KR20230035365A - 이소프레놀의 생산에 유용한 변형된 효모 숙주 세포 - Google Patents

이소프레놀의 생산에 유용한 변형된 효모 숙주 세포 Download PDF

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KR20230035365A
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Abstract

본 발명은 상승된 수준의 3-메틸-3-부텐-1-올 또는 이소프레놀을 생산할 수 있는 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포를 제공한다.

Description

이소프레놀의 생산에 유용한 변형된 효모 숙주 세포
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 7월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제63/049,551호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원 성명
본원에 기재되고 청구된 본 발명은 계약 번호 DE-AC02-05CH11231 하에 미국 에너지국과 승인 번호 FRD-17-004 하에 캘리포니아 에너지 위원회에 의해 공급된 기금을 이용하여 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
발명의 분야
본 발명은 효모에서 이소프레놀을 생산하는 생산 분야에 관한 것이다.
기후 변화에 대한 우려 및 에너지 부문의 지속 가능성에 대한 요구는 재생 가능한 탄소원으로부터 고급 바이오연료를 생산하기 위한 미생물 숙주 개발에 대한 관심을 증가시켰다. 미생물이 다양한 환경 조건 하에서 대사 항상성을 유지하기 위해 진화함에 따라, 이들의 대사는 상업적 생산을 위한 높은 역가, 속도 및 수율을 달성하도록 집중적으로 재설계되어야 한다. 대사 공학 및 합성 생물학의 최근 발전은 생산 숙주에 대한 더 나은 이해를 가능하게 하는 새로운 도구 및 경제적으로 보다 저렴한 방식으로 바이오연료를 생산하기 위해 대사를 재설계하는 방법을 제공하였다. 고급 알코올, 이소프레노이드- 및 지방산-유래된 바이오연료와 같은 진보된 바이오연료는 석유-기반 연료와 유사한 물리적 특성을 가진다. 예를 들어, 고급 알코올, 예컨대, n-부탄올, 이소부탄올, 및 C5 알코올은 에탄올보다 더 높은 에너지 밀도 및 더 적은 흡습성을 가진 가솔린에 대한 생물-유래 대체물이다(Generoso et al., 2015). 지방산-유래 바이오연료, 예컨대, 지방산 에스테르 및 이소프레노이드-유래 바이오연료, 예컨대, 파르네산, 비사볼란, 및 에피-이소지잔은 이들의 유리한 물리화학적(예컨대, 동결 온도) 및 연소 특성(예컨대, 세탄가 및 에너지 밀도)을 고려하여 디젤 및 제트 연료를 대체할 수 있는 것으로 여겨진다(Zhang et al., 2017, Runguphan and Keasling, 2014).
바이오매스로부터 고에너지 화합물의 생산은 중요한 과제이며, 최근에 이소프레놀(3-메틸-3-부텐-1-올)이 고용량 바이오연료 블렌드-스톡을 위한 유망한 바이오매스 기반의 전략적 재생 가능한 중간체로서 관심을 얻고 있다. 이소프레놀은 에탄올보다 높은 이의 에너지 함량, 더 낮은 물 혼화성, 흡습성, 및 휘발성을 기반으로 하는 우수한 표적의 진보된 바이오연료이다. 추가로, 최근 문헌은 또한 1,4-디메틸사이클로옥탄(DMCO)과 같은 고성능 제트 연료 블렌드-스톡의 생물기반 전구체로서 이소프레놀로부터 생산된 이소프렌을 제안하였다(Rosenkoetter et al., 2019).
이소프레놀의 미생물 생산을 위해, 메발로네이트(MVA) 경로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 및 최근에는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 조작되고 최적화되었다(Withers et al., 2007, George et al., 2014, Chou and Keasling, 2012, Liu et al., 2013, Sasaki et al., 2019, Kang et al., 2016, Kang et al., 2019). 예를 들어, 이종성 MVA 경로는 다양한 유기체로부터 경로 효소를 과발현시킴으로써 이. 콜라이에서 이소프레놀을 생산하도록 작제되었다. 이소프레노이드 생합성의 보편적인 전구체인 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)는 MEP와 MVA 경로 둘 모두를 통해 축적되고, 이. 콜라이 내인성 포스파타제의 무차별적 활성에 의해 이소프레놀로 탈인산화된다(도 1). 씨. 글루타미쿰은 또한 이종성 MVA 경로를 통해 이소프레놀을 생산하도록 조작되었다(Sasaki et al., 2019). 그러나, 조작된 MVA 경로를 통한 IPP의 축적은 성장 억제, 감소된 세포 생존력, 및 플라스미드 불안정성을 초래하였고, 이들 모두는 생산 숙주에 대해 낮은 수율 및 역가를 초래하였다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 이소프레놀 생산을 위한 IPP 형성을 피하는 새로운 경로가 설계되었다(도 1)(Kang et al., 2016). 2개의 효소인, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)로부터의 포스포메발로네이트 데카르복실라제(PMD 또는 ERG19sc) 및 무차별적 포스파타제(AphA)의 무차별적 활성을 이용하여, 이소프레놀 생산을 위한 신규한 "IPP-우회 경로"가 개발되었고, 3.7 g/L의 이소프레놀 역가가 회분식 조건에서 달성되었고, 최근 10.8 g/L의 가장 높은 역가가 유가식 발효 공정의 최적화에 의해 보고되었다(Kang et al., 2019).
에스. 세레비지애는 고유의 안전성, 산업적 견고성, 유전자 조작의 용이함을 가지고 일반적으로 대규모 작업에 안전한(GRAS) 것으로 여겨지기 때문에 생명공학 산업에서 널리 사용되어 왔다. 이러한 이점으로 인해, 효모 세포 공장은 분지쇄 고급 알코올과 같은 다수의 생화학물질(Generoso et al., 2015), 이소프렌 및 파르네센과 같은 테르페노이드로부터 유래된 바이오연료, 및 아모르파디엔과 같은 약학적 테르페노이드(Zhang et al. al., 2017)를 생산하기 위해 사용되었다.
에스. 세레비지애에서의 에를리히(Ehrlich) 경로는 이소부탄올, 이소펜탄올, 및 2-메틸-1-부탄올과 같은 분지쇄 고급 알코올을 생산하는 잘 알려진 경로이다. 에스. 세레비지애는 또한 테르페노이드로부터 유래된 바이오연료를 생산하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, FPP-과잉생산 플랫폼 및 비사볼렌 신타제 발현은 900 mg/L 초과의 역가의 바이오디젤 전구체 비사볼렌을 초래하였고(Peralta-Yahya et al., 2011), 산업-규모 테르페노이드 생산을 위한 효모 조작의 성공적인 예로서, 파르네센은 바이오리액터에서 130 g/L를 초과하는 역가로 생산되었고 아모르파디엔은 40 g/L를 초과하는 역가로 생산되었다(Westfall et al., 2012). 흥미롭게도, 에스. 세레비지애에서 이소프레노이드 생산의 다수 성공적인 예가 있었지만, 이소프레노이드 생합성 경로를 통한 매우 낮은 역가로 에스. 세레비지애에서 이소프레놀 생산에 대한 보고는 다만 극소수였다.
발명의 개요
본 발명은 상승된 수준의 3-메틸-3-부텐-1-올 또는 이소프레놀을 생산할 수 있는 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 출아 효모 세포이다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 사카로미세탈레스(Saccharomycetales) 목의 세포이다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 사카로미세타세애(Saccharomycetaceae) 과의 세포이다. 일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 사카로미세스(Saccharomyces) 속의 세포이다.
이소프레놀을 생산하는 상승된 수준은 40 μg/10 mL(중량 세포 부피) 초과이다. 일부 실시양태에서, 이소프레놀을 생산하는 상승된 수준은 배지 리터 당 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 또는 130 mg 이상을 생산할 수 있는 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포이다. 일부 실시양태에서, 이소프레놀을 생산하는 상승된 수준은 배지 리터 당 약 0.1 g, 0.2 g, 0.3 g, 0.4 g, 0.5 g, 0.6 g, 0.7 g, 0.8 g, 0.9 g, 1.0 g, 또는 1.02 g 이상을 생산할 수 있는 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포이다. 일부 실시양태에서, 배지는 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(yeast extract peptone dextrose; YPD) 배지와 같은 복합 배지이다. 일부 실시양태에서, 배지는 델프트(Delft) 배지와 같은 최소 배지이다. 일부 실시양태에서, 수율은 회분식 배양물 또는 연속식 배양물로부터이다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)로부터의 EfmvaE 및 Efmvas, 및 에스. 세레비지애로부터의 ERG8sc, ERG12sc, 및 ERG19sc, 및 NudB, 또는 이의 임의의 동종 효소를 과발현시키도록 조작된다. 각각의 효소의 증가된 발현은 효소를 인코딩하는 하나 이상의 안정적으로 도입된 유전자로부터 효모 숙주 세포로의 발현으로부터일 수 있다. 도입된 유전자는 효모 게놈에 안정적으로 통합될 수 있거나, 효모 숙주 세포에서 하나 이상의 플라스미드, 예컨대, 고 카피 수의 플라스미드에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는, 내인성 포스포메발로네이트 키나제 또는 PMK(예컨대, ERG8), 이소프레노이드 및 스테롤의 생합성에서 작용하는 세포질 효소, 및/또는 내인성 콜린 키나제에 대해 녹아웃되고, 임의적으로 포스파타제의 증가된 발현, 예컨대, 내인성 포스파타제의 증가된 발현, 또는 효모 숙주 세포에 천연 또는 이종성인 포스파타제를 인코딩하는 하나 이상의 안정적으로 도입된 유전자로부터 발현된 하나 이상의 포스파타제를 가지도록 조작된다. 안정적으로 도입된 포스파타제 유전자는 다음 포스파타제 중 하나 이상을 인코딩할 수 있다: PHO5, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; PHO3, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; LPP1, 에스. 세레비지애로부터의 지질 포스페이트 포스파타제; PYP, 에스. 세레비지애로부터의 당 알코올 포스파타제; GLC7, 에스. 세레비지애로부터의 세린/트레오닌 포스파타제; PAH1, 에스. 세레비지애로부터의 포스파티데이트 포스파타제; DPP1, 에스. 세레비지애로부터의 디아실글리세롤 포스페이트 포스파타제; PHO13, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; GPP1, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; GPP2, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; APHA, 이. 콜라이로부터의 아미노글리코사이드-3-포스포트랜스페라제; AGP, 이. 콜라이로부터의 글루코스-1-포스파타제; YQAB, 이. 콜라이로부터의 프룩토스-1-포스페이트; PHO8, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; PHOA, 이. 콜라이로부터의 알칼리 포스파타제, 또는 이들의 임의의 동종 효소. 일부 실시양태에서, 포스파타제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포에 대해 코돈 최적화된다. 포스파타제는 천연 발생 또는 합성의 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 내인성 알코올 아세틸 트랜스페라제 유전자, 예컨대, 알코올 아세틸 트랜스페라제 1(ATF1) 및/또는 알코올 아세틸 트랜스페라제 2(ATF2)를 인코딩하는 유전자에 대해 녹아웃되도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 내인성 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제(GPD1), 및/또는 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제(ADH) 유전자, 예컨대, 알코올 데하이드로게나제 1(ADH1), 알코올 데하이드로게나제 3(ADH3), 및 알코올 데하이드로게나제 5(ADH5)를 인코딩하는 유전자에 대해 녹아웃되도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 내인성 ERG20과 같은 파르네실 피로포스페이트 신타제(ERG20)에 대한 발현이 감소하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 HMG-CoA 신타제(MvaS), 아세토아세틸-CoA 티올라제/HMG-CoA 리덕타제(MvaE), 메발로네이트 키나제(MK)(또는 ERG12), 및/또는 포스포메발로네이트 데카르복실라제(PMD)(또는 ERG19) 중 하나 이상을 과발현시키도록 조작된다. 일부 실시양태에서, HMG-CoA 신타제(MvaS)는 엔테로코커스 패칼리스 HMG-CoA 신타제(EfmvaS), 또는 이의 동종 효소이다. 일부 실시양태에서, 아세토아세틸-CoA 티올라제/HMG-CoA 리덕타제(MvaE)는 엔테로코커스 패칼리스 아세토아세틸-CoA 티올라제/HMG-CoA 리덕타제(EfmvaE), 또는 이의 동종 효소이다. 일부 실시양태에서, ERG12는 사카로미세스 세레비지애 ERG12(ERG12sc), 또는 이의 동종 효소이다. 일부 실시양태에서, ERG19는 사카로미세스 세레비지애 ERG19(ERG19sc), 또는 이의 동종 효소이다. 일부 실시양태에서, 과발현은 프로모터에 작동적으로 연결된 각각의 효소를 인코딩하는 유전자의 하나 이상의 카피를 가진 핵산을 효모 숙주 세포에 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 효모 숙주 세포에서 염색체에 안정적으로 통합된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 각각의 효소가 효모 숙주 세포에서 발현 가능하도록 숙주 세포에서 구성적이거나 유도성이다.
본 발명은 MVAP, IP, 및/또는 이소프레놀을 과발현시킬 수 있는 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포를 제공하며, 여기서 효모 숙주 세포는 내인성 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제(GPD1), 및/또는 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제(ADH) 유전자에 대해 녹아웃되고/녹아웃되거나, 파르네실 피로포스페이트 신타제(ERG20)에 대한 발현이 감소하도록 조작된다.
본 발명은 본 발명의 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포를 작제하기 위한 방법으로서, (a) 본원에 기재된 효소를 인코딩하는 개방형 해독틀(ORF)을 포함하는 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계로서, 각각은 작동적으로 연결된 각각의 ORF를 전사할 수 있는 프로모터에 작동적으로 연결되는 단계, 및/또는 (b) 변형된 숙주 세포가 하나 이상의 녹아웃된 효소를 발현시키지 않도록 본원에 기재된 하나 이상의 효소를 녹아웃시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명은 이소프레놀을 생산하기 위한 방법으로서, (a) 본 발명의 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포 또는 이의 배양물을 제공하는 단계, (b) 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포를 배양하거나 성장시켜 이소프레놀을 생산하는 단계, (c) 임의적으로 배양물로부터 이소프레놀을 추출하거나 분리하는 단계, 및 (d) 임의적으로 추출되거나 분리된 이소프레놀에 연료 첨가제를 도입하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이소프레놀을 추출하거나 분리하는 단계는 배양하거나 성장하는 단계와 동시적이거나 이에 후속적이다.
일부 실시양태에서, 연료 첨가제는 산화방지제, 열 안정성 개선제, 세탄 개선제, 안정화제, 저온 유동 개선제, 연소 개선제, 소포제, 헤이즈 방지 첨가제, 부식 억제제, 윤활성 개선제, 착빙 억제제, 인젝터 청결 첨가제, 연기 억제제, 드래그 저감 첨가제, 금속 불활성화제, 분산제, 세제, 해유화제, 염료, 마커, 정전기 분산제, 살생물제, 및 이들의 조합 중 하나를 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
전술한 측면 및 다른 측면은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 예시적인 실시양태의 하기 설명으로부터 당업자에 의해 용이하게 이해될 것이다.
