KR20230035233A - 생물정보학 - Google Patents

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티나 시카넨
사라 페오라
사리 타카
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Abstract

본 발명은 종양 항원 식별 장치와 종양 항원 식별 방법; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용하여 식별된 종양 항원; 이러한 종양 항원을 포함하는 약학적 조성물; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용한 암 치료 방법; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용하여 암 치료하기 위해 환자를 계층화하는 방법; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용해 암 치료하기 위한 환자를 계층화한 다음 암 치료제를 투여하는 것을 수반하는 치료 용법; 및 암 백신 또는 면역원성 물질 또는 암 요법으로서 이용하기 위해 이러한 장치 및/또는 방법을 이용해 식별된 종양 항원에 관한 것이다.

Description

생물정보학
본 발명은 종양 항원 식별 장치 및 종양 항원 식별 방법; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용하여 식별된 종양 항원; 이러한 종양 항원을 포함하는 약학적 조성물; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용한 암 치료 방법; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용하여 암을 치료하기 위해 환자를 계층화하는 방법; 이러한 장치 및/또는 방법을 이용하여 암을 치료하기 위해 환자를 계층화한 다음 암 치료제를 투여하는 것을 포함하는 치료 용법; 및 암 백신 또는 면역원성 물질 또는 암 요법으로서 이용하기 위한 이러한 장치 및/또는 방법을 이용해 식별된 종양 항원에 관한 것이다.
CD8+ T-세포는 바이러스 감염과 같은 병원성 감염 또는 악성 형질전환의 결과로서 표면에 비정상적인 펩타이드를 제시하는 세포를 검출하여 소거하는데 중추적인 역할을 담당한다. T-세포 수용체 (TCR)의 교차-반응성은 T-세포가 엄청나게 다양한 여러가지 표적 펩타이드들을 인지할 수 있다는 것을 의미한다. 이런 현상은 비교적 적은 수의 T-세포만으로도 비정상적인 세포임을 나타내고 그래서 잠재적으로 건강 또는 생명에 위협이 됨을 의미하는 복수의 pMHC (펩타이드: 주 조직적합성 복합체)를 인지 가능하게 한다.
그러나, 이러한 기전의 부적절한 부작용은, 병원체를 겨냥하는 면역 반응이 매우 상동적인 자기-항원에 대한 관용 역치를 넘어, T-세포의 교차-반응성에 의해 매개되는 유해한 비-표적 효과, 즉 분자 의태 (molechlar mimicry)로 알려진 과정을 유발할 수 있다는 것이다. 자가면역 분야에서, 자기 펩타이드와 병원성 펩타이드 간의 이러한 상동성으로 인한 잠재적으로 유해한 결과는 잘 알려져 있지만, 암에서는 분석된 바 없다.
실제, 암 면역치료학적 치료에서 성공적인 결과를 의미하는 최상의 예후 예측 마커는 높은 종양 항원 돌연변이율과 상당한 T-세포 침윤인 것으로 여겨져 왔다. 이러한 생각은 돌연변이 수가 많은 종양이 침윤성 T-세포에 의해 인지 및 제거될 가능성이 더 높을 것이라는 점에 근거한다.
그럼에도 불구하고, 일부 연구들에서는 종양 항원의 정성적인 특성이 이의 양적 측면보다 더 중요할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 아울러, 항-바이러스 T-세포가 종양 미세환경에 상주하지만 [28], 이의 역할이 능동적인지 또는 단지 방관자인지는 여전히 명확하지 않은 것으로 관찰된 바 있다.
종양면역학 및 면역요법은 과거 10년간 암 치료 방법을 완전히 바꾸었으며, 특히 체크포인트 저해제 (ICI)를 이용할 경우 탁월한 임상 결과를 거두었지만 공교롭게도 소수의 환자들에만 국한되었다. ICI를 이용한 면역요법은 특정한 종양 항원을 표적화하는 경우에만 완전히 작동한다는 점이 분명해지고 있다. 그러나, 현재 이러한 종양 항원을 식별하기 위한 쉽고 빠른 방법은 없는 실정이다.
본원에서, 본 발명자들은 종양이 병원체-유래 펩타이드, 특히 바이러스 펩타이드와 높은 수준의 상동성 또는 친화성 수준을 공유하는 펩타이드를 제시할 수 있으며, 이로써 병리학적으로 생성된 교차-반응성 T 세포가 종양 세포를 인지해 이를 사멸시킬 수 있을 것이라는 가설을 세웠다.
이를 위해, 본 발명자들은 바이러스 펩타이드와 매우 유사한 종양 항원을 자동적이고 매우 간단하게 식별하기 위한 HEX (제노펩타이드의 상동성 평가)로 지칭되는 생물정보학적 장치를 개발하게 되었다. 본 발명들은, 이 장치를 이용해, 암 항원에 대해 상동성 또는 친화성 수준이 높은 펩타이드에 의해 매개되는 항-바이러스 T-세포 면역이 예방학적 및 치료학적 상황에서 종양 증식을 능동적으로 방제할 수 있다는 것을 관찰하였다. 이러한 관찰 결과는 상동적인 바이러스-유래 펩타이드 및 종양-유래 펩타이드 둘다에 대해 활성화된 T-세포의 교차-반응성을 입증해준다.
다음으로, 본 발명자들은 사이토메갈로바이러스 (CMV)에 대한 체액성 반응으로 체크포인트 저해제 요법 (항-PD1)에 대한 흑색종 환자의 반응을 계층화할 수 있다는 것을 알게 되었다. 실제, 장치 HEX를 사용해 식별된, CMV 및 흑색종과 상동적인 펩타이드는 CMV 혈청양성 흑색종 환자로부터 유래한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 Inf-g 분비를 촉진하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은, 제1 측면에서, 하기를 포함하는 종양 항원을 식별하기 위한 장치를 제공한다:
채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널.
본 발명에서 항-범-HLA 항체에 대한 언급은 포유류, 특히 인간에 존재하는 여러가지 HLA들 중 임의의 것을 인지하거나 또는 이에 대해 특이성을 가진 항체를 지칭하는 것이다.
보다 이상적으로는, 이러한 항체는 다음의 군: MHC 클래스 I A, B 및 C 중 적어도 하나로부터 선택되는 MHC-I과 같은 특정한 HLA 타입을 인지하거나 또는 이에 대한 특이성을 가진다.
부가적으로 또는 대안적으로, 이러한 항체는 다음의 군: MHC 클래스 II DP, DM, DO, DQ 및 DR 중 적어도 하나로부터 선택되는 MHC-II와 같은 특정한 HLA 타입을 인지하거나 또는 이에 대해 특이성을 가진다.
보다 더 바람직하게는, 이러한 항체는 항-인간이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기한 분자 또는 복합체는 티올 관능기와 알킬 ("엔") 관능기의 복합체이며, 이상적으로는 0.15:0.1 내지 1500:1000 (테트라티올:트리알릴) 범위의, 1.5 : 1.0의 화학량론적 비율을 수반하는, 티올 관능기와 알킬 ("엔") 관능기로 된 복합체이다.
보다 더욱 이상적으로는, 장치의 제작은 티올 관능기와 알킬("엔") 관능기 간의 UV-개시되는 광반응을 기초로 한다. 본 발명의 다른 추가적인 바람직한 구현예에서, 장치는 바이오틴-PEG4-알킨 (Sigma, 764213)과의 UV 광중합에 의해 제작된다. 이후, 아비딘:스트렙타비드와의 반응이 후속적으로 이루어진다. 그러나, 돌기 (pillar)에 바이오틴을 부착하기 앞서 바이오틴에 아비딘을 부착하는 공정, 그리고 그 반대 순서도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 다른 추가적인 바람직한 구현예에서, 상기한 장치는 스트렙타비딘을 항체와 반응시킴으로써 관능화된다. 이상적으로는, 복수의 항-범-HLA 항체와 같은 항체 2 또는 3개 등의 여러개가 스트렙타비딘으로 관능화된 각 복합체에 탑재되도록, 2 이상의 항체가 스트렙타비딘과 반응한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 미세돌기 어레이 (micropillar array)는, 스트렙타비딘으로 관능화된 후, 그리고 항체가 결합되기 전, 소 혈청 알부민 (BSA)(이상적으로는, 15 mM PBS 중의 100 ㎍/mL, 10분 인큐베이션)과 같은 단백질로, 사전-컨디셔닝화된다.
본 발명의 더 바람직한 측면에서, 지지체는 미세유체 장치에 존재하는 것과 같이 복수의 미세돌기를 포함하며, 바람직하게는 상기한 돌기는 상기한 장치 내부에 어레이로 정렬된다. 이상적으로는, 상기한 미세돌기는 예를 들어 고정된 효소 반응을 구현하기 위해 통상적인 미세유체 장치에서 사용되는 것과 동일하거나 또는 유사한 구성으로 제작된다.
본 발명은 추가적인 측면에서 하기를 포함하는 종양 항원 식별 방법을 제공한다:
i) 종양의 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
ii) 상기 유체를 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계로서, 장치가 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널을 포함하는, 단계;
iii) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
iv) 선택적으로, 상기 장치로부터 iii)의 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
v) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)의 펩타이드를 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 병원체-유래 항원 또는 이의 일부에 대해 상동성 또는 친화성 (분자 의태)을 나타내는 지를 확인하는 단계, 및 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
vi) 상기 펩타이드를 암 요법에 이용하기 위한 종양 항원으로서 식별하는 단계.
본 발명의 임의 측면에 대한 바람직한 구현예에서, 상기한 상동성/친화성은 다음과 같은 퍼센트 중 어느 하나일 수 있다: 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100%.
본 발명에서 상동성/친화성에 대한 언급은 본원에 정의된 바와 같은 상동성/친화성 중 하나; 또는 주어진 정렬에서 정의된 길이 상에서 동일한 잔기의 개수에 의해 결정되는 동일성; 또는 주어진 정렬에서 정의된 길이 상에서 물리화학적 특성이 유사한 보존적인 치환 또는 동일한 잔기의 개수에 의해 결정되는 유사성을 이용하여, 상기 단계 v)에서 서열 구조체들을 비교하는 것을 포함한다.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기한 라이브러리는 인간 병원체-유래 항원 라이브러리이며, 이는 이상적으로는 병원성 바이러스로부터 유래한 공지된 병원체-유래 항원들로 엄선된 라이브러리, 또는 더 적합하게는, 하기 바이러스들 중 임의의 하나 이상의 또는 사실상 이들의 임의 조합과 같이, 포유류, 이상적으로는 인간에 감염하는 바이러스의 프로테옴을 포함한다:
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스피나레오비리내 (Spinareovirinae); 스피라비리대 (Spiraviridae); 스포우나비리내 (Spounavirinae); 스푸마레트로비리내 (Spumaretrovirinae); 순비리대 (Sunviridae); 텍티비리대 (Tectiviridae); 테벤비리내 (Tevenvirinae); 티아마비리내 (Tiamatvirinae); 토바니비리대 (Tobaniviridae); 토가비리대 (Togaviridae); 톨레쿠사텔리티대 (Tolecusatellitidae); 톰부스비리대 (Tombusviridae); 토로비리내 (Torovirinae); 토스포비리대 (Tospoviridae); 토티비리대 (Totiviridae); 트리스트로마비리대 (Tristromaviridae); 트리비리내 (Trivirinae); 투나비리내 (Tunavirinae); 투니카니비리내 (Tunicanivirinae); 투리비리대 (Turriviridae); 트와트비리내 (Twortvirinae); 티모비리대 (Tymoviridae); 바리아르테리비리내 (Variarterivirinae); 베퀸타비리내 (Vequintavirinae); 비르가비리대 (Virgaviridae); 우페데비리대 (Wupedeviridae); 크시노모비리대 (Xinmoviridae); 유에비리대 (Yueviridae); 및 지알라르테리비리내 (Zealarterivirinae).
더 바람직하게는, 병원성 바이러스는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 또는 엡스타인-바 바이러스 (EBV)이거나, 또는 바람직하게는, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 헤파드나바이러스, 인플루엔자 바이러스 코로나바이러스, 간염 바이러스, HIV 또는 분야 바이러스 (Bunyavirus)이다.
가장 바람직하게는, 바이러스는 비-종양용해성 (non-oncolytic)이며, 즉 이의 복제가 암 세포로 특이적으로 국한되지 않는다.
대안적인 구현예에서, 바이러스는 종양용해성이며, 즉 정상 세포와 비교해 종양에서의 선택적인 복제로 인해 암 세포를 감염 및 사멸시킬 수 있다.
바람직한 방법에서, 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)의 펩타이드를 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하는 단계는 상동성/친화성 또는 동일성 또는 유사성을 결정하기 위한 복수의 점수 평가 (펩타이드 친화성 점수 평가 및 정렬 점수 평가 및 유사성 점수 평가 및 MHC-결합 친화성 점수 평가)를 수반한다. 가장 바람직하게는, 점수 평가는 후술한 바와 같은 상동성/친화성 점수 평가이다.
일 구현예에서, 종양 펩타이드의 아미노산 위치를 나타낸 열 (또는 행)과 표준 아미노산 20종 각각을 나타낸 행 (또는 열)으로 된 행렬을 작성하고, 종양 펩타이드의 아미노산 위치들에는 동일한 높은 점수를 할당하고, 다른 위치에는 병원체-유래 항원/펩타이드와 동일한 낮은 점수를 할당한다. 하기 측면 (선호도 내림차순)에 따라 병원성-유래 항원/펩타이드와 비교해 상동성/친화성이 가장 높은 종양 펩타이드에 최고 점수가 부여될 것이다:
a) 전체 서열 구조 (명확하게는, 병원체-유래 펩타이드와 100% 동일한 종양 펩타이드에 최고 점수가 부여됨);
b) 핫-스팟 또는 핵심적인 결합 부위 내 핵심 아미노산들에 대한 동일성; 및
c) 핫-스팟 또는 핵심적인 결합 부위 내 핵심적인 아미노산들의 최다 개수.
정렬은 종양 세트 대비 쿼리 (병원체-유래) 세트에서 펩타이드들 간의 쌍으로 계산하거나, 또는 그 반대로 계산한다. 주어진 펩타이드 쌍에서, 이들의 정렬은 동일한 위치에서 아미노산 쌍들 간의 거리 점수를 합산함으로써 계산한다. 점수 평가시 펩타이드에서 보다 중심적인 아미노산들 간의 유사성을 우선시하기 위해 가중치를 부여한다.
아울러, MHC 클래스 I 결합 친화성 예측을 수행한다. 이를 구현하기 위한 방법들은 IEDB (http://tools.iedb.org/main/tools-api/)의 애플리케이션 프로그래밍 인터페이스를 통해 NetMHC (NetMHC4.0 또는 NetMHCpan4.1.)를 이용하는 바와 같이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 이후 툴에서 분석 및 수집한다.
본 발명의 대안적인 구현예에서, 비교 단계는 아미노산 8-12개 길이의 종양 펩타이드 목록을 소프트웨어에 입력하는 것을 수반한다. 먼저, 툴 BLAST를 이용해 병원체-유래 항원 라이브러리에서 히트 (유사한 서열들)를 검색한다. 이를 위해, 일반적으로 PAM30 툴이 사용되지만, 수개의 진화 거리 (evolutionary distances)에 걸친 BLOSUM 및 PAM 치환 행렬 둘다 지원된다. 다음으로, 위치-가중 방식으로 정렬을 개선하기 위해, 적어도 BLOSUM62를, 이상적으로는, 또한 김 등에 의해 개발된 치환 행렬 (BMC Bioinformatics. 2009;10:394. Published 2009 Nov 30. doi:10.1186/1471-2105-10-394 Derivation of an amino acid similarity matrix for peptide: MHC binding and its application as a Bayesian prior. Kim Y, Sidney J, Pinilla C, Sette A, Peters B.)을 이용한 쌍별 정밀 정렬을 수행한다. TCR-상호작용 영역 (펩타이드의 중심 부위)에서 유사성이 높은 펩타이드 쌍에 더 높은 유사성 점수를 부여한다. 마지막으로, 독립형 명령줄 도구로서 NetMHC4.0 또는 NetMHCpan4.1을 이용해 종양 및 바이러스 동족 펩타이드 둘다에 대해 MHC-결합 친화성을 예측한다. 결과는 궁극적으로 툴에서 자동적으로 분석 및 수집되며, 전술한 분석을 요약한 최종 점수가 생성된다.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 전술한 장치 및/또는 방법 중 어느 하나 또는 둘다를 이용해 식별된 종양 항원을 포함하는 암 치료학적 물질 또는 면역원성 물질 또는 암 백신이 제공된다.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 암 요법에 이용하기 위한 전술한 장치 및/또는 방법 중 어느 하나 또는 둘다를 이용해 식별된 종양 항원이 제공된다.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 암 치료용 의약제의 제조에 이용하기 위한, 전술한 장치 및/또는 방법 중 어느 하나 또는 둘다를 이용해 식별된 종양 항원이 제공된다.
