KR20230023463A - 두경부암의 예후 예측을 위한 암 관련 섬유아세포의 바이오마커 - Google Patents

두경부암의 예후 예측을 위한 암 관련 섬유아세포의 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 두경부암의 예후 예측을 위한 정보제공방법 및 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로, 콜라겐 유전자 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 발현이 증가한 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts)의 경우, 암을 촉진하는 것으로 알려진 통상의 CAF와 달리 오히려 암 세포의 침윤 및 성장을 억제한다는 것을 발견하여 완성된 것이다. 나아가, CAF에서 상기 콜라겐 유전자의 발현이 억제되면 CAF에 의한 암 침윤 촉진 효과가 증가하며, 상기 콜라겐 유전자들의 발현 수준 및 두경부암 환자의 예후간에 강력한 상관관계가 있다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 CAF의 콜라겐 유전자 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1를 활용하여 두경부암의 예후를 높은 정확도로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포의 침윤 및 전이를 억제하여 두경부암을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

두경부암의 예후 예측을 위한 암 관련 섬유아세포의 바이오마커 {Biomarkers in cancer associated fibroblasts for predicting prognosis of head and neck cancer}
본 발명은 두경부암의 예후를 예측하기 위한 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts, CAFs)의 바이오마커 등에 관한 것이다.
최근 종양 미세환경 (tumor microenvironment)에 대한 다양한 구조적, 기능적 연구는, 종양 미세환경이 신생 세포 (neoplastic cell)의 종양 형성 (tumorigenesis), 진행, 및 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 규명하였다. 종양 미세환경의 주요 세포 구성요소 중 하나인 섬유아세포 (fibroblasts)는 본래 조직 항상성 및 상처 치유에 필수적인 세포로 알려져 있으며, 종양 조직에 존재하는 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts, CAFs)가 종양 형성 과정에서 핵심 역할을 한다는 것이 보고되고 있다. CAF는 세포외기질 (extracellular matrix) 및 발암성 신호경로 (oncogenic signal)를 변형할 수 있는 성장 인자 (growth factor) 및 캐모카인 (chemokines)을 분비하므로 암세포의 증식과 침윤 (invasion)을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일반적으로 종양 세포와 함께 CAF를 공동-주입하는 경우 암의 진행이 더욱 촉진된다고 알려져 있으며, 정상 조직의 섬유아세포는 암세포의 성장을 억제한다고 알려져 있다. 그러나, 섬유아세포는 세포 유형에 따라 기능이 이질적이므로, 주변 세포에 미치는 효과 또한 달라질 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 종양 조직에 인접한 섬유아세포, 또는 CAF가 암 진행을 억제할 수 있다는 사실은 아직까지 알려진 바 없다.
세포외기질 (extracellular matrix, ECM)은 세포 및 조직을 연결하는 물리적 스캐폴드 (scaffold)로서, 섬유 단백질 (protein fiber), 및 콜라겐 (collagen)과 같은 ECM 내의 단백질들이 세포 및 조직의 정상적인 기능 유지에 기여한다고 알려져 있다. ECM에서 가장 풍부한 단백질인 콜라겐은 인간의 전체 단백질 중 1/3을 차지한다. ECM의 구조적 특징에 따라 콜라겐은 다양한 하위 유형으로 분류되나, 콜라겐 아형 각각의 암 진행에 대한 효과에 대해서는 정확히 연구된 바가 없다.
두경부암 (head and neck cancer)은 뇌 및 안구의 종양을 제외하고, 쇄골 상부 및 인두 이하 (구강, 인두, 후두, 기관 및 식도, 부비동, 침샘, 안면골과 연부 조직 및 갑상선 등)에서 발생하는 암을 의미한다. 2015년을 기준으로 전체 암환자 중 두경부암 환자가 차지하는 비율은 2.1%이며, 매년 증가세를 보이고 있다. 두경부암은 조기 (1기)에 발견할 경우 완치율이 약 90%에 달할 정도로 높지만, 늦게 발견할수록 완치율이 현저히 떨어지므로, 조기 발견이 중요하다. 또한 두경부암은 구체적인 유형이나 림프절 전이 여부 등에 따라 예후가 극히 달라지는 것으로 알려져 있다. 실제로 원발성 암이 완치되었더라도 경부 림프절에서 암이 재발하는 경우가 있으며, 원격 전이암의 발생율도 높은 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 두경부암 예후를 정확히 예측할 수 있는 방법은 미비한 실정이다.
대한민국 등록특허공보 제10-1198526호
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로서, 암 관련 섬유아세포의 콜라겐 유전자들의 발현량 확인을 통해 두경부암의 예후를 높은 정확도로 예측하는 방법 등을 제공하고, 암세포의 전이를 억제하여 두경부암을 효과적으로 치료할 수 있는 약학적 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 구체적으로 두경부암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 두경부암 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 두경부암의 예후 예측용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 두경부암의 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서,
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는지 확인하는 단계를 포함하고,
상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우 두경부암의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조직은 종양 기질 (tumor stroma)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblast)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 대조군은 정상인 또는 비전이성 두경부암 환자로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 수준은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 두경부암 치료 물질의 스크리닝 방법으로서,
(S1) 두경부암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
(S2) 상기 시험물질을 처리한 시료와 처리하지 않은 대조군 시료에서 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준; 또는 콜라겐 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(S3) 대조군 시료와 비교해 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준; 또는 콜라겐 단백질의 활성 정도를 증가시킨 시험물질을 두경부암 치료 물질로 선별하는 단계를 포함하고,
상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 두경부암의 예후 예측용 조성물로서, 상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 예후 예측용 조성물을 포함하는, 두경부암의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 하기 두경부암의 예후 예측 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우, 두경부암의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 단계.
또한, 본 발명은 콜라겐 단백질, 상기 단백질의 활성화제, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 콜라겐 단백질은 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
상기 COL3A1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함;
상기 COL6A6 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함함;
상기 COL25A1 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함함; 또는
상기 COL26A1 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함함.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 두경부암의 전이를 억제하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 두경부암 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 두경부암 전이 예방 또는 억제 방법일 수 있다.