도 1. 이소프레놀 생산을 위한 원래 및 IPP-우회 경로의 개략도. 에스. 세레비지애에서 메발로네이트 경로는 아세틸-CoA를 IPP 및 DMAPP로 전환시키는 7개의 반응으로 이루어진다. 무차별적 이. 콜라이 포스파타제인 NudB에 의한 이들 화합물의 탈인산화는 이소프레놀을 생산한다. IPP-우회 경로가 본 연구에서 제안된다: 메발로네이트 디포스페이트(MVAP)의 직접 탈카르복실화 및 이어서 이소펜테닐 모노포스페이트(IP)의 탈인산화. PMD(또는 ERG19)는 비-천연 기질 MVAP에 대해 무차별적 활성을 가진다. 에를리히 경로는 분지쇄 아미노산으로부터 이소부탄올, 이소펜탄올, 및 2-메틸-1-부탄올과 같은 분지쇄 고급 알코올을 생산하는 잘 알려진 경로이다. 예를 들어, 류신은 에를리히 경로를 통해 이소펜탄올로 전환된다. HMG-CoA, 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA; MVA, 메발론산; MVAP, 메발로네이트 포스페이트; MVAPP, 메발로네이트 디포스페이트; IPP, 이소펜테닐 디포스페이트; DMAPP, 디메틸알릴 디포스페이트; AtoB(또는 ERG10), 아세토아세틸-CoA 티올라제; HMGS(또는 ERG13), HMG-CoA 신타제; HMGR, HMG-CoA 리덕타제; MK(또는 ERG12), 메발로네이트 키나제; PMK(또는 ERG8), 포스포메발로네이트 키나제; PMD(또는 ERG19), 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제; IDI, 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제; NudB, 이. 콜라이 천연 포스파타제(디하이드로네오프테린 트리포스페이트 디포스파타제).
도 2. 이소프레놀 생산 경로의 작제. (a) 원래의 MVA 경로를 작제하기 위해, 5개의 MVA 경로 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG8sc, ERG12sc, 및 ERG19sc)가 갈락토스 프로모터의 제어 하에 게놈 상에 통합된다. NudB는 TEF3 프로모터의 제어 하에 고-카피 플라스미드 상에서 발현된다. (b) IPP-우회 경로를 작제하기 위해, 4개의 경로 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)가 갈락토스 프로모터의 제어 하에 게놈 상에 통합된다. ERG19sc(또는 PMD)는 TEF3 프로모터의 제어 하에 고-카피 플라스미드 상에서 발현된다.
도 3. 원래의 MVA 경로를 통한 이소프레놀 생산. (a) 2% 글루코스 및 2% 갈락토스를 가진 YPD 배지 보충물에서 균주로부터의 이소프레놀 역가 (b) 2% 글루코스 및 2% 갈락토스를 가진 델프트 배지 보충물에서 2개의 균주(JHK17 및 JHK18)로부터의 이소프레놀 역가. 오차 막대는 생물학적 복제물로부터의 하나의 표준 편차를 나타낸다. WT, 야생형; JHK2, 플라스미드 상에서 NudB 발현을 가진 야생형; JHK4, pRS425를 가진 게놈 상에 통합된 2개의 유전자(EfmvaE 및 EfmvaS); JHK11, 게놈 상의 2개의 유전자(EfmvaE 및 EfmvaS)의 통합 및 플라스미드 상의 NudB의 발현; JHK14, pRS425를 가진 게놈 상의 4개 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)의 통합; JHK15, 게놈 상의 4개 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)의 통합 및 플라스미드 상의 NudB의 발현; JHK17, pRS425를 가진 게놈 상의 5개 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG8sc, ERG12sc, 및 ERG19sc)의 통합; JHK18, 게놈 상의 5개 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG8sc, ERG12sc, 및 ERG19sc)의 통합 및 플라스미드 상의 NudB의 발현.
도 4. 델프트 배지에서 이소펜탄올 생산 및 이소프레놀 생산에 대한 류신 효과. (a) 원래의 MVA 경로 균주의 이소펜탄올 생산. (b) 원래의 MVA 경로를 통한 이소프레놀 생산에 대한 류신 효과. 균주는 1 g/L의 류신의 존재 또는 류신의 부재에서 2% 글루코스 및 2% 갈락토스가 보충된 250 mL 플라스크에서 배양된다. 오차 막대는 3개의 생물학적 복제물로부터의 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 5. IPP-우회 경로를 통한 이소프레놀 생산. (a) 2% 글루코스 및 2% 갈락토스가 보충된 YPD 배지에서 이소프레놀 역가. (b) 2% 글루코스 및 2% 갈락토스가 보충된 델프트 배지에서 JHK19 및 JHK20의 이소프레놀 역가. 오차 막대는 3개의 생물학적 복제물로부터의 하나의 표준 편차를 나타낸다. WT, 야생형; JHK1, pRS425를 가진 야생형; JHK4, pRS425를 가진 게놈 상의 2개의 유전자(EfmvaE 및 EfmvaS)의 통합; JHK12, pERG19sc를 가진 게놈 상의 2개의 유전자(EfmvaE 및 Efmvas)의 통합; JHK14, pRS425를 가진 게놈 상의 4개 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)의 통합; JHK16, pERG19sc를 가진 게놈 상의 4개 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)의 통합.
도 6. 이소프레놀 생산을 개선하기 위한 MVA 경로의 변형. ERG8sc(PMK)가 결실되고 IP 키나제(IPK)가 게놈 상에서 통합된다. ERG19sc는 플라스미드 상에서 과발현된다. 콜린 키나제(CK)는 이소프레놀 생산을 개선하기 위해 결실된다.
도 7. 이소프레놀 생산에 대한 게놈 상에서 CK 및 ERG8sc의 결실의 효과. CK 결실이 없는 3개의 균주(대조 IBP 균주(JHK16), ΔERG8sc 균주(JHK26), 및 IPK 통합이 있는 ΔERG8sc 균주(JHK27))의 (a) 성장 속도 및 (b) 이소프레놀 역가. CK가 결실된 3개의 균주(대조 IBP 균주(JHK22), ΔERG8sc 균주(JHK24), 및 IPK 통합을 가진 ΔERG8sc 균주(JHK28))의 (c) 성장 속도 및 (d) 이소프레놀 역가. 균주는 30℃ 및 200 rpm에서 2% 글루코스 및 2% 갈락토스가 보충된 델프트 배지에서 배양된다.
도 8. CK의 존재(JHK16) 또는 CK의 부재(JHK22)에서 IPP-우회 경로 균주로부터의 경로 대사산물 수준의 비교. (a) 성장; (b) 이소프레놀 생산; (c) 세포내 MVA 수준; (d) 세포내 MVAP 수준; (e) 세포내 MVAPP 수준; (f) 세포내 IP 수준; (g) 세포내 IPP/DMAPP. 오차 막대는 30℃에서 2% 글루코스 및 2% 갈락토스가 보충된 델프트 배지를 사용하여 3개의 생물학적 복제물로부터의 하나의 표준 편차를 나타낸다.
도 9. 다양한 포스파타제로 IPP-우회 경로를 통한 이소프레놀 생산. JHK22는 대조 균주이고, 다른 모든 균주는 대조 균주 이외에 플라스미드 상의 각각의 포스파타제를 포함한다. PHO5, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; PHO3, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; LPP1, 에스. 세레비지애로부터의 지질 포스페이트 포스파타제; PYP, 에스. 세레비지애로부터의 당 알코올 포스파타제; GLC7, 에스. 세레비지애로부터의 세린/트레오닌 포스파타제; PAH1, 에스. 세레비지애로부터의 포스파티데이트 포스파타제; DPP1, 에스. 세레비지애로부터의 디아실글리세롤 포스페이트 포스파타제; PHO13, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; GPP1, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; GPP2, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; APHA, 이. 콜라이로부터의 아미노글리코사이드-3-포스포트랜스페라제; AGP, 이. 콜라이로부터의 글루코스-1-포스파타제; YQAB, 이. 콜라이로부터의 프룩토스-1-포스페이트; PHO8, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; PHOA, 이. 콜라이로부터의 알칼리 포스파타제.
도 10. IPP-우회 경로를 통해 효모에서 이소프레놀 생산을 개선하기 위한 조작 전략.
도 11. 회분식 발효에서의 세포 밀도 및 20 g/L 글루코스가 보충된 델프트 배지를 포함하는 2 L 발효기에서 배양된 세포.
도 12. 회분식 발효(유일한 탄소원으로서 20 g/L의 글루코스가 보충된 델프트 배지)에서 배양물 중 화합물의 농도. 그래프는 배양물 중의 글루코스 및 기타 대사산물(에탄올, 아세테이트)을 보여준다. 갈락토스는 유도제로서 존재한다(따라서 이는 소모되지 않는다). 회분식 발효에서 1.02 g/L의 이소프레놀이 생산되었다.
도 13. 20 g/L 글루코스가 보충된 델프트 배지를 포함하는 2 L 발효기에서 배양된 세포로부터의 이소프레놀의 역가.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 달리 나타내지 않는 한, 본 발명은 특정 서열, 발현 벡터, 효소, 숙주 미생물, 또는 과정으로 제한되지 않으며, 그 자체가 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하려는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.
명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형은 달리 문맥상 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "발현 벡터"에 대한 언급은 단일 발현 벡터뿐만 아니라 동일하거나(예를 들어, 동일한 오페론) 또는 상이한 복수의 발현 벡터들을 포함하고; "세포"에 대한 언급은 단일 세포뿐만 아니라 복수의 세포들을 포함하고; 및 이와 유사한 것을 포함한다.
본 명세서 및 하기의 청구범위에서, 하기 의미를 갖도록 정의될 다수의 용어가 참조될 것이다:
본원에 사용된 바와 같은 용어 "임의적" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기재된 특징 또는 구조가 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있거나, 또는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 또는 발생하지 않을 수 있고, 설명이 특정한 특징 또는 구조가 존재하는 경우 및 특징 또는 구조가 없는 경우, 또는 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 명시된 값보다 10% 더 큰 값 및 명시된 값보다 10% 더 작은 값을 포함하는 값을 의미한다.
용어 "숙주 세포" 및 "숙주 미생물"은 발현 벡터의 삽입을 통해 형질전환될 수 있는 살아있는 생물학적 세포, 예컨대, 미생물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 숙주 유기체 또는 세포는 원핵 유기체(예를 들어, 세균계(kingdom Eubacteria)의 유기체) 또는 진핵 세포일 수 있다. 당업자에 의해 인지될 바와 같이, 원핵세포는 막-결합 핵(membrane-bound nucleus)이 결핍되어 있는 반면에, 진핵세포는 막-결합 핵을 가진다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이종성 DNA"는 하기 중 적어도 하나가 사실인 핵산의 폴리머를 지칭한다: (a) 핵산의 서열이 주어진 숙주 미생물과 이질적임(즉, 자연적으로 발견되지 않음); (b) 서열이 주어진 숙주 미생물에서 자연적으로 발견되지만, 비천연(예를 들어, 예상했던 양보다 많이) 양으로 발견될 수 있음; 또는 (c) 핵산의 서열이, 자연에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 둘 이상의 서브서열을 포함함. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이종성"은 하기 중 적어도 하나가 사실인 구조 또는 분자를 지칭한다: (a) 구조 또는 분자가 주어진 숙주 미생물과 이질적임(즉, 자연적으로 발견되지 않음); 또는 (b) 구조 또는 분자가 주어진 숙주 미생물에서 자연적으로 발견되지만, 비천연(예를 들어, 예상했던 양보다 많이) 양으로 발견될 수 있음. 예를 들어, 예 (c)와 관련하여, 재조합적으로 생산되는 이종성 핵산 서열은 새로운 기능성 핵산을 제조하도록 배열된 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열을 가질 것이다. 구체적으로, 본 발명은 숙주 미생물로의 발현 벡터의 도입을 기술하고, 여기서 발현 벡터는 숙주 미생물에서 정상적으로 발견되지 않는 효소를 코딩하는 핵산 서열을 함유한다. 숙주 미생물의 게놈과 관련하여, 이후, 효소를 코딩하는 핵산 서열은 이종성이다.
용어 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 숙주 미생물을 형질도입하거나, 형질전환하거나, 감염시켜, 세포가 세포에 네이티브한 것들 이외에, 또는 세포에 네이티브하지 않은 방식으로 핵산 및/또는 단백질을 발현시키도록 하는 화합물 및/또는 조성물을 지칭한다. "발현 벡터"는 숙주 미생물에 의해 발현될 핵산(보통 RNA 또는 DNA)의 서열을 함유한다. 임의적으로, 발현 벡터는 또한 바이러스, 리포좀, 단백질 코팅 등과 같은 숙주 미생물 내로 핵산의 진입을 달성하는 데 도움이 되는 물질을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위해 고려되는 발현 벡터는 임의의 바람직하거나 또는 필요한 작동 요소과 함께, 핵산 서열이 삽입될 수 있는 것들을 포함한다. 추가로, 발현 벡터는 숙주 미생물 내로 전달되고 그 안에서 복제될 수 있는 것이어야 한다. 특정 발현 벡터는 플라스미드, 특히 잘 문서화되어 있고 핵산 서열의 전사에 바람직하거나 필요한 작동 요소를 함유하는 제한 부위가 있는 것들이다. 이러한 플라스미드, 뿐만 아니라 다른 발현 벡터는 당업자에게 널리 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "형질도입"은 핵산 서열의 숙주 미생물 또는 세포로의 전달을 지칭한다. 핵산의 서열이 세포에 의해 안정적으로 복제되는 경우에만 숙주 미생물 또는 세포가 "형질전환"된다. 당업자에 의해 인지될 바와 같이, "형질전환"은 핵산 서열의 세포 게놈 내로의 혼입, 즉, 염색체 통합에 의해, 또는 염색체외 통합에 의해 일어날 수 있다. 대조적으로, 발현 벡터, 예를 들어, 바이러스는 숙주 미생물을 형질도입하고, 복제하고, (임의의 상보적인 바이러스 또는 벡터의 이점 없이) 다른 미생물에 원래의 형질도입 발현 벡터와 동일한 유형의 자손 발현 벡터, 예를 들어, 바이러스를 확산시킬 때 "감염성"이고, 여기서 자손 발현 벡터는 동일한 번식 능력을 가진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 서열", "핵산의 서열" 및 이의 변형은 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보스를 포함), 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보스를 포함), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드인 기타 다른 종류의 폴리뉴클레오타이드, 및 DNA 및 RNA에서 발견된 바와 같이, 상기 폴리머가 염기 짝짓기(base pairing) 및 염기 중첩(base stacking)을 가능하게 하는 입체배치(configuration)에서의 핵염기를 함유한다면, 비뉴클레오타이드 백본을 함유하는 그 밖의 폴리머를 총칭할 것이다. 따라서, 이러한 용어는 공지된 유형의 핵산 서열 변형, 예를 들어, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오타이드의 유사체로의 치환; 뉴클레오타이드간 변형, 예를 들어, 하전되지 않은 연결(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 카바메이트 등), 음으로 하전된 연결(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 및 양으로 하전된 연결(예를 들어, 아르니노알킬포스포아미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르)을 가진 것들; 예를 들어, 단백질(뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 폴리-L-리신 등 포함)과 같은 펜던트 모이어티를 함유하는 것들; 인터칼레이터를 가진 것들(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등); 및 킬레이터를 함유하는 것들(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)을 포함한다. 본원에서 사용되는 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 대한 기호는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회( Biochem. 9:4022, 1970)에 의해 권장된 것들이다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
일부 실시양태에서, 발아 효모 사카로미세스 세레비지애는 이소프레놀의 생합성을 위해 조작된다. 이소프레놀(3-메틸-3-부텐-1-올)은 가치 있는 드롭-인(drop-in) 바이오연료 및 상품 화학물질의 중요한 전구체이다. 이. 콜라이에서 이소프레놀의 생산을 위해 이종성 메발로네이트 경로를 이용한 합성 미생물 시스템이 개발되었지만, 고유한 안전성, 견고성, 및 대규모 작업의 우수한 이력을 포함하는 다수 이점들로 인해 이소프레노이드 생산을 위해 생명공학 산업에서 널리 사용되는 숙주인 에스. 세레비지애에서 보고된 이소프레놀 생산의 우수한 예는 없었다. 에스. 세레비지애에서 이소프레놀 생산을 위한 2개의 경로가 개발되었다. 이소프레놀 생산을 위해, 하나는 원래의 MVA 경로를 사용하고, 다른 하나는 IPP-우회 경로를 사용한다. 균주에서 녹아웃될 때 그 균주의 이소프레놀 역가를 유의하게 개선하는 주요 내인성 유전자가 효모에서 확인되었다.