가장 바람직하게는, 이러한 암 치료학적 물질 또는 면역원성 물질 또는 암 백신 또는 종양 항원은 표 1-6에 열거된 것들 중 어느 하나 이상이다.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 하기를 포함하는 암 환자를 치료하는 방법이 제공된다:
본 발명의 장치 및/또는 방법을 이용해 종양 항원을 식별한 다음 이러한 종양 항원을 개체에 투여하거나 또는 이러한 종양 항원을 이용해 종양 항원에 대항하여 활성인 T-세포 집단을 증폭시킨 다음 T-세포를 환자에 투여하는 단계.
바람직한 구현예에서, T 세포는 동종이계 또는 자가 T 세포로서 생체외 T 세포 및/또는 배양한 T 세포이다.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 본 발명의 종양 항원 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 보강제, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 또는 면역원성 물질 또는 백신이 제공된다.
적절한 약학적 부형제들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 약학적 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 종양내, 근육내, 동맥내, 정맥내, 흉막내, 낭내 (intravesicular), 강내 (intracavitary) 또는 복막 주사, 볼, 코 또는 기관지 (흡입), 경피 또는 비경구에 의해 투여하기 위해 제형화될 수 있으며, 약학 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 조제될 수 있다.
조성물은 상기한 종양 항원을 담체와 조합함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 제형은 종양 항원을 액체 담체 또는 미분화된 고체 담체 또는 이 둘다와 균일하고 밀접하게 조합함으로써 제조되며, 이후 필요에 따라 제품으로 성형한다. 본 발명은 본원에 정의된 종양 항원을 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클과 결합 또는 조립하는 것을 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법으로 확대된다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 본 발명의 장치 및/또는 방법을 이용해 식별된 종양 항원; 및 하나 이상의 추가적인 암 치료제를 포함하는 암 치료용 조합 치료제가 제공된다.
바람직하게는, 추가적인 암 치료제는 T-조절성 세포를 하향 조절하므로 가장 적합하게는 사이클로포스파미드를 포함한다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 추가적인 치료제는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 항암제일 수 있다.
바람직하게는, 추가적인 암 치료제는 체크포인트 저해제 (ICI)를 포함한다.
체크포인트를 저해하기 위한 가장 잘 특정화된 경로는 세포독성 T-림프구 단백질 4 (CTLA-4) 경로 및 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 경로 (PD-1/PD-L1)이다. 따라서, 본 발명은 면역억제 종양 환경에 대항하여 강력한 항-면역 반응을 유발하기 위해 항-CTLA-4, 항-PD1 또는 항-PD-L1 분자와 같은 하나 이상의 체크포인트 조절제와 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 하기를 포함하는 체크포인트 저해제로 암을 치료하기 위해 환자를 계층화하는 방법이 제공된다:
i) 환자로부터 종양 샘플을 채취하는 단계;
ii) 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
iii) 상기 유체를 하기를 포함하는 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계: 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널;
iv) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
v) 선택적으로, 상기 장치로부터 iv)의 상기 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
vi) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 인간 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 인간 병원체-유래 항원 또는 그 일부에 대해 서열 상동성/친화성을 가지는지를 확인하는 단계, 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
vii) 상기 펩타이드를 종양 항원으로서 식별하는 단계; 및
viii) 펩타이드가 발견되면, 하나 이상의 체크포인트 저해제 (ICI)를 유효량으로 환자에 투여하는 단계.
본 발명의 또한 추가적인 측면 또는 구현예에서, 하기를 포함하는 체크포인트 저해제로 암을 치료하기 위해 환자를 계층화하는 방법이 제공된다:
환자가 CMV-혈청양성인지 확인하는 단계, 및 그러한 경우, 하나 이상의 체크포인트 저해제 (ICI)를 유효량으로 사용해 치료하기 위한 환자를 선별하는 단계.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 하기를 포함하는 암 치료 방법이 제공된다:
i) 환자로부터 종양의 샘플을 입수하는 단계;
ii) 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
iii) 상기 유체를 하기를 포함하는 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계: 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널;
iv) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
v) 선택적으로, 상기 장치로부터 iv)의 상기 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
vi) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 인간 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 인간 병원체-유래 항원 또는 그 일부에 대해 서열 상동성/친화성을 가지는지를 확인하는 단계, 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
vii) 상기 펩타이드를 종양 항원으로서 식별하는 단계; 및 상기 펩타이드를 유효량으로 환자에 투여하여, 종양 항원, 즉 샘플이 채취된 암에 대해 T-세포를 자극 또는 활성화하거나, 또는 종양 항원을 이용해 종양 항원에 대하여 활성인 T-세포 집단을 증폭시킨 후 T-세포를 환자에 투여하는 단계.
본 발명의 또한 추가적인 측면 또는 구현예에서, 하기를 포함하는 암 치료 방법이 제공된다:
환자가 CMV-혈청양성인지 확인하는 단계, 및 그러한 경우, 하나 이상의 체크포인트 저해제 (ICI)를 유효량으로 환자에 투여하는 단계.
본 발명의 다른 추가적인 측면에서, 하기를 포함하는 아데노바이러스 암을 치료하기 위해 환자를 계층화하는 방법이 제공된다:
i) 환자로부터 종양의 샘플을 입수하는 단계;
ii) 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
iii) 상기 유체를 하기를 포함하는 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계: 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널;
iv) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
v) 선택적으로, 상기 장치로부터 iv)의 상기 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
vi) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 인간 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 인간 병원체-유래 항원 또는 그 일부에 대해 서열 상동성/친화성을 가지는지를 확인하는 단계, 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
vii) 상기 펩타이드를 종양 항원으로서 식별하는 단계; 및
viii) 펩타이드가 확인되면, 펩타이드를 아데노바이러스 벡터의 캡시드에 부착하고, 이 아데노바이러스 벡터를 유효량으로 환자에 투여하는 단계.
바람직한 구현예에서, 펩타이드는 WO 2015/177098에 기술되거나 및/또는 본원에 수록된 바와 같이 공지된 기술을 이용해 아데노바이러스 벡터에 부착하며, PeptiCRAd 제조를 참조한다.
본원에서 "유효량"에 대한 언급은 암 세포 사멸과 같이 요망되는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이다.
유효한 투여량은 수여체의 나이, 성별, 건강 및 체중, 병용 치료의 유형, 존재할 경우, 치료 빈도 및 원하는 효능의 특성에 따라 결정될 것이다. 전형적으로, 유효량은 치료를 주관하는 사람에 의해 결정된다.
가장 바람직하게는, 본원에서 언급되는 암은 다음과 같은 암들 중 어느 하나를 포함한다: 비인두암, 활막암, 간세포암, 신장암, 결합 조직 암, 흑색종, 폐암, 장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암 (oral cancer), 간암, 골암, 췌장암, 융모암, 가스트린종, 갈색세포종, 프로락틴종, T-세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우 질환, 졸린거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 핍지교종, 신경모세포종, 수막종, 척수 종양, 골연골종, 연골육종, 유잉 육종, 미확인 원발 부위 암, 유암종, 위장관의 유암종, 섬유육종, 유방암, 파제트 질환, 자궁경부암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안구암, 목암, 신장암, 윌름 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 고환암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 부갑상선 암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 영양막 암 (trophoblastic cancer), 포상 기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부 암, 청신경종, 균상 식육종, 인슐린종, 유암종 증후군, 소마토스타틴종, 치은암, 심장암, 입술암, 뇌척수막암, 구강암 (mouth cancer), 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 혀암 및 편도암.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 샘플은 흑색종으로부터 채취되며, 종양 항원은 CMV 항원 또는 펩타이드에 대해 상동적이다.
후술한 청구항 및 본 발명의 전술한 설명에서, 명시적 표현 또는 필연적인 암시로 인해 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고는, 용어 "들을 포함한다" 또는 "를 포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형어는 포괄적인 의미로, 즉 언급된 특징들의 존재를 명시하지만, 본 발명의 다양한 구현예들에서 추가적인 특징들의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 의미로 사용된다.
본 명세서에 인용된 임의의 특허 또는 특허 출원을 비롯한 모든 참조문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 임의의 참조문헌이 선행 기술을 구성하는 것으로 인정하는 것은 아니다. 나아가, 임의의 선행 기술이 당해 기술 분야의 공통적인 일반 지식의 일부를 구성하는 것으로 인정하는 것은 아니다.
본 발명의 각 측면에 대한 바람직한 특징들은 임의의 다른 측면들과 연계하여 기술되는 바와 같을 수 있다.
본 발명의 다른 특징들은 하기 실시예들에서 명확해질 것이다. 일반적으로 말해, 본 발명은 (첨부된 청구항 및 도면을 비롯하여) 본 명세서에 개시된 특징들 중 임의의 새로운 특징 또는 이들의 임의의 새로운 조합으로까지 확장된다. 따라서, 본 발명의 구체적인 측면, 구현예 또는 실시예와 연계하여 기술된 특징, 정수, 특성, 화합물 또는 화학적 모이어티는 서로 비-호환성이지 않은 한 본원에 기술된 임의의 다른 측면, 구현예 또는 실시예에도 적용가능한 것으로 이해되어야 한다.
아울러, 달리 언급되지 않은 한, 본원에 개시된 임의의 특징은 동일하거나 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다.
본 명세서의 설명 및 청구항 전체에서, 단수는 문맥상 달리 요구되지 않은 한 복수를 포괄한다. 구체적으로, 부정 관사가 사용되는 경우, 본 명세서는 문맥상 달리 요구되지 않은 한 복수형뿐 아니라 단수형을 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
이제 본 발명의 구현예는 하기를 참조하여 단순 예로서 기술될 것이다:
도 1. [A] 내부 PeptiCHIP . PeptiCHIP 내부는 바이오틴이 부착된 링커가 코팅된 수천개의 돌기들로 구성된다. 바이오틴은 이후 스트렙타비딘와 반응하며, 스트렙타비딘은 향후 HLA-특이적인 포획 항체 분자 3개와 반응할 수 있다. [B]. 신 속한 항원 발굴을 위한 새로운 면역정제 플랫폼으로서 마이크로칩 기술.
개발된 새로운 마이크로칩 방법을 기술한 개략도. 자유 표면 티올이 병합된 티올-엔 마이크로칩을 바이오틴-PEG4-알킨 티올렌 (단계 1)으로 유도체화하고, 스트렙타비딘 층으로 관능화한 (단계 2) 다음, 바이오틴화된 범-HLA 항체를 미세돌기 표면에 고정하고 (단계 3), 세포용해물을 마이크로칩에 로딩한다 (단계 4). 적절한 인큐베이션 시간 및 세척 단계를 수행한 후, 7% 아세트산을 첨가하여 HLA 분자를 용출시킨다 (단계 5).
도 2. 바이오틴화된 범- HLA 항체를 이용한 마이크로칩 관능화의 선택성 특징 규명.
A) 2가지 스트렙타비딘 인큐베이션 시간 (15분 및 1시간)에 따른, 바이오틴-PEG4-알킨으로 미리 코팅된 티올-엔 미세돌기 상의 AlexaFluor 488-스트렙타비딘의 결합 효능. B) AlexaFluor 488-표지된 2차 항체를 통해 정량한, 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 양에 대한 스트렙타비딘 (비-형광성)의 농도 효과. C) AlexaFluor 488-표지된 2차 항체를 통해 정량한, 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 양에 대한 BSA의 인큐베이션 효과. 비-특이 결합 부위를 차단하는 BSA 효과는 바이오틴화된 범-HLA 항체를 고정하기 (BSA-panHLA) 전 또는 고정한 (panHLA-BSA) 후 미세돌기 어레이를 BSA로 사전-처리함으로써 평가하였다. D) 로딩 사이클 횟수에 따른 단일 칩 상에 결합된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 총량. 각 사이클에서, 동일한 (일정한) 농도의 신선한 범-HLA 항체 배치를 사용하였다. 유의성은 양측 독립표본 스튜던트 t-검정 (two-tailed unpaired Student's t-test)으로 분석하였다, * p<0.05.
도 3. JY 세포주로부터 입수한 HLA -I 펩티돔 데이터세트의 특성. A) 50x106, 10x106 및 1x106 JY 세포로부터 용출된 고유한 펩타이드의 개수. B) JY 세포주로부터 유래한 데이터세트 3종에서 HLA 펩타이드의 전체 펩타이드 길이 분포. C-E) 50x106 (C), 10x106 (D) 및 1x106 (E)에서 HLA 펩타이드의 길이 분포를 고유한 펩타이드의 개수 (좌측 y 축) 및 출현 빈도 % (우축 y 축)에 대해 도시한다.
도 4. JY 세포주로부터 단리한 HLA 리간드에 대한 정확 분석 . A) 용출된 9mer를 HLA-A*02:01 및 HLA-B*07:02 결합 친화성에 대해 분석하였다. NetMHCpan 4.0 서버 (적용 순위 2%)에서 결합 물질 (녹색 점) 및 비-결합 물질 (검정색 점)을 정의하였다. B) HLA-I 컨센서스 결합 모티프. Gibbs 클러스터링 분석을 수행하여 용출된 9mer 펩타이드들에서 컨센서스 결합 모티프를 정의하였다. 참조 모티프는 상단 우측 코너에 도시한다. 최적으로 적합한 클러스터 (높은 KLD 값, 오렌지색 별표)를 표시하고, 서열 로고는 각 클러스터에 대한 HLA-I의 개수와 함께 표시된다.
도 5A. HEX 알고리즘의 흐름도. 종양 펩타이드 (참조 펩타이드)의 아미노산 구성에 기반하여 행렬을 작성하였다. 이 행렬을 이용해 바이러스 데이터베이스를 탐색하고, 수득한 바이러스 펩타이드를 로그-인지 가능성 순서로 순위를 매긴다. 각 바이러스 펩타이드에 대해 정렬 점수 및 MHC-I 결합 예측 점수를 할당한다. 후보 바이러스 펩타이드를 다음과 같은 기준: MHC-I 결합 예측 점수 > 정렬 점수 > B-점수에 따라 순위를 매기고, 점수가 가장 높은 펩타이드를 실험을 통해 분석한다.
도 5B. 기존 소프트웨어의 사용 흐름도. 아미노산 8-12개 길이의 종양 펩타이드 목록을 소프트웨어의 입력값으로 사용하였다. 먼저 툴 BLAST를 사용해 병원체-유래 항원 라이브러리에서 히트 (유사한 서열)를 탐색한다. 이를 위해, 일반적으로 PAM30을 사용하지만, 수개의 진화 거리에 걸친 BLOSUM 및 PAM 치환 행렬이 지원된다. 다음으로, 위치-가중 방식으로 정렬을 개선하기 위해, 적어도 BLOSUM62를, 이상적으로는, 또한 김 등에 의해 개발된 치환 행렬 (BMC Bioinformatics. 2009;10:394. Published 2009 Nov 30. doi:10.1186/1471-2105-10-394 Derivation of an amino acid similarity matrix for peptide: MHC binding and its application as a Bayesian prior. Kim Y, Sidney J, Pinilla C, Sette A, Peters B.)을 이용한 쌍별 정밀 정렬을 수행한다. TCR-상호작용 영역 (펩타이드의 중심 부위)에서 유사성이 높은 펩타이드 쌍에 더 높은 유사성 점수를 할당한다. 마지막으로, 독립형 명령줄 도구로서 NetMHC4.0 또는 NetMHCpan4.1을 사용해 종양 및 바이러스 동족 펩타이드 둘다에 대해 MHC-결합 친화성을 예측한다. 결과는 궁극적으로 툴에서 자동적으로 분석 및 수집되며, 전술한 분석을 요약한 최종 점수가 생성된다.
도 6: 종양 항원에 상동적인 바이러스 펩타이드를 이용한 면역화는 종양 증식을 느리게 한다.
A: 동물 실험의 개략도: 종양 펩타이드와 유사한 바이러스 펩타이드가 종양 증식에 영향을 미칠 수 있는 지를 평가하기 위해, C57BL6 마우스로 구성된 군 4종을 구축하였다. 나이브 마우스 한 군은 모의 군으로 사용하였고, 나머지 군 3종은 각각 서로 다른 바이러스 펩타이드 풀로 면역화하였다. 마우스는 종양 생착하기 전 14일 및 7일에 2번 면역화하였다.
