KR20230035623A - 올리고뉴클레오티드의 제조 방법 - Google Patents

올리고뉴클레오티드의 제조 방법 Download PDF

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KR20230035623A
KR20230035623A KR1020237004344A KR20237004344A KR20230035623A KR 20230035623 A KR20230035623 A KR 20230035623A KR 1020237004344 A KR1020237004344 A KR 1020237004344A KR 20237004344 A KR20237004344 A KR 20237004344A KR 20230035623 A KR20230035623 A KR 20230035623A
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첸첸 후
치앙 자오
칭 리
지민 양
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창저우 신더올 파마슈티컬스 컴퍼니 리미티드
상하이 스타 파마슈티컬 알앤디 컴퍼니 리미티드
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Abstract

올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법이 개시된다. 방법은 (a) 화학식 X-1의 화합물을 하기 화학식 X-2의 화합물로 전환시키는 단계: 여기서 R10은 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머)의 잔기이고; R11은 아민 보호기이고; 여기서 화학식 X-1의 화합물은 고체 지지체에 결합되어 있지 않고; 및; (b) 임의로 화학식 X-2의 화합물에서 보호기를 제거하여 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 합성 방법은 감소된 4-니트로스티렌 부가물 불순물을 갖는 표적 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 개선된 수율 및 순도를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 측면에서 유리하다.

Description

올리고뉴클레오티드의 제조 방법
본 개시내용은 일반적으로 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(phosphorodiamidate morpholino oligomer) 또는 PMO는 상보적인 RNA에 단단히 그리고 서열 특이적으로 결합하는 핵산 유사체이며 단백질 합성 및 따라서 유전자 발현을 조절하는 데 유용하다. 이러한 올리고머는 모르폴리노 백본 시스템에 의해 지지되는 염기쌍(base-pairing) 인식 모이어티(헤테로사이클릭 염기)로 구성된다. 그러한 올리고머를 합성하는데 사용하기 위한 모르폴리노 서브유닛은 쉽게 입수가능하고 저렴한 전구체인 상응하는 리보뉴클레오시드로부터 쉽게 제조될 수 있다.
그러한 합성 동안, 통상적인 올리고뉴클레오티드 합성에서와 같이, 헤테로사이클릭 염기 상의 작용기는 합성 변환에서의 간섭을 방지하기 위해 전형적으로 마스킹된다.
O6-보호되지 않은 구아닌 서브유닛은 올리고머 단계에서 부반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, O6 산소는 커플링 단계 동안 활성화된 서브유닛과 반응하여 O6-인산화된 또는 유도체 종을 형성할 수 있고, 암모니아로 염기 보호기를 최종 절단하는 동안 암모니아는 C6에서 반응하여 이들 종을 대체하여 디아미노퓨린 유도체를 제공할 수 있다. 이러한 불순물은 크로마토그래피로 제거하기 어려우며, 수율의 큰 손실을 야기한다.
종래의 올리고뉴클레오티드 합성에서 보호되지 않은 구아닌 O6-위치의 부반응을 감소시키기 위해 당업계에서 다양한 보호 방식이 제안되었다. 그러나, 이러한 프로토콜은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성에 적용될 때 대체로 실패하였다. 따라서, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성에서, 특히 G 모르폴리노 서브유닛의 사용에서, 수율 및 순도를 증가시키기 위한 개선된 방법이 필요하다.
요약
모르폴리노 화학의 특정 챌린지로 인해, 염기 보호기는 여러 요구 사항을 충족해야 한다. 보호기는 헤테로사이클 모이어티에 쉽게 도입되어야 하며 그 후 서브유닛 활성화 및 정제 조건 및 고상(solid phase) 합성에 대해 안정해야 한다. 보호기는 성장하는 사슬의 모르폴리노 아민 모이어티와 반응하지 않아야 하며, 활성화된 모르폴리노 서브유닛이 성장하는 올리고머 사슬과 깔끔하게 결합할 수 있도록 해야 한다. 보호기는 새로운 불순물을 도입하지 않고 바람직하게는 암모니아에 의해 절단되어야 한다. 마지막으로, 그것은 활성화 전에 크로마토그래피 정제의 필요성을 피하기 위해 결정질 서브유닛 유도체를 생성해야 한다.
US2009/0131624A1에 기재된 바와 같이, O6-위치의 4-니트로페네틸(nitrophenethyl, NPE) 기는 이러한 기준을 적절하게 충족하지 못한다. NPE 기는 β-제거 메커니즘을 통해 알칼리성 시약으로 절단된다. 이러한 조건은 반응성 부산물인 4-니트로스티렌을 생성하는 경향이 있으며, 이는 올리고머의 반응성 부위와 반응할 수 있다. 올리고머에 의한 부산물의 트래핑을 방지하기 위한 시도로 탈보호 혼합물에 다양한 스캐빈징제(scavenging agent)(예를 들어, 티올 및 1,3-디카르보닐 화합물)를 도입하였지만, 이 내부 복귀 문제를 제거하는 데 완전히 성공한 것은 없었다. 심지어 정제 후에도, 이 서브유닛으로 제조된 올리고머는 노란색을 띠었다. 다양한 구현예에서, 본 개시내용은 이러한 문제 중 하나 이상을 해결하는 데 유용한 방법 및 공정을 제공한다.
일 측면에서, 본 개시내용은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머("PMO")와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 개시내용은 고상-지지된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드를 제조하는 데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
본원에 기술된 PMO의 합성 방법은 감소된 4-니트로스티렌 부가물(adduct) 불순물을 갖는 표적 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 개선된 수율 및 순도를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 측면에서 유리하다.
본 개시내용의 이러한 그리고 다른 목적 및 특징은 본 개시내용의 하기 상세한 설명을 읽을 때 보다 완전하게 명백해질 것이다.
올리고뉴클레오티드 합성의 예시적인 방법
본 개시내용은 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 화학식 X-1의 화합물을 화학식 X-2의 화합물로 전환시키는 단계:
Figure pct00001
상기 식에서:
R10은 출발 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머)의 잔기이고;
R11은 아민 보호기이고;
바람직하게는, 화학식 X-1의 화합물은 고체 지지체에 결합되어 있지 않고; 및
(b) 임의로(optionally) 화학식 X-2의 화합물에서 보호기를 제거하여 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계.
R10은, 화학식 X-1에서 출발 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머)의 잔기가 NPE 기가 제거되는 조건 하에서 변화되는지 여부에 따라, 화학식 X-1 및 X-2에서 동일하거나 상이할 수 있음이 통상의 기술자에게 명백해야 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 화학식 X-1에 나타난 NPE 기 외에 다른 보호기는 탈보호되지 않으며, R10은 화학식 X-1 및 X-2에서 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 X-2의 R10은 화학식 X-1의 R10의 탈보호된 버전을 나타낼 수 있다.
올리고뉴클레오티드(및 출발 올리고뉴클레오티드)는 특별히 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머이다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 대한 서열-특이적 결합을 위한 표적화 염기 서열을 포함한다. 표적 및 표적화 서열은 혼성화가 역평행 구성에서 일어날 때 서로에 대해 "상보적"인 것으로 기술된다. 표적화 서열은 표적 서열에 대해 "거의" 또는 "실질적인" 상보성을 가질 수 있고 본원에 기재된 방법의 목적을 위해 여전히 기능할 수 있다. 즉, 여전히 "상보적"이다. 바람직하게는, 본원에 기재된 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물은 매 10개의 뉴클레오티드당 표적 서열과 최대 1개의 미스매치를 가지며, 바람직하게는 20개 중 최대 1개의 미스매치를 갖는다. 대안적으로, 사용된 안티센스 올리고머는 적어도 80%, 적어도 90% 서열 상동성(sequence homology) 또는 적어도 95% 서열 상동성을 가지며, 본원에 지정된 예시적인 표적화 서열을 갖는다. RNA 표적에 대한 상보적 결합의 목적을 위해, 그리고 아래에서 논의되는 바와 같이, 구아닌 염기는 시토신 또는 우라실 RNA 염기에 상보적일 수 있다.
다양한 아민 보호기가 R11로 사용될 수 있다. 전형적으로, R11은 NH3로 처리하여 제거될 수 있는 아민 보호기이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R11은 아실기, 즉 RB-C(=O)-이고, 여기서 RB는 예를 들어 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴일 수 있고, 이들 각각은 임의로 치환된다. 일부 구현예에서, R11은 -C(=O)-RB이고, 여기서 RB는 임의로 치환된 C1- 6알킬, 예를 들어, C1- 6알킬(예: 이소프로필), 아릴 치환된 C1- 6알킬(예: 벤질), 또는 아릴옥시 치환된 C1- 6알킬이다. 일부 특정 구현예에서, R11은 -C(=O)-RB일 수 있으며, 여기서 RB는 C1- 6알킬(예: 이소프로필), 아릴(예: 페닐), 또는 아릴 치환된 C1- 6알킬(예: 벤질)이고, 바람직하게는 RB는 이소프로필이다.
일부 바람직한 구현예에서, 화학식 X-1의 화합물은 고체 지지체에 결합되어 있지 않다. 이론에 얽매이지 않고, 고체 지지체에 결합되어 있지 않으면서, 화학식 X-1의 NPE 기의 탈보호는 4-니트로스티렌 부산물이 반응 매질에서 화학식 X-2의 화합물보다 스캐빈저와 우선적으로 반응할 수 있도록 제어될 수 있는 것으로 여겨진다. 그러나, 일부 구현예에서, 화학식 X-1의 화합물은 또한 고체 지지체에 결합될 수 있고 반응은 예를 들어 4-니트로스티렌 부산물이 반응 매질에서 화학식 X-2의 화합물보다 스캐빈저와 우선적으로 반응할 수 있도록 과량의 스캐빈저를 첨가함으로써 제어된다.
화학식 X-1의 화합물을 화학식 X-2의 화합물로 전환시키는 조건은 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 전환은, 바람직하게는 용액 중의, 화학식 X-1의 화합물을 알칼리성 시약(예를 들어, 본원에 기재된) 및 화학식 X-3의 화합물과 반응할 수 있는 스캐빈저를 포함하는 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다:
Figure pct00002
.
알칼리성 시약은 전형적으로 염기성 유기 아민이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 알칼리성 시약은 수중 pKa가 약 9 이상, 예컨대 약 9-15, 약 10-14, 약 12, 약 13, 또는 약 14인 염기성 유기 아민이다. 일부 구현예에서, 알칼리성 시약은 염기성 사이클릭 아민이다. 일부 구현예에서, 알칼리성 시약은 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔("DBU") 또는 1,5-디아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔("DBN")이다. 알칼리성 시약은 전형적으로 과량으로 첨가되며, 예를 들어 알칼리성 시약 대 화학식 X-1의 화합물의 NPE 기(들)의 몰비는 전형적으로 1:1 초과, 예컨대 1.2:1, 1.5:1, 2:1, 5:1 또는 10:1, 또는 언급된 값 사이의 임의의 범위, 예컨대 1:1 내지 10:1이다.
스캐빈저는 화학식 X-3의 부산물과 반응할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 전형적으로, 스캐빈저는 -SH 또는 1,3-디카르보닐 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 스캐빈저는 화학식 X-4의 화합물일 수 있다:
Figure pct00003
상기 식에서:
q는 0, 1 또는 2이고, 및
RA는 각 경우에 독립적으로 임의로 치환된 C1- 6알킬(예: 메틸)이다.
일부 구현예에서, q는 0이다. 일부 구현예에서, q는 1이고, RA는 임의로 치환된 C1- 6알킬, 예컨대 메틸이다. RA는 화학식 X-4의 화합물이 화학식 X-3의 화합물의 스캐빈저로서 작용할 수 있는 한, 이용 가능한 위치 중 어디에든 부착될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 스캐빈저는 티민 또는 이의 유도체이다. 일부 특정 구현예에서, 스캐빈저는 티민이다.
스캐빈저는 전형적으로 또한 과도하게 사용된다. 예를 들어, 스캐빈저 대 화학식 X-1의 화합물의 NPE 기(들)의 몰비는 전형적으로 1:1 초과, 예컨대 1.2:1, 1.5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 또는 언급된 값 사이의 임의의 범위, 예컨대 1:1 내지 10:1이다. 화학식 X-1의 화합물이 4-니트로스티렌과 반응할 수 있는 하나 이상의 염기를 갖는 경우, 스캐빈저의 양은 예를 들어 최대 50:1(또는 그 이상)의 화학식 X-1의 화합물의 NPE 기(들)까지로 추가로 증가될 수 있다.