이러한 숙주에서 이소프레놀 생산을 개선하는 무차별적 포스파타제가 또한 확인되었다. 조작된 효모는 산업적 규모의 이소프레놀 생산을 위한 우수한 생산 시스템이다. 에스. 세레비지애에서 이소프레놀을 생산하기 위해, 이. 콜라이에서 이전에 입증된 2개의 경로가 시도된다. (도 1)
제1 경로는 내인성 MVA 경로를 사용하여 구상되었다. 에스. 세레비지애에서 이소프레놀 생산에 대한 연구에 이용 가능한 문헌은 단지 하나였다(Pham, 2015). 그러나, 이러한 작업에서, 이소프레놀은 조작된 에스. 세레비지애로부터 단지 매우 낮은 역가(40 μg/10 mL 중량 세포 부피)로 생산되었다.
효모에서 이러한 낮은 이소프레놀 역가를 극복하기 위해, IPP 풀을 증가시키는 경로가 설계된다. 5개의 유전자(엔테로코커스 패칼리스로부터의 EfmvaE 및 Efmvas, 및 에스. 세레비지애로부터의 ERG8sc, ERG12sc 및 ERG19sc)는 숙주 게놈 상에 통합되고, NudB는 도 2(패널 a)에 도시된 바와 같이 강한 프로모터 하에 고 카피 플라스미드 상에서 과발현된다.
MVA 경로의 모든 5개 유전자가 게놈 상에 통합될 때, 이러한 균주(JHK18)는 YPD 배지에서 원래의 MVA 경로에 대한 가장 높은 이소프레놀 역가인 36 mg/L의 이소프레놀을 생산하고(도 3(패널 a)), YPD 배지로부터의 생산 역가와 비교하여 델프트 배지에서 이소프레놀 생산이 증가한다. 균주 JHK18은 델프트 배지에서 약 45 mg/L의 이소프레놀을 생산할 수 있는데(도 3(패널 b)), 이는 이전에 보고된 역가로부터 상당한 개선이지만, 역가는 여전히 임의의 추가 적용에 충분히 높지 않다.
원래의 MVA 경로 균주(JHK18)는 여전히 단지 낮은 역가의 이소프레놀을 생산하기 때문에, 이소프레놀 생산을 개선하기 위해 최근에 보고된 IPP-우회 경로(IBP)가 설계된다(Kang et al., 2016). IBP는 비-천연 기질 MVAP를 향한 PMD(ERG19)의 무차별적 활성을 기반으로 설계되며, 원래의 MVA 경로와 비교하여 이소프레놀 생산을 위해 하나의 ATP 및 하나의 효소(PMK 또는 ERG8)를 저장할 수 있다(도 1). 에스. 세레비지애에서 IBP를 작제하기 위해, 4개의 MVA 경로 유전자(엔테로코커스 패칼리스로부터의 2개의 이종성 유전자(EfmvaE 및 Efmvas) 및 2개의 내인성 효모 유전자(ERG12sc 및 ERG19sc))가 갈락토스 프로모터 PGAL1 및 PGAL10 하에 효모 게놈 상에 통합된다(도 2(패널 b)). 도 2(패널 b)에 도시된 바와 같이, 강한 TEF3 프로모터 하에 고 카피 2-마이크론 플라스미드 상의 ERG19sc가 과발현된다.
4개의 경로 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)가 또한 통합되고 게놈으로부터 과발현될 때, 이러한 균주(JHK16)는 72 시간 후에 YPD에서 45 mg/L의 이소프레놀(도 4(패널 a)) 및 72 시간 후 델프트 배지에서 75 mg/L의 이소프레놀(도 4(패널 b))을 생산하는데, 이는 원래의 MVA 경로 균주로부터의 역가에 비해 각각 1.8-배 및 1.3-배 개선이다.
고수준의 MVAP를 달성하기 위해, ERG8sc를 녹아웃시키고 IBP 균주에서 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스(Methanothermobacter thermautotrophicus)로부터의 IPK를 통합함으로써 MVAP의 원치 않는 소비를 감소시키는 것이(도 6) 시도된다. 예상된 바와 같이, 이종성 IPK를 가진 ERG8sc 녹아웃 균주(JHK27)는 델프트 배지에서 성장할 수 있다. 그러나, 이러한 균주는 도 6(패널 a 및 b)에 도시된 바와 같이 이소프레놀을 단지 매우 적게 생산한다.
ERG8sc 녹아웃 균주(JHK26)는 또한 IPK 발현 없이도 서서히 성장하기 시작하는 것으로 관찰된다(도 6(패널 a)). 이러한 관찰은 MVAP, IP, 또는 심지어 이소프레놀을 인산화시켜 ERG8sc 녹아웃 균주에서 IPP를 생산할 수 있는 추정상의 키나제가 있다는 것을 시사한다. 추정 키나제를 찾아보면 이소프레놀을 사용하여 상당량의 IPP 및 IP를 생산할 수 있는 에스. 세레비지애로부터의 콜린 키나제(CK)가 확인된다(Chatzivasileiou et al., 2019).
CK 녹아웃 균주는 IP 및 이소프레놀의 IPP로의 잠재적인 전환을 방지하도록 작제된다(도 6). 130 mg/L의 이소프레놀 역가는 콜린 키나제를 녹아웃시키기 전에 대조 균주(JHK16)에 비해 2-배 개선으로 CK 녹아웃 균주(JHK22)에 의해 72 시간 동안 델프트 배지에서 달성된다(도 6(패널 d)). 예상된 바와 같이, CK와 ERG8sc 둘 모두가 녹아웃된 균주 JHK24는 YPD(데이터는 포함되지 않음) 또는 델프트 배지에서 성장하지 않는다(도 7(패널 c)). 예상된 바와 같이, IPK 통합을 가진 이중 녹아웃 균주(JHK28)는 긴 지연 및 대수기로 서서히 성장하지만, 이는 어떠한 이소프레놀도 생산하지 않는다(도 7(패널 c 및 d)). 따라서, 이소프레놀을 생산하기 위한 추가 변형 및 조작을 위한 IBP 배경 균주로서 ERG8sc(JHK22)를 녹아웃시키지 않고 CK 녹아웃 균주를 사용하는 것으로 결론지어진다.
이소프레놀 생산 경로의 병목 현상을 확인하고 경로 조작 방향을 결정하기 위해, IPP-우회 경로 균주의 MVA 경로 대사산물의 분석이 수행된다. 대사체학 분석의 가장 흥미로운 결과는 48 시간 후 IP 수준이 CK 녹아웃 균주에서 400 mM까지 IP의 유의한 증가 및 막대한 축적을 나타내는 반면, 대조 균주의 IP 수준은 어떠한 유의한 증가 없이 약 50 mM로 유지된다는 것이다(도 8).
CK 녹아웃 균주(JHK22)에서 IP 수준은 고수준의 이소프레놀 생산에 충분해야 한다. 그러나, 이러한 균주는 단지 약 130 mg/L의 이소프레놀을 생산하며, 이는 IP의 이소프레놀로의 가수분해를 담당하는 포스파타제가 현재 이소프레놀 균주의 병목 현상이라는 것을 시사한다.
효모 이소프레놀 균주에서 IP 가수분해를 개선하기 위해, 무차별적 활성에 대해 보고된 15개의 포스파타제(표 xx)가 시험되고 선택되며, 이. 콜라이로부터의 PhoA의 발현이 이소프레놀 역가를 유의하게 개선하는 것으로 밝혀졌다. 플라스미드 상에서 과발현된 ERG19 및 PhoA를 가진 CK 녹아웃 균주를 사용하여 380 mg/L의 이소프레놀 역가가 달성되었다(도 8).
Novozymes 및 Aemetics와 같은 바이오연료 산업은 이들이 조작된 효모를 사용하는 에탄올 산업의 핵심 업체이고 현재 효모에서 다른 유형의 바이오연료 생산을 목표로 하고 있기 때문에 이러한 기술에 관심을 가질 것이다. 최근에, 이소프레놀은 바이오연료 및 바이오제품 분야에서 많은 관심을 얻었지만, 높은 역가로 이소프레놀을 생산할 수 있는 박테리아 균주만이 있었다. 이들 업체는 대규모 발효를 위해 박테리아보다 효모를 선호하기 때문에, 높은 역가로 이소프레놀을 생산하기 위해 개발된 효모 균주의 기술은 바이오연료 산업을 유치할 수 있을 것이다.
효모는 대규모 발효를 위해 선호되는 바이오연료 생산 플랫폼 숙주이다. 이소프레놀 생산에 사용되는 경로는 박테리아 숙주에서 이소프레놀 생산을 위한 천연 경로보다 더 효율적인 것으로 이미 입증된 바 있다. 또한, 이러한 기술은 이소프레놀 생산을 유의하게 개선하기 위해 녹아웃되는 효모의 주요 내인성 유전자를 밝혀냈고, 역가를 추가로 개선하기 위해 경로의 병목 현상을 완화시키는 일련의 무차별적 포스파타제를 확인하였다.
효소, 및 이를 인코딩하는 핵산
동종 효소는 본 명세서 또는 인용 문헌에 기술된 효소 중 어느 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 폴리펩타이드 서열을 가지는 효소이다. 동종 효소는 효소에 보존되어 있는 것으로 인식되는 아미노산 잔기를 보유한다. 동종 효소는 상이한 아미노산으로 치환되거나 발견되는 비보존된 아미노산 잔기, 또는 동종 효소의 효소 활성에 영향을 미치지 않거나 무의미한 효과를 가진 삽입 또는 결실된 아미노산(들)을 가질 수 있다. 동종 효소는 동종인 효소의 효소 활성과 동일하거나 본질적으로 동일한 효소 활성을 가진다. 동종 효소는 본 명세서 또는 인용 문헌에 기술된 효소 중 어느 하나의 효소 활성과 동일하거나 본질적으로 동일한 효소 활성을 가진다. 동종 효소는 자연에서 발견되거나 이의 조작된 돌연변이체일 수 있다.
본 발명의 핵산 작제물은 대상자 효소 중 하나 이상을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 대상자 효소의 핵산은 적합한 조건 하에서 배양된 숙주 세포에서 대상자 효소가 발현되도록 프로모터 및 선택적으로 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터 및 제어 서열은 각 숙주 세포 종에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 핵산 작제물을 포함한다. 핵산 작제물 및 발현 벡터를 설계하고 제작하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
대상자 효소를 인코딩하는 핵산 서열은, 예를 들어, 직접 화학 합성 또는 클로닝을 포함한 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조된다. 직접 화학 합성의 경우, 핵산의 폴리머의 형성은 전형적으로 3'-차단 및 5'-차단 뉴클레오타이드 모노머의, 성장하는 뉴클레오타이드 쇄의 말단 5'-하이드록실 기에 대한 순차 첨가를 수반하고, 각 첨가는 전형적으로 인 유도체, 예컨대, 포스포트리에스테르, 포스포라미다이트 등인 첨가된 모노머의 3'-위치 상에 성장하는 쇄의 말단 5'-하이드록실 기의 친핵성 공격에 의해 영향을 받는다. 이러한 방법론은 당업자에게 공지되어 있고 관련 텍스트 및 문헌에 기술되어 있다(예를 들어, 문헌[Matteuci et al. (1980) Tet. Lett. 521:719]; 미국 특허 번호 제4,500,707호; 제5,436,327호; 및 제5,700,637호에서). 또한, 기술된 서열은, 적절한 제한 효소를 사용하여 DNA를 분할하는 단계, 겔 전기영동을 사용하여 단편을 분리하는 단계, 및 이후 당업자에게 공지된 기법, 예컨대, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR; 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,683,195호)의 이용을 통해 겔로부터 원하는 핵산 서열을 회수하는 단계에 의해 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다.
원하는 대상자 효소를 인코딩하는 각 핵산 서열은 발현 벡터 내에 통합될 수 있다. 개별 핵산 서열의 통합은, 예를 들어, 발현 벡터, 예컨대, 플라스미드의 특정 부위를 절단하는 제한 효소(예컨대, BamHI, EcoRI, HhaI, Xhol, XmaI 등)의 사용을 포함하는 공지된 방법을 통해 달성될 수 있다. 제한 효소는 절단된 발현 벡터의 말단에 서열 상보성을 가진 말단을 갖거나 말단을 갖도록 합성되는 핵산 서열로 어닐링될 수 있는 단일 가닥 말단을 생산한다. 어닐링은 적절한 효소, 예를 들어, DNA 리가제를 사용하여 수행된다. 당업자에게 인지될 바와 같이, 발현 벡터와 원하는 핵산 서열 둘 모두는 종종 동일 제한 효소로 절단되어, 발현 벡터의 말단과 핵산 서열의 말단이 서로 상보성이 있는 것을 보장한다. 또한, DNA 링커는 핵산 서열의 발현 벡터로의 연결을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다.
일련의 개별 핵산 서열은 또한 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 조합될 수도 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,683,195호).
예를 들어, 각각의 원하는 핵산 서열은 별도의 PCR에서 초기에 생성될 수 있다. 이후, 특정 프라이머는 PCR 산물의 말단이 상보성 서열을 함유하도록 설계된다. PCR 산물이 혼합되고, 변성되고, 재어닐링되는 경우, 3' 말단에 대응 서열을 가진 가닥은 중첩되고 서로 프라이머로서 작용할 수 있다. DNA 폴리머라제에 의한 이러한 중첩의 연장은 원래의 서열이 함께 "스플라이싱된" 분자를 생산한다. 이러한 방식으로, 일련의 개별 핵산 서열은 함께 "스플라이싱되고", 이어서 동시에 숙주 미생물로 형질도입될 수 있다. 따라서, 각각의 복수의 핵산 서열의 발현이 실시된다.
개별 핵산 서열, 또는 "스플라이싱된" 핵산 서열은 이후 발현 벡터로 통합된다. 본 발명은 핵산 서열이 발현 벡터로 통합되는 과정과 관련하여 비제한적이다. 당업자라면 핵산 서열의 발현 벡터로의 통합에 필요한 단계에 익숙하다. 통상의 발현 벡터는, 리보솜 결합 부위, 예를 들어, 3 내지 9개의 뉴클레오타이드 길이이고, 이. 콜라이에서 개시 코돈의 상류에서 3 내지 11개의 뉴클레오타이드에 위치한 뉴클레오타이드 서열과 함께 하나 이상의 조절 영역이 선행되는 원하는 핵산 서열을 함유한다. 문헌[Shine et al. (1975) Nature 254:34 and Steitz, in Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, N.Y.] 참조.
조절 영역은, 예를 들어, 프로모터 및 오퍼레이터를 함유하는 영역을 포함한다. 프로모터는 원하는 핵산 서열에 작동적으로 연결되어, RNA 폴리머라제 효소를 통해 핵산 서열의 전사를 개시한다. 오퍼레이터는 억제 단백질이 결합할 수 있는 단백질 결합 도메인을 함유하는 프로모터에 인접한 핵산 서열이다. 억제 단백질의 부재 하에, 전사는 프로모터를 통해 개시된다. 존재하는 경우, 오퍼레이터의 단백질 결합 도메인에 특이적인 억제 단백질은 오퍼레이터에 결합되어, 전사를 개시한다. 이러한 방식으로, 전사의 제어가 사용되는 특정 조절 영역 및 상응한 억제 단백질의 존재 또는 부재를 기반으로 달성된다. 예시로 락토스 프로모터(LacI 억제 단백질은 락토스와 접촉 시 배좌가 변화되어, LacI 억제 단백질이 오퍼레이터에 결합하는 것을 방지함)를 포함한다. 또 다른 예시는 tac 프로모터이다. (문헌[deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25] 참조). 당업자에게 인지될 바와 같이, 상기 및 다른 발현 벡터는 본 발명에 사용될 수 있고, 본 발명은 이와 관련하여 비제한적이다.