B: 1차 면역화 후 2주 경과 후, 마우스에 뮤라인 흑색종 B16-OVA 세포 3x105개를 피하 주사하였다. 생착 후, 19일간 2일마다 디지털 캘리퍼를 사용해 측정하여 종양 증식을 추적하였다. 이원식 ANOVA 다중 비교 및 터키의 교정 (Tukey's correction)으로 P 값을 계산하였다.
C: 엔드포인트에 도달하면 마우스를 안락사시켰다. ELISpot 분석하기 위해 각 군의 마우스에서 비장세포를 수집하여 합쳤다. 그런 후, 각 풀을 각 바이러스 펩타이드 (TYR1에 상동적인 바이러스 펩타이드, TRP2에 상동적인 바이러스 펩타이드, GP100에 상동적인 바이러스 펩타이드)로 자극하여, 처리 반응을 평가하였다. 점선은 음성 대조군에 의해 수득된 백그라운드를 표시한다.
도 7: MHC에 대해 높은 친화성을 가진 바이러스 펩타이드는 면역원성이 더 높고, 더 강한 교차-반응성 반응을 일으킬 수 있다.
A: 각각의 오리지널 종양 에피토프에 대한 반응을 평가하기 위해, 각 면역화 군으로부터 유래한 비장세포를 합치고, 대응되는 종양 펩타이드로 자극하였다.
B: 비장세포를 바이러스 펩타이드 풀 및 대응되는 오리지널 종양 펩타이드로 자극함으로써 생성된 반응들의 비교.
C: 뮤라인 MHC 클래스 I에 대한 오리지널 종양 및 각각의 유사 바이러스 펩타이드 풀의 친화성 예측. IEDB 가이드라인에 따라 펩타이드를 "고-친화성" 및 "중간/저 친화성"으로 정의하기 위한 역치로 50 nM를 적용하였다.
D: IFN-γ 반응 데이터와 친화성 예측 간의 연관성.
E: 친화성 및 IFN-γ 생산 자극력에 기반한 펩타이드의 계층화. 고 친화성 펩타이드 (IC50 <50nM)는 중간/저 친화성 펩타이드 (IC50 >50nM)와 비교해 INF-γ의 생산을 유의하게 높게 촉진한다. P 값은 만 휘트니 교정과 t-검정을 이용해 계산하였다. P 값 범위는 하기 기준에 따라 %로 표시한다: > 0.05 (ns), ≤ 0.05 (*), ≤ 0.01 (**), ≤ 0.001 (***), ≤ 0.0001 (****).
도 8. 종양 항원에 상동적인 바이러스 펩타이드는 이미 확립된 종양에서 종양 증식을 저하할 수 있다.
A: 동물 실험의 개략도: 검사할 각 종양 세포주에 대해 C57BL 마우스 군 4종을 구축하였다. 0일에 B16-OVA 또는 B16F10 세포를 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 촉진 가능해지면, 마우스에 식염수 (모의 군), 비-코팅 아데노바이러스 (비코팅 바이러스 군), TRP2에 상동적인 바이러스 펩타이드 풀 (Viral PeptiCRAd, VPC)로 코팅된 아데노바이러스 또는 TRP2 펩타이드 (TRP2 PeptiCRAd, TPC)로 코팅된 아데노바이러스를 마우스에 처리하였다.
B: B16 OVA 종양 개개 증식. 치료 성공을 정의하는 역치는 마지막 날 모든 종양 체적의 중앙값으로 확인한다.
C: 엔드포인트 시점에 B16 OVA 종양 체적. 점선으로 나타낸 종양 체적의 중앙값은 치료의 성공 역치를 정의한다.
D: B16 OVA 컨티전시 플롯 (contingency plot)은 각 치료 군 당 반응자의 수를 나타낸다.
E: B16 F10 종양 개개 증식. 치료 성공을 정의하는 역치는 마지막 날 모든 종양 체적의 중앙값으로 확인한다.
F: 엔드포인트 시점에 B16 F10 종양 체적. 점선으로 나타낸 종양 체적은 치료의 성공 역치를 정의한다.
G: B16 OVA 컨티전시 플롯은 각 치료 군 당 반응자의 수를 나타낸다.
(C-F) P 값은 일원식 ANOVA 및 터키 교정을 이용해 계산하였다. p 값 범위는 다음과 같은 기준에 따라 *로 표시하였다: > 0.05 (ns), ≤ 0.05 (*), ≤ 0.01 (**), ≤ 0.001 (***), ≤ 0.0001 (****).
(D-G) P 값은 교차비의 카이 제곱 (및 피셔 정확) 검정으로 계산하였다. p 값 범위는 다음과 같은 기준에 따라 *로 표시하였다: > 0.05 (ns), ≤ 0.05 (*), ≤ 0.01 (**), ≤ 0.001 (***), ≤ 0.0001 (****).
도 9. 높은 수준의 상동성 /친화성을 공유한 바이러스 항원과 종양 항원 간의 T-세포 교차-반응성. HLA-A*02:01이고 혈청 내 항-CMV Ab 수준이 높은 환자로부터 유래한 PBMC를 표 2의 펩타이드로 자극하였다. CD8+ T-세포에 의해 활성화된 분비된 IFN-γ 수준을 ELISpot 분석으로 검정하였다. 점선은 음성 대조군 (DMSO)(A)에서 CTL의 비특이적인 활성화로부터 발생한 노이즈 수준을 표시한다. HLA-A*02:01이고 혈청 내 항-CMV Ab 수준이 높은 환자, 및 CMV 반응 양성으로 확인된 건강한 공여자 (HS)로부터 유래한 PBMC를, CMV-특이적인 HLA-A*02:01 제한 펩타이드 NLVPMVATV를 이용해 ELISpot 분석으로 항-CMV 반응을 검사하였다. P 값은 T-검정 및 만-휘트니 교정을 이용해 계산하였다 (B).
도 10. 마이크로칩 기반의 플랫폼은 희소한 종양 생검에서 면역펩티도믹스 프로파일을 드러낸다. A) 가공 처리하기 전 샘플의 무게, 총 수 및 고유한 펩타이드 및 7-13mer 표본의 농화를 요약 개시한다. B) 절대 개수 및 %에 대한 펩타이드의 길이 분포를 막대 그래프로 도시한다.
도 11. ccRCC 및 방광 종양 환자 유래 오르가노이드 ( PDO )에 대한 면역펩티 도믹 분석. A) ccRCC 및 방광 PDO에서 검출된 고유한 펩타이드의 개수. B) 펩타이드 길이 분포를 고유한 펩타이드의 총 수 (좌측 y 축) 및 각 PDC 당 출현 빈도 % (우측 y 축)(ccRCC 상단 패널, 방광 파단 패널)에 대해 도시한다.
도 12. 펩타이드 검사. Balb/c 마우스에 동계 종양 모델 CT26을 좌측 및 우측 옆구리에 피하 주사하였다 (0일, 도 12A). 종양이 확립되면 (7일, 도 12A), Valo-mD901을 목록 (PeptiCRAd1, PeptiCRAd2, PeptiCRAd3, 표)의 각 폴리라이신-변형된 펩타이드 쌍으로 코팅하여, 우측 종양에만 종양내 주사하였다. PeptiCRAd4는 게놈에 d암호화된 자기-항원으로부터 유래한 CT26의 공지된 면역우세 항원인 gp70423-431 (AH1-5)로 코팅된 Valo-mD901으로 구성된다. 모의 군 및 Valo-mD901 군 역시 대조군으로 사용하였다. 각 처리 군 당 각 마우스 당 단일 종양 증식에서도 확인된 바와 같이, PeptiCRAd1 및 PeptiCRAd2는 주사한 병소에서 대조군뿐 아니라 Valo-mD901의 종양 증식을 개선하였다 (도 12B, 그래프 패널의 우측). 엄격하게는, PeptiCRAd1만 비처리 종양에서 항-종양 활성을 유의하게 개선하였으며, Valo-mD901은 효과를 촉발하지 못하였다 (도 12B, 그래프 패널의 좌측).
PeptiCRAd1의 펩타이드들은 HEX 분석으로부터 유래한 것이다. PeptiCRAd4는 gp70 423-431 (AH1-5)로 코팅된 Valo-mD901로 구성된 것이다.
도 13. 본 발명의 개략도를 도시한다. pMHC (펩타이드: 주 조직적합성 복합체)를 포획할 수 있는 복수의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체로 미리 관능화된 본 발명의 장치가 도표 형태로 도시된다. 종양 세포용해물은 장치를 통해 통과되고, 항체가 pMHC를 추출한다. pMHC를 용출시키고, pMHC 복합체로부터 회수한 펩타이드를, 예를 들어, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광 측정 (LC-MS/MS)에 의해 분석하고, 그 결과 종양 펩타이드 목록이 생성된다. 각 종양 펩타이드를 (항원을 비롯한) 병원체-유래 단백질 라이브러리와 비교해, 장치를 이용하여 식별한 각 종양 펩타이드와 라이브러리에서의 병원체-유래 단백질 (병원성 항원/병원성 펩타이드 함유) 간의 상동성/친화성 수준을 결정한다. 이로써 암 치료에 이용하기 위한, 후보물질 목록이, 이상적으로는 상동성/친화성 측면에서 우선 순위를 둔 후보물질 목록이 생성된다.
표 1. 동물 실험에 이용한 펩타이드 . 공지된 흑색종 종양 펩타이드 (TRP2180-188, hGP10025-33 및 TYR208-216)를 HEX로 분석하였다. 소프트웨어에서 가장 우수한 것으로 제안한 후보 바이러스 펩타이드를 선택하고, 각 오리지널 종양 에피토프 당 가장 우수한 제노펩타이드 4개로 구성된 풀을 생체내에서 검사하였다.
표 2. 환자의 PBMC에 대한 ELISpot 분석에 이용한 펩타이드 . 공지된 흑색종-관련 항원을 HEX로 분석하였다. 각 항원 당 인간 CMV-유래한 가장 우수한 후보 펩타이드를 시험관내 검사하기 위해 선택하였다.
표 3. 마이크로칩-기반의 면역 침강 기술 및 표준 공정 간의 비교 분석. 표는 마이크로칩-기반의 IP 기술 및 표준 공정에 따른 항체의 총 코팅 함량을 기록한다.
표 4. 종양 MHC 제한 펩타이드 13종과 이의 카운터파트 병원체-유래 펩타이드를 식별한 HEX 결과.
표 5. ELISPOT 분석에서 검사한 펩타이드들에 대한 표.
표 6. 도 12에 나타낸 생체내 PeptiCRAd 분석에 선택된 펩타이드들을 열거한 표.
방법 및 재료
장치 제작
본 발명의 장치 (PeptiCHIP)는 바이오틴이 부착된 링커가 코팅된 돌기를 수천개 포함하는 유체-통과 구조이다. 바이오틴은 스트렙타비딘과 연결되고, 스트렙타비딘에는 HLA-특이적인 포획 항체, 구체적으로 HLA-특이적인 포획 항체 분자 3개가 결합된다.
통상적인 미세유체 제조 기술을 이용해, PeptiCHIP의 제작은 다음과 같은 오프-화학량론적 비율 150:100 (테트라티올: 트리알릴)에 따라 티올 관능기와 알릴 ("엔") 관능기 간의 UV-개시 광반응으로 이루어진다.
제작 직후, UV 광중합한 다음 아비딘과 반응시켜 PeptiCHIP을 바이오틴-PEG4-알킨 (Sigma, 764213)으로 관능화한다. 이는 다음과 같이 수행한다.
단계 1: 1 mM 바이오틴-PEG4-알킨 용액 (에틸글리콜 중의 10 mM 바이오틴-PEG4-알킨 원액)을 준비하였다. 소량 취하고, 메탄올 중의 10% 광개시제 원액을 사용해 1% (m/v) 광개시제 (Igracure® TPO-L, BASF)를 첨가하였으며, 따라서 최종 용액은 1 mM 바이오틴 + 1% 루시린 / EG-MeOH 9:1*이다.
EG:MeOH 9:1 (v/v) 중의 바이오틴-PEG4-알킨 및 1% 루시린 용액 1 부피를 칩에 넣고, 1분간 UV에 노출시켰다 (LED UV 램프 l=365 nm, l=15 mW/cm2 사용).
메탄올로 먼저 잘 헹군 다음 milli-Q 워터로 헹구고, 각 용매 1-2 mL로 채널을 씻어낸 후 (필요에 따라) 건조한 상태로 보관하였다.
단계 2: 바이오틴으로 유도체화한 다음, 칩을 스트렙타비딘으로 관능화하였다. PBS 중의 0.01 mg/ml 스트렙타비딘 원액을 준비하고, 이를 칩에 15' 동안 암 조건 하 실온에서 첨가하였다. 이를 PBS 200 ㎕로 3번 헹구었다.
PBS 중의 15 mM의 BSA를 100 ㎍/ml로 첨가하여 10' 동안 실온에 두었다.
단계 3: 항-범-HLA 항체와 반응시켰다. 1.6 ㎍/㎕ 바이오틴 항-인간 HLA-A,B,C (Biolegend CAT. Number 311434) 25 ㎕를 15' 동안 실온에서 첨가하였다. 그런 후, PBS 200 ㎕로 3번 헹군 다음 칩은 MHC 복합체의 면역침강을 위해 준비되었다.
종양 샘플 준비: 세포를 4mM EDTA를 사용해 탈착시켜 PBS로 1번 헹구었다. 25㎕ 1% Igepal/PBS + 프로테아제 저해제를 첨가하였다. 500xg에서 10´동안 +4℃에서 원심분리하였다. 20000xg에서 10´동안 +4℃에서 원심분리하였다.
최적화된 미세유체 돌기 어레이
하나의 미세유체 칩에서, 스트렙타비딘-사전 관능화된 고체 지지체 구조 (즉, 미세돌기 어레이)에 바이오틴화된 범-HLA 항체를 첨가한 다음 범-HLA 항체로 코팅된 고체 표면에 HLA를 고정하여, 면역-정제 단계를 수행하였다.
요컨대, 오프-화학량론적 티올-엔 (OSTE) 폴리머 기반의 미세돌기 어레이는 UV-레플리카 몰딩 기법으로 제작한 다음 바이오틴화하였다. 그런 후, 바이오틴화된 미세돌기에 스트렙타비딘 관능기를 부착하고, 바이오틴화된 범-HLA 항체를 첨가한 다음 HLA-I 복합체를 선택적으로 포획하기 위해 세포 용해물을 미세유체 칩에 직접 로딩하였다. 적절하게 헹군 후, 포획한 HLA-I 복합체는 7% 아세트산을 적용하여 실온에서 용출시켰다 (도 1b). 그런 후, 용출된 HLA 펩타이드를 SepPak®-C18을 사용해 아세토니트릴로 정제한 다음 이를 진공 원심분리를 이용해 건조물로 증발시키는 것을 포함하는, 표준 면역펩티도믹 작업 흐름에 따라 프로토콜을 진행하였다.
