KR20230025935A - 항산화 효과를 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서는 서열번호 1 내지 340 중 어느 한 항의 서열을 갖는 항산화 펩티드, 1 내지 340 의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 이를 유효 성분으로 포함하는 항산화용 조성물이 개시된다. 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드는 우수한 항산화 활성을 가진다. 따라서 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물은 항산화 효과를 위한 약학적 조성물 또는 화장료 조성물, 나아가 식품조성물로도 사용될 수 있어 인체의 항산화체계가 정상 작동을 하지 못하여 발생할 수 있는 질병의 예방 또는 치료에 널리 이용될 수 있다.

Description

항산화 효과를 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물{PEPTIDE HAVING ANTIOXIDATIVE EFFECT AND COMPOSITION COMPRISING SAME}
본 발명은 항산화 효과를 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
인체는 나이가 들면서 자연스럽게 노화가 진행이 된다. 하지만 체내 활성산소의 농도가 높게 된다면 노화는 보다 빨리 진행이 되고 이외에 다른 신체 이상 증상을 유발한다. 활성산소는 호흡과정에서 몸 속으로 들어간 산소가 산화과정에 이용되면서 여러 대사과정에서 생성되어 생체조직을 공격하고 세포를 손상시키는 산화력이 강한 산소를 말하고 유해산소라고도 불린다. 현대인이 앓고 있는 질환 중에 약 90%이상이 활성산소와 관련이 있을 정도로 많은 질환이 활성산소와 관계 있다.
노화, 암, 뇌혈관 질환, 심혈관계 질환 등과 같은 질환의 원인이 자유라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)인 것으로 인식되고 있다. 상기 활성산소종은 생물체에 침입된 병균 등에 의한 생물학적 스트레스나 지구 환경 악화에 따른 각종 환경 스트레스 등의 스트레스로 인하여 생물 유지에 필수적으로 요구되는 산소의 반응성이 높아진 산소를 의미할 수 있으며, 상기 반응성이 높은 산소는 심각한 생리적 장애 등을 유발할 수 있게 된다. 일예로, 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 과산화수소 또는 일중항산소(singlet oxygen) 등이 있다.
구체적으로, 상기 자유라디칼 또는 활성산소종은 세포를 파괴하거나 피부 진피층의 결합조직을 절단하거나 교차 결합을 일으키므로 주름형성, 아토피성 피부염, 여드름 또는 피부암과 같은 피부 관련 질병뿐만 아니라 암, 심근경색증(myocardial infarction), 뇌졸증(stroke), 죽상동맹경화증(atherosclerosis) 등을 포함하는 심혈관계질환, 근위축측삭경화증(amyotrophic laternal sclerosis)이나 파킨스씨 병(Parkinsion's disease, PD)과 같은 퇴행성 신경질환(chronic neurodegenerative disease)의 원인이 되는 것으로 보고되어 있다. 또한, 자유라디칼 또는 활성산소종은 인체 내에서 지질을 과산화시켜 과산화지질이라고 하는 해로운 물질을 생성할 수 있고, 상기 과산화지질은 혈관에 작용하여 동맥경화나 혈정과 같은 각종 성인병의 원인이 되는 것으로 보고되어 있다.
이와 같이, 평균수명이 증가하고 사회의 노령화가 진행되면서 노화 및 퇴행성 질환과 같은 노화와 관련된 질병에 대한 관심이 증대되고 있고, 경제성장 및 식생활의 변화 등에 따라 대사증후군이나 성인병 등에 대한 관심이 증대되고 있다. 이러한 질병에 대한 관심의 증가와 함께 상기 질병의 원인으로 보고된 자유라디칼 또는 활성산소종에 대한 관심도 증대되면서, 항산화효과를 갖는 물질에 대한 관심이 증대되고 있다.
생체 내에는 이러한 자유라디칼 또는 활성산소종을 제거하는 항산화체계로 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 퍼옥시다제(peroxidase, POD) 또는 카탈라제(catalase, CAT) 등의 고분자 항산화 효소와 비타민 C, 비타민 E 또는 글루타치온(glutathione) 등의 항산화 물질 등이 존재한다. 그러나, 공해나 자외선 또는 상기 생물학적 스트레스를 포함하는 여러 원인 및 노화에 의해서 점차적으로 인체의 항산화체계는 정상 작동을 하지 못하게 되며, 이러한 경우 항산화 물질을 섭취함으로써 방어할 수 있도록, 활성산소종을 제거할 수 있는 물질 즉, 항산화제의 체내 공급이 요구되고 있다. 이러한 항산화제의 체내 공급 요구에 따라 항산화제 또는 항산화 효과를 갖는 식품 등을 섭취하여 상기 질병을 예방 또는 치료하거나 노화를 지연시키고자 하는 노력이 다방면으로 이루어지고 있는 실정이다.
특히, 자유라디칼(free radicals)에 의한 산화 스트레스는 뇌신경 질환에서 나타나는 세포사멸의 주요 기전 중의 하나로 제시되고 있다.( Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996) 뿐만 아니라 체 내의 각 조직에서 일어나는 세포 사멸의 주원인으로 보고되고 있는 바, 현대인의 질병 중 약 90%가 활성산소와 관련이 있으며, 상기한 뇌신경질환을 제외한 다른 질병의 일례로는 암, 동맥경화증, 당뇨병, 심근경색증, 간염, 신장염, 아토피, 자기면역질환이 등이 해당된다. 따라서 상기 뇌신경질환을 포함한 관련 질환의 예방 또는 치료에서 활성산소의 활성저해 시킬 수 있는 방법이나 물질의 개발은 매우 절실히 요구 되고 있다.
또한, 종래에 뛰어난 항산화력을 지닌 합성 항산화제로는 BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxytoluene) 또는 TBHQ(tertiary butylhydropuinone) 등이 보고되어 있는데, 이러한 합성 항산화제는 체내 흡수 물질의 일부가 독성을 지니고 있어, 기형발생인자 및 발암 물질화 될 수 있고, 간 비대증을 유발하거나 간장 중 마이크로소말 효소활성(microsomal enzyme activity)을 증가시킬 수 있어, 폐나 신장 등의 장기 조직의 병리적인 해를 유발시키는 등의 안전성 문제가 제기되고 있다.
따라서, 근래에는 보다 인체에 안전하고, 항산화력이 뛰어난 항산화제를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구의 일환으로 천연 항산화제 즉, 천연물질로부터 수득한 항산화제에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.
Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264, 1996 Cross, C.E. et al. Ann. Intern. Med. 1987, 107:526-45; Adelman, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85(8): 2706-8, Moran Benhar et al. EMBO Reports, 2002, 3(5):420-425
이에 본 발명자들은 보다 인체에 안전하고, 항산화력이 뛰어난 항산화제를 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명자들은 텔로머라제로부터 유래되는 펩티드들이 항산화 활성을 가질 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 항산화 활성을 가진 신규 펩티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 활성을 가진 신규 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 하는 항산화 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항산화 활성을 갖는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 일측면에 따르면, 항산화 활성을 갖는 펩티드로서, 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드가 제공된다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 85, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 94, 서열번호 101, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 142, 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 154, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 164, 서열번호 165, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 182, 서열번호 186, 서열번호 189, 서열번호 192, 서열번호 197, 서열번호 200, 서열번호 205, 서열번호 207, 서열번호 210, 서열번호 240, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 284, 서열번호 286, 서열번호 288, 서열번호 289, 서열번호 290, 서열번호 291, 서열번호 293, 서열번호 294, 서열번호 295, 서열번호 296, 서열번호 310, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 330, 서열번호 337 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 142, 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 147, 서열번호 180, 서열번호 186, 서열번호 189, 서열번호 192, 서열번호 197, 서열번호 200, 서열번호 205, 서열번호 207, 서열번호 210, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 284, 서열번호 286, 서열번호 295, 서열번호 310, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 337로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에서 따르면, 항산화 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것 일 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 30개 이하의 아미노산으로 구성된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 펩티드는 인간의 텔로머라제로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 조성물은 과산화 작용 또는 활성 산소에 기인한 질환의 치료 또는 예방용일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 과산화 작용 또는 활성산소에 기인한 질환은 뇌신경계 또는 심혈관계 질환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 뇌신경계 또는 심혈관계 질환은 알츠하이머병, 루게릭병, 파킨슨씨병, 크로이츠펠트-야곱병, 뇌졸중, 뇌경색 및 뇌출혈 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화 방지 또는 미백용일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 상기 언급된 항산화 조성물을 투여하는 것을 특징으로 하는 과산화 작용 또는 활성 산소에 기인한 질환의 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나의 서열을 갖는 펩티드 또는 상기 서열과 80%의 상동성을 갖는 서열을 갖는 펩티드 또는 단편인 펩티드는 우수한 항산화 활성을 가진다. 따라서 본 발명의 펩티드를 포함하는 조성물은 항산화 효과를 위한 약학적 조성물 또는 화장료 조성물, 나아가 식품조성물로도 사용될 수 있어 인체의 항산화체계가 정상 작동을 하지 못하여 발생할 수 있는 질병의 예방 또는 치료에 널리 이용될 수 있다.
도 1은 PC12 세포주의 세포활성에 과산화수소(H2O2)가 농도에 따라 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 과산화수소 농도의 증가에 따라, PC12 세포 활성의 감소를 분석한 것으로, (A)는 MTT 어세이법을 이용한 세포활성(viability activity) 분석결과이고, (B)는 CCK-8 어세이법을 이용한 세포활성 분석결과이다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 2는 과산화수소에 의해 세포활성이 감소된 PC12 세포에서 PEP 1을 각각의 농도에 따라 처리하였을 때 세포활성 정도를 나타낸 그래프이다. 과산화수소에 의해 세포활성이 감소된 PC12 세포에 PEP 1를 처리하였을 때 세포활성을 감소시키지 않는 것을 확인한 결과를 나타낸다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 3은 신경줄기세포의 세포활성에 과산화수소가 농도에 따라 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 과산화수소 농도의 증가에 따라, 신경줄기세포 활성의 감소를 분석한 결과를 나타낸다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 4는 과산화수소에 의해 세포활성이 감소된 신경줄기세포에서 PEP 1의 효과를 보기 위하여 PEP 1의 농도 증가에 의해 감소된 세포활성이 회복 정도를 확인한 그래프이다. (A)는 MTT 어세이 및 CCK 어세이 결과를 나타낸 것이고, (B) 세포독성을 나타낸 결과를 나타낸 것이다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우, #표시는 200μM H2O2 만을 처리한 군과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 5는 β-아밀로이드에 의해 손상된 신경줄기세포에서 PEP 1을 각각의 농도에 따라 처리하였을 때 세포활성 정도를 나타낸 그래프이다. PEP 1 농도 증가에 의해 상기 신경줄기세포의 증식활성이 회복되는 것을 확인한 결과를 나타낸다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우, #표시는 200μM H2O2 만을 처리한 군과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 6은 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포에서 PEP 1을 각각의 농도에 따라 처리하였을 때 세포사멸 정도를 나타낸 그래프이다. 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포의 세포사멸이 PEP 1의 농도에 비례하여 효과적으로 감소되는 것을 확인한 결과를 나타낸다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우, #표시는 200μM H2O2 만을 처리한 군과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 7은 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포에서 PEP 1을 각각의 농도에 따라 처리하였을 때 세포이동의 활성 정도를 나타낸 그래프이다. 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포의 세포이동 활성이 PEP 1의 농도에 비례하여 회복되는 것을 나타낸다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우, #표시는 200μM H2O2 만을 처리한 군과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 8은 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포에서 PEP 1을 각각의 농도에 따라 처리하였을 때 활성산소(Reactive oxygen species, ROS) 생성의 정도를 나타낸 사진이다. 과산화수소에 의한 손상으로 신경줄기세포에서 증가된 활성산소가 PEP 1의 농도에 비례하여 감소한 결과를 나타낸다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우, #표시는 200μM H2O2 만을 처리한 군과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 9는 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포에서 PEP 1의 단백질 발현량 조절 효과를 분석한 2D 전기영동분석 결과 사진이다.
도 10은 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포의 단백질 발현량 변화에서 PEP 1의 효과를 나타낸 그래프 및 2D 전기영동분석 결과 사진이다.
도 11은 신경줄기세포 및 뇌피질 신경세포의 세포 활성사이에서 PEP 1의 효과를 비교한 그래프이다. MTT어세이 결과에서 PEP 1은 뇌피질 신경세포보다 신경줄기세포에서 우세하게 세포활성 증가 유도를 나타낸다 (*표시는 대조군(control group)과 비교하였을 때 p<0.05인 경우, #표시는 200μM H2O2 만을 처리한 군과 비교하였을 때 p<0.05인 경우).
도 12 내지 도 32는 DCF-DA 방법을 이용한 펩티드들의 ROS 억제능 분석 결과를 나타낸 것이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
호흡을 통해 체내에 들어간 산소는 산화 과정을 거치면서 산화력이 강한 활성 산소로 될 수 있는데, 이 활성 산소는 DNA를 손상시키고, 적혈구를 파괴시키며, 세포를 사멸시키는 작용 등을 하여 각종 질환의 원인이 될 수 있다.
우리 인체는 이러한 활성 산소에 대한 방어 시스템을 가지고 있는데, 예를 들어 SOD(superoxide dismutase), 카탈라제(catalase), 또는 락토퍼옥시다아제(lactoperoxidase), 글루타티온퍼옥시다아제(glutathione peroxidase)와 같은 퍼옥시다제(peroxidase) 등의 항산화성 효소 및 비타민 C(ascorbic acid), 비타민 E(토코페롤), 요산(uric acid)과 같은 저분자의 항산화 물질의 작용에 의하여 자유라디칼을 제거하는 방법으로 이러한 ROS의 작용을 최소화할 수 있다. 하지만, 이러한 생체 방어력에 이상이 생기거나 과도한 ROS에 노출될 경우에는 잔여 또는 과잉의 활성산소종을 쉽게 분해하지 못하거나 또는 그로 인한 손상을 회복시키지 못하는 상태, 즉 산화적 스트레스(oxidative stress)를 받게 된다.