임의의 적당한 발현 벡터가 원하는 서열을 통합시키는 데 사용될 수 있지만, 용이하게 이용 가능한 발현 벡터는 제한 없이 플라스미드, 예컨대, pSC101, pBR322, pBBR1MCS-3, pUR, pEX, pMR100, pCR4, pBAD24, pUC19; 박테리오파지, 예컨대, M13 파지 및 λ 파지를 포함한다. 물론, 이러한 발현 벡터는 특정 숙주 세포에만 적합할 수 있다. 하지만, 당업자라면 임의의 특정 발현 벡터가 임의의 제시된 숙주 세포에 적합한지 여부에 상관 없이 일상 실험을 통해 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 숙주 세포 내에 도입될 수 있고, 이는 이후 벡터에 함유된 서열의 생존력 및 발현에 대해 모니터링된다. 또한, 발현 벡터 및 임의의 특정 숙주 세포에 대한 적합성을 기술하는 관련 텍스트 및 문헌을 참조할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입 또는 전달되어야 한다. 발현 벡터를 숙주 세포 내로 전달하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 이. 콜라이를 발현 벡터로 형질전환시키는 한 방법은 염화칼슘 처리를 수반하고, 여기서 발현 벡터는 칼슘 침전물을 통해 도입된다. 다른 염, 예를 들어, 인산칼슘은 또한 유사한 절차 후에 사용될 수도 있다. 또한, 전기천공법(즉, 세포의 핵산 서열에 대한 투과성을 증가시키기 위한 전류 인가)은 숙주 미생물을 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 핵산 서열분석기의 현미주입은 숙주 미생물을 형질감염시키는 능력을 제공한다. 지질 복합체, 리포솜 및 덴드리머와 같은 다른 수단도 또한 사용될 수 있다. 당업자라면 상기 또는 다른 방법을 사용하여 원하는 서열로 숙주 세포를 형질감염시킬 수 있다.
형질감염된 숙주 세포를 동정하기 위해, 다양한 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 잠재적으로 형질감염된 숙주 세포의 배양물을, 적당한 희석액을 사용하여, 개별 세포 내로 분리한 후, 개별적으로 성장시키고 원하는 핵산 서열의 발현을 시험할 수 있다. 또한, 플라스미드가 사용되는 경우, 종종 사용되는 실시는 발현 벡터 내 의도적으로 함유된 유전자, 예컨대, amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여된 항미생물 내성을 기반으로 세포의 선별을 수반한다.
숙주 세포는 적어도 하나의 발현 벡터로 형질전환된다. 단일 발현 벡터만이 사용되는 경우(중간체 첨가 없이), 벡터에는 필요한 모든 핵산 서열이 함유될 것이다.
일단 숙주 세포가 발현 벡터로 형질전환되면, 숙주 세포를 성장시킬 수 있다. 미생물 숙주의 경우, 이 과정은 적합한 배지에서 세포를 배양하는 것을 수반한다. 중간체가 도입되지 않는 경우, 배양 배지가 과량의 탄소원, 예컨대, 당류(예를 들어, 글루코스)를 함유하는 것이 중요하다. 이러한 방식으로, 이소프레놀의 세포 생산이 보장된다. 첨가되는 경우, 임의의 중간체는 배양 배지에서 과량으로 존재한다.
숙주 세포로부터 변형된 이소프레놀을 추출하거나 분리하기 위한 임의의 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포를 수확하고 저장성 조건으로 처리하여 세포를 용해시킬 수 있다. 이후 용해물을 원심분리하고 상청액을 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 기체 크로마토그래피(GC)로 처리할 수 있다.
숙주 세포
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 이종 핵산이 숙주 세포 내로 도입되어 유전적으로 변형된 것이므로, 유전적으로 변형된 숙주 세포는 자연적으로 발생되지 않는다. 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 하나 이상의 효소를 인코딩하는 핵산 작제물을 발현시킬 수 있는 것이다. 효소(들)를 인코딩하는 유전자(들)는 숙주 세포에 이종성일 수 있거나 유전자는 숙주 세포에 네이티브할 수 있지만 숙주 세포에서 유전자의 더 많은 발현을 유도하는 하나 이상의 제어 영역 및 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된다.
효소는 숙주 세포에 네이티브이거나 이종성일 수 있다. 효소가 숙주 세포에 네이티브인 경우, 숙주 세포는 효소의 발현을 조절하도록 유전적으로 변형된다. 이러한 변형은 숙주 세포에서 효소를 인코딩하는 염색체 유전자의 변형을 수반할 수 있거나 효소의 유전자를 인코딩하는 핵산 작제물은 숙주 세포 내로 도입된다. 변형의 효과 중 하나는 효소의 발현이 숙주 세포에서 조절되는 것이며, 예컨대, 비변형된 숙주 세포에서의 효소의 발현에 비해 숙주 세포에서의 효소의 발현이 증가된다.
유전적으로 변형된 숙주 세포는 본 발명의 방법에 따라 이소프레놀을 생산할 수 있는 임의의 효모일 수 있다.
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 효모이다. 본 발명에 적합한 효모 숙주 세포는 야로위아(Yarrowia), 칸디다(Candida), 베바로미세스(Bebaromyces), 사카로미세스(Saccharomyces), 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 및 피키아(Pichia) 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 사카로미세스 세레비지애는 숙주 세포이다. 일 구현예에서, 효모 숙주 세포는 씨. 트로피칼리스(C. tropicalis), 씨. 말토사(C. maltosa), 씨. 아피콜라(C. apicola), 씨. 파라트로피칼리스(C. paratropicalis), 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 클로아카에(C. cloacae), 씨. 길레르몬디이(C. guillermondii), 씨. 인테르메디아(C. intermedia), 씨. 리폴리티카(C. lipolytica), 씨. 파나실로시스(C. panapsilosis) 및 씨. 제일레노이데스(C. zeylenoides)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 칸디다 종이다. 일 실시양태에서, 칸디다 트로피칼리스는 숙주 세포이다. 일부 실시양태에서, 효모 숙주 세포는 비-유지성 효모이다. 일부 실시양태에서, 비-유지성 효모는 사카로미세스 종이다. 일부 실시양태에서, 사카로미세스 종은 사카로미세스 세레비지애이다. 일부 실시양태에서, 효모 숙주 세포는 유지성 효모이다. 일부 실시양태에서, 유지성 효모는 로도스포리디움(Rhodosporidium) 종이다. 일부 실시양태에서, 로도스포리디움 종은 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides)이다.
인용된 참고 문헌(모두 각각 본원에 참조로 포함됨):
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명은 본 발명의 바람직한 특정 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 상기 설명은 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 한 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명의 범위 내 다른 측면, 장점 및 변형은 본 발명이 속한 업계의 당업자에게 자명할 것이다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공개는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명이 기술되었지만, 하기 실시예는 제한에 의해서가 아니라 예시에 의해 본 발명을 예시하려고 제공된 것이다.
실시예 1
이소프레놀 생산을 위한 사카로미세스 세레비지애의 조작
이소프레놀(3-메틸-3-부텐-1-올)은 가치 있는 드롭-인 바이오연료 및 상품 화학물질의 중요한 전구체이다. 이종성 메발로네이트 경로를 이용한 합성 미생물 시스템은 에스케리치아 콜라이에서 이소프레놀의 생산을 위해 개발되었고, 10년의 연구를 통해 상당한 수율 및 역가 개선이 달성되었다. 에스. 세레비지애는 고유한 안전성, 견고성, 및 대규모 작업의 우수한 이력을 포함하는 다수 이점들로 인해 이소프레노이드 생산을 위해 생명공학 산업에서 널리 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 숙주에서 보고된 이소프레놀 생산의 우수한 예는 없었다. 본 연구에서, 발아 효모 사카로미세스 세레비지애를 이소프레놀의 개선된 생합성을 위해 조작하였다. 조작된 메발로네이트 경로를 가진 초기 균주는 YPD에서 36 mg/L 및 최소(델프트) 배지에서 45 mg/L의 역가로 이소프레놀 생산을 개선하였다. 이. 콜라이에서 독성 중간체(즉, IPP)의 축적 없이 보다 효율적인 이소프레놀 생산을 나타낸 IPP(이소프레닐 디포스페이트)-우회 경로를 작제하였고, 이소프레놀 역가가 YPD에서 45 mg/L 및 델프트 배지에서 75 mg/L로 개선되었다. IPP-우회 경로를 통해 이소프레놀 생산을 개선하기 위해, IPP-우회 경로의 주요 중간체인 이소프레닐 포스페이트(IP)로부터 및 이소프레놀로부터 IPP를 생성함으로써 경로 플럭스를 전환시킬 수 있는 무차별적 내인성 키나제를 결실시킴으로써 균주를 조작하였다. IPP-우회 경로를 과발현시킨 녹아웃 균주는 72 시간 후에 델프트 배지에서 130 mg/L의 이소프레놀을 생산하며, 이는 대조 균주에 비해 약 2-배 개선된 것이다. 마지막으로, 대사체학 연구는 경로 병목 현상 및 이러한 병목 현상을 완화시키기 위한 무차별적 알칼리성 포스파타제의 과발현이 플라스크에서 역가를 380 mg/L로 개선하였다는 것을 시사하였다. 조작된 효모는 이소프레놀 생산을 위한 우수한 생산 시스템일 것이다.
이소프레놀(3-메틸-3-부텐-1-올)은 가치 있는 드롭-인 바이오연료 및 상품 화학물질의 중요한 전구체이다. 이종성 메발로네이트 경로를 이용한 합성 미생물 시스템은 에스케리치아 콜라이에서 이소프레놀의 생산을 위해 개발되었고, 10년의 연구를 통해 상당한 수율 및 역가 개선이 달성되었다. 에스. 세레비지애는 고유한 안전성, 견고성, 및 대규모 작업의 우수한 이력을 포함하는 다수 이점들로 인해 이소프레노이드 생산을 위해 생명공학 산업에서 널리 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 숙주에서 보고된 이소프레놀 생산의 우수한 예는 없었다. 본 연구에서, 발아 효모 사카로미세스 세레비지애를 이소프레놀의 개선된 생합성을 위해 조작하였다. 조작된 메발로네이트 경로를 가진 초기 균주는 YPD에서 36 mg/L 및 최소(델프트) 배지에서 45 mg/L의 역가로 이소프레놀 생산을 개선하였다. 이. 콜라이에서 독성 중간체(즉, IPP)의 축적 없이 보다 효율적인 이소프레놀 생산을 나타낸 IPP(이소프레닐 디포스페이트)-우회 경로를 작제하였고, 이소프레놀 역가가 YPD에서 45 mg/L 및 델프트 배지에서 75 mg/L로 개선되었다. IPP-우회 경로를 통해 이소프레놀 생산을 개선하기 위해, IPP-우회 경로의 주요 중간체인 이소프레닐 포스페이트(IP)로부터 및 이소프레놀로부터 IPP를 생성함으로써 경로 플럭스를 전환시킬 수 있는 무차별적 내인성 키나제를 결실시킴으로써 균주를 조작하였다. IPP-우회 경로를 과발현시킨 녹아웃 균주는 72 시간 후에 델프트 배지에서 130 mg/L의 이소프레놀을 생산하며, 이는 대조 균주에 비해 약 2-배 개선된 것이다. 마지막으로, 대사체학 연구는 경로 병목 현상 및 이러한 병목 현상을 완화시키기 위한 무차별적 알칼리성 포스파타제의 과발현이 플라스크에서 역가를 380 mg/L로 개선하였다는 것을 시사한다. 조작된 효모는 이소프레놀 생산을 위한 우수한 생산 시스템일 것이다.
본 연구에서, 발아 효모 에스. 세레비지애를 이소프레놀의 개선된 생합성을 위해 조작하였다. 에스. 세레비지애에서 원래의 MVA 경로 및 IPP-우회 경로를 조작하였다. 특히, IPP-우회 경로를 통해 이소프레놀 생산을 개선하기 위해, IPP-우회 경로의 주요 중간체인 이소프레닐 포스페이트(IP)로부터 및 이소프레놀로부터 IPP를 생성함으로써 경로 플럭스를 전환시킬 수 있는 무차별적 내인성 키나제를 결실시킴으로써 균주를 조작하였다. 대사체학 분석을 사용하여, 경로 병목 현상으로서 IP의 이소프레놀로의 가수분해, 및 이소프레놀 역가를 유의하게 개선하는 무차별적 포스파타제가 스크리닝되는 최종 단계가 확인된다.
결과 및 논의
원래의 MVA 경로를 이용한 이소프레놀 경로의 설계
에스. 세레비지애에서 이소프레놀을 생산하기 위해, 내인성 MVA 경로를 사용하는 경로를 먼저 고려하였다. 흥미롭게도, 이소프레노이드 생합성 경로를 사용한 에스. 세레비지애에서의 이소프레놀 생산에 관한 연구에 이용 가능한 문헌(석사 논문)은 단 하나였으며(Pham, 2015), 이 연구에서 저자는 에스. 세레비지애에서 내인성 MVA 경로를 사용하였고 이. 콜라이에서 이전에 보고된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(NudF)로부터의 포스파타제를 과발현시켜 이소프레놀 및 프레놀을 생산하였다(Withers et al., 2007, Pham, 2015). 그러나, 이 작업에서, 이소프레놀은 매우 낮은 역가(40 μg/10 mL 중량 세포 부피)로만 생산되었고, 저자는 이러한 낮은 역가가 세포막을 빠르게 파괴할 수 있는 이소프레놀 및 프레놀의 독성 때문이라고 설명하였다.
효모에서의 이소프레놀 생산을 위한 첫 번째 전략에서, 원래의 MVA 경로를 통한 에스. 세레비지애에서의 이소프레놀 생산을 위한 경로(도 1)를 마찬가지로 설계하였다. IPP는 스테롤, 유비퀴논, 돌리콜, 및 이소프레노이드의 합성에 사용되기 때문에 에스. 세레비지애에서 중요한 대사산물이지만, 세포질 IPP 수준은 이소프레놀의 고수준 생산을 위해 충분히 높지 않을 수 있는 것으로 추정된다. IPP 풀을 증가시키기 위해, MVA 경로 효소를 천연 또는 상이한 종으로부터의 경로 유전자의 더 많은 카피를 첨가함으로써 과발현시켰다. 5개의 유전자(엔테로코커스 패칼리스로부터의 EfmvaE 및 Efmvas, 및 에스. 세레비지애로부터의 ERG8sc, ERG12sc 및 ERG19sc)를 숙주 게놈 상에 통합하였다(도 2(패널 a)). IPP의 이소프레놀로의 가수분해에 NudF를 사용하는 대신, 이전에 보고된 바와 같이, 이. 콜라이로부터의 무차별적 포스파타제 NudB 및 AphA에 의한 2 단계 가수분해를 사용하였다(Kang et al., 2016). 무차별적 포스파타제 NudB를 TEF 프로모터 하에 2-마이크론 고-카피 플라스미드 상에서 발현시켰다.
원래의 MVA 경로를 통한 이소프레놀 생산의 초기 평가
야생형 균주는 플라스미드 상에서의 NudB 과발현에 관계없이 YPD 배지에서 이소프레놀을 임의의 검출 가능한 수준으로 생산하지 않았다(도 3(패널 a)의 WT 및 JHK2). 이. 패칼리스(EfmvaE 및 Efmvas) 및 NudB로부터의 MVA 경로의 상단 부분을 과발현시키는 균주(JHK11)는 YPD에서도 이소프레놀을 생산하지 않았다. 이러한 결과는 IPP가 단지 상단 부분의 과발현에 의해 이소프레놀을 생산하기에 충분히 생산되지 않는 다는 것을 가리킨다. 2개 초과의 유전자(ERG12sc 및 ERG19sc)가 게놈으로부터 과발현되었고, 이러한 균주(JHK15)는 이소프레놀을 생산하기 시작하지만 역가는 여전히 매우 낮았다(4 mg/L 미만)(도 3(패널 a)). MVA 경로의 모든 5개 유전자가 게놈 상에 통합될 때, 이러한 균주(JHK18)는 36 mg/L의 이소프레놀을 생산하였는데, 이는 이러한 실험에서 YPD 배지에서 달성된 원래의 MVA 경로에 대한 가장 높은 이소프레놀 역가이다(도 3(패널 a)).
