KR20230035048A - B 세포에서 b2m 로커스를 편집하는 방법 및 조성물 - Google Patents
B 세포에서 b2m 로커스를 편집하는 방법 및 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230035048A KR20230035048A KR1020237001885A KR20237001885A KR20230035048A KR 20230035048 A KR20230035048 A KR 20230035048A KR 1020237001885 A KR1020237001885 A KR 1020237001885A KR 20237001885 A KR20237001885 A KR 20237001885A KR 20230035048 A KR20230035048 A KR 20230035048A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell
- cells
- modified
- gene
- nuclease
- Prior art date
Links
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 284
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 117
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 260
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 216
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 216
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 claims abstract description 124
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 116
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 110
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 101
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 98
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 75
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 64
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 45
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 35
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 32
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 31
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 30
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 claims description 24
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 24
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 claims description 22
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 17
- 102100026277 Alpha-galactosidase A Human genes 0.000 claims description 16
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 9
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 9
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 9
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 claims description 9
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 9
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 9
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 claims description 8
- 102100033342 Lysosomal acid glucosylceramidase Human genes 0.000 claims description 8
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims description 8
- 101150054399 ace2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 8
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 8
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 102100039341 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Human genes 0.000 claims description 7
- 101710102159 Atrial natriuretic peptide receptor 2 Proteins 0.000 claims description 7
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 210000004667 early pro-b cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000000014 large pre-b cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002202 late pro-b cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002809 long lived plasma cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003826 marginal zone b cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000003720 plasmablast Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000000345 small pre-b cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 102100028966 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Human genes 0.000 claims description 6
- 101000986080 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 101100508818 Mus musculus Inpp5k gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100366438 Rattus norvegicus Sphkap gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 52
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 52
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 48
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 48
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 48
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 34
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 16
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 13
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 12
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 12
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 12
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 11
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 11
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 10
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 10
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 9
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 9
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 description 9
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 9
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 9
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 6
- 101000937544 Homo sapiens Beta-2-microglobulin Proteins 0.000 description 6
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 description 6
- 102000047279 human B2M Human genes 0.000 description 6
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 5
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 4
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 4
- 101000874179 Homo sapiens Syndecan-1 Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102100035721 Syndecan-1 Human genes 0.000 description 4
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 101100219625 Mus musculus Casd1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 3
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 3
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000037451 immune surveillance Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100395313 Homo sapiens HLA-E gene Proteins 0.000 description 2
- -1 IGMC Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 208000007345 glycogen storage disease Diseases 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 1
- 102100021253 Antileukoproteinase Human genes 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 102100024965 Caspase recruitment domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100030442 Derlin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100021807 ER degradation-enhancing alpha-mannosidase-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 101000615334 Homo sapiens Antileukoproteinase Proteins 0.000 description 1
- 101001095043 Homo sapiens Bone marrow proteoglycan Proteins 0.000 description 1
- 101100382122 Homo sapiens CIITA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000761179 Homo sapiens Caspase recruitment domain-containing protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000842622 Homo sapiens Derlin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000895701 Homo sapiens ER degradation-enhancing alpha-mannosidase-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 1
- 101000840257 Homo sapiens Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 description 1
- 101001130862 Homo sapiens Oligoribonuclease, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000891028 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 Proteins 0.000 description 1
- 101001131990 Homo sapiens Peroxidasin homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000582986 Homo sapiens Phospholipid phosphatase-related protein type 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000919297 Homo sapiens Protein disulfide isomerase CRELD2 Proteins 0.000 description 1
- 101001098824 Homo sapiens Protein disulfide-isomerase A4 Proteins 0.000 description 1
- 101000621057 Homo sapiens Serum paraoxonase/lactonase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000685001 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 2-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102000026659 IL10 Human genes 0.000 description 1
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 1
- 102100029572 Immunoglobulin kappa constant Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 1
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100026371 MHC class II transactivator Human genes 0.000 description 1
- 108700002010 MHC class II transactivator Proteins 0.000 description 1
- 101100437231 Mus musculus B2m gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100032835 Oligoribonuclease, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100024894 PR domain zinc finger protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100040348 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP11 Human genes 0.000 description 1
- 102100034601 Peroxidasin homolog Human genes 0.000 description 1
- 108010009975 Positive Regulatory Domain I-Binding Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100029370 Protein disulfide isomerase CRELD2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037089 Protein disulfide-isomerase A4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022833 Serum paraoxonase/lactonase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101000898746 Streptomyces clavuligerus Clavaminate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000879712 Streptomyces lividans Protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102100023183 Stromal cell-derived factor 2-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 1
- 101710181056 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4612—B-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포에서의 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자는 변형된다. 일부 실시양태는 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 불활성화되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대체 MHC-I는 불활성화된 내인성 B2M 유전자 내로 삽입되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 실시양태는 성공적으로 변형된 세포를 풍부화시키는 것을 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 11월 16일에 출원된, "B 세포에서 B2M 로커스를 편집하는 방법 및 조성물"이라는 명칭의 미국 가출원 번호 63/114,131, 및 2020년 7월 3일에 출원된, "B 세포에서 B2M 로커스를 편집하는 방법 및 조성물"이라는 명칭의 미국 가출원 번호 63/047,978을 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 명백히 참조로서 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 포맷의 서열 목록과 함께 출원되고 있다. 서열 목록은 2021년 6월 29일에 생성된, SCRI295WOSEQLIST라는 명칭의 파일로서 제공되며, 이는 대략 4.5 Kb 크기이다. 서열 목록의 전자 포맷에서의 정보는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포에서의 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자는 변형된다. 일부 실시양태는 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 불활성화되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대체 MHC-I는 불활성화된 내인성 B2M 유전자 내로 삽입되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 실시양태는 성공적으로 변형된 세포를 풍부화시키는 것을 포함한다.
게놈 편집 적용은 최근 도구, 예를 들어, CRISPR 및 TALEN 시스템의 효능 및 사용의 용이성의 결과로서 빈도가 증가해왔다. 그러나, 임상적으로 관련이 있는 인간 체세포에서의 게놈 편집은, 예를 들어, 이러한 세포의 동종이계 이식에 대한 원치 않는 숙주 면역 반응으로 인해 여전히 과제이다. 따라서, 이러한 세포의 동종이계 이식에 대한 원치 않는 수용자 면역 반응을 유발할 가능성을 제거하거나 또는 감소시키는 동종이계 이식에 적합한 세포에 대한 필요가 존재한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 하기를 포함하는, 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 변형시키는 시스템을 포함한다: 세포의 게놈에서의 내인성 B2M 유전자에서 표적화된 로커스를 절단할 수 있는 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 임의로: B2M 유전자에 상보성인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA), 및/또는 제1 상동성 아암, 제2 상동성 아암, 및 이들 사이의 페이로드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 상동성 아암 및/또는 제2 상동성 아암은 B2M 유전자의 서열에 대한 상동성을 갖는 것인 복구 주형.
일부 실시양태에서, gRNA는 하기를 포함한다: 서열식별번호(SEQ ID NO): 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나와 비교하여 3개 이하의 미스매치를 갖는 그의 변이체.
일부 실시양태에서, gRNA는 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키도록 적합화된다.
일부 실시양태에서, 표적화된 로커스는 B2M 유전자의 제1 코딩 엑손 내에 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제 (HE), 및 조합된 TALEN-HE 단백질 (메가TAL)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 복구 주형은 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 상동성의 제1 아암 및/또는 상동성의 제2 아암은 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 핵산이 제1 핵산과 제2 핵산 사이에 위치된다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 B2M cDNA를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 또는 치료적 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드는 HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G로부터 선택된다. 일부 실시양태는 또한 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 제3 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 효소, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 수용체, 키메라 항원 수용체, 또는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 핵산은 내인성 B2M 유전자의 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 내인성 B2M 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드와 인-프레임으로 존재한다.
일부 실시양태에서, 페이로드는 이종성 프로모터를 포함하고, 제1 핵산은 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 이종성 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 MND 프로모터, 및 EF1 알파 프로모터, 또는 PGK 프로모터로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 복구 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
일부 실시양태는 또한 뉴클레아제; 및 임의로, gRNA, 및/또는 복구 주형을 포함하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 gRNA, 및/또는 복구 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 B 세포, 조혈 줄기 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프리-B 세포, 소형 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, T1 B 세포, T2 B 세포, 변연부 B 세포, 성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 형질모세포 (단기 생존) 세포, GC B 세포, 기억 B 세포, 및 장기 생존 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간이다.
일부 실시양태에서, 세포는 대상체에 대해 자가이다.
일부 실시양태에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다.
일부 실시양태에서, 세포는 생체외이다.
일부 실시양태에서, 세포는 생체내이다.
일부 실시양태는 본원에 제공된 시스템 중 임의의 하나 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, 변형된 세포를 제조하는 방법을 포함한다: 본원에 제공된 시스템 중 임의의 하나를 수득하는 것; 뉴클레아제를 제1 세포로 도입하는 것; 및 임의로: gRNA를 세포로 도입하고/거나, 복구 주형을 세포로 도입하며, 이로써 변형된 세포의 게놈에 변형된 B2M 로커스를 포함하는 변형된 세포를 제조하는 것.
일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 불활성화된 B2M 내인성 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키도록 적합화된다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포의 MHC-I와 상이한 MHC-I를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체내이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체외이다.
일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현한다. 일부 실시양태에서, 복구 주형은 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여되어, 변형된 B2M 로커스는 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 복구 주형은 B2M cDNA를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포에 대해 자가이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체내이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체외이다.
일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 대체 MHC-I를 발현한다. 일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 불활성화된 B2M 내인성 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복구 주형은 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및/또는 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체내이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체외이다.
일부 실시양태에서, 제1 세포는 B 세포이다.
일부 실시양태는 본원에 제공된 방법 중 임의의 하나에 의해 제조된 세포를 포함한다.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, T 세포 또는 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법을 포함한다: 본원에 제공된 방법 중 임의의 하나에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 제1 세포는 B 세포이고, 여기서 변형된 B2M 로커스는 불활성화되는 것임; 및 변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 동종이계이고, 여기서 변형된 B 세포는 B2M 유전자를 발현하는 B 세포와 비교하여 T 세포 또는 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 것임.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법을 포함한다: 본원에 제공된 방법 중 임의의 하나에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 변형된 B2M 로커스는 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현하는 것임; 및 변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 자가이고, 여기서 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현하지 않는 세포는 T 세포 또는 자연 살해 세포에 의해 살해되는 것임.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법을 포함한다: 본원에 제공된 방법 중 임의의 하나에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 변형된 B2M 로커스는 대체 MHC-I를 발현하며, 여기서 복구 주형은 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함하는 것임; 및 변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 동종이계인 것임.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, 동종이계 주입을 위한 변형된 B 세포를 제조하는 방법을 포함한다: 본원에 제공된 방법 중 임의의 하나에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 세포는 B 세포이고, 복구 주형은 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함하는 것임. 일부 실시양태는 또한 변형된 B 세포를 대상체에게 투여하며, 여기서 B 세포는 대상체에 대해 동종이계인 것임을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드는 HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 하기를 포함하는, 변형된 B 세포를 제조하는 방법을 포함한다: B 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하며, 이로써 변형된 B 세포를 수득하며, 여기서 융합 단백질은 외인성 B2M 폴리펩티드를 포함하는 것임.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 하기를 포함하는, 자가 대상체에서의 변형된 B 세포의 생체내 풍부화 방법을 포함한다: B 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 불활성화시키는 것; 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하며, 이로써 변형된 B 세포를 수득하며, 여기서 융합 단백질은 외인성 B2M 폴리펩티드를 포함하는 것임; 및 변형된 B 세포를 대상체에게 투여하며, 여기서 B 세포는 대상체에 대해 자가인 것임.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 하기를 포함하는, 동종이계 주입을 위한 변형된 B 세포를 제조하는 방법을 포함한다: B 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하며, 이로써 변형된 B 세포를 수득하며, 여기서 융합 단백질은 외인성 B2M 폴리펩티드, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 포함하는 것임. 일부 실시양태는 또한 변형된 B 세포를 대상체에게 투여하며, 여기서 B 세포는 대상체에 대해 동종이계인 것임을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드는 HLA-E 또는 HLA-G로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 내인성 B2M 유전자의 적어도 일부의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 DNA (CRISPR)를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 가이드 RNA (gRNA)를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제 (HE), 및 조합된 TALEN-HE 단백질 (메가TAL)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질이 내인성 B2M 유전자의 엑손과 인-프레임으로 존재하도록 불활성화된 B2M 유전자로 도입된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 상동성 아암, 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및/또는 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 DNA (CRISPR)를 도입하는 것이다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 가이드 RNA (gRNA)를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제 (HE), 및 조합된 TALEN-HE 단백질 (메가TAL)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, B 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, B 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 동시에 수행된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 치료적 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 효소, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 수용체, 키메라 항원 수용체, 또는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, B 세포는 조혈 줄기 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프리-B 세포, 소형 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, T1 B 세포, T2 B 세포, 변연부 B 세포, 성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 형질모세포 (단기 생존) 세포, GC B 세포, 기억 B 세포, 및 장기 생존 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 상기 방법 중 임의의 하나에 의해 제조된 변형된 B 세포를 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 본원에 제공된 변형된 B 세포 중 임의의 하나, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
도 1은 하기를 포함한 조건 하에서 배양된 형질 세포 (CD138+)에서의 MHC-II 발현의 유동 분석을 도시한다: (1) 2일 동안 MCD40L 및 CpG B 또는 αCD180을 사용한 활성화; (2) 3일 동안 IL-21 및 IL-6 또는 R848을 사용한 I상; 및 (3) 3일 동안 IL-21을 사용한 II상.
