조한다. 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 숙주 세포로 핵산을 전달하기 위한, 선택을 위한 및 외부 핵산을 통합하기 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 알려진 렌티바이러스는 미국형 배양 컬렉션(“ATCC”; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)과 같은 기탁 기관 또는 컬렉션으로부터 용이하게 수득될 수 있거나 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 알려진 공급원으로부터 단리될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 성분이 바이러스 기반 유전자 전달 시스템을 만드는 데 관여하는데, 첫번째는, 바이러스 벡터 입자를 생성하는 데 필요한 효소뿐만 아니라 구조 단백질을 포함하는 패키징 플라스미드이고, 두번째는, 전달 플라스미드, 즉, 전달될 유전 물질이다. 생물학적 안전성 보호 장치를 상기 성분들 중 하나 또는 둘 다의 설계에 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는 외피 단백질 이외의 모든 HIV-1 단백질을 함유할 수 있다(Naldini 등, 1998). 일부 구현예에서, 바이러스 벡터에는 병독성과 관련된 유전자, 예를 들어 vpr, vif, vpu 및 nef 및/또는 Tat, 즉 HIV의 1차 전이 활성 인자(transactivator)와 같은 추가 바이러스 유전자가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV 기반 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터를 위한 패키징 시스템들은 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소시키거나 제거하는 모(parental) 바이러스의 3가지 유전자: gag, pol 및 rev만을 포함하는 개별 패키징 플라스미드들을 포함한다.
제공된 바이러스 벡터의 일부 측면에서, 프로모터의 제어 하에 전이유전자를 함유하는 발현 카세트의 일부로서 제공되는 것과 같은 재조합 단백질을 암호화하는 이종 핵산이 야생형 LTR 또는 이의 부분 또는 키메라 부분을 포함하는 벡터 게놈의 5′ LTR 및 3′ LTR 서열 사이에 함유되고/거나 위치한다. 일부 구현예에서, HIV 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터는 추가 전사 단위가 결여된다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 자가 비활성화(self-inactivating, SIN) 벡터를 생성할 수 있는 바이러스 벡터 RNA를 생산하는 데 사용되는 DNA의 3′ LTR의 U3 영역에서의 결실을 함유할 수 있다. 이어서 상기 결실은 역전사 동안 프로바이러스(proviral) DNA의 5′ LTR로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, U3의 프로모터 및 인핸서에 대해 3′ LTR이 결실된다. 일부 구현예에서, LTR의 전사 활성을 폐기하기 위해 TATA 박스의 제거를 포함하여 충분한 서열이 제거될 수 있다. 이는 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 방지할 수 있다. 따라서, 일부 구현예는 DNA의 3′ LTR의 U3 영역에서 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 이는 벡터 역가 또는 벡터의 시험관내 또는 생체내 특성에 영향을 미치지 않는다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 또한 추가 유전적 요소들을 함유할 수 있다. 상기 구조체들에 포함될 수 있는 요소들의 유형은 어떠한 방식으로도 제한되지 않으며 본 기술분야의 지식을 가진 자에 의해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 DNA 또는 RNA 합성 및 처리를 위한 인식 신호를 촉진하거나 제공하는 게놈의 비코딩 영역인 바이러스 게놈(예를 들어, 렌티바이러스 게놈)에서 유래된 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 이러한 서열은 패키징 또는 캡슐화, 역전사 및 전사 및/또는 유전자 전달 또는 통합에 관여할 수 있는 시스-작용 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 일부로서 제공되는 시스-작용 서열은 동일한 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 유사 유기체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 표적 세포에서 바이러스 게놈의 핵산 진입을 촉진하는 신호가 포함될 수 있다. 그러한 신호의 예는 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 바이러스 벡터 게놈의 pol 유전자의 일부인 cPPT 및 CTS 성분으로부터 형성된 플랩 서열(DNA 플랩 서열이라고도 함)이다. 일부 구현예에서, 플랩 서열은 cPPT 및/또는 CTS 영역을 함유하지만 플랩 기능에 필요하지 않은 pol 유전자의 5′ 및 3′ 부분이 결실된 바이러스 핵산의 일부를 포함한다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 기능적 플랩 영역을 함유하지 않는다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 cPPT 및 CTS 영역 중 하나 또는 둘 다의 전체 또는 일부가 결여된 변이체 플랩을 함유하는 바이러스 핵산을 함유한다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 게놈은 스플라이스 공여체 부위(SD), 스플라이스 수용체 부위(SA) 및/또는 Rev-반응 요소(RRE) 중에서 선택된 요소들을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, RRE는 바이러스 패키징 동안 헬퍼 플라스미드의 일부로 제공되는 Rev 단백질의 결합 후 핵(nucleus)에서 시토졸(cytosol)로 바이러스 메신저 RNA를 내보낼 수 있도록 하기 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 일부 경우에 gag ORF의 N-말단 단편에서 유래될 수 있는 psi(w) 패키징 신호를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, psi 패키징 신호 서열은 gag 펩타이드의 가능한 전사/번역과 전이유전자의 간섭을 방지하기 위해 틀 이동 돌연변이(들)에 의해 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터 게놈의 5′ 및 3′ LTR 서열 사이에 순서대로: RRE; 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어하는 프로모터의 상류에 삽입되는 cPPT 및 CTS를 함유하는 기능적 DNA 플랩을 포함하는 바이러스 핵산을 함유하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 기술된 임의의 것과 같은 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항원 수용체(예를 들어, CAR)와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어하는프로모터를 함유하는 전이유전자; 및 본원에 제공된 임의의 것과 같은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 본원에 제공된 임의의 것과 같은 변형된 PRE를 함유하는 폴리뉴클레오타이드;를 함유하는 재조합 게놈을 함유하는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 게놈은 서열 5′ LTR-RRE-cPPT-CTS-전이유전자(들)-변형된 PRE-3′ LTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 변형된 PRE는 문헌[WO2016115177]에 기술된 바와 같다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1 유래 렌티바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터들을 포함하는 제공된 폴리뉴클레오타이드들 중에 (“변이체 플랩” 폴리뉴클레오타이드 또는 서열로 간주되는) 바이러스 플랩 서열에 변이들을 함유하는 것들이 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드들에는 폴리뉴클레오타이드 내에 바이러스 플랩 서열 내에 하나 이상의 변형들, 예를 들어, 결실(들)을 함유하는 것들이 포함된다. 이 변이들은 폴리뉴클레오타이드의 바이러스 서열 내에 플랩 서열 또는 이의 하위 부분의 완전한 결실을 포함할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드들은 이러한 변이체 플랩 서열을 함유하는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터들을 포함한다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 변형된 플랩(Flap)은 문헌[WO2016115177]에 기술된 바와 같다.
일부 구현예에서, 벡터는 또한 원핵생물 숙주 세포와 같은 숙주 세포에 번식을 위한 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산은 세균 세포와 같은 원핵 세포에 번식을 위한 하나 이상의 복제 기점을 함유한다. 일부 구현예에서, 원핵 생물 복제 기점을 포함하는 벡터는 또한 유전자의 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 표지자를 부여하는 유전자를 함유할 수 있다.
바이러스 벡터 입자의 제조
일부 구현예에서, 복제 결함이 있는 바이러스를 생산하기 위해 핵산(예를 들어 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 카세트와 같은 목적하는 서열을 암호화하는 핵산)이 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈으로 삽입된다. 비리온을 생산하기 위해서, gag, pol, 및 env 유전자를 함유하나 LTR 및 패키징 성분은 함유하지 않는 패키징 세포주가 구성될 수 있다. 변형된 PRE의 작동 가능한 제어 하에 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 카세트와 같은 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 플라스미드가 또한 사용될 수 있다. 재조합 플라스미드가 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 숙주 세포로 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자로 패키징되도록 허용할 수 있으며, 이어서 이는 배양 배지로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지가 수집되고, 선택적으로 농축되고, 유전자 전달을 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주가 입자를 생성하는 데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질주입된다. 패키징 세포주는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하는 필수 렌티바이러스(예를 들어, HIV-1) 유전자 또는 아데노 연관 바이러스 입자의 생성을 허용하는 기타 필수 바이러스 유전자(예를 들어, 아데노 연관 바이러스 유전자)를 발현하거나 발현하도록 만들어질 수 있다. 이 유전자들은 여러 플라스미드에 의해 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전 성분을 분리하기 위해 다중 벡터가 사용된다. 일부 상기 구현예에서, 패키징 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 가능 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 이벤트의 기회를 감소시킨다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 시스-작용 psi(Y) 패키징 서열 및 표적 세포 통합을 허용하기 위해 렌티바이러스 LTR들 사이에 삽입된 전이유전자 유전자를 함유하는 렌티바이러스 발현 플라스미드; pol, gag, rev 및/또는 tat 바이러스 유전자를 암호화하고 일부 경우에 rev-반응 요소(RRE)를 함유하는 패키징 플라스미드 또는 플라스미드들; 및 수포성 구내염 바이러스(VSV-G) 외피 유전자의 G 단백질과 같은 외피 단백질을 암호화하는 플라스미드와 같은 슈도타이핑 플라스미드로 형질주입될 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 LTR들, 시스-작용(cis-acting) 패키징 서열 및 관심 서열, 즉 재조합 단백질(예를 들어, CAR과 같은 항원 수용체)을 암호화하는 핵산과 함께 바이러스의 효소 성분 및/또는 구조 성분, 예컨대 Env, Gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 여러 헬퍼 플라스미드를 포함한 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 플라스미드로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 구조 및 효소 성분을 암호화하는 gag 및 pol 유전자를 함유하는 GagPol 패키징 플라스미드 및 Rev 조절 단백질을 암호화하는 rev 유전자를 함유하는 Rev 플라스미드를 패키징 세포주에 개별적으로 도입한다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, env 유전자를 암호화하는 외피 플라스미드도 도입될 수 있으며, 이는 일부 경우에 대체 Env 단백질로 슈도타입화된 바이러스 입자를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위해 슈도타입화된다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 레트로바이러스 벡터 입자는 VSV-G 당단백질로 슈도타입화되며, 이는 형질도입될 수 있는 세포 유형을 확장하는 광범위한 세포 숙주 범위를 제공한다.