이러한 균주는 IPP로부터 DMAPP를 생산할 수 있는 내인성 IPP 이소머라제(IDI)를 포함하기 때문에, 이러한 균주는 또한 DMAPP로부터 생산된 이소프레놀의 이성질체인 프레놀을 생산할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 흥미롭게도, 프레놀은 검출되지 않았으며, 프레놀이 생산되지 않은 이유에 대한 제안은 다음과 같다. 첫째로, 세포질 DMAPP 수준은 검출 가능한 수준으로 프레놀의 생산을 위해 충분히 높지 않을 수 있다. 이는 IPP 및 DMAPP의 비율이 IDI에 의해 조절되고 본질적으로 비율이 DMAPP보다 훨씬 더 많은 IPP로 유지되기 때문에 타당하다(Rohdich et al., 2002, Withers and Keasling, 2007). 둘째로, 소량의 프레놀이 생산되더라도, 내인성 NemA 효소를 사용하여 이. 콜라이에서 이전에 나타낸 바와 같이 프레놀은 에스. 세레비지애에 대한 무차별적 환원효소에 의해 이소펜탄올로 전환될 수 있다(George et al., 2015, Chou and Keasling, 2012).
DMAPP로부터의 이소펜탄올 생산을 확인하기 위해, YPD에서 가장 우수한 이소프레놀 생산 균주(JHK18)를 최소 배지(델프트 배지)에서 배양하였다. YPD(효모 추출물로부터)에 존재하는 류신이 에를리히 경로를 통해 이소펜탄올로 전환될 수 있기 때문에 최소 배지를 사용하였다(도 1). 균주 JHK18은 델프트 배지로부터 12 mg/L의 이소펜탄올을 생산하는 반면, 대조 균주(JHK17)는 임의의 이소펜탄올을 생산하지 않았는데(도 4(패널 a)), 이는 예측된 바와 같았다. 이러한 결과는 DMAPP로부터 생산되는 소량의 프레놀이 미지의 무차별적 환원효소에 의해 이소펜탄올로 전환될 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
흥미롭게도, 이소프레놀 생산은 YPD 배지로부터의 생산 역가와 비교하여 델프트 배지에서 증가하였다. 균주 JHK18은 72 시간에 델프트 배지에서 45 mg/L의 이소프레놀을 생산하였다(도 3(패널 b)). 델프트 배지에서의 역가와 비교하여 YPD 배지에서 더 낮은 역가를 설명하기 위해, YPD 배지에서 류신, 이소류신, 및 발린과 같은 분지쇄 아미노산이 내인성 알칼리성 포스파타제를 억제하고 IPP의 가설에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다는 것이 가정된다. 에스. 세레비지애에서 류신 효과의 메커니즘이 검증되지 않았음에도 불구하고 포유동물 시스템에서 알칼리성 포스파타제 활성에 대한 분지쇄 아미노산의 효과를 보고하는 여러 문헌이 있다(Boyd et al., 2019, Hoylaerts et al., 2006, Hoylaerts et al., 1992). 효모에서 류신 효과를 시험하기 위해, 1 g/L의 류신이 보충된 델프트 배지에서 세포를 배양하였다. 과량의 류신으로 균주 JHK18은 18 mg/L의 이소프레놀을 생산하였는데, 이는 이소프레놀 생산을 2.5-배 감소시켰고(도 4(패널 b)), 이러한 결과는 효모 추출물로부터의 과량의 류신이 YPD에서 이소프레놀 생산을 억제할 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 에스. 세레비지애에서 류신 효과가 확인됨에 따라, 델프트 배지를 에스. 세레비지애에서의 모든 이소프레놀 생산 작업에 사용하였다.
이소프레놀 생산을 위한 IPP-우회 경로(IBP)의 설계
원래의 MVA 경로 균주(JHK18)는 단지 낮은 역가의 이소프레놀을 생산하기 때문에, 이소프레놀 생산을 개선하기 위해 최근에 보고된 IPP-우회경로(IBP)가 설계되었다(Kang et al., 2016). IBP는 비-천연 기질 MVAP를 향한 PMD(ERG19)의 무차별적 활성을 기반으로 설계되며, 원래의 MVA 경로와 비교하여 이소프레놀 생산을 위해 하나의 ATP 및 하나의 효소(PMK 또는 ERG8)를 저장할 수 있다(도 1). 에스. 세레비지애로부터의 PMD(ERG19sc)는 MVAP를 IP로 전환시키는 것으로 이전에 보고된 바 있다(Kang et al., 2016).
에스. 세레비지애에서 IBP를 작제하기 위해, 4개의 MVA 경로 유전자(이. 패칼리스로부터의 2개의 이종성 유전자(EfmvaE, EfmvaS) 및 2개의 내인성 효모 유전자(ERG12sc 및 ERG19sc))를 갈락토스 프로모터 GAL1 및 GAL10 하에 효모 게놈 상에 통합하였다(도 2). ERG19sc의 무차별적 활성은 이. 콜라이 IBP에서 속도-제한적인 것으로 알려져 있으므로, 고 카피 2-마이크론 플라스미드 상의 ERG19sc는 도 2(패널 b)에 도시된 바와 같이 강한 TEF3 프로모터 하에 과발현되었다.
IBP는 ERG19sc에 의해 IP를 생산하기 위해 MVAP의 축적을 필요로 하기 때문에, 천연 기질이 MVAP인 내인성 효소 PMK(또는 ERG8sc)의 활성을 녹아웃시키거나 녹다운시킬 필요가 있다. 그러나, ERG8sc는 내인성 MVA 경로에서 중요한 유전자이고, ERG8sc-녹아웃 균주는 이소프레노이드의 보편적인 전구체인 IPP를 제공하는 또 다른 경로가 없는 한 성장할 수 없을 것이다. 따라서, 대안적인 경로는 이. 콜라이에서 IP를 IPP로 인산화시키는 것으로 나타낸 메타노써모박터 써마우토트로피쿠스로부터의 고세균 IP 키나제(IPK)를 사용하여 게놈에서 ERG8sc를 녹아웃시킨 후 IPP를 제공하도록 설계된다(Kang et al., 2017).
IPP-우회 경로(IBP)를 통한 이소프레놀 생산의 초기 평가
원래 경로 균주에 대한 이전 섹션의 결과에 기초하여, IBP 균주를 YPD 및 델프트 배지 둘 모두에서 배양하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 플라스미드 상에서 과발현된 ERG19sc를 가진 야생형 균주(JHK1)는 임의의 검출 가능한 수준의 이소프레놀을 생산하지 않았다. 이. 패칼리스(EfmvaS 및 EfmvaE)로부터의 MVA 경로의 상단 부분이 플라스미드 상의 ERG19sc뿐만 아니라 게놈으로부터 과발현될 때, 이러한 IBP 균주(JHK12)는 5 mg/L 미만의 역가로 이소프레놀을 생산하기 시작하였다. 다른 2개의 경로 유전자(ERG12sc 및 ERG19sc)가 또한 통합되고 게놈으로부터 과발현될 때, 이러한 균주(JHK16)는 72 시간 후에 YPD에서 45 mg/L의 이소프레놀(도 5(패널 a)) 및 72 시간 후 델프트 배지에서 75 mg/L의 이소프레놀(도 5(패널 b))을 생산하였는데, 이는 원래의 MVA 경로 균주로부터의 역가에 비해 각각 1.8-배 및 1.3-배 개선이다.
IBP 균주(JHK16)는 원래의 MVA 경로 균주보다 이소프레놀 생산에 더 효율적인데, 이는 아마도 ERG19sc가 고도로 과발현될 때 ERG8sc(또는 PMK)의 천연 기질 및 ERG19sc의 새로운 기질인 MVAP가 IPP-우회 경로를 통한 이소프레놀 생산에 주로 사용되기 때문일 것이다. 다른 한 편으로, MVAP는 IPP가 성장을 위한 다양한 이소프레노이드 및 중성 지질의 합성에 사용되기 때문에 원래 MVA 경로에서 IPP 생산에 주로 사용된다. ERG19sc 과발현은 유효한 MVA 경로에 의해서도 IPP 생산을 위한 천연 MVA 경로로부터 이소프레놀 생산을 위한 IPP-우회 경로로 플럭스를 재지정하기에 충분하다는 것이 주목할 만하다(ERG8sc의 결실에 의한 원래의 MVA 경로는 녹아웃 또는 녹다운되지 않기 때문에).
IPP-우회 경로가 잘 작동하고 에스. 세레비지애에서 이소프레놀 생산을 위한 원래의 MVA 경로보다 더 나은 것으로 나타난 것이 확인됨에 따라, 이소프레놀 역가를 개선하기 위한 추가 조작을 위한 IBP 균주를 계속 사용하였다.
5-포스포메발로네이트 키나제(ERG8sc) 및 콜린 키나제(CK)의 녹아웃
IPP-우회 경로에서 속도-제한 효소(ERG19sc)의 기질인 높은 수준의 MVAP를 달성하기 위해, ERG12sc(메발로네이트 키나제)에 의한 MVAP 형성은 증가될 수 있거나 MVA 경로에서 ERG8sc(메발로네이트 포스페이트 키나제)에 의한 MVAP 소비가 감소될 수 있다. 첫 번째 시도는 IBP 균주에서 ERG8sc를 녹아웃시킴으로써 MVAP의 원치 않는 소비를 줄이는 데 중점을 두었다(도 6). ERG8sc는 에스. 세레비지애에서 IPP를 생산하는 데 있어서 필수 유전자이기 때문에, ERG8sc 녹아웃 균주는 IPP에 대한 대안적인 경로가 제공되는 배지에서 성장하지 않을 것이다. ERG8sc 녹아웃 균주에서 성장을 위한 IPP를 공급하기 위해, 엠. 써마우토트로피쿠스로부터의 IP 키나제(IPK)는 IPP-우회 경로에서 IP의 IPP로의 인산화에 사용된다(Kang et al., 2017).
예상된 바와 같이, 이종성 IPK를 가진 ERG8sc 녹아웃 균주(JHK27)는 델프트 배지에서 성장할 수 있다. 그러나, 이러한 균주는 도 7(패널 a 및 b)에 도시된 바와 같이 이소프레놀을 단지 매우 적게 생산한다. 놀랍게도, ERG8sc 녹아웃 균주(JHK26)는 또한 IPK 발현 없이도 서서히 성장하기 시작하는 것으로 관찰되었다(도 7(패널 a)). 이러한 관찰은 MVAP, IP, 또는 심지어 이소프레놀을 인산화시켜 ERG8sc 녹아웃 균주에서 IPP를 생산할 수 있는 추정상의 키나제가 있다는 것을 시사한다. 추정상의 키나제를 찾아볼 때, "2-단계" 이소프레노이드 합성에 대한 무차별적 활성 키나제를 보고하는 문헌(Chatzivasileiou et al., 2019)이 확인된다. 이 보고서에서, 저자들은 이소프레놀 및 프레놀이 여러 무차별적 키나제에 의해 IPP 및 DMAPP로 전환될 수 있고, 이들 중에서, 에스. 세레비지애로부터의 콜린 키나제(CK)가 이소프레놀을 사용하여 상당량의 IPP 및 IP를 생산할 수 있다고 보고하였다(Chatzivasileiou et al., 2019). 이러한 정보로, CK 녹아웃 균주는 IP 및 이소프레놀의 IPP로의 잠재적인 전환을 방지하도록 작제되었다(도 6). 130 mg/L의 이소프레놀 역가는 콜린 키나제를 녹아웃시키기 전에 CK 녹아웃 균주(JHK22)에 의해 72 시간 동안 델프트 배지에서, 대조 균주(JHK16)에 비해 2-배 개선으로 달성되었다(도 7(패널 d)). 이러한 결과는 CK가 에스. 세레비지애에서 IP 및 이소프레놀을 IPP로 인산화시킬 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 예상된 바와 같이, CK와 ERG8sc 둘 모두가 녹아웃된 균주 JHK24는 YPD(데이터는 포함되지 않음) 또는 델프트 배지(도 7(패널 c))에서 성장하지 않았다. 예상된 바와 같이, IPK 통합을 가진 이중 녹아웃 균주(JHK28)는 긴 지연 및 대수기로 서서히 성장하지만, 이는 어떠한 이소프레놀도 생산하지 않았다(도 7(패널 c 및 d)). 이는 아마도 IPK에 의한 IPP로의 IP 전환의 낮은 효율 때문이며, 변형된 MVA 경로를 통한 IPP의 회복된 생산(즉, IPK 발현을 가진 ΔCK ΔERG8sc)은 아마도, 이소프레놀 생산을 위한 IP 및 세포 생존을 위한 IPP의 비율을 제어하는 것은 어려운 것으로 보이기 때문에, 생존에 충분하지만 이소프레놀 생산에는 충분하지 않은 것으로 결론지어진다. 따라서, 이소프레놀을 생산하기 위한 추가 변형 및 조작을 위해 IBP 배경 균주로서 ERG8sc(JHK22)를 녹아웃시키지 않고 CK 녹아웃 균주를 사용하는 것으로 결론지어진다.
IPP-우회 경로 균주의 대사산물 분석
이소프레놀 생산 경로의 병목 현상을 확인하고 경로 조작 방향을 결정하기 위해, IPP-우회 경로 균주의 MVA 경로 대사산물을 분석하였다. 대사체학 분석을 위해, IPP-우회 경로를 통해 유사한 성장 패턴 및 비교적 우수한 이소프레놀 생산을 나타내지만 CK 유전자의 존재만이 상이한 2개의 균주(JHK16 및 JHK22)를 선별하였다. 접종 후 24 시간, 48 시간, 및 72 시간(비교: 유도제가 12 시간에 첨가되었음)에 MVA 경로 중간체(MVA, MVAP, MVAPP, IP/DMAP, 및 IPP/DMAPP)뿐만 아니라 이들의 OD 및 이소프레놀 역가의 수준(도 8).
CK 녹아웃 균주(JHK22)의 성장 속도 및 최종 OD는 대조 균주(JHK16)의 성장 속도 및 최종 OD보다 약간 낮고, 이소프레놀 역가는 JHK22 균주의 경우 72 시간에 130 mg/L에 도달한 반면, 대조 균주는 75 mg/L를 생산하였다(도 8(패널 a 및 b)). 대조 균주(JHK16)의 경로 중간체의 분석은 MVA 및 MVAP(MVAP에 대해 큰 오차 막대가 있더라도)가 48 시간에 축적되고 그 후 빠르게 감소하는 것을 보여주어, 이들이 에탄올 단계 동안 스테롤 및 이소프레노이드를 생산하는 데 사용된다는 것을 시사하였다(도 8(패널 c 및 d)). 다른 한 편으로, 세포내 MVA 및 MVAP 수준은 CK 녹아웃 균주(JHK22)에서 반대 경향을 나타냈다. MVA 및 MVAP 수준은 48 시간에 대조 균주에서보다 낮지만, 수준은 JHK22에서 48 시간에서 72 시간으로 지속적으로 증가하였는데, 이는 MVA 경로가 CK 녹아웃 균주에서 에탄올 단계 동안 여전히 상당히 활성이라는 것을 시사한다. 이는 이러한 균주에서 이소프레노이드 생산을 위한 필수 대사산물인 IPP의 부족으로 설명될 수 있다. ERG19sc가 이러한 균주에서 과발현되기 때문에, 내인성 ERG8sc에 의한 MVAP에서 MVAPP로의 플럭스는 야생형 효모의 플럭스보다 훨씬 작을 것으로 예상된다. 따라서, 필수 이소프레노이드 생산을 위한 IPP의 공급은 IBP 균주에서 충분하지 않을 것이며, 이러한 부족을 완화하기 위해, IPP는 CK의 무차별적 활성을 이용한 IP의 인산화에 의해 또는 MVA 경로의 자극에 의해 추가로 공급되어야 한다. 균주 JHK22에서, CK가 결실되고 IPP 공급은 MVA 경로에만 의존해야 하므로 첫 번째 시나리오는 이루어지지 않고, 이는 에탄올 단계 동안 MVA 및 MVAP의 증가를 설명할 수 있다. 그리고 이러한 설명은 두 균주 모두에서 MVAPP가 거의 검출되지 않았다는 도 8(패널 e)에 도시된 결과와 일치한다.