화학식 X-1의 화학식 X-2로의 전환은 전형적으로 하나 이상의 용매를 사용하는 것을 포함한다. 다양한 용매가 적합하다. 비제한적인 유용한 용매는 본원에 기재된 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용매는 DMF, DMA, DMI, NMP 등과 같은 비양성자성(aprotic) 극성 용매일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 용매는 NMP일 수 있다.
일부 구현예에서, 알칼리성 시약 및 스캐빈저의 혼합물에 화학식 X-1의 화합물을 첨가하는 것은 올리고뉴클레오티드에 대한 NPE 부가물의 양이 최소화되도록, 예를 들어 10% 미만, 예컨대 5% 미만이 되도록 제어될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 화학식 X-2의 화합물을 NH3로 처리하여 화학식 X-2에서 보호기를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R11은 C1- 6알킬-C(=O)-이고, NH3로 처리시, R11 기가 제거되어 탈보호된 염기 G를 제공한다.
화학식 X-1의 화합물을 화학식 X-2로 전환하는 예시적인 절차가 본원에 기재되어 있으며, 이로부터 통상의 기술자는 본 개시내용의 구현예에 쉽게 적응할 수 있다.
PMO 합성의 예시적인 방법
일부 특정 구현예에서, 본 개시내용은 PMO를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 다음을 포함한다:
(a) 화학식 X-5의 화합물을 화학식 X-6의 화합물로 전환시키는 단계:
Figure pct00004
상기 식에서:
m1 및 m2는 독립적으로 0-50의 정수(예를 들어, 0-30)이고;
R11은 아민 보호기이고;
Base(염기)는 각 경우에 독립적으로 G(구아닌), C(시토신), A(아데닌), U(우라실) 및 T(티민), 이들의 변형된 유사체, 및 이들의 보호된 유도체로부터 선택되는 염기이며, 단 화학식 X-5에서 Base가 보호된 염기인 경우, 화학식 X-6에서 상응하는 Base는 동일한 보호된 염기이거나 상응하는 부분적으로 또는 완전히 탈보호된 염기일 수 있으며;
상기 식에서:
T1은 적합한 5' 말단기(예를 들어, 짧은 펩티드, 임의로 치환된 알킬아미노기, 임의로 치환된 헤테로사이클릭기 등)이고; 및
T2는 적합한 3' 말단기, 예를 들어 수소 또는 보호기(예를 들어, 아실기, 트리틸 등)이고; 및
(b) 임의로 화학식 X-6의 화합물에서 보호기를 부분적으로 또는 완전히 제거하여 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계.
화학식 X-5 또는 X-6의 올리고뉴클레오티드는 서열의 다양한 위치에서 다양한 개수의 G 모노머를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, m1은 0이다. 일부 구현예에서, m2는 0이다. 일부 구현예에서, m1과 m2 중 어느 것도 0이 아니다. 일부 구현예에서, m1과 m2의 합은 5에서 50 사이, 예컨대 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 언급된 값 사이의 임의의 범위, 예컨대 10-40, 15-30 등이다.
화학식 X-5 또는 X-6에서 Base는 G(구아닌), C(시토신), A(아데닌), U(우라실) 및 T(티민), 이들의 변형된 유사체, 및 이들의 보호된 유도체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 본원에서 사용되는 변형된 유사체는 5-메틸 시토신, 이노신(I) 및 7-데아자-G 염기와 같은 비표준 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 X-5 또는 X-6에서 Base는 다음으로부터 독립적으로 선택될 수 있다:
Figure pct00005
.
일부 구현예에서, 화학식 X-5에서 Base가 G 모노머 단위인 경우, 그것은 NPEG일 수 있고,
Figure pct00006
, 여기서 R11은 본원에서 정의된다. 일부 구현예에서, 화학식 X-5의 모든 G 모노머 단위는 NPEG일 수 있다.
PMO와 같은 올리고뉴클레오티드는 5' 또는 3' 말단에 다양한 말단을 가질 수 있다. 본원에 기재된 합성 방법의 경우, 이러한 말단의 정확한 정체는 중요하지 않으며 PMO에 적합한 알려진 말단 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 X-5 또는 X-6에서 T1은 임의로 치환된 알킬 아민, 예를 들어 -N(C1- 6알킬)(C1- 6알킬)일 수 있고, 여기서 2개의 C1- 6알킬은 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 각각은 예를 들어 아미드로 임의로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학식 X-5 또는 X-6에서 T1은 아미드(예: -C(O)NH2) 치환된 알킬 아민, 예를 들어
Figure pct00007
일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 X-5 또는 X-6에서 T1은 임의로 치환된 헤테로사이클릭 고리, 예를 들어 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택되는 1 또는 2개의 고리 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 4-7원 헤테로사이클릭 고리일 수 있으며, 예컨대 임의로 치환된 피페리진 고리로서, 예를 들어,
Figure pct00008
이고, 여기서 RC는 아실, 아실옥시기 또는 펩티드 잔기이다.
일부 구현예에서, 화학식 X-5 또는 X-6에서 T2는 수소일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 X-5 또는 X-6의 T2는 트리틸 또는 메톡시 치환된 트리틸 기(예를 들어, MMT, DMT 등)일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 X-5 또는 X-6의 T2는 아실기(예를 들어, 아세틸)일 수 있다.
화학식 X-5 또는 X-6의 PMO는 임의의 서열을 가질 수 있으며, 이는 바람직하게는 표적 핵산에 대한 서열-특이적 결합을 위한 표적화 염기 서열을 포함한다.
다양한 아민 보호기가 화학식 X-5 또는 X-6에서 R11로 사용될 수 있다. 전형적으로, R11은 NH3로 처리하여 제거될 수 있는 아민 보호기이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R11은 아실기, 즉 RB-C(=O)-이고, 여기서 RB는 예를 들어 수소, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 헤테로아릴일 수 있고, 이들 각각은 임의로 치환된다. 일부 구현예에서, R11은 -C(=O)-RB이고, 여기서 RB는 임의로 치환된 C1- 6알킬, 예를 들어, C1-6알킬(예: 이소프로필), 아릴 치환된 C1- 6알킬(예: 벤질), 또는 아릴옥시 치환된 C1- 6알킬이다. 일부 특정 구현예에서, R11은 -C(=O)-RB일 수 있으며, 여기서 RB는 C1- 6알킬(예: 이소프로필), 아릴(예: 페닐), 또는 아릴 치환된 C1- 6알킬(예: 벤질)이고, 바람직하게는 RB는 이소프로필이다.
일부 바람직한 구현예에서, 화학식 X-5의 화합물은 고체 지지체에 결합되어 있지 않다.
화학식 X-5의 화합물을 화학식 X-6의 화합물로 전환시키는 조건은 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 일부 바람직한 구현예에서, 전환은, 바람직하게는 용액 중의, 화학식 X-5의 화합물을 알칼리성 시약(예를 들어, 본원에 기재된) 및 화학식 X-3의 화합물과 반응할 수 있는 스캐빈저를 포함하는 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다:
Figure pct00009
.
알칼리성 시약은 전형적으로 염기성 유기 아민이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 알칼리성 시약은 수중 pKa가 약 9 이상, 예컨대 약 9-15, 약 10-14, 약 12, 약 13, 또는 약 14인 염기성 유기 아민이다. 일부 구현예에서, 알칼리성 시약은 염기성 사이클릭 아민이다. 일부 구현예에서, 알칼리성 시약은 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔("DBU") 또는 1,5-디아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔("DBN")이다. 알칼리성 시약은 전형적으로 과량으로 첨가되며, 예를 들어 알칼리성 시약 대 화학식 X-5의 화합물의 NPE 기(들)의 몰비는 전형적으로 1:1 초과, 예컨대 1.2:1, 1.5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 또는 언급된 값 사이의 임의의 범위, 예컨대 1:1 내지 10:1이다.
스캐빈저는 화학식 X-3의 부산물과 반응할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 전형적으로, 스캐빈저는 -SH 또는 1,3-디카르보닐 모이어티를 갖는다. 일부 구현예에서, 스캐빈저는 화학식 X-4의 화합물일 수 있다:
Figure pct00010
상기 식에서:
q는 0, 1 또는 2이고, 및
RA는 각 경우에 독립적으로 임의로 치환된 C1-6알킬(예: 메틸)이다.
일부 구현예에서, q는 0이다. 일부 구현예에서, q는 1이고, RA는 임의로 치환된 C1- 6알킬, 예컨대 메틸이다. RA는 화학식 X-4의 화합물이 화학식 X-3의 화합물의 스캐빈저로서 작용할 수 있는 한, 이용 가능한 위치 중 어디에든 부착될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 스캐빈저는 티민 또는 이의 유도체이다. 일부 특정 구현예에서, 스캐빈저는 티민이다.
스캐빈저는 전형적으로 또한 과도하게 사용된다. 예를 들어, 스캐빈저 대 화학식 X-5의 화합물의 NPE 기(들)의 몰비는 전형적으로 1:1 초과, 예컨대 1.2:1, 1.5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 또는 언급된 값 사이의 임의의 범위, 예컨대 1:1 내지 10:1이다. 화학식 X-5의 화합물이 4-니트로스티렌과 반응할 수 있는 하나 이상의 염기를 갖는 경우, 스캐빈저의 양은 예를 들어 최대 50:1(또는 그 이상)의 화학식 X-5의 화합물의 NPE 기(들)까지로 추가로 증가될 수 있다.
화학식 X-5의 화학식 X-6으로의 전환은 전형적으로 하나 이상의 용매를 사용하는 것을 포함한다. 다양한 용매가 적합하다. 비제한적인 유용한 용매는 본원에 기재된 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 용매는 DMF, DMA, DMI, NMP 등과 같은 비양성자성 극성 용매일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 용매는 NMP일 수 있다.
일부 구현예에서, 알칼리성 시약 및 스캐빈저의 혼합물에 화학식 X-5의 화합물을 첨가하는 것은 올리고뉴클레오티드에 대한 NPE 부가물의 양이 최소화되도록, 예를 들어 10% 미만, 예컨대 5% 미만이 되도록 제어될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 화학식 X-6의 화합물을 NH3로 처리하여 화학식 X-6에서 보호기를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R11은 C1- 6알킬-C(=O)-이고, NH3로 처리시, R11 기가 제거되어 탈보호된 염기 G를 제공한다.
화학식 X-5의 화합물은 본 개시내용에 비추어 통상의 기술자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 화학식 X-5의 화합물은 예를 들어 NH3로 화학식 X-7의 올리고뉴클레오티드로부터 고체 지지체를 절단하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:
Figure pct00011
,
상기 식에서
SS는 폴리스티렌 고체 지지체와 같은 고체상 지지체이고,
L1은 링커, 예컨대 사르코신(sarcosine) 기반 링커, 예를 들어
Figure pct00012
이고, 여기서 질소 말단은 인(phosphorous) 원자에 연결되고 카르보닐 말단은 고체 지지체와 아미드 결합을 형성하고;
화학식 X-7에서 m1, m2 및 R11은 화학식 X-5에서 대응하는 기와 동일하며,
Base(염기)는 각 경우에 독립적으로 G(구아닌), C(시토신), A(아데닌), U(우라실) 및 T(티민), 이들의 유사체, 및 이들의 보호된 유도체로부터 선택되는 염기이며, 단 화학식 X-7에서 Base가 보호된 염기인 경우, 화학식 X-5에서 상응하는 Base는 동일한 보호된 염기이거나 상응하는 부분적으로 또는 완전히 탈보호된 염기일 수 있으며;
T2는 적합한 3' 말단기, 예를 들어 수소 또는 보호기(예를 들어, 아실기, 트리틸)이다.
일부 구현예에서, SS는 -CH2-NH2 그룹을 갖는 폴리스티렌 고체 지지체와 같은 고체 지지체이고, 다르게는 SS-CH2-NH2로 지칭된다.