env 유전자는 레트로바이러스와 같은 임의의 적절한 바이러스에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, env는 인간 및 다른 종의 세포의 형질도입을 가능하게 하는 암포트로픽 외피 단백질이다. 일부 구현예들은 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMuLV 또는 MMLV), 하비 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV 또는 HSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV 또는 MMTV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV 또는 GALV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 라우스 육종 바이러스(RSV)를 포함하나 이에 한정되지 않는 레트로바이러스 유래 env 유전자를 사용한다. 일부 구현예에서, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 단백질 G (VSVG), 간염 바이러스의 것, 및 인플루엔자의 것과 같은 다른 env 유전자도 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 env 핵산 서열을 제공하는 패키징 플라스미드는 조절 서열, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서와 작동 가능하게 연결되어 회합된다. 일부 구현예에서 조절 서열은 예를 들어 EF1α, PGK, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소, 인간 시토메갈로 바이러스 인핸서, 백시니아 P7.5 프로모터 등을 포함하여 임의의 진핵 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 일부 경우에, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 요소와 같은 프로모터-인핸서 요소들이 LTR 서열 내에 또는 인접해 위치한다. 일부 구현예에서, 조절 서열은 벡터가 구성되는 렌티바이러스에 대해 내인성이 아닌 서열이다. 따라서, 만일 벡터가 SIV로부터 만들어지는 경우, SIV LTR에서 발견되는 SIV 조절 서열은 SIV에서 유래하지 않은 조절 요소로 대체될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 플라스미드는 패키징 세포주 내로 형질주입 또는 감염을 통해 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 벡터 입자를 생산한다. 패키징 세포주(들)의 형질주입 방법이 본원에 기술된다. 패키징 플라스미드 및 전달 벡터를 패키징 세포주로 공형질주입(cotransfection) 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되어 당업자들에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다. 따라서, 일부 구현예에서 패키징 플라스미드는 이러한 방법들에 의해 인간 세포주 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 패키징 플라스미드가 네오마이신, DHFR, 글루타민 합성효소 또는 ADA와 같은 우성 선별 표지자와 함께 제공되며, 이어서 적절한 약물의 존재 하에서 선별되고 클론이 단리한다. 선별 표지 유전자는 구조체 내에서 패키징 유전자에 물리적을 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자가 패키징 기능이 발현되도록 구성된 안정적인 세포주에 의해 생산될 수 있다. 적합한 패키징 세포는 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 5,686,279; 및 Ory 등, (1996)]을 포함하여 알려져 있다. 렌티바이러스 벡터가 포함된 패키징 세포는 생산자 세포를 형성한다. 따라서 생산자 세포는 관심 있는 유전자를 운반하는 바이러스 벡터 입자를 생산하거나 방출할 수 있는 세포 또는 세포주이다. 일부 구현예에서, 이 세포들은 또한 부착 의존적일 수 있는데, 이는 이 세포들이 유리 또는 플라스틱과 같은 표면에 부착될 때 최적으로 성장, 생존 또는 기능을 유지할 것임을 의미한다. 일부 구현예에서, 이 세포들은 이 세포들이 표면에 부착할 필요가 없도록 현탁액-적응된다. 일부 구현예에서, 생산자 세포는 신생물성으로 형질전환된 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 및 패키징 플라스미드로 형질주입시키기 위한 숙주 세포는 예를 들어 포유동물 일차 세포; COS, CHO, HeLa, NIH3T3, 293T, 293F, LV293, HEK 293 및 PC12 세포와 같은 확립된 포유동물 세포주; 제노푸스 배아 및 난모세포와 같은 양서류 세포; 기타 척추동물 세포; 곤충 세포(예를 들어, 초파리), 효모 세포(예를 들어, 사카로미세스 세레비시아, 스키조사카로마이세스 폼베 또는 피치아 파스토리스) 및 원핵 세포(예를 들어, 대장균)를 포함한다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293 세포주와 같은 패키징 세포주에서 생산될 수 있다. 세포(예를 들어, HEK 293 세포)의 형질주입 후 대략 2일 후에, 세포 상청액은 재조합 렌티바이러스 벡터를 함유하고 이는 표적 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에 제공되면, 최종 바이러스 벡터에 존재하는 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵 내로 유입되어 안정적으로 숙주 게놈에 통합된다. 바이러스 RNA의 통합 후 1일 또는 2일 후, 표적 세포 내 재조합 단백질의 발현이 검출될 수 있다.
다음 실시예들은 특정 구현예들의 구체적인 특징들을 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 아래 기술되는 구체적인 특징들은 본 개시내용의 범위에 제한으로 해석되어서는 안되며, 그보다는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들에 의해 인식될 등가물들의 실시예들로 해석되어야 한다.
실시예들
실시예
1
복합체 대기 시간은 바이러스
역가에
영향을
준다
본 실시예는 LV293 형질주입 복합체에 대한 마스터 믹스 대기 시간이 DNA 및 PEI 농도의 함수로서의 바이러스 역가에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
부유성 세포 형질주입 프로세스의 간략한 개요가 도 1a에 도시되어 있다. 본 실시예의 세포를 도 1a에 상세히 설명된 PEI-매개 4-플라스미드 시스템을 사용하여 일시적으로 형질주입하였다. 목표 규모에 맞는 생산 시스템을 교반 탱크 생물반응기에서 수행하였다.
본 실시예를 위해, 모든 마스터 믹스를 3:1:1:1 전이유전자:rev:env:gag/pol 몰비 및 1:1 DNA:PEI 질량비로 준비하였다. 각 플레이트 웰에 최종 DNA 농도가 2μg/mL가 되도록 하기에 필요한 부피의 마스터 믹스를 수용하였다. 다음 조건을 세 번 시험하였다(표 1):
pH-중성 배지(예를 들어, BalanCD 배지; Irvine Scientific, Santa Ana, CA, PN 91165)에서 성장하는 현탁액-적응 HEK 293 세포(예를 들어, LV293 세포; Thermo Fisher, Walham, MA, PN A35347)의 샘플을 기존 시드 트레인(seed train)에서 분할하고 이 실시예를 위해 증폭하였다. 배양물을 125rpm으로 진탕하면서 8% 대기 중 CO2, 37°C에서 성장시켰다. 세포를 생산 통에 시딩하기 전에 1000mL 진탕 플라스크에서 2 x 250 mL 배양물로 증폭하였다.
시딩 24시간 전에, 증폭 배양물을 모으고 계수하였다. 기존 배양물을 사용하여 증폭 배양물을 2.1e6 vc/mL로 희석하여 2 x 250mL 배양물을 생산하였다. 배양물들을 1000mL 삼각 진탕 플라스크들에 넣고 형질주입될 때까지 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣었다.
형질주입 전에, 벌크 마스터 믹스 용액을 준비했다. 10%, 3%, 및 1% 마스터 믹스를 위해 세 번 DNA 용액 및 PEI 용액을 준비하였다. 3% 및 1% 마스터 믹스 용액을 96웰 2mL 딥 웰 플레이트(DWP)에 준비했다. 10% 마스터 믹스 용액을 24웰 10mL 둥근 바닥 DWP에 준비했다. 10% 마스터 믹스를 위해 3 x 44μg/mL DNA 용액 및 3 x 44μg/mL PEI 용액을 준비했다. 3% 마스터 믹스를 위해 3 x 146.7μg/mL DNA 용액 및 3 x 146.7μg/mL PEI 용액을 준비했다. 1% 마스터 믹스를 위해 3개의 개별 440μg/mL DNA 용액 및 3개의 개별 440μg/mL PEI 용액을 준비했다.
형질주입 직전에 3개의 24웰 DWP를 생물학적 안전 실험대(BSC)에 넣었다. 시드 배양물을 BSC에 넣고 모았다. 3mL 시드 세포 배양물을 3개의 24 DWP의 각 웰에 넣었다. DWP들을 10%, 3% 및 1%로 표지하고 형질주입될 때까지 진탕 인큐베이터에 넣어 두었다.
3개의 개별 단계로 형질주입을 수행하였고, 각 단계는 각 마스터 믹스 준비 그룹을 구성한다. 멀티채널 피펫터를 사용하여 각 마스터 믹스 준비 그룹에 대한 3개의 마스터 믹스를 동시에 준비하였다. 마스터 믹스 준비 그룹들은 한 번에 하나씩 준비되었으며 다음 마스터 믹스 준비 그룹이 준비되기 전에 모든 상대적 대기 시간 시점에 형질주입하는 데 사용하였다. 구체적으로, 1% 마스터 믹스의 대기 시간들은 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 및 4분이었고, 3% 마스터 믹스의 대기 시간들은 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 및 8분이었고, 10% 마스터 믹스의 대기 시간들은 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 15분이었다. 마스터 믹스 첨가 후 멀티채널 피펫터를 사용하여 웰들을 혼합하였다. 모든 웰들이 형질주입된 후 플레이트들을 진탕기 인큐베이터로 되돌려 놓았다.
형질주입 48시간 후, 각 플레이트를 1000 x g로 5분 동안 원심분리하여 정화하였다. 정화된 각 웰의 0.5mL 샘플 3개를 분취하고 분석할 때까지 -80°C에서 보관했다. 렌티바이러스 벡터 샘플들의 연속 희석을 사용하여 세포주를 형질도입하였다. 형질도입 48 내지 72시간 후, CAR 단백질의 표면 발현을 위한 형광 표지 항체 염색을 사용하여 유세포 분석을 통해 형질도입된 세포 백분율을 정량화했다. 가장 낮은 두 가지 희석액의 값을 사용하여 기능적 역가를 mL당 형질도입 단위(TU/mL)로 계산했다. 개별 샘플 값은 도 1b의 표에 제공된다.
각 복제물의 평균 값은 도 1c에 도시된 마스터 믹스 준비 그룹으로 도표화된다. 도 1c에서, 도표 101은 1% v/v MM이고, 도표 102는 3% v/v MM이고, 도표 103은 10% v/v MM이다. 10% 마스터 믹스의 피크는 5분과 8분 대기 시간 사이에 관찰되었다. 3% 마스터 믹스의 피크는 1.5분 대기 시간과 8분 대기 시간 사이에 관찰되었다. 1% 마스터 믹스의 피크는 쉽게 눈에 띄지 않았지만 1분 미만일 수 있으며, 수동 첨가의 제한으로 인해 측정할 수 없었을 수 있다.