미세돌기 어레이 상의 스트렙타비딘 관능화 효과를, 형광성 AlexaFluor488-스트렙타비딘의 보조 하에, 2가지 인큐베이션 시간 (15분 및 1시간)으로 조사하였다. 첫번째 스트렙타비딘 층을 구축하는데에는 더 짧은 인큐베이션 시간도 충분히 긴 것으로 확인되었다 (도 2a). 아울러, 최종 바이오틴화된 범-HLA 항체의 양에 대한 스트렙타비딘 농도 효과를 확인하기 위해, 비-형광성 스트렙타비딘을 여러가지 농도로 바이오틴화된 범-HLA 항체의 양은 고정한 상태에서 검사하였다. 이 경우, 바이오틴화된 범-HLA 항체를 15분간 인큐베이션한 다음 PBS 세척 단계를 3회 수행하였다 (각 단계별 200 ㎕). 각 스트렙타비딘 농도에서 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 양을 정량하기 위해, 형광-표지된 AlexaFluor488 2차 항체를 이용해 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체를 타이트레이션하였다. 흥미롭게도, 심지어 스트렙타비딘 농도 10배 증가시에도 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 양에는 큰 영향이 없었으며 (도 2b), 이는 이용가능한 스트렙타비딘 결합 부위의 개수를 제한하는 입체 장애가 원인일 수 있다. 이러한 발견 사실을 토대로, 스트렙타비딘의 추가적인 농도에 대해서는 조사하지 않았으며, 바이오틴화된 범-HLA 항체의 최대 결합을 확보하기 위해 이후 모든 실험들에서는 스트렙타비딘은 검사한 최고 농도 (0.1 mg/mL)로 사용하였다. 스트렙타비딘 관능화된 미세돌기 표면 상의 항체 결합의 선택성을 추가로 조사하기 위해, 비-특이적인 상호작용을 배제하는 관점에서의 소 혈청 알부민 (BSA)을 이용한 추가적인 코팅 단계가, 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 양에 대한 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해, 스트렙타비딘 관능화 후 BSA (15mM PBS 중의 100 ㎍/mL, 10분 인큐베이션)로 미세돌기 어레이를 사전-처리하고, 이후 형광-표지된 2차 항체를 이용해 바이오틴화된 범-HLA 항체의 효율을 다시 확인하였다. 이러한 과정은 사전-처리되지 않은 표면과 비교해 고정된 범-HLA 항체의 양을 실질적으로 감소시켰으며 (도 2c), 이는 비-특이적인 결합 부위를 간단한 BSA 예비 인큐베이션 단계를 통해 차단할 수 있음을 의미한다. 따라서, BSA 인큐베이션 단계는 향후 모든 실험들에 적용하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 최적화된 프로토콜을 이용해 단일 칩 상에 결합시킬 수 있는 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 최대량을 특정하고자 하였다. 이는 단일 미세유체 칩 당 동일 농도의 새로운 항체 배치 (0.5 mg/mL)를 로딩하는 사이클을 수회 실시함으로써 평가하였다. 이 경우, 고정된 범-HLA 항체의 양은 투입 용액 대 배출 용액에서의 범-HLA 항체의 양을 ELISA 분석으로 비교하여 결정하였다. 고정된 항체의 양은 로딩 사이클 횟수에 따라 거의 선형적으로 증가하는 것으로 관찰되어 (도 2d), 로딩 사이클 횟수에 따른 고정된 바이오틴화된 범-HLA 항체의 총량을 정확하게 적정할 수 있었다. 사이클 7회 실시 후, 고정된 항체의 양은 대략적인 함량 45 ㎍에 도달하였는데, 최신 방법에 따르면 세포 109개를 조사하는데 범-HLA (항체 분자 3.88x1016개) 10 mg이 필요하므로, 이는 적어도 이론적으로 소량의 생물학적 물질에 대한 면역펩티돔을 조사하는데 충분하다 [22A](표 3).
마이크로칩 설정에서, 항체 분자 1.74x1014개를 고정할 수 있었으며, 기술적으로 세포 4.5x106개를 조사할 수 있었다.
면역펩 티도믹 작업 흐름에서 구현되는 마이크로칩-기반의 항원 농화로 천 연적으로 제시된 HLA-I 펩타이드를 식별할 수 있다.
개발된 티올-엔 마이크로칩을 항원 발굴 플랫폼으로 이용할 수 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 인간 B 세포 림프모구성 세포주 JY로부터 HLA 펩타이드를 면역 정제하였다. JY 세포주는 클래스 I HLA를 높은 수준으로 발현하며, 인간 집단에서 공통적인 대립유전자 3종 (HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 및 HLA-C*07:02)에 대해 동형접합성이며, 리간돔 분석에 광범위하게 채택된 바 있다. 결과적으로, JY 세포주는 마이크로칩-기반의 항원 농화 면역 침강 기술을 벤치마킹하는데 적합한 모델로 간주되었다.
그래서, 전술한 바와 같이 소정량의 범-HLA 항체로 관능화된 티올-엔 마이크로칩을 이용해 HLA-I 복합체를 면역친화성에 의해 정제하였다. 아울러, 본 발명의 방식의 민감성을 확인하기 위해, 총 세포수를 50x106, 10x106 및 1x106개 정도로 적은 수로 사용해 시험하였다. 세포용해물을 마이크로칩에 로딩하고, PBS로 적절히 헹군 다음 펩타이드를 7% 아세트산으로 용출시켜 탠덤 질량 분광 측정에 의해 분석하였다. 전체 작업 흐름은, 스트렙타비딘 관능화에서 종양 펩타이드 용출까지 평균적으로 <24시간이 소요된다. 펩타이드 및 단백질 식별에 대해 엄격한 위 발견율 역치 1%를 적용해 신뢰성이 높은 데이터를 구축하였다. 본 발명자들은 세포 50x106, 10x106 및 1x106개로부터 각각 고유한 펩타이드 5589, 2100 및 1804개를 식별할 수 있었다 (도 3a).
본 발명자들은 천연적인 HLA-I 결합 물질을 농화하고 잠재적인 오염 물질의 공동-용출을 회피하는 마이크로칩 기술의 능력을 조심스럽게 분석하고자 하였으므로, 용출된 펩타이드들을 광범위하게 특정화하였다. 먼저, JY 세포주로부터 용출된 펩타이드는 리간돔 데이터 세트의 전형적인 길이 분포를 나타내었으며, 가장 농화된 펩타이드 종은 9mer였다 (도 b-e). 다음으로, JY 세포에서 발현된 HLA-I 대립유전자 2종 (HLA-A*0201 및 HLA-B*0702)에 대해 예측되는 결합 친화성을 결정하였다. JY 세포는 또한 대립유전자 HLA-C*0702의 수준은 낮았지만, 결합 모티프는 HLA-A*0201과 HLA-B*0702의 모티프들과 중첩되며; 그래서 오직 이들 대립유전자들만 후속 분석에서 고려하였다.
고유한 9mer들 중 78%, 83% 및 67%가, 세포 50x106, 10x106 및 1x106개 각각에서 HLA-A*0201 또는 HLA-B*0702 대립유전자에 대해 결합 물질 (NetMHCpan4.0에서 결합 물질로서 설명됨, 적용 순위 2% [24A-26A])인 것으로 예측되었다 (도 4a). 아울러, Gibbs 분석을 수행해, 용출된 9mer 펩타이드로부터 각각의 HLA-I 대립유전자의 컨센서스 결합 모티프를 분리 (deconvolute)하였으며; 이들은, HLA-A*0201 및 HLA-B*0702에 대해 공지된 것과 충분히 매칭되는 P2 및 W 위치에서 잔기에 대한 아미노산 복잡성 저하 선호성을 가진, 2개의 별개의 군으로 클러스터링되어 있었다 (도 4b).
다음으로, 식별한 펩타이드의 역할을 확인하기 위해, 유전자 온톨로지 (G0) 기간 농화 분석을 9mer 결합 물질 소스 단백질 목록에 대해 수행하였다. 본 발명자들은 핵 및 세포내 단백질에서, 주로 DNA, RNA와 상호작용하거나 또는 이화 활성에 참여하는 단백질들에서 농화를 관찰하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 HLA-I과의 복합체에서 마이크로칩 기술의 펩타이드 단리 능력을 추가로 입증하기 위해 시험관내 사멸 분석을 확립하였다. 이를 위해, JY 데이터 세트로부터 펩타이드 3종으로 구성된 세트를 선택하여, HLA-매칭되는 PMBC를 자극하였으며; PBMC에서 CD8+ T 세포를 정제하여, JY 세포와의 공-배양시 작동자 세포로 이용하였다. 자체 작동자 세포로 인한 비-특이적인 세포독성을 확인하기 위해, 대조군으로 비-자극한 PBMC를 이용하였다. 그런 후, 실시간 세포용해를 모니터링하였다. 흥미롭게도, 펩타이드 QLVDIIEKV (서열번호 75; 유전자명 PSME3) 및 KVLEYVIKV (서열번호 76; 유전자명 MAGEA1)로 펄싱된 CD8+ T 세포는 특이적인 세포용해가 약 10%인데 반해, 펩타이드 ILDKKVEKV (서열번호 77; 유전자명 HSP90AB3P)로 펄싱한 CD8+ T 세포는 특이적인 세포용해를 15%로 유도하였는데, 이는 정의된 펩타이드의 존재시 특이적인 세포용해가 이루어짐을 의미한다.
마이크로칩 기술을 통해 식별한 HLA-I 펩타이드 목록의 유효성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 질량 분광 측정을 통해 생성된 면역펩티돔 데이터 세트의 저장소인 SysteMHC를 조사하였다. 본 데이터에서 식별된 고유한 9mer 결합 물질들 중 69%, 77% 및 81%가 세포 50x106, 10x106 및 1x106개 각각에 대해 JY 세포주로부터 유래한 이전에 발표된 리간돔 데이터 세트에서 발견되었다 (pride ID PXD000394)[3A](도 6a). 아울러, 소스 단백질의 출현 빈도와 HLA 제시 간에는 양의 상관관계가 검증되었으며, 가장 풍부한 단백질은 HLA 펩타이드의 주요 소스였다.
즉, 이들 결과는, 칩-기반한 프로토콜이 면역펩티돔 작업 흐름에서 신뢰할 수 있는 면역 침강 플랫폼으로서 이용할 수 있음을, 입증해준다.
장치 사용
칩에 샘플 적용 및 추후 분석을 위한 분획 용출
본 발명자들은 샘플을 복수의 사이클로 적용하고, 5분간 (4℃에서 작동) 인큐베이션하였다. PBS 200 ㎕로 3번 헹구고, 마지막 세척액을 흡인하여 칩을 비웠다. 50% MeOH 및 50% MilliQ 용액을 준비하였다. 이전의 용액을 이용해 7% 아세트산 용액을 준비하였다. 이 용액을 칩에 적용하고, 분획을 수집하였다. 용출 시간은 5분이었다. 동일한 날, 수집한 분획들을 정제하였다. 각 조직 샘플 - HLA-I 펩타이드 샘플에 대해 SepPak 카트리지를 준비하고, 이를 표지하였다. 주사기 및 접용 어댑터를 사용해, 카트리지를 0.1% TFA 중의 80% ACN 1 ml로 먼저 한번 헹군 다음 0.1% TFA 1 ml로 헹구었다. SepPak 카트리지에 생물 샘플을 각각 로딩하였다. 이를 천천히 통과시켰다 (속도: 약 1 ml/20초). 카트리지를 0.1% TFA 1 ml로 2회 헹구었다. 0.1% TFA 중의 30% ACN 300 ㎕를 사용해 HLA 결합 펩타이드를 수집관으로 용출시켰다.
HEX ( 제노펩타이드의 상동성 평가)
제노펩타이드의 상동성 (친화성) 평가 (HEX)는 종양 펩타이드 (참조 펩타이드) 및 바이러스와 같은 병원체-유래 펩타이드 (쿼리 펩타이드) 간의 유사성을 비교하는 새로운 인 실리코 플랫폼이다. 이는 후보 펩타이드 선별을 수행하기 위해 몇가지 행렬을 이용한다. 이는 새로운 방법 (펩타이드 점수 평가 및 정렬 점수 평가 알고리즘) 및 통합된 기존 방법 (MHC-I 결합 예측)을 둘다 통합함으로써 수행된다. HEX에는 바이러스 병원체 및 인간 프로테옴으로부터 유래한 단백질과 같은 공지된 단백질들이 미리 컴파일링된 데이터베이스 여러개가 부록된다 (33).
조합 점수 평가 행렬 (associated scoring matrix)이 실험에 의해서와는 대조적으로 참조 펩타이드의 아미노산 구성에 기반하여 임시로 생성하였다. 구체적으로, 펩타이드에서 아미노산 위치를 나타낸 열과 표준 아미노산 20종 각각을 나타낸 줄로 구성된 행렬에서, 참조 펩타이드의 아미노산 위치에는 동일한 높은 점수를 할당하고, 다른 위치에는 동일한 낮은 점수를 할당하였다.
정렬은 참조 세트에 대한 쿼리 세트에서의 펩타이드 쌍으로 계산한다. 주어진 펩타이드 쌍에 대해, 동일 위치에서의 아미노산 쌍 간의 거리 점수를 합산해 정렬을 계산한다. 펩타이드에서 더 중심적인 아미노산들 간의 유사성에 우선 순위를 부여하기 위해 점수 평가에서 가중치를 두었다. HEX는 수개의 진화 거리에 걸친 BLOSUM 및 PAM 치환 행렬을 둘다 지원한다. 구체적으로, 본 실험에서 선택한 행렬은 BLOSUM 62이었다.
MHC 클래스 I 결합 친화성 예측은 IEDB (http://tools.iedb.org/main/tools-api/)의 애플리케이션 프로그래밍 인터페이스를 통해 NetMHC [27]를 이용해 수행한 다음 툴에서 분석 및 수집한다. 사용자는 원하는 점수 평가 방법을 지정하거나 또는 권장되는 여러가지 결과들을 복구할 수 있다. 다수의 인간 및 뮤라인 MHC-I 대립유전자에 대한 예측이 지원된다.
사용자는 자체 기준에 따라 펩타이드를 선택할 수 있거나, 또는 무작위 포레스트 모델을 통해 펩타이드를 선택할 수 있다. 무작위 포레스트는 사용자가 선택한 펩타이드의 실험 결과에 대해 훈련된다. 평균 제곱 오차 (MSE)에서 OOB (out-of-bag) 증가에 의해 특징 중요도를 결정하고, 펩타이드 미확인 샘플에 대해 교차 검증한다. HEX는 R 패키지 Shiny를 이용한 웹 어플리케이션으로서 개발되었으며, https://picpl.arcca.cf.ac.uk/hex/app/에서 사용자 등록없이 사용할 수 있다. 소스 코드는 https://github.com/whalleyt/hex에서 이용가능하다.
본 발명의 대안적인 구현예에서, HEX는 수개의 진화 거리에 걸친 BLOSUM 및 PAM 치환 행렬 둘다 지원한다. 구체적으로, 본 실험에서 사용한 행렬은 BLOSUM 62이다. HEX는 먼저 참조 라이브러리에서 히트 (유사한 서열)를 탐색하기 위해 PAM30을 이용하여 BLAST 검색을 수행한다. 그런 후, HEX는 김 등에 의해 개발된 치환 행렬 및 BLOSUM62 둘다를 이용한 쌍별 정밀 정렬을 수행한다.
참조: Kim Y, Sidney J, Pinilla C, Sette A, Peters B. Derivation of an amino acid similarity matrix for peptide: MHC binding and its application as a Bayesian prior. BMC Bioinformatics. 2009;10:394. Published 2009 Nov 30. doi:10.1186/1471-2105-10-394.
MHC 클래스 I 결합 친화성 예측은 독립형 명령줄 도구로서 NetMHC4.0 (또는 NetMHCpan4.1)을 사용해 수행한 다음 툴에서 분석 및 수집한다. 사용자는 원하는 점수 평가 방법을 지정할 수 있거나 또는 권장되는 여러가지 결과들을 복구할 수 있다. 다수의 인간 및 뮤라인 MHC-I 대립유전자에 대한 예측이 지원된다.
환자 및 샘플
4기 전이성 흑색종 환자 총 16명에 헬싱키 대학 중앙 병원 (HUCH) 종합 암 센터에서 항-PD1 단일클론 항체로 치료하였다. 환자는 2주마다 니볼루맵 (Nivolumab)(n=7) 또는 3주마다 펨브롤리주맵 (Pembrolizumab)(n=9)을 주입 투여하도록 무작위 선정하였다. 실험은 헬싱키 대학 중앙 병원 (HUCH) 윤리 위원회 (Dnro 115/13/03/02/15)로부터 승인받았다. 모든 환자들로부터 고지에 입각한 서면 동의를 받았으며, 실험은 헬싱키 선언에 따라 수행하였다.
말초혈 샘플 (3 ml EDTA 혈액, 50 ml 헤파린 혈액)을 3가지 시점에서 수집하였다: 처리 개시 전, 1달 치료 후 및 3달 치료 후. 이로부터 원심분리하여 혈장을 분리하여, -70℃에서 보관하였다. 해동한 EDTA 혈장 샘플에서 CMV 및 EBV IgG 수준을 VIDAS CMV IgG (BioMerieux, Marcy-l'Etoile, France) 및 Siemens Enzygnost 항-EBV/IgG 키트 (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany)를 사용해 측정하였다. 해동한 헤파린 혈장에서 면역글로불린 (IgA, IgM, IgG)은 헬싱키 대학 중앙 병원 (HUSLAB)의 중앙 실험실에서 측정하였다.
세포주 및 인간 샘플
뮤라인 흑색종 세포주 B16-F10을 ATCC (American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 매나사스)에서 구입하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청 (FBS) (Life Technologies), 1% Glutamax (Gibco, Thermo Fisher Scientific, US) 및 1% 페니실린과 스트렙토마이신 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, US)이 첨가된 RPMI (Gibco, Thermo Fisher Scientific, US)에서 37℃/ 5% CO2 하에 배양하였다.