일부 구현예에서, L1은 사르코신계 기반 링커, 예를 들어,
Figure pct00013
,
Figure pct00014
,
Figure pct00015
,
Figure pct00016
, 또는
Figure pct00017
이고, 여기서 질소 말단은 인 원자에 연결되고 카르보닐 말단은 고체 지지체와 아미드 결합을 형성한다.
일부 구현예에서, 화학식 X-7에서 Base는 다음으로부터 독립적으로 선택될 수 있다:
Figure pct00018
일부 구현예에서, 화학식 X-7에서 T2는 수소일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 X-7에서 T2는 트리틸 또는 메톡시 치환된 트리틸 기(예를 들어, MMT, DMT 등)일 수 있다.
일부 구현예에서, 화학식 X-7에서 T2는 아실기(예를 들어, 아세틸)일 수 있다.
화학식 X-7의 화합물은 본 개시내용에 비추어 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 절차가 또한 본 명세서의 실시예 섹션에 기재되어 있다.
화학식 X-5의 화합물을 화학식 X-6으로 전환시키는 예시적인 절차가 본원에 기재되어 있으며, 이로부터 통상의 기술자는 본 개시내용의 구현예에 쉽게 적응할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 화학식 X-5, X-6 또는 X-7의 화합물이 또한 본 개시내용의 신규 조성물임을 주목해야 한다. 추가로, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 임의의 올리고뉴클레오티드는 또한 본 개시내용의 신규 조성물이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
추가 측면에서, 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머로부터 4-니트로페네틸(NPE) 기를 탈보호하는 방법이 제공되며, 이는 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 알칼리성 시약 및 스캐빈저 예컨대 1,3-디카르보닐 모이어티를 갖는 것의 존재 하에 처리하는 것을 포함한다. PMO는 바람직하게는 표적 핵산에 대한 서열-특이적 결합을 위한 표적화 염기 서열을 포함한다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 방법은 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 알칼리성 시약 및 스캐빈저의 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머는 예를 들어 본 개시내용에 기재된 바와 같은 화학식 X-5의 화합물이다.
NPE 기를 탈보호하기 위한 알칼리성 시약은 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 그러한 알칼리성 시약은 예를 들어 PMO 백본에 대한 상당한 반응성을 갖지 않는다. 알칼리성 시약은 전형적으로 보호된 구아닌과 같은 보호된 염기로부터 NPE 기를 제거하기에 적합한 pKa를 갖는다. 본 개시내용에서, 알칼리성 시약은 유기 알칼리성 시약, 예를 들어 수중 pKa가 약 9 이상, 예컨대 약 9-15, 약 10-14, 약 12, 약 13, 또는 약 14인 염기성 유기 아민일 수 있다. 일부 구현예에서, 알칼리성 시약은 염기성 사이클릭 아민, 예컨대 DBU(1,8-디아자바이사이클로[5,4,0]운덱-7-엔), DBN(1,5-디아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔), DABCO(1,4-디아자바이사이클로[2.2.2]옥탄) 또는 이들의 혼합물, 예를 들어 DBU이다.
본원의 방법에 사용되는 스캐빈저는 NPE 기(들)의 탈보호로부터 생성된 4-니트로스티렌과 반응할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐빈저는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 -SH 기 또는 1,3-디카르보닐 모이어티를 가질 수 있다(예를 들어, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 화학식 X-4의 화합물). 본 개시내용의 일부 바람직한 구현예에서, 스캐빈저는 1,3-디카르보닐 화합물, 예컨대 티민, 디에틸 말로네이트 또는 이들의 혼합물, 예를 들어 티민일 수 있다.
일 구현예에서, 알칼리성 시약 대 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 NPE 기(들)의 몰비는 1:1 초과, 예컨대 1:1-10:1, 1.2-10:1 또는 1.5:1-10:1일 수 있다. 일 구현예에서, 알칼리성 시약의 양은 NPE 기(들)에 비해 과잉이다.
일 구현예에서, 스캐빈저는 전형적으로 또한 과잉으로 사용된다. 예를 들어, 스캐빈저 대 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 NPE 기(들)의 몰비는 전형적으로 1:1 초과, 예컨대 1.2:1, 1.5:1, 2:1, 5:1, 10:1, 또는 언급된 값 사이의 임의의 범위, 예컨대 1:1 내지 10:1이다. 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머가 4-니트로스티렌과 반응할 수 있는 하나 이상의 염기를 갖는 경우, 스캐빈저의 양은 예를 들어 최대 50:1(또는 그 이상)의 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 NPE 기(들)까지로 추가로 증가될 수 있다.
본 개시내용에서, NPE 기를 탈보호하는 공정은 용매 존재 하에서 수행될 수 있다. 용매는 NPE 기를 탈보호하기 위해 당업계에서 사용되는 임의의 용매일 수 있다. 본 개시내용에서, 용매는 DMF, DMA, DMI, NMP 등과 같은 극성 비양성자성 용매 중에서 선택될 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머로부터 NPE 기를 탈보호하는 방법은 제1 용매 중 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 혼합물을 제2 용매 중 알칼리성 시약 및 스캐빈저의 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 제1 및 제2 용매는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 용매는 DMF, DMA, DMI, NMP 등과 같은 극성 비양성자성 용매로부터 선택될 수 있다. 제1 용매 중의 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 혼합물에서, 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 농도는 0.001 M 내지 0.1 M, 예컨대 0.01 M 내지 0.02 M일 수 있다. 제2 용매 중 알칼리성 시약 및 스캐빈저의 혼합물에서, 알칼리성 시약의 농도는 0.1 M 내지 5 M, 예컨대 0.5 M 내지 1.0 M일 수 있고; 스캐빈저의 농도는 0.1 M 내지 5 M, 예컨대 0.5 M-1.5 M, 예를 들어 0.8 M일 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머로부터 NPE 기를 탈보호하는 방법은 제1 용매 중 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 혼합물을 제2 용매 중 알칼리성 시약 및 스캐빈저의 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 제1 및 제2 용매는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 용매는 DMF, DMA, DMI, NMP 등과 같은 극성 비양성자성 용매로부터 선택될 수 있다. 제1 용매 중의 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 혼합물에서, 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 농도는 0.001 M 내지 0.1 M, 예컨대 0.01 M 내지 0.02 M일 수 있다. 제2 용매 중 알칼리성 시약 및 스캐빈저의 혼합물에서, 알칼리성 시약의 농도는 0.1 M 내지 5 M, 예컨대 0.5 M 내지 1.0 M일 수 있고; 스캐빈저의 농도는 0.1 M 내지 5 M, 예컨대 0.5 M-1.5 M, 예를 들어 0.8 M일 수 있다. 일 구현예에서, 첨가 속도는 1-10 mL/분, 예를 들어 2 mL/분, 3 mL/분, 4 mL/분, 5 mL/분, 6 mL/분, 7 mL/분, 8 mL/분 또는 9 mL/분일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 상기 기재된 바와 같은 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머로부터 NPE 기(들)을 탈보호하는 공정을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 제조하는 방법을 제공한다.
본원에서 올리고머의 합성은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 지지체-매체(support-medium) 상에서 수행된다. 일반적으로 첫 번째 신톤(synthon)(예를 들어, 모르폴리노 서브유닛과 같은 모노머)이 먼저 지지체-매체에 부착된 다음, 지지체-결합된 신톤에 서브유닛을 순차적으로 커플링하여 올리고머가 합성된다. 이 반복적인 연신은 결국 최종 올리고머 화합물을 생성한다. 적합한 지지체-매체는 용해성 또는 불용성일 수 있으며, 성장하는 지지체-결합된 폴리머가 원하는 대로 용액 내 또는 외적으로 존재할 수 있도록 다양한 용매에서 다양한 용해도를 가질 수 있다. 전통적인 지지체-매체는 대부분 불용성이며 반응 용기에 일상적으로 배치되고 동시에 올리고머가 목표 길이에 도달할 때까지 시약 및 용매가 성장 사슬과 반응 및/또는 세척하고, 그 후에 그것은 지지체로부터 절단되고; 필요한 경우 최종 폴리머 화합물을 생산하기 위해 추가 작업이 수행된다. 보다 최근의 접근법은 용해성 폴리머 지지체를 포함하는 용해성 지지체를 도입하여 합성의 원하는 지점에서 반복적으로 합성된 생성물을 침전 및 용해할 수 있도록 하였다.
특정 구현예에서, 모르폴리노는 올리고머의 5' 또는 3' 말단에서 "꼬리" 모이어티와 접합되어 그의 안정성 및/또는 용해도를 증가시킨다. 예시적인 꼬리는 짧은 펩티드, 임의로 치환된 알킬아미노 기, 임의로 치환된 헤테로사이클릭 기 등, 아실기, 트리틸 등을 포함한다. 일 구현예에서, 적합한 5' 말단 그룹은 예를 들어 짧은 펩티드, 임의로 치환된 알킬아미노 기, 임의로 치환된 헤테로사이클릭 기 등(예를 들어, -C(O)NH2) 치환된 알킬 아민, 예를 들어,
Figure pct00019
)이다. 또 다른 구현예에서, 적합한 3' 말단 그룹은 예를 들어 수소 또는 보호기(예를 들어, 아실기, 트리틸 등)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 보호되지 않은 고리 질소를 갖는 고상-지지된 모르폴리노 서브유닛을, 보호된 고리 질소 및 5'-외환(exocyclic) 탄소 상에 활성화된 포스포르아미데이트(phosphoramidate) 기를 갖는 염기-보호된 모르폴리노 서브유닛 모노머와 반응시키는 단계,
이로써 5'-외환 탄소와 보호되지 않은 질소 사이에 포스포로디아미데이트 연결을 형성하고;
(b) 보호된 질소를 탈보호하여 보호되지 않은 질소를 형성하는 단계;
(c) 추가의 염기-보호된 모르폴리노 서브유닛 모노머로 단계 (a) 및 (b)를 1회 이상 반복하여 염기-보호된 모르폴리노 변형된 고체 지지체를 수득하는 단계; 및
(d) 절단 및 탈보호의 3단계를 수행하여 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 수득하는 단계; 절단 및 탈보호의 3단계는 상기 기재한 바와 같이 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머로부터 NPE 기를 탈보호하는 공정을 포함하고;
여기서 염기-보호된 모르폴리노 서브유닛 모노머 중 적어도 하나는 구조 (M)을 갖는 보호된 구아닌 모르폴리노 화합물이고:
Figure pct00020
R1은 클로로포스포르아미데이트기이고;
R2는 저급 알킬, 모노사이클릭 아릴메틸 또는 모노사이클릭 (아릴옥시)메틸이고;
R3은 트리아릴메틸이다.
모르폴리노 고리 질소에 대한 트리아릴메틸 보호기(R3)의 예는 트리페닐메틸(트리틸), 4-메틸트리틸, 4,4'-디메틸트리틸, 4,4',4''-트리메틸트리틸, 모노메톡시트리틸(예: 4-메톡시트리틸) 또는 디메톡시트리틸(예: 4,4'-디메톡시트리틸)일 수 있다.
R1은 -O-P(=O)-N(CH3)2Cl일 수 있다.
R2는 벤질 또는 -CH(CH3)2일 수 있다.
일 측면에서, 화합물 (E)를 탈블로킹제(deblocking agent)와 접촉시켜 화학식 (II)의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 화학식 (II)의 화합물을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다;
Figure pct00021
상기 식에서 SS는 지지체-매체이고, Z1은
Figure pct00022
이고, 산소 말단은 사르코신 단위에 연결되고, m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, R4는 Tr(트리페닐메틸) 또는 그의 유도체, 예컨대 Tr(트리페닐메틸), MMTr(p-메톡시페닐디페닐메틸) 또는 DMTr(디-(p-메톡시페닐)페닐메틸)이다. 바람직한 구현예에서, m은 3이고, R4는 Tr(트리페닐메틸)이다.
일 구현예에서, 화학식 (II)의 화합물을 제조하는 방법은 탈블로킹된 화합물을 중화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 화학식 (II)의 화합물을 화학식 (G)의 화합물과 커플링시켜 화학식 (III)의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 화학식 (III)의 화합물을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다;
Figure pct00023
Base는 PC, T, PA, P5mC, U, I, PG, DPG 또는 NPEG와 같은 임의로 보호된 핵산 염기; G(구아닌), C(시토신), A(아데닌), U(우라실) 및 T(티민), 이들의 변형된 유사체, 및 이들의 보호된 유도체로부터 선택되며, 예를 들어 임의로 보호된 핵산 염기, 예컨대 PC, T, PA, P5mC, U, I, PG, DPG 또는 NPEG이고;
Figure pct00024
SS, Z1, R1, R2 및 R3의 정의는 본 개시내용에 기재된 바와 같다.