본 실시예에 나타난 결과는 DNA-PEI 마스터 믹스가 준비하는 동안 보류 시간에 의해 상당한 영향을 받을 수 있으며, 마스터 믹스의 DNA 및 PEI 농도가 주어진 마스터 믹스에 대한 최적의 대기 시간을 결정하는 중요한 역할을 할 수 있음을 보여준다. DNA와 PEI의 농도가 높을수록 최적의 대기 시간이 짧아지는 것으로 나타났다. 이는 마스터 믹스에서 복합체 형성 속도를 증가시키는 더 높은 DNA 및 PEI 농도의 결과일 수 있다고 생각된다. 본 실시예에 제시된 데이터는 대기 시간이 293 PEI-기반 형질주입에서 주어진 마스터 믹스에 대한 수확 시 바이러스 역가를 최대화하는 측면에서 인자임을 나타낸다.
도 1c에 도시된 바와 같이, 1% 마스터 믹스 용액으로 형질주입된 샘플의 피크 역가는 3% 및 10% 마스터 믹스 샘플의 피크 역가보다 상당히 낮았다. 그러나 1% 마스터 믹스 샘플이 명확한 피크를 나타내지 않았다는 것은 제1 첨가(30초) 전에 피크 대기 시간이 발생했음을 시사할 수 있다. 이는 3%와 10% 샘플 사이에서 보이는 마스터 믹스 농도 증가에 따른 피크 대기 시간 단축과 일치한다. 30초에 마스터 믹스를 형성하고 사용하는 데 어려움이 있다는 것은 피크 대기 시간에 1% 마스터 믹스를 사용하는 것이 더 큰 규모에서 어려울 수 있음을 의미할 수 있다. 그러나, 최대 2분까지 대기 시간들의 1% 마스터 믹스 샘플에서 생성된 역가는 규모에 맞는 프로세스에 대해 충분히 높다.
생산 부피가 증가함에 따라 악화되는 복합체 인큐베이션 시간의 부정적인 영향을 평가하기 위한 연구들이 수행되었다. 이 연구들에 따르면 복합 효능 손실률은 규모에 따라 달라지지 않으며 복합체 부피는 배양물 부피가 증가하고 복합체 준비 및 전달 시간이 증가함에 따라 선형적으로 증가하는 것으로 나타났다. 상업용 배치(commercial batch)들에 대해 예상되는 복합체 부피(표 2)는 최적의 인큐베이션 기간을 훨씬 초과하는 준비 및 전달 시간을 필요로 하므로 수확 시 역가가 상당히 낮아진다. 더 긴 인큐베이션 시간 동안 복합체 활성을 안정화하는 방법은 확대 시 역가 감소를 완화한다.
[표 2] 3가지 복합체 농도에 대한 배양물 부피별 복합체 부피
실시예
2
마스터
믹스에
HSA를
첨가하면 벡터 생산 프로세스에서 생존 가능한 대기 시간이
증가한다
본 실시예는 DNA 용액과 PEI 용액을 혼합한 후 마스터 믹스에 인간 혈청 알부민(HSA)을 첨가하면 벡터 생산 프로세스에서 생존 가능한 대기 시간을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
본 실시예에서는 48개의 서로 다른 조건을 시험하였다. 모든 조건은 24개의 웰 DWP에서 3mL 배양물로 시험하였다. 두 가지 다른 인간 혈청 알부민(HSA) 첨가 방법을 시험했다. 제1 첨가 방법은 DNA와 PEI를 혼합하여 복합체 형성을 시작하고, 이어서 혼합 2분 후 HSA를 첨가하여 복합체를 형성하였다. 제2 첨가 방법은 PEI 첨가 전에 HSA와 DNA를 혼합하였고, DNA-HSA 혼합물에 PEI를 첨가하여 복합체를 형성하였다. 각 첨가 방법 내에서 샘플들은 0, 0.05, 0.2, 2, 5 및 10mg/mL의 HSA 농도에서 시험하였다. 모든 마스터 믹스는 10mg/mL 마스터 믹스 부피에 의해 결정된 바와 같이 설정된 최대 부피까지 배지로 보충하였다. 각 HSA 농도에 대해, 첨가 방법당 하나의 마스터 믹스를 준비하고 형질주입 복합체 형성을 시작한 후 2, 10, 20 또는 30분에 웰들에 첨가했다. HSA는 250mg/mL 벌크 용액(예를 들어, Octapharma(Langenfeld, Germany)에서 생산됨(25% 알부민(인간), NDC# 68982-643-02, Lot# K838A6871))에서 추출하였다.
모든 조건은 동일한 시드 트레인에서 시딩되었다. 시드 트레인을 1000mL 진탕 플라스크에서 1 x 250mL 배양물로 증폭하였다. 시딩 시, 세포 배양물을 2.1e6vc/mL로 희석했다. 형질주입 전 추가 24시간 동안 배양물을 성장시켰다. 형질주입 직전에 세포 배양물 3mL를 4개의 플레이트에 고르게 분할한 48개의 웰에 넣었다. 별도의 96웰 DWP에서, 아래 표 4에 표시된 농도 및 시간에 HSA를 첨가하여 12개의 별도 마스터 믹스를 만들었다. 모든 마스터 믹스는 동일한 부피의 DNA와 PEI 용액을 함께 혼합하여 만들었다. 각 마스터 믹스를 3:1:1:1 전이유전자:rev:env:gag/pol 플라스미드 몰비 및 1:1 DNA:PEI 질량비로 준비하였다. 각 마스터 믹스의 최종 DNA 농도는 68.65μg/mL였다. 마스터 믹스 용액 1-6의 경우, 두 용액을 혼합한 후 표 3에 표시된 농도로 HSA를 PEI-DNA 용액에 첨가했다. 마스터 믹스 용액 7-12의 경우, PEI 용액과 혼합하기 전에 DNA 용액에 HSA를 첨가하였다. 추가된 HSA의 농도는 PEI 용액을 혼합한 후 HSA의 최종 농도가 표 3에 표시된 농도와 같도록 계산되었다. 모든 마스터 믹스는 480μL 규모로 만들었다. 250mg/mL HSA를 pH 중성 배지에서 연속 희석하여 각 마스터 믹스 또는 DNA 용액에 대한 HSA 첨가 부피가 20μL가 되도록 했다. 각 마스터 믹스 및 HSA 용액의 최종 부피는 500μL였다.
복합체 형성 시작 후 2분, 10분 또는 30분 후에 웰들을 형질주입시켰다. 유사한 시간에 복합체을 수용하는 웰들을 동일한 플레이트에 그룹화하였다. 각 웰은 형질주입 시 해당 마스터 믹스 90μL를 수용하였다.
모든 배양물은 형질주입 후 48시간까지 인큐베이션하였다. 배양물들을 1000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 정화하였다. 각 웰로부터 상청액을 수확하여 샘플들로 분취하였다. 샘플들은 수확 직후 -80°C에서 동결하였다. 모든 샘플을 해동하고 역가를 측정했다. 유사한 HSA 첨가 패턴을 가진 샘플들을 비교하여 HSA 첨가가 형질주입 복합체에 미치는 영향을 결정하였다.
제1 첨가 방법(마스터 믹스 1-6, DNA와 PEI 혼합 후 HSA 첨가)에 의해 얻은 감염성 역가 값들을 측정하였다. 결과는 DNA-PEI 용액에 0.2 - 10mg/mL 이상의 농도로 HSA를 첨가하면 마스터 믹스가 배양물 외부에 유지될 수 있는 시간의 길이가 증가하고 여전히 허용 가능한 역가를 생산한다는 것을 보여준다(도 1d). 도 1d에서, 도표 120은 0mg/mL 조건, 도표 121은 0.05mg/mL 조건, 도표 122는 0.2mg/mL 조건, 도표 123은 1mg/mL 조건, 도표 124는 5mg/mL 조건, 도표 125는 10mg/mL 조건이다.
마스터 믹스 3-6으로 형질주입된 역가들은 혼합 후 2분, 10분 및 30분에 효과적으로 등가의 역가를 생성한다. 마스터 믹스 1 및 2로 형질주입된 배양물은 대기 시간이 증가함에 따라 역가가 감소하는 것으로 나타났다. 이 결과는 통제 조건(마스터 믹스 1)에 대해 수행된 것처럼 HSA 첨가 없이 생산된 마스터 믹스들에서 이전에 관찰되었다. 마스터 믹스 2로 형질주입된 샘플들은 대기 시간이 증가함에 따라 역가가 감소하는 유사한 패턴을 나타냈으며, 이는 30분 유지에 걸쳐 일관된 역가를 유지하기 위해 0.05mg/mL보다 큰 HSA의 최소 농도가 필요함을 나타낸다.
PEI 용액 첨가 전에 마스터 믹스 7-12에 대해 표 3에 나열된 농도로 DNA 용액에 HSA를 첨가하였다. PEI 용액을 첨가하여 복합체를 만들고 복합체를 사용하여 2, 10 및 30분에 배양물을 형질주입시켰다. 이 배양물들의 수확 물질을 감염성 역가에 대해 시험하였다. 이 분석에 대한 감염성 역가 데이터는 PEI를 첨가하기 전에 DNA 용액에 1mg/mL 이상의 농도로 HSA를 첨가하면 역가에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다. 1mg/mL HSA, 5mg/mL HSA 및 10mg/mL HSA를 포함한 시험 조건에서는 사실상 감염성 역가가 측정되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). HSA의 이러한 높은 농도에서 DNA 대신 PEI와 복합체를 형성하여 마스터 믹스가 형성되는 것을 방지할 수 있다.
따라서, PEI 용액과 DNA 용액을 혼합한 후 마스터 믹스에 HSA를 첨가하면 HSA가 0.2 내지 10mg/mL HSA로 보충된 모든 용액의 생존 가능한 대기 시간이 증가했다. 이러한 마스터 믹스들로 형질주입된 샘플들은 2 내지 30분의 대기 시간에 걸쳐 일정한 역가를 나타냈다. 이는 HSA가 0.05mg/mL 이하로 보충된 대조군 샘플 및 마스터 믹스와 대조적이며, 이는 대기 시간이 증가함에 따라 역가가 감소했다. 0.2mg/mL 이상의 HSA 첨가는 형질주입 복합체를 안정화시키는 것으로 보인다. 시간에 따른 형질주입 복합체의 퇴행(degradation)은 형질주입 복합체가 생산자 세포가 섭취하기에 너무 큰 크기로 응집된 결과라는 가설을 세운다. HSA를 첨가하면 복합체가 추가로 응집되는 것을 방지할 수 있다.