또한, 본 발명은 두경부암 치료용 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명 두경부암 전이 억제용 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 두경부암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다. 상기 용도는 두경부암의 전이 억제 용도를 포함한다.
본 발명은 두경부암 (head and neck cancer)의 예후 예측을 위한 정보제공방법 및 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로, 콜라겐 유전자 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 발현이 증가한 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts)는 암을 촉진하는 것으로 알려진 통상의 CAF와 달리 오히려 암 세포의 침윤 및 성장을 억제한다는 것을 발견하여 완성된 것이다. 나아가, CAF에서 상기 콜라겐 유전자의 발현이 억제되면 CAF에 의한 암 침윤 촉진 효과가 증가되고, 상기 콜라겐 유전자들의 발현 수준 및 두경부암 환자의 예후간에 강력한 상관관계가 있다는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 CAF의 콜라겐 유전자 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1를 활용하여 두경부암의 예후를 높은 정확도로 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포의 침윤 및 전이를 억제하여 두경부암을 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 및 도 1b는 두경부암 환자의 종양 조직에서 CAF-P (도 1a) 또는 CAF-D (도 1b)에 대한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸다. 상단은 H&E 염색을 통해 CAF (적색 화살표)를 포함한 암 기질 (cancer stroma)을 나타낸 사진이며, 하단은 암 상피세포 및 CAF를 각각 확인하기 위해 pan-사이토케라틴 (Pan-CK) 및 α-SMA 염색을 동시에 수행한 결과를 나타낸 사진이다. 상피 암 (epithelial cancer) 및 인접한 기질 사이의 경계는 적색선으로 표시했다.
도 2a 및 도 2b는 두경부암 환자의 조직으로부터 배양된 일차 섬유아세포의 면역세포화학 분석 결과를 나타낸다 (도 2a: CAF-P 분석 결과; 도 2b: CAF-D 분석 결과). 3회 계대된 섬유아세포를 동일한 수로 커버 슬라이드가 있는 6-웰 플레이트에 씨딩 (seeding)한 후 섬유아세포 특이적 항체 (α-SMA), 상피세포 특이적 항체 (pan-CK), 및 내피세포 특이적 항체 (CD31)로 면역염색하였다 (흰색 스케일 바=200μM).
도 3은 일차 섬유아세포의 면역염색 후 그룹별 α-SMA 발현 수준을 비교하기 위해 이미지 분석을 통해 α-SMA 형광을 정량화한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 두경부암 세포 (도 4a: FaDU 세포; 도 4b: YD-10B 세포)의 2D 마트리젤 침윤 능력에 대한 CAF-P 및 CAF-D의 영향을 확인한 결과를 나타낸다 (5배 배율).
도 5는 FaDu 스페로이드의 3D 마트리젤 침윤 능력에 대한 CAF-유래 CM의 효과를 확인하기 위한 실험을 나타낸 그림이다. 96-well U-bottom Ultra-Low Attachment plate에서 스페로이드를 형성한 후, CM 및 마트리젤을 첨가하였다.
도 6a는 CAF-P 유래 CM에서 스페로이드 (직경 400 μm)의 마트리젤 침윤 정도를 위상차 현미경으로 14일간 관찰한 결과를 나타낸다 (5배 확대).
도 6b는 CAF-P 유래 CM에서 각 스페로이드 표면으로부터 뻗어 나온 튜브형 구조물들의 평균 수를 측정함으로써 세포 침윤 정도를 정량화한 결과 및 Cell3iMager로 측정한 스페로이드 크기를 나타낸 것이다.
도 7a는 CAF-D 유래 CM에서 스페로이드 침윤 정도를 위상차 현미경으로 14일간 관찰한 결과를 나타낸다 (5배 확대).
도 7b는 CAF-D 유래 CM에서 각 스페로이드 표면으로부터 뻗어 나온 튜브형 구조물들의 평균 수를 측정함으로써 세포 침윤을 정량화한 결과를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 CAF-P 유래 CM (도 8a) 또는 CAF-D 유래 CM (도 8b)으로 공동-배양된 FaDu 스페로이드의 MMP mRNA 발현 수준을 qPCR로 측정한 결과를 나타낸다. 대표적인 EMT 마커들의 mRNA 발현을 동일한 조건에서 함께 측정하였다.
도 9는 CAF-P 및 CAF-D 섬유아세포에서 차등적으로 발현되는 유전자 리스트를 확인하기 위해 DNA 마이크로어레이 분석을 수행한 뒤, fold change > 1.75 및 p-값 < 0.05를 만족하는 차등적 발현 유전자를 선별하여 작성한 히트맵이다.
도 10은 CAF-P 및 CAF-D에서 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 발현을 히트맵으로 나타낸 것이다.
도 11은 CAF-P 및 CAF-D 그룹 섬유아세포에서 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 mRNA 발현을 qPCR로 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 CAF-P 및 CAF-D 그룹 섬유아세포에서 COL3A1, 및 COL6A6 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 CAF-P 및 CAF-D 그룹 섬유아세포의 COL3A1, 및 COL6A6 단백질의 상대적인 수준을 비교한 결과를 나타낸다.
도 14는 네 세트의 CAF-D 및 짝 NTF-D에서 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 mRNA 발현을 qPCR로 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 두경부암 환자의 CAF-P 또는 CAF-D 조직에서 COL3A1 및 COL6A6 단백질 수준을 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 마우스 뺨 아래 구강 점막에 FaDu 스페로이드를 CAF-P 또는 CAF-D와 공동-주입하여 이종이식 (xenograft)을 수행한 후, 이로부터 형성된 종양 조직을 촬영한 이미지를 나타낸다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정했다.
도 17은 이종이식 마우스 모델에서 형성된 종양이 FaDu 및 인간 섬유아세포로부터 유래한 것인지 확인하기 위해, 마우스의 종양 조직에 대해 Ku80 특이적 항체로 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸다.