도 2는 뮤린 B2M 로커스의 도식을 도시하고 B2M 유전자를 포함하며, 상응하는 B2M mRNA는 엑손을 도시하고, mRNA의 상응하는 단백질 코딩 부분은 B2M cDNA로 도시되고; 또한 가이드 RNA: gRNA-1 및 gRNA_5에 대한 부위가 제시된다.
도 3은 가이드 RNA: gRNA-1 및 gRNA_5, 및 이들의 역방향 서열에 대한 B2M 유전자의 결실 빈도 (ICE 스코어) 및 예측된 불활성화 (녹아웃 (KO) 스코어)를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 4a는 gRNA-1, gRNA_5, 또는 대조군으로 처리된 뮤린 B 세포의 유동 분석을 도시한다.
도 4b는 gRNA-1, gRNA_5, 또는 대조군으로 처리된 세포에 대한 H2Kb 단백질 발현 세포 백분율에 대한 막대 도표를 도시한다.
도 4c는 인간 B2M 로커스를 표적화하는 gRNA (gRNA-1, gRNA-2), 또는 대조군으로 처리된 인간 B 세포의 유동 분석을 도시한다.
도 5a는 미스매치된 MHC 폴리펩티드를 인식하는 TCR 단백질을 발현하는 세포독성 CD8+ T 세포가 미스매치된 MHC-I 단백질을 갖는 세포를 살해하는 것 (좌측 패널); 및, MHC-I가 결여된 세포가 세포독성 CD8+ T 세포에 의한 살해를 유도할 수 없다는 것 (우측 패널)을 도시한다.
도 5b는 BALB/c 마우스로부터의 T 세포 (HLA, 부류 D) 및 C57BL/6 마우스로부터의 B 세포 (HLA, 부류 B)를 사용하여 MHC-I가 결여된 B 세포가 이러한 세포독성 CD8+ T-세포에 의한 살해에 대해 저항성일 지 여부를 결정하는 혼합된 세포 검정을 도시한다.
도 6a는 B2M gRNA_1 RNP, Rosa26RNP, 또는 모의로 처리된 B 세포, 및 T 세포의 혼합된 배양물에 대한 유동 분석을 도시한다.
도 6b는 혼합된 배양물에 대한 T 세포 대 B 세포의 비와 비교하여 CD45.1 (B2M 녹아웃 B 세포)의 비 대 CD45.2 (대조군 B 세포) 비의 그래프를 도시한다.
도 7은 CD8+ 시험관내 살해 검정에 대한 시간선을 도시한다.
도 8a는 24시간 및 48시간 Balb/C CD8+ T-세포 공동-배양 시점에서의 CD45.2 (표적) 및 CD45.1 (유인체) C57/B6 B-세포에 대한 변형된 세포의 FACS 분석을 도시한다.
도 8b는 CD8+ T-세포가 없는 공동-배양 조건에서의 기본 비로 정규화된, 도 8a와 관련된 실험으로부터의 CD45.1:CD45.2 비의 정량에 관한 변형된 세포에 대한 선 그래프를 도시한다.
도 9a는 도 8a와 관련된 실험에서의 CD45.1 B-세포 집단 내 H2Kb (C57/B6 B-세포에서의 관련이 있는 MHC1 일배체형)에 대한 변형된 세포의 FACS 분석을 도시한다.
도 9b는 증가하는 CD8+ T-세포 비에 따른 24시간 및 48시간 시점에서 B2M 편집된 CD45.1 B-세포에서의 H2Kb 녹아웃 수준의 정량에 관한 변형된 세포에 대한 선 그래프를 도시한다.
도 10은 B2M 로커스를 변형시키기 위한 구축물 (3307)의 도식을 도시하고 하기를 코딩하는 서열을 포함한다: 5' 및 3' 상동성 아암 (HA), GFP 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 MND 프로모터, P2A 자기-절단 펩티드, 및 B2M cDNA.
도 11은 B2M gRNA_1 RNP 전달 및 3307 AAV 형질도입의 조합을 사용하여 편집된 1차 마우스 B 세포의 유동 분석이다.
도 12a는 B2M 로커스가 내인성 B2M 발현을 불활성화시키고, 조작된 HLA-E을 발현하도록 변형되는 B2M 로커스에서의 치환을 위한 전략을 도시한다.
도 12b는 내인성 B2M 발현을 불활성화시키고, 조작된 HLA-E를 발현하도록 변형된 B 세포의 B 세포 생존을 시험하는 혼합된 세포 검정을 도시한다.
도 13은 5' 및 3' 상동성 아암 (HA); 외인성 MND 프로모터; 가요성 링커를 통해 연결된, Qdm 자기-펩티드, B2M cDNA, 및 비-다형성 HLA-E 알파 쇄를 포함하는 융합 단백질; 2A 자기-절단 펩티드; GFP 마커; 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 코딩하는 HDR 공여자 주형 (3310)을 도시한다.
도 14는 도 13에 도시된 구축물로 편집된 B 세포 및 7일차 H2Kb-, 분화된 B 세포에서의 GFP 발현에 대한 유동 분석이다.
도 15a는 MHC-I 녹아웃 세포의 생체내 생착을 사용한 NK 세포 살해에 대한 파라미터를 확립하기 위한 연구를 도시한다.
도 15b는 뮤린 세포를 사용한 동종이계 B 세포 생착을 위한 마우스 모델에 대한 연구를 도시한다.
도 16은 인간 세포를 사용한 동종이계 B 세포 생착을 위한 이종이식편 모델에 대한 연구를 도시한다.
도 2는 뮤린 B2M 로커스의 도식을 도시하고 B2M 유전자를 포함하며, 상응하는 B2M mRNA는 엑손을 도시하고, mRNA의 상응하는 단백질 코딩 부분은 B2M cDNA로 도시되고; 또한 가이드 RNA: gRNA-1 및 gRNA_5에 대한 부위가 제시된다.
도 3은 가이드 RNA: gRNA-1 및 gRNA_5, 및 이들의 역방향 서열에 대한 B2M 유전자의 결실 빈도 (ICE 스코어) 및 예측된 불활성화 (녹아웃 (KO) 스코어)를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 4a는 gRNA-1, gRNA_5, 또는 대조군으로 처리된 뮤린 B 세포의 유동 분석을 도시한다.
도 4b는 gRNA-1, gRNA_5, 또는 대조군으로 처리된 세포에 대한 H2Kb 단백질 발현 세포 백분율에 대한 막대 도표를 도시한다.
도 4c는 인간 B2M 로커스를 표적화하는 gRNA (gRNA-1, gRNA-2), 또는 대조군으로 처리된 인간 B 세포의 유동 분석을 도시한다.
도 5a는 미스매치된 MHC 폴리펩티드를 인식하는 TCR 단백질을 발현하는 세포독성 CD8+ T 세포가 미스매치된 MHC-I 단백질을 갖는 세포를 살해하는 것 (좌측 패널); 및, MHC-I가 결여된 세포가 세포독성 CD8+ T 세포에 의한 살해를 유도할 수 없다는 것 (우측 패널)을 도시한다.
도 5b는 BALB/c 마우스로부터의 T 세포 (HLA, 부류 D) 및 C57BL/6 마우스로부터의 B 세포 (HLA, 부류 B)를 사용하여 MHC-I가 결여된 B 세포가 이러한 세포독성 CD8+ T-세포에 의한 살해에 대해 저항성일 지 여부를 결정하는 혼합된 세포 검정을 도시한다.
도 6a는 B2M gRNA_1 RNP, Rosa26RNP, 또는 모의로 처리된 B 세포, 및 T 세포의 혼합된 배양물에 대한 유동 분석을 도시한다.
도 6b는 혼합된 배양물에 대한 T 세포 대 B 세포의 비와 비교하여 CD45.1 (B2M 녹아웃 B 세포)의 비 대 CD45.2 (대조군 B 세포) 비의 그래프를 도시한다.
도 7은 CD8+ 시험관내 살해 검정에 대한 시간선을 도시한다.
도 8a는 24시간 및 48시간 Balb/C CD8+ T-세포 공동-배양 시점에서의 CD45.2 (표적) 및 CD45.1 (유인체) C57/B6 B-세포에 대한 변형된 세포의 FACS 분석을 도시한다.
도 8b는 CD8+ T-세포가 없는 공동-배양 조건에서의 기본 비로 정규화된, 도 8a와 관련된 실험으로부터의 CD45.1:CD45.2 비의 정량에 관한 변형된 세포에 대한 선 그래프를 도시한다.
도 9a는 도 8a와 관련된 실험에서의 CD45.1 B-세포 집단 내 H2Kb (C57/B6 B-세포에서의 관련이 있는 MHC1 일배체형)에 대한 변형된 세포의 FACS 분석을 도시한다.
도 9b는 증가하는 CD8+ T-세포 비에 따른 24시간 및 48시간 시점에서 B2M 편집된 CD45.1 B-세포에서의 H2Kb 녹아웃 수준의 정량에 관한 변형된 세포에 대한 선 그래프를 도시한다.
도 10은 B2M 로커스를 변형시키기 위한 구축물 (3307)의 도식을 도시하고 하기를 코딩하는 서열을 포함한다: 5' 및 3' 상동성 아암 (HA), GFP 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 MND 프로모터, P2A 자기-절단 펩티드, 및 B2M cDNA.
도 11은 B2M gRNA_1 RNP 전달 및 3307 AAV 형질도입의 조합을 사용하여 편집된 1차 마우스 B 세포의 유동 분석이다.
도 12a는 B2M 로커스가 내인성 B2M 발현을 불활성화시키고, 조작된 HLA-E을 발현하도록 변형되는 B2M 로커스에서의 치환을 위한 전략을 도시한다.
도 12b는 내인성 B2M 발현을 불활성화시키고, 조작된 HLA-E를 발현하도록 변형된 B 세포의 B 세포 생존을 시험하는 혼합된 세포 검정을 도시한다.
도 13은 5' 및 3' 상동성 아암 (HA); 외인성 MND 프로모터; 가요성 링커를 통해 연결된, Qdm 자기-펩티드, B2M cDNA, 및 비-다형성 HLA-E 알파 쇄를 포함하는 융합 단백질; 2A 자기-절단 펩티드; GFP 마커; 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 코딩하는 HDR 공여자 주형 (3310)을 도시한다.
도 14는 도 13에 도시된 구축물로 편집된 B 세포 및 7일차 H2Kb-, 분화된 B 세포에서의 GFP 발현에 대한 유동 분석이다.
도 15a는 MHC-I 녹아웃 세포의 생체내 생착을 사용한 NK 세포 살해에 대한 파라미터를 확립하기 위한 연구를 도시한다.
도 15b는 뮤린 세포를 사용한 동종이계 B 세포 생착을 위한 마우스 모델에 대한 연구를 도시한다.