닭 오발부민 (OVA)을 구성적으로 발현하도록 변형된 마우스 흑색종 세포주인 세포주 B16-OVA를 리차드 바일 교수 (미국 미네소타주 로체스터, 마이오 클리닉)로부터 친절하게 제공받았다. 세포는 10% FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific, US), 1% Glutamax, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, US)과 1% Geneticin (Gibco, Thermo Fisher Scientific, US)이 첨가된 글루코스 저 농도 RPMI (Gibco, Thermo Fisher Scientific, US)에서 37℃/ 5% CO2 하에 배양하였다.
모든 세포는 시판 검출 키트 (Lonza - Basel, Switzerland)를 사용해 마이코플라스마 오염을 검사하였다. 단리한 인간 PBMC는 10% DMSO가 첨가된 FBS에서 냉동한 후 사용시까지 액체 질소에서 유지하였다. 저온보존한 PBMC를 해동하고, ELISPOT 분석을 위해 이를 도말하기 전, 10% FBS, 1% Glutamax, 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 완전 RPMI 배지에서 밤새 37℃/ 5% CO2 하에 회복시켰다.
펩타이드
본 실험에서 이용한 모든 펩타이드들은 Zhejiang Ontores Biotechnologies Co. (Zhejiang, China)에서 5 mg, >90% 순도로 구입하였다. 본 실험에 이용한 모든 펩타이드 서열은 표 1 및 2에서 확인된다.
PeptiCRAd 제조
본 연구에서 언급되는 모든 PeptiCRAd 복합체들은 아데노바이러스 및 폴리K-꼬리가 달린 펩타이드를 다음과 같은 프로토콜에 따라 혼합하여 준비하였다: 1x109 vp(바이러스 입자)를 (수 중에 현탁한) 폴리K-꼬리가 달린 펩타이드 20 ㎍과 혼합하고; 볼텍싱한 후 혼합물을 실온에서 15분간 인큐베이션하고; 인큐베이션한 후 주입 부피 (50 ㎕/마우스)까지 PBS를 첨가하여 용액을 다시 볼텍싱한 다음 분석 또는 동물 주사용으로 사용하였다. TRP2-PeptiCRAd의 경우, 1x109 vp를 6K-TRP2180 -188 펩타이드 20 ㎍과 혼합하였으며, Viral-PeptiCRAd는 1x109 vp를 TRP2180 -188에 대해 상동적인 각 바이러스 6K-펩타이드 5 ㎍과 혼합하여 준비하였다.
새로운 PeptiCRAd는 신선한 시약을 사용해 각 실험 전 준비하였다. PeptiCRAd 조제물에 대해 인큐베이션하기 전 필요한 바이러스 및 펩타이드 희석물들은 모두 멸균 PBS 또는 물을 이용해 준비하였다. 그런 후, PeptiCRAd를 분석에 필요한 완충제로 희석하였다.
바이러스는 도처에 기술된 방법에 따라 구축, 증폭 및 특정화하였다 [20].
동물 실험 및 윤리적 허가
모든 동물 실험은 헬싱키 대학의 실험 동물 위원회 및 핀란드 남부 지방 정부로부터 검토 및 승인받았다.
모든 실험은 Scanbur (Karlslunde, Denmark)에서 입수한 C57BL/6JOlaHsd 마우스를 이용해 수행하였다.
면역화 실험에서는, 8-9주령의 면역 적격 암컷 C57BL/6J 마우스를 4개의 군으로 나누었다. 모의 군은 n = 마우스 3마리를 사용하였고, 서로 다른 처리 군 3종 각각은 n = 마우스 7마리로 구성하였다. 각 처리 군에는 서로 다른 군의 제노펩타이드를 백신 접종하였다. 마우스에는 백신을 2번 접종하였으며, 주사는 펩타이드 40 ㎍ 및 보강제 (VacciGrade 폴리(I:C) - Invivogen) 40 ㎍을 최종 주사 부피 100 ㎕로 꼬리 기저부에서 1주 간격으로 (0일 및 7일) 수행하였다. 나이브 마우스 (PBS 주사)를 모의 군으로 이용하였다. 14일차에, 마우스에 B16-OVA 세포 3*105개를 우측 옆구리에 주사하고, 엔드포인트에 도달할 때까지 종양 증식을 추적하였다.
확립된 종양을 치료하기 위해, 본 발명자들은 종양 세포주 2종을 검사하였다: B16-OVA 세포와 더 공격적인 B16F10 세포. B16-OVA 세포 3*105개 및 B16-F10 세포 1*105개를 8-9주령의 면역 적격 암컷 C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 이어, 이들 마우스를 각 종양 세포주에 대해 마우스 7-8마리로 구성된 군 4종으로 무작위 할당하였다. 모의 군은 PBS를 처리하였으며; 제2 군에는 비-코팅 아데노바이러스를 처리하고; 제3 군에는 TRP2180 -188 (TRP2-PeptiCRAd)로 코팅된 아데노바이러스를 처리하고; 마지막 군에는 TRP2-상동적인 바이러스 펩타이드 (Viral-PeptiCRAd)로 코팅된 아데노바이러스를 처리하였다.
마우스에는 종양내 2번 처리하고, 주사는 2일 간격 (종양 생착으로부터 10일 및 12일)으로 수행하였으며, 엔드포인트에 도달할 때까지 종양 증식을 추적하였다. 마지막 날 종양 체적 측정 중앙값은 점선으로 나타낸 치료 성공 역치를 표시한다. 엔드포인트에 종양 체적이 역치 미만인 마우스는 반응자로 간주하고, 역치보다 높은 마우스는 비-반응자로 간주하였다.
종양 증식은 디지털 캘리퍼를 사용해 종양의 2가지 치수를 측정하여 추적하였다. 이어, 체적은 하기 식에 따라 수학적으로 계산하였다:
((긴 변) x (짧은 변)2 )/2
모든 실험들에서, 종양 크기가 허용 최대치에 도달할 때까지 2일 또는 3일 간격으로 측정하였으며, 이후 마우스를 희생시키고 비장을 수집하였다.
ELISpot 분석
활성형의 항원 특이적인 T-세포의 양을 분석하기 위해, 인터페론- γ (IFN-γ) 분비를 뮤라인 IFN-γ에 대해 IMMUNOSPOT (CTL, Ohio USA)에서 그리고 인간 IFN-γ에 대해 MABTECH (Mabtech AB, Nacka Strand, Sweden)에서 ELISPOT 분석으로 측정하였다.
실험 종료 시점에 수집한 신선한 마우스 비장세포를 이용하였다. 절차는 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게는, 뮤라인 IFN-γ의 경우, 웰 당 비장세포 3*105개를 0일에 접종하였다. 세포는 펩타이드 2 ㎍/웰로 자극하였다. 37℃/ 5% CO2에서 3일간 인큐베이션한 후, 키트의 프로토콜에 따라 플레이트를 현상하였다.
인간 IFN-γ ELISPOT의 경우, 인간 PBMC를 해동하고, 완전 배지에서 37℃/ 5% CO2 하에 밤새 회복시켰다. 다음날 웰 당 PBMC 3x105개를 접종하고, 펩타이드 2 ㎍/웰로 자극하였다. 37℃/ 5% CO2에서 48시간 인큐베이션한 후, 플레이트를 제조사의 프로토콜에 따라 현상하였다. 플레이트를 분석하기 위해 CTL-Europe GmbH로 이송하였다.
세포주 및 시약들
EBV-형질전환된 인간 림프모구성 B 세포주 JY (ECACC HLA-type collection, Sigma Aldrich)는 1% GlutaMAX (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 10% 열-불활화된 소 태아 혈청 (HI-FBS, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 첨가된 RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다.
스트렙타비딘 (스트렙토마이세스 아비디니, 친화성 정제됨, 10 mm 포타슘 포스페이트로부터 동결건조, ≥13 U/mg 단백질)은 Sigma-Aldrich (Saint Louis, Missouri, USA) 사에서 구입하였다.
바이오틴-접합된 항-인간 HLA-A, B, C 클론 w6/32는 분석하기 위해 Biolegend (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
다음과 같은 펩타이드는 Ontores Biotechnologies Co., Ltd. 사에서 구입해 실험 전체에 사용하였다: KVLEYVIKV (서열번호 75; 유전자명 MAGE A1), ILDKKVEKV (서열번호 76; 유전자명 HSP90) 및 QLVDIIEKV (서열번호 77; 유전자명 PSME3).
아울러, 다음과 같은 펩타이드는 Chempeptide (Shangai, China)에서 구입하였다:
VIMDALKSSY (서열번호 78; 유전자명 NNMT), FLAEGGGVR (서열번호 79; 유전자명 FGA) 및 EVAQPGPSNR (서열번호 80; 유전자명 HSPG2).
난소 종양 생검 및 윤리적 고려
고지에 입각한 동의서에 서명한, 난소 전이성 종양 (고 등급 중증)을 가진 환자로부터 북부 사보 병원 디스트릭트의 연구 윤리 위원회로부터 승인 번호 350/2020으로 승인받은 실험 하에, 난소 종양 생검을 수집하였다. 샘플을 작은 조각으로 자르고, D형 콜라게나제 (Roche) 1 mg/ml, 히알루로니다제 (Sigma Aldrich) 100 ㎍/ml 및 DNase I (Roche) 1 mg/ml이 함유된 분해 완충제를 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 세포 현탁물을 500 ㎛ 및 300 ㎛ 세포 스트레이너 (pluriSelect)를 순차적으로 통과시켜, 단일 세포를 수득하였다.
신장 세포 암종 및 방광 종양 샘플 및 윤리적 고려 사항
오르가노이드 배양물에 대한 환자 조직 샘플은 헬싱키 대학 중앙 병원에서 DEDUCER (Development of Diagnostics and Treatment of Urological Cancers)에서 승인 번호 HUS/71/2017, 26.04.2017, 윤리 위원회 승인 번호 15.03.2017 Dnro 154/13/03/02/2016, 및 환자 동의 하에 입수하였다. 신장 샘플은 투명 세포 신장 세포 암종 (ccRCC, pTNM stage pT3a G2)을 가진 성인 남성의 신장 절제로부터 수득하였다. 양성 신장 조직 샘플을 실험에 이용하였다. 암종 요로상피 (방광암, 고 등급, III기, 1x1 cm)를 성인 여성으로부터 수득하고, 암 조직 샘플은 오르가노이드 배양에 사용하였다.
투명 세포 신장암 및 방광 종양 오르가노이드 배양
세포는, 조직을 작은 단편을 분해하고 여기에 콜라게나제 (40 units/ml)를 2-4시간 동안 처리하여, 수술 후 즉시 오리지널 조직으로부터 단리하였다. 투명 세포 신장 세포 암종 환자 세포의 신장의 양성 및 암 세포는 F-배지 [F-12 영양분 혼합물 (Ham) - DMEM (Invitrogen)의 3:1 (v/v), 5% FBS, 8.4 ng/mL 콜레라 독소 (Sigma), 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손 (Sigma), 10 ng/mL 상피 성장 인자 (Corning), 24 ㎍/mL 아데닌 (Sigma), 5 ㎍/mL 인슐린 (Sigma), 10 μM ROCK 저해제 (Y-27632, Enzo Life Sciences, Lausen, Switzerland) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신]과 10% Matrigel (Corning)에서 오르가노이드로서 배양하였다. 방광 종양-유래 오르가노이드는 5% CSFBS (Thermo Fisher Scientific), 10 μM Y-27632 RHO 저해제 (Sigma), 10 ng/mL 상피 성장 인자 (Corning), 1% GlutaMAX (Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% Matrigel이 첨가된 간세포 칼슘 배지 (Corning)[15A]에서 배양하였다. 세포 6x106개를 원심분리를 통해 수집해 PBS 중에 헹궈 Matrigel을 제거하고, 분석하기 전 냉동하였다.
HLA 타이핑
종양 샘플 (ccRCC 및 방광)에 대한 임상 HLA 타이핑은 핀란드 적십자 혈액 서비스의 유럽 면역유전학 연맹 (EFI, European Federation for Immunogenetics)-인증된 HLA 실험실에서 수행하였다. 고전적인 HLA-I 유전자 3종 HLA-A, -B 및 -C의 대립유전자 결정은 표적화된 PCR 기반의 차세대 서열 (NGS) 기법을 제조사 (NGSgo® Workflow, GenDx, Utrecht, The Netherlands)에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행하였다.
4-필드 분해능 수준에서 대립유전자 할당은 IPD IMGT/HLA 데이터베이스 공개 3.33.0, https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/를 이용해 NGSengine Version: 2.11.0.11444 (GenDx, Utrecht, The Netherlands)에 의해 수행하였다.
유세포 측정 분석
다음과 같은 항체를 사용해 HLA-A2 및 HLA-A, B, 및 C의 세포 표면 발현을 분석하였다: PE-접합된 항-인간 HLA-A2 (clone BB7.2, BioLegend 343306 San Diego, CA, USA), PE-접합된 항-인간 HLA-A, B 및 C (clone W6/32, BioLegend 311406, San Diego, CA, USA), 및 인간 TruStain FcX block (BioLegend B247182, San Diego, CA, USA).
데이터는 BDLSR Fortessa 유세포 측정기를 사용해 획득하였다. 신장 세포 암종 및 방광 종양-유래 오르가노이드에 대한 유세포 측정 분석을 BD Accuri 6 plus (BD Biosciences)를 사용해 수행하였으며, FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Ashland, OR, USA)로 분석하였다.
결과
우수한 분자 의태를 이용한 바이러스- 및 종양-유래 펩타이드를 식별하기 위한 제노펩타이드 상동성 평가 (HEX) 개발
바이러스와 종양 간의 분자 의태가 종양 증식에 영향을 미칠 수 있는 지를 조사하기 위해, 높은 수준의 상동성/친화성을 공유한 펩타이드를 식별하는 것이 필요하였다. 그러나, 관련 표적을 이러한 수준으로 식별할 수 있는 도구가 부족하다. 이에, 본 발명자들은 병원체-유래 항원/펩타이드 또는 단백질 서열의 데이터베이스에 대해 입력 서열을 비교하고, 다음과 같은 3가지 기준들 중 적어도 2가지에 기반하여 상동성이 우수한 후보 펩타이드 쌍을 선별하는 장치인, HEX (제노펩타이드의 상동성 평가)를 개발하였다: 1) 주어진 TCR에 의한 펩타이드 인지 가능성에 해당하는 B-점수; 2) TCR과 상호작용하는 영역에서의 유사성을 우선시하기 위한 위치 가중 정렬 점수 (positional weighted alignment score); 3) MHC 클래스 I 결합 친화성 예측 (도 5a). 대안적으로, 도 5b에 나타낸, 전술한 바와 같은 통상적인 소프트웨어를 사용할 수 있다.
본 발명자들은, 여러가지 백신접종 실험에서 성공적으로 적용된 바 있는, 흑색종-관련 항원 3종에서 착수하였다: TRP2180 -188 (티로시나제 -관련 단백질 2), GP10025-33 (PMEL; 프리멜라노솜 단백질) 및 TYR1208 -216 (티로시나제 1). TYR1208 -216은 뮤라인 MHC의 결합 물질인 것으로 예측되지 않으며, 따라서 "관련없는 표적"으로 간주되었다. 본 발명자들은 HEX를 이용해, 입력 종양 에피토프와 높은 수준의 상동성/친화성을 공유한 바이러스 펩타이드들을 식별하였다. 각 오리지널 종양 에피토프 (표 1)별 바이러스-유래 펩타이드 4종으로 구성된 풀을 생체내 추가로 평가하기 위해 선택하였다.
항-바이러스 면역은 종양 항원을 이용한 분자 의태를 통해 종양 증식을 제어한다
바이러스-유래 펩타이드가 종양 증식에 영향을 미치는 지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 C57BL6 마우스를 선택한 바이러스 펩타이드-풀로 면역화한 다음 종양 생착하여 바이러스 감염을 모방하기로 하였다 (도 6a). 면역화한 마우스들 모두 모의 군과 비교해 종양 증식 저하를 나타내었다. 아울러, 처리 군들 간의 유의한 차이도 관찰되었다. 종양 증식은 TRP2 또는 gp100에 상동적인 펩타이드의 바이러스-풀로 면역화한 마우스에서 가장 많이 감소하였다 (도 6b).
선택한 바이러스 펩타이드가 종양 증식의 저하에 기여하는지를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 ELISpot 분석을 위해 엔드포인트에 마우스의 비장세포를 수집하였다 (도 6c). TRP2 또는 gp100에 상동적인 바이러스 펩타이드-풀로 면역화한 마우스의 비장세포는 대조군 TYR1-상동적인 에피토프로 면역화한 마우스의 비장세포와 비교해 종양 증식의 결과와 상관관계로서 더 높은 IFN-γ 반응을 촉진하였다.