일 구현예에서, 화학식 (III)의 화합물을 제조하는 방법은 화학식 (II)의 화합물을 캡핑제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 화학식 (II)의 화합물은 상기 정의된 바와 같은 방법으로부터 수득된다.
또 다른 측면에서, 다음의 순차적인 단계를 포함하는 화학식 (IV)의 화합물을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다:
(i) 화학식 (II)의 화합물을 화학식 (G)의 화합물과 커플링시켜 화학식 (III)의 화합물을 수득하는 단계;
(ii) 하기의 순차적인 단계의 n-1 반복을 수행하는 단계:
(ii-1) 직전 단계에서 수득한 생성물을 탈블로킹제와 접촉시키는 단계; 및
(ii-2) 직전 단계에서 수득한 화합물을 화학식 (G)의 화합물과 커플링시켜 화학식 (IV)의 화합물을 형성하는 단계;
Figure pct00025
;
임의로 염기 중 적어도 하나는 NPEG이고;
Figure pct00026
상기 식에서 SS, Z1, R1, R2 및 R3의 정의는 본 개시내용에 기재된 바와 같고; n은 10 내지 40의 정수이고, 예를 들어 n은 20 내지 30의 정수, 예컨대 25이고;
Base는 각 경우에 독립적으로 PC, T, PA, P5mC, U, I, PG, DPG 또는 NPEG와 같은 임의로 보호된 핵산 염기; G(구아닌), C(시토신), A(아데닌), U(우라실) 및 T(티민), 이들의 변형된 유사체, 및 이들의 보호된 유도체로부터 선택되는 염기이고, 예를 들어 임의로 보호된 핵산 염기, 예컨대 PC, T, PA, P5mC, U, I, PG, DPG 또는 NPEG이다.
일 구현예에서, 단계 (ii-1)은 탈블로킹된 화합물을 중화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 단계 (ii-2)는 직전 단계에서 수득한 화합물을 캡핑제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 화학식 (IV)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 화학식 (V)의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 화학식 (V)의 화합물을 제조하는 방법이 본원에서 제공된다;
Figure pct00027
상기 식에서 SS, Z1, Base, R3 및 n의 정의는 본 개시내용에 기재된 바와 같다.
일 구현예에서, 화학식 (V)의 화합물을 제조하는 방법은 탈블로킹된 화합물을 중화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 화학식 (V)의 화합물을 절단제(cleaving agent)와 접촉시켜 화학식 (VI)의 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 화학식 (VI)의 화합물을 제조하는 방법이 제공된다;
Figure pct00028
상기 식에서 SS, Z1, Base, R3 및 n의 정의는 본 개시내용에 기재된 바와 같다.
또 다른 측면에서, 다음을 포함하는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 제조하는 방법이 본원에서 제공된다:
(a) 화학식 (VI)의 화합물을 탈보호제와 접촉시키는 단계; 및
(b) 임의로, 직전 단계에서 수득한 화합물에 대해 아미노분해(aminolysis) 반응을 수행하여 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 수득하는 단계;
Figure pct00029
상기 식에서 Base 및 n의 정의는 본 개시내용에 기재된 바와 같다.
일 구현예에서, 각각의 공정(단계)은 적어도 하나의 용매의 존재하에 수행된다.
또 다른 구현예에서, 중화제는 디클로로메탄 및 이소프로필 알코올을 포함하는 용액에 존재한다.
또 다른 구현예에서, 중화제는 모노알킬, 디알킬, 또는 트리알킬 아민이다.
또 다른 구현예에서, 중화제는 N,N-디이소프로필에틸아민이다.
바람직한 구현예에서, 각 공정(단계)에서 사용되는 중화제는 25% 이소프로판올/디클로로메탄 중 5% 디이소프로필에틸아민이다.
또 다른 구현예에서, 화학식 (G)의 화합물은 에틸모르폴린 및 디메틸이미다졸리디논을 포함하는 용액에 존재한다.
추가 구현예에서, 화학식 (G)의 화합물은 PMO-NPEG 모노머, PMO-PA 모노머, PMO-PC 모노머 및 PMO-T 모노머로부터 선택된다;
Figure pct00030
.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 당업계에 공지된 연속 흐름 모드 또는 불연속 흐름 모드에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 맞춤형 펩티드 배치 반응기에서 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 화합물 (D)를 화합물 (S)와 접촉시켜 화합물 (E)를 수득하는 단계를 포함하는, 화합물 (E)의 제조 방법이 제공된다;
Figure pct00031
상기 식에서 SS, Z1 및 R4의 정의는 본 개시내용에서 정의된 바와 같다.
화합물 (E)의 제조 방법에서, 화합물 (S)는 사용 전에 활성화될 필요가 있을 수 있으며, 여기서 화합물 (S)의 활성화는 다음 단계를 포함할 수 있다: 화합물 (S)를 용매에 현탁시키고 팽윤시킨 다음, 용매를 제거하는 단계 및 염소화 탄화수소 용매 및 용매 중의 염기의 혼합물로 연속적으로 세척하는 단계.
화합물 (S)의 활성화에서, 화합물 (S)를 현탁시키기 위한 용매는 알카논 용매, 예를 들어 NMP와 같은 극성 비양성자성 용매로부터 선택될 수 있다. 용매의 양은 특별히 제한되지 않을 수 있다. 용매 대 화합물 (S)의 부피-질량비는 10 mL/g-30 mL/g일 수 있다. 용매를 제거하기 위한 조작은 여과일 수 있다. 염소화 탄화수소 용매는 DCM일 수 있다. 혼합물 중의 염기는 DIPEA와 같은 유기 염기일 수 있다. 혼합물 중의 용매는 알코올 용매(예: IPA), 염소화 탄화수소 용매(예: DCM) 또는 이들의 조합, 보다 바람직하게는 알코올 용매와 염소화 탄화수소 용매의 조합일 수 있다(예: IPA와 DCM의 조합, 부피 비율은 1:1-1:5, 예를 들어 1:3일 수 있다). 혼합물에서, 염기의 질량 백분율은 1%-10%, 예를 들어 5%일 수 있으며, %는 혼합물의 총 질량에서 염기의 질량을 나타낸다.
화합물 (E)의 제조 방법은 용매 중에서 수행될 수 있다. 용매는 극성 비양성자성 용매, 예컨대 알카논 용매, 아미드 용매 또는 이들의 혼합물, 예를 들어 NMP, DMI, DMF 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 용매의 양은 특별히 제한되지 않을 수 있다. 용매 대 화합물 (S)의 부피-질량비는 10 mL/g-30 mL/g일 수 있다.
화합물 (E)의 제조 방법에서, 화합물 (D)와 화합물 (S)의 몰비는 1:1-1:3일 수 있다.
화합물 (E)의 제조 방법에서, 반응 온도는 20-50℃, 예컨대 40-45℃일 수 있다. 반응의 진행은 당업계의 통상적인 검출 방법(예컨대 TLC, HPLC, GC 또는 NMR)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 화합물 (D)의 소멸은 일반적으로 반응의 완료로 간주된다. 그리고 반응 시간은 24-48시간이 될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 화합물 (E)의 제조 방법은 바람직하게는 용매 중 화합물 (D)의 용액을 용매 중 화합물 (S)의 현탁액에 첨가하여 반응을 수행하는 것을 포함한다.
화합물 (E)의 제조 방법에서, 후처리는 당업계에서 이러한 반응에 대한 통상적인 후처리일 수 있다. 본 개시내용에서, 후처리는 바람직하게는 생성된 혼합물을 여과한 다음 필터 케이크를 용매(예컨대 알카논 용매, 염소화 탄화수소 용매 또는 이들의 조합; 알카논 용매는 NMP일 수 있음; 염소화 탄화수소 용매는 DCM일 수 있음; 용매가 알카논 용매와 염소화 탄화수소 용매의 조합인 경우, 이들의 부피비는 1:1-1:10일 수 있음)로 세척하고; 이어서 용매(예컨대 알카논 용매; 예를 들어 NMP; 용매 대 화합물 (S)의 부피-질량비는 50 mL/g-200 mL/g일 수 있음) 중 NEM의 용액(0.2-1.0 M) 및 용매(예컨대 알카논 용매; 예를 들어 NMP; 용매 대 화합물 (S)의 부피-질량비는 50 mL/g-200 mL/g일 수 있음) 중 Bz2O의 용액(0.2-1.0 M)을 연속적으로 첨가하고, 및 캡핑 반응을 수행하고, 캡핑 반응이 완료된 후, 수득된 혼합물을 여과하고 용매(예컨대 염소화 탄화수소 용매, 예를 들어 DCM; 용매 대 화합물 (S)의 부피-질량비는 100 mL/g-300 mL/g일 수 있음)로 세척한 후 건조하여 화합물 (E)를 수득하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 바람직한 구현예에서, 화합물 (S)는 Xi'an Lanxiao Technology Co., Ltd.에서 판매하는 아미노메틸 폴리스티렌 수지이다.
본 개시내용의 바람직한 구현예에서, 화합물 (E)의 제조 방법은 화합물 (D)의 제조 방법을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 용매 중에서, 촉매, 염기 및 축합제의 존재 하에 화합물 (C)를 화합물 (SM4)와 접촉시켜 화합물 (D)를 수득하는 단계를 포함한다;
Figure pct00032
상기 식에서 Z1 및 R4의 정의는 본 개시내용에서 정의된 바와 같다.
화합물 (D)의 제조 방법에서, 촉매는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 촉매이다. 본 개시내용에서, 촉매는 DMAP일 수 있다. 촉매 대 화합물 (C)의 몰비는 0.01:1-0.5:1, 예컨대 0.33:1일 수 있다.
화합물 (D)의 제조 방법에서, 염기는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 염기이다. 본 개시내용에서, 염기는 유기 아민, 예를 들어 DIPEA와 같은 유기 염기일 수 있다. 염기의 양은 당업계에서 이러한 반응에 대한 통상적인 양이다. 본 개시내용에서, 염기 대 화합물 (C)의 몰비는 1:-3:1, 예컨대 2.5:1일 수 있다.
화합물 (D)의 제조 방법에서, 축합제는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 축합제이다. 본 개시내용에서, 축합제는 EDCI, DCC, DIC 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 축합제의 양은 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 양이다. 본 개시내용에서, 축합제 대 화합물 (C)의 몰비는 1:1-2:1, 예를 들어 1.1:1일 수 있다.
화합물 (D)의 제조 방법에서, 화합물 (C)와 화합물 (SM4)의 몰비는 1:1-1:2, 예컨대 1:1.02일 수 있다.
화합물 (D)의 제조 방법에서, 용매는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 용매이다. 본 개시내용에서, 용매는 DCM과 같은 염소화 탄화수소 용매일 수 있다. 용매 대 화합물 (C)의 부피-질량비는 10 mL/g-20 mL/g, 예컨대 10 mL/g일 수 있다.
화합물 (D)의 제조 방법에서, 반응 온도는 20-30℃일 수 있다. 반응의 진행은 당업계의 통상적인 검출 방법(예컨대 TLC, HPLC, GC 또는 NMR)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 화합물 (C)의 소멸은 일반적으로 반응의 완료로 간주된다.
바람직한 구현예에서, 화합물 (D)의 제조 방법은 화합물 (SM4), 촉매, 염기 및 축합제를 용매 중의 화합물 (C)의 용액에 첨가하여 반응을 수행하는 것을 포함한다.
화합물 (D)의 제조 방법에서, 후처리는 당업계에서 이러한 반응에 대한 통상적인 후처리일 수 있다. 본 개시내용에서, 후처리는 바람직하게는 반응 혼합물을 시트르산(예를 들어, 10% 시트르산 용액) 및 염수로 연속적으로 세척하고, 유기층을 농축 건조시켜 화합물 (D)을 수득하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 바람직한 구현예에서, 화합물 (E)의 제조 방법은 화합물 (C)의 제조 방법을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 화합물 (B)와 화합물 (SM3)을 용매 중에서 접촉시켜 화합물 (C)를 수득하는 단계를 포함한다;
Figure pct00033
상기 식에서 m은 1 내지 5의 정수이고, R4의 정의는 본 개시내용에서 정의된 바와 같다.