도 16은 인간 세포를 사용한 동종이계 B 세포 생착을 위한 이종이식편 모델에 대한 연구를 도시한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포에서의 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자는 변형된다. 일부 실시양태는 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 불활성화되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 대체 MHC-I는 불활성화된 내인성 B2M 유전자 내로 삽입되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 실시양태는 성공적으로 변형된 세포를 풍부화시키는 것을 포함한다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, B 세포에서의 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자는 변형된다. 일부 실시양태에서, B 세포에서의 내인성 B2M 유전자는 불활성화된다. 일부 이러한 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 불활성화된 B2M 유전자로 도입된다. 일부 실시양태는 동종이계 주입, 융합 단백질의 발현, 및/또는 변형된 세포의 생체내 풍부화를 위한 B2M 로커스에서 변형된 B 세포의 제조 및 용도를 포함한다.
본원에 제공된 일부 실시양태는 B 세포 요법의 전달을 개선시킬 목적을 위해 외인성 트랜스진을 도입하고 B2M 로커스에서 게놈 DNA를 조작하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태는 AAV 전달된 복구 주형을 갖는 CRISPR-Cas9 재조합체 핵단백질 복합체 (가이드 RNA 및 단백질)의 용도를 포함한다. 일부 실시양태는 유전자 전달을 위한 대안 뉴클레아제 (예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제, talen, 또는 메가talen) 또는 복구 주형 (예를 들어, 단일 또는 이중-가닥 DNA) 플랫폼의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, B2M 로커스로 전달되는 서열은 조작된 인간 B 세포의 동종이계 전달 및/또는 풍부화를 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, B2M 로커스로 전달되는 서열은 조작된 B 세포의 생체내 풍부화에 의한 자가 전달을 용이하게 한다.
일부 실시양태는 B2M 로커스를 효율적으로 편집하는데, 예를 들어 MHC-I를 녹-다운/불활성화시키는데 유용한 인간 B2M을 위한 합성 가이드 RNA를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 내인성 B2M의 발현을 유지하면서, 외인성 서열을 B2M으로 도입하기 위한 복구 주형을 포함한다. 이러한 복구 주형은 치료적 단백질, 예컨대 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태는 내인성 B2M을 비-중합체성 버전의 HLA (예를 들어, HLA-E, 또는 HLA-G)에 융합된 B2M으로 대체하는 복구 주형 및 NK 세포 살해를 억제하는 펩티드를 포함한다. 이들 서열은 숙주 면역 세포 (예를 들어, T 및/또는 NK 세포)에 의한 이식편 거부가 없는 형질 세포의 동종이계 생착을 용이하게 한다. 일부 실시양태는 B2M을 비-다형성 HLA에 융합된 B2M으로 대체하고 치료적 단백질에 대한 외인성 서열을 도입하는 복구 주형을 포함한다.
일부 실시양태는 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 불활성화되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 이러한 실시양태는 동종이계 T 세포 또는 동종이계 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 변형된 B 세포를 풍부화시키는 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 이러한 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하며, 여기서 세포의 게놈의 B2M 로커스는 불활성화되는 것임, 및 변형된 세포를 면역 세포, 예컨대 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포와 접촉시키며, 여기서 면역 세포는 변형된 B 세포에 대해 동종이계인 것임을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 변형된 B 세포와 면역 세포 사이의 미스매치된 MHC-I의 결여는 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다.
일부 실시양태는 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대체 MHC-I는 불활성화된 내인성 B2M 유전자 내로 삽입되어 동종이계 면역 세포에 의한 살해에 대한 변형된 B 세포의 저항성을 증가시킨다. 일부 이러한 실시양태는 세포의 MHC-I를 대체함으로써 동종이계 T 세포 또는 동종이계 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 변형된 B 세포를 풍부화시키는 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 이러한 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하며, 여기서 변형된 B2M 로커스는 대체 MHC-I를 발현하는 것임을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 내인성 B2M 로커스는 불활성화되고 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드에 의해 대체된다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포를 면역 세포, 예컨대 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포와 접촉시키며, 여기서 면역 세포는 면역 세포에 대해 동종이계인 것임을 포함한다.
일부 이러한 실시양태는 특정 성공적인 변형을 갖는 변형된 B 세포를 풍부화시키는 조성물 및 방법을 포함한다. 일부 이러한 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하며, 여기서 세포의 변형된 B2M 로커스는 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현하는 것임, 및 변형된 세포를 면역 세포, 예컨대 T 세포, 예컨대 CD8+ T 세포와 접촉시키며, 여기서 면역은 변형된 B 세포에 대해 자가인 것임을 포함한다. 변형이 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA의 성공적인 발현을 초래하지 않는 변형된 세포는 면역 세포에 의해 살해되거나, 제거되거나, 또는 클리어될 수 있다.
본원에 제공된 방법 및 조성물의 특정 실시양태에 유용한 특정 측면은 U.S. 20180141992; 문헌 [Hung K.L. et al., (2018) Mol Ther 26:456-467; Voss J.E. et al., (2019) Elife 8:e42995; Hartweger H., et al., (2019) J Exp Med 216:1301-1310; Johnson M.J. et al., (2018) Scientific Reports 8:12144; and Moffett H.F. et al., (2019) Sci Immunol 4(35)]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 명백히 참조로서 포함된다.
정의
본원에 사용된 바와 같은, "게놈 편집"은 본 명세서에 비추어 읽을 때 그의 평범하고 일반적인 의미를 갖고, 예를 들어, DNA가 살아있는 유기체의 게놈에서 삽입되거나, 결실되거나 또는 대체되는 유전자 조작 방법을 포함하는 프로세스를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 유전자를 편집하는 것은 또한 유전자 편집으로 공지되어 있다. 본원에 기재된 일부 대안에서, 분자, 예컨대 거대분자를 발현하는 형질 세포 또는 형질 세포 전구체를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 B 세포 또는 B 세포 전구체는 게놈 편집의 적어도 1회의 라운드에 적용된다. 게놈 편집 방법은 핵산이 세포의 게놈에서 삽입되거나, 결실되거나 또는 대체되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 뉴클레아제가 이 프로세스를 달성하는데 사용된다. 일부 대안에서, 뉴클레아제는 조작된다. 일부 대안에서, 방법은 비상동성 단부-연결 (NHEJ) 또는 상동성 재조합 (HR)을 통해 복구되는 이중 가닥 파단을 유도하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 게놈 편집의 단계는 단일 가닥 핵산의 도입에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 게놈 편집의 적어도 1회의 라운드는 후보 유전자 로커스로의 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 재조합체 아데노-연관 바이러스의 상동성 재조합을 위해 B-세포를 순환시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 대안에서, 단백질 발현을 위한 B 세포의 게놈 편집은 바이러스 통합의 부재 하에 수행된다. 일부 대안에서, 게놈 편집의 제2 라운드가 영역을 절제하기 위해 수행된다. 일부 대안에서, 게놈 편집의 제3 라운드가 약물 활성화가능한 성장 인핸서의 발현을 초래하기 위해 수행된다. 본원 일부 대안에서, 게놈 편집은 지정 상동성 재조합에 의한 비병원성 AAV 매개된 편집에 의해 수행된다.
게놈 편집은 또한 RNA 및 단백질-기반 형질감염의 사용을 이용할 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템은 게놈을 편집하도록 변형될 수 있다. 이 기술은 세포로의 합성 가이드 RNA (gRNA)와 복합체화된 Cas 뉴클레아제의 전달을 필요로 하고, 따라서 세포의 게놈은 특이적인 위치에서 커팅되고 기존 유전자로 하여금 제거되고/거나 새로운 것을 부가하게 할 수 있다. 따라서, CRISPR/Cas 및 관련 프로그래밍가능한 엔도뉴클레아제 시스템은 다양한 배양된 세포 및 모델 유기체 시스템에서 입증된 바와 같은 유전자 파괴 및/또는 유전자 표적화를 위한 이들의 적용과 함께 빠르게 생물의학적 연구 실험실의 중요한 게놈 편집 도구가 되고 있다. 일부 대안에서, 본원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템 중에서, Cas 뉴클레아제는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8 또는 Cas9를 포함한다.
CRISPR/Cas 시스템의 기본 구성 요소는 표적 유전자, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM), 가이드 RNA, Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다. 게놈 편집에 CRISPR/Cas를 적용하는 것의 중요한 측면은 가이드 RNA를 효율적으로 다양한 세포 유형에 전달하는 시스템에 대한 필요이다. 이는, 예를 들어, 핵산으로서의 시험관내 생성된 가이드 RNA (시험관내 전사 또는 화학적 합성에 의해 생성된 가이드 RNA)의 전달을 수반할 수 있다. 일부 대안에서, 핵산은 변형된 염기의 혼입에 의해 뉴클레아제 저항성이 될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템은 2종의 부류로 나뉜다. 부류 1 시스템은 외래 핵산의 분해를 위한 다수의 Cas 단백질의 복합체를 갖는다. 부류 2 시스템은 외래 핵산의 분해에 대한 동일한 목적을 위한 단일 대형 Cas 단백질을 갖는다. 35종의 패밀리로 분류되는 93개의 cas 유전자가 있다. 35종의 패밀리 중 11종은 단백질 패밀리 CAS1 내지 CAS9를 포함하는 cas 코어로부터의 것이다. 본원에 기재된 바와 같은, Cas는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8 또는 Cas9를 포함한다.
유전자 편집은 또한 신규 비-뉴클레아제-기반 유전자 편집 플랫폼에 의해 수행될 수 있다. AAV의 신규 패밀리는 이전에 인간 조혈 줄기 세포로부터 단리되었다. 이들 비병원성 AAV는 건강한 개체에 천연적으로 존재하고 고유한 유전자 편집 및 유전자 전달 특성을 보유할 수 있다. 이 기술은 또한 지정 상동성 재조합에 의한 AAV 매개된 편집 (AmENDRTM)으로서 기재되어 있다. 이 프로세스는 세포에 의해 고도로 정확한 DNA 복구를 보장하는데 사용되는 천연 생물학적 메커니즘에 의한 상동성 재조합이다.
지정 상동성 재조합에 의한 AAV 매개된 편집은 게놈의 영역에 특이적인 상동성 서열 "아암"의 설계에 의해 개시되고 세포에 투여될 때 DNA에서의 영구적인 교정을 초래한다. 본원 일부 대안에서, 유전자 편집은 지정 상동성 재조합에 의한 비병원성 AAV 매개된 편집에 의해 수행된다. 신규 AAV 게놈의 확인은 문헌 [Smith et al.]에 기재되어 있다 (Mol Ther. 2014 Sep; 22(9): 1625-1634; 그 전문이 본원에 참조로서 포함됨). 문헌 [Smith et al.]에 의해 기재된 신규 AAV는 HSC 게놈의 조작을 위한 새로운 부류의 유전자 벡터를 나타낸다. 더욱이, 이들 벡터는 표적화된 조직, 및 AAV2에 대한 일반적인 기존 면역을 피하는 유전자 전달에 불응성인 세포를 포함하는 세포에 유전자를 전달하는 능력을 크게 확장시킬 수 있다. 일부 대안에서, 유전자 편집은 조혈 세포에 천연적으로 존재하는 비병원성 AAV에 의해 수행되며, 여기서 편집은 문헌 [Smith et al.]에 기재된 바와 같이 비병원성 AAV를 사용하는 지정 상동성 재조합에 의한 AAV 매개된 편집에 의해 수행된다.
본원에 사용된 바와 같은, "조작된 뉴클레아제"는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이들의 평범하고 일반적인 의미를 갖고, 예를 들어, DNA 서열을 특이적으로 인식하고 이중-가닥 파단의 도입에 의해 게놈을 효율적으로 편집하는데 사용될 수 있는 혼성 효소이도록 조작된 효소를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 제한 없이, 본원에 기재된 실시양태와 함께 사용하기에 적합한 바람직한 조작된 뉴클레아제의 4종의 패밀리가 있으며, 메가뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터-기반 뉴클레아제 (TALEN), 또는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "메가뉴클레아제"는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이들의 평범하고 일반적인 의미를 갖고, 예를 들어, 대형 인식 부위 (12 내지 40개의 염기 쌍의 이중-가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 분자, 예컨대 거대분자를 발현하는 형질 세포 또는 형질 세포 전구체를 제조하는 일부 대안적인 방법에서, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) B 세포를 단리하는 단계, (b) B 세포를 발생시키는 단계, (c) 바이러스 통합의 부재 하에 단백질 발현을 위해 B 세포의 게놈 편집의 제1 라운드를 수행하는 단계, (d) B 세포를 확장시키는 단계, 및 (e) 임의로, 단계 (c) 또는 (d) 후에, B 세포를 분화시키며, 이로써 단백질을 발현하는 형질 세포를 생산하는 단계. 일부 대안에서, 게놈 편집의 제1 라운드는 RNA 및 단백질-기반 형질감염에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제이다.