위에서 설명한 실험 결과에 따르면 마스터 믹스 형성 이전에 DNA 용액에 HSA를 첨가해도 형질주입 복합체의 대기 시간이 연장되지 않았거나 수확 시 역가가 향상되지 않았다. (제2 첨가 방법을 통해)1mg/mL 이상의 농도에서 HSA를 함유하는 DNA 용액으로 준비된 마스터 믹스로 형질주입된 모든 샘플은 측정 가능한 양의 벡터를 생산하지 않았다. HSA는 중성 pH 용액에서 음전하를 띠기 때문에 PEI와 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 마스터 믹스들에서 HSA의 농도는 DNA의 농도보다 훨씬 높기 때문에, HSA가 DNA보다 훨씬 더 유리하게 PEI와 복합체를 형성했을 수 있다. 0.2mg/mL HSA가 함유된 DNA 용액으로 준비된 마스터 믹스로 형질주입된 샘플들은 생존 가능한 마스터 믹스 대기 시간을 연장하는 능력을 나타냈다. 10분 및 30분에 형질주입된 샘플들은 2분에 형질주입된 샘플들보다 더 많은 벡터를 생산했으며, 이는 DNA 용액에서 0.2mg/mL HSA로 준비된 마스터 믹스의 최적 대기 시간이 2분보다 길 수 있으며 마스터 믹스가 최적 대기 시간에 도달한 후 더 오랜 시간 동안 안정적일 수 있음을 시사한다.
실시예
3
DNA-
PEI
형질주입 복합체에
HSA를
첨가하면 복합체의 전체 크기에 영향을 미친다
본 실시예는 DNA-PEI 형질주입 복합체에 HSA 첨가가 DNA 및 PEI 농도의 함수로서 형질주입 복합체의 전체 크기에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
본 실시예에서, 마스터 믹스의 DNA, PEI 및 HSA 농도를 동적 광 산란(DLS)에 의해 시간에 따른 입자 크기에 대한 영향에 대해 시험하였다. 도 2a에 도시된 표에 명시된 실험 조건을 준비하고 입자 크기를 측정하였다. 플라스미드 농도는 22, 73.3 및 220μg/mL에서 시험하였다. 모든 복합체는 플라스미드에 대해 1:1 DNA:PEI 질량비 및 p10013을 사용했다. 복합체를 준비하기 위해 DNA 용액을 1mL로 준비하여 정사각형 바닥 큐벳에 첨가하였다. 1mg/mL p10013 플라스미드 용액을 pH-중성 배지에서 희석하여 도 2a에 도시된 표에 열거된 목표 농도에 도달하게 하였다. PEI 용액은 pH-중성 배지에서 1mg/mL PEI 용액을 희석하여 도 2a에 도시된 표에 열거된 목표 농도에 도달하게 함으로써 1mL로 준비하였다. DNA 용액이 담긴 큐벳에 PEI 용액을 첨가하고 용액을 혼합하였다. 혼합 직후 크기 측정을 시작하였다. 알부민을 받은 복합체의 경우, 복합체 형성이 시작된 지 3분 후에 50mg/mL HSA 용액 40μL를 첨가했다. 50mL HSA 용액은 HSA를 pH 중성 배지에 희석하여 준비했다. HSA는 250mg/mL 벌크 용액에서 추출하였다.
모든 DLS 측정은 제타사이저(Malvern, United Kingdom)를 사용하여 수행되었으며 모든 물질은 사용 전에 실온에서 평형을 이루도록 하였다. 모든 샘플은 10 x 10 x 45 mm 정사각형 바닥 폴리스티렌 큐벳(Sarstedt, Newton, NC, #67.754)에서 준비하였다. 모든 측정은 아래 표 4에 나열된 설정으로 이루어졌다.
DNA, PEI 및 HSA의 크기는 복합체를 형성하기 전에 결정되었다. 복합체를 형성하기 전에 크기 결정을 위한 측정 빈도는 단일 60초 측정을 포함했다. 입자들의 크기는 표 5에 나타낸다.
DNA 및 PEI 각각 22μg/mL, 73.3μg/mL 및 220μg/mL(각각 10%, 3% 및 1% 배양물 부피 복합체)로 준비된 형질주입 복합체들의 시간에 따른 복합체 입자 크기는 도 2b에 도시되어 있다. 도 2b에서, 도표 201은 44μg/mL이고, 도표 202는 146.6μg/mL이고, 도표 203은 440μg/mL 샘플이다. 도시된 바와 같이, 입자 크기의 변화는 농도 의존적인 것으로 보이며, 더 작은 부피와 더 높은 농도의 용액으로 준비된 복합체가 더 빠른 속도로 크기가 증가한다. 세 가지 다른 용액에 대한 측정 빈도에는 0 내지 5분 사이에 15초마다 15초 측정, 및 5 내지 60분 사이에 5분마다 60초 측정이 포함되었다.
HSA 첨가가 형질주입 복합체 크기에 미치는 영향을 조사하기 위해, 44μg/mL, 146.6μg/mL 및 440μg/mL 형질주입 복합체들을 유사하게 준비하고 DLS로 크기를 측정했다. 혼합 3분 후, 50mg/mL HSA 용액을 복합체에 첨가하여 복합체의 총 HSA 농도를 1mg/mL로 만들었다. 각각의 복합체에 대한 HSA 첨가의 영향은 도 3 내지 도 6에 도시되어 있다. 간단히 말하면, 도 3과 관련하여, 복합체 형성이 시작되고 3분 후 44μg/mL 복합체에 HSA를 첨가하였다. HSA 첨가 후, 평균 복합체 크기는 혼합 후 1시간까지 더 이상 크게 증가하지 않았다. 도 3에서, 도표 301은 44μg/mL 복합체 + 0.1% HSA이고 도표 302는 HSA가 없는 44μg/mL 복합체이다. 44μg/mL 복합체 + HSA에 대한 측정 빈도는 다음과 같았다. HSA 첨가 전(0 내지 3분 사이), 측정 빈도에는 15초마다 15초 측정이 포함되었다. HSA 첨가 후, 측정 빈도에는 3분 내지 6분 사이 15초마다 15초 측정, 및 6 내지 60분 사이 5분마다 60초 측정이 포함되었다.
도 4와 관련하여, 복합체 형성이 시작되고 3분 후 73.3μg/mL 복합체에 HSA를 첨가하였다. HSA 첨가 후, 평균 복합체 크기는 혼합 후 1시간까지 더 이상 크게 증가하지 않았다. 도 4에서, 도표 401은 146.6μg/mL 복합체 + 0.1% HSA이고 도표 402는 HSA가 없는 146.6μg/mL 복합체이다. 73.3μg/mL 복합체 + HSA에 대한 측정 빈도는 다음과 같다. HSA 첨가 전(0 내지 3분 사이), 측정 빈도에는 15초마다 15초 측정이 포함되었다. 시간 제약으로 인해, 146.6μg/mL 복합체 + 0.1% HSA에 대한 측정 매개변수에는 표 5에 기재된 3분 동안 15초마다 15초 판독한 후 5분마다 60초 판독하는 대신, 알부민 첨가 직후 60분까지 5분마다 60초 판독이 포함되었다.
도 5와 관련하여, 복합체 형성이 시작되고 3분 후 440μg/mL 복합체에 HSA를 첨가하였다. HSA 첨가 후, 평균 복합체 크기는 계속 증가했고, HSA가 첨가되지 않은 440μg/mL 복합체보다 더 빠른 페이스로 증가했다. +HSA 복합체에 대한 크기 측정은 복합체 크기의 명확한 상승 추세로 인해 12분 후에 중단하였다. 도 5에서, 도표 501은 440μg/mL 복합체 + 0.1% HSA이고 도표 502는 HSA가 없는 440μg/mL 복합체이다.
이러한 연구들은 혼합 후 대기 시간이 증가함에 따라 PEI-DNA 복합체 크기가 증가함을 보여준다. 크기의 증가는 DNA와 PEI가 상호 작용하고 복합체를 형성할 기회가 더 많아짐에 따라 복합체가 함께 응집된 결과일 가능성이 높다. 복합체 용액에서 PEI와 DNA의 농도를 높이면 이러한 복합체들이 형성되는 속도가 증가한다. 증가된 농도는 PEI와 DNA가 접촉할 가능성을 증가시켜 더 빈번한 복합체화를 초래할 수 있다.
복합체 용액들에 HSA를 첨가하면 PEI-DNA 복합체의 크기에 농도 의존적 효과가 있었다. 146.6 및 44μg/mL 복합체의 경우, HSA를 1mg/mL에 첨가하면 최대 1시간 동안 복합체 크기 증가가 중단되었다. 복합체 크기 증가의 갑작스러운 정지는 알부민이 없는 등가 농도의 복합체 용액들에서 나타나는 복합체 크기의 선형 증가와 직접적으로 대조된다. 특정 이론에 구애받지 않고, HSA는 이미 DNA와 복합체를 형성하지 않은 모든 이용 가능한 기회에서 PEI와 복합체를 형성함으로써 추가 복합체 응집을 방지하는 것으로 여겨진다. PEI 및 DNA와 비교하여 HSA의 훨씬 더 높은 농도는 이미 복합체를 형성하지 않은 거의 모든 PEI가 DNA와 점진적으로 계속 복합체를 형성하는 대신 HSA와 즉시 복합체를 형성하게 할 수 있다.
440μg/mL 복합체 용액은 HSA가 도입되었을 때 복합체 크기 증가를 멈추지 않았다. 반대로, 입자 크기는 HSA를 첨가했을 때 급격하게 증가하였고 HSA를 첨가한 후에도 계속 증가하였다. 갑작스런 크기 증가는 HSA 첨가 후 용액이 혼합된 결과일 수 있다. 용액 내 DNA와 PEI의 농도가 높기 때문에, 혼합은 복합체 형성 기회가 갑작스럽고 눈에 띄게 증가할 수 있다. 농도가 더 낮은 용액은 복합체화 기회가 눈에 띄게 증가하지 않을 수 있다. 첨가된 HSA는 추가 DNA 및 PEI 복합체화를 방지할 만큼 충분히 농축되지 않았을 수 있다. HSA 농도를 높이면 440μg/mL 복합체 용액(또는 그 이상)에서 복합체 응집이 방지될 수 있지만, HSA 첨가 시간은 목적하는 크기나 최적 크기에 또는 그 근처에서 복합체를 생성하기 위해 매우 빨라야 할 것이다. 146.6μg/mL 이하의 복합체 농도의 경우, HSA를 최종 농도 1mg/mL에 첨가하는 것이 복합체 응집을 방지하는 생존 가능한 방법이다.