화합물 (C)의 제조 방법에서, 화합물 (B) 대 화합물 (SM3)의 몰비는 1:1-1:2, 예컨대 1:2일 수 있다.
화합물 (C)의 제조 방법에서, 용매는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 용매일 수 있다. 본 개시내용에서, 용매는 THF와 같은 에테르 용매일 수 있다. 용매 대 화합물 (B)의 부피-질량비는 10-20 mL/g, 예컨대 10 mL/g일 수 있다.
화합물 (C)의 제조 방법에서, 반응 온도는 20-55℃일 수 있다. 반응의 진행은 당업계의 통상적인 검출 방법(예컨대 TLC, HPLC, GC 또는 NMR)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 화합물 (B)의 소멸은 일반적으로 반응의 완료로 간주된다.
바람직한 구현예에서, 화합물 (C)의 제조 방법은 바람직하게는 화합물 (SM3)을 용매 중의 화합물 (B)의 용액에 첨가하여 반응을 수행하는 것을 포함한다.
화합물 (C)의 제조 방법에서, 후처리는 당업계에서 이러한 반응에 대한 통상적인 후처리일 수 있다. 본 개시내용에서, 후처리는 반응 혼합물의 pH를 NaHCO3 수용액(예: 10% NaHCO3 수용액)으로 약 8.5로 조정한 다음, 에테르 용매(예: MTBE)를 첨가하고, 생성된 수성층의 pH를 시트르산 용액(20% 시트르산 용액)으로 3-5로 조정한 다음, 염소화 탄화수소 용매(예: DCM)로 추출하고 Na2SO4 수용액(예: 10% Na2SO4 수용액)으로 세척하고, 생성된 유기층을 농축하여 화합물 (C)를 수득하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 바람직한 구현예에서, 화합물 (E)의 제조 방법은 화합물 (B)의 제조 방법을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 용매 중에서, 염기의 존재 하에 화합물 (A)를 화합물 (SM2)와 접촉시켜 화합물 (B)를 수득하는 단계를 포함한다;
Figure pct00034
상기 식에서 m은 1 내지 5의 정수이고, R4의 정의는 본 개시내용에서 정의된 바와 같다.
화합물 (B)의 제조 방법에서, 염기는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 염기이다. 본 개시내용에서, 염기는 NaH와 같은 금속 수소화물일 수 있다. 염기 대 화합물 (SM2)의 몰비는 0.01:1-1:1, 예컨대 0.01:1일 수 있다.
화합물 (B)의 제조 방법에서, 화합물 (A) 대 화합물 (SM2)의 몰비는 1:5-1:20, 예컨대 1:10일 수 있다.
화합물 (B)의 제조 방법에서, 용매는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 용매일 수 있다. 본 개시내용에서, 용매는 알카논 용매; 예를 들어, NMP일 수 있다. 용매의 양은 특별히 제한되지 않을 수 있다. 용매 대 화합물 (A)의 부피-질량비는 15 mL/g-25 mL/g, 예컨대 20 mL/g일 수 있다.
화합물 (B)의 제조 방법에서, 반응 온도는 20-30℃일 수 있다. 반응의 진행은 당업계의 통상적인 검출 방법(예컨대 TLC, HPLC, GC 또는 NMR)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 화합물 (A)의 소멸은 일반적으로 반응의 완료로 간주된다.
바람직한 구현예에서, 화합물 (B)의 제조 방법은 바람직하게는 교반 하에 용매 중 화합물 (SM2)의 용액에 염기를 첨가한 다음, 화합물 (A)를 첨가하여 반응을 수행하는 것을 포함하며, 보다 바람직하게는 20-30℃에서 용매 중 화합물 (SM2)의 용액에 염기를 첨가한 다음, 수득한 혼합물을 20-30℃에서 10~30분 동안 교반한 후, 화합물 (A)를 첨가하여 반응을 수행하는 것을 포함한다.
화합물 (B)의 제조 방법에서, 후처리는 당업계에서 이러한 반응에 대한 통상적인 후처리일 수 있다. 본 개시내용에서, 후처리는 물과 추출용 유기용매(예를 들어, 염소화 탄화수소 용매, 에테르 용매 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 DCM과 MTBE의 혼합 용매)를 반응 혼합물에 첨가한 후, 수득한 유기층을 염수로 세척하고, 생성된 유기층을 농축 및 정제(예를 들면, 실리카 겔 컬럼)하여 화합물 (B)를 수득하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 바람직한 구현예에서, 화합물 (E)의 제조 방법은 화합물 (A)의 제조 방법을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 용매 중에서, 화합물 (SM1)을 염기의 존재 하에 R4Cl과 접촉시켜 화합물 (A)를 수득하는 단계를 포함한다;
Figure pct00035
상기 식에서 R4는 본 개시내용에서 정의된 바와 같다.
화합물 (A)의 제조 방법에서, 염기는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 염기이다. 본 개시내용에서, 염기는 유기 염기, 예컨대 유기 아민, 예를 들어 DIPEA일 수 있다. 염기의 양은 당업계에서 이러한 반응에 대한 통상적인 양이다. 본 개시내용에서, 염기 대 R4Cl의 몰비는 1:1-3:1, 예컨대 1.5:1일 수 있다.
화합물 (A)의 제조 방법에서, 화합물 (SM1) 대 R4Cl의 몰비는 1:1-1:3, 예컨대 1:2일 수 있다.
화합물 (A)의 제조 방법에서, 용매는 당업계에서 이러한 반응을 위한 통상적인 용매이다. 본 개시내용에서, 용매는 아미드계 용매, 예컨대 아미드 용매, 알카논 용매, 염소화 탄화수소 용매 또는 이들의 혼합물, 예를 들어 DMF, DCM, NMP 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 용매의 양은 특별히 제한되지 않을 수 있다. 본 개시내용에서, 용매 대 화합물 (SM1)의 부피-질량비는 10 mL/g-30 mL/g, 예컨대 10 mL/g일 수 있다.
화합물 (A)의 제조 방법에서, 반응 온도는 20-25℃일 수 있다. 반응의 진행은 당업계의 통상적인 검출 방법(예컨대 TLC, HPLC, GC 또는 NMR)을 사용하여 모니터링할 수 있다. 화합물 (SM1)의 소멸은 일반적으로 반응의 완료로 간주된다.
바람직한 구현예에서, 화합물 (A)의 제조 방법은 바람직하게는 용매 중의 화합물 (SM1)의 용액에 염기 및 R4Cl을 연속적으로 첨가하여 반응을 수행하는 것을 포함한다.
화합물 (A)의 제조 방법에서, 후처리는 당업계에서 이러한 반응에 대한 통상적인 후처리일 수 있다. 본 개시내용에서, 후처리는 물과 추출용 유기용매(예를 들어, 에스테르 용매, 바람직하게는 EtOAc)를 반응 혼합물에 첨가한 후, 수득한 유기층을 NaCl 수용액(예를 들어, 20% NaCl 수용액)으로 세척하고, 생성된 유기층을 농축 및 정제(예를 들어, 실리카 겔 컬럼)하여 화합물 (A)를 수득하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 화합물 (E)가 제공된다:
Figure pct00036
상기 식에서 Z1은
Figure pct00037
이고, 산소 말단이 사르코신 단위에 연결되고, m은 1, 2, 3, 4 또는 5이고, SS 및 R4의 정의는 본 개시내용에서 정의된 바와 같다.
추가의 측면에서, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)와 같은 올리고뉴클레오티드의 제조에서 본 개시내용에 기재된 바와 같은 화합물 (E)의 용도가 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, NPE 보호된 구아닌 모노머 단위를 사용하여 올리고뉴클레오티드가 고수율 및 순도로 제조될 수 있음이 발견되었다. 또한 고체 지지체에 결합되어 있지 않은 올리고뉴클레오티드로부터의 NPE 그룹의 탈보호가 NPE 부가물(불순물)을 최소화하면서 고효율로 수행될 수 있음이 발견되었다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
구현예가 본원에서 "포함하는"이라는 언어로 기재될 때마다 "함유하는" "구성되는" 및/또는 "필수적으로 구성되는"의 용어로 기재되는 유사한 구현예가 또한 제공된다는 것이 이해된다. 그러나, 특허청구범위에서 전환 문구(transitional phrase)로 사용되는 경우, 각각은 개별적으로 그리고 적절한 법적 및 사실적 맥락에서 해석되어야 한다(예를 들어, 청구항에서, 전환 문구 "포함하는"은 개방형 문구로 간주되는 반면 "구성되는"은 보다 배타적이고, "필수적으로 구성되는"은 중간 지점을 달성한다).
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 명시적으로 언급되지 않는 한 또는 문맥상 그러한 의도가 없다는 것이 명확하지 않은 한 복수 참조를 포함한다.
제목 및 소제목은 편의 및/또는 공식 준수를 위해서만 사용되며, 대상 기술을 제한하지 않으며, 대상 기술의 설명의 해석과 관련하여 참조되지 않는다. 본 개시내용의 하나의 제목 또는 하나의 소제목 하에 설명된 특징은 다양한 구현예에서 다른 제목 또는 소제목 하에 설명된 특징과 결합될 수 있다. 또한 단일 제목 또는 단일 소제목 하에 모든 특징이 구현예에서 반드시 함께 사용되는 것은 아니다.
값의 범위가 나열되는 경우, 범위 내의 각 값과 하위 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어 "C1-6"은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C1-5, C1-4, C1-3, C1-2, C2-6, C2-5, C2-4, C2-3, C3-6, C3-5, C3-4, C4-6, C4-5, 및 C5-6을 포함하는 것으로 의도된다.
"모르폴리노 올리고머"는 전형적인 폴리뉴클레오티드에 수소 결합할 수 있는 염기를 지지하는 백본을 갖는 폴리머 분자를 지칭하며, 여기서 폴리머는 오탄당(pentose) 당 백본 모이어티, 보다 구체적으로는 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 전형적인 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 리보스 백본이 결여되어 있고, 그러나 대신에 고리 질소를 통한 커플링과 함께 고리 질소를 포함한다. 바람직한 모르폴리노 올리고머는 하기에 나타낸 바와 같은 "모르폴리노 서브유닛" 구조로 구성되며, 이는 올리고머에서 바람직하게는 (티오)포스포로디아미데이트 결합에 의해 함께 연결되어, 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접한 서브유닛의 5' 외환 탄소에 결합시킨다. 각각의 서브유닛은 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 모이어티인 Base를 포함하는데, 이는 염기-특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드의 염기에 결합하는 데 효과적이다.
Figure pct00038
"포스포로디아미데이트" 기는 2개의 부착된 산소 원자 및 2개의 부착된 질소 원자를 갖는 인을 포함하고, 본원에서는 또한 1개의 부착된 산소 원자 및 3개의 부착된 질소 원자를 갖는 인을 지칭할 수 있다. 본원에 기재된 올리고머의 서브유닛간 결합에서, 하나의 질소는 전형적으로 백본 사슬에 매달려(pendant) 있고, 두 번째 질소는 모르폴리노 고리 구조의 고리 질소이다: 하기 화학식 (a1)에 나타난 바와 같음. 대안적으로 또는 추가로, 하기 화학식 (b1) 및 (c1)에 나타난 바와 같이 5'-외환 탄소에 질소가 존재할 수 있다.
Figure pct00039
Base1과 Base2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 이에 대한 정의는 본 개시내용에 기재된 base와 동일하다.
티오포스포로디아미데이트 결합에서, 하나의 산소 원자, 전형적으로 본원에 기재된 올리고머의 백본에 매달려 있는 산소는 황으로 대체된다.
바람직한 구현예에서, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머는 하기 일반 구조의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 지칭한다:
Figure pct00040
.