본원에 사용된 바와 같은, "아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)"는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이들의 평범하고 일반적인 의미를 갖고, 예를 들어, 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 조작된 제한 효소를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 아연 핑거 도메인은 특이적인 목적하는 DNA 서열을 표적화하도록 조작될 수 있고, 이는 아연-핑거 뉴클레아제가 복합체 게놈 내 고유한 서열을 표적화할 수 있게 한다. 분자, 예컨대 거대분자를 발현하는 형질 세포를 제조하는 일부 대안적인 방법에서, 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) B 세포를 단리하는 단계, (b) B 세포를 발생시키는 단계, (c) 바이러스 통합의 부재 하에 단백질 발현을 위해 B 세포의 게놈 편집의 제1 라운드를 수행하는 단계, (d) B 세포를 확장시키는 단계, 및 (e) 임의로, 단계 (c) 또는 (d) 후에, B 세포를 분화시키며, 이로써 단백질을 발현하는 형질 세포를 생산하는 단계. 일부 대안에서, 게놈 편집의 제1 라운드는 RNA 및 단백질-기반 형질감염에 의해 수행된다. 일부 대안에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다.
본원에 사용된 바와 같은, "전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제" (TALEN)는 본 명세서에 비추어 읽을 때 이들의 평범하고 일반적인 의미를 갖고, 예를 들어, DNA에서 특이적인 서열 또는 부위를 커팅하도록 조작될 수 있는 제한 효소를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이들은 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 제조된다 (DNA 가닥을 커팅하는 뉴클레아제). 전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE)는 목적하는 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있으며, 따라서 뉴클레아제와 조합될 때, DNA는 특이적인 위치에서 커팅될 수 있다. 따라서, 제한 효소는 게놈 편집 또는 조작된 뉴클레아제를 사용한 게놈 편집으로 공지된 기술인 계내 게놈 편집에 사용하기 위해, 세포로 도입될 수 있다. TALEN의 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 본원에 기재된 일부 대안에서, 분자, 예컨대 거대분자를 발현하는 형질 세포 또는 형질 세포 전구체를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 B 세포 또는 B 세포 전구체는 게놈 편집의 적어도 1회의 라운드에 적용된다. 게놈 편집 방법은 핵산이 세포의 게놈에서 삽입되거나, 결실되거나 또는 대체되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 대안에서, 뉴클레아제가 이 프로세스를 달성하는데 사용된다. 일부 대안에서, 뉴클레아제는 조작된다. 일부 대안에서, 방법은 비상동성 단부-연결 (NHEJ) 또는 상동성 재조합 (HR)을 통해 복구되는 이중 가닥 파단을 유도하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 방법은 게놈 편집의 제1 라운드 또는 게놈 편집을 포함한다. 일부 대안에서, 게놈 편집의 제1 라운드는 뉴클레아제를 전달하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 B 세포에서 적어도 1개의 유전자 로커스를 표적화한다. 일부 대안에서, 적어도 1개의 유전자 로커스는 JCHAIN, IGKC, IGMC, PON3, PRG2, FKBP11, SDC1, SLPI, DERL3, EDEM1, LY6C2, CRELD2, REXO2, PDIA4, PRDM1, CARD11, CCR5 또는 SDF2L1을 포함한다. 일부 대안에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제 (HE), 조합된 TALEN-HE 단백질 (메가TAL) 또는 Cas 뉴클레아제에 커플링된 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 DNA (CRISPR)를 표적화하는 합성 가이드 RNA이다. 일부 대안에서, Cas 뉴클레아제는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8 또는 Cas9를 포함한다. 일부 대안에서, 게놈 편집의 제1 라운드는 후보 유전자 로커스로의 상동성 재조합을 위한 공여자 주형으로서 역할을 하기 위해 재조합체 아데노-연관 바이러스 벡터로 B 세포를 형질도입하는 것을 포함한다. 일부 대안에서, 재조합체 아데노-연관 바이러스 벡터는 단일-가닥, 이중 가닥 또는 자기-상보성이다.
본원에 사용된 바와 같은, "녹 아웃"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 방해하는 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 녹 아웃은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 도메인 (예를 들어, DNA 결합 도메인)에서 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 indel을 유도함으로써 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 세부 사항을 기반으로 하여 표적 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부를 녹 아웃시키는데 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 방법을 용이하게 인식할 것이다.
변형된 B 세포를 제조하는 특정 방법
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 변형된 B 세포를 제조하는 방법을 포함한다. 일부 이러한 실시양태는 B 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하며, 이로써 변형된 B 세포를 수득하며, 여기서 융합 단백질은 외인성 B2M 폴리펩티드를 포함하는 것임을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 내인성 B2M 유전자의 적어도 일부의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 게놈, 예컨대 이배체 게놈에서의 B2M의 각각의 대립유전자는 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 가이드 RNA (gRNA)를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 상기 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 백분율인 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제 (HE), 및 조합된 TALEN-HE 단백질 (메가TAL)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질이 내인성 B2M 유전자의 엑손과 인-프레임으로 존재하도록 불활성화된 B2M 유전자로 도입된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 상동성 아암, 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및/또는 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 CRISPR 핵산을 도입하는 것이다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 gRNA를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 상기 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 백분율인 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, HE, 및 메가TAL로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, B 세포에서 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, B 세포에서 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 동시에 수행된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 치료적 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 효소, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 수용체, 키메라 항원 수용체, 또는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 포함한다.
치료적 폴리펩티드 또는 치료적 핵산의 더 많은 예는 하기를 포함한다: (a) 치료적 항체, 이뮤노어드헤신, 및 이중-특이적 T 세포 결합 단백질을 포함하는, 병원체 감염을 억제하도록 설계된 친화도 시약; (b) 시토카인, 예컨대 IL10, 항체, 예컨대 항-TNF, 및 펩티드를 포함하는, 염증 상태, 이식편 거부 및/또는 자가면역을 치료하기 위한 면역억제제; (c) 시토카인, 항체 예컨대 항-PDL1, 및 이중-특이적 T 세포 결합 단백질을 포함하는, 암 또는 병원체에 대한 숙주 세포 반응을 증가시키도록 설계된 면역 증강제; 및 (d) 글리코겐 저장 장애, 또는 혈우병에 수반되는 것, 예컨대 인자 IX, 또는 인자 VIII를 포함하는 누락 단백질에 의해 초래된 질환을 고치도록 설계된 효소.
일부 실시양태에서, B 세포는 조혈 줄기 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프리-B 세포, 소형 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, T1 B 세포, T2 B 세포, 변연부 B 세포, 성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 형질모세포 (단기 생존) 세포, GC B 세포, 기억 B 세포, 및 장기 생존 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
변형된 B 세포의 특정 생체내 풍부화 방법
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 대상체, 예컨대 자가 대상체에서의 변형된 B 세포의 생체내 풍부화 방법을 포함한다. 일부 이러한 실시양태는 B 세포에서 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하며, 이로써 변형된 B 세포를 수득하며, 여기서 융합 단백질은 외인성 B2M 폴리펩티드를 포함하는 것임; 및 변형된 B 세포를 대상체에게 투여하며, 여기서 B 세포는 대상체에 대해 자가인 것임을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 활성 내인성 B2M 유전자, 또는 외인성 B2M 폴리펩티드가 결여된 변형된 세포는 대상체의 면역 시스템에 의한 클리어런스, 예컨대 자연 살해 세포에 의한 클리어런스의 증가된 가능성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 내인성 B2M 유전자의 적어도 일부의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 게놈, 예컨대 이배체 게놈에서의 B2M의 각각의 대립유전자는 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 CRISPR 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 gRNA를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 상기 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 백분율인 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, HE, 및 메가TAL로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질이 내인성 B2M 유전자의 엑손과 인-프레임으로 존재하도록 불활성화된 B2M 유전자로 도입된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 상동성 아암, 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및/또는 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 CRISPR 핵산을 도입하는 것이다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 gRNA를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 상기 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 백분율인 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, HE, 및 메가TAL로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, B 세포에서 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, B 세포에서 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 동시에 수행된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 치료적 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 효소, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 수용체, 키메라 항원 수용체, 또는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, B 세포는 조혈 줄기 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프리-B 세포, 소형 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, T1 B 세포, T2 B 세포, 변연부 B 세포, 성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 형질모세포 (단기 생존) 세포, GC B 세포, 기억 B 세포, 및 장기 생존 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
동종이계 주입을 위한 변형된 B 세포를 제조하는 특정 방법
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 동종이계 주입을 위한 변형된 B 세포를 제조하는 방법을 포함한다. 일부 이러한 실시양태는 B 세포에서 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하며, 이로써 변형된 B 세포를 수득하며, 여기서 융합 단백질은 외인성 B2M 폴리펩티드, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 포함하는 것임을 포함한다. 일부 방법은 또한 변형된 B 세포를 대상체에게 투여하며, 여기서 B 세포는 대상체에 대해 동종이계인 것임을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드는 HLA-E 또는 HLA-G로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자는 내인성 B2M 유전자의 적어도 일부의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 게놈, 예컨대 이배체 게놈에서의 B2M의 각각의 대립유전자는 불활성화된다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 CRISPR 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 gRNA를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 상기 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 백분율인 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, HE, 및 메가TAL로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질이 내인성 B2M 유전자의 엑손과 인-프레임으로 존재하도록 불활성화된 B2M 유전자로 도입된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 상동성 아암, 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및/또는 프로모터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 Cas 뉴클레아제에 커플링된 CRISPR 핵산을 도입하는 것이다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 gRNA를 B 세포로 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 또는 상기 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 백분율인 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 B 세포로 복구 주형을 포함하는 바이러스 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 뉴클레아제를 B 세포로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, HE, 및 메가TAL로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, B 세포에서 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 순차적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, B 세포에서 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키는 것; 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 불활성화된 B2M 유전자로 도입하는 것은 동시에 수행된다.
일부 실시양태에서, 융합 단백질은 치료적 폴리펩티드 또는 치료적 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 효소, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 수용체, 키메라 항원 수용체, 또는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, B 세포는 조혈 줄기 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프리-B 세포, 소형 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, T1 B 세포, T2 B 세포, 변연부 B 세포, 성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 형질모세포 (단기 생존) 세포, GC B 세포, 기억 B 세포, 및 장기 생존 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 포유류이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 조성물 및 시스템
본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 본원에 제공된 방법 중 임의의 하나에 의해 제조된 변형된 B 세포를 포함한다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 본원에 제공된 변형된 B 세포 중 임의의 하나, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 상기 백분율 중 임의의 2개 사이의 임의의 백분율의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
방법 및 조성물의 일부 실시양태는 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 불활성화시키는 시스템을 포함한다. 일부 이러한 실시양태는 세포의 게놈에서의 내인성 B2M 유전자에서 표적화된 로커스를 절단할 수 있는 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태는 또한 B2M 유전자에 상보성인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA), 및/또는 제1 상동성 아암, 제2 상동성 아암, 및 이들 사이의 페이로드를 코딩하는 핵산을 포함하는 복구 주형을 포함하며, 여기서 제1 상동성 아암 및/또는 제2 상동성 아암은 B2M 유전자의 서열에 대한 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, gRNA는 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키도록 적합화된다. 일부 실시양태에서, gRNA는 하기를 포함한다: 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나와 비교하여 3개 이하의 미스매치를 갖는 그의 변이체. 일부 실시양태에서, 표적화된 로커스는 B2M 유전자의 제1 코딩 엑손 내에 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 Cas9 뉴클레아제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제 (HE), 및 조합된 TALEN-HE 단백질 (메가TAL)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 복구 주형은 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 상동성의 제1 아암 및/또는 상동성의 제2 아암은 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 핵산이 제1 핵산과 제2 핵산 사이에 위치된다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 B2M cDNA를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 비-중합체성 HLA 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드는 HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G로부터 선택된다. 일부 실시양태는 또한 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 제3 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 효소, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 수용체, 키메라 항원 수용체, 또는 시토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 폴리펩티드는 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 핵산은 내인성 B2M 유전자의 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 내인성 B2M 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드와 인-프레임으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 페이로드는 이종성 프로모터를 포함하고, 제1 핵산은 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 이종성 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 MND 프로모터, 및 EF1 알파 프로모터, 또는 PGK 프로모터로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 복구 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
일부 실시양태는 또한 뉴클레아제; 및 임의로, gRNA, 및/또는 복구 주형을 포함하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 B 세포, 조혈 줄기 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프리-B 세포, 소형 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, T1 B 세포, T2 B 세포, 변연부 B 세포, 성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 형질모세포 (단기 생존) 세포, GC B 세포, 기억 B 세포, 및 장기 생존 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에 대해 자가이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체외이다. 일부 실시양태에서, 세포는 생체내이다.