이와 같은 산화적 스트레스로 인해 과잉으로 생성되는 자유 라디칼이나 과산화수소와 같은 활성산소종으로 인하여 생체에 치명적인 산소독성이 야기될 뿐만 아니라, 세포 구성 성분인 기질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도하여 노화는 물론 암을 비롯하여 알츠하이머 질환, 파킨슨병과 같은 뇌질환, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 류마티스, 자기면역 질환 등의 각종 질병을 일으킨다고 알려져 있다(Cross, C.E. et al. Ann. Intern. Med. 1987, 107:526-45; Adelman, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85(8): 2706-8, Moran Benhar et al. EMBO Reports, 2002, 3(5):420-425).
본 발명의 일측면은 서열 번호 1 내지 340에 기재된 펩티드 중 선택된 하나이상의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항산화용, 구체적으로 세포 과산화 방지 또는 과산화에 의한 세포 사멸 방지용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면의 서열 번호 서열 번호 1 내지 340에 기재된 펩티드 중 하나 이상의 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 조성물은 활성 산소에 의해 손상된 세포의 사멸을 방지하고 보호하여, 우수한 항산화 효과를 나타내고, 나아가 생체 노화 방지, 피부 미백, 피부 재생 촉진, 피부 보습 및 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 서열 번호 1 내지 340에 기재된 펩티드 중 선택된 하나 이상의 펩티드를 유효 성분으로 포함하여 뛰어난 항산화 효과를 가지므로, 과산화 작용 또는 활성 산소에 기인한 각종 질환 및 증상을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 과산화 작용 또는 활성 산소에 기인한 질환은 뇌신경계 또는 심혈관계 질환을 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 뇌신경계 또는 심혈관계 질환은 알츠하이머병, 루게릭병, 파킨슨씨병, 크로이츠펠트-야곱병, 뇌졸중, 뇌경색 및 뇌출혈 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
서열번호 1 내지 서열번호 340에 기재된 펩티드는 아래 표 1 내지 6과 같다. 서열번호 341은 인간의 텔로머라제 전장 단백질의 서열이다. 서열번호 1은 텔로머라제로부터 유래된 펩티드로서 16개 아미노산으로 구성된 펩티드이다. 서열번호 2 내지 서열번호 77의 펩티드는 서열번호 1의 서열을 포함하는 펩티드이다. 서열번호 78 내지 서열번호 179의 펩티드는 서열번호 1의 펩티드의 단편들이다. 서열번호 180 내지 서열번호 340의 펩티드는 텔로머라제로부터 유래된 펩티드로 서열번호 341의 단편들이다.
아래 표 1 내지 7의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1 내지 서열 번호 340에 기재된 펩티드 중 하나 이상의 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 본 명세서에서 "pep"이라 함은 서열번호 1 내지 서열번호 340 중 어느 한 서열을 갖는 펩티드, 또는 그 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 상기 서열의 단편을 총칭하는 용어이다.
[표 1]
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
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Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
본 발명의 일측면은 항산화 활성을 갖는 펩티드로서, 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 펩티드를 대량 생산할 수 있다. 예컨대 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 넣어 배양함으로써, 펩티드를 대량 생산할 수 있다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드는, 30개 이하의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1 내지 340 의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1 내지 340 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.
[표 2]
Figure pat00009
펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
본 발명의 일측면에서, 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자로서 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예컨대, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머(antosense oligomer), 플라스미드(plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 일측면에 따른 서열 번호 1 내지 340의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1 내지 340의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮아 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다.
본 발명의 일측면에서는 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 항산화 조성물은 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01g/L 내지 1kg/L, 구체적으로 0.1g/L 내지 100g/L, 더 구체적으로 1g/L 내지 10g/L의 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열 번호 1 내지 340로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1 내지 340 중 어느 하나의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항산화용, 구체적으로는 세포 과산화 방지 또는 과산화에 의한 세포 사멸 방지용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 항산화용, 구체적으로는 세포 과산화 방지 또는 과산화에 의한 세포 사멸 방지용 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 10ng/kg/일 내지 10mg/kg/일, 구체적으로는 0.1㎍/kg/일 내지 1mg/kg/일, 더 구체적으로는 1㎍/kg/일 내지 100㎍/kg/일, 보다 더 구체적으로는 2㎍/kg/일 내지 50㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에서는 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항산화용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면에서는 서열번호 1 내지 340 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항산화용, 구체적으로는 세포 과산화 방지 또는 과산화에 의한 세포 사멸 방지용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 피부 외용제 조성물 또는 화장료 조성물은 국소 적용에 적합한 모든 제형으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 용액, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 고체, 겔, 분말, 페이스트, 포말(foam) 또는 에어로졸의 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물은 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일측면에 따른 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 계면 활성제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 또는 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한(制汗)제를 더 포함할 수 있다. 상기 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 화장료 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
본 발명의 일측면에서 조성물은 서열 번호 1 내지 340으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 유효 성분으로 포함하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는 한, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
발명의 실시를 위한 형태
실시예 1: 신경줄기 세포 내 PEP 1의 과산화수소 처리 후 생존도 증가여부 측정
PEP 1의 항산화 효과는 과산화수소에 의해 유도된 신경줄기세포의 사멸을 방지하는 효과로부터 입증하는 방법을 사용하였다. 즉, 신경줄기세포를 배양한 후, 과산화수소를 처리하여 신경독성을 유발하였고, PEP 1이 과산화수소 처리로 인한 신경독성에 작용하는 신경보호 효과가 있는지 확인하기 위해, 배양된 세포에 PEP 1을 처리하여, PI3K 신호전달 경로를 분석하였다.
실험예 1-1. 펩티드 PEP 1(서열번호 1)의 합성
인간 텔로머라제로부터 선별된 하기의 서열번호 1(PEP 1)을 가지는 하기 화학식 1의 구조식을 갖는 16개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 합성하였다.
<화학식 1>
Figure pat00010
서열번호 1의 펩티드 PEP 1은 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조할 수 있었다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫 번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin
펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
PEP 1의 구체적인 합성 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 커플링
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc 탈보호
20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.
4) 절단(Cleavagge): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 레진에서 분리하였다.
5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.
6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 파우더로 제조하였다.
실험예 1-2. PC12 세포 및 신경줄기세포의 준비
일반세포로서 PC12 세포(pheochromocytoma cell)는 랫드(rat) 부신피질에서 유래된 것으로 신경성장인자(nerve growth factor)로서 신경세포의 분화를 유도하였다. 신경줄기세포는 임신 13일째 랫드 배아의 머리에서 대뇌피질을 분리한 후, 일주일간 염기성 섬유모세포증식인자(Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF))를 처리하여 배양한 것을 사용하였다.