"고상-지지된 모르폴리노 서브유닛"은 본원에 기재된 바와 같이 고상 단계적 합성에 의해 모르폴리노 올리고머에 혼입된 첫 번째 또는 임의의 후속 모르폴리노 서브유닛 모노머일 수 있다. 서브유닛은 5' 외환 탄소를 통해 고체 지지체에 부착되거나 또는 고체 지지체에서 성장하는 올리고머 사슬에 부착된다. "염기-보호된"은 단계적 올리고머 합성 동안 염기-쌍 그룹의 반응 또는 간섭을 방지하기에 적합한 보호기로 모르폴리노 서브유닛 상의 염기-쌍 그룹, 예를 들어 퓨린 또는 피리미딘 염기의 보호를 지칭한다.
"활성화된 포스포르아미데이트 기"는 전형적으로 올리고머에서 최종 포스포르아미데이트 결합에서 요구되는 질소 치환을 갖는 클로로포스포르아미데이트 기이다. 예는 (디메틸아미노)클로로포스포르아미데이트, 즉 -O-P(=O)(NMe2)Cl이다.
"염기-보호된" 또는 "염기 보호"는 단계적 올리고머 합성 동안 염기-쌍 그룹의 반응 또는 간섭을 방지하기에 적합한 보호기로 모르폴리노 서브유닛 상의 염기-쌍 그룹, 예를 들어 퓨린 또는 피리미딘 염기의 보호를 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 염기-보호된 모르폴리노 서브유닛 모노머 중 적어도 하나는 구조 (M)을 갖는 보호된 구아닌 모르폴리노 화합물로부터 유도된다:
Figure pct00041
R1, R2 및 R3의 정의는 본 개시내용에 기재된 바와 같다.
"핵산 염기"는 핵산의 합성에 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 시토실기, 우라실기, 티미닐기 등과 같은 피리미딘 염기, 및 아데닐기, 구아닐기 등과 같은 퓨린 염기를 포함한다. "임의로 보호된 핵산 염기"란, 예를 들면, 아미노기를 갖는 핵산 염기인 아데닐기, 구아닐기 또는 시토실기에서 아미노기가 보호될 수 있는 것을 의미하고, 여기서 핵산 염기는 그 안의 아미노기가 모르폴리노 뉴클레오티드의 모르폴린 고리 질소 원자의 탈보호 조건 하에서 지속가능한 보호기에 의해 보호되는 것이 바람직하다. "아미노 보호기"는 특별히 제한되지 않으며, "아미노 보호기"의 구체적인 예로는 피발로일기, 피발로일옥시메틸기, 트리플루오로아세틸기, 페녹시아세틸기, 4-이소프로필페녹시아세틸기, 4-tert- 부틸페녹시아세틸기, 아세틸기, 벤조일기, 이소부티릴기, 디메틸포름아미디닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 등을 포함한다. 또한, 핵산 염기의 카르보닐기는 임의로 보호되며, 예를 들어 페놀, 2,5-디클로로페놀, 3-클로로페놀, 3,5-디클로로페놀, 2-포르밀페놀, 2-나프톨, 4-메톡시페놀, 4-클로로페놀, 2-니트로페놀, 4-니트로페놀, 4-아세틸아미노페놀, 펜타플루오로페놀, 4-피발로일옥시벤질 알코올, 4-니트로페네틸 알코올, 2-(메틸설포닐)에탄올, 2-(페닐설포닐)에탄올, 2-시아노에탄올, 2-(트리메틸실릴)에탄올, 디메틸카르바모일 클로라이드, 디에틸카르바모일 클로라이드, 에틸페닐카르바모일 클로라이드, 1-피롤리딘카르보닐 클로라이드, 4-모르폴린카르보닐 클로라이드, 데페닐카르바모일 클로라이드 등을 반응시켜 보호될 수 있다. 경우에 따라, 카르보닐 보호기는 특별히 도입할 필요가 없다. 또한, 상기 언급된 기에 추가하여, 임의의 위치(들)에서 임의의 1 내지 3개의 치환기(예를 들면, 할로겐 원자, 알킬기, 아르알킬기, 알콕시기, 아실기, 알콕시알킬기, 히드록시기, 아미노기, 모노알킬아미노, 디알킬아미노, 카르복시, 시아노, 니트로 등)로 치환된 핵산 염기인 변형된 핵산 염기(예를 들면, 8-브로모아데닐기, 8-브로모구아닐기, 5-브로모시토실기, 5-요오도시토실기, 5-브로모우라실기, 5-요오도우라실기, 5-플루오로우라실기, 하이포크산티닐기 등)도 "핵산 염기"에 포함된다.
"저급 알킬"은 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 이소아밀, n-펜틸 및 이소펜틸로 예시되는 바와 같은 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬 라디칼을 지칭한다. 선택된 구현예에서, "저급 알킬" 기는 1 내지 4개의 탄소 원자, 또는 1-2개의 탄소 원자를 갖는다; 즉, 메틸 또는 에틸.
용어 "지지체-결합된"은 지지체-매체에 공유적으로 결합된 화학적 엔터티를 지칭한다.
용어 "지지체-매체"는 올리고머가 부착되거나 합성될 수 있거나, 또는 올리고머의 부착 또는 합성을 위해 변형될 수 있는 예를 들어 임의의 입자, 비드 또는 표면을 포함하는 임의의 물질을 지칭한다. 대표적인 물질은 무기 지지체 및 유기 지지체, 예컨대 유리 및 변성 또는 기능화 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, TEFLON 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 세라믹, 수지, 실리콘 및 변성 실리콘을 포함하는 실리카 또는 실리카-기반 물질, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광섬유 다발 및 다양한 기타 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에 특히 유용한 지지체-매체 및 고체 표면은 유동 셀 장치(flow cell apparatus) 내에 위치한다. 본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 지지체-매체는 1% 가교된 디비닐벤젠을 갖는 폴리스티렌을 포함한다. 본원에 기재된 방법의 다른 구현예에서, 지지체-매체는 아미노메틸 폴리스티렌 수지이다(예를 들어, Xi'an Lanxiao Technology Co., Ltd.에서 구입하고, 이의 로딩은 예를 들어 1 mmol/g임).
일부 구현예에서, 대표적인 지지체-매체는 올리고머의 부착 또는 합성을 위한 적어도 하나의 반응성 부위를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 지지체-매체는 올리고머를 부착 또는 합성하기 위해 들어오는(incoming) 서브유닛 또는 다른 활성화된 기와 화학 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 말단 아미노 또는 하이드록실 기를 포함한다.
용어 "유동 셀 장치"는 하나 이상의 유체 시약(예: 액체 또는 기체)이 흐를 수 있는 표면(예: 고체 표면)을 포함하는 챔버를 지칭한다.
용어 "탈블로킹제"는 보호기를 제거하기 위한 화학적 산 또는 화학적 산의 조합을 포함하는 조성물(예: 용액)을 지칭한다. 탈블로킹제에 사용되는 예시적인 화학적 산은 할로겐화 산, 예를 들어 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 플루오로아세트산, 디플루오로아세트산 및 트리플루오로아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 탈블로킹제는 예를 들어 올리고머, 지지체-결합된 올리고머, 지지체-결합된 서브유닛, 또는 다른 보호된 질소 또는 산소 모이어티로부터 하나 이상의 트리틸 그룹을 제거한다. 다른 구현예에서, 각 공정(단계)에서 사용되는 탈블로킹제는 4-시아노피리딘, 디클로로메탄, 트리플루오로아세트산, 트리플루오로에탄올 및 물을 포함하는 용액 또는 4-시아노피리디늄 트리플루오로아세테이트, 트리플루오로에탄올, 디클로로메탄 및 에탄올을 포함하는 용액이다. 바람직한 구현예에서, 각 공정(단계)에 사용되는 탈블로킹제는 1% 에탄올을 포함하는 20% 트리플루오로에탄올/디클로로메탄 중 2% 4-시아노피리디늄 트리플루오로아세테이트(CYTFA)(w/v)이다.
용어 "할로겐" 및 "할로"는 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택되는 원자를 지칭한다.
용어 "캡핑제"는 예를 들어 들어오는 서브유닛 또는 기타 활성화된 그룹과 화학 결합을 형성하는 지지체-매체의 반응성 부위를 차단하는데 유용한 산 무수물(예를 들어, 벤조산 무수물, 아세트산 무수물, 페녹시아세트산 무수물 등)을 지칭한다. 일 구현예에서, 캡핑제는 에틸모르폴린 및 메틸피롤리디논을 포함하는 용액에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 캡핑제는 캡핑 A 및 캡핑 B를 포함하고, 여기서 캡핑 A는 NMP 중의 NEM 용액이고, 캡핑 B는 NMP 중의 캡핑제의 용액이다.
용어 "절단제"는 예를 들어 지지체-매체로부터 지지체-결합된 올리고머를 절단하는데 유용한 화학 염기(예를 들어, 암모니아 또는 1,8-디아자바이사이클로운덱-7-엔) 또는 화학 염기의 조합을 포함하는 조성물(예를 들어, 액체 용액 또는 기체 혼합물)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, 절단제는 N-메틸-2-피롤리돈을 포함하는 용액에 존재한다.
용어 "탈보호제"는 보호기를 제거하는데 유용한 화학 염기(예를 들어, 암모니아, 1,8-디아자바이사이클로운덱-7-엔 또는 탄산칼륨) 또는 화학 염기의 조합을 포함하는 조성물(예를 들어, 액체 용액 또는 기체 혼합물)을 지칭한다. 예를 들어, 탈보호제는 일부 구현예에서 예를 들어 모르폴리노 서브유닛, 모르폴리노 올리고머의 모르폴리노 서브유닛, 또는 그의 지지체 결합 버전으로부터 염기 보호를 제거할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 절단제는 디티오트레이톨 및 1,8-디아자바이시클로[5,4,0]운덱-7-엔을 포함한다.
용어 "용매"는 용질이 용해되는 용액 또는 혼합물의 성분을 지칭한다. 용매는 무기 또는 유기일 수 있다(예: 아세트산, 아세톤, 아세토니트릴, 아세틸 아세톤, 2-아미노에탄올, 아닐린, 아니솔, 벤젠, 벤조니트릴, 벤질 알코올, 1-부탄올, 2-부탄올, i-부탄올, 2-부탄온, t-부틸 알코올, 이황화탄소, 사염화탄소, 클로로벤젠, 클로로포름, 시클로헥산, 시클로헥산올, 시클로헥사논, 디-n-부틸-프탈레이트, 1,1-디클로로에탄, 1,2-디클로로에탄, 디에틸아민, 디에틸렌 글리콜, 디글림(diglyme), 디메톡시에탄, N,N-디메틸아닐린, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸아세트아미드(DMA), 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논(DMI), 1-메틸-2-피롤리디논(NMP), 디메틸프탈레이트, 디메틸술폭사이드, 디옥산, 에탄올, 에테르, 에틸 아세테이트, 에틸 아세토아세테이트, 에틸 벤조에이트, 에틸렌 글리콜, 글리세린, 헵탄, 1-헵탄올, 헥산, 1-헥산올, 메탄올, 메틸 아세테이트, 메틸 t-부틸 에테르, 메틸렌 클로라이드, 1-옥탄올, 펜탄, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-펜타논, 3-펜타논, 1-프로판올, 2-프로판올, 피리딘, 테트라히드로푸란, 톨루엔, 물, p-자일렌).
본 개시내용에서, G, C, A, U 및 T는 각각 구아닌, 시토신, 아데닌, 우라실 및 티민이다.