도 18은 이종이식 마우스 모델에서 FaDu와 공동-주입된 섬유아세포 종류 (CAF-P 또는 CAF-D)에 따른 상대적인 콜라겐 유전자 발현 수준 (좌측) 및 MMP 유전자 발현 수준 (우측)을 비교한 결과를 나타낸다.
도 19는 본 발명의 실시예에서 사용한 siCOL3A1의 녹다운 효율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 20a는 COL3A1이 녹다운된 CAF-D 유래 CM에서 스페로이드 (직경 400 μm)의 마트리젤 침윤 정도를 위상차 현미경으로 14일간 관찰한 결과를 나타낸다 (5배 확대).
도 20b는 COL3A1이 녹다운된 CAF-D 유래 CM에서 각 스페로이드 표면으로부터 뻗어 나온 튜브형 구조물들의 평균 수를 측정함으로써 세포 침윤 정도를 정량화한 결과 및 Cell3iMager로 측정한 스페로이드 크기를 나타낸다.
도 21은 COL3A1이 녹다운된 CAF-D 유래 CM에서 배양된 FaDu 스페로이드의 MMP mRNA 발현 수준을 qPCR로 측정한 결과를 나타낸다.
도 22는 콜라겐 유전자 발현에 따른 두경부암 환자의 Kaplan-Meier 생존율 플롯이다.
본 발명은 두경부암의 예후 예측을 위한 정보제공방법 및 두경부암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것으로, 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblasts) 중 특정 콜라겐 유전자 (COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1)의 발현이 증가한 CAF (CAF-Defense, CAF-D)는 암세포의 침윤 및 성장을 억제하며, 따라서 상기 콜라겐 유전자들의 발현 수준과 두경부암 환자의 예후간에 상관관계가 있음을 확인하여 완성된 것이다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 CAF와 암 상피세포 (cancer epithelial cells) 사이의 경계의 특성을 비교하여, 암세포와의 경계가 뚜렷한 CAF 그룹 (CAF-Defense, CAF-D)과 암세포와 경계가 구분되지 않는 CAF 그룹 (CAF-Promote, CAF-P)으로 구별하였다 (실시예 1).
본 발명의 다른 실시예에서는, 두 유형의 CAF 그룹 (CAF-P, 및 CAF-D)의 특성을 확인한 결과, 두 그룹의 섬유아세포 모두 α-SMA를 강하게 발현하는 것을 확인하여, 두 CAF 그룹 모두 종양 기질 (tumor stroma)을 구성하고 있음을 확인하였다 (실시예 2).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CAF-P 및 CAF-D가 암 침윤 (invasion)에 미치는 영향을 확인하기 위해 두경부암 세포주의 2D 마트리젤 침윤 실험 및 두경부암 세포주 스페로이드의 3D 마트리젤 침윤 실험을 각각 진행한 결과, CAF-D (또는 CAF-D-유래 CM)와 공동-배양된 두경부암 세포 (또는 스페로이드)의 마트리젤 침윤 능력은 CAF-P (또는 CAF-P-유래 CM)과 공동-배양된 것에 비해 현저히 낮은 것을 관찰한 바, CAF-D는 암세포의 침윤 능력을 저해하는 특성이 있음을 확인하였다 (실시예 3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마이크로어레이 분석을 수행해 CAF-D 및 CAF-P의 유전자 발현 양상을 비교하였으며, 그 결과 CAF-D는 CAF-P에 비해 네 가지 콜라겐 유전자, COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 발현이 더 높은 것을 확인하였다 (실시예 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 두경부암 환자 조직에서 CAF-P 및 CAF-D의 유전자 발현을 비교한 결과, 마이크로어레이 분석 결과와 마찬가지로 CAF-P에 비해 CAF-D에서 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다 (실시예 5).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마우스 양 쪽 뺨 구강 점막에 FaDu 세포와 CAF-P (우측) 또는 CAF-D (좌측)을 공동-주입하여 이종이식 모델 (xenograft model)을 제작하고, 콜라겐 유전자 발현 수준 및 종양 성장 정도를 측정한 결과, CAF-D가 공동-주입된 FaDu-유래 종양은 CAF-P가 공동-주입된 FaDu-유래 종양에 비해 크기가 현저히 작고, COL3A1,　COL6A6,　COL25A1, 및　COL26A1의 mRNA 발현은 증가되어 있음을 확인하였다 (실시예 6).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, COL3A1 발현이 녹다운된 CAF-D가 두경부암 세포의 침윤 능력에 미치는 영향을 확인하기 위해 마트리젤 침윤 실험을 각각 진행한 결과, COL3A1의 발현이 녹다운된 CAF-D는 대조군에 비해 두경부암 세포의 침윤을 촉진하는 것을 확인하였다 (실시예 7).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, COL3A1,　COL6A6,　COL25A1, 및　COL26A1의 발현 수준과 두경부암 환자의 생존율의 상관관계를 분석한 결과, 상기 콜라겐 유전자의 발현이 높을수록 환자의 생존율이 높은 것을 확인하였다 (실시예 8).
따라서, 본 발명자들은 상기 구체적인 실시예를 통해 암의 진행 및 성장을 억제하는 암-연관 섬유아세포 (CAF-D)를 발굴하였으며, CAF-D의 이와 같은 종양-저해 특성은 콜라겐 유전자 COL3A1,　COL6A6,　COL25A1, 및　COL26A1의 발현 증가에 기인한 것임을 확인하였다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 두경부암의 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서, (S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는지 확인하는 단계를 포함하고, 상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 정보제공방법은 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우 두경부암의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “콜라겐 (collagen)”은 결합조직의 주요 성분으로서, 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)의 주요 구조 단백질이다. 콜라겐은 섬유아세포 (fibroblast)에 의해 생성되며, 포유동물의 전신 단백질 성분 중 약 30%를 차지한다. 본 발명에 있어서 상기 콜라겐 유전자는 종류에 제한이 없으나, 바람직하게는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 COL3A1 (Collagen Type III Alpha 1 Chain) 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 33의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 33으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되나, 이에 제한되지 않으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 즉, 본 발명의 서열번호 2 또는 서열번호 33으로 표시되는 염기서열의 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드)는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실 (deletion), 치환 (substitution) 또는 삽입 (insertion)에 의해 변형되었지만, 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체 (variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 COL3A1 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 33으로 표시되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 COL3A1 유전자로부터 발현된 단백질 (COL3A1)은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 COL3A1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 COL3A1에 대한 정보는 공공 단백질 데이터베이스 Uniprot (https://www.uniprot.org) 에서 확인할 수 있다 (Uniprot 등록번호: P02461).