본 발명자들은, 각각의 동족 종양 항원에 대해 바이러스 사전-면역화한 마우스로부터 수득한 이들 비장세포의 반응성을 추가적으로 조사하였다 (도 7a). 나란히 비교한 결과, TRP2에 상동적인 바이러스 펩타이드는 동족 종양 펩타이드와 비교해 더 높은 IFN-γ 분비성을 나타내었다 (도 7b). 아울러, 본 발명자들은 C57BL/6J MHC 클래스 I 분자에 대한 각 종양 항원 및 이의 상동적인 바이러스 풀의 친화성을 후향적으로 분석하였으며 (도 7c), IFN-γ 분비를 자극하는 이의 능력과 유의한 상관관계를 관찰하였다 (도 7d). 면역 에피토프 데이터베이스 (IEDB)의 가이드라인에 따라, 본 발명자들은 역치 50 nM을 이용해 고 친화성 및 저 친화성으로 펩타이드를 분류하고 (http://tools.iedb.org/mhci/help/), MHC-I 고 친화성 펩타이드가 MHC-I 저 친화성 펩타이드와 비교해 더 많은 INF-γ 생산을 촉진함을 관찰하였다 (도 7e). 요컨대, 이들 결과는 상동적인 펩타이드를 식별하는 HEX 툴의 예측 효과를 검정해주며, 바이러스와 종양 간의 분자 의태가 교차-반응성 T 세포들에서 항-종양 면역 반응에 역할을 수행한다는 것을 부각시켜준다.
종양 에피토프에 대해 높은 유사성을 공유한 바이러스 에피토프는 확립된 흑생종의 증식을 생체내에서 감소시킨다.
본 발명자들은, 바이러스 항원과 종양 항원 간의 분자 의태가 사전 면역화된 마우스에서 종양 증식에 영향을 미칠 수 있다는 것을 입증하였다. 다음으로, 본 발명자들은 분자 의태 지향-반응이 나이브 마우스에서 이미 확립된 종양에도 영향을 미칠 수 있는 지를 평가하고자 하였다. 이를 위해, 마우스에 B16OVA 종양 또는 더 공격적인 면역억제 B16F10 종양을 이식한 다음, 바이러스 감염을 모방하기 위해 이미 개발된 백신 플랫폼 PeptiCRAd (20)를 처리하였다 (도 8A). 간략하게는, PeptiCRAd는 양으로 하전된 폴리-아미노산 꼬리를 가진 MHC-I 제한된 펩타이드로 코팅된 아데노바이러스로 이루어진 백신 기술이다. 이 경우, 본 발명자들은 1차 생체내 실험으로부터 가장 효과적인 펩타이드 풀을 이용해 진행하였다. 백신은 아데노바이러스를 오리지널 TRP2180 -188 에피토프 (TRP2-PeptiCRAd) 또는 TRP2 (Viral PeptiCRAd)와 유사한 바이러스-유래 펩타이드 대응 풀로 코팅함으로써, 제조하였다. B16OVA (도 8B-C) 및 B16F10 종양 (도 8E-F) 둘다에 대해 종양내 PeptiCRAd 주사는 식염수 완충제 또는 비코팅-바이러스를 처리한 경우와 비교해 종양 진행을 유의하게 감소시켰다. 오리지널 종양 항원 또는 바이러스 상동체가 처리된 마우스는 양쪽 종양 모델들에서 반응자의 수가 유의하게 더 많이 관찰되었다 (도 8D, 8G). 양쪽 종양 모델에서, 본 발명자들은, 마우스에 종양 펩타이드와 유사한 바이러스 펩타이드를 처리한 경우 종양 증식에서 유의한 감소를 관찰하였으며, 이는 재차 분자 의태가 교차-반응성 T 세포와 연관된 항-종양 면역에 기본적인 역할을 할 수 있음을 시사해준다.
CMV 및 종양 항원 간의 분자 의태가 예후를 더 잘 설명할 수 있는지에 대한 연구
본 발명자들은 CMV에 대한 유사성이 높은 종양 펩타이드 목록 (표 2)을 생성하는 HEX를 이용하여 CMV 프로테옴과 비교되는 흑색종-관련 단백질 풀 [ 21]을 선택하였다. 종양 펩타이드 및 이의 CMV 카운터파트를 ELISPOT 분석에 이용하였으며, 반응자 환자에서 PBMC는 항상 바이러스 및 이의 카운터파트 종양 항원 둘다에 반응하는 것으로 확인되었으며, 이는 CMV 감염이, 종양 세포를 공격 및 사멸시켜 혈청양성 환자를 CMV와 유사한 흑색종 특이 에피토프에 대해 더 잘 반응하는 경향으로 만들 수 있는 바이러스 T 세포 클론을 증폭시킴을 시사해준다 (도 9a, b). 안타깝지만, 이러한 관찰 결과는, 바이러스 및 종양 펩타이드가 동일한 T 세포 클론을 확장시켰는지를 직접적으로 보여주지 못하는 한계가 있었다.
새로운 미세유체 칩-기반의 플랫폼은 희소한 종양 생검 조직에서 면역펩 티돔 프로파일을 식별한다.
본 발명자들은 희소한 종양 생검을 조사하기 위한 플랫폼에 도전하였다. 그래서, 환자로부터 난소 전이성 종양 (고 등급 장액성)을 수집하고, 종양 경계에서 단편 4개를 수득하고 (S1, S2, S3 및 S4); 종양의 중앙부에서도 물론 수집하였다 (S5). 다음으로, 샘플 무게를 측정하고, 도 10a에 요약한 바와 같이 크기는 평균적으로 0.01g 내지 0.06g이었다. 샘플을 분해한 후, 수득한 단일 세포 현탁물을 세포용해하고, 마이크로칩을 통해 처리하였다. 펩타이드 및 단백질 식별에 대해 엄격한 위 발견율 역치 1%를 적용해, S1, S2, S3, S4 및 S5에서 각각 고유한 펩타이드 916개, 695,172개, 1128개 및 256개를 식별하였다 (도 10a). 전형적인 리간돔 프로파일과 마찬가지로, 7-13mer 표본에서 일반적인 농화 (>70%)가 관찰되었다 (도 10a). 절대 수 및 %와 관련하여, 아미노산 길이 분포에서, 9mer 표본이 가장 대표적인 것으로 확인되었으며 (도 10b), 이는 본 발명 및 그외 이전의 면역펩티돔 분석을 검증해주었다. 다음으로, 본 발명자들은 유전자 온톨로지 (GO) 농화 분석을 적용하여 본 발명의 데이터에서 발견한 소스 단백질을 추가로 조사하였다. 전형적인 리간돔 프로파일과 마찬가지로, 대사 공정들이 조사한 샘플들 모두에서 농화되었다. 아울러, 분석 결과 본원에서 분석한 난소 장액성 종양의 상피 특성과 일치하는 피부 발달 경로 단백질의 증가가 밝혀졌다. 아울러, 결과들은 희소한 종양 생검을 분석하고 종양 치료를 위한 맞춤형 항원 펩타이드를 수득하기 위해 개발된 미세유체-칩 플랫폼을 이용할 수 있는 가능성을 부각시켜 주었다.
미세칩 -기반의 프로토콜은 환자-유래 오르가노이드에서 면역펩 티돔 환경을 밝혀준다
미세칩 기술은 환자-유래 오르가노이드 (PDO)로부터 세포 6x106개 정도의 적은 수로 사용해 시험 조사하였다. 본 발명자들은 비뇨기과 암에 대한 진행 중인 정밀 의학 실험으로부터 환자 2명을 선택하였으며, 투명 세포 신장 세포 암종 (ccRCC) 환자로부터 양성 및 암 조직 둘다를 함유한 신장 절제 샘플 및 방광암 환자의 1x1 cm 샘플을 3D 일차 오르가노이드 배양으로서 추가로 처리하였다.
개발된 미세칩 기술 및 펩타이드와 단백질 식별에 대해 엄격한 위 발견율 역치 1%를 적용하여, 본 발명자들은 ccRCC 및 방광 PDO 각각에서 고유한 펩타이드 총 576개 및 2089개를 식별할 수 있었다 (도 11a). 회수한 펩타이드 수는 샘플 2종 간에 차이가 있었으며, 방광 샘플이 ccRCC 샘플보다 펩타이드가 더 많았다. HLA 발현은 단리된 HLA-I 펩타이드의 양에 영향을 미치는 것으로 잘 알려져 있으며 [22A], 이와 마찬가지로, 유세포 측정 분석 결과 ccRCC 샘플에서보다 방광에서 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 표면 수준이 더 높은 것으로 밝혀졌으며, 이는 샘플에서 회수되는 펩타이드 수율 차이를 설명해준다. 펩타이드 분석 결과, 리간돔 분석의 전형적인 길이 분포와 일치하여 [33], 9-12mer에 대한 선호성이 드러났다 (ccRCC의 경우 56.4%, 방광 종양의 경우 47.9%)(도 11b). HLA-I 결합 물질을 오염 물질과 구분하기 위해, Gibbs 클러스터링 및 NetMHC4.0 분석을 수행하였다. 먼저, 9mer 디콘볼루션으로, 방광 및 ccRCC PDO에서 각각 55% 및 67%가 환자의 HLA 대립유전자 하나 이상과 일치하는 것으로 확인되었다. 다음으로, NetMHC4.0를 데이터세트에서 식별한 모든 9mer들에 적용하였다. 이 중, 46% 및 69%는 환자의 특이적인 HLA의 결합 물질인 것으로 예측되었다. 다음으로, 본 데이터 세트 양쪽에 존재하는 소스 단백질들을 조사하였다. 이를 위해, 유전자 온톨로지 (GO) 농화 분석을 수행하였다. 본 발명에서 이전의 관찰 결과 및 공개된 데이터와 마찬가지로, 양쪽 샘플 모두 RNA와 상호작용하고 이화/대사 공정에 참여하는 세포내 및 핵 단백질의 농화가 확인되었다.
본 기술을 치료학적 암 백신을 신속하게 개발하는데 이용할 수 있음을 입증하기 위해, 본 발명자들은 사멸 분석을 확립하였다. 본 발명자들은 ccRCC 샘플에 대한 분석에 집중하였다. 본 발명자들은 참조 세트로서 건강한 신장 조직과 PBMC를 이용해 추정의 종양 항원을 선택하기 위해 트랜스크립톰 수준을 이용하였다. 다음으로, 건강한 자원자의 PBMC를 선택 펩타이드로 자극하고, 이들 세포로부터 단리한 CD8+ T 세포를 분석에 이용하였다. 펩타이드 EVAQPGPSNR (유전자명 HSPG2)로 자극된 T 세포는 약 10%의 특이적인 세포용해를 나타내었다.
마지막으로, 본 발명자들은 ccRCC 환자에서 리콜 T 세포 반응을 조사하고자 하였다. 이를 위해, 환자로부터 유래한 미분획 PBMC를 펩타이드 EVAQPGPSNR로 시험관내 자극하고, 비-자극 PBMC는 대조군으로 사용하였다. 이후 유래한 CD8+T 세포를 ccRCC PDO에 첨가하였으며, 대조군 대비 약 7% 사멸 활성 증가가 확인되었다.
환자 오르가노이드 유래 펩타이드는 생체내 실험에서 치료학적으로 유효한 것으로 입증되었다.
펩타이드 목록을 HEX로 분석하였다. 먼저, 소프트웨어에서 동시에 강한 결합 물질 (NetMHC4.0에 따라 컷 오프 IC50 범위 50nM-500nM)이고 더 높은 가중 정렬 점수 (가중 정렬 점수로 표준화한 컷 오프 0.8-1)를 나타낸 펩타이드에 우선 순위를 부여하였다. 후자는 매개 면역 반응을 유도하기 위해 CD8+ T 세포의 TCR에 결합할 가능성이 가장 높은 상호작용 부위에서의 펩타이드 유사성에 대해 집중하였으며; 수득한 펩타이드는 이후 병원체-유래 항원/펩타이드에 대한 전체 동일성 % 및 IC50 결합 친화성 점수에 기반하여 추가로 분류하였다. 궁극적인 결과물은 펩타이드 13종과 이의 카운터파트 병원성 펩타이드로 구성되었다 (표 4).
펩타이드 면역원성을 확인하기 위해, 각 단일 펩타이드를 보강제 폴리(I:C)의 존재 하에 피하 주사하여 마우스를 사전 면역화하고; 마우스 일 군에는 폴리(I:C) 단독 또는 식염수를 물론 대조군으로 주사하였다. 이들 마우스로부터 유래한 비장세포를 회수하고, ELISpot 분석으로 특이적인 자극시 IFNγ 생산을 검사하였다 (표 5).
다음으로, 본 발명자들은 후보 펩타이드가 확립된 종양을 치료하기 위한 암 백신으로서 이용할 수 있는지를 검증하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 종양용해성 아데노바이러스를 (폴리-라이신 링커를 통해) 캡시드 부착된 폴리-라이신 변형된 펩타이드와 조합한, 본 발명자들이 이전에 개발한 암 백신 플랫폼인 PeptiCRAd를 채택하였다. 본원에서 사용한 아데노바이러스는 VALO-mD901이며, 즉 뮤라인 OX40L 및 CD40L을 발현하도록 유전자 변형되고 뮤라인 흑색종 모델에서 종양 증식 제어 및 전신 항종양 반응을 유발하는 것으로 기존에 확인된 것이다. 이에, Balb/c 마우스에 동계 종양 모델 CT26을 좌측 및 우측 옆구리에 피하 주사하였다 (0일, 도 12a). 종양이 확립되면 (7일, 도 12a), Valo-mD901을 본 발명의 목록 (PeptiCRAd1, PeptiCRAd2, PeptiCRAd3, 표 6)의 각 폴리-라이신-변형된 펩타이드 쌍으로 코팅하고, 우측 종양에만 종양내 주사하였다. PeptiCRAd4는 gp70423-431 (AH1-5)으로 코팅된 Valo-mD901로 구성되었다. 모의 군 및 Valo-mD901 군은 물론 대조군으로 사용하였다. PeptiCRAd1 및 PeptiCRAd2는 주사한 병소에서 종양 증식을 대조군뿐 아니라 Valo-mD901에 비해 개선하였다 (도 12b, 우측 패널). 유익하게는, PeptiCRAd1은 효능을 촉발하지 못한 Valo-mD901과 대조적으로 비처리 종양에서 항-종양 증식 제어를 개선하였다.
요약
HEX는 펩타이드 서열을 분석하고 이를 유사성이 높은 서열을 검색하는 병원체-유래 바이러스 프로테옴의 선별된 데이터베이스와 비교하는, 생물정보학 도구이다.
제시된 펩타이드는 주로 MHC의 앵커 잔기와의 상호작용에 참여하므로 [25], 본 발명의 소프트웨어는 TCR과의 상호작용에 대부분 관여하는 위치인 [26], 펩타이드의 중앙 부분에서의 유사성에 우선 순위를 두기 위해 위치 가중치가 부여된 정렬 점수를 회복하였다. 아울러, 본 발명의 표적이 제시되는 에피토프일 가능성을 높이기 위해, 본 발명자들은 실시예에서, IEDB NetMHC 예측 툴 API [27]; 또는 NetMHC4.0 또는 NetMHCpan4.1b를 독립 툴로서 사용해 선택 MHC에 대한 결합 친화성에 따라 수득한 펩타이드의 순위를 매겼다.
본 발명자들은 HEX를 이용해 광범위하게 특정화된 종양 관련 항원 3종에 대해 상동적인 바이러스-펩타이드를 식별하였다.
본 발명자들은, 선택한 바이러스 펩타이드 풀을 이용한 사전 면역화가 종양이 확립되기 전 항-바이러스 면역 상태를 자극하고, 마우스에서 피하 주사된 흑색종 종양 세포의 증식을 효과적으로 서행시킨다는 것을, 확인하였으며, 이는 바이러스-유래 펩타이드에의 사전-노출이 종양 증식에 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미한다.
다음으로, 본 발명자들은, 종양-상동적인 바이러스-유래 펩타이드가, 종양 진행 중 투여시 이미 확립된 종양에 비슷한 효과를 가지는 것으로 관찰하였으며, 이는 종양 진행 중에 발생하는 바이러스 감염이 이의 증식에 여전히 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미한다.
요컨대, 본 발명의 결과들은 바이러스-유래 항원과 종양-유래 항원 간의 분자 의태가 심지어 사전-노출 또는 사전-획득 면역에 의존하지 않으면서 종양 증식에 대한 제어를 발휘할 수 있음을 시사해준다.