대사체학 분석의 가장 흥미로운 결과는 IPP-우회 경로에서 다른 경로 대사산물보다 몇 자리수 높은 IP 수준이다. 특히, 48 시간 후 IP 수준은 CK 녹아웃 균주에서 400 mM까지 IP의 유의한 증가 및 막대한 축적을 나타냈고, 반면에 대조 균주의 IP 수준은 어떠한 유의한 증가 없이 약 50 mM로 유지되었다(도 8(패널 f)). 첫째로, 고수준의 IP의 결과는 ERG19sc 과발현이 IP로의 다른 경로가 없기 때문에 MVAP의 IP로의 전환을 유의하게 개선한다는 것을 시사한다. IP 수준은 48 시간까지 두 균주 모두에서 유사했지만, 균주 JHK22의 MVA 경로는 상기 기재된 바와 같이 에탄올 단계 동안 여전히 활성이었다. 결과적으로, 이 균주는 ERG8sc의 수준에 비해 유의하게 더 높은 수준의 ERG19sc로 인해 대부분 IP로 전환되는 MVAP를 계속 생산한다. MVAP의 작은 부분만이 IPP 수준을 증가시키기 위해 사용되기 때문에, 균주는 MVA 경로를 더 강하게 푸시하고 더 많은 IPP를 생산하기 위해 더 많은 에너지 및 자원을 사용할 수 있으며, 이에 의해 IP 생산이 훨씬 더 많아진다.
CK 녹아웃 균주(JHK22)에서 IP 수준은 고수준의 이소프레놀 생산에 충분해야 한다. 그러나, 이러한 균주는 단지 약 130 mg/L의 이소프레놀을 생산하며, 이는 IP의 이소프레놀로의 가수분해를 담당하는 포스파타제가 현재 이소프레놀 균주의 병목 현상이라는 것을 시사한다. 에스. 세레비지애애에서 내인성 포스파타제의 무차별적 활성이 의존적이기 때문에, IP 가수분해에서 더 효율적이고 IBP 균주의 이러한 병목 현상을 완화시킬 수 있는 무차별적 포스파타제를 찾는 것이 중요한 공학 과제가 될 것이다.
IPP-우회 경로를 통한 이소프레놀 생산을 위한 무차별적 포스파타제의 검증
IP 가수분해를 위한 임의의 추가 포스파타제를 과발현시키지 않으면서, CK 녹아웃 균주는 내인성 포스파타제를 사용하여 여전히 이소프레놀을 생산할 수 있지만, 역가는 여전히 낮다. 대사체학 데이터는 CK 녹아웃 균주에서 상당한 IP 축적이 있다는 것을 보여준다. 이소프레놀로의 IP 가수분해는 아마도 내인성 포스파타제가 IP 가수분해를 향해 약한 활성을 가지기 때문에 이러한 CK 녹아웃 효모 균주에서 IPP-우회 경로를 통한 이소프레놀 생산의 병목 현상이 될 것으로 가정된다.
이. 콜라이에서 수행된 이전 연구에서, 단일 유전자 녹아웃 돌연변이체 라이브러리를 사용한 무차별적 IP 가수분해 활성에 대한 스크리닝으로부터 여러 내인성 포스파타제(AphA, Apg, 및 YqaB)가 확인된다(Kang et al., 2016). 이소프레놀 역가는 이러한 포스파타제(AphA) 중 하나가 조작된 이. 콜라이에서 과발현될 때 증가한다. 효모 이소프레놀 균주에서 IP 가수분해를 개선하기 위해, 무차별적 포스파타제 활성에 대해 이전에 보고된 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애로부터의 15개의 포스파타제를 시험하였다. 이. 콜라이로부터 유래된 4개의 포스파타제는 아미노글리코시드-3-포스포트랜스페라제(AphA), 글루코스-1-포스파타제(Agp), 프룩토스-1-포스페이트 포스파타제(YqaB)(Kang et al., 2016), 및 알칼리성 포스파타제(PhoA)를 포함하고, 에스. 세레비지애로부터 유래된 11개의 포스파타제는 당 알코올 포스파타제(PYP1)(Xu et al., 2018), 포스파티데이트 포스파타제(PAH1)(Han et al., 2006), 글리세롤-3-포스파타제(GPP1 및 GPP2), 세린/트레오닌 포스파타제(GLC7), 산 포스파타제(PHO3 및 PHO5), 알칼리성 포스파타제(PHO8 및 PHO13), 지질 포스페이트 포스파타제(LPP1)(Faulkner et al., 1999), 및 디아실글리세롤 포스페이트 포스파타제(DPP1)(Faulkner et al., 1999)를 포함하였다. 포스파타제 유전자를 구성적 프로모터(pGK1)의 제어 하에 ERG19sc를 발현시키는 고-카피 플라스미드 상에 개별적으로 클로닝하였다.
9개의 포스파타제(PYP1, GLC7, PAH1, GPP1, GPP2, LPP1, DPP1, PHA1, 및 Agp)가 IPP-우회 경로로 CK 녹아웃 효모 균주에서 개별적으로 발현될 때, 성장 속도 및 이소프레놀 역가는 대조 균주(JHK22)와 유사하거나 이보다 약간 더 낮았다(도 9). 흥미롭게도, 이. 콜라이에서 이소프레놀을 생산하는 것으로 보고된 가장 우수한 포스파타제인 AphA의 발현은 성장에 부정적인 영향을 나타내고, 대조와 비교하여 이소프레놀 역가를 개선하지 않았다. 에스. 세레비지애는 상이한 특이성, 세포 위치, 및 무기 포스페이트(Pi) 흡수에 사용되는 투과효소를 가진 여러 포스파타제를 가진다(Dick et al., 2011). 이러한 포스파타제의 활성은 본질적으로 Pi 항상성과 연관성이 있으며, 이들은 다양한 Pi 수준에 반응하여 Pi 신호 전달 경로(PHO)를 통한 조절을 거친다(Persson et al., 2003, Dick et al., 2011). 에스. 세레비지애로부터의 PHO3 및 PHO5와 같은 산 포스파타제의 경우, 이소프레놀 역가는 균주에서 48 시간 후에 빠르게 감소한다. 이는 산 포스파타제가 IP 가수분해로 인해 높은 Pi 농도에서 불활성화될 수 있기 때문에 산 포스파타제가 다른 포스파타제보다 더 빨리 이들의 활성을 잃을 수 있다는 것을 시사한다. 이소프레놀 역가는 PHO13 발현에 의해서도 증가하지 않는다. 일반적으로, PHO13은 pH 8에서 p-글리콜레이트, 리보스-5-포스페이트, 및 4-니트로페닐 포스페이트와 같은 작은 중간체를 향해 무차별적 활성을 가지며(Kuznetsova et al., 2015), 세포내 pH는 델프트 배지에서 이소프레놀을 생산하기에 PHO13에 대해 최적이 아닐 수 있다(pH 6.5로 조정). PHO8이 과발현될 때, 이소프레놀 역가는 약 20% 증가하였다. YqaB를 가진 균주는 또한 PHO8과 유사한 수준으로 약간의 이소프레놀 역가 증가를 야기하지만, 이들의 역가는 포스파타제 발현에 의한 유익한 효과를 결론짓기에 여전히 충분히 높지 않았다.
가장 흥미로운 결과는 이. 콜라이로부터의 알칼리성 포스파타제인 PhoA를 과발현시키는 균주에서 달성되었다. PhoA가 균주 PHOA에서 과발현될 때, 이소프레놀 역가는 유의하게 증가하고 대조의 약 300%인 380 mg/L에 도달하였다(도 9). PhoA가 이. 콜라이에서 시도된 이전 스크리닝에서 IP 가수분해를 위한 중요한 무차별적 포스파타제로서 확인되지 않았다는 것이 흥미롭다(Kang et al., 2016). PhoA로의 시험관내 동역학 연구가 수행되지 않았고 PhoA가 어떻게 에스. 세레비지애에서 IP 가수분해를 위한 가장 우수한 포스파타제가 되는지는 여전히 명확하지 않지만, PHOA 균주가 지금까지 에스. 세레비지애 균주를 생산하는 가장 높은 이소프레놀이라는 것은 분명하고, PhoA 발현을 개선하고 ERG19sc 수준과 PhoA 수준의 균형을 맞추는 것과 같이 균주 최적화를 위한 더 많은 노력이 역가를 더 증가시키기 위해 후속될 것이다.
결론
최근, 이소프레놀(3-메틸-3-부텐-1-올)은 바이오연료 및 바이오제품 분야에서 많은 관심을 얻었다. 본 연구에서, 이소프레놀을 생산하기 위한 에스. 세레비지애의 성공적인 대사 조작이 보고된 바 있다. 원래의 MVA 경로의 조작은 MVA 경로 및 무차별적 포스파타제 NudB의 과발현에 의한 이소프레놀 생산을 위해 먼저 시도된다. 원래 경로의 균주는 델프트 배지에서 약 45 mg/L의 이소프레놀을 생산할 수 있는데, 이는 이전에 보고된 역가로부터 유의한 개선이지만, IPP는 효모에서 다양한 다른 이소프레노이드 생산을 위한 주요 중간체이기 때문에 역가는 여전히 아마도 이소프레놀 생산에 있어서 IPP 축적의 어려움으로 인해 임의의 추가 적용에 충분히 높지 않다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 비-천연 기질 MVAP를 향한 ERG19(PMD)의 무차별적 활성을 이용함으로써 IPP-우회 경로가 이소프레놀 생산을 위해 개발되었고, 초기 IPP-우회 경로 균주는 이소프레놀을 델프트 배지에서 75 mg/L의 역가로 생산하였다. ERG8(PMK)을 녹아웃시킴으로써 MVAP를 축적하려는 이러한 실험에서의 시도는 성공적이지 않았지만, 효모에서 이소프레놀 생산에 부정적인 영향을 미치는 주요 내인성 키나제(콜린 키나제, CK)가 검출되었다. 따라서, CK 녹아웃 균주가 작제되었고, 이들은 72 시간 후에 130 mg/L의 이소프레놀을 생산하였다. 대사체학 데이터를 사용하여, 경로 병목 현상이 IP의 이소프레놀로의 가수분해인 마지막 단계인 것으로 확인되었고, IP 가수분해를 개선하기 위해, 무차별적 활성에 대해 보고된 15개의 포스파타제를 선별하고 시험하였다. 이. 콜라이로부터의 PhoA의 발현은 이소프레놀 역가를 유의하게 개선한 것으로 밝혀졌다. 결과로서 플라스미드 상에서 과발현된 ERG19 및 PhoA를 가진 CK 녹아웃 균주를 사용하여 380 mg/L의 이소프레놀 역가가 달성되었다. 바이오매스 가수분해물 이용을 위한 추가 경로 최적화 및 숙주 조작으로, 효모는 상업적으로 실행 가능한 방식으로 이소프레놀 및 관련 C5 화합물 생산을 위한 가치 있는 플랫폼을 제공할 수 있을 것이다.
재료 및 방법
사용된 균주 및 플라스미드는 표 1 및 2에 제시되어 있다.
[표 1] 본 실시예에서 사용된 균주.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 2] 본 실시예에서 사용된 플라스미드.
Figure pct00008
에스. 세레비지애 CEN.PK2-1C(MATa; ura3-52; trp1-289; leu2-3_112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2)를 모든 작제물에 대한 배경 균주로 사용하고, 이. 콜라이 DH1을 사용하여 재조합 플라스미드를 증식시켰다. 그리고, 에스. 세레비지애 CEN.PK2-1C 게놈을 모든 선형 DNA 및 플라스미드의 작제에 사용하였다. 모든 화학물질은 달리 언급되지 않는 한 Sigma Aldrich(Sigma-Aldrich, USA)로부터 구입된다.
원래 경로 및 IPP-우회 경로(IBP) 균주의 작제
원래의 MVA 경로를 통해 이소프레놀을 생산하기 위해, 5개의 경로 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG8sc, ERG12sc, 및 ERG19sc)를 게놈 상에 통합하였다. 모든 표적 유전자, 프로모터 및 종결자를 에스. 세레비지애 게놈으로부터 증폭시켰다. EfmvaE 및 EfmvaS를 URA 유전자좌 상의 URA 선별 마커와 통합되고 갈락토스 프로모터(pGal)의 제어 하에 발현시켰다. ERG12sc 및 ERG19sc를 류신(LEU) 유전자좌 상의 히스티딘(HIS) 선별 마커와 통합하고 pGal의 제어 하에 발현시켰다. ERG8sc를 Gal1 유전자좌에서 트립토판(TRP) 선별 마커와 통합하고 pGal의 제어 하에 발현시켰다. 갈락토스 프로모터를 사용하기 위해, GAL1, GAL7, 및 GAL10을 게놈으로부터 결실시켰다. 표적 유전자의 통합 및 결실을 위해, 500 개의 염기쌍(bp) 상동성 아암(HA), 선별 마커, 프로모터 및 종결자를 가진 표적 유전자를 포함하는 선형 DNA를 Gibson 어셈블리 키트(NEB, 영국)를 사용하여 조립하였다. 상동성 재조합효소를 사용하여 표적 영역 상에 조립된 선형 DNA를 통합하였다. LEU 선별 마커로 고 카피(2 마이크론) 플라스미드 상에서 NudB를 발현시켰다.
IBP 균주의 작제를 위해, 4개의 경로 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)를 게놈 상에 통합하였다. 모든 표적 유전자, 프로모터 및 종결자를 에스. 세레비지애 게놈으로부터 증폭시켰다. EfmvaE 및 Efmvas를 URA 유전자좌 상의 URA 선별 마커와 통합하고 pGal의 제어 하에 발현시켰다. ERG12sc 및 ERG19sc를 류신(LEU) 유전자좌 상의 히스티딘(HIS) 선별 마커와 통합하고 pGal의 제어 하에 발현시켰다. 갈락토스 프로모터를 사용하기 위해, GAL1, GAL7, 및 GAL10을 결실시키고 TRP 선별 마커를 GAL1 유전자좌에 삽입하였다. LEU 선별 마커로 고 카피(2 마이크론) 플라스미드 상에서 ERG19sc를 발현시켰다.