보다 구체적으로, 랫드(rat) 부신피질 갈색세포종(adrenal gland phaeochromocytoma)으로부터 유래된 PC-12 세포주(Cell Line)는 88022401 Sigma를 사용하였고, 배양 배지(Culture Medium)는 RPMI 1640 + 2mM Glutamine + 10% Horse Serum + 5% FBS(Foetal Bovine Serum)를 사용하였다. PC12 셀은 50-70%가 분화(differentiation)를 위해 합체된다(confluent for differentiation). 분화는 50 ng/ml NGF 가 보충된 15% FBS 를 함유하는 DMEM-Hi 에서 이루어지고, 2-3일에 한번씩 새로운 NGF-함유 배지로 교체해주었다. 분화는 5-7일이면 완료된다.
신경줄기 세포의 경우, 임신 13일째 랫드 배아의 머리에서 대뇌피질을 분리한 후 다음과 같은 배양조건에서 일주일간 bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor)를 처리하여 확보하였다: Ca2+/Mg2+-free HBSS(Hank's balanced salt solution), 폴리 오르니틴(poly-ornithine, 5 μg/ml, Sigma, St. Louis, MO at 37℃ overnight)으로 코팅된 이후 피브로넥틴(fibronectin, 1 μg/ml, Sigma, for at least 2 h before use)으로 코팅되어 전처리된 폴리오르니틴 피브로넥틴(polyornithine-fibronectin)으로 코팅하여 전처리된 12 mm 유리 커버슬립(coverslips) (Bellco, Vineland, NJ).
실험예 1-3. 과산화수소에 의해 손상된 PC12 세포에서 PEP 1의 신경 독성평가
과산화수소의 신경독성에 대한 PEP 1의 신경보호 효과를 관찰하기 위해, MTT, CCK-8을 이용하여 과산화수소의 농도를 선정하였고(도 1 참조), 선정된 농도인 200μM 과산화수소 처리하고, 0.01에서 500uM 농도의 다양한 농도로 PEP 1을 48시간 동안 처리한 후, 세포 생존도 및 사멸정도를 MTT 어세이, CCK-8 어세이, LDH 어세이, TUNEL 어세이 이용하여 평가하였다. 또한, BrdU 어세이를 이용하여 세포의 증식 정도를 분석하였다.
MMT 어세이에서는 200 ml PBS 내의 104 - 106 셀이 담긴 96 웰 플레이트를 이용하였다. 20 ml MTT 용액을 첨가하고 잘 섞어 주었다. 어두운 곳에서 37℃ 온도 조건으로 4시간 동안 배양하였다. 분석을 위해 부분표본(aliquot)을 제고하였고, 200 ml의 acidic isopropanol으로 처리하여 잘 섞어 주었다. 어두운 곳에서 37℃ 온도 조건으로 1시간 동안 추가 배양한 후, ELISA 플레이트 리더(ELISA plate reader)에서 570nm로 OD값을 분석하였다(표준 파장은 630nm).
CCK-8 어세이는 WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt] 및 1-methoxy PMS를 결합시켜 생존 세포수를 카운트하기 위한 어세이법이다. 즉, 10 μl 의 시약 키트를 셀에 처리하고 96 웰 플레이트에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 생존도(Cell viability)는 ELISA 플레이트 리더(ELISA plate reader )에서 450 nm로 분석하였다. 모든 측정 결과는 셀 배양물이 없는 플레이트와 비교하여 OD(optical density) 값을 정규분포화(normalize)하였다
LDH 어세이 에서는 비색분석 키트(colorimetric assay kit, Roche Boehringer-Mannheim, IN, USA)를 이용하여 LDH를 정량화하였는데, LDH는 배양된 신경줄기세포로부터 분비된 것이다. 세포 생존도는 ELISA 플레이트 리더(ELISA plate reader)에서 490 nm로 분석하였고, 표준 파장은 690 nm였다. 모든 측정 결과는 셀 배양물이 없는 플레이트와 비교하여 OD(optical density) 값을 정규분포화(normalize)하였다.
아폽토틱 세포(Apoptotic cell death)의 사멸은 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling, Roche Boehringer-Mannheim, IN, USA) 어세이 를 이용하여 측정하였다. 손상되지 않고, 압축되고, 단편화된 핵을 관찰하기 위하여, TUNEL 염색된 셀을 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma, Saint Louis, MO, USA; 100 μg/ml in PBS)을 20분 동안 대비염색(counterstained)하였고, PBS로 여러 번 세척하였다. 이후, Moviol 4-88 솔루션 (Calbiochem, Merck Biosciences, Darmstadt, Germany)을 이용하여 유리 슬라이드에 마운드(mound)하였다. TUNEL 염색법에 대한 적절한 여기 파장(excitation wavelengths ) 하에서 올림푸스의 형광 현미경으로 관찰하였다.
BrdU 어세이에서는 세포 증식을 측정하였다. 각기 다른 농도의 PEP 1과 함께 Aβ25-35 (아밀로이드 β 20-35 단편) 20 μM 에 48시간 동안 노출시켜준 신경줄기세포를 수집하였다. 그리고 상기 신경줄기세포를 BrdU-라벨 배지(10 μM BrdU)에서 5시간동안 인큐베이션하였다. 이후, BrdU Labeling and Detection Kit (Roche Boehringer-Mannheim, IN, USA)를 이용하여 세포 증식을 측정하였다. 세포 증식은 ELISA 플레이트 리더(ELISA plate reader)에서 370nm로 분석하였고, 표준 파장은 492nm였다. 모든 측정 결과는 셀 배양물이 없는 플레이트와 비교하여 OD(optical density) 값을 정규분포화(normalize)하였다
PEP 1이 과산화수소에 의한 PC12 세포의 사멸을 억제하는 효과는 500uM의 과산화수소와 함께 여러 농도의 PEP 1을 처리한 후, CCK-8 어세이를 통해 신경세포의 생존도가 분석되었으며, 분석 결과 생존도 증가는 확인 되지 않았다 (도 2 참조).
실험예 1-4. 과산화수소에 의해 손상된 신경줄기세포에서 PEP 1의 신경 독성평가
상기 실험예 1-3를 바탕으로, 신경줄기 세포에서도 PC12세포와 동일한 결과가 나오는 확인하기 위해 세포를 바꾼 것을 제외하고는 동일한 방법으로 신경 독성 평가를 실시하였다.