일부 실시양태는 본원에 제공된 시스템 중 임의의 하나 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, 변형된 세포를 제조하는 방법을 포함한다: 본원에 개시된 시스템 중 임의의 하나를 수득하는 것; 및 뉴클레아제를 제1 세포로 도입하는 것. 일부 실시양태는 또한 gRNA를 세포로 도입하고/거나, 복구 주형을 세포로 도입하며, 이로써 변형된 세포의 게놈에 변형된 B2M 로커스를 포함하는 변형된 세포를 제조하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 불활성화된다. 일부 실시양태에서, gRNA는 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키도록 적합화된다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포에 대해 동종이계이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포의 MHC-I와 상이한 MHC-I를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체내이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체외이다.
일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현한다. 일부 실시양태에서, 복구 주형은 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여되어, 변형된 B2M 로커스는 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된다. 일부 실시양태에서, 복구 주형은 B2M cDNA를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포에 대해 자가이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체내이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체외이다.
일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 대체 MHC-I를 발현한다. 일부 실시양태에서, 복구 주형은 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및/또는 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택은 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 제1 세포에 대해 동종이계이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체내이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 생체외이다. 일부 실시양태에서, 제1 세포는 B 세포이다.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, T 세포 또는 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법을 포함한다: 본원에 개시된 시스템 중 임의의 하나를 수득함으로써 변형된 세포를 제조하는 것; 및 뉴클레아제를 제1 세포로 도입하는 것; 및/또는 복구 주형을 세포로 도입하며, 이로써 변형된 세포의 게놈에 변형된 B2M 로커스를 포함하는 변형된 세포를 제조하는 것. 일부 이러한 실시양태에서, 제1 세포는 B 세포이고, 여기서 변형된 B2M 로커스는 불활성화된다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 동종이계이고, 여기서 변형된 B 세포는 B2M 유전자를 발현하는 B 세포와 비교하여 T 세포 또는 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 것임을 포함한다.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법을 포함한다: 본원에 개시된 시스템 중 임의의 하나를 수득함으로써 변형된 세포를 제조하는 것; 및 뉴클레아제를 제1 세포로 도입하는 것; 및/또는 복구 주형을 세포로 도입하며, 이로써 변형된 세포의 게놈에 변형된 B2M 로커스를 포함하는 변형된 세포를 제조하는 것. 일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현한다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 자가이고, 여기서 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현하지 않는 세포는 T 세포 또는 자연 살해 세포에 의해 살해되는 것임을 포함한다.
일부 실시양태는 하기를 포함하는, 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법을 포함한다: 본원에 개시된 시스템 중 임의의 하나를 수득함으로써 변형된 세포를 제조하는 것; 및 뉴클레아제를 제1 세포로 도입하는 것; 및/또는 복구 주형을 세포로 도입하며, 이로써 변형된 세포의 게놈에 변형된 B2M 로커스를 포함하는 변형된 세포를 제조하는 것. 일부 실시양태에서, 변형된 B2M 로커스는 대체 MHC-I를 발현하며, 여기서 복구 주형은 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함한다. 일부 실시양태는 또한 변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 동종이계인 것임을 포함한다.
일부 실시양태는 본원에 제공된 방법 중 임의의 하나에 의해 제조된 세포를 포함한다.
실시예
실시예 1-형질 세포에서의 MHC II의 하향조절
주요 조직적합성 복합체 (MHC) -I 및 MHC-II 각각은 이식편 거부에서 역할을 갖는다. 각각의 MHC는 결국 제시 세포의 사망을 야기하는 면역 반응을 유발할 수 있는 펩티드 항원을 제시한다. 미분화된 B 세포, 및 분화된 B 세포의 일부 서브세트는 MHC-I 및 MHC-II 둘 다를 발현한다.
분화된 형질 세포가 MHC-II를 하향-조절하였는지 여부를 조사하기 위해, 뮤린 비장 B 세포를 음성 선택을 사용하여 단리하고 다양한 시토카인 및 피더 세포와 함께 배양하였다. 배양 조건은 하기를 포함하였다: (1) 2일 동안 MCD40L 및 CpG B 또는 αCD180을 사용한 활성화; (2) 3일 동안 IL-21 및 IL-6 또는 R848을 사용한 I상; 및 (3) 3일 동안 IL-21을 사용한 II상. 배양의 8일 후, 형질 세포의 서브세트는 MHC-II에 결합하는 항체 (MHCII-B-BV650)를 검출하는 유동 세포측정법을 사용하여 측정된 바와 같이, MHC-II를 하향-조절하였다. 도 1에 제시된 바와 같이 MCD40L 및 CpG B; 및 IL-21 및 IL-6 또는 R848을 포함하는 조건은 MHC-II의 감소된 수준을 갖는 세포의 증가된 백분율 (26.3, 및 23.3)을 초래하였다. 특정 배양 조건을 사용하는 분화된 B 세포로의 B 세포의 분화 또는 분화된 B 세포 산물은 MHC-II의 하향조절을 초래하였다. 생체외 분화된 B 세포 배양에서의 MHC-II의 예기치 않은 하향조절은 변형된 B 세포에 의한 미스매치된 MHC-II 단백질의 발현에 의해 야기될 수 있는 동종이식편 거부를 완화시킬 수 있다.
실시예 2-B 세포에서의 B2M 로커스의 변형
분화된 및 미분화된 B 세포 둘 다는 MHC-I를 발현하고 MHC-I 펩티드 복합체에서 펩티드 항원을 제시한다. MHC-I-펩티드 복합체는 MHC-I-펩티드 복합체에 대한 특이성을 갖는 T 세포 수용체를 발현하는 T 세포에 의해 직접적으로 인식될 수 있다. 이식편 거부는 공여자 MHC-I가 수용자 MHC-I와 상이한 경우를 초래할 수 있다. 이식편에서 MHC-I 복합체에 제시된 상이한 서열의 T 세포 인식 시, T 세포는 이식편 세포를 직접적으로 살해할 수 있다. MHC-I 분자는 B2M 단백질, 인간 백혈구 항원 (HLA) 단백질, 및 항원 펩티드를 포함한다. B2M은 세포 표면으로의 MHC-I 복합체의 수송에 요구된다.
B2M의 CRISPR 표적화를 기능적 B2M 로커스를 제거하는데 사용하였다. 2개의 gRNA 표적 서열 (B2M gRNA_1 및 B2M gRNA_5)을 ccTop CRISPR/Cas9 표적 온라인 예측자 도구를 사용하여 마우스 B2M 유전자의 코딩 영역 내에서 개발하였다 (도 2). gRNA_1은 뮤린 B2M의 제1 엑손의 시작 코돈에 인접한다 (게놈 조립 GRCm39/mm39, 위치 121978227-121978246). gRNA_5는 B2M의 엑손 2에 위치된다 (게놈 조립 GRCm39/mm39, 위치 121981407-121981388). 가이드 둘 다는 프레임쉬프트를 도입하는 뉴클레오티드 삽입 또는 결실, 또는 전사된 RNA를 넌센스 매개된 붕괴에 감수성이 되게 하는 정지 코돈의 도입을 통해 내인성 B2M 유전자의 불활성화 / 녹아웃을 초래하는 것으로 예측되었다. B2M gRNA_1은 번역 시작 부위 및 내인성 B2M 프로모터에 근접하였으며 이는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 인-프레임 삽입에 유리할 것이다. B2M gRNA_1 및 B2M gRNA_5에 대한 서열은 표 1에 열거된다.
표 1
B2M gRNA_1 및 gRNA_5를 재조합체 Cas9와 함께 리보핵단백질 (RNP) 복합체로서 1차 뮤린 B 세포에 전달하였다. 게놈 DNA를 세포로부터 제조하였고, 서열 디콘볼루션 분석을 수행하였다. 분석은 가이드 둘 다에서 높은 삽입 및 결실 빈도 (ICE 스코어), 및 예측된 불활성화 indel (KO 스코어)의 높은 발생률을 밝혀냈다 (도 3).
실질적으로 유사한 연구를 인간 세포에서 수행하여 표 1에 열거된 gRNA로 인간 B2M 로커스를 표적화하였다. 인간 가이드_1은 인간 B2M의 제1 엑손에 위치된다 (게놈 조립 GRCh38/hg38, 위치 44711585-44711566). 인간 가이드 2는 인간 B2M의 엑손 2에 위치된다 (게놈 조립 GRCh38/hg38, 위치 44715531-44715512). 가이드 둘 다는 프레임쉬프트를 도입하는 뉴클레오티드 삽입 또는 결실, 또는 RNA를 넌센스 매개된 붕괴에 감수성이 되게 하는 정지 코돈의 도입을 통해 내인성 B2M 유전자의 불활성화 / 녹아웃을 초래하는 것으로 예측되었다.
실시예 3-변형된 B 세포에서의 단백질 발현
HLA-B에 의해 코딩된 단백질 (H2kb)은 C57BL/6 마우스에 의해 발현된 1차 HLA 분자이다. B2M 녹아웃이 세포 표면에서의 MHC-I 발현을 제거하였는지 여부를 결정하기 위해, B 세포에서의 H2kb 발현을 유동 세포측정법에 의해 정량화하였다. C57BL/6 마우스로부터의 1차 B 세포 배양을 B2M gRNA_1 또는 gRNA_5 RNP 복합체로 처리하였다. 처리 후 4일에, 세포에서의 H2Kb 단백질 발현을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. H2kb-발현 세포의 수는 대조군과 비교하여 gRNA_1 또는 gRNA_5로 처리된 세포에 대해 감소되었다 (도 4a, 도 4b). 이 유동 세포측정법-기반 분석은 BM2 / MHC-I 단백질 발현이 75% 초과의 나이브, 활성화된 및 분화된 B 세포에서 녹-아웃 / 불활성화되었다는 것을 입증하였다: (a) 총 림프구, (b) CD19+, CD138- B-세포, 및 (c) CD19mid, CD138+ 형질 세포. 기능적 B2M 로커스의 게놈 제거는 MHC-I 복합체의 표면 발현을 제거하였다.
실질적으로 유사한 연구를 인간 B 세포에서 수행하여 표 1에 열거된 gRNA로 인간 B2M 로커스를 표적화하였다 (도 4c). gRNA-1를 사용하나, gRNA-2를 사용하지 않으면서, MHC-I 복합체 (HLA-A)의 발현은 90% 초과의 편집된 B 세포에서 제거되었다. 이들 결과는 뮤린 B 세포에서의 B2M 고갈 실험에서 관측된 것과 실질적으로 유사하다.
실시예 4-변형된 B 세포의 기능적 분석
미스매치된 MHC 폴리펩티드를 인식하는 TCR 단백질을 발현하는 세포독성 CD8+ T 세포는 미스매치된 MHC-I 단백질을 갖는 세포를 살해한다. 그러나, 세포독성 CD8+ T 세포는 비록 CD8+ T 세포 및 표적 세포가 미스매치된 공여자로부터 채취될지라도 MHC-I가 결여된 세포를 살해하지 않을 수 있다 (도 5a). B2M 불활성화에 의해 MHC-I가 결여된 B 세포가 이러한 세포독성 CD8+ T-세포에 의한 살해에 대해 저항성일 지 여부를 결정하기 위해, 혼합된 세포 검정을 BALB/c 마우스로부터의 T 세포 (HLA, 부류 D) 및 C57BL/6 마우스로부터의 B 세포 (HLA, 부류 B)를 사용하여 수행하였다. 도 5b를 참조한다. 간단하게, 0일차에, Hkd+CD8+ T 세포를 항-CD3/CD28 비드로 자극하였다. 3일차에, 자극제 비드를 T 세포로부터 제거하였고, T 세포를 IL-2에서 확장시켰다. 3일차에, Hkb+ B 세포를 비장으로부터 단리하고 MCD40L, 및 CpG와 함께 배양하였다. 4일차에, Hkb+ B 세포를 B2M을 불활성화시키거나, 또는 음성 대조군으로서 사용된 관련이 없는 로커스를 불활성화시키는 (Rosa26) RNP로, 또는 모의로 처리하였다. 6일차에, 공동-배양 군을 처리된 B 세포 및 자극된 T-세포로 확립하고, MCD40-L, IL-4, IL-2로 처리하였고 피더 지원은 없었다. 7 및 8일차에, 모든 배양물을 FACS에 의해 분석하였다.