도 6에 도시된 추가 시점들을 평가하는 추가 연구들이 수행되었다. 이 연구들의 경우, p10013 플라스미드를 44μg/mL, 146.6μg/mL 및 404μg/mL의 3가지 다른 배지 용액에 현탁하였다. PEI를 44μg/mL, 146.6μg/mL 및 404μg/mL의 3가지 다른 배지 용액에 현탁하였다. 각 용액을 5mL씩 만들었다. 0.5mL 44ug/mL DNA 용액을 Sarstedt 정사각형 12mm x 12mm x 45mm 투명 폴리스티렌 큐벳(Sarstedt, Newton, NC, PN 67.754)에 넣고 제타사이저 DLS 큐벳 홀더에 넣었다. 0.5mL 44μg/mL PEI를 큐벳에 첨가하고 용액을 혼합했다. 혼합 직후, 제타사이저 DLS 프로그램이 시작되었고 DLS 측정이 수행되었다. 입자 크기 값을 5분 동안 15초 간격으로 평균을 낸 다음 70분 동안 5분 간격으로 평균을 냈다. 이것을 146.6μg/mL DNA 및 PEI 용액과 404μg/mL DNA 및 PEI 용액으로 각각 55분 및 33분 동안 반복하였다. 이러한 실행들을 완료한 후, 모든 측정을 반복했으며, 다만, 각각의 용액을 초기 5분 DLS 판독 후 1mg/mL HSA로 50mg/mL HSA 용액으로 보충했다. 44, 146.6 및 404μg/mL 용액을 각각 59, 55 및 7분 동안 실행하였다. 404μg/mL 용액은 다른 용액보다 더 일찍 중단되었는데, 그 이유는 입자 크기가 세포내이입이 가능한 것으로 간주되는 크기 범위를 초과했기 때문이다. 시간 경과에 따른 각각의 용액에 대한 입자 크기를 도 6에 도표화하였다. 도 6에서, 도표 610은 44μg/mL 복합체 + 1mg/mL HSA이고, 도표 611은 HSA가 없는 44μg/mL 복합체이고, 도표 612는 146.6μg/mL 복합체 + 1mg/mL HSA이고, 도표 613은 HSA가 없는 146.6μg/mL 복합체이고, 도표 614는 404μg/mL 복합체 + 1mg/mL HSA이고, 도표 615는 HSA가 없는 404μg/mL 복합체이다.
복합체의 DLS 데이터는 복합체 농도와 복합체 크기 변화율 사이의 명확한 관련성을 입증한다. 더 높은 DNA 및 PEI 농도는 시간이 지남에 따라 더 큰 크기 증가율을 나타낸다. 복합체에 HSA의 첨가는 44μg/mL 복합체 및 146.6μg/mL 복합체에서 복합체 형성에 명백한 영향을 나타냈다. 복합체 크기 변화는 HSA가 첨가되기까지 보충되지 않은 복합체들을 반영하였다. HSA 첨가 후, 복합체 크기는 최대 대략 1시간 동안 정적으로 유지되었다. 404μg/mL 복합체는 유사한 효과를 나타내지 않았지만, 대신 HSA 첨가 후 훨씬 더 빠른 속도로 증가하였다.
보충되지 않은 복합체들의 크기 데이터는 마스터 믹스 부피를 감소시킬 때 최적 형질주입 인큐베이션의 변화에 대한 설명을 제공한다. 마스터 믹스 내의 복합체의 농도가 증가함에 따라 복합체 크기의 변화율이 증가한다. 주어진 시점에서의 복합체 크기의 차이들 및 최적 인큐베이션 시간의 차이들은 역가를 최대화하도록 표적화되어야 하는 최적의 복합체 크기 또는 크기 범위가 존재함을 시사한다.
HSA 보충 후 복합체들에서 관찰된 0으로의 복합체 크기 변화율의 감소는 HSA의 첨가가 역가의 손실을 방지하는 이유에 대한 작용 메커니즘을 시사한다. 충분히 높은 농도로 첨가되는 경우, HSA는 추가의 복합체 크기 변화를 방지하였다. 이론에 구속되지 않고, 복합체는 크기가 증가함에 따라 세포가 세포내이입하기가 더 어려워질 가능성이 있고, 추가 응집을 방지함으로써, 복합체 입자는 세포내이입 크기 범위 내에 더 길게 유지될 수 있는 것으로 고려된다. 이 효과는 44μg/mL 및 146.6μg/mL 복합체 용액에서 관찰되었지만, 404μg/mL 복합체 용액에서는 관찰되지 않았다. 복합체 입자의 농도는 존재하는 HSA가 응집을 방지하기에는 너무 높았을 가능성이 있다. 도 6에 제시된 연구들은 146.6μg/mL 복합체 용액에 HSA를 1mg/mL로 보충하면 규모에 관계없이 향후 모든 293개 렌티바이러스 생산 프로세스에서 역가 손실을 방지할 수 있음을 나타낸다.
실시예
4
HSA
첨가 후 최대 24시간 동안의 복합체 대기 시간의 평가
이 실시예는 HSA 첨가 또는 첨가 없이 복합체로 형질주입된 배양물에서 바이러스 벡터 생산에 대한 형질주입 복합체 대기 시간의 효과를 특성화한다.
실시예 3은 DNA 및 PEI 용액을 함께 혼합한 후 형질주입 복합체 용액을 보충하면 30분까지 연장된 복합체 인큐베이션 시간에서 관찰되는 역가의 손실을 방지한다는 것을 입증했다. 이는 도 7a에도 그래픽으로 도시되어 있다. 최대 대기 시간(30분)에서 어떠한 유의한 역가 감소도 관찰되지 않았기 때문에, HSA 첨가 후에 복합체 인큐베이션 시간이 수확시 역가에 영향을 미치기 시작할 때 또는 그러한지는 알려지지 않았다. 따라서, 최대 24시간 동안 HSA 첨가 후 복합체 대기 시간의 영향을 본 실시예에서 평가하였다.
본 실시예는 DWP에서 성장한 배양물에서 수행하였다. 3개의 동일한 마스터 믹스를 제조하였다. 모든 마스터 믹스를 3:1:1:1 전이유전자:rev:env:gag/pol 몰비, 68.7μg/mL DNA 농도, 및 1:1 DNA:PEI 질량비로 준비하였다. 각 웰에 최종 DNA 농도가 2μg/mL가 되도록 하기에 필요한 부피의 마스터 믹스를 수용하였다. 이 실시예에 대한 각각의 조건을 3회 시험하였다.
단일 시드 트레인을 모든 조건에 대해 증폭하였다. 시드 트레인을 증폭하고 1L 진탕 플라스크에서 2 x 250mL 배양물로 시딩하는 데 사용하였다. 세포 배양물을 2.1e6vc/mL로 희석했다. 플라스크를 진탕 인큐베이터 플랫폼 상에 24시간 동안 다시 놓았다. 시딩 직후, 3개의 벌크 DNA 용액을 137.3μg/mL DNA 및 3:1:1:1 전이유전자:rev:env:gag/pol 몰비로 준비하고, 3개의 벌크 PEI 용액을 137.3μg/mL로 준비하였다. 각각의 DNA 및 PEI 용액 0.6mL를 96 딥 웰 플레이트에서 16개 웰로 개별적으로 분취하였다. 형질주입 24시간 전에, 각각의 벌크 PEI 용액으로부터 2개의 PEI 분취물을 각각의 벌크 DNA 용액으로부터의 2개의 개별 DNA 분취물로 옮기고, 혼합하여 6개의 마스터 믹스 용액을 준비하였다. 6개의 마스터 믹스 용액 중에서, 벌크 PEI 및 DNA 용액의 각 군으로부터 하나의 용액을 24μL의 50mg/mL HSA 용액으로 보충하여 세 개의 안정화된 복합체 용액을 형성하였다. 이 복합체 생성 절차를 형질주입 18시간, 2시간, 1시간, 30분, 20분, 10분 및 2분 전에 반복하였다. 형성된 복합체 및 비혼합된 DNA 및 PEI 배양물을 형성과 형질주입 사이에 실온에서 저장하였다. 시딩 24시간 후, 벌크 세포 배양물을 24개 DWP에 분취하였다. 3mL 세포 배양물을 2개의 플레이트 상의 48개 웰로 피펫팅하여 옮겼다. 이어서, 각각의 웰을 형질주입시켰다. 이전 24시간 내에 준비된 각각의 마스터 믹스를 사용하여 하나의 웰을 형질주입시켰다. HSA로 보충된 마스터 믹스를 사용한 형질주입물을 보충되지 않은 마스터 믹스로 형질주입된 샘플로부터 플레이트에 의해 분리하였다. 도 7b에 도시된 플레이트 맵은 각각의 웰에 대한 형질주입 복합체 대기 시간 및 HSA 함량을 상세히 나타낸다.
형질주입 후 48시간째에, 모든 웰을 수확하였다. 두 플레이트 모두 1000 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 각각의 웰로부터 3 x 0.6mL 상청액을 분취하고, -80°C에서 동결시켰다. 동결된 샘플들을 이후에 역가에 대해 분석하였다.
본 실시예에서 각 웰의 수확 역가를 비교하기 위해 역가 분석을 수행하였다. 동일한 벌크 DNA 및 PEI 용액들로부터의 마스터 믹스들로 형질주입된 웰들을 도 7c에 개별 곡선으로 도표화하였다. 구체적으로, 도 7c는 복합체 인큐베이션 시간에 따른 모든 샘플의 역가를 상세히 나타낸다. HSA로 보충된 복합체들로 형질주입된 웰들은 점선으로 표시된다. 보충되지 않은 PEI-DNA 복합체들로 형질주입된 웰들은 실선으로 표시된다. 도 7c에서, 도표 701, 702, 및 703은 HSA가 없는 샘플을 도시하고, 도표 704, 705, 및 706은 HSA가 있는 샘플을 도시한다.