상기한 바와 같이 CCK-8과 MTT 어세이로부터 과산화수소의 농도를 200uM로 선정하고(도 3 참조), PEP 1이 과산화수소에 의한 신경줄기세포 사멸을 억제하는지 확인하기 위해 200uM 과산화수소와 여러 농도의 PEP 1을 처리한 후 CCK-8과 MTT 어세이를 시행하여 세포 생존도를 확인한 결과, 1uM PEP 1의 농도부터 증가하기 시작해 농도 의존적으로 세포생존도의 증가를 확인하였다. (도 4A 참조) 다른 방법으로 세포의 사멸 정도를 평가하는 LDH 어세이를 시행하였으며, 그 결과 과산화수소에 의해 증가되었던 세포사멸이 PEP 1에 의해 효과적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 1μM 농도에서부터 효과가 나타났다. (도 4B 참조)
산화성 손상에 의해 감소되었던 세포증식률이 함께 처리한 PEP 1에 의해 어떻게 변화되는지 BrdU 어세이를 통해 확인 하였고, 그 결과는 과산화수소 처리에 의하여 감소되었던 세포 증식률이 PEP 1의 처리에 의해 회복됨을 확인하였다. (도 5 참조)
이러한 세포생존도의 증가가 세포독성과 관련이 되어있는지 확인하기 위해 TUNEL 염색으로 확인해 본 결과 200uM 과산화수소에 의해 증가되었던 세포독성이 PEP 1의 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인했다. (도 6 참조)
실험예 1-5. PEP 1의 신경세포 이동성 평가
신경줄기세포의 특성상 세포 이동성은 매우 중요한 부분이다. 과산화수소 및 PEP 1을 다양한 조건으로 처리한 후 이동(Migration) 어세이를 시행하여 세포이동성의 변화를 측정하였다. 세포이동성에 대한 실험결과는 과산화수소에 의해 감소된 세포이동이 PEP 1 처리에 의해 회복되었고, 10μM 농도의 경우, 비교군 대비 더 증가된 이동성을 확인하였으며, 이후 임상실험에서 성체줄기세포 이식 전에 전처리 될 경우, 더욱 효과적인 결과가 있을 수 있음을 보여주었다. (도 7 참조)
실험예 1-6. PEP 1의 항산화효과 평가
산화스트레스에 의해 증가된 활성산소를 DCF-DA 염색시료 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)를 이용하여 과산화수소와 PEP 1 처리 후 발생 변화를 관찰하였다. 200μM의 과산화수소에 의해 활성산소가 증가하고 PEP 1와 함께 처리한 군에서는 늘어났던 활성산소가 감소함을 확인하였다. (도 8 참조)
실험예 1-7. 과산화수소에 의한 손상을 억제하는 PEP 1의 신경보호기전 확인을 위해 PI3K 경로 관련 단백질의 발현량 변화 확인
보다 자세한 작용기전을 확인하기 위해, 단백질분석(프로테오믹스)을 진행한 결과 과산화수소만 처리한 군과 비교할 때 PEP 1을 함께 처리한 군에서 TCA 사이클(cycle), 세포이동, GPCR 신호전달경로에 관련된 단백질들의 발현량의 조절이 현저하게 긍정적인 방향으로 변하여 신경보호효과를 나타냄을 확인하였다. (도 9 참조)
상기 단백질 분석(프로테오믹스) 방법은 다음과 같다.
단백질 샘플 준비
배양된 신경줄기세포 펠렛(pellets)을 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 샘플 용해 용액(sample lysis solution, 7M urea, 2M Thiourea containing 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS), 1%(w/v) dithiothreitol (DTT), 2%(v/v) pharmalyte, and 1mM benzamidine 로 구성됨) 내에서 10초 동안 초음파 처리하였다(Sonoplus (Bandelin electronic, Germany) 이용).
단백질은 1시간 동안 상온에서 보텍싱(vortexing)하여 추출하였다. 15,000xg , 15℃, 1 시간의 조건으로 원심분리 한 후, 용해되지 않는 성분은 제거하고, 용해된 분획만을 2차원 겔 전기영동(2D PAGE, 2-dimensional gel electrophoresis)에 이용하였다. 단백질 농도는 Bradford법에 의하여 분석할 수 있다.
2D PAGE
IPG 건조 스트립(IPG dry strips, 4-10 NL IPG, 24cm, Genomine, Korea)을 12-16시간 동안 7M 우레아(urea), 2M 티오우레아(thiourea)로서 2% CHAPS (3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate), 1% DTT(dithiothreitol), 및 1% pharmalyte를 함유하는 용매로 평형 시키고(equilibrated), 각 샘플 200μg을 로딩하였다. IEF(Isoelectric focusing)은 20℃ 조건에서 Multiphor II 전기영동 유닛 및 EPS 3500 XL 전원공급장치 (Amersham Biosciences) 를 이용하여 수행하였다. IEF를 위하여, 샘플을 넣어주면서 전압은 3시간에 걸쳐 150 에서 3,500V까지 직선적으로 증가시켰고, 3,500V로 일정하게 유지시켜주었다. 96kVh가 넘으면 종료하도록 하였다. 2차원 전기영동 실시 전, 스트립들을 평형 버퍼(50mM Tris-Cl, pH6.8 , 6M 우레아, 2% SDS 및 30% 글리세롤 함유) 에서 10분간 인큐베이션하였다. 첫번째는 1% DTT와, 두번째는 2.5% 아이오도아세트아미트(iodoacetamide)와 함께 실시하였다. 평형화된 스트립들은 SDS-PAGE 겔 (20 x 24cm, 10-16%)에 주입하였고, SDS-PAGE를 Hoefer DALT 2D system (Amersham Biosciences)를 이용하여 실시하였다. 2D 겔은 20℃에서 1,700Vh 로 작동시켰다.
이미지 분석(Image analysis)
이미지의 정량분석은 PDQuest (version 7.0, BioRad) 소프트웨어를 이용하여 실시하였다. 각 스팟(spot)은 총 유효 스팟 강도(total valid spot intensity)에 의해 정규분포화(normalize) 시켰다.
PMF(Peptide Mass Fingerprinting)
대량의 단백질 핑거프린팅(fingerprinting)을 통한 단백질 식별을 위해서 단백질 스팟을 트립신을 이용하여 자르고, 소화시킨 후 (Promega, Madison, WI), CHCA(α cyano-4-hydroxycinnamic acid)을 50% 아세토니트릴/0.1% TFA와 혼합하였고, MALDI-TOF 분석 (Microflex LRF 20, BrukerDaltonics)을 Fernandes J et al이 기술한 바와 같이 시행하였다. 스펙트럼은 300샷/스펙트럼으로 m/z 범위 600-3000이내에서 수집하였, 트립신 자동 소화 피크 (m/z 842.5099.2211.1046)을 이용한 two point internal calibration을 통해서 구경 측정 하였다. 피크 목록은 Flex 분석 3.0을 사용하여 생성 하였다. Peak-picking에 사용 된 임계 값은 다음과 같다: monoisotopic mass의 최소 해상도는 500, S/N에는 5. Matrixscience가 개발한 검색프로그램인 MASCOT(http://www.matrixscience.com/)를 대량의 단백질 핑거프린팅을 통한 단백질 식별에 사용하였다. 다음 매개 변수는 데이터베이스 검색에 사용된 입력 인자 값이다: 절단 효소로는 트립신, 미절단은 1개로 최대치(a maximum of one missed cleavage), 완전 수식화(complete modification)에는 아이오도아세트아미드(Cys), 부분 수식화(partial modification)에는 산화(Met), 단일동위원소 질량(monoisotopic masses), 그리고 질량 오차 ± 0.1 Da. PMF 수용 기준으로는 확률 평점법(probability scoring)을 사용하였다.