MHC-1 녹아웃을 B2M gRNA_1을 사용하여 1차 C57BL/6 (Hkb+) CD45.1 B 세포에서 유도하였다. 이들 세포를 편집되지 않은 C57BL/6 CD45.2 B 세포와 혼합하고 이어서 계통-미스매치된 Balb/C (Hkd+) CD8+ T 세포와 함께 다양한 비로 공동-배양하였다. B2M gRNA_1 RNP로 처리된 B 세포의 집단은 Rosa26 RNP 또는 모의로 처리된 B 세포와 비교하여 더 높은 수준의 생존 및 더 높은 수준의 CD45.1 발현을 가졌다 (도 6a). 24시간 공동-배양 후, B2M으로 편집된 CD45.1 세포가 B 세포 혼합물에서 모의 또는 Rosa26 편집된 대조군 세포에 비해 우선적으로 나타났다. B2M 녹아웃 세포는 Rosa26 녹아웃 세포에 비해 증가된 생존 이점을 가졌다. CD45.2 (대조군 B 세포) 비에 대한 CD45.1 (B2M 녹아웃 B 세포)의 비를 B 세포에 대한 T 세포의 비와 비교하였다 (도 6b). CD8 T-세포 살해 검정에서의 B2M 녹아웃의 보호 효과는 증가하는 T 세포 대 B 세포 비에 따라 보다 현저하였다. 이들 데이터는 기능적 B2m의 게놈 제거가 B 세포를 T 세포 살해로부터 보호하였다는 것을 나타냈다.
실시예 5-B2M 불활성화는 CD8+ T 세포 살해에 대해 보호한다
CD8+ 시험관내 살해 검정을 수행하였다. 도 7은 실시예 4에 수행된 검정과 실질적으로 유사한 검정에 대한 시간선을 도시한다.
도 8a는 24시간 및 48시간 Balb/C CD8+ T-세포 공동-배양 시점에서의 CD45.2 (표적) 및 CD45.1 (유인체) C57/B6 B-세포에 대한 대표적인 FACS 플롯을 도시한다. CD45.1 유인체 세포를 Rosa26 세이프 하버 로커스를 표적화하는 대조군 RNP 또는 MHC1 녹아웃을 유도하는 B2M RNP로 편집하였다. 도 8a는 CD45.2 및 CD45.1 세포의 상대 비율이 두 시점에 걸쳐 Rosa26 대조군에서 안정적이고 초기 1:1 표적:유인체 시딩 비와 거의 동등하였다는 것을 나타낸다. 대조적으로, B2M 편집된 CD42.1 유인체 세포를 사용하여, 시간 경과에 따라 증가한 유인체 집단에 대한 상당한 왜곡이 관측되었으며, 이는 MHC1 손실에 대한 보호 효과를 시사한다.
도 8b는 CD8+ T-세포가 없는 공동-배양 조건에서의 기본 비로 정규화된, 도 8a에서의 실험으로부터의 CD45.1:CD45.2 비의 정량을 도시한다. 비를 증가하는 CD8+ T-세포 대 B-세포 비에 걸쳐 24시간 공동-배양 시점 (상단 패널) 및 48시간 공동-배양 시점 (하단 패널)에 대해 플롯팅하였다. 도 8b는 CD45.1:CD45.2 비가 두 시점에서 모의 편집된 또는 Rosa26 대조군 편집된 CD45.1 유인체 B-세포에 대해 안정적이지만, 증가된 CD8+ T-세포 비에 따라 B2M CD45.1 유인체 세포에 대해 계속해서 증가하였다는 것을 나타낸다. 각각의 데이터 포인트에 대해 N=3이다.
도 9a는 도 8a와 관련된 실험에서의 CD45.1 B-세포 집단 내 H2Kb (C57/B6 B-세포에서의 관련이 있는 MHC1 일배체형)에 대한 대표적인 FACS 분석을 도시한다. 24시간 공동-배양 시점 (상단 행) 및 48시간 공동-배양 시점 (하단 행)이 1.5:1, 1:1 및 1:2의 감소하는 CD8+ T-세포 대 B-세포 비에 따라 제시된다. 각각의 히스토그램은 3개의 상이한 CD45.1 유인체 집단: 모의 편집, Rosa26 대조군 편집, 및 B2M 편집에 대한 플롯을 덮어씌운다. 각각의 히스토그램에 제시된 백분율 값은 B2M 편집된 군에 대한 것이다. 도 9a는 B2M 편집된 군에서의 MHC1 녹아웃의 수준이 시간 경과 및 증가하는 CD8+ T-세포 비 둘 다에 따라 증가였다는 것을 나타내며, 이는 세포독성 CD8+ T-세포의 존재 하에 이 MHC1 음성 집단에 대한 선택을 시사한다.
도 9b는 증가하는 CD8+ T-세포 비에 따른 24시간 및 48시간 시점에서 B2M 편집된 CD45.1 B-세포에서의 H2Kb 녹아웃 수준의 정량을 도시한다. 도 9b는 두 시점에서 증가하는 CD8+ T-세포 비에 따라 MHC1 녹아웃 백분율에서의 점진적인 증가가 있었다는 것을 나타낸다. 각각의 데이터 포인트에 대해 N=3이다.
실시예 6-B 세포에서의 B2M 발현의 회복
NK 세포는 표면 상에 MHC-I 분자를 발현하지 않는 잠재적으로 해로운 세포를 제거하기 위해 면역 감시를 수행한다. B2M 로커스를 조작하는 것 중 하나의 가능한 적용은 CRISPR 및 상동성 지정 복구를 사용하여 카고 DNA를 B2M 로커스로 도입하고 NK 세포의 천연 면역 감시 기능을 조작된 세포 집단을 풍부화시키는데 사용하는 것이다. 상동성-지정 복구 실험에서, CRISPR gRNA는 게놈 표적 로커스를 파괴하는데 사용되고, AAV-전달된 복구 주형은 로커스로 혼입되며, 내인성 서열을 대체한다. 전형적인 실험에서, 게놈 파괴 이벤트는 고도로 효율적이고, 상동성-지정 복구 이벤트는 덜 효율적이다. 생성된 세포 집단은 오직 녹-아웃 대립유전자만을 갖는 다수의 세포 및 복구된 대립유전자를 발현하는 보다 작은 서브세트를 함유한다.
이 실시예에서, 생성된 서열이 내인성 B2M 코딩 서열과 인-프레임으로 존재하도록, B2M 로커스를 강한 MND 프로모터 및 GFP 마커를 포함하도록 변형시키기 위해 HDR 공여자 주형을 포함하는 구축물을 개발하였다 (도 10). 구축물은 돌연변이된 버전의 B2M gRNA_1 표적 부위를 함유하였다. P2A 자기-절단 서열은 GFP를 B2M cDNA로부터 분리하였으며, 이는 또한 인공적으로 재구성된 B2M 코딩 서열 발현한 HDR-편집된 세포에서 추적가능한 마커의 발현을 허용한다. 이 공여자 주형 (3307로 지정됨)은 아데노 연관 바이러스 (AAV)로 전달되도록 설계되었다.
B2M 로커스가 이전에 녹-아웃 / 불활성화되었던 B 세포에서, 구축물을 사용한 B2M 로커스의 성공적인 변형은 B 세포에 대한 MHC-I 발현을 회복시켜야 한다. 반대로, B2M 로커스가 이전에 녹-아웃 / 불활성화되었던 B 세포에서, 예를 들어 비-B2M 로커스에서의 부적절한 삽입 또는 부적절한 부분적인 삽입에 의한, 구축물을 사용한 B2M 로커스의 성공하지 못한 변형은 B 세포에 대한 MHC-I 발현을 회복시키지 않을 것이다. 간단하게, 부분적으로 편집된 세포는 H2Kb-이고; 이들은 NK 세포 감시로 인해 생체내에서 죽어야 하고; H2Kb는 GFP+ 세포에서 회복되어야 하고; 오직 HDR 및 편집되지 않은 세포만이 생체내에서 생존해야 한다.
1차 마우스 B-세포에서의 상동성-지정 복구를 B2M gRNA_1 RNP 전달 및 3307 AAV 형질도입의 조합을 사용하여 끌어냈다. RNP 및 바이러스 둘 다를 받은 세포에서, GFP+ 세포의 집단이 편집-후 3일에 관측되었으며 이는 또한 MHC-I 양성이었다 (도 11). GFP+ 세포는 MHC-1 음성 집단에서 관측되지 않았다. RNP 없이 3307 바이러스 구축물을 받은 세포는 완전히 GFP 음성이었으며, 이는 AAV 에피솜이 B 세포를 순환시키는데 안정적일 것이고, DNA 서열이 연관된 B2M CRISPR 시약의 공동-전달 없이 혼입되지 않았을 것이기 때문으로 예상되었다. 이는 B2M 로커스가 성공적으로 변형되고, (1) 변형이 일어나지 않았고; (2) B2M 로커스의 일부가 로커스가 gRNA에 의한 불활성화에 대해 저항성이고, B2M 산물을 발현하도록 변형된 세포에 대해 생체내 선택될 수 있다는 것을 입증하였다.
실시예 7-복구된 B2M cDNA 발현을 갖는 B 세포의 생존
B 세포는 내인성 B2M 로커스가 녹-아웃 / 불활성화되고, 외인성 코딩 서열이 B2M 로커스에서 B2M cDNA와 함께 인-프레임 삽입되는 실시예 6에 따라 제조된다.
대상체로부터 제조된 세포의 집단은 동일한 대상체, 또는 매치된 MHC-I 서열을 갖는 상이한 대상체에게 투여된다. 구축물이 적절히 B2M 로커스를 변형시킨 제조된 세포는 B2M 로커스에서 B2M cDNA를 발현하고 NK 세포 살해에 대해 생체내 저항성이다. 대조적으로, B2M 로커스가 구축물에 의해 적절히 변형되지 않고, B2M 로커스에서 B2M cDNA를 발현하지 않는 제조된 세포는 NK 세포 살해에 대해 생체내 감수성이고, NK 세포에 의해 생체내 클리어된다. 일부 실시양태에서, 유사한 전략이, 예를 들어 대상체에 대해 자가인 조작된 B 세포를 사용하여, 조작된 B 세포에 대해 생체내 선택하는데 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, B 세포는 제1 대상체로부터 수득된다. 세포는 변형된다. 변형된 세포는 제1 대상체, 또는 제1 대상체의 MHC-I 서열과 매치되는 MHC-I 서열을 갖는 제2 대상체에게 투여된다. 세포는 B2M 게놈 로커스 내로의 B2M cDNA의 삽입에 의해 B2M 게놈 로커스에서 변형된다. B2M cDNA를 발현하는 변형된 세포는 NK 세포 살해에 대해 생체내 저항성이다. 대조적으로, B2M cDNA를 발현하지 않는 세포는 NK 세포 살해에 대해 생체내 감수성이고, NK 세포에 의해 생체내 클리어된다.
또 다른 예에서, B 세포는 내인성 B2M 및/또는 CIITA가 녹-아웃 / 불활성화되고, 외인성 코딩 서열이 삽입되어 B2M을 대체하는 실시예 5에 따라 제조된다. 일부 실시양태에서, B2M 로커스는 하기를 발현하도록 변형된다: (a) 조작된 HLA-E, NK 세포를 불활성화시킬 수 있는 공통 자기-펩티드, 및 B2M을 포함하는 삼량체; (b) NK 세포 세포독성 활성을 억제할 수 있는 표면 단백질인 CD47; 또는 (c) NK 세포 활성을 억제할 수 있는 표면 단백질인 CD24.
실시예 8-B 세포에서의 B2M 로커스의 치환
HLA 분자는 고도로 다형성이며, 이는 상이한 사람들 사이에서 HLA 분자는 많은 상이한 서열을 갖는다는 것을 의미한다. MHC-I 내에서, 사람은 하나의 유형의 HLA를 발현한다. HLA-A, HLA-B 및 HLA-C는 고도로 다형성인 것으로 간주되는 반면에, HLA-E, HLA-F, 및 HLA-G는 덜 다형성이다. B2M 로커스에서의 치환을 위한 전략은 도 12a에 도시되며, 여기서 B2M 로커스는 내인성 B2M 발현을 불활성화시키고, 조작된 HLA-E, 사람에서 전형적으로 돌연변이되지 않는 공통 자기-펩티드, 및 B2M으로 이루어진 삼량체를 발현하도록 변형된다. 이 비다형성 삼량체를 사용한 B2M 로커스의 재구성 후, 세포는 세포 표면에서 삼량체를 발현하지만, 내인성, 고도로 다형성 HLA를 발현하지 않는다. 미스매치된 개체로부터 채취된 이 조작된 삼량체를 발현하는 B 세포는 CD8+ T 세포 살해를 끌어내지 않지만 NK 세포 면역 감시를 억제한다. 변형된 B 세포의 B 세포 생존을 시험하는 혼합된 세포 검정은 도 12b에 도시된다.