Figure pct00042
약어
DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 나타내고;
DIPEA는 N,N-디이소프로필에틸아민을 나타내고;
TrCl은 트리페닐메틸 클로라이드를 나타내고;
TLC는 박층 크로마토그래피를 나타내고;
EtOAc는 에틸 아세테이트를 나타내고;
NaCl은 염화나트륨을 나타내고;
DBU는 1,8-디아자바이사이클로[5,4,0]운덱-7-엔을 나타내고;
DBN은 1,5-디아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔을 나타내고;
DABCO는 1,4-디아자바이사이클로[2.2.2]옥탄을 나타내고;
NMP는 1-메틸-2-피롤리디논을 나타내고;
NPE는 4-니트로페네틸(NPE) 기를 나타내고;
IPC는 공정 중 제어(In-Process Control)를 나타내고;
UV는 자외선을 나타내고;
CYTFA는 4-시아노피리디늄 트리플루오로아세테이트를 나타내고;
Vol.(vol.)은 부피를 나타내고;
DCM은 디클로로메탄을 나타내고;
MTBE는 메틸 tert-부틸 에테르를 나타내고;
DMAP는 디메틸아미노피리딘을 나타내고;
EDCI는 1-에틸-3-(3-디메틸아민프로필)카르보디이미드 염산염을 나타내고;
IPA는 이소프로필 알코올을 나타내고;
NEM은 N-에틸 모르폴린을 나타내고;
Bz2O는 벤조산 무수물을 나타내고;
DMI는 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논을 나타내고;
PMO는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 나타내고;
CAP A는 캡핑 A를 나타내고;
CAP B는 캡핑 B를 나타내고;
"a M"은 "a mol/L"을 나타내며, 여기서 a는 디지털이고;
min은 분을 나타낸다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 실시예의 작업에서 온도가 제한되어 있지 않는 경우, 작업이 실온에서 수행되는 것을 의미한다.
실시예 1 화합물 (E)의 합성
합성 경로:
Figure pct00043
단계 1 화합물 (A)의 합성
DMF(350 mL) 중 화합물 (SM1)(35 g, 0.25 mol, 1 당량(eq.))의 용액에 DIPEA(0.75 mol, 3 당량) 및 TrCl(0.5 mol, 2 당량)을 연속적으로 충전하였다. 화합물 (SM1)이 완전히 소비되었음을 TLC가 나타낼 때까지 반응물을 20-25℃에서 교반하였다. 반응 혼합물에 물(1400 mL, 40 vol.) 및 EtOAc(1400 mL, 40 vol.)를 충전하였다. 유기층을 분리하고 20% NaCl 수용액으로 세척하여 DMF를 제거하였다. 생성된 유기층을 농축하고 실리카 겔 컬럼을 통해 정제하여 79 g의 백색 분말(화합물 (A))을 91% 수율로 수득하였다. 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.56 (d, 6H), 7.30-7.28(m, 6H), 7.20-7.18(m, 6H), 3.71-3.68(m, 3H), 2.95(s, 2H), 2.04(s, 3H).
단계 2 화합물 (B)의 합성
NMP(500 mL, 10 vol.) 중 트리글리콜(10 당량)의 용액에 20-30℃에서 60% NaH(0.1 당량, 미네랄 오일에 용해됨)를 충전한 다음, 20-30℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서 화합물 (A)(50 g, 1 당량)를 20-30℃에서 반응 혼합물에 충전하였다. 대부분의 화합물 (A)가 소비될 때까지 반응물을 20-30℃에서 교반하였다. 반응 후, DCM/MTBE(3/7, 1000 mL, 20 vol.) 및 물(1000 mL, 20 vol.)을 반응 혼합물에 충전하였다. 유기층을 분리하고 염수로 세척하였다. 생성된 유기층을 농축하여 조 화합물 (B)를 수득하였다. 조 화합물 (B)를 실리카 겔 컬럼을 통해 정제하여 70% 수율로 47 g 생성물을 수득하였다. 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.56 (d, 6H), 7.30-7.28(m, 6H), 7.20-7.18(m, 6H), 4.36-4.34(m, 2H), 3.75-3.60(m, 8H), 3.60-3.59(m, 2H), 3.05(s, 2H), 2.15(s, 3H).
단계 3 화합물 (C)의 합성
THF(470 mL) 중 화합물 (B)(47 g, 1 당량)의 용액에 석신산 무수물(2 당량)을 충전하였다. 화합물 (B)가 완전히 소비되었음을 TLC가 나타낼 때까지 반응물을 55℃에서 2.0시간 동안 교반하였다. 반응 후, 반응 혼합물의 pH를 10% NaHCO3 수용액으로 약 8.5로 조절하였다. 그런 다음 MTBE(940 mL, 20 vol.)를 혼합물에 첨가하고 수성층을 분리하였다. 생성된 수성층의 pH를 20% 시트르산 용액으로 3-5로 조절한 다음, DCM(940 mL, 20 Vol.)으로 추출하고 10% Na2SO4 수용액(470 mL, 10 vol.)으로 세척하여 유기상을 수득하였다. 농축 후, 황색 오일 56 g을 98% 수율로 수득하였고, 추가 정제 없이 다음 단계로 텔레스코프하였다. 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46 (d, 6H), 7.17-7.21(m, 6H), 7.07-7.10(m, 6H), 4.20-4.24(m, 2H), 4.17-4.15(m, 2H), 3.65-3.50(m, 8H), 2.96(s, 2H), 2.54-2.52(m, 4H), 2.05(s, 3H).
단계 4 화합물 (D)의 합성
DCM(560 mL) 중 화합물 (C)(56 g, 1 당량)의 용액에 N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복실산 이미드(HONB, 1.02 당량), DMAP(0.33 당량), DIPEA(2.5 당량) 및 EDCI(1.1 당량)를 충전하였다. 화합물 (C)가 완전히 소비되었음을 TLC가 나타낼 때까지 반응물을 20-30℃에서 교반하였다. 혼합물을 10% 시트르산 용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 농축 건조시켰다. 67 g의 폼 고형물을 93% 수율로 수득하였다. 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.46 (d, 6H), 7.17-7.21(m, 6H), 7.07-7.10(m, 6H), 6.11(d, 2H), 4.20-4.24(m, 2H), 4.17-4.15(m, 2H), 3.65-3.50(m, 8H), 3.36(s, 2H), 3.23(s, 2H), 2.96(s, 2H), 2.79(t, 2H), 2.63(t, 2H), 2.05(s, 3H), 1.70(d, 1H)，1.44 (d, 1H).
단계 5 화합물 (E)의 합성
아미노메틸 폴리스티렌 수지(10 g, 로딩량은 1 mmol/g 이었음)(Xi'an Lanxiao Technology Co., Ltd.에서 구입)를 NMP(200 mL)에 현탁시키고 1-2시간 동안 팽윤시켰다. 수지 현탁액을 여과하여 NMP를 제거하고 DCM(200 mL) 및 IPA/DCM(200 mL, v/v=1:3) 중 5% DIPEA로 연속적으로 세척하였다. NMP(10 vol.) 중 화합물 (D)(2.5 당량)의 용액을 NMP(100 mL) 중 아미노메틸 폴리스티렌 수지(10 g)의 현탁액에 충전하였다. 반응 혼합물을 40-45℃에서 24-48시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과한 다음, 100 mL NMP 및 100 mL DCM으로 세척하였다. 습윤 케이크를 반응기로 옮긴 다음, NMP(60 mL) 중 NEM(0.4 M) 용액 및 NMP(60 mL) 중 Bz2O(0.4 M) 용액을 첨가하였다. 수지에 남아있는 아미노 그룹은 Bz2O에 의해 캡핑하였다. 캡핑 반응이 완료된 후, 수지를 여과하고 DCM(100 mL)으로 세척하였다. 건조 후, 사르코시네이트 변형된 아미노메틸 수지를 수득하였고, 이를 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성에 사용하였다.
로딩량의 결정
전형적인 절차:
수지의 로딩량(잠재적으로 이용 가능한 반응 부위의 수)을 건조된 수지의 알려진 중량(25+3 mg)에 대한 분광 분석에 의해 결정하였고, 실란 처리된 25 mL 부피 플라스크로 옮기고 디클로로메탄 중 2%(v/v) 트리플루오로아세트산 약 5 mL를 첨가하였다. 내용물을 부드럽게 휘저어 혼합한 다음 30분 동안 그대로 두었다. 디클로로메탄 중 2%(v/v) 트리플루오로아세트산을 추가하여 부피를 25 mL로 만들고 내용물을 완전히 혼합하였다. 용적식 피펫을 사용하여 트리틸 함유-용액(500 μL)의 분취량을 10 mL 부피 플라스크로 옮기고 메탄설폰산으로 부피를 10 mL로 늘렸다. 최종 용액의 트리틸 양이온 함량을 406 nm에서 UV 흡광도에 의해 측정하였고 수지 로딩은 화합물 A를 참조 표준으로 사용하여 수지 그램당 트리틸 그룹(μmol/g)으로 계산하였다. 분석을 2회 수행하였고 평균 로딩을 계산하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1 화합물 E의 로딩량
Figure pct00044
실시예 2 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성
사르코시네이트 변형된 아미노메틸 수지로부터 25 사이클의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 서브유닛 어셈블링에 의해 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성을 달성하였다. 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성의 합성 경로는 다음과 같다.
Figure pct00045
Figure pct00046
포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 합성은 탈트리틸화(detritylation), 중화, 커플링, 캡핑 및 세척 주기를 위한 펩티드 합성 장치를 사용하여 트리글리콜 사르코시네이트 변형된 지지체로부터 고상 합성에 의해 수동으로 수행하였다. 모든 반응은 20 mL, 100 mL 및 500 mL 및 2 L의 컬럼 부피를 갖는 글라스 재킷 컬럼에서 수행하였다.
모노머를 고체 지지체에 어셈블링하기 전에, 모든 용액을 다음과 같이 준비하였다.
탈트리틸화 용액: 1% 에탄올을 포함하는 20% 트리플루오로에탄올/디클로로메탄(1:4, v/v) 중 2% 4-시아노피리디늄 트리플루오로아세테이트(CYTFA)(w/v).
중화 용액: 25% 이소프로판올/디클로로메탄 중 5% 디이소프로필에틸아민.
커플링 용액: DMI 중 0.36 M 모르폴리노 서브유닛 용액 및 DMI 중 0.8 M N-에틸모르폴린(NEM). 한편, DMI 중 모르폴리노 서브유닛 용액은 분자체(molecular sieve)로 12시간 이상 처리하여 수분 함량을 감소시켰다.
캡핑 용액: 캡핑 A로서 NMP 중 0.4 M NEM; 캡핑 B로서 NMP 중 0.4 M 벤조산 무수물 또는 아세트산 무수물.
표 2 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성에서의 반응 용액
Figure pct00047
재킷 컬럼 반응기에 사르코시네이트 변형된 아미노메틸폴리스티렌 수지를 충전한 후 15 vol. 1-메틸-2-피롤리디논(NMP 15 mL/g 수지)을 충전하고, 현탁액을 0.5-1시간 동안 정치시켰다. 그런 다음 NMP를 비우고 수지를 DCM으로 5회 세척한 후 탈트리틸화하였다. 각 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 서브유닛을 지지체 상에 어셈블하기 위해, 4개의 반응이 수행된다.
첫 번째로, 지지체 상의 트리틸기를 제거하기 위해, 2% 4-시아노피리디늄 트리플루오로아세테이트(CYTFA)(w/v) 용액(1% EtOH를 포함하는 2,2,2-트리플루오로에탄올/DCM ¼)(15-25 vol.)을 컬럼 반응기에 충전하였다. 혼합물을 2-5분 동안 N2로 거품을 낸 다음 배출하여 용매를 제거하였다. 모든 트리틸기가 제거되었음을 IPC가 나타낼 때까지 이 조작을 5-9회 반복하였다(IPC: 여액을 채취하여 메탄술폰산으로 희석하였다. 트리틸기가 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 411 nm에서의 UV 흡광도를 UV 분광계로 테스트하였다).
두 번째로, 탈트리틸화 후 재킷 컬럼에 IPA/DCM(1/3) 중 5% DIPEA를 충전하여 수지를 중화하였다. 커플링 전에, 잔류 CYTFA는 여러 번 세척하여 완전히 제거해야 한다.
세 번째로, DMI 중 모르폴리노 서브유닛 용액과 NEM 용액을 반응기에 충전하여 커플링을 수행하고 반응물을 45℃에서 90분 동안 N2로 거품을 내었다. 모르폴리노 서브유닛을 지지체 상에 어셈블링한 후, 반응 혼합물을 비우고 DCM으로 세척하였다.
마지막으로, 지지체 상의 미반응 모르폴리노 서브유닛을 캡핑하여 신장을 중지시켰다.
표적 서열이 완성될 때까지 4개의 반응을 하기 표 3과 같이 반복하였다.