항체 마이크로어레이
항체 마이크로어레이는 Panorama Antibody Microarray-Cell Signaling kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 수행하였. 간단히, 1.5 × 107 개의 세포들을 100mm 접시에 놓고, 이 세포들은 20 μM Aβ25-35 (베타 아밀로이드 25-35)와 10 μM PEP 1과 함께 48시간 동안 처리하였다.
수집된 세포들과 단백질 샘플들은 제조업체의 프로토콜에 따라 준비하였다. 이 단백질 샘플들에는 Cy3 또는 Cy5 (Amersham Biosciences, UK)의 라벨을 붙이고, 항체 마이크로어레이 (Sigma-Aldrich) 분석의 대상이 하였다. 어레이(array) 슬라이드들은 GenePix Personal 4100A 스캐너 (Molecular Devices)를 통해 스캔하였고, 데이터는 GenePix Pro 5.0 (Molecular Devices)를 통해 분석하였다.
웨스턴 블랏(Western blot) 분석
Ki67, PI3K(p85α phosphatidylinositol 3-kinase), pAkt (phosphorylated Akt, Ser473), GSK-3β (phosphorylated glycogen synthase kinase-3β, Ser9), HSTF)-1(heat shock transcription factor-1), Bcl-2(B cell lymphoma-2), HMGB-1(cytoplasmic high-mobility group protein 1), Bax, 시토졸 시토크롬 c(cytosolic cytochrome c) 및 절단된 caspase-3 (Asp175)의 수치는 웨스턴 블랏을 통하여 분석하였다. 여러 가지 세포 내 신호의 웨스턴 블랏t은 48시간의 처리가 끝나는 즉시 수행하였다. 간단히, 5 X 106개의 세포들을 차가운 PBS에 두 번 세척하였고, 30분 동안 얼음 위에서 세포 용해 버퍼([50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.02% sodium azide, 0.2% SDS, 100 μg/ml phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF), 50 μl/ml aprotinin, 1% Igepal 630, 100 mM NaF, 0.5% sodium deoxy choate, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA]를 사용하여 배양 하였으며, 손상되지 않은 세포들과 핵들은 10분간의 2000 x g 원심 분리에 의해 뭉쳐졌으며, 라이세이트(lysates)는 10,000 x g에 의해 제거하였다. HMGB-1 세포질과 시토졸 시토크롬c 레벨을 평가하기 위하여 제조업체의 지시에 따라 미토콘드리아와 시토졸 분획을 Mitochondra/Cytosol Fractionation Kit (Abcam, UK)를 이용하여 격리시켰다. 간단히, 20 μM Aβ25-35를 48시간 동안 PEP 1을 여러 농도로 처리 한 후에, 신경줄기세포를 수집하였고, 얼음처럼 차가운 PBS로 한번 세척하였으며, DTT (dithiothreitol)와 단백 분해 효소 억제제를 함유하는 1.0 mL 의 1× 시토졸 추출 버퍼(cytosol extraction buffer)와 함께 다시 섞었다. 얼음과 위에서 10분간 배양한 후, 세포 현탁액은 30에서 50시간 동안 주사기로 균질화하였다. 샘플은 10분 동안 4℃ 에서 3,000rpm으로 원심 분리시켰다. 상청액(supernatants)은 다시 미토콘드리아 분획 (펠릿)과 시토졸 분획(상청액)을 분류하기 위해 13,000rpm으로 30분간 원심 분리하였다. 미토콘드리아 펠렛은 격리용 버퍼(isolation buffer)로 한 번 세척 한 후 DTT와 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 미토콘드리아 추줄 버퍼에 용해시켰다. 단백질과 동등한 양(20 μg)을 포함하는 샘플은 10% SDS-PAGE (sodium docecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분해하고, 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membranes, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 상기 니트로셀룰로스 막은 5% 탈지 우유로 차단시킨 후, 특정 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 사용된 항체들은 anti-Ki67 (1:200, Abcam, UK), anti-p85α PI3K (1:1000, Millipore), anti-pAkt (Ser473) (1:500, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), anti-pGSK-3β (Ser9) (1:1000, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA), anti-HSTF-1 (H-311) (1:1000, Santa Cruz, CA, USA), anti-Bcl-2 (1:1000, Cell Signaling), anti-HMGB-1 (1:500, Cell Signaling), anti-BAX (1:1000, Cell Signaling), anti-cytochrome c (1:200, Cell Signaling), and anti-cleaved caspase-3 (Asp 175) (1:1000, Cell signaling, Beverly, MA, USA)이다. 막은 0.05% Tween-20 (TBST)를 함유하는 Tris-버퍼 식염수로 세척하고, ECL 검출(Amersham Pharmacia Biotech)후, HRP-conjugated anti-rabbit 항체나 anti-mouse 항체(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 처리하였다 블랏은 이미지 분석기 (GE Healthcare, ImageQuant LAS 4000)로 정량 하였다.
상기 분석 결과를 바탕으로, 신경세포의 성장 및 생존에 있어 결정적인 역할을 하는 Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) / AKT 신호전달경로에 대한 PEP 1의 영향을 확인하였다. PI3K 신호전달 경로는 다양한 성장인자 및 조절인자에 의해 활성화되며 신경세포 성장 및 생존의 정상적인 조절에 관여한다. AKT 신호전달경로는 여러 proapoptotic factor를 비활성화하며 이미 잘 알려진 대표적 세포사멸 신호인 GSK3β을 억제시킨다.
따라서 본 실험예 1-7에서 상기 PI3K 경로에 대한 과산화수소 및 PEP 1의 효과를 확인하기 위해 웨스턴블랏을 진행하였고, PEP 1의 처리는 과산화수소 단독 처리에 비하여 세포생존신호인 Ki67, pAKT, PI3K, HSTF-1, Bcl-2를 증가시켰고 세포사멸 신호인 caspase-3, cytochrome-c, Bax와 염증반응신호인 COX-2의 감소를 확인하였다. (도 10 참조)
실험예 1-8. 신경줄기 세포와 뇌피질 신경세포(Cortical neuron)에서 PEP 1 신경보호 효과 비교
신경줄기세포에서 얻어진 PEP 1의 긍정적인 효과들을 근거로 다른 신경세포에서도 효과가 동일하게 나타나는지 확인하고자 하였다. 신경줄기세포와 일차 배양된 뇌피질 신경세포에 과산화수소와 PEP 1을 처리하고 그 결과를 비교하였다.