본 발명에 있어서, 상기 COL6A6 (Collagen Type VI Alpha 6 Chain) 유전자는 서열번호 4 또는 서열번호 34의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 가장 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 34로 표시되는 유전자이나, 서열번호 4 또는 서열번호 34의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 COL6A6 유전자로부터 발현된 단백질 (COL6A6)은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지나, 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 COL6A6에 대한 정보는 Uniprot에서 등록번호 A6NMZ7로 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 COL25A1 (Collagen Type XXV Alpha 1 Chain) 유전자는 서열번호 6 또는 서열번호 35의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 가장 바람직하게는 서열번호 6 또는 서열번호 35로 표시되는 유전자이나, 서열번호 6 또는 서열번호 35의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 COL25A1 유전자로부터 발현된 단백질 (COL25A1)은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지나, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 COL6A6에 대한 정보는 Uniprot에서 등록번호 Q9BXS0으로 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 COL26A1 (Collagen Type XXVI Alpha 1 Chain) 유전자는 서열번호 8 또는 서열번호 36의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 가장 바람직하게는 서열번호 8 또는 서열번호 36로 표시되는 유전자이나, 서열번호 8 또는 서열번호 36의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 COL26A1 유전자로부터 발현된 단백질 (COL26A1)은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 가장 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지나, 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 COL6A6에 대한 정보는 Uniprot에서 등록번호 Q96A83으로 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 두경부암은 안구, 뇌를 제외하고 쇄골 상부 및 인두 이하 (구강, 인두, 후두, 기관 및 식도, 부비동, 침샘, 안면골과 연부 조직 및 갑상선 등)에서 발생하는 모든 종류의 악성 종양을 총칭한다. 두경부암은 흡연, 음주, 바이러스 감염 (특히 인체유두종 바이러스 (Human Ppillomavirus, HPV)의 감염)에 이해 유발될 수 있으며, 부위에 따라 종류 및 증상이 달라질 수 있는데, 구체적인 예로는 구강암, 후두암, 비인두암, 구인두암, 하인두암, 침샘암, 갑상선암, 비부비동암, 설암, 및 비강암 등이 있다. 특히 두경부암의 90%는 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma)이 차지하는 것으로 알려져 있는 바, 본 발명에서 “암”이란 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma)을 포함한다.
본 발명에 있어서, “예후” 는 병의 발생, 진행, 회복, 재발, 및 약물 내성 등에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 있어서 “예후”란 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 통해 두경부암의 중증도, 종양 진행 (tumor progression) 정도, 전이 가능성, 재발 가능성, 전이성 재발 가능성, 생존율, 및 무질병 생존율 (disease-free survival) 등을 포함하는 개념으로, 이를 종합적으로 평가하여 예후를 판단할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 다른 정보제공방법에서 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우, 두경부암의 전이 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 있어서 “생물학적 시료”란 두경부암의 예후를 예측하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체 및 진공흡입생검 검체 등으로부터 선택될 수 있으나, 바람직하게는 상기 생물학적 시료는 조직 및/또는 세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 종양 기질 (tumor stroma), 종양 조직에 인접한 섬유아세포, 및/또는 암 관련 섬유아세포 (CAF) 일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 “기질 (stroma)”은 구조적 또는 결합적 (connective) 역할을 하는 조직으로서, 기저막 (basement membrane), 섬유아세포, 세포외기질, 면역세포, 및 혈관계 등으로 이루어진 종양 주변 조직을 말한다. 정상적인 기질은 종양 억제 능력을 가지고 있으나, 종양이 진행되면 종양 주변 기질의 성질도 변화하여 결국 암세포의 성장, 침윤, 및 전이 등을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 기질의 성질 변화에는 암 관련 섬유아세포 (CAF)의 출현이 주원인이 된다. 따라서, 본 발명에 있어서 종양 기질이란, 바람직하게는 CAF를 포함하는, 종양 주변 조직을 의미한다.
최근, 질환의 진단 또는 예후 예측을 보다 간편히 수행하기 위해 타액, 혈액, 소변, 대변 등 비침습적 시료 등이 활용되고 있으나, 이와 같은 비침습적 시료는 종양 외의 조직에서 발현된 mRNA이나, 용해된 세포 (lysed cells)로부터 흘러나온 mRNA 등을 포함하고 있기 때문에, 종양 혹은 그 주변 조직의 세포에서 실제로 생성된 단백질의 양을 정확히 반영하지 못하는 문제점이 있다. 그러나, 본 발명에 따른 정보제공방법은 피검체로부터 분리된 조직 및/또는 세포 시료에 적용하기 적합하며, 종양 기질 또는 종양 주변 섬유아세포 (특히 CAF)에서 본 발명에 따른 두경부암 예후 예측을 위한 바이오마커들 (COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1)의 단백질 수준을 측정하여 두경부암의 예후를 높은 정확도로 판단할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 상기 생물학적 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 환자로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
본 발명에 있어서, “대조군 (control)”은 정상인 또는 비전이성 두경부암 환자로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 “피검체”는 인간을 포함한 포유류일 수 있으며, 두경부암을 앓거나 앓는 것으로 의심되는 개체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “측정”은 목적하는 물질 (본 발명의 경우 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질)의 존재 (발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준 (발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것 (즉, 발현 유무를 측정하는 것), 또는 상기 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법 (분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 단백질 검출은 콜라겐 단백질의 존재 여부의 검출, 또는 상기 단백질 수준의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “분석”은 바람직하게는 “측정”을 의미하는 것일 수 있고, 상기 정성분석은 목적하는 물질의 존재 여부를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 상기 정량분석은 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준) 또는 양의 변화를 측정 및 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명에서 분석 또는 측정은 정성적인 방법과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있으며, 바람직하게는 정량적인 측정이 수행되는 것일 수 있다.