도 7d는 도 7c의 데이터를 포함하는 그래프이지만, 24시간 주기에서 2시간 시간 프레임으로 압축한 것이다. 따라서, 도 7d의 숫자들은 도 7c의 것과 동일하다. 도 7d는 HSA-보충된 복합체들로 형질주입된 샘플들 내에서, 특정 대기 시간이 일관되게 다른 것보다 유의하게 더 높은 역가를 초래함을 보여준다.
본 실시예에서, 68.7μg/mL DNA의 최종 농도로 준비된 복합체들은 10분 보다 길게 인큐베이션된 복합체들로 형질주입된 모든 샘플에서 측정가능한 역가를 생성하지 않았다. 대조적으로, HSA로 보충된 복합체들로 형질주입되고 최대 2시간 동안 유지된 샘플들에서 역가의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 2시간에서 18시간까지 유의한 역가 감소가 관찰되었다. 그러나, 18시간 동안 인큐베이션된 보충된 복합체들로 형질주입된 샘플들은 여전히 측정가능한 역가를 생성하였으며, 이는 역가가 감소하기 시작할 수 있는 대기 시간이 2시간 내지 18시간 사이의 어딘가이고 최대 18시간까지는 허용가능한 역가 수준을 생성하기에 충분하다는 것을 나타낸다. 더욱이, 도 7c 및 도 7d의 데이터는 이 기간 동안 역가의 점진적인 감소가 발생함을 보여주며, 이는 특정 대기 시간에서 역가의 급격한 붕괴와 대조적이다. 본 실시예는 68.7μg/mL DNA에서 준비되고 HSA가 1mg/mL로 보충된 형질주입 복합체들에 대해 30분 내지 2시간, 심지어 최대 18시간까지 허용가능한 인큐베이션 시간을 연장시키는 것을 지지한다.
추가 연구들에서도 HSA 보충이 생물반응기 규모에서 복합체들을 안정화할 수 있음을 발견했다. 형질주입을 규모를 축소한 교반 탱크 생물반응기 모델에서 수행하였다. 4개의 생물반응기 배양물을 형질주입시켜 바이러스 벡터들을 생산하였다. 배양물들에 형성 후 2 또는 30분에 0 또는 1mg/mL HSA로 보충된 형질주입 복합체 복합체들을 수용하였다. 생물반응기 규모 배양물에 HSA를 도입하는 것은 진탕 플라스크 규모에서 나타난 것과 동일한 안정화 효과를 보였다. 대규모 복합체는 30분까지 안정하였다.
30분은 실험실-규모 형질주입 복합체를 준비하고 도입하기에 충분한 시간을 제공하지만, 제조 규모 복합체 준비는 추가 시간을 필요로 할 수 있다. 역가의 감소가 관찰되기 전에 얼마나 긴 HSA 보충된 복합체가 유지될 수 있는지를 결정하기 위해 추가의 복합체 유지 실험을 수행하였다. 형질주입 복합체를 준비하고, 형성 후 목적하는 시점에 0 또는 1mg/mL HSA로 보충하고, 세포에 첨가하기 전에 2, 10, 20, 30, 60, 120, 1140, 또는 1440분 동안 유지하였다. 각 배양물의 역가를 측정하였다. 보충된 복합체들은 최대 120분 동안 안정성을 나타낸 반면, 보충되지 않은 복합체들은 2분을 넘는 모든 시점에서 유의한 역가 손실을 나타낸다. 추가로, 보충된 복합체들은 여전히 최대 24시간 동안 측정가능한 역가를 생성하였다.
실시예
5
형질주입 복합체의 동결건조 스크리닝
본 실시예는 상온에서 안정한 형질주입 복합체의 생성을 위한 형질주입 복합체, 특히 PEI-DNA 형질주입 복합체의 동결건조 스크리닝을 입증한다. 이점들에는 형질주입 단위 조작으로부터 형질주입 복합체 형성 프로세스를 공간적으로 및 시간적으로 분리하는 능력, 형질주입 단위 조작 동안 조작 오류의 위험을 감소시키는 능력, 및 로트-대-로트 일관성에 대한 개선이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 도 9는 동결건조된 형질주입 복합체를 생성하고 사용하기 위한 일반적인 프로세스 흐름을 도시한다. 일반적으로, 프로세스 단계들은 형질주입 복합체의 제형화 및 ??칭을 포함하였다. ??칭된 형질주입 복합체에 대해 동적 광 산란 측정을 수행하였다. 형질주입 복합체는 DNA 및 중합체(예를 들어, PEI)를 포함하였고, ??칭은 HSA(재조합 또는 비-재조합)에 의해 이루어졌다. 제형화 및 ??칭 후, 형질주입 복합체를 동결건조시키고, 냉장고(예를 들어, 4°C), 또는 냉동고(예를 들어, -20°C 또는 -80°C)에 저장하였다. 이후에, 물을 첨가하여 동결건조된 형질주입 복합체를 재구성하였다. 재구성 후, 형질주입 복합체의 크기를 동결건조 전 크기와 비교하기 위해 DLS 측정을 다시 수행하였다. 목적하는 세포들의 집단의 형질주입을 재구성 후에 수행하였다.
동결건조-전 연구로 지칭되는 제1 연구에서, PEI 및 DNA를 포함하지 않는 조성물에 대한 에지 효과를 조사하였다. 본원에서 논의할 때, 에지 효과는 시험한 동결건조 제형의 코너 지점들, 즉 가장 높은 당 농도 및 가장 낮은 당 농도를 지칭한다. 본 연구는 첨가제가 HSA 동결건조에 어떤 영향을 미칠 수 있는지를 이해하기 위해 수행되었다.
따라서, 본 실시예의 제1 연구에서, 물 중 HSA, 수크로스 및 만니톨의 상이한 혼합물을 동결건조에 대해 시험하였다. 6가지 상이한 실험에서 다양한 농도의 HSA, 수크로스 및 만니톨을 시험하였다. 만니톨이 없는 제형은 약간의 동결건조 케이크 붕괴를 나타냈다. 모든 제형은 거의 즉시 재구성되었다.
제2 연구에서, ??칭된 형질주입 복합체의 동결건조 스크리닝을 수행하였다. 동결건조 스크리닝 조성물들은 pH-중성 배지 중 1-10mg/mL의 HSA, 0-40mg/mL의 수크로스, 0-30mg/mL의 만니톨, 68.7mg/mL의 DNA, 및 68.7mg/mL의 PEI를 포함하였다. 아래 표 6은 ??칭된 형질주입 복합체들을 사용하여 제조된 13개의 제형을 제공한다.
표 9에 열거된 13개의 상이한 조건의 동결건조-전 DLS 측정을 수득하였다. 데이터는 도 10에 도시되며, x축 상에 유체역학적 직경 및 y축 상에 강도 백분율이 도시된다. 3개의 현저한 피크가 도 10에 화살표로 도시된 바와 같이 각 조건에서 관찰되었고 이는 ~ 10d.nm, ~ 50-100d.nm, 및 ~ 500-1000d.nm에 해당한다. 피크가 특정 범위 이내인 경우(예를 들어, 가장 큰 피크에 대해 500 또는 1000d.nm), 샘플 의존적이고 ??칭된 복합체들에 대해 특이적이었다. 인간 혈청 알부민은 도 11의 데이터에 의해 도시된 바와 같이 100d.nm(유체역학적 직경) 및 6-10d.nm 근처의 2개의 더 작은 피크의 이유인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 도 11은 2개의 상이한 HSA 용액(10mg/mL로 희석된 250mg/mL 스톡(stock) HSA 및 10mg/mL로 희석된 25mg/mL 스톡 HSA)에 대해, x-축 상의 유체역학적 직경 및 y-축 상의 강도 백분율을 다시 도시한다. 도 11의 경우, 도표 1101은 10mg/mL로 희석된 250mg/mL 스톡 HSA이고, 도표 1102는 10mg/mL로 희석된 25mg/mL 스톡 HSA이다. 500 내지 1000d.nm 근처의 가장 큰 피크들은 각각의 조건에서 ??칭된 복합체들이고, 도 6에 도시된 결과와 일치한다.
도 12는 만니톨 농도, 수크로스 농도 및 HSA 농도(각각 mg/mL)에 대해 별도로 도표화된 표 6에 열거된 13개의 상이한 조건에 대해 DLS에 의해 측정된 바와 같은 형질주입 복합체 크기를 도시한다. 도 12에 도시된 데이터는 직경이 약 500 나노미터이고 직경이 1000 나노미터(유체역학적 직경)인 현저한 복합체 크기를 나타낸다. 도 13은 1mg/mL HSA 제형, 5.5mg/mL HSA 제형 및 10mg/mL HSA 제형 각각에 대한 강도 백분율에 대한 유체역학적 직경을 개별적으로 도표화한다(표 6 참조). 이 데이터는 유사하게 직경(유체역학적 직경)이 약 500 나노미터 및 1000 나노미터인 현저한 복합체 크기들을 나타낸다.
추가로, DNA, PEI, HSA 및 pH-중성 배지 단독(예를 들어, 수크로스 또는 만니톨 없음)을 함유하는 제형들을 시험하여 이들이 양질의 동결건조 케이크를 생성할 수 있는지 여부를 확인하였다. 수크로스 및 만니톨이 결여된 제형은 수크로스 및 만니톨 중 하나 이상을 포함하는 샘플과 비교하여 품질이 저하된 동결건조 케이크를 생성한다.
동결건조 전 형질주입 크기가 동결건조 케이크 외관과 연관되는지 여부를 평가하기 위해, 케이크 외관과 관련된 동결건조 케이크 점수 체계를 생성하였다. 도 14는 표 6에 도시된 13개의 상이한 제형 각각에 대한 동결건조 전 복합체 크기에 대해 도표화된 동결건조 케이크 점수를 나타낸다. 도시된 바와 같이, 형질주입 복합체 크기는 동결건조 케이크 외관과 상관관계가 없다.
표 6에 열거된 13개의 상이한 제형의 관점에서, 3개의 제형은 상기 언급된 동결건조 케이크 점수 체계에 의해 판단된 바와 같이 최상의 케이크 외관을 나타냈다. 구체적으로, 조건 6, 조건 7 및 조건 9는 최상의 케이크 외관을 나타냈다. 더 높은 점수의 케이크는 보유 성능의 더 높은 확률에 상응할 것으로 예상된다 (예를 들어, 더 높은 점수의 케이크는 재구성된 동결건조 케이크의 형질주입 후 증가된 역가에 상응함).