신경줄기세포와 비슷하게 뇌피질 신경세포에서도 농도 의존적으로 생존도가 증가하는 모습을 확인하였다. 상기 두 세포에서, PEP 1은 신경세포 사멸을 억제하는 효과가 있는 것으로 확인 되었다.(도 11 참조)
실시예 2: 펩티드의 활성산소종 생성 억제여부 측정
실험예 2-1. 세포내 활성 산소종((Reactive Oxygen Species )측정방법
DCF-DA 방법을 사용하여 세포주의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성이 억제되는지를 측정하였다.
사람 T 림프구 세포주인 Jurkat 세포(Jurkat, Clone E6-1 (ATCC® TIB-152™)를 96 웰 플레이트에 1x105 세포를 주입 한 후 1uM 농도의 펩티드와 항산화제인 NAC (N-acetyl-cysteine)을 2mM 농도로 1시간 동안 처리한 후 배지를 제거하고 PBS 로 두, 세 번 씻어낸 후 DCF-DA((Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) 25mM 을 37℃에서 반응 시킨다. 30분 후, 4mM H2O2 로 ROS 를 30분 동안 유도한다. 100ul ROS lysis buffer (2.5mM KH2PO4, 0.1M EDTA, 0.1% Triton X-100) 로 중화하여 Infinte M200 Tecan (Tecan Trading AG, Switzerland) 분석기를 이용하여 485 nm (emission) / 535 nm (exitation)에서 ROS생성 여부를 측정하였다.
실험예 2-2. 펩티드에 의한 사람 T 림프구 세포주의 세포 내 활성산소종 (Reactive Oxygen Species) 에 발생에 미치는 영향
펩티드들의 항산화 작용에 미치는 영향을 알아보고자, 상기 실험예 2-1과 같은 방법을 사용하여 펩티드를 처리한 세포에 H2O2 를 처리하여 ROS 를 유도하여 세포 내 활성산소종을 측정하였다.
그 결과, PEP 1 이 H2O2 로 처리한 세포에 비해 약 40% 정도 ROS 유도를 억제하는 것으로 관찰되며, 반면 항산화제인 NAC 은 약 30% 정도 억제되는 것으로 관찰되었다. 이에, PEP 1 을 기준으로 RIA 시리즈 펩티드들의 ROS에 대한 항산화 효과를 측정하여 스크리닝 한 결과, ROS 활성을 억제하는 펩티드들을 선별할 수 있었다.
상기 ROS 측정 결과, 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 49, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 85, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 94, 서열번호 101, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113, 서열번호 119, 서열번호 120, 서열번호 121, 서열번호 125, 서열번호 126, 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 142, 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 147, 서열번호 148, 서열번호 149, 서열번호 154, 서열번호 155, 서열번호 156, 서열번호 164, 서열번호 165, 서열번호 166, 서열번호 167, 서열번호 168, 서열번호 169, 서열번호 171, 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174, 서열번호 175, 서열번호 176, 서열번호 177, 서열번호 178, 서열번호 179, 서열번호 180, 서열번호 182, 서열번호 186, 서열번호 189, 서열번호 192, 서열번호 197, 서열번호 200, 서열번호 205, 서열번호 207, 서열번호 210, 서열번호 240, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 284, 서열번호 286, 서열번호 288, 서열번호 289, 서열번호 290, 서열번호 291, 서열번호 293, 서열번호 294, 서열번호 295, 서열번호 296, 서열번호 310, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 330, 서열번호 337이 H2O2에 의해 자극된 세포의 ROS를 낮추어주는 효과가 있는 것으로 확인되었다.
또한 잘 알려진 항산화제인 NAC를 대조군으로 사용하여 비교하여 본 결과, 서열번호 1, 서열번호 8, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 132, 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137, 서열번호 141, 서열번호 142, 서열번호 143, 서열번호 144, 서열번호 145, 서열번호 146, 서열번호 147, 서열번호 180, 서열번호 186, 서열번호 189, 서열번호 192, 서열번호 197, 서열번호 200, 서열번호 205, 서열번호 207, 서열번호 210, 서열번호 272, 서열번호 273, 서열번호 284, 서열번호 286, 서열번호 295, 서열번호 310, 서열번호 323, 서열번호 327, 서열번호 337이 NAC보다 ROS를 낮추어주는 효과가 우수한 것으로 확인되어, 효과가 우수한 항산화제로서 사용 가능할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> KAEL-GemVax Co., Ltd. KIM, Sang Jae <120> Peptides having Antioxidizing Activity and Composition comprising the same <130> OF14P198PCT <150> KR10-2013-0153043 <151> 2013-12-10 <150> KR10-2013-0153038 <151> 2013-12-10 <160> 341 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 1 5 10 15 Lys <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 15 Pro Lys <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5 10 15 Ile Pro Lys <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Phe Ile Pro Lys 20 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Arg Phe Ile Pro Lys 20 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 <210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu 1 5 10 15 Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 25 <210> 11 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 25 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala 1 5 10 15 Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 25 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro 1 5 10 15 Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 25 <210> 14 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg 1 5 10 15 Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 25 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala 1 5 10 15 Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 20 25 30 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 1 5 10 15 Lys Pro <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro Asp 20 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 1 5 10 15 Lys Pro Asp <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5 10 15 Ile Pro Lys Pro 20 <210> 21 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5 10 15 Ile Pro Lys Pro Asp 20 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5 10 15 Ile Pro Lys Pro Asp Gly 20 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro Asp Gly 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 1 5 10 15 Lys Pro Asp Gly 20 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Phe Ile Pro Lys Pro 20 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Phe Ile Pro Lys Pro Asp 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly 20 <210> 28 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5 10 15 Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu 20 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro Asp Gly Leu 20 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 1 5 10 15 Lys Pro Asp Gly Leu 20 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Arg Phe Ile Pro Lys Pro 20 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp 20 <210> 34 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly 20 <210> 35 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu 20 25 <210> 36 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg 20 25 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg 20 25 <210> 38 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5 10 15 Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg 20 <210> 39 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg 20 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 1 5 10 15 Lys Pro Asp Gly Leu Arg 20 <210> 41 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro 20 <210> 42 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp 20 <210> 43 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly 20 25 <210> 44 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu 20 25 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg 20 25 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 25 <210> 47 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu 1 5 10 15 Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 25 <210> 48 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg 1 5 10 15 Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 25 <210> 49 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe 1 5 10 15 Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 25 <210> 50 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 1 5 10 15 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro 1 5 10 15 Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 <210> 52 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro 20 <210> 53 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp 20 25 <210> 54 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly 20 25 <210> 55 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu 20 25 <210> 56 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg 20 25 <210> 57 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro 20 25 <210> 58 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ala Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser 1 5 10 15 Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile 20 25 30 <210> 59 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Glu Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Phe Ile Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile 20 25 <210> 60 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Val Arg Gln His Arg Glu Ala Arg Pro 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Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val 1 5 10 15 Leu Gln Leu Pro 20 <210> 278 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 278 Phe His Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile 1 5 10 15 Ser Asp Thr Ala 20 <210> 279 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 279 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1 5 10 15 Gly Ala Lys Gly 20 <210> 280 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 280 Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu 20 <210> 281 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 281 Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu 1 5 10 15 Arg Thr Ala Gln 20 <210> 282 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 282 Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asn 20 <210> 283 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 283 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1 5 10 <210> 284 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 284 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val 1 5 10 <210> 285 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285 Arg Ser Leu Leu Arg Ser His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr 1 5 10 15 Phe Val Arg Arg 20 <210> 286 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286 Leu Gly Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala 1 5 10 15 Phe Arg Ala Leu 20 <210> 287 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 