세포 배양 조건
영양요구성-스크리닝 조건(SC, 우라실 20 mg/L, 히스티딘 20 mg/L, 트립토판 20 mg/L 및 류신 100 mg/L) 하에 합성 완전 배지 또는 항생제 스크리닝(G418 200 mg/L)이 있는 효모 추출물 펩톤 글루코스(YPD) 배지에서 조작된 효모를 선별하였다. YPD 및 델프트 배지를 에스. 세레비지애로부터의 이소프레놀 생산에 사용하였다. YPD는 다음을 함유하였다(L-1): 20 g의 글루코스, 10 g의 효모 추출물, 및 20 g의 펩톤. 델프트 배지는 다음을 함유하였다((L-1): 7.5 g의 (NH4)2SO4, 14.4 g의 KH2PO4, 0.5 g의 MgSO4ㆍ7H2O, 20 g의 글루코스, 2 mL의 미량 금속 용액, 및 1 mL의 비타민. 오토클레이브 전에 pH를 6.5로 조정하였다. 오토클레이브 후 비타민 용액을 델프트 배지에 첨가하였다. 미량 금속 용액은 다음을 함유하였다(L-1): 4.5 g의 CaCl2ㆍ2H2O, 4.5 g의 ZnSO4ㆍ7H2O, 3 g의 FeSO4ㆍ7H2O, 1 g의 H3BO3, 1 g의 MnCl2ㆍ4H2O, 0.4 g의 Na2MoO4ㆍ2H2O, 0.3 g의 CoCl2ㆍ6H2O, 0.1 g의 CuSO4ㆍ5H2O, 0.1 g의 KI, 15 g의 EDTA. 미량 금속 용액을 EDTA를 제외한 모든 성분을 pH 6.5의 900 mL 초순수에 용해시킴으로써 제조하였다. 이어서, 용액을 약하게 가열하고 EDTA를 첨가하였다. 마지막으로, pH를 4로 조정하고, 용액 부피를 1 L로 조정하고, 오토클레이브하였다(20 분 이내에 121℃). 이 용액을 4℃에서 저장하였다. 비타민 용액은 다음을 함유하였다(L-1): 50 mg의 비오틴, 200 mg의 p-아미노벤조산, 1 g의 니코틴산, 1 g의 Ca-판토테네이트, 1 g의 피리독신-HCl, 1 g의 티아민-HCl, 25 g의 미오-이노시톨. 비오틴을 20 mL의 0.1 M NaOH에 용해시키고, 900 mL의 물을 첨가하였다. HCl로 pH를 6.5로 조정하고, 나머지 비타민을 첨가하였다. m-이노시톨을 첨가하기 직전 및 직후에 pH를 6.5로 재조정하였다. 최종 부피를 1 L로 조정하고, 4℃에서 저장하기 전에 멸균 여과하였다. 이소프레놀 생산을 위해, 재조합 효모 콜로니를 30℃에서 2% 글루코스가 보충된 5 mL의 YPD 배지를 함유하는 유리 튜브에서 밤새 접종하고, 배양물을 5 mL의 신선한 델프트 배지에서 30℃에서 12 시간 동안 50-배(v/v) 희석하였다. 이 단계를 배지 적응을 위해 2 회 반복되고, 이소프레놀 및 세포 성장의 분석을 위해 세포를 50 mL의 델프트 배지에서 OD600 0.2로 접종하였다. 12 시간 후, gal 프로모터의 유도를 위해 2% 갈락토스를 YPD 및 델프트 배지에 첨가하였다. 균주의 성장 속도를 UV/vis 분광법을 사용하여 시간 경과에 따라 OD600에서 측정하였다.
에스. 세레비지애 형질전환
에스. 세레비지애를 이전에 공개된 프로토콜(Gietz and Schiestl, 2007)에 기반하여 리튬 아세테이트(LiAc)/단일-가닥 담체 DNA(ssD)/PEG 방법에 의해 형질전환하였다. 간략하게, 효모 균주의 단일 콜로니를 5 mL의 YPD 액체 배지에 접종하고, 200 rpm 및 30℃에서 회전식 진탕기에서 밤새 접종하였다. 2.5 × 108개 세포를 세포 역가가 2 × 107개 세포/mL에 도달할 때까지 200 rpm 및 30℃에서 50 mL의 YPD를 함유하는 250 mL 플라스크 상에 접종하였다. 세포를 4,000 x g에서 15 분 동안 원심분리하여 수확하고, 펠렛을 25 mL의 멸균수를 사용하여 2 회 재현탁시켰다. 세포를 1 mL의 멸균수에 재현탁시키고, 108개 세포를 함유하는 100 μL의 샘플을 형질전환에 사용하였다. 세포를 13,000 g에서 30 초 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 336 μL의 형질전환 믹스(240 μL의 PEG 3350, 36 μL의 1.0 M LiAc, 50 μL의 ssD(2 mg/mL) 및 34 μL의 플라스미드 또는 선형 DNA 포함)를 첨가하고, 격렬하게 볼텍스에 의해 세포를 재현탁시켰다. 플라스미드와 세포의 혼합물을 42℃의 수조에서 튜브에 넣고, 이를 40 분 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 제거한 후, 세포를 1 mL의 YPD에 재현탁시키고, 30℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 SC 선별 배지에서 스크리닝하였다.
이소프레놀의 생산 및 정량화
이소프레놀 생산을 위해, 원래 경로 균주 및 IBP 균주의 단일 콜로니를 30℃에서 2% 글루코스가 보충된 5 mL의 YPD를 함유하는 유리 튜브에 개별적으로 접종하고, 200 rpm에서 밤새 진탕시켰다. 세포를 2% 글루코스가 보충된 50 mL의 YPD 배지에서 초기 OD 0.02로 접종하였다. 12 시간 후, 2% 갈락토스를 첨가함으로써 통합된 유전자를 유도하였다.
세포를 먼저 신선한 델프트 배지에서 세포 배양물을 연속 희석함으로써 델프트 배지에서 적응시켰다. 간략하게, 각각의 단일 콜로니를 YPD에 밤새 접종하고, 델프트 배지에서 50-배(v/v) 희석하였다. 적응된 세포를 신선한 델프트 배지에서 다시 50-배(v/v) 희석하고, 최종 적응된 세포를 2% 글루코스가 보충된 50 mL의 델프트 배지에서 초기 OD 0.02로 접종하였다. 12 시간 후, 2% 갈락토스를 첨가함으로써 통합된 유전자를 유도하였다.
이소프레놀 정량화 및 수량화를 위해, 세포 배양물(1 mL)을 내부 표준물로서 1-부탄올(30 mg/L)을 함유하는 등가 부피의 에틸 아세테이트(1 mL)와 합하고, 볼텍스 믹서(Scientific industrial, USA)에서 10 분 동안 3,000 rpm으로 혼합하였다. 세포 배양물 및 에틸 아세테이트를 14,000 x g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 500 μL의 에틸 아세테이트 층을 DB-WAX 컬럼(15-m, 0.32-mm 내부 직경, 0.25-μm 필름 두께, Agilent, USA)이 장착된 기체 크로마토그래피 - 화염 이온화 검출(GC-FID, Thermo Focus GC)에 의해 분석하였고, 오븐 온도 프로그램은 다음과 같았다: 40℃에서 시작하여 100℃로 15℃/분의 램프, 230℃로 40℃/분의 램프 및 230℃에서 3 분 동안 유지.
5-포스포메발로네이트 키나제(PMK 또는 ERG8sc) 및 콜린 키나제(CK)의 결실
표적 영역을 사카로미세스 게놈 데이터베이스(SGD, 웹페이지: yeastgenome.org/)에 기반하여 분석하였다. CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 이소프레놀 생산을 위한 균주를 작제하였다. CRISPR/Cas9의 경우, pCut 플라스미드는 효모 에피솜 셔틀 벡터로부터 유래되고 2-마이크론 복제 기점 및 우라실 선별 마커를 가진다(Reider Apel et al., 2017). Cas9를 ADH1 프로모터 및 CYC1 종결자에 의해 구동시켰다. 표적 유전자 상의 20 bp 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 티로신 프로모터 및 SNR52 종결자 하에 제어하였다. Benchling 웹 도구(웹페이지: benchling.com/)를 사용하여 각각의 표적 부위에 상동성인 500 bp 측접 영역을 가진 공여자 DNA 단편을 생성하기 위한 프라이머를 설계하였다. CEN.PK2-1C 게놈 DNA는 모든 측접 영역, 프로모터 및 종결자 단편을 생성하기 위한 주형으로서 작용하였다. 결실을 URA가 없는 SC 한천 플레이트에서 재조합체를 성장시킴으로써 스크리닝하였다. 표적 유전자, ERG8sc 및 CK의 결실을 특이적 프라이머를 사용하여 확인하였다. 프라이머를 접합 서열을 증폭시키기 위해 표적 영역에 측접하는 서열을 기반으로 설계하였다.
이소프레놀 생산을 위한 포스파타제의 검증
이소프레놀로의 IP 가수분해를 개선하기 위해, 15개의 이전에 보고된 포스파타제(이들의 무차별적 활성에 대한)를 시험하였는데; 이. 콜라이 DH1로부터 증폭된 4개의 포스파타제는 아미노글리코시드-3-포스포트랜스페라제(AphA), 글루코스-1-포스파타제(Agp), 프룩토스-1-포스페이트 포스파타제(YqaB)(Kang et al., 2016), 및 알칼리성 포스파타제(PhoA)를 포함하고, 에스. 세레비지애 CEN.PK2-1C로부터의 11개의 포스파타제는 당 알코올 포스파타제(PYP1)(Xu et al., 2018), 포스파티데이트 포스파타제(PAH1)(Han et al., 2006), 글리세롤-3-포스파타제(GPP1 및 GPP2), 세린/트레오닌 포스파타제(GLC7), 산 포스파타제(PHO3 및 PHO5), 알칼리성 포스파타제(PHO8 및 PHO13), 지질 포스페이트 포스파타제(LPP1)(Faulkner et al., 1999), 및 디아실글리세롤 포스페이트 포스파타제(DPP1)(Faulkner et al., 1999)를 포함하였다. Gibson 어셈블리를 사용하여 플라스미드를 작제하였다. 포스파타제 발현 벡터의 작제를 위해, 포스파타제 유전자를 pRS425 상에 개별적으로 클로닝하였다. 모든 포스파타제의 발현을 구성적 GK1 프로모터 및 ADH1 종결자 하에 제어하였다. 이러한 플라스미드는 2-마이크론 기원 및 효모에서 선별 마커로서 LEU를 함유하였다.
대사산물의 정량화
내인성 MVA 경로에 대한 대사산물의 분석, OD 15 세포를 4℃에서 10 분 동안 14,000 x g에서 원심분리기를 사용하여 수확하였다. 세포 펠렛을 300 μL의 메탄올, 300 μL의 클로로포름 및 150 μL의 물에 재현탁시켰다. 세포 및 상청액을 세포내 대사산물 추출을 위해 유리 비드가 있는 1.7 mL 스크류-캡 튜브 상으로 옮겼다. 세포를 10 초 비트의 10 회 사이클을 사용하여 비드-비터에서 파괴하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 5 분 동안 14,000 x g에서 원심분리하고, 수성 상을 3 kDa 컷-오프 튜브로 옮겼다. 여과 단계로 많은 단백질을 제거한 다음, 여액을 동결건조시키고, LC-MS 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다. 동결건조된 용액을 등가 부피의 아세토니트릴(최종 50% (v/v) ACN)로 희석하고, ZIC-HILIC 컬럼(150-mm 길이, 4.6-mm 내부 직경, 및 5 μm 입도)에서 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS; Agilent Technologies 1200 시리즈 HPLC 시스템 및 Agilent Technologies 6210 비행 시간 질량 분광계)을 통해 분석하였다(Baidoo et al., 2019).
실시예 2
이소프레놀 생산을 위한 IPP-우회 경로 사카로미세스 세레비지애의 조작
경쟁 경로를 녹아웃/녹다운시키고 산화환원 보조인자의 균형을 맞추고 아세틸-CoA 풀을 개선함으로써 이소프레놀 생산을 개선하도록 사카로미세스 세레비지애를 조작하였다.
단사슬 알코올의 상응하는 에스테르로의 에스테르화를 촉매작용하는 알코올 아세틸 트랜스페라제(ATF1 및 ATF2)가 효모에 존재하였다. 유기 오버레이로 플라스크에서 이소프레놀 생산의 초기 평가 동안, 이소프레닐 아세테이트 및 파르네실 아세테이트의 축적이 관찰되었다. 이소프레놀 및 임의의 다른 이소프레노이드 알코올의 아세테이트 에스테르의 생산을 방지하기 위해, 게놈에서 ATF1(및/또는 ATF2) 유전자를 녹아웃시켰다.
FPP 생산을 담당하는 내인성 ERG20의 프로모터 강도를 조작하였다. FPP는 스쿠알렌 및 파르네솔의 전구체이고, 파르네실 아세테이트 형성은 올레일 알코올 오버레이를 사용한 이전 플라스크 실험에서 관찰되었다. ERG20 발현을 낮추면 FPP를 향한 탄소 손실이 감소하고 이소프레놀 생산이 증가하였다.
효모는 일반적으로 다량의 에탄올을 생산한다. 이소프레놀 생산을 개선하기 위해, 탄소 플럭스를 에탄올로 제한하고 이를 이소프레놀 생산 경로로 재지정하는 것이 중요하다. 이소프레놀 생산 효모의 에탄올 경로는 효모에서 알코올 데하이드로게나제(ADH) 유전자(ADH1, ADH3, ADH5)를 하나씩 녹아웃시킴으로써 변형된다. 글리세롤 축적은 ADH 녹아웃 효모에서 이전에 보고된 바 있으며, 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제(GPD1)는 글리세롤 축적을 방지하기 위해 GPD1을 녹아웃시키는 것으로 보고된 바 있다(Baek et al. Appl Microbiol Biotechnol (2016)). ADH 및 GPD1 녹아웃은 NADH 축적을 초래하고, NADH-의존적 HMG-CoA 리덕타제는 플라스미드에서 과발현되어(예컨대, 에스. 포메료이 HMGr 또는 디. 애시도보란스 HMGr) 산화환원 불균형을 완화하고 이소프레놀 경로를 가속화한다.
ERG19 및 ERG12는 유전자 녹아웃 후 AFT1, ADH 및 GPD1 부위에 통합되어 이소프레놀 경로 유전자(mvaES, ERG12, ERG19)를 과발현시킨다.
효모에서 이소프레놀을 생산하기 위해, MVA 경로 유전자는 효모 게놈에서 과발현되고 무차별적 키나제 중 하나에 대해 녹아웃된다. 이소프레놀을 생산하는 경로는 원래의 MVA 경로(메발로네이트를 통한 아세틸-CoA에서 이소펜테닐 디포스페이트(IPP)로, 이후 이소프레놀로의 가수분해) 또는 IPP-우회 경로(메발로네이트를 통한 아세틸-CoA에서 이소프레닐 모노포스페이트(IP)로, 이후 이소프레놀로의 가수분해)이다.
통합된 이소프레놀 경로 및 ERG19 및 무차별적 포스파타제의 플라스미드-기반 과발현으로의 효모 균주는 회분식 진탕 플라스크 실험에서 380 mg/L의 역가 및 이론 수율의 약 15.6%인 2% 글루코스를 사용한 회분식 발효에서 1 g/L의 역가로 이소프레놀을 생산할 수 있었다. 따라서, 효모에서 이소프레놀 수율을 증가시킬 더 많은 기회가 있었다.
회분식 발효 동안, 에탄올의 축적이 관찰되었고, 생성물 증발에 의한 손실을 감소시킴으로써 생산을 개선하기 위해 올레일 알코올 오버레이를 사용하는 경우, 또한 부산물로서 이소프레닐 아세테이트 및 파르네실 아세테이트와 같은 에스테르의 형성이 관찰되었다.
이러한 관찰에 기초하여, 이소프레놀 생산을 개선하기 위한 효모 균주의 추가 조작은 하기 기재된 바와 같이 경쟁 경로를 녹아웃/녹다운시키고, 산화환원 보조인자의 균형을 맞추고, 아세틸-CoA 풀을 개선하는 것으로 제안된다.
1. ATF1 녹아웃 및 ERG20에 대한 프로모터 대체
단사슬 알코올의 상응하는 아세테이트 에스테르로의 에스테르화를 촉매작용하는 알코올 아세틸 트랜스페라제(ATF1 및 ATF2)가 효모에 존재하였다. 유기 오버레이로 플라스크에서 이소프레놀 생산의 초기 평가 동안, 이소프레닐 아세테이트 및 파르네실 아세테이트의 축적이 관찰되었다. 이소프레놀 및 임의의 다른 이소프레노이드 알코올의 아세테이트 에스테르의 생산을 방지하기 위해, 게놈에서 ATF1(및/또는 ATF2) 유전자를 녹아웃시켰다(도 10). 이소프레놀 생합성 경로는 생산 경로로의 플럭스를 증가시키기 위해 과발현될 필요가 있었다. 유전자는 염색체에서 유전자가 녹아웃되는 동일한 부위에 통합될 수 있다. 이소프레놀 경로 유전자의 추가 카피는 ATF1 녹아웃 부위에 통합될 수 있다.
ATF1 녹아웃에 더하여, FPP 생산을 담당하는 내인성 ERG20의 프로모터 강도가 조작될 수 있다. FPP는 스쿠알렌 및 파르네솔의 전구체이고, 파르네실 아세테이트 형성은 올레일 알코올 오버레이를 사용한 이전 플라스크 실험에서 관찰되었다. ERG20 발현은 FPP를 향한 탄소 손실을 감소시키고 이소프레놀 생산을 증가시키기 위해 낮아질 수 있다.