HDR 공여자 주형을 포함하는 구축물을 가요성 링커 서열을 통해 연결되고 외인성 MND 프로모터에 의해 구동된, Qdm 자기-펩티드, B2M, 및 HLA-E 알파 쇄를 함유하는 비-다형성 HLA-E 융합 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위해 개발하였다 (도 13). Qdm은 비-다형성 HLA-E에 의해 제시된 자기-펩티드였다. 융합 폴리펩티드는 추적을 위해 GFP 형광단에 쌍이 형성되고 내인성 B2M 녹아웃을 유도하도록 설계되었다. 삼량체에 대한 복구 주형을 함유하는 구축물 (3310으로 지정됨)은 아데노 연관 바이러스 (AAV)로 전달되도록 설계되었다. 구축물 3210에 대한 예시적인 뉴클레오티드 서열은 표 2에 열거된다.
C57BL/6 마우스로부터 단리된 1차 마우스 B-세포를 B2M gRNA_1 RNP 전달 및 3310 AAV 형질도입의 조합을 사용하여 편집하였다. 상동성-지정 복구를 겪은 세포에서, GFP는 편집-후 7일차에 CD19+, CD138- B-세포 및 CD19mid, CD138+ 형질 세포 둘 다에서 검출가능하였다 (도 14). 중요하게는, 두 집단에서 GFP 발현은 HLA-B (Hk2b) 표면 발현의 손실과 완전히 일치하였지만, HLA-B 양성 세포는 완전히 GFP 음성이었으며, 이는 HLA-E 융합 단백질이 이들 세포에서 대체된 내인성 MHC-I 발현을 가졌다는 것을 시사한다.
표 2
실시예 9-동종이식된 유전자-편집된 스텔스 B 세포의 생체내 생존
NK 살해에 대한 파라미터를 확립하기 위해, 도 15a 및 도 15b에 도시된 연구와 실질적으로 유사하게 수행된 생체내 연구가 수행된다. 1차 마우스 B 세포는 고정된 B 세포 수용체/항체 (SW-HEL)를 발현하는 C57BL/6 마우스로부터 단리된다. 세포는 변형된 세포가 HLA-E 삼량체, CD47, CD24, 또는 CD47 또는 CD24를 갖는 HLA-E 삼량체를 함유하는 조합을 발현하도록 실시예 6 및 8에 기재된 바와 같이 변형된다. 뮤린 BAFF, 뮤린 CD40L을 발현하고 가용성 R848 또는 뮤린 IL21로 보충된 피더 세포 상에서의 변형된 세포의 확장 후, 약 1000만개의 변형된 세포가 BalB/C 마우스로 전달된다. 세포 전달 후, 생착은 시간 경과에 따라 SW-HEL 항체 생산을 측정함으로써 추적된다. 생착은 B2M 로커스에서 GFP를 발현하도록 편집된 C57BL/6 세포 및 C57BL/6 마우스로의 모든 편집 전략으로부터의 모든 세포의 전달과 비교된다. HLAE-삼량체, CD47, CD24 또는 이들의 조합을 발현하는 동종이계 B 세포는 미스-매치된 수용자 동물로의 전달 후 SW-HEL을 발현한다. 전달된 세포에 의해 발현된 항체의 검출은 성공적인 생착을 나타낸다. 대조적으로, GFP를 발현하고 B2M을 발현하지 않도록 조작된 세포, 또는 B2M을 결실시키도록 편집된 세포는 NK 세포에 의한 클리어런스로 인해 전달에서 생존하지 않는다. 편집되지 않은 세포는 T 세포에 의한 클리어런스로 인해 성공적으로 생착하지 않는다. HLAE 삼량체, CD47 및/또는 CD24로의 MHC 부류 1의 성공적인 대체는 변형된 B 세포 집단이 미스-매치된 수용자로의 전달 시 생존한다는 것을 입증한다.
실시예 10-동종이식된 유전자-편집된 스텔스 B 세포의 생체내 생존
도 16에 도시된 연구와 실질적으로 유사한 연구가 수행된다. 인간 B 세포는 말초 혈액 단핵구 세포로부터 단리되고 변형된 세포가 HLA-E 삼량체, CD47, CD24, 또는 CD47 또는 CD24와 함께 HLA-E 삼량체를 함유하는 이들의 조합을 발현하도록 편집된다. 변형된 세포는 3-상 분화 절차, 예컨대 그 전문이 참조로서 포함된 U.S. 2018/0282692에 개시된 것을 사용하여 시험관내 확장되고 분화된다. 확장 및 분화 후, 1000만개의 조작된 세포는 IL15를 발현하도록 조작되고 이전에 상이한, 미스매치된 공여자로부터 단리된 인간 CD34 세포로 생착된 면역결핍 마우스 (NSG)로 전달된다. 인간 CD34 세포로의 전달을 통해 인간화된 NSG-IL15 마우스는 NK 세포를 발생시키고, NK 세포 살해의 평가를 가능하게 할 수 있다. 세포 전달 후, 생착은 시간 경과에 따라 인간 IgG 항체 생산을 측정함으로써 추적된다. CD34 세포로 인간화된 NSG 마우스는 IgG 항체를 생산하지 않는다. 동종이계 편집된 세포의 생착은 B2M 로커스에서 GFP를 발현하도록 편집된 B 세포 및 자가 인간화된 NSG-IL15 마우스로의 모든 편집 전략으로부터의 모든 세포의 전달과 비교된다.
HLAE-삼량체, CD47, CD24 또는 이들의 조합을 발현하는 동종이계 B 세포는 미스-매치된 수용자 동물로의 전달 후 hIgG를 발현한다. 전달된 세포에 의해 발현된 항체의 검출은 성공적인 생착을 나타낸다. 대조적으로, GFP를 발현하고 B2M을 발현하지 않도록 조작된 세포, 또는 B2M을 결실시키도록 편집된 세포는 NK 세포에 의한 클리어런스로 인해 전달에서 생존하지 않는다. 편집되지 않은 세포는 T 세포에 의한 클리어런스로 인해 성공적으로 생착하지 않는다. HLAE 삼량체, CD47 및/또는 CD24로의 MHC 부류 1의 성공적인 대체는 변형된 B 세포 집단이 미스-매치된 수용자로의 전달 시 생존한다는 것을 입증한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 "포함한", "함유하는", 또는 "특징으로 하는"과 동의어이고, 포괄적이거나 또는 개방형이고 추가적인, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
상기 설명은 본 발명의 여러 방법 및 물질은 개시한다. 본 발명은 방법 및 물질에서의 변형 뿐만 아니라 제조 방법 및 장비에서의 변경에 영향을 받기 쉽다. 이러한 변형은 본 개시내용 또는 본원에 개시된 본 발명의 실시를 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 결과적으로, 본 발명은 본원에 개시된 특정 실시양태로 제한되는 것이 아니라 본 발명의 진정한 범주 및 사상 내에 있는 모든 변형 및 대안을 포함하는 것으로 의도된다.
공개된 및 미공개된 출원, 특허, 및 문헌 참조를 포함하나 이에 제한되지는 않는 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 포함되고 본원에서 본 명세서의 일부로 구성된다. 참조로서 포함된 공개문헌 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 개시내용을 부정하는 한, 본 명세서는 임의의 이러한 모순된 자료를 대체하고/거나 그보다 우선하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Rawlings, David J.
James, Richard G.
Stoffers, Claire Marie
Cook, Peter J.
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR EDITING THE
B2M LOCUS IN B CELLS
<130> SCRI.295WO
<150> 63/047978
<151> 2020-07-03
<160> 10
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Murine B2M gRNA_1 (gRNA_1)
<400> 1
ctcggtgacc ctggtctttc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Murine 0B2M gRNA_5 (gRNA_5)
<400> 2
tcggcttccc attctccggt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human Guide 1
<400> 3
gagtagcgcg agcacagcta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human Guide 2
<400> 4
aagtcaactt caatgtcgga 20
<210> 5
<211> 301
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5? Homology arm
<400> 5
caccaaactc aagagcacac cctagatagt agggcaccaa gggtccagcc caggctgttt 60
gaaatatcac gggactttat aagaacatga aactgaaaat gggaaagtcc ctttgtaacc 120
tagttcagca tcaacagcta ggagactggt gacgacctcc ggatctgagt ccggattggc 180
tgtgagttca ggaactatat aagagcgcgc gccctggctg gctctcattt cagtggctgc 240
tactcggcgc ttcagtcgcg gtcgcttcag tcgtcagcat ggctcgctcg gtgaccctgg 300
t 301
<210> 6
<211> 347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MND promoter
<400> 6
gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 60
cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt 120
aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc 180
tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc 240
ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc 300
tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatc 347
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Qdm peptide
<400> 7
gctatggctc ccaggacact cctgctg 27
<210> 8
<211> 297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta-2 microglobulin
<400> 8
attcagaaga cacctcaaat ccaggtgtac tccagacacc cccccgagaa cggaaagcct 60
aatattctca attgttacgt gacccagttt cacccccccc atattgagat ccagatgctc 120
aaaaacggca agaaaattcc taaggtggag atgagcgaca tgagctttag caaggactgg 180
agcttctaca ttctcgccca cacagaattt acacccaccg agaccgacac ctatgcttgc 240
agggtgaaac atgccagcat ggctgagcct aagacagtgt actgggatag ggacatg 297
<210> 9
<211> 1011
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Alpha chain
<400> 9
agcccacact cgctgcggta tttcaccacc gccgtgtccc ggcccggcct cggggagccc 60
cggttcatca ttgtcggcta cgtggacgac acgcagttcg tgcgcttcga cagcgacgcg 120
gaaaatccga ggatggagcc tcgggcgcgg tggattgagc aggaggggcc ggagtattgg 180
gagcgggaga cttggaaagc cagggacatg gggaggaact tcagagtaaa cctgaggacc 240
ctgctcggct actacaatca gagtaacgac gaatctcaca cgctgcagtg gatgtacggc 300
tgcgacgtgg ggcccgatgg gcgcctgctc cgcgggtatt gtcaggaggc ctacgatggc 360
caggattaca tctccctgaa cgaggacctg cgttcctgga ccgcgaatga catagcctca 420
cagatctcta agcacaagtc agaggcagtc gatgaggccc accaacagag ggcatacctg 480
caaggtcctt gcgtggagtg gctccataga tacctacggc tgggaaatga gacactgcag 540
cgctcagacc ctccaaaggc acatgtgacc catcacccta gatctgaaga tgaagtcacc 600
ctgaggtgct gggccctggg cttctaccct gctgacatca ccctgacctg gcagttgaat 660
ggggaggagc tgacccagga catggagctt gtggagacca ggcctgcagg ggatggaacc 720
ttccagaagt gggcagctgt cgtggtgcct cttgggaagg agcagtatta cacatgccat 780
gtgtaccatg aggggctgcc tgagcccctc accctgagat gggagcctcc tccatccact 840
gtctccaaca tggtaatcat agctgttctg gttgtccttg gagctgtgat catccttgga 900
gctgtggtgg cttttgtgat gaagaggagg agacacatag gtgtaaaagg atgctatgct 960
catgttctag gcagcaagag cttccagacc tctgactggc ctcagaaggc a 1011
<210> 10
<211> 301
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' Homology arm
<400> 10
ttctggtgct tgtctcactg accggcctgt atgctatcca gagtgagtgc ctctttcccc 60
tctcttggca ttaaattttt agttctcctt agttctcctt cccgacggga ttggccaggg 120
ctgcgtctct cgggaaagga gtgggcgtcc cgctgcttac agctttgagg ctacagggtg 180
gatgcgcctg tttgcgagtg tgctgacggt cagcgctgaa gatggggaag gcttctcttt 240
ttctcctctg ctggcgggag cccctagact ccctgagcgc aaaaggaggg tggggctgcc 300
t 301
Claims (77)
- 하기를 포함하는, 세포에서 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M) 유전자를 변형시키는 시스템:
세포의 게놈에서의 내인성 B2M 유전자에서 표적화된 로커스를 절단할 수 있는 뉴클레아제, 또는 뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 및 임의로:
B2M 유전자에 상보성인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA), 및/또는
제1 상동성 아암, 제2 상동성 아암, 및 이들 사이의 페이로드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 상동성 아암 및/또는 제2 상동성 아암은 B2M 유전자의 서열에 대한 상동성을 갖는 것인 복구 주형. - 제1항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나와 비교하여 3개 이하의 미스매치를 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, gRNA가 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키도록 적합화되는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 로커스가 B2M 유전자의 제1 코딩 엑손 내에 있는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 Cas 뉴클레아제를 포함하는 것인 시스템.