287 Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro Pro Pro 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ser 20 <210> 288 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 288 Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu Val Ala Arg Val Leu Gln 1 5 10 15 Arg Leu Cys Glu 20 <210> 289 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 289 Arg Gly Ala Lys Asn Val Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly 1 5 10 15 Ala Arg Gly Gly 20 <210> 290 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 290 Pro Pro Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr 1 5 10 15 Val Thr Asp Ala 20 <210> 291 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 291 Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val Gly Asp 1 5 10 15 Asp Val Leu Val 20 <210> 292 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 292 His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val Leu Val Ala Pro Ser Cys 1 5 10 15 Ala Tyr Gln Val 20 <210> 293 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 293 Cys Gly Pro Pro Leu Tyr Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro 1 5 10 15 Pro Pro His Ala 20 <210> 294 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 294 Ser Gly Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser 1 5 10 15 Val Arg Glu Ala 20 <210> 295 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 295 Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Ser Arg 20 <210> 296 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 296 Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Pro Glu Pro 1 5 10 15 Glu Arg Thr Pro 20 <210> 297 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 297 Val Gly Gln Gly Ser Trp Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser 1 5 10 15 Asp Arg Gly Phe 20 <210> 298 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 298 Cys Val Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ser 20 <210> 299 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 299 Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His Ala Gly 1 5 10 15 Pro Pro Ser Thr 20 <210> 300 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 300 Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro Cys Pro Pro Val Tyr Ala 1 5 10 15 Glu Thr Lys His 20 <210> 301 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 301 Phe Leu Tyr Ser Ser Gly Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu 20 <210> 302 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 302 Arg Pro Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu 1 5 10 15 Gly Ser Arg Pro 20 <210> 303 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 303 Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln Arg Tyr 1 5 10 15 Trp Gln Met Arg 20 <210> 304 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 304 Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His Ala Gln Cys Pro Tyr Gly 1 5 10 15 Val Leu Leu Lys 20 <210> 305 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 305 Thr His Cys Pro Leu Arg Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys 1 5 10 15 Ala Arg Glu Lys 20 <210> 306 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306 Pro Gln Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg 1 5 10 15 Arg Leu Val Gln 20 <210> 307 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307 Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe Val Arg 1 5 10 15 Ala Cys Leu Arg 20 <210> 308 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 308 Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser Arg His Asn Glu Arg Arg 1 5 10 15 Phe Leu Arg Asn 20 <210> 309 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Thr Lys Lys Phe Ile Ser Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln 1 5 10 15 Glu Leu Thr Trp 20 <210> 310 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Lys Met Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val 1 5 10 15 Gly Cys Val Pro 20 <210> 311 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311 Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe Leu His 1 5 10 15 Trp Leu Met Ser 20 <210> 312 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe Phe Tyr Val Thr Glu Thr 1 5 10 15 Thr Phe Gln Lys 20 <210> 313 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Asn Arg Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gly Ile Arg 20 <210> 314 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Gln His Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val 1 5 10 15 Arg Gln His Arg 20 <210> 315 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15 Pro Asp Gly Leu 20 <210> 316 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 316 Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val Gly Ala Arg Thr Phe Arg 1 5 10 15 Arg Glu Lys Arg 20 <210> 317 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317 Ala Glu Arg Leu Thr Ser Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn 1 5 10 15 Tyr Glu Arg Ala 20 <210> 318 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318 Arg Arg Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile 1 5 10 15 His Arg Ala Trp 20 <210> 319 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro Glu Leu 1 5 10 15 Tyr Phe Val Lys 20 <210> 320 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile Pro Gln Asp Arg Leu Thr 1 5 10 15 Glu Val Ile Ala 20 <210> 321 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 Ser Ile Ile Lys Pro Gln Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val 1 5 10 15 Val Gln Lys Ala 20 <210> 322 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 Ala His Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu 1 5 10 15 Thr Asp Leu Gln 20 <210> 323 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser Pro Leu 1 5 10 15 Arg Asp Ala Val 20 <210> 324 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 324 Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu Ala Ser Ser Gly Leu Phe 1 5 10 15 Asp Val Phe Leu 20 <210> 325 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 325 Arg Phe Met Cys His His Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val 1 5 10 15 Gln Cys Gln Gly 20 <210> 326 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 326 Ile Pro Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr 1 5 10 15 Gly Asp Met Glu 20 <210> 327 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu Arg Leu 1 5 10 15 Val Asp Asp Phe 20 <210> 328 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala Lys Thr Phe Leu Arg Thr 1 5 10 15 Leu Val Arg Gly 20 <210> 329 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Val Pro Glu Tyr Gly Cys Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn 1 5 10 15 Phe Pro Val Glu 20 <210> 330 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 330 Asp Glu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly 1 5 10 15 Leu Phe Pro Trp 20 <210> 331 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 331 Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Ala 20 <210> 332 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 332 Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg Gly Phe Lys Ala 1 5 10 15 Gly Arg Asn Met 20 <210> 333 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 333 Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe 1 5 10 15 Leu Asp Leu Gln 20 <210> 334 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 334 Val Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gln Ala Tyr 20 <210> 335 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 335 Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val Trp 1 5 10 15 Lys Asn Pro Thr 20 <210> 336 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 336 Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Leu Lys Ala Lys 20 <210> 337 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 337 Asn Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Ala Val 20 <210> 338 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 338 Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg 1 5 10 15 Val Thr Tyr Val 20 <210> 339 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339 Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr 20 <210> 340 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340 Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp 1 5 10 15 Phe Lys Thr Ile Leu Asp 20 <210> 341 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 341 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130

Claims (6)

  1. 항산화 활성을 갖는 펩티드로서,
    서열번호 286, 서열번호 295, 및 서열번호 337로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  2. 항산화 활성을 갖는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서,
    서열번호 286, 서열번호 295, 및 서열번호 337로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 산화 또는 노화를 억제하기 위한 조성물로서, 서열번호 286, 서열번호 295, 및 서열번호 337로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항산화 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화방지를 위한 화장품 조성물인 항산화 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백용 화장품 조성물인 항산화 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 인체내 세포 노화 및 세포 산화를 방지 또는 억제하기 위한 건강증진용 식품 조성물인 항산화 조성물.

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Cross, C.E. et al. Ann. Intern. Med. 1987, 107:526-45; Adelman, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85(8): 2706-8,
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