실시예
6
PEI
-
아데노
-연관 바이러스(
AAV
) 플라스미드 복합체에 대한
??칭제로서의
HSA의
평가
본 실시예는 DNA가 렌티바이러스 벡터 플라스미드와는 대조적으로 AAV 플라스미드인 PEI-DNA 복합체에 대한 HSA의 첨가가 HSA 첨가가 결여된 복합체와는 대조적으로 복합체를 안정화시킨다는 것을 예시한다. 본 실시예는 또한 DNA가 AAV 플라스미드인 PEI-DNA 복합체에 대한 HSA의 첨가가 HSA로 처리되지 않은 복합체보다 더 높은 AAV 벡터 게놈을 초래한다는 것을 예시한다.
실시예 6에 개괄된 실험을 위해, AAV에 대한 플라스미드 몰비는 1:1:1 pHleper, RepCap, 및 관심 유전자(GOI)였다(표 7 참조).
계산된 복합체 농도는 AAV에 대해 약 135mg/mL이었고, 따라서 복합체 대기 시간은 이전에 결정된 HSA 복합체 대기 시간 데이터에 기초하여 약 5분으로 고정되었다. DNA 벌크 용액, PEI 벌크 용액, 및 HSA 스톡을 형질주입 24시간 전에 준비하고, 실온에서 밤새 유지하였다. 복합체들은 AAV 플라스미드들의 1:1:1 몰비였다(표 7 참조). 사용된 PEI 대 DNA 질량비는 2:1이었고, PEI 대 DNA 용액을 첨가하기 위한 부피비는 1:1이었다. 16개의 개별 복합체를 각각의 플라스크에 대해 그의 각각의 시점(형질주입 0, 2, 6, 24시간 전)에서 15mL 원뿔형 튜브들에서 형성한 다음, 1mg/mL의 HSA 또는 유사한 부피의 ??칭 시약 대 복합체 부피 비의 형질주입 배지(약 4%의 복합체 용액)로 ??칭하였다. 구체적으로, 복합체 형성 5분 후에 HSA를 첨가하거나 첨가하지 않고, ??칭된 복합체를 0, 2, 6 및 24시간 동안 유지시킨 후 형질주입시킨 후 복합체 안정성을 평가하였다. HSA가 PEI-AAV DNA 복합체를 안정화시킬 수 있는지를 알아내기 위해, 벡터 게놈들에서의 반응을 평가하였다. 0mg/mL 및 1mg/mL에서 HSA 각각에 대해 실험 시점들을 2회 평가하였다.
형질주입/접종을 위해, 125mL 삼각 플라스크들을 30mL의 부피로 사용하였다. 플라스크들을 120RPM, 8% CO2 및 85% 습도에서 37°C에서 인큐베이션하였다. 사용된 세포 성장 배지는 BalanCD, 4mM 글루타맥스, 0.1% 폴록사머 188이었다. 벡터 게놈의 결정을 위해, 각각의 조건으로부터 세포 3mL를 37°C에서 4시간 동안 0.5%(v/v) 트리톤-X 100 (최종 농도)에서 용해시키고, 이어서 3000 x g에서 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 도 15는 ??칭/안정화제로서 PEI-AAV DNA 복합체에 대한 HSA의 첨가가 0 시점 이외의 검사된 모든 시점(예를 들어, ??칭 후 및 형질주입 전 2시간, 6시간 및 24시간 대기 시간)에서 벡터 게놈의 증가를 초래한다는 것을 예시한다. 언급된 바와 같이, 0mg/mL(원들 1501) 및 1mg/mL(삼각형들 1502)에서 HSA 각각에 대해 실험 시점들을 2회 평가하였다. 요약하면, HSA는 PEI-AAV DNA 복합체뿐만 아니라 PEI-LVV DNA 복합체에 대한 ??칭/안정화제로서 사용될 수 있다.
실시예
7
복합체 안정화제로서 재조합 단백질의 평가
이 실시예는 TFXN 복합체를 안정화시킬 수 있는 재조합 단백질을 확인할 목적으로, PEI-DNA 복합체 안정화제로서 사용하기 위한 단백질을 스크리닝하였다.
본원에 개시된 바와 같이, 인간 혈청 알부민(HSA)은 추가의 복합체 응집을 방지함으로써 TFXN 복합체를 안정화시키기 위해 PEI 매개된 형질주입에 사용된다. HSA의 안정화 효과를 복제한 재조합 단백질로 HSA를 대체하는 것은 여전히 TFXN 복합체 크기에 대한 조작자 제어를 허용하면서 동물 및 인간 유래 성분이 없는 상태로 유지되도록 293LV 현탁액 프로세스를 유지할 것이다.
TFXN 복합체에 대한 상이한 단백질들의 안정화 효과를 더 잘 이해하고 제조 매개변수들의 변화에 따라 복합체 거동이 어떻게 변화하는지를 이해하기 위해, HSA를 안정화 보충제로서 시험하였다. HSA 이외에 잠재적인 안정화 효과에 대해 스크리닝된 단백질은 옵티부민(Invitria, Junction City, KS), 피치아 파스토리스 r-알부민(Sigma), 쌀 r-알부민(Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 엑스부민(Invitria, Junction City, KS), r-트랜스페린(Sigma-Aldrich, St Louis, MO), r-인슐린(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 및 소 태아 혈청(FBS)(Hyclone, Logan, UT)을 포함하였다. 본 실시예에서, “r-단백질”은 “재조합 단백질”을 지칭하고, 예를 들어, “r-알부민”은 재조합 알부민을 지칭한다.
각각의 단백질을 balanCD 배지에서 FBS를 제외하고 50mg/mL의 최종 농도로 용해시켰다. FBS의 정확한 단백질 농도가 명시되지 않기 때문에, 다른 보충 용액에 첨가된 부피와 동일하게 하는 동시에, 인산칼슘 형질주입 복합체가 1.96%의 최종 FBS v/v 농도를 함유하는 배지로 ??칭되게 하도록, 첨가된 FBS의 부피는 총 복합체 용액의 1.96%였다. 복합체 크기 측정을 수행하기 위해, 벌크 137.3μg/mL DNA 및 137.3μg/mL PEI 용액을 각각 10mL로 제조하였다. 1.37mL의 플라스미드 p10021(Lot 82094)을 8.63mL의 balanCD에 첨가하여 DNA 용액을 생성하였다. 1.37mL의 PEI(Lot 26033C1B)를 8.63mL의 balanCD에 첨가하여 PEI 용액을 생성하였다. 각 실행에 대해, 0.6mL DNA 용액을 Sarstedt 정사각형 12mm x 12mm x 45mm 투명 폴리스티렌 큐벳(Sarstedt, Newton, NC, PN 67.754)에 넣고 제타사이저 DLS 큐벳 홀더에 넣었다. 0.6mL PEI 용액을 피펫으로 첨가하고, 용액을 간단히 혼합하였다. 제타사이저 소프트웨어를 시작하여 DLS를 사용하여 3분 동안 15초 입자 크기 판독치들을 취하였다. 이어서, 측정을 70초 동안 중단하고, 하나의 단백질 용액 24μL를 큐벳에 첨가하고, 용액을 혼합하였다. 이어서, DLS 측정을 30초 평균으로 30분 동안 계속하였다.
본 실시예의 실험 절차들은 다른 날들에 수행하였다. 모든 용액을 판독일들 사이에 2-8°C 냉장고에 저장하였다. 첫째 날에, HSA, 옵티부민, 피치아 파스토리스 r-알부민, 및 쌀 r-알부민이 보충된 복합체들에 대해 상기 상세한 절차를 수행하였다. 모든 용액을 측정하기 전에 실온(RT)으로 만들었다. 둘째 날에, r-트랜스페린, r-인슐린 및 FBS가 보충된 복합체들에 대해 상기 상세한 절차를 반복하였다. 모든 용액을 복합체 형성 전에 RT로 만들었다. 셋째 날에, 엑스부민이 보충된 복합체들에 대해 상기 상세한 절차를 반복하였다. 모든 용액을 복합체 형성 전에 RT로 만들었다.
측정 결과를 도 16에 나타내었다. 시험된 인간 알부민들 중에서, 단지 HSA 및 피치아 파스토리스 유래 r-알부민만이 복합체 안정화 효과를 나타냈다. GMP(우수한 제조 프로세스) r-알부민(예를 들어, 옵티부민, 엑스부민) 및 쌀 유래 r-알부민은 안정화 효과를 나타내지 않았다. 참고로, 도 17은 도 16의 그래프의 일부만을 도시한 것으로, 구체적으로 도 17은 HSA와 비교하여 PEI-DNA 복합체 크기에 대한 피치아 파스토리스 유래 r-알부민-알부민의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 16에서 도표 1602는 HSA이고, 도표 1603은 옵티부민이고, 도표 1604는 피치아 파스토리스-유래 r-알부민이고, 도표 1605는 쌀-유래 r-알부민이고, 도표 1606은 엑스부민이고, 도표 1607은 r-트렌스페린이고, 도표 1608은 r-인슐린이고, 도표 1609는 FBS이다. 도 17은 도 17에 도시된 데이터도 도시하므로, 숫자는 동일하다. 구체적으로, 도표 1602는 HSA이고, 도표 1604는 피치아 파스토리스-유래 r-알부민이다.
FBS, r-인슐린, 및 r-트랜스페린으로 ??칭된 복합체들은 초기에 더 작고 더 느린 속도로 성장하는 것으로 보인다. 더 작은 초기 시작 크기는 더 빠른 기기에 대한 혼합 초기화 기간의 결과일 수 있다. 이 기간을 단축시키는 것은 복합체가 혼합과 제1 판독의 시작 사이에 형성하기 위한 더 적은 시간을 가질 수 있어, 더 작은 복합체 크기를 초래할 수 있음을 의미할 수 있다. 그러나, 이것으로는 복합체 형성 속도가 이날 보충 전후 모두에서 이 복합체들에 대해 더 느린 이유가 설명되지 않는다. 시험된 모든 단백질에 대해 동일한 DNA 및 PEI 용액을 사용하였기 때문에, 이러한 속도 변화의 근본 원인은 용액 제조에서의 실수에 고정될 수 없다. 판독들 사이의 기간 동안 DNA 또는 PEI 품질 저하 가능성이 있지만, 왜 이 복합체 형성이 둘째 날에 느려졌다가, 그 다음 셋째 날에는 첫째 날에 관찰된 수준으로 다시 증가했는지를 설명하지 않기 때문에 그 가능성도 낮다. 그럼에도 불구하고, 보충 전 및 후에 복합체의 거동은 단백질이 복합체와 어떻게 상호작용하는지에 대한 명백한 이해를 보여주며, 여전히 r-인슐린, r-트랜스페린, 및 FBS의 안정화 잠재력을 대표하는 것으로 간주된다.