콜라겐 유전자의 단백질 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 단백질 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및/또는 단백질칩 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.
콜라겐 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 mRNA 측정 방법에 의한 것이라면 특별한 제한은 없으나, PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및/또는 RNA 칩 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 두경부암의 예후 예측 방법 또는 이를 위한 정보제공방법은, 피검체의 생물학적 시료에서 측정된 콜라겐 유전자 (COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및/또는 COL26A1)의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소된 경우, 두경부암의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “수준이 증가되어 있다”는 것은, 검출되지 않던 것이 검출된 것, 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 검출량이 많아지는 것을 의미한다. 예를 들어, 수준이 “증가”되어 있다는 것은, 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다. 구체적으로는, 대조군의 그것에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대 의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.
또한, 본 발명은 두경부암 치료 물질의 스크리닝 방법으로서,
(S1) 두경부암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
(S2) 상기 시험물질을 처리한 시료와 처리하지 않은 대조군 시료에서 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준; 또는 콜라겐 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
(S3) 대조군 시료와 비교해 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준; 또는 콜라겐 단백질의 활성 정도를 증가시킨 시험물질을 두경부암 치료 물질로 선별하는 단계를 포함하고, 상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 “시험물질”은 생물학적 시료 내의 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준; 또는 이의 단백질 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 재조합 플라스미드(recombinant plasmid), 나노입자(nanoparticle), 단백질, 올리고펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어, “대조군”은 시험물질을 처리하지 않은 시료일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 두경부암의 예후 예측용 조성물로서, 상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 조성물이 mRNA의 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다. 상기 콜라겐 유전자들의 mRNA에 특이적인 프라이머 세트 또는 프로브를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용함으로써 피검체에서 상기 단백질 마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “프라이머”는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 “프라이머” 또는 “프로브”는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명의 조성물이 단백질의 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어, “앱타머 (aptamer)”는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 콜라겐 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체 (본 발명에서는 피검체로부터 수득한 생물학적 시료)에서 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 예후 예측용 조성물을 포함하는, 두경부암의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “키트 (kit)”란 특히 조직 또는 세포 시료 내에 포함되어 있는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및/또는 COL26A1의 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하여 두경부암의 예후를 예측할 수 있는 검진용 기기를 의미하며, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 유전자들의 발현량을 측정할 수 있는 형태라면 제한이 없다. 따라서, 본 발명의 키트에는 표적 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머 세트, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 하기 두경부암의 예후 예측 방법이 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다:
(S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우, 두경부암의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 단계.
또한, 본 발명은 콜라겐 단백질 (COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및/또는 COL26A1), 상기 단백질의 활성화제, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 본래 암세포의 침윤 능력을 저해하는 CAF-D에서 상기 콜라겐 단백질들의 발현을 녹다운한 결과 CAF-D에 의한 암세포 침윤 억제 효과가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 두경부암 암세포의 침윤능을 억제함으로써, 결과적으로는 두경부암의 전이를 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 “활성화제 (activator)”는 세포 내, 바람직하게는 섬유아세포 내의 콜라겐 단백질의 활성 혹은 기능을 증가시킬 수 있는 것이라면 종류에 제한이 없다.
본 발명에 있어서, “벡터 (vector)”란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터는 벡터 내에 삽입된 유전자가 발현될 수 있도록 상기 유전자와 작동 가능하게 연결되는 필수적인 조절 요소를 포함할 수 있으며, 구체적으로는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열 등을 포함할 수 있고, 목적에 따라 다양하게 변형 및 제조될 수 있다. 본 발명의 벡터의 구체적인 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터 등에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서 “벡터를 포함하는 세포”란 콜라겐 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포를 의미한다. “형질전환 (transformation)”은 수용자 세포 (recipient cells)가 외부 유전물질 (특히, 유리 (free) DNA 등)을 받아들임으로써 새로운 유전 형질이 발현되는 것을 총칭한다. 본 발명에 있어서 상기 세포는 바람직하게는 섬유아세포일 수 있다.
본 발명에 있어서 조성물 내의 콜라겐 단백질, 이의 활성화제, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험 재료 및 방법]
1. 환자 시료의 확보 및 동물 실험
환자 조직 표본은 Helsinki 선언의 기본 원칙에 따라 환자의 서면 동의 및 경북대학교 병원 연구윤리위원회의 승인 (KNUH201704011, 2017년 5월 11일)을 거쳐 사용하였다. 마우스를 이용한 모든 실험 프로토콜은 ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) 가이드라인을 따라 수행하였으며, 경북대학교 동물윤리위원회 (KNU 2017-51-2, 2017년 8월 11일)의 승인을 받았다.
2. 실험 재료
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), RPMI-1640 medium, 소태아혈청 (FBS), 및 페니실린-스트렙토마이신 용액은 Invitrogen (미국, 캘리포니아, 칼즈배드)으로부터 구입했다. 퀴아졸 (qiazol)은 Qiagen (미국, 캘리포니아, 발렌시아)에서 구입하였으며, 2× SYBR Green PCR Master Mix는 Takara Bio (일본, 오쓰시)에서 구입했다. HRP-결합 항-β-actin 항체 (Cat# sc-47778HRP, RRID: AB_2714189)는 Santa Cruz Biotechnology (미국, 캘리포니아, 샌타크루즈)에서 구입했다. 토끼 항-α-SMA (Cat# ab5694, RRID: AB_2223021), 토끼 항-CD31 (Cat# ab28364, RRID: AB_726362), 및 마우스 항-pan-cytokeratin (Cat# ab7753, RRID: AB_306047) 항체는 Abcam (미국, 매사추세츠, 케임브리지)에서 구입했다. 토끼 항-COL3A1 항체 (Cat# 22734-AP-1)는 Proteintech (미국, 일리노이, 로즈먼트)에서 구입했다. 토끼 항-COL6A6 항체 (Cat# PA5-60958, RRID: AB_2640027)는 Thermo Fisher Scientific, Inc. (미국, 캘리포니아, 어바인)에서 구입했다. 토끼 항-Ku80 항체 (Cat# 2753)는 Cell Signaling Technology (미국, 매사추세츠, 댄버스)에서 구입했다.