- 제5항에 있어서, Cas 뉴클레아제가 Cas9 뉴클레아제를 포함하는 것인 시스템.
- 제1항에 있어서, 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제 (HE), 및 조합된 TALEN-HE 단백질 (메가TAL)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 복구 주형이 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된 것인 시스템.
- 제8항에 있어서, 페이로드가 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된 것인 시스템.
- 제8항에 있어서, 상동성의 제1 아암 및/또는 상동성의 제2 아암이 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된 것인 시스템.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산을 포함하는 것인 시스템.
- 제11항에 있어서, 페이로드가 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 것인 시스템.
- 제12항에 있어서, 리보솜 스킵 서열을 코딩하는 핵산이 제1 핵산과 제2 핵산 사이에 위치되는 것인 시스템.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드가 B2M cDNA를 코딩하는 것인 시스템.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드가 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 또는 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 것인 시스템.
- 제15항에 있어서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드가 HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G로부터 선택되는 것인 시스템.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 제3 폴리펩티드를 추가로 포함하는 시스템.
- 제15항에 있어서, 치료적 폴리펩티드가 효소, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 수용체, 키메라 항원 수용체, 또는 시토카인을 포함하는 것인 시스템.
- 제15항에 있어서, 치료적 폴리펩티드가 인자 IX, 안지오텐신-전환 효소 2 (Ace2), 베타-글루코세레브로시다제 (GBA), 알파-갈락토시다제 A (GLA), 또는 산성 알파-글루코시다제 (GAA)를 포함하는 것인 시스템.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산이 내인성 B2M 유전자의 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 시스템.
- 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 내인성 B2M 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드와 인-프레임으로 존재하는 것인 시스템.
- 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 페이로드가 이종성 프로모터를 포함하고, 제1 핵산이 이종성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 시스템.
- 제22항에 있어서, 이종성 프로모터가 구성적 프로모터인 시스템.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 프로모터가 MND 프로모터, 및 EF1 알파 프로모터, 또는 PGK 프로모터로부터 선택되는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 복구 주형을 포함하는 것인 시스템.
- 제25항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인 시스템.
- 제26항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제; 및 임의로, gRNA, 및/또는 복구 주형을 포함하는 세포를 추가로 포함하는 시스템.
- 제28항에 있어서, 세포가 뉴클레아제를 포함하는 것인 시스템.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 세포가 gRNA, 및/또는 복구 주형을 포함하는 것인 시스템.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 B 세포, 조혈 줄기 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 대형 프리-B 세포, 소형 프리-B 세포, 미성숙 B 세포, T1 B 세포, T2 B 세포, 변연부 B 세포, 성숙 B 세포, 나이브 B 세포, 형질모세포 (단기 생존) 세포, GC B 세포, 기억 B 세포, 및 장기 생존 형질 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
- 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 B 세포인 시스템.
- 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간인 시스템.
- 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가인 시스템.
- 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 동종이계인 시스템.
- 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체외인 시스템.
- 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생체내인 시스템.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 시스템 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
- 하기를 포함하는, 변형된 세포를 제조하는 방법:
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 시스템을 수득하는 것;
뉴클레아제를 제1 세포로 도입하는 것; 및 임의로:
gRNA를 세포로 도입하고/거나, 복구 주형을 세포로 도입하며, 이로써 변형된 세포의 게놈에 변형된 B2M 로커스를 포함하는 변형된 세포를 제조하는 것. - 제39항에 있어서, 변형된 B2M 로커스가 불활성화된 B2M 내인성 유전자를 포함하는 것인 방법.
- 제39항 또는 제40항에 있어서, gRNA가 내인성 B2M 유전자를 불활성화시키도록 적합화되는 것인 방법.
- 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제42항에 있어서, 선택이 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 면역 세포가 제1 세포에 대해 동종이계인 방법.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 면역 세포가 제1 세포의 MHC-I와 상이한 MHC-I를 포함하는 것인 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택되는 것인 방법.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 생체내인 방법.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 생체외인 방법.
- 제39항에 있어서, 변형된 B2M 로커스가 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현하는 것인 방법.
- 제49항에 있어서, 복구 주형이 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여되어, 변형된 B2M 로커스가 뉴클레아제에 의해 표적화된 서열이 결여되고/거나, gRNA 또는 그의 상보체의 서열에 혼성화할 수 있는 서열이 결여된 것인 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 복구 주형이 B2M cDNA를 포함하는 것인 방법.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제52항에 있어서, 선택이 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제53항에 있어서, 면역 세포가 제1 세포에 대해 자가인 방법.
- 제53항 또는 제54항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택되는 것인 방법.
- 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 생체내인 방법.
- 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 생체외인 방법.
- 제39항에 있어서, 변형된 B2M 로커스가 대체 MHC-I를 발현하는 것인 방법.
- 제58항에 있어서, 변형된 B2M 로커스가 불활성화된 B2M 내인성 유전자를 포함하는 것인 방법.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 복구 주형이 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및/또는 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함하는 것인 방법.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 세포에 대해 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제61항에 있어서, 선택이 변형된 세포를 면역 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제62항에 있어서, 면역 세포가 제1 세포에 대해 동종이계인 방법.
- 제62항 또는 제63항에 있어서, 면역 세포가 T 세포, 예컨대 세포독성 CD8+ T 세포, 또는 자연 살해 세포로부터 선택되는 것인 방법.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 생체내인 방법.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 생체외인 방법.
- 제39항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포가 B 세포인 방법.
- 제39항 내지 제67항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 세포.
- 하기를 포함하는, T 세포 또는 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법:
제39항의 방법에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 제1 세포는 B 세포이고, 여기서 변형된 B2M 로커스는 불활성화되는 것임; 및
변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 동종이계이고, 여기서 변형된 B 세포는 B2M 유전자를 발현하는 B 세포와 비교하여 T 세포 또는 자연 살해 세포에 의한 살해에 대한 증가된 저항성을 갖는 것임. - 하기를 포함하는, 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법:
제39항의 방법에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 변형된 B2M 로커스는 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현하는 것임; 및
변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 자가이고, 여기서 활성 B2M 유전자 또는 B2M cDNA를 발현하지 않는 세포는 T 세포 또는 자연 살해 세포에 의해 살해되는 것임. - 하기를 포함하는, 변형된 B 세포를 풍부화시키는 방법:
제39항의 방법에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 변형된 B2M 로커스는 대체 MHC-I를 발현하며, 여기서 복구 주형은 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함하는 것임; 및
변형된 세포를 T 세포 또는 자연 살해 세포와 접촉시키며, 여기서 T 세포 또는 자연 살해 세포는 제1 세포에 대해 동종이계인 것임. - 하기를 포함하는, 동종이계 주입을 위한 변형된 B 세포를 제조하는 방법:
제39항의 방법에 의해 변형된 세포를 제조하며, 여기서 세포는 B 세포이고, 복구 주형은 B2M cDNA, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드, 및 비-중합체성 HLA 폴리펩티드에 의해 제시될 자기-펩티드를 코딩하는 페이로드를 포함하는 것임. - 제72항에 있어서, 변형된 B 세포를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 B 세포는 대상체에 대해 동종이계인 방법.
- 제72항 또는 제72항에 있어서, 비-중합체성 HLA 폴리펩티드가 HLA-E, HLA-F, 또는 HLA-G로부터 선택되는 것인 방법.
- 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유류인 방법.
- 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
- 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열; 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열; 또는 서열식별번호: 01-04 중 임의의 하나와 비교하여 3개 이하의 미스매치를 갖는 그의 변이체를 포함하는 단리된 핵산.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063047978P | 2020-07-03 | 2020-07-03 | |
| US63/047,978 | 2020-07-03 | ||
| US202063114131P | 2020-11-16 | 2020-11-16 | |
| US63/114,131 | 2020-11-16 | ||
| PCT/US2021/039953 WO2022006309A1 (en) | 2020-07-03 | 2021-06-30 | Methods and compositions for editing the b2m locus in b cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230035048A true KR20230035048A (ko) | 2023-03-10 |
Family
ID=79315579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237001885A KR20230035048A (ko) | 2020-07-03 | 2021-06-30 | B 세포에서 b2m 로커스를 편집하는 방법 및 조성물 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4175651A1 (ko) |
| JP (1) | JP2023532917A (ko) |
| KR (1) | KR20230035048A (ko) |
| CN (1) | CN116033910A (ko) |
| AU (1) | AU2021300358A1 (ko) |
| BR (1) | BR112022026534A2 (ko) |
| CA (1) | CA3186620A1 (ko) |
| IL (1) | IL299491A (ko) |
| MX (1) | MX2022015788A (ko) |
| WO (1) | WO2022006309A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20240093308A1 (en) * | 2022-08-01 | 2024-03-21 | Idexx Laboratories, Inc. | Human Fractional Abundance Assays |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108699132B (zh) * | 2015-12-18 | 2023-08-11 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | Mhc细胞受体的靶向破坏 |
| US20220233588A1 (en) * | 2017-06-30 | 2022-07-28 | Cellectis | Cellular immunotherapy for repetitive administration |
-
2021
- 2021-06-30 AU AU2021300358A patent/AU2021300358A1/en active Pending
- 2021-06-30 KR KR1020237001885A patent/KR20230035048A/ko unknown
- 2021-06-30 WO PCT/US2021/039953 patent/WO2022006309A1/en active Application Filing
- 2021-06-30 BR BR112022026534A patent/BR112022026534A2/pt unknown
- 2021-06-30 CN CN202180047549.4A patent/CN116033910A/zh active Pending
- 2021-06-30 MX MX2022015788A patent/MX2022015788A/es unknown
- 2021-06-30 CA CA3186620A patent/CA3186620A1/en active Pending
- 2021-06-30 JP JP2022581341A patent/JP2023532917A/ja active Pending
- 2021-06-30 EP EP21832140.4A patent/EP4175651A1/en active Pending
- 2021-06-30 IL IL299491A patent/IL299491A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3186620A1 (en) | 2022-01-06 |
| WO2022006309A1 (en) | 2022-01-06 |
| CN116033910A (zh) | 2023-04-28 |
| JP2023532917A (ja) | 2023-08-01 |
| IL299491A (en) | 2023-02-01 |
| BR112022026534A2 (pt) | 2023-04-18 |
| AU2021300358A1 (en) | 2023-02-02 |
| MX2022015788A (es) | 2023-02-27 |
| EP4175651A1 (en) | 2023-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11180776B1 (en) | Universal donor cells | |
| CN110139675B (zh) | 用具有工程化稳定的内源性foxp3基因表达的cd4t细胞治疗自身免疫疾病的方法 | |
| AU2018264636B2 (en) | Artificially manipulated immune cell | |
| WO2023011638A1 (zh) | 融合蛋白以及其使用方法 | |
| KR20210010555A (ko) | 약물 저항성 면역 세포 및 그의 사용 방법 | |
| CN114502181A (zh) | 人工抗原特异性免疫调控性t(airt)细胞 | |
| KR20230035048A (ko) | B 세포에서 b2m 로커스를 편집하는 방법 및 조성물 | |
| JP2020528046A (ja) | Ｔ細胞に基づく免疫療法の有効性増強のための組成物および方法 | |
| US20230158110A1 (en) | Gene editing of monogenic disorders in human hematopoietic stem cells -- correction of x-linked hyper-igm syndrome (xhim) | |
| US20230272431A1 (en) | Methods and compositions for editing the b2m locus in b cells | |
| US20220279767A1 (en) | Transgenic swine, methods of making and uses thereof, and methods of making human immune system mice | |
| WO2022251217A2 (en) | Ciita targeting zinc finger nucleases |