본 연구에서 FBS의 존재 하에 형질주입 복합체의 거동은 이전에 관찰된 것과 상이하였다. 이 이전 연구들에서, FBS는 형질주입 복합체 용액에 첨가시 입자 크기를 감소 및 안정화시키는 것 둘 다에 대해 관찰되었다. 이러한 거동은 본 실시예에서 관찰되지 않았고, 복합체 크기가 다른 용액보다 FBS-보충된 용액에서 더 느리게 증가하였지만, 크기 변화율의 차이는 같은 날에 수행된 다른 샘플들과 유사하고, FBS 첨가의 결과인 것으로 생각되지 않는다. FBS 첨가 후의 효과의 차이는 복합체 제조 매개변수들의 차이 또는 보충 기술의 차이에 의해 설명될 수 있다. 본 연구의 복합체들은 68.7μg/mL DNA 및 1:1 DNA:PEI 질량비로 준비하였다. 이전 연구들의 복합체들은 26.8μg/mL DNA 및 1:2.4 DNA:PEI 질량비로 준비하였다. 이러한 연구들에서 FBS 농도는 또한 약간 더 높았다: 본 연구는 1.96%의 최종 FBS v/v 비를 갖는 복합체들을 준비한 반면, 이전에는 2.5% 및 4.05%의 최종 FBS v/v 비들을 갖는 복합체들에서 안정화를 보였다. 또 다른 중요한 인자는 첨가 절차일 수 있다: 이 실험은 농축물 중의 FBS를 첨가하였고 이의 부피를 총 복합체 용액 부피의 1.96%로 제한하였다. 이전 연구들은 배지에 희석된 FBS를 첨가하였다. 희석된 FBS 용액은 복합체 용액과 같거나 더 큰 부피로 첨가될 것이다. 복합체 용액 부피의 배가는 복합체 크기 변화의 속도를 느리게 할 것이다. FBS가 복합체를 안정화시킨다고 가정하면, 더 희석된 복합체는 복합체를 안정화시키기 위해 더 낮은 농도의 FBS를 필요로 할 수 있다.
특정 구현예들이 본원에 예시되고 설명되었지만, 동일한 목적들을 달성하기 위해 계산된 매우 다양한 대안적인 및/또는 동등한 구현예들 또는 구현들이 범위를 벗어나지 않고 도시되고 설명된 구현예들에 대해 대체될 수 있다는 것을 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들은 이해할 것이다. 본 기술분야의 기술자들은 구현예들이 매우 다양한 방식으로 구현될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 본 출원은 본원에서 논의된 구현예들의 임의의 적응들 또는 변형들을 커버하도록 의도된다. 따라서, 구현예들은 청구항들 및 그 등가물들에 의해서만 제한되는 것이 명백히 의도된다.
Claims (36)
- 방법으로서,
제1 농도의 제1 미리 결정된 양의 PEI 용액을 제2 농도의 제2 미리 결정된 양의 DNA 용액에 첨가하고 혼합하여 용액 중의 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계;
제1 미리 결정된 기간 이후에, 상기 PEI-DNA 용액에 제3 미리 결정된 양의 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제(transfection complex stabilizing agent)를 첨가하여 안정화된 PEI-DNA 복합체를 수득하는 단계; 및
상기 제1 미리 결정된 기간 다음에 제2 미리 결정된 기간 이후에, 상기 안정화된 PEI-DNA 복합체로 세포들의 집단을 형질주입시키는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 미리 결정된 기간은 상기 제1 농도 및 상기 제2 농도의 함수인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 제1 농도 및 상기 제2 농도가 감소함에 따라 상기 제1 미리 결정된 기간은 증가하고;
상기 제1 농도 및 상기 제2 농도가 증가함에 따라 상기 제1 미리 결정된 기간은 감소하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 미리 결정된 대기 시간은 상기 PEI-DNA 복합체의 목적하는 크기의 함수인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제4항에 있어서,
상기 목적하는 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 DNA 용액은 하나 이상의 DNA 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 하나 이상의 DNA 플라스미드는 하나 이상의 바이러스 단백질의 합성을 위한 하나 이상의 유전자를 포함하는 전달 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 하나 이상의 유전자는 렌티바이러스 게놈 또는 아데노 연관 바이러스 게놈 중 적어도 일부에 대한 유전자들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 세포들의 집단은 포유동물 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK) 293 부유성 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 안정화된 PEI-DNA 복합체는 상기 세포들의 집단을 형질주입하기 전에 동결되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 미리 결정된 기간은 상기 PEI-DNA 용액에 상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제의 첨가 후 1분 내지 18시간 사이인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 미리 결정된 기간은 5분 초과이고 2시간 미만인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 비재조합 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로부터 정제된 재조합 알부민인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 PEI-DNA 형질주입 복합체 안정화제는 재조합 인간 혈청 알부민(HSA)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 폴리플렉스(polyplex)의 크기를 안정화하는 방법으로서,
디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA)을 포함하는 제1 용액을 양이온성 중합체를 포함하는 제2 용액과 함께 혼합하여 폴리플렉스 용액을 수득하는 단계; 및
상기 제1 용액과 상기 제2 용액을 함께 혼합한 후 미리 결정된 시간에, 폴리플렉스 안정화제를 상기 폴리플렉스 용액에 첨가하여 상기 폴리플렉스의 크기를 안정화시키는 단계;
를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 미리 결정된 시간은 상기 폴리플렉스의 목적하는 크기에 기초하여 선택되고; 상기 목적하는 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 폴리플렉스의 크기는 상기 미리 결정된 시간이 증가함에 따라 증가하고, 상기 미리 결정된 시간이 감소함에 따라 감소하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 폴리플렉스 안정화제를 첨가하여 상기 폴리플렉스의 크기를 안정화하는 것은 상기 폴리플렉스의 크기가 계속 증가하는 것을 방지하는 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 폴리플렉스 안정화제는 비재조합 인간 혈청 알부민(HSA)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 폴리플렉스 안정화제는 피치아 파스토리스로부터 정제된 재조합 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 폴리플렉스 안정화제는 재조합 인간 혈청 알부민(HSA)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 양이온성 중합체는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 제1 용액은 제1 농도의 DNA를 더 포함하고, 상기 제2 용액은 제2 농도의 양이온성 중합체를 더 포함하고; 상기 폴리플렉스의 크기는 상기 제1 농도, 상기 제2 농도, 및 상기 미리 결정된 시간 중 하나 이상의 함수인 것을 특징으로 하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 제1 용액을 상기 제2 용액과 미리 결정된 온도에서 함께 혼합하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 제1 용액을 상기 제2 용액과 미리 결정된 pH에서 함께 혼합하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 제1 용액이 상기 제2 용액과 혼합되는 속도(rate)를 제어하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 정의된 크기의 중합체-DNA 나노입자를 생산하기 위한 시스템으로서,
중합체 챔버 중 제1 농도의 중합체 용액;
DNA 챔버 중 제2 농도의 DNA 용액;
제1 연결 라인을 통해 상기 중합체 챔버에 선택적으로 유체 결합되고 제2 연결 라인을 통해 상기 DNA 챔버에 선택적으로 유체 결합된 혼합 챔버;
상기 중합체 챔버와 상기 혼합 챔버 사이에서 상기 제1 연결 라인에 결합된 제1 펌프 및 상기 DNA 챔버와 상기 혼합 챔버 사이에서 상기 제2 연결 라인에 결합된 제2 펌프;
상기 제1 연결 라인에 결합되고 상기 제1 펌프와 상기 혼합 챔버 사이에 위치하는 제1 밸브;
상기 제2 연결 라인에 결합되고 상기 제2 펌프와 상기 혼합 챔버 사이에 위치하는 제2 밸브;
제3 연결 라인을 통해 상기 혼합 챔버로부터 유체 흐름을 수용하는 ??칭 챔버(quenching chamber)―상기 ??칭 챔버는 제3 농도의 ??칭제(quenching agent)를 포함함―; 및
비일시적 메모리에 명령들을 저장하는 컨트롤러―상기 명령들은 실행되면, 상기 컨트롤러로 하여금 상기 제1 펌프, 상기 제2 펌프, 상기 제1 밸브, 및 상기 제2 밸브 중 하나 이상을 제어하여 상기 중합체 용액이 제1 유속으로 상기 혼합 챔버로 가도록 하고 동시에 상기 DNA 용액이 제2 유속으로 상기 혼합 챔버로 가도록 하게 하여 상기 혼합 챔버 내에서 중합체-DNA 복합체를 제공하고 이어서 상기 ??칭 챔버로 가도록 함―;
를 포함하는, 시스템.
- 제29항에 있어서,
상기 ??칭제는 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는, 시스템.
- 제29항에 있어서,
상기 ??칭제는 재조합 인간 혈청 알부민인 것을 특징으로 하는, 시스템.
- 제29항에 있어서,
상기 혼합 챔버는 상기 제1 유속 및 상기 제2 유속의 함수로서 상기 중합체 용액 및 상기 DNA 용액의 일관된 혼합 및 체류 시간을 용이하게 하기 위한 모양으로 형성된 기하학적 구조인 것을 특징으로 하는, 시스템.
- 제29항에 있어서,
상기 중합체-DNA 복합체의 성장이 상기 혼합 챔버 내에서 일어나고; 상기 중합체-DNA 복합체의 성장은, 상기 정의된 크기의 중합체-DNA 복합체를 제공하기 위해, 상기 중합체-DNA 복합체가 상기 ??칭 챔버에 침전될 때 상기 ??칭제에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는, 시스템.
- 제29항에 있어서,
상기 중합체-DNA 복합체의 상기 정의된 크기는 직경이 400 내지 1000 나노미터 사이인 것을 특징으로 하는, 시스템.
- 제29항에 있어서,
상기 DNA 용액은 하나 이상의 바이러스 단백질의 합성을 위한 하나 이상의 유전자를 포함하는 복수의 전달 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
- 제29항에 있어서,
상기 중합체 용액은 폴리에틸렌이민을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
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