3. 임상 표본에 대한 면역조직화학 분석 (immunohistochemical (IHC) analysis)
파라핀-포매 조직 블록은 2017년부터 2018년까지 경북대학교 치과 병원에서 구강암 치료를 위해 종양 절제술을 받은 두경부암 환자로부터 수득했다. 환자 정보는 하기 표 4에 정리하였다. 탈랍 (dewaxing) 후, 절편을 5분 동안 블로킹 (blocking)한 다음, pan-사이토케라틴 항체 (1:500), COL3A1 항체 (1:500), 또는 COL6A6 항체 (1:500)과 상온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. IHC 염색은 UltraTek Horseradish Peroxidase (HRP) Anti-olyvalent Kit (ScyTek Laboratories; 미국, 유타주, 로건)를 사용하여 수행했다. 발색체로는 3,3-diaminobenzidine (Dako; 미국, 캘리포니아, 카핀테리아)를 사용했다. 핵은 헤마톡시린으로 대조염색했다.
종양 조직에 대해 Ku80 항체로 염색하여 마우스의 이종이식 종양 조직이 주입된 인간 암세포로부터 유래한 것인지 확인하였다. Ku80은 인간-특이적이며, 인체 전반에서 광범위하게 발현되는 단백질이다.
4. 신선한 두경부암 조직 유래 섬유아세포의 1차 배양
섬유아세포 1차 배양을 위한 종양 조직은 경북대학교 치과병원의 두경부암 환자로부터 외과적 절제를 통해 확보했다. 수술 전 화학방사선 요법을 받은 환자는 없었다. 종양 덩어리에 인접한 기질 (stroma)를 병리학자가 조심스럽게 분리하고 멸균된 DMEM에서 가능한 가장 작은 절편으로 절단한 다음, 10%의 FBS가 첨가된 10 cm 배양접시에 씨딩 (seeding)하였다. NTF 배양을 위한 조직 샘플은 종양으로부터 적어도 1 cm 떨어진 영역에서 확보했다. 2 내지 3주 후, 면역세포화학 분석을 위해 섬유아세포를 커버 슬라이드가 있는 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 다음날, 세포를 세척한 후 즉시 4% 파라포름알데히드에서 1시간 동안 고정했다. 세척 후, 상온에서 알부민 혈청을 이용해 1시간 동안 세포를 블로킹 (blocking)했다. 세포는 1차 항체로 4 ℃에서 16시간 동안 면역염색하였고, 이어서 형광 2차 항체로 실온에서 인큐베이션하였다. 형광 이미지는 형광현미경 (Carl Zeiss; 미국, 뉴욕, 손우드)으로 촬영했다.
CAF로부터 조건 배지 (condition medium, CM)을 확보하기 위해, 3회의 계대를 거친 1차 섬유아세포를 48시간 동안 성장시켜 80%의 컨플루언시 (confluence)가 되도록 했다. 배양 배지를 모아 0.45 μM의 다공성 필터를 통과시켰으며, 여과액을 CM으로 사용했다. 모든 실험에서 세포는 계대 횟수가 3 내지 6인 것을 사용했다.
5. 두경부암 세포 배양 및 FaDu 스페로이드 형성
FaDu 인간 두경부암 세포주 (ATCC Cat# HTB-43, RRID: CVCL_1218)는 American Type Culture Collection 로부터 구매했으며 (미국, 버지니아, 머내서스), 10%의 FBS 및 1%의 페니실린-스트렙토마이신 용액을 함유한 DMEM에서 37 ℃ 및 5% CO2의 가습된 환경에서 배양했다. YD-10B 세포주는 동일한 조건에서 RPMI 배지로 배양했다. 2달마다, 세포주의 오염 여부를 CellSafe Mycoplasma PCR Detection Kit (Cat# CS-D, CellSafe Co.; 한국, 용인)을 이용해 테스트했다. FaDu 스페로이드를 만들기 위해, 세포를 96-well U-bottom Ultra-Low Attachment plate (Corning Inc.; 미국, 뉴욕, 코닝)에 웰당 4000개 세포로 씨딩하였으며, 직경이 약 400 μm인 스페로이드가 형성될 때까지 2 내지 3일간 배양하였다. YD-10B 세포는 스페로이드를 형성하지 않았다.
6. 마트리젤 침윤 분석 (Matrigel invasion assay)
2D HNSC 세포 침윤 (2D 두경부암 cell invasion)은 마트리젤이 코팅된 8.0-μm 필터 챔버 (BD Biosciences; 미국, 캘리포니아주, 산호세)를 사용한 공동-배양 시스템 (co-culture system)으로 평가했다. CAF-P 또는 CAF-D 세포를 24웰 플레이트에 씨딩했다. 두경부암 세포를 배지에 재현탁하고, 300 μL의 분취량 (aliquots)을 마트리젤-코팅된 트랜스웰 챔버에 첨가했다. 48 내지 72시간의 배양 후에, 세포를 10% 에탄올 중의 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. 트랜스웰 챔버의 상단면에 있는 세포는 면봉을 사용하여 제거하고, 챔버의 하부 표면으로 이동한 세포를 계수했다. 침윤 지수 (invasion index)는 대조군의 침윤 세포 (invaded cells) 대비 실험군의 침임 세포의 수의 배수 변화 (fold change)로 계산했다.