표 3 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 어셈블리 절차
Figure pct00048
Figure pct00049
각 커플링 반응에 대해 608 μmol/g 로딩 및 2.5 당량의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 서브유닛(PMO-NPEG 모노머, PMO-PA 모노머, PMO-PC 모노머, PMO-T 모노머, 그 구조는 실시예 2에 나타내었다)과 함께 250 mg 화합물 (E)을 사용하여 하나의 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성을 수행하였다. 25 사이클의 반응 후, 2.95 g의 습한 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 변형된 고체 지지체를 수득하였다. 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 변형된 고체 지지체를 NMP(20 mL) 중 0.5 M DBU로 15℃에서 4시간 동안 처리하여 4-니트로페네틸 기를 제거하고 농축(conc .) 수산화 암모니아로 처리하여 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 절단하고 다른 보호기를 연속적으로 제거하였다. 28.8%의 4-니트로스티렌 부가물 불순물이 발견되었으며(LC-MS로 측정), 이는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성의 수율을 상당히 감소시킨다.
4-니트로스티렌 부가물 불순물 문제를 해결하기 위해, 3 단계의 절단 및 탈보호 전략을 개발하였다. 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 NMP 중의 DBU 및 티민 용액(DBU의 농도는 0.8 M이었고, 티민의 농도는 1.0 M이었음)에 천천히(5 mL/분) 충전하였다. 통상의 기술자는 표적 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 서열이 티민을 함유할 때, 티민의 농도가 표적 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 서열 내의 티민의 농도 보다 훨씬 커야 한다는 것을, 예를 들어 티민 대 표적 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 서열 내의 티민의 몰비가 10:1보다 크다는 것을 알고 있다. 3 단계의 절단 및 탈보호 후, 4-니트로스티렌 부가물 불순물이 상당히 감소되었다(5% 미만, LC-MS에 의해 측정됨).
절단 및 탈보호의 3 단계
고체상 어셈블리 후, 구아닌 상에 4-니트로페네틸 기를 갖는 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 변형된 고체 지지체를 수득하였다. 다음으로 절단 및 탈보호의 3 단계를 하기와 같이 수행하였다.
단계 (1), 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 조 생성물을 농축 수산화 암모니아(25%-28% 수산화 암모니아)를 사용하여 먼저 절단하여 수용액을 수득하고, 이를 동결건조하거나 농축 건조시켜 염기-보호된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 조 생성물을 생성하였다.
단계 (2), 단계 (1)의 조 생성물을 NMP에 재용해시키고(NMP 대 조 생성물의 부피-질량비는 10 mL/g이었음) NMP(조 생성물에 대해 10 Vol.) 중의 DBU/티민(1.0 M/0.8 M) 용액에 천천히(5 mL/분) 충전하여 4-니트로스티렌 부가물 불순물을 최소화하면서 4-니트로페네틸 기를 제거하였다.
단계 (3), NPE 탈보호 후 수득한 올리고뉴클레오티드를 농축 수산화 암모니아(25%-28% 수산화 암모니아)로 다시 처리하여 이소부티릴과 같은 남아있는 보호기를 제거하여 표적화된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 A(PMO-A)를 형성하였고, 서열은 다음과 같았다: 5'-GTT GCC TCC GGT TCT GAA GGT GTT C- 3'(서열번호 1).
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
PMO-B, PMO-C, PMO-D 및 PMO-E를 PMO-A의 제조 방법과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.
PMO-B의 염기 서열은 5'-CTC CAA CAT CAA GGA AGA TGG CAT TTC TAG-3'(서열번호 2)이었다.
PMO-C의 염기 서열은 5'-CTATATATAGTTATTCAACA-3'(서열번호 3)이었다.
PMO-D의 염기 서열은 5'-GGC CAA ACC TCG GCT TAC CTG AAA T-3'(서열번호 4)이었다.
PMO-E의 염기 서열은 5'-CAG CAG CAG CAG CAG CAG-3'(서열번호 5)이었다.
포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성 동안 몇 가지 전형적인 불순물이 발견되었으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 합성에서 발견되는 전형적인 불순물
Figure pct00053
FLP 순도는 전체 길이 생성물의 LC-MS 순도를 나타낸다.
N-A, N-C, N-G, N-T는 N-1의 네 가지 불순물을 나타낸다.
OH는 포스포릴 데메틸아민 가수분해의 불순물을 나타낸다.
N+NPE는 4-니트로스티렌 부가물 불순물을 나타낸다.
LC-MS: Xevo G2-XS-TOF 검출기가 있는 Waters H-Class UPLC.
조 생성물은 정제 없이 3단계 절단 및 탈보호 후에 수득된 PMO를 지칭한다.
정제 생성물은 3단계 절단 및 탈보호 후에 수득한 PMO를 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제한 것을 지칭한다.
2개의 바람직한 구현예에 대한 앞선 기재는 본 발명의 원리를 철저하게 설명하는 것이 아니라 순전히 예시하기 위한 것이고, 변경 및 변화는 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 본 발명은 하기 청구범위에 명시적으로 제시된 것 외에는 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Changzhou SynTheAll Pharmaceuticals Co., Ltd. Shanghai STA Pharmaceutical R&D Co., Ltd. <120> Processes for preparing oligonucleotides <130> P20403221C <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMO-A <400> 1 gttgcctccg gttctgaagg tgttc 25 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMO-B <400> 2 ctccaacatc aaggaagatg gcatttctag 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMO-C <400> 3 ctatatatag ttattcaaca 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMO-D <400> 4 ggccaaacct cggcttacct gaaat 25 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMO-E <400> 5 cagcagcagc agcagcag 18

Claims (20)

  1. 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법:
    (a) 화학식 X-1의 화합물을 화학식 X-2의 화합물로 전환시키는 단계:
    Figure pct00054

    상기 식에서:
    R10은 출발 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(phosphorodiamidate morpholino oligomer))의 잔기이고;
    R11은 아민 보호기이고;
    여기서 화학식 X-1의 화합물은 고체 지지체에 결합되어 있지 않고; 및
    (b) 임의로(optionally) 화학식 X-2의 화합물에서 보호기를 제거하여 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 전환이, 바람직하게는 용액 중의, 화학식 X-1의 화합물을 알칼리성 시약 및 화학식 X-3의 화합물과 반응할 수 있는 스캐빈저를 포함하는 혼합물에 첨가하는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00055
    .
  3. 제2항에 있어서, 알칼리성 시약이 수중 pKa가 약 9 이상인 염기성 유기 아민이고; 예를 들어, 알칼리성 시약이 사이클릭 염기성 아민, 예컨대 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 또는 1,5-디아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔인, 방법.
  4. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐빈저가 -SH 또는 1,3-디카르보닐 모이어티를 갖고; 예를 들어, 스캐빈저가 화학식 X-4의 화합물인, 방법:
    Figure pct00056

    상기 식에서:
    q는 0, 1 또는 2이고, 및
    RA는 각 경우에 독립적으로 임의로 치환된 C1- 6알킬(예: 메틸)이다.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐빈저가 티민 또는 이의 유도체인, 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R11은 NH3로 처리하여 제거될 수 있는 아민 보호기이고, 예를 들어, R11은 아실기, 예컨대 -C(=O)-RB이고, 여기서 RB는 임의로 치환된 C1- 6알킬, 예를 들어, C1- 6알킬(예: 이소프로필), 아릴 치환된 C1- 6알킬(예: 벤질), 또는 아릴옥시 치환된 C1- 6알킬인, 방법.
  7. 하기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법:
    (a) 화학식 X-5의 화합물을 화학식 X-6의 화합물로 전환시키는 단계:
    Figure pct00057
    ,
    Figure pct00058
    ,
    상기 식에서:
    m1 및 m2는 독립적으로 0-50의 정수(예를 들어, 0-30)이고;
    R11은 아민 보호기이고;
    Base(염기)는 각 경우에 독립적으로 G(구아닌), C(시토신), A(아데닌), U(우라실) 및 T(티민), 이들의 변형된 유사체, 및 이들의 보호된 유도체로부터 선택되는 염기이며, 단 화학식 X-5에서 Base가 보호된 염기인 경우, 화학식 X-6에서 상응하는 Base는 동일한 보호된 염기이거나 상응하는 부분적으로 또는 완전히 탈보호된 염기일 수 있으며;
    상기 식에서:
    T1은 적합한 5' 말단기(예를 들어, 짧은 펩티드, 임의로 치환된 알킬아미노기, 임의로 치환된 헤테로사이클릭기 등)이고; 및
    T2는 적합한 3' 말단기, 예를 들어 수소 또는 보호기(예를 들어, 아실기, 트리틸 등)이고; 및
    (b) 임의로 화학식 X-6의 화합물에서 보호기를 부분적으로 또는 완전히 제거하여 올리고뉴클레오티드를 수득하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 화학식 X-5 또는 X-6에서 Base가 각 경우에 하기로부터 독립적으로 선택되는, 방법:
    Figure pct00059
    ,
    상기 식에서 R11은 아민 보호기이다.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, m1 및 m2 중 하나는 0이거나, 또는 m1과 m2 중 어느 것도 0이 아닌, 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, m1과 m2의 합이 5에서 50 사이, 예컨대 10에서 40 사이인, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, T1이 임의로 치환된 알킬 아민 또는 임의로 치환된 헤테로사이클릭 고리, 예컨대 아미드(예: -C(O)NH2) 치환된 알킬 아민, 예를 들어
    Figure pct00060
    ; 임의로 치환된 피페리진 고리로서, 예를 들어,
    Figure pct00061
    이고, 여기서 RC는 아실, 아실옥시기 또는 펩티드 잔기인, 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, T2가 수소, 트리틸 또는 아실기(예를 들어, 아세틸)인, 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전환이, 바람직하게는 용액 중의, 화학식 X-5의 화합물을 알칼리성 시약 및 화학식 X-3의 화합물과 반응할 수 있는 스캐빈저를 포함하는 혼합물에 첨가하는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00062
    .
  14. 제13항에 있어서, 알칼리성 시약이 수중 pKa가 약 9 이상인 염기성 유기 아민이고, 예를 들어 알칼리성 시약이 사이클릭 염기성 아민, 예컨대 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 또는 1,5-디아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 스캐빈저가 -SH 또는 1,3-디카르보닐 모이어티를 갖고; 예를 들어, 스캐빈저가 화학식 X-4의 화합물인, 방법:
    Figure pct00063

    상기 식에서:
    q는 0, 1 또는 2이고, 및
    RA는 각 경우에 독립적으로 임의로 치환된 C1- 6알킬(예: 메틸)이다.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 스캐빈저가 티민 또는 이의 유도체인, 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, R11은 NH3로 처리하여 제거될 수 있는 아민 보호기이고, 예를 들어, R11은 아실기, 예컨대 -C(=O)-RB이고, 여기서 RB는 임의로 치환된 C1- 6알킬, 예를 들어, C1- 6알킬(예: 이소프로필), 아릴 치환된 C1-6알킬(예: 벤질), 또는 아릴옥시 치환된 C1- 6알킬인, 방법.
  18. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, X-6의 화합물을 NH3로 처리하여 화학식 X-6에서 보호기를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 X-5의 화합물이 예를 들어 NH3로 화학식 X-7의 올리고뉴클레오티드로부터 고체 지지체를 절단하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 방법:
    Figure pct00064
    ,
    상기 식에서
    SS는 폴리스티렌 고체 지지체와 같은 고체상 지지체이고,
    L1은 링커, 예컨대 사르코신(sarcosine) 기반 링커, 예를 들어
    Figure pct00065
    이고, 여기서 질소 말단은 인(phosphorous) 원자에 연결되고 카르보닐 말단은 고체 지지체와 아미드 결합을 형성하고;
    화학식 X-7에서 m1, m2 및 R11은 화학식 X-5에서 대응하는 기와 동일하며,
    Base(염기)는 각 경우에 독립적으로 G(구아닌), C(시토신), A(아데닌), U(우라실) 및 T(티민), 이들의 변형된 유사체, 및 이들의 보호된 유도체로부터 선택되는 염기이며, 단 화학식 X-7에서 Base가 보호된 염기인 경우, 화학식 X-5에서 상응하는 Base는 동일한 보호된 염기이거나 상응하는 부분적으로 또는 완전히 탈보호된 염기일 수 있으며;
    T2는 적합한 3' 말단기, 예를 들어 수소 또는 보호기(예를 들어, 아실기, 트리틸)이다.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 생성물.
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