새로운 ICPI는 수종의 고형 종양, 특히 전이성 흑색종에서, 방사선 및 화학치료와 같이 다른 통상적으로 사용되는 요법과 비교해, 환자 생존을 현저하게 개선하였다. 그러나, 생존성 및 효과적인 반응율 개선에도 불구하고, 일부 환자에서 ICPI-요법이 유용하지 못한 이유는 아직 알려져 있지 않다. 본 발명의 결과들은, CMV-특이적인 IgG 수준 역가가 높은 환자가 무-진행 생존 기간이 현저하게 더 길다는 것을 보여주었다.
본 발명자들은, 항-CMV-IgG 역가가 높은 환자로부터 유래한 PBMC가 CMV 펩타이드와 비슷한 흑색종 항원과 반응하는 것을 관찰하였다. 이 데이터는 CMV-혈청양성이 흑색종-특이적인 T 세포 면역에 기여함을 보여주며, 즉 ICPI 요법을 진행 중인 환자들에 임상적인 이점을 제공해준다.
본원에서, 본 발명자들은 바이러스 감염이 종양 증식 및 소거에 영향을 미칠 수 있다는 것을, 입증하였다. 아울러, 본 발명자들은 HEX를 이용해 선택한 바이러스- 및 상동적인 종양-유래 항원에 대한 세포독성 T-세포의 교차-반응성을 입증하였다. 본 발명의 결과에 기반하여, 본 발명자들은 분자 의태 현상이 새로운 요법 개발을 위해 향후 이용할 수 있거나, 또는 면역요법과 함께 사용할 경우 이들 요법에 의해 달성되는 항-종양 면역 효과를 잠재적으로 강화할 수 있을 것으로, 결론 내렸다.
아울러, 효과적인 종양 거부 및 보호 전략을 설계하는데에 HLA-I에 결합하는 종양 펩타이드를 신뢰성있게 식별할 수 있어야 한다. HLA-I 복합체로부터 직접적인 펩타이드 식별 역시 여전히 가장 좋은 방법이다. 그럼에도 불구하고, 면역펩티돔 작업 흐름은 상대적으로 복잡하며, 따라서 항원 발굴 공정에서 주요 병목 현상이다. 현재, 기존의 플랫폼에서 소량의 생물학적 물질 (예, 조직 바늘 생검), 샘플 처리, 비용 및 채택된 친화성 행렬 (구축하는데 노동력이 많이 들고 비쌈)로 인한 면역펩티돔 분석 불능은 해결해야 할 주요 기술적인 과제로 언급되어 왔다.
본 연구에서, 본 발명자들은 분석 물질의 제한적인 이용가능성, 소모품 비용 및 긴 프로토콜에 주로 집중하여 리간돔 연구를 방해하는 몇가지 기술적인 문제들을 해결하였다.
본 발명자들은, 바이오틴화된 범-HLA 항체를 스트렙타비딘-관능화된 표면에 고정하기 위해 잘-특정화된 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 이용함으로써, 가교 반응을 통해 준비된 친화성 매트릭스에 기반한 통례적인 기법을 마이크로칩 플랫폼으로 대체할 수 있었다. 재료 (예, 바늘 생검) 부족으로 인한 한계가 미세유체 프로토콜을 개발하는데 영감을 주었다. 본 연구에서, 본 발명자들은 단일 미세유체 칩에서 전체 IP 공정을 수행할 수 있는, 추가적인 2 관능화의 고체 지지체로서 티올-엔 폴리머-기반의 미세돌기 어레이를 수반하는, 맞춤형 마이크로칩 프로토콜을 이용하였다.
시험관내 사멸 분석에서 식별된 펩타이드에 대한 검증에 따르면, 본 발명의 수행으로 식별된 펩타이드가 특이적인 CD8+ T 세포-의존적인 방식으로 세포를 사멸하였으므로, 실제 JY 세포 표면 상에 제시된다는 것이 검증되었다. 본 발명의 데이터 세트에서 발굴된 펩타이드 ILDKKVEKV (서열번호 3)는 특이적인 세포용해를 더 높은 %로 유발하였다.
따라서, 본 발명의 방식은 면역-친화성 정제하기 위한 검토된 바는 도구를 제공해준다.
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SEQUENCE LISTING <110> University of Helsinki <120> Bioinformatics <130> 4649P/WO <150> GB2006760.9 <151> 2020-05-07 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISspot peptide 1 <400> 1 Ser Tyr His Pro Ala Leu Asn Ala Ile 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 2 <400> 2 Ser Tyr Leu Thr Ser Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 3 <400> 3 Tyr Tyr Val Arg Ile Leu Ser Thr Ile 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 4 <400> 4 Ser Tyr Leu Pro Pro Gly Thr Ser Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 5 <400> 5 Arg Tyr Leu Pro Ala Pro Thr Ala Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 6 <400> 6 Lys Tyr Ile Pro Ala Ala Arg His Leu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 7 <400> 7 Ala Phe His Ser Ser Arg Thr Ser Leu 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISspot peptide 8 <400> 8 Asn Tyr Asn Ser Val Asn Thr Arg Met 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 9 <400> 9 Ser Tyr Ser Asp Met Lys Arg Ala Leu 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 10 <400> 10 Phe Tyr Glu Lys Asn Lys Thr Leu Val 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 11 <400> 11 Lys Gly Pro Asn Arg Gly Val Ile Ile 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 12 <400> 12 Phe Tyr Lys Asn Gly Arg Leu Ala Val 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 13 <400> 13 Leu Tyr Lys Glu Ser Leu Ser Arg Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 14 <400> 14 Ser Tyr Arg Asp Val Ile Gln Glu Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISspot peptide 15 <400> 15 Lys Phe Tyr Asp Ser Lys Glu Thr Val 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 16 <400> 16 Lys Tyr Leu Asn Val Arg Glu Ala Val 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISspot peptide 17 <400> 17 His Tyr Leu Pro Asp Leu His His Met 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 18 <400> 18 Ser Gly Pro Asn Arg Phe Ile Leu Ile 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 19 <400> 19 Ser Tyr Ile Ile Gly Thr Ser Ser Val 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 20 <400> 20 Arg Gly Pro Tyr Val Tyr Arg Glu Phe 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 21 <400> 21 Phe Tyr Ala Thr Ile Ile His Asp Leu 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 22 <400> 22 Gly Tyr Met Thr Pro Gly Leu Thr Val 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 23 <400> 23 Ser Tyr Leu Ile Gly Arg Gln Lys Ile 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 24 <400> 24 Ala Gly Ala Ser Arg Ile Ile Gly Ile 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISspot peptide 25 <400> 25 Gln Pro Glu Tyr Ile Glu Arg Leu 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISpot peptide 26 <400> 26 Ser Tyr Ile His Gln Arg Tyr Ile Leu 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ELISspot peptide 27 <400> 27 Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polylysine peptide <400> 28 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Tyr Leu Pro Pro Gly Thr Ser Leu 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polylysine peptide <400> 29 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Tyr Leu Pro Ala Pro Thr Ala Leu 1 5 10 15 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polylysine polypeptide <400> 30 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Ile Pro Ala Ala Arg His Leu 1 5 10 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polylysine peptide <400> 31 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Tyr Lys Glu Ser Leu Ser Arg Leu 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polylysine peptide <400> 32 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Tyr Leu Asn Val Arg Glu Ala Val 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polylysine peptide <400> 33 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Phe Tyr Ala Thr Ile Ile His Asp Leu 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polylysine peptide <400> 34 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe 1 5 10 15 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Viral peptide herpesvirus 2 <400> 35 Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 1 orthoreovirus <400> 36 Phe Ala Trp Pro Arg Leu Phe Glu Leu 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 1 orthoreovirus <400> 37 Leu Arg Trp Thr Arg Leu Ala Leu Leu 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 1 strain ad169 <400> 38 Leu Tyr Gly His Arg Leu Phe Arg Leu 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 1 lister <400> 39 Leu Phe Leu His Leu Leu Gln Leu Leu 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trp2 <400> 40 Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 2 metapneumovirus <400> 41 Leu Asn Tyr Asp Phe Phe Glu Ala Leu 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 2 influenza <400> 42 Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 2 viral core cystein proteinase vaccinia <400> 43 Lys Val Tyr Thr Phe Phe Lys Phe Leu 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 2 protein ul32 herpes <400> 44 Ser Asn Tyr Ser Phe Phe Val Gln Ala 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 3 <400> 45 Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 3 capsid protein papillomavirus <400> 46 Lys Val Pro Leu Asn Ala Asp Val Leu 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 3 orfla protein enteric coronavirus <400> 47 Lys Ala Thr Arg Asn Asn Cys Trp Leu 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 3 epstein barr virus <400> 48 Ala Val Ala Arg Asn Thr Asp Ile Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> viral peptide pool 3 echovirus <400> 49 Ile Val Val Arg Asn His Asp Asp Leu 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ala Met Ala Ser Ala Ser Ser Ser Ala 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr Val 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Leu Ala Arg Leu Ala Ser Ala Ala 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Asn Met Met Gly Leu Tyr Asp Gly Met 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 55 Met Leu Asp Arg Arg Thr Val Glu Met 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 56 Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser Ala 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 57 Asp Met Met Glu Met Pro Ala Thr Met 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 58 Phe Leu Thr Arg Leu Ala Glu Ala Ala 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 59 Cys Met Met Thr Met Tyr Gly Gly Ile 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Molluscum contagiosum virus <400> 60 Ser Tyr His Ala Ala Leu Asn Ala Leu 1 5 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Human adenovirus type 31 <400> 61 His Phe Ser Thr Ser Arg Thr Ser Leu 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Cercopithecine herpesvirus 1 <400> 62 Ala Tyr Gln Asp Thr Lys Arg Ala Leu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Human herpesvirus 7 <400> 63 Phe Tyr Asn Ser Val Asn Thr Arg Asn 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 64 Thr Ile Trp Thr Ser Ala Ser Ser Ile 1 5 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> epstein-barr virus <400> 65 Thr Tyr Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ser 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Orf virus <400> 66 Asn Tyr Tyr Lys Asn Lys Ser Leu Val 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Human adenovirus type 41 <400> 67 Ala Tyr Met Asn Gly Arg Val Ala Val 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Variola virus <400> 68 Lys Asn Pro Asn Arg Phe Val Ile Phe 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 69 Ser His Gln Pro Ala Ala Arg Arg Leu 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza C virus <400> 70 Arg Asn Met Pro Ala Ala Thr Ala Leu 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 71 Ser His Gln Pro Ala Ala Arg Arg Leu 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Molluscum contagiosum virus <400> 72 Tyr Val Phe Arg Leu Leu Ser Thr Ile 1 5 <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <400> 73 Arg Tyr Ala Asp Val Ile Gln Glu Val 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Human adenovirus type 18 <400> 74 Asn Phe Tyr Asn Ser Lys Glu Thr Val 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A1 gene <400> 75 Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP90 gene <400> 76 Ile Leu Asp Lys Lys Val Glu Lys Val 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSME3 <400> 77 Gln Leu Val Asp Ile Ile Glu Lys Val 1 5 <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NNMT gene <400> 78 Val Ile Met Asp Ala Leu Lys Ser Ser Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FGA gene <400> 79 Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg 1 5 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPG2 gene <400> 80 Glu Val Ala Gln Pro Gly Pro Ser Asn Arg 1 5 10

Claims (33)

  1. 하기 단계를 포함하는 종양 항원을 식별하는 방법:
    i) 종양의 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
    ii) 상기 유체를 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계로서, 상기 종양 항원 식별 장치가 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널을 포함하는, 단계;
    iii) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
    iv) 선택적으로, 상기 장치로부터 iii)의 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
    v) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)의 펩타이드를 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 병원체-유래 항원 또는 이의 일부에 대해 상동성 또는 친화성인지를 확인하는 단계, 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
    vi) 상기 펩타이드를 암 요법에 이용하기 위한 종양 항원으로서 식별하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 병원체-유래 항원 라이브러리가 상기 병원체-유래 항원을 포함하는 엄선된 공지된 병원체-유래 단백질 라이브러리 또는 엄선된 공지된 병원체-유래 항원 라이브러리를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 병원체-유래 항원이 인간에 유효한 병원체-유래 항원인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 병원체-유래 항원이 바이러스 항원인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 병원체-유래 항원이 하기 바이러스들 및 이들의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스로부터 유래하는, 방법:
    어비소비리대 (Abyssoviridae); 악커만비리대 (Ackermannviridae); 액탄타비리내 (Actantavirinae); 아데노비리대 (Adenoviridae); 아간타비리내 (Agantavirinae); 아글림비리내 (Aglimvirinae); 알로헤르페스비리대 (Alloherpesviridae); 알파플렉시비리대 (Alphaflexiviridae); 알파헤르페스비리내 (Alphaherpesvirinae); 알파이리도비리내 (Alphairidovirinae); 알파사텔리티대 (Alphasatellitidae;); 알파테트라비리대 (Alphatetraviridae); 알베르나비리대 (Alvernaviridae); 아말가비리대 (Amalgaviridae); 암눈비리대 (Amnoonviridae); 암풀라비리대 (Ampullaviridae); 아넬로비리대 (Anelloviridae); 아레나비리대 (Arenaviridae); 아르쿠아트로비리내 (Arquatrovirinae); 아르테리비리대 (Arteriviridae); 아르토비리대 (Artoviridae); 아스코비리대 (Ascoviridae); 아스파르비리대 (Asfarviridae); 아스피비리대 (Aspiviridae); 아스트로비리대 (Astroviridae); 오토그라피비리내 (Autographivirinae); 아브순비로이대 (Avsunviroidae); 아불라비리내 (Avulavirinae); 바실라드나비리대 (Bacilladnaviridae); 바큘로비리대 (Baculoviridae); 바르나비리대 (Barnaviridae); 바스틸레비리내 (Bastillevirinae); 브클라스비리내 (Bclasvirinae); 벨파오비리대 (Belpaoviridae); 베니비리대 (Benyviridae); 베타플렉시비리대 (Betaflexiviridae); 베타헤르페스비리내 (Betaherpesvirinae); 베타이리도비리내 (Betairidovirinae); 비카우다비리대 (Bicaudaviridae); 비드나비리대 (Bidnaviridae); 비르나비리대 (Birnaviridae); 보르나비리대 (Bornaviridae); 보토우르미아비리대 (Botourmiaviridae); 브록비리내 (Brockvirinae); 브로모비리대 (Bromoviridae); 불라비리내 (Bullavirinae); 칼릭시비리대 (Caliciviridae); 칼부스비리내 (Calvusvirinae); 카르모테트라비리대 (Carmotetraviridae); 카울리모비리대 (Caulimoviridae); 세로니비리내 (Ceronivirinae); 케브루비리내 (Chebruvirinae); 코르도폭스비리내 (Chordopoxvirinae); 크리소비리대 (Chrysoviridae); 쿠비리대 (Chuviridae); 시르코비리대 (Circoviridae); 클라바비리대 (Clavaviridae); 클로스테로비리대 (Closteroviridae); 코모비리내 (Comovirinae); 코로나비리대 (Coronaviridae); 코르티코비리대 (Corticoviridae); 크로카르테리비리내 (Crocarterivirinae); 크룰리비리대 (Cruliviridae); 크루스토니비리내 (Crustonivirinae); 크비비리내 (Cvivirinae); 시스토비리대 (Cystoviridae); 드클라스비리내 (Dclasvirinae); 델타플렉시비리대 (Deltaflexiviridae); 덴소비리내 (Densovirinae); 디시스트로비리대 (Dicistroviridae); 엔도르나비리대 (Endornaviridae); 엔토모폭스비리내 (Entomopoxvirinae); 에쿠아르테리비리내 (Equarterivirinae); 유캄피비리내 (Eucampyvirinae); 유로니비리대 (Euroniviridae); 필로비리대 (Filoviridae); 피모비리대 (Fimoviridae); 피르스트파필로마비리내 (Firstpapillomavirinae); 플라비비리대 (Flaviviridae); 푸셀로비리대 (Fuselloviridae); 가마플렉시비리대 (Gammaflexiviridae); 감마헤르페스비리내 (Gammaherpesvirinae); 게미니아파사텔리티내 (Geminialphasatellitinae); 게미니비리대 (Geminiviridae); 게노모비리대 (Genomoviridae); 글로불로비리대 (Globuloviridae); 고쿠소비리내 (Gokushovirinae); 구에르세이비리내 (Guernseyvirinae); 구타비리대 (Guttaviridae); 한타비리대 (Hantaviridae); 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae); 헤페비리대 (Hepeviridae); 헤렐레비리대 (Herelleviridae); 헤로아르테리비리내 (Heroarterivirinae); 헤르페스비리대 (Herpesviridae); 헥스포니비리내 (Hexponivirinae); 하이포비리대 (Hypoviridae); 하이트로사비리대 (Hytrosaviridae); 이플라비리대 (Iflaviridae); 이노비리대 (Inoviridae); 이리도비리대 (Iridoviridae); 야신카비리내 (Jasinkavirinae); 키타비리대 (Kitaviridae); 라비다비리대 (Lavidaviridae); 라이쉬부비리대 (Leishbuviridae); 레토비리내 (Letovirinae); 레비비리대 (Leviviridae); 리포트릭스비리대 (Lipothrixviridae); 리스피비리대 (Lispiviridae); 루테오비리대 (Luteoviridae); 말라코헤르페스비리대 (Malacoherpesviridae); 마만타비리내 (Mammantavirinae); 마르나비리대 (Marnaviridae); 마르셀레비리대 (Marseilleviridae); 마토나비리대 (Matonaviridae); 맥클레스케이비리내 (Mccleskeyvirinae); 맥클라스비리내 (Mclasvirinae); 메디오니비리대 (Medioniviridae); 메디오니비리내 (Medionivirinae); 메가비르나비리대 (Megabirnaviridae); 메소니비리대 (Mesoniviridae); 메타파라믹소비리내 (Metaparamyxovirinae); 메타비리대 (Metaviridae); 마이크로비리대 (Microviridae); 미미비리대 (Mimiviridae); 모노니비리대 (Mononiviridae); 모노니비리내 (Mononivirinae); 미모나비리대 (Mymonaviridae); 미오비리대 (Myoviridae); 미포비리대 (Mypoviridae); 나이로비리대 (Nairoviridae); 나노알파사텔리티내 (Nanoalphasatellitinae); 나노비리대 (Nanoviridae); 나르나비리대 (Narnaviridae); 낵클라스비리내 (Nclasvirinae); 니마비리대 (Nimaviridae); 노다비리대 (Nodaviridae); 누디비리대 (Nudiviridae); 니아미비리대 (Nyamiviridae); 님박스테르비리내 (Nymbaxtervirinae); 오카니비리내 (Okanivirinae); 오르토코로나비리내 (Orthocoronavirinae); 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae); 오르토파라믹소비리내 (Orthoparamyxovirinae); 오르토레트로비리내 (Orthoretrovirinae); 오우나비리내 (Ounavirinae); 오발리비리대 (Ovaliviridae); 파필로마비리대 (Papillomaviridae); 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae); 파르티티비리대 (Partitiviridae); 파르보비리대 (Parvoviridae); 파르보비리내 (Parvovirinae); 프클라스비리내 (Pclasvirinae); 슈도비리내 (Peduovirinae); 페리부니아비리대 (Peribunyaviridae); 퍼무토테트라비리대 (Permutotetraviridae); 파스마비리대 (Phasmaviridae); 페누이비리대 (Phenuiviridae); 피코드나비리대 (Phycodnaviridae); 피코비르나비리대 (Picobirnaviridae); 피코르나비리대 (Picornaviridae); 피코비리내 (Picovirinae); 피스카니비리내 (Piscanivirinae); 플라스마비리대 (Plasmaviridae); 플레올리포비리대 (Pleolipoviridae); 뉴모비리대 (Pneumoviridae); 포도비리대 (Podoviridae); 폴리시피비리대 (Polycipiviridae); 폴리드나비리대 (Polydnaviridae); 폴리오마비리대 (Polyomaviridae); 포르토글로보비리대 (Portogloboviridae); 포스피비로이대 (Pospiviroidae); 포티비리대 (Potyviridae); 폭스비리대 (Poxviridae); 프로세도비리내 (Procedovirinae); 슈도비리대 (Pseudoviridae); 퀸비리대 (Qinviridae); 쿠아드리비리대 (Quadriviridae); 퀸비리내 (Quinvirinae); 레그레소비리내 (Regressovirinae); 레모토비리내 (Remotovirinae); 레오비리대 (Reoviridae); 레판타비리내 (Repantavirinae); 레트로비리대 (Retroviridae); 랍도비리대 (Rhabdoviridae); 로니비리대 (Roniviridae); 루불라비리내 (Rubulavirinae); 루디비리대 (Rudiviridae); 사르트로비리대 (Sarthroviridae); 세콘드파필로마비리내 (Secondpapillomavirinae); 세코비리대 (Secoviridae); 세도레오비리내 (Sedoreovirinae); 셉비리내 (Sepvirinae); 세르펜토비리내 (Serpentovirinae); 시마르테리비리내 (Simarterivirinae); 시포비리대 (Siphoviridae); 스마코비리대 (Smacoviridae); 솔레모비리대 (Solemoviridae); 솔린비비리대 (Solinviviridae); 스페어롤리포비리대 (Sphaerolipoviridae); 스피나레오비리내 (Spinareovirinae); 스피라비리대 (Spiraviridae); 스포우나비리내 (Spounavirinae); 스푸마레트로비리내 (Spumaretrovirinae); 순비리대 (Sunviridae); 텍티비리대 (Tectiviridae); 테벤비리내 (Tevenvirinae); 티아마비리내 (Tiamatvirinae); 토바니비리대 (Tobaniviridae); 토가비리대 (Togaviridae); 톨레쿠사텔리티대 (Tolecusatellitidae); 톰부스비리대 (Tombusviridae); 토로비리내 (Torovirinae); 토스포비리대 (Tospoviridae); 토티비리대 (Totiviridae); 트리스트로마비리대 (Tristromaviridae); 트리비리내 (Trivirinae); 투나비리내 (Tunavirinae); 투니카니비리내 (Tunicanivirinae); 투리비리대 (Turriviridae); 트와트비리내 (Twortvirinae); 티모비리대 (Tymoviridae); 바리아르테리비리내 (Variarterivirinae); 베퀸타비리내 (Vequintavirinae); 비르가비리대 (Virgaviridae); 우페데비리대 (Wupedeviridae); 크시노모비리대 (Xinmoviridae); 유에비리대 (Yueviridae); 및 지알라르테리비리내 (Zealarterivirinae).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 병원체-유래 항원이 사이토메갈로바이러스 (CMV) 항원, 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 항원, 헤르페스바이러스 항원, 폭스바이러스 항원, 헤파드나바이러스 항원, 인플루엔자 바이러스 항원, 코로나바이러스 항원, 간염 바이러스 항원, HIV 항원 또는 분야 바이러스 항원인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)의 펩타이드를 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하는 단계는 상동성/친화성을 결정하기 위한 펩타이드 또는 아미노산의 점수 평가 및 정렬 점수 평가를 수반하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)의 펩타이드를 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하는 단계는 하기를 결정하는 것을 수반하는, 방법:
    a) 상기 펩타이드와 상기 병원체-유래 항원의 전체 서열 구조의 유사성 또는 동일성; 및/또는
    b) 상기 펩타이드와 상기 병원체-유래 항원의 핵심적인 결합 부위에서 핵심 아미노산의 유사성 또는 동일성; 및/또는
    c) 상기 펩타이드와 상기 병원체-유래 항원의 핵심적인 결합 부위에서 유사하거나 또는 동일한 핵심 아미노산의 최다수.
  9. 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체가 결합된 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널을 포함하는, 종양 항원 식별 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항-범-HLA 항체가 MHC 클래스 I A, B 및 C를 포함하는 군으로부터 선택되는, 장치.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 항-범-HLA 항체가 MHC 클래스 II DP, DM, DO, DQ 및 DR을 포함하는 군으로부터 선택되는, 장치.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 항-인간인, 장치.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자 또는 복합체가 티올 관능기와 알킬("엔") 관능기의 복합체인, 장치.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자 또는 복합체가 바이오틴 및 스트렙타비딘을 포함하는, 장치.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자 또는 복합체가 스트렙타비딘에 결합된 항체 2 이상을 포함하는, 장치.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분자 또는 복합체가 소 혈청 알부민과 같은 단백질로 코팅함으로써 컨디셔닝화된, 장치.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지지체가 복수의 미세돌기 (micropillar)를 포함하는, 장치.
  18. 제17항에 있어서, 상기 미세돌기가 상기 장치 내부에 어레이로 정렬된, 장치.
  19. 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 장치가 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기에 적합한, 장치.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법 및/또는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 장치를 이용해 식별된 종양 항원을 포함하는, 암 치료학적 물질 또는 면역원성 물질 또는 암 백신.
  21. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법 및/또는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 장치를 이용해 식별된, 암 요법에 이용하기 위한 종양 항원.
  22. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법 및/또는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 장치를 이용해 식별된, 암 치료용 의약제를 제조하는데 이용하기 위한, 종양 항원.
  23. 제20항 또는 제21항 또는 제22항에 있어서,
    하기를 포함하는 군으로부터 선택되는, 암 치료학적 물질 또는 면역원성 물질 또는 암 백신 또는 종양 항원:
    SYHPALNAI (서열번호 1);
    AFHSSRTSL (서열번호 2);
    SYSDMKRAL (서열번호 3);
    NYNSVNTRM (서열번호 4);
    SYLTSASSL (서열번호 5);
    SYLPPGTSL (서열번호 6);
    FYEKNKTLV (서열번호 7);
    FYKNGRLAV (서열번호 8);
    KGPNRGVII (서열번호 9);
    LYKESLSRL (서열번호 10);
    RYLPAPTAL (서열번호 11);
    KYIPAARHL (서열번호 12);
    YYVRILSTI (서열번호 13);
    SYRDVIQEL (서열번호 14);
    KFYDSKETV (서열번호 15);
    KYLNVREAV (서열번호 16);
    HYLPDLHHM (서열번호 17);
    SGPNRFILI (서열번호 18);
    SYIIGTSSV (서열번호 19);
    RGPYVYREF (서열번호 20);
    FYATIIHDL (서열번호 21);
    GYMTPGLTV (서열번호 22);
    SYLIGRQKI (서열번호 23);
    AGASRIIGI (서열번호 24);
    QGPEYIERL (서열번호 25);
    SYIHQRYIL (서열번호 26);
    SPSYAYHQF (서열번호 27);
    KKKKKKSYLPPGTSL (서열번호 28);
    KKKKKKRYLPAPTAL (서열번호 29);
    KKKKKKYIPAARHL (서열번호 30);
    KKKKKKLYKESLSRL (서열번호 31);
    KKKKKKYLNVREAV (서열번호 32);
    KKKKKKFYATIIHDL (서열번호 33); 및
    KKKKKKSPSYAYHQF (서열번호 34).
  24. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법 및/또는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 장치를 이용해 종양 항원을 식별한 다음 상기 종양 항원을 환자에게 투여하거나; 또는 상기 종양 항원을 이용해 종양 항원에 대해 활성인 T 세포의 집단을 증폭시킨 다음 T 세포를 환자에 투여하는 것을 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법 및/또는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 장치를 이용해 식별된 종양 항원; 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 보강제, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물 또는 면역원성 물질 또는 백신.
  26. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법 및/또는 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 장치를 이용해 식별된 종양 항원; 및 하나 이상의 추가적인 암 치료제를 포함하는, 암 치료용 조합 치료제.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 추가적인 암 치료제가 체크포인트 저해제 (ICI)를 포함하는, 암 치료용 조합 치료제.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 체크포인트 저해제 (ICI)가 항-CTLA-4, 항-PD1 또는 항-PD-L1 분자인, 암 치료용 조합 치료제.
  29. 하기 단계를 포함하는, 체크포인트 저해제로 암을 치료하기 위해 환자를 계층화하는 방법:
    i) 환자로부터 종양의 샘플을 입수하는 단계;
    ii) 상기 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
    iii) 상기 유체를 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계로서, 상기 장치가 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널을 포함하는, 단계;
    iv) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
    v) 선택적으로, 상기 장치로부터 iv)의 상기 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
    vi) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 인간 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 인간 병원체-유래 항원 또는 그 일부에 대해 서열 상동성/친화성을 가지는지를 확인하는 단계, 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
    vii) 상기 펩타이드를 종양 항원으로서 식별하는 단계; 및
    viii) 상기 펩타이드가 발견되면, 하나 이상의 체크포인트 저해제 (ICI)를 유효량으로 환자에 투여하는 단계.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 단계 viii)은 상기 펩타이드를 유효량으로 환자에게 투여하여 종양 항원, 즉 샘플이 채취된 암에 대항하는 T 세포를 자극 또는 활성화하거나; 또는 상기 종양 항원을 이용해 상기 종양 향원에 대해 활성인 T 세포 집단을 증폭시킨 다음 T 세포를 환자에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  31. 하기 단계를 포함하는, 아데노바이러스 암을 치료하기 위해 환자를 계층화하는 방법:
    i) 환자로부터 종양의 샘플을 입수하는 단계;
    ii) 상기 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
    iii) 상기 유체를 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계로서, 상기 장치가 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널을 포함하는, 단계;
    iv) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
    v) 선택적으로, 상기 장치로부터 iv)의 상기 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
    vi) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 인간 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 인간 병원체-유래 항원 또는 그 일부에 대해 서열 상동성/친화성을 가지는지를 확인하는 단계, 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
    vii) 상기 펩타이드를 종양 항원으로서 식별하는 단계; 및
    viii) 상기 펩타이드를 아데노바이러스 벡터의 캡시드에 부착시킨 다음 상기 아데노바이러스 벡터를 유효량으로 환자에 투여하는 단계.
  32. 하기 단계를 포함하는, 암 치료 방법:
    i) 환자로부터 종양의 샘플을 입수하는 단계;
    ii) 상기 샘플을 유체에 용해 또는 현탁하는 단계;
    iii) 상기 유체를 종양 항원 식별 장치를 통해 통과시키는 단계로서, 상기 장치가 채널을 통과하여 흐르는 샘플 내 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 적어도 하나의 항체를 이용해 샘플로부터 추출할 수 있도록, 하나 이상의 항-MHC (주 조직적합성 복합체) 항체 또는 하나 이상의 항-범-인간 백혈구 항원 (HLA)(anti-pan-HLA) 항체가 결합된, 적어도 하나의 분자 또는 적어도 하나의 복합체가 부착된, 복수의 지지체를 포함하는 적어도 하나의 유체-통과 채널을 포함하는, 단계;
    iv) 상기 샘플 내 하나 이상의 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 상기 하나 이상의 항체에 결합시키는 단계;
    v) 선택적으로, 상기 장치로부터 iv)의 상기 하나 이상의 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 회수하는 단계;
    vi) 상기 결합된 pMHC (펩타이드:주 조직적합성 복합체)를 인간 병원체-유래 항원 라이브러리와 비교하여, 상기 펩타이드가 하나 이상의 인간 병원체-유래 항원 또는 그 일부에 대해 서열 상동성/친화성을 가지는지를 확인하는 단계, 상동성/친화성이 60%보다 높을 경우;
    vii) 상기 펩타이드를 종양 항원으로서 식별하는 단계; 및
    viii) 상기 펩타이드를 유효량으로 환자에게 투여하여 상기 종양 항원, 즉 샘플이 채취된 암에 대항하는 T 세포를 자극 또는 활성화거나; 또는 상기 종양 항원을 이용해 상기 종양 향원에 대해 활성인 T 세포 집단을 증폭시킨 다음 T 세포를 환자에 투여하는 단계.
  33. 제20항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 비인두암, 활막암, 간세포암, 신장암, 결합 조직 암, 흑색종, 폐암, 장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암 (oral cancer), 간암, 골암, 췌장암, 융모암, 가스트린종, 갈색세포종, 프로락틴종, T-세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우 질환, 졸린거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 핍지교종, 신경모세포종, 수막종, 척수 종양, 골연골종, 연골육종, 유잉 육종, 미확인 원발 부위 암, 유암종, 위장관의 유암종, 섬유육종, 유방암, 파제트 질환, 자궁경부암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안구암, 목암, 신장암, 윌름 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 고환암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 부갑상선 암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 영양막 암, 포상 기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부 암, 청신경종, 균상 식육종, 인슐린종, 유암종 증후군, 소마토스타틴종, 치은암, 심장암, 입술암, 뇌척수막암, 구강암 (mouth cancer), 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 침샘암, 혀암 및 편도암을 포함하는 군으로부터 선택되는, 암 치료학적 물질, 면역원성 물질, 암 백신, 종양 항원, 방법, 약학적 조성물, 면역원성 물질, 백신, 조합 치료제 및 방법.
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