또한, FaDu 스페로이드 (spheroid)의 마트리젤 침윤능에 대한 CAF-P 또는 CAF-D 유래 CM의 효과를 평가했다. 이틀 동안 96-well U-bottom ultra-low attachment plate 상에서 FaDu 스페로이드를 형성한 후, 배지를 100 μl의 CM으로 교체하고, 50 μl의 마트리젤을 각 웰에 첨가하여 반-고체 매트릭스 (semi-solid matrix)를 제공했다. 마트리젤 용액이 고형화되고 나서, 건조를 방지하기 위해 100 μl의 CM을 추가로 첨가했다. FaDu 스페로이드의 마트리젤 침윤은 위상차 현미경 (5× 배율)으로 14일 동안 모니터링하였으며. 각 스페로이드의 표면으로부터 뻗어나온 튜브형 구조 (tube-like structures)의 평균 수를 측정했다. 또한, Cell3iMager (CC-5000; Screen Holdings Co.; 일본, 교토)를 사용해 스페로이트의 평균 크기를 측정했다.
7. 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time polymerase chain reaction)
총 RNA 추출, cDNA 합성, 및 유전자 발현 정규화는 표준 프로토콜을 따라 수행했다. 실시간 정량적 중합효소연쇄반응 (real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)에 사용된 프라이머는 아래 표에 정리했다.
Figure pat00001
유전자 발현 수준은 하우스키핑 (housekeeping) 유전자인 GAPDH에 대해 정규화하여 나타냈다. ABI 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems; 미국, 캘리포니아, 포스터시티)를 이용해 qPCR을 수행했다. 계산은 각 샘플의 평균 Ct 값을 GAPDH 대조군의 평균 Ct 값으로 정규화한 다음, 2-ΔΔCt　값을 계산하여 결정된 ΔCt 값을 기초로 수행했다.
8. DNA 마이크로어레이 분석 (DNA microarray analysis)
CAF-P 그룹과 CAF-D 그룹간 유전자 발현 차이를 분석하기 위해, 각 그룹에서 3 개 1차 섬유아세포 샘플 (총 6개 샘플)에 대해, 40,716개 유전자-수준 프로브 세트를 포함하고 있는 Affymetrix GeneChip®　Human Gene 2.0 ST array (Affymetrix; 미국, 캘리포니아, 샌타클래라)를 이용하여 마이크로어레이 분석을 수행했다. 총 RNA (total RNA)는 Trizol 시약 (Invitrogen)을 사용해 분리했다. RNA 품질은 Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies; 미국, 캘리포니아주, 산타클래라)로 분석했으며, ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies; 미국, 델라웨어주, 윌밍턴)으로 정량했다. RNA 시료는 권장 프로토콜에 따라 Affymetrix 절차에 input으로 사용했다. 간략히 설명하면, 각 샘플의 총 RNA를 T7 프로모터를 포함하는 랜덤 헥사머 (hexamer)를 사용해 이중-가닥의 cDNA로 변환하고였다. In vitro 전사 (in vitro transcription, IVT) 반응을 통해 이중-가닥 cDNA 주형으로 RNA를 증폭하고 (cRNA), Affymetrix 샘플 정리 모듈 (cleanup module)을 사용해 정제했다. 그 후, cDNA를 UDG 및 APE1 제한효소로 절단한 후, 비오틴화된 디데옥시뉴클레오티드를 중합하는 말단 트랜스퍼라제 반응 (terminal transferase reaction)을 통해 말단을 표지했다. 말단-표지된 cDNA 단편은 Affymetrix array에 혼성화시키고, streptavidin-phycoerythrin 접합체를 사용해 염색했다. Affymetrix array를 Affymetrix Model 3000 G7 스캐너 (Affymetrix)를 사용해 스캔하고, Affymetrix Command Console Software 1.1로 이미지 데이터를 분석했다. 데이터 마이닝 및 그래픽 시각화는 ExDEGA 소프트웨어 (Ebiogen Inc.; 한국, 서울)로 수행했다.
9. 웨스턴 블롯 분석
총 단백질을 추출하고 농도를 측정하여, 동량의 단백질 (30-40 μg)을 SDS-PAGE로 분리한 뒤 니트로셀룰로스 맴브레인 (nitrocellulose membrane)에 트랜스퍼 (transfer) 했다. 5% 탈지유 (skim milk)로 30분간 블로킹한 후, 맴브레인을 1차 항체와 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 했다. β-액틴은 로딩 대조군 (loading control)로 사용했다. HRP-접합 2차 항체는 1:5000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 블롯을 0.1%의 Tween 20을 함유한 Tris-buffered saline으로 3회 세척했다. 단백질 밴드는 화학발광 (chemiluminescence)으로 관찰했다.
10. 마우스 이종이식 모델 (Xenograft model)
이종이식 마우스 (6주령 암컷 BALB/c 마우스; 효창 과학; 한국, 대구) 모델을 제작하여 FaDu 스페로이드-유래 종양 성장에 대한 CAF-P 및 CAF-D의 영향을 평가했다. FaDu 스페로이드는 96-well U-bottom ultra-low attachment plate에서 준비했다 (직경 < 400 μm). 22-게이지 바늘을 사용해 5마리의 마우스에 50개의 FaDu 스페로이드 및 5 × 105　개의 CAF를 공동-주입했다. 마우스간 가변성으로 인한 오류를 최소화하기 위해, CAF-P 및 CAF-D를 FaDu 스페로이드와 각각 우측 및 좌측 뺨의 구강 점막에 공동-주입했다. 90일 후, 마우스를 안락사시키고, 캘리퍼를 사용해 종양 부피를 측정했다. IHC 분석으로 종양 조직을 분석했다.
11. small interfering RNA (siRNA)의 형질도입
1차 CAF-D 세포를 siCOL3A1 (Santa Cruz Biotechnology)으로 일시적으로 형질주입시켰다. 1 × 105　개의 세포를 60-mm 플레이트에 씨딩하고, 다음날 배지를 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체한 직후 siRNA를 최종 농도를 10 nM로 하여 Lipofectamine 3000 (hermo Fisher Scientific; 미국, 매사추세츠, 월섬)으로 형질도입시켰다. 6시간이 지난 후, 배지를 혈청이 포함된 신선한 배지로 교체하고, 트랜스웰 공동-배양 시스템으로 두경부암 세포의 마트리젤 침윤능을 확인했다. 이틀 후 siRNA-형질주입된 CAF로부터 CM을 수확하고, 3D FaDu 스페로이드의 마트리젤 침윤에 대한 COL3A1-녹다운 CAF-D의 영향을 평가했다.