2. ADH1 녹아웃, GPD1 녹아웃, 및 NADH 의존성 HMGR 과발현
효모는 일반적으로 다량의 에탄올을 생산한다. 이소프레놀 생산을 개선하기 위해, 탄소 플럭스를 에탄올로 제한하고 이를 이소프레놀 생산 경로로 재지정하는 것이 중요하다. 이소프레놀 생산 효모의 에탄올 경로는 효모에서 ADH 유전자(ADH1, ADH3, ADH5)를 녹아웃시킴으로써 조작될 수 있다. 에탄올 생산은 산화환원 균형 및 성장과 관련이 있으므로, 이러한 유전자는 성장을 유지하면서 순차적으로 결실될 수 있다. 글리세롤 축적은 ADH 녹아웃 효모에서 이전에 보고된 바 있다(Baek et al. Appl Microbiol Biotechnol (2016)). GPD1은 글리세롤 축적을 방지하기 위해 녹아웃될 수 있다. ADH 및 GPD1 노크는 NADH 축적을 초래하고, NADH 의존성 HMG-CoA 리덕타제(예를 들어, 에스. 포메료이 HMGr 또는 디. 애시도보란스 HMGr)는 산화환원 불균형을 완화하고 이소프레놀 경로를 가속화하기 위해 과발현될 수 있다(Meadows et al. Nature (2016)). ERG19 및 ERG12는 유전자 녹아웃 후 ADH 및 GPD1 부위(들)에 통합되어 이소프레놀 경로 유전자를 과발현시킬 수 있다. 도 11 내지 13을 참조하라.
방법
이소프레놀 생산을 위한 IPP-우회 경로를 작제하기 위해, 4개의 경로 유전자(EfmvaE, EfmvaS, ERG12sc, 및 ERG19sc)를 게놈 상에 통합하였다. EfmvaE 및 Efmvas 카세트를 균주 JPUB_007547로부터 증폭시키고(Reider Apel et al., 2017), URA 유전자좌 상에서 URA 선별 마커와 통합시켰다. 다중-카피 발현을 위해, EfmvaE 및 Efmvas 카세트를 ADH1 상에 통합하고, 갈락토스 프로모터(PGAL)의 제어 하에 발현시켰다. ADH1 유전자를 결실시켜 아세틸-CoA 생합성을 위한 초기 전구체인 아세트알데하이드를 축적하였다. 2개의 유전자(ERG12sc 및 ERG19sc), 프로모터, 및 종결자를 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. ERG12sc 및 ERG19sc를 류신(LEU) 유전자좌 상의 히스티딘(HIS) 선별 마커와 통합하였다. ERG12sc 및 ERG19sc를 과발현시키기 위해, 카세트를 GPD1 유전자좌에 통합하고, PGAL의 제어 하에 발현시켰다. GPD1 유전자를 결실시켜 글리세롤과 같은 부산물의 생산을 차단하였다. 효모는 ADH1 결실에 의해 축적되는 NADH의 산화를 위해 높은 역가의 글리세롤을 생산하였다. MVA 경로로부터 축적된 중간체 IPP 및 FPP에 의한 성장 문제를 극복하기 위해 PGAL 하에 IPP-우회 경로 유전자를 제어하였다. 표적 유전자의 결실 및 통합을 위해, 500개 내지 1000개의 염기쌍(bp) 상동성 아암(HA), 선별 마커, 표적 유전자, 프로모터, 및 종결자를 포함하는 선형 DNA를 Gibson 어셈블리 키트(NEB, 영국)를 사용하여 조립하였다. CRISPR/Cas9 시스템을 표적 유전자 결실에 사용하고, 상동성 재조합효소를 사용하여 표적 영역 상에 조립된 선형 DNA를 통합하였다. ERG19sc 및 포스파타제(이. 콜라이로부터의 phoA)를 LEU 선별 마커와 함께 고 카피(2 μm) 플라스미드 상에서 발현시켰다. ERG19sc 발현을 구성적 TEF3 프로모터(PTEF3) 하에 제어하고, phoA 발현을 구성적 PGK1 프로모터(PPGK1) 하에 제어하였다. 세포내 NADH의 산화를 위해, NADH-의존성 HMGR를 플라스미드 상의 TEF1 프로모터(PTEF1)의 제어 하에 발현시켰다.
알코올 아세틸트랜스페라제(ATF1) 유전자의 결실
ATF1 유전자의 결실을 위해, 표적 영역을 사카로미세스 게놈 데이터베이스(SGD, 웹페이지: yeastgenome.org/)에 기반하여 설계하고, CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 이소프레놀 생합성 생산을 위해 효모를 조작하였다. pCut 플라스미드가 얻어졌고, 2 μm의 복제 기점 및 G418 항생제 선별 마커를 가졌다. Cas9를 ADH1 프로모터 및 CYC1 종결자에 의해 구동시켰다. 표적 유전자의 결실을 위해, 20 bp 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 티로신 프로모터 및 SNR52 종결자 하에 제어하였다. 20 sgRNA를 Benchling 웹사이트 도구(웹페이지: benchling.com/)를 기반으로 설계하였다. 조작된 효모를 G418(200 mg/L)을 가진 효모 펩톤 글루코스 배지(YPD) 한천 플레이트에서 재조합체를 성장시킴으로써 스크리닝하였다. 표적 ATF1 유전자의 결실을 특정 프라이머를 사용하여 확인하였다. 프라이머를 접합 서열을 증폭시키기 위해 표적 영역에 측접하는 서열을 기반으로 설계하였다.
ERG20 프로모터의 스와핑
ERG20은 파르네실 피로포스페이트 신타제(FPPS)를 인코딩하는 에스. 세레비지애 유전자이다. 파르네실 피로포스페이트(FPP)는 1-단위 DMAPP 및 2-단위 IPP를 포함한다. 다량의 이소프레놀을 생산하기 위해, 효모는 이소프레노이드 및 스테롤 에스테르 생합성 경로를 향한 플럭스를 감소시키도록 조작될 필요가 있다. 이소프레노이드 경로 플럭스를 제어하기 위해, ERG20 유전자의 원래 프로모터를 PBTS1, PHXT1, 및 PCTR3의 약한 프로모터로 스와핑하였다. ERG20 유전자를 각각 PBTS1, PHXT1, 및 PCTR3의 제어 하에 발현시켰다. CEN.PK2-1C 균주의 게놈을 프로모터, 종결자, HA, 및 ERG20 유전자의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하고, G418 선별 마커를 JBEI-2668 플라스미드로부터 증폭시켰다. G418 항생제 선별 마커를 상류 상동 영역과 프로모터 영역 사이에 통합하였다. 프로모터 스왑 균주를 30℃에서 G418 항생제(200 mg/L)가 있는 YPD 한천 배지에서 스크리닝하였다.
발효
이소프레놀 생산을 위해, 균주를 용존 산소(DO), 온도, 및 기류를 제어하면서 2 L 바이오리액터(Sartorius BIOSTAT B 플러스)에서 성장시켰다. DO, 온도, 및 기류를 각각 30%, 30℃, 및 1VVM(분당 액체 부피당 공기 부피)으로 설정하였다. 효모 균주를 2% 글루코스가 보충된 델프트 배지를 포함하는 바이오리액터에서 배양하였다. 배양물의 pH를 암모니아수(15%)의 보충에 의해 7.0으로 유지하였다. 소포제 B를 필요 시 바이오리액터에 첨가하였다. 2-상 배양의 경우, 20%(v/v) 올레일 알코올을 유도 시점에 바이오리액터에 첨가하였다. 발효 동안, 올레일 알코올의 총 부피를 20%로 유지하였다. 발효 동안 광학 밀도 측정 및 이소프레놀 정량화를 위해, 유기 상 및 수성 상을 먼저 원심 분리기(10 분, 5,000 X g)에 의해 분리하였다. 유기 상으로부터 이소프레놀을 정량화하기 위해, 10 μL의 올레일 알코올을 내부 표준물로서 1-부탄올(30 mg/L)을 함유하는 990 μL의 에틸 아세테이트에 첨가하였다. 수성 상으로부터 이소프레놀을 정량화하기 위해, 300 μL의 수성 상을 1-부탄올(30 mg/L)을 함유하는 등가 부피의 에틸 아세테이트와 혼합하였다.
이소프레놀의 수량화 및 정량화
이소프레놀 수량화 및 정량화를 위해, 세포 배양물(500 μL)을 내부 표준물로서 1-부탄올(30 mg/L)을 함유하는 등가 부피의 에틸 아세테이트(500 μL)와 합하고, 볼텍스 믹서(Scientific industrial, USA)에서 10 분 동안 3000 rpm으로 혼합하였다. 세포 배양물 및 에틸 아세테이트를 14,000 x g에서 5 분 동안 원심분리에 의해 분리하였다. 500 μL의 에틸 아세테이트 층을 DB-WAX 컬럼(15-m, 0.32-mm 내부 직경, 0.25-μm 필름 두께, Agilent, USA)이 장착된 기체 크로마토그래피 - 화염 이온화 검출(GC-FID, Thermo Focus GC)에 의해 분석하였다. GC 오븐 온도 프로그램은 다음과 같았다: 40℃에서 시작하여, 100℃로 15℃/분의 램프, 230℃로 40℃/분의 램프 및 230℃에서 3 분 동안 유지. 입구 온도는 180℃였다.
본 발명은 본 발명의 구체적 실시양태를 참조하여 기재되었지만, 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 본 발명의 진정한 취지 및 범위를 벗어나지 않고 대체될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 목적, 취지 및 범위에 특정한 상황, 재료, 물질 조성, 과정, 과정 단계 또는 단계들을 조정하기 위한 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본원에 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (24)

  1. 40 μg/10 mL(중량 세포 부피) 초과의 3-메틸-3-부텐-1-올 또는 이소프레놀을 생산할 수 있는, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 출아 효모 세포인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 사카로미세탈레스(Saccharomycetales) 목의 세포인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  4. 제3항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 사카로미세타세애(Saccharomycetaceae) 과의 세포인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 사카로미세스(Saccharomyces) 속의 세포인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  7. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 배지 리터 당 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 110 mg, 120 mg, 또는 130 mg 이상을 생산할 수 있는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  8. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)로부터의 EfmvaE 및 Efmvas, 및 에스. 세레비지애로부터의 ERG8sc, ERG12sc, 및 ERG19sc, 및 NudB, 또는 이의 임의의 동종 효소를 과발현시키도록 변형되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는, 내인성 포스포메발로네이트 키나제 또는 PMK(예컨대, ERG8), 이소프레노이드 및 스테롤의 생합성에서 작용하는 세포질 효소, 및/또는 내인성 콜린 키나제에 대해 녹아웃되고, 임의적으로 포스파타제의 증가된 발현을 가지도록 추가로 조작되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 포스파타제는 다음 포스파타제 중 하나인, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포: PHO5, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; PHO3, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; LPP1, 에스. 세레비지애로부터의 지질 포스페이트 포스파타제; PYP, 에스. 세레비지애로부터의 당 알코올 포스파타제; GLC7, 에스. 세레비지애로부터의 세린/트레오닌 포스파타제; PAH1, 에스. 세레비지애로부터의 포스파티데이트 포스파타제; DPP1, 에스. 세레비지애로부터의 디아실글리세롤 포스페이트 포스파타제; PHO13, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; GPP1, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; GPP2, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; APHA, 이. 콜라이로부터의 아미노글리코사이드-3-포스포트랜스페라제; AGP, 이. 콜라이로부터의 글루코스-1-포스파타제; YQAB, 이. 콜라이로부터의 프룩토스-1-포스페이트; PHO8, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; PHOA, 이. 콜라이로부터의 알칼리 포스파타제; 또는 이들의 임의의 동종 효소.
  11. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는, 내인성 포스포메발로네이트 키나제 또는 PMK(예컨대, ERG8), 이소프레노이드 및 스테롤의 생합성에서 작용하는 세포질 효소, 및/또는 내인성 콜린 키나제에 대해 녹아웃되고, 임의적으로 포스파타제의 증가된 발현을 가지도록 조작되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, 포스파타제는 다음 포스파타제 중 하나인, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포: PHO5, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; PHO3, 에스. 세레비지애로부터의 산 포스파타제; LPP1, 에스. 세레비지애로부터의 지질 포스페이트 포스파타제; PYP, 에스. 세레비지애로부터의 당 알코올 포스파타제; GLC7, 에스. 세레비지애로부터의 세린/트레오닌 포스파타제; PAH1, 에스. 세레비지애로부터의 포스파티데이트 포스파타제; DPP1, 에스. 세레비지애로부터의 디아실글리세롤 포스페이트 포스파타제; PHO13, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; GPP1, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; GPP2, 에스. 세레비지애로부터의 글리세롤-3-포스파타제; APHA, 이. 콜라이로부터의 아미노글리코사이드-3-포스포트랜스페라제; AGP, 이. 콜라이로부터의 글루코스-1-포스파타제; YQAB, 이. 콜라이로부터의 프룩토스-1-포스페이트; PHO8, 에스. 세레비지애로부터의 알칼리 포스파타제; PHOA, 이. 콜라이로부터의 알칼리 포스파타제; 또는 이들의 임의의 동종 효소.
  13. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 하나 이상의 내인성 알코올 아세틸 트랜스페라제 유전자에 대해 녹아웃되도록 조작되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 알코올 아세틸 트랜스페라제 유전자는 알코올 아세틸 트랜스페라제 1(ATF1) 및/또는 알코올 아세틸 트랜스페라제 2(ATF2)인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  15. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 내인성 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제(GPD1), 및/또는 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제(ADH) 유전자에 대해 녹아웃되도록 조작되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제(ADH) 유전자는 알코올 데하이드로게나제 1(ADH1), 알코올 데하이드로게나제 3(ADH3), 및 알코올 데하이드로게나제 5(ADH5)인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  17. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 파르네실 피로포스페이트 신타제(ERG20)에 대한 발현이 감소하도록 조작되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  18. 제1항에 있어서, 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포는 HMG-CoA 신타제(MvaS), 아세토아세틸-CoA 티올라제/HMG-CoA 리덕타제(MvaE), 메발로네이트 키나제(MK)(또는 ERG12), 및/또는 포스포메발로네이트 데카르복실라제(PMD)(또는 ERG19) 중 하나 이상을 과발현시키도록 조작되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, HMG-CoA 신타제(MvaS)는 엔테로코커스 패칼리스 HMG-CoA 신타제(EfmvaS), 또는 이의 동종 효소인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  20. 제18항에 있어서, 아세토아세틸-CoA 티올라제/HMG-CoA 리덕타제(MvaE)는 엔테로코커스 패칼리스 아세토아세틸-CoA 티올라제/HMG-CoA 리덕타제(EfmvaE), 또는 이의 동종 효소인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  21. 제18항에 있어서, ERG12는 사카로미세스 세레비지애 ERG12(ERG12sc), 또는 이의 동종 효소인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  22. 제18항에 있어서, ERG19는 사카로미세스 세레비지애 ERG19(ERG19sc), 또는 이의 동종 효소인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  23. MVAP, IP, 및/또는 이소프레놀을 과발현시킬 수 있는 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포로서, 효모 숙주 세포는 내인성 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제(GPD1), 및/또는 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제(ADH) 유전자에 대해 녹아웃되고/되거나, 파르네실 피로포스페이트 신타제(ERG20)에 대한 발현이 감소하도록 조작되는 것인 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포.
  24. 이소프레놀을 생산하기 위한 방법으로서, (a) 제1항의 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포 또는 이의 배양물을 제공하는 단계, (b) 유전적으로 변형된 효모 숙주 세포를 배양하거나 성장시켜 이소프레놀을 생산하는 단계, (c) 임의적으로 배양물로부터 이소프레놀을 추출하거나 분리하는 단계, 및 (d) 임의적으로 추출되거나 분리된 이소프레놀에 연료 첨가제를 도입하는 단계를 포함하는 방법.
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