12. 통계 분석
그룹간 차이는 매개변수 two-tailed non-paired t-test로 평가했다. Origin v.8.0 소프트웨어 (OriginLab; 미국, 매사추세츠, 노샘프턴)로 분석을 수행했으며 p값이 0.05 이하일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주했다.
[실시예]
실시예 1. CAF 및 암 상피세포 사이의 경계 형태에 따른 두경부암 조직의 특성 확인
두경부암 조직에서 ECM 및 암 상피세포 (cancer epithelial cells) 사이의 경계 (margin) 특성을 비교한 결과, 두 가지 특성이 확인되었다. 한 그룹은 암세포와 CAF 사이에 경계가 뚜렷하지 않았다 (unbounded) (도 1a). 반면, 다른 그룹은 암세포 및 CAF 사이의 경계가 상대적으로 구별된 것을 확인할 수 있었다 (도 1b). 특히, 이 경우 CAF의 배열은 암세포를 둘러싸고 있는 것처럼 보였다. 따라서, 본 발명자들은 전자 그룹을 CAF-Promote 또는 CAF-P로 명명하였으며, 후자 그룹을 CAF-Defense 또는 CAF-D로 명명하였다.
실시예 2. 두경부암 조직 내 섬유아세포의 특성 확인
실시예 1에서 확인한 두 가지 두경부암 조직 그룹 (CAF-P 및 CAF-D 그룹)에서 CAF가 종양에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해, 각 그룹의 CAF를 1차 배양하였다. 배양 2 내지 3주 후, 배양 플레이트에 부착되어 있던 섬유아세포가 성장하기 시작했다. 모든 1차 섬유아세포는 균질하고, 방추형 모양의 섬유아세포 형태를 나타냈다. α-SMA를 발현하는 섬유아세포는 다양한 암에서 기질 (stroma)의 주성분으로 간주된다. 4명의 환자로부터 배양된 1차 섬유아세포에 대해 면역세포화학 염색을 수행하였으며, 그 결과를 도 2a (CAF-P) 및 도 2b (CAF-D)에 나타냈다. 분리된 섬유아세포에서 상피 및 내피세포에 의한 오염 정도를 확인하기 위해, pan-사이토케라틴 (pan-cytokeratin, Pan-CK) 및 CD31 발현을 확인했다. 섬유아세포 배양체는 두 가지 마커 모두에 대해 음성이었다. 대부분의 CAF-P 및 CAF-D 세포 (>95%)는 α-SMA에 대해 양성 염색 (positive staining)을 나타냈다. 반면, 각 그룹의 대응되는 비-종양 섬유아세포 (non-tumor fibroblast, NTF)는 형광 α-SMA 염색 수행시 약한-양성 또는 음성 신호를 나타냈다. 1차 섬유아세포에서의 α-SMA 발현 수준을 형광 이미지 분석을 통해 정량화하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, CAF-P 및 CAF-D 그룹간에는 유의미한 차이가 없었다. 다만, 각각의 NTF에 비해서는 α-SMA 수준이 유의미하게 높은 것으로 나타났다. 이들 마커의 발현 패턴은 다수의 계대 (passages) 후에도 유지되었다.
실시예 3. 두경부암 세포의 마트리젤 침윤에 대한 CAF의 영향 확인
다음으로, 트랜스웰 공동-배양 시스템 (Transwell co-culture system)을 사용해 두경부암 세포의 2D 마트리젤 침윤 (2D Matrigel invasion)에 대한 CAF의 영향을 확인했다. 그 결과, FaDu 세포의 침윤 능력은 CAF-D와 공동-배양했을 때에 비해 CAF-P와 공동-배양했을 때 현저하게 증가한 것으로 나타났으며 (도 4a), YD-10B를 CAF-D 또는 CAF-P와 공동-배양했을 때에도 동일한 결과를 확인하였다 (도 4b).
또한, 3D FaDu 스페로이드의 침윤능 (invasive potential)에 대한 CAF-P 또는 CAF-D-유래 조건 배지 (condition medium, CM)의 효과를 확인했다 (도 5). 환자간 CAF 특성의 차이를 고려하여, 각-CAF의 짝 NTF (paired NTF)도 함께 비교했다. 그 결과, 상대적인 침윤 정도 (스페로이드로부터 뻗어 나온 싹 (sprouts)의 수) 및 스페로이드 크기에서 상응하는 차이가 나타났다. 4일 동안은 스페로이드 침윤능에서 변화가 관찰되지 않았으나, 14일 째에, CAF-P-유래 CM이 처리된 스페로이드의 마트리젤 침윤이 짝 NTF-유래 CM이 처리된 스페로이드에 비해 더욱 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 6a). 상대적인 침윤 정도 (스페로이드로부터 뻗어 나온 싹의 수) 및 FaDu 스페로이드 크기에서 상응하는 차이가 관찰됐다 (도 6b). 그러나, CAF-D 유래-CM을 처리한 경우에는 14일이 경과할 때까지 마트리젤 침윤이나 FaDu 스페로이드 크기에 유의미한 차이가 없었다 (도 7a 및 도 7b). 두 그룹 (CAF-P 및 CAF-D)의 짝 NTF-유래 CM 역시, 마트리젤 침윤이나 스페로이드 크기에 유의미한 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
다음으로, 각 CAF 그룹의 MMP (matrix metalloproteinase)의 발현을 비교했다. MMP는 대부분의 암에서 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, MMP mRNA 발현 수준을 비교한 결과, 짝 NTF-유래 CM으로 공동-배양된 FaDu 스페로이드에 비해 CAF-P 유래 CM으로 공동-배양된 FaDu 스페로이드에서 MMP 발현이 증가한 것으로 나타났다 (도 8a). 그러나, CAF-D 유래 CM으로 공동-배양된 FaDu 스페로이드의 MMP mRNA 발현 수준은 짝 NTF-유래 CM으로 공동-배양된 것에 비해 현저하게 감소한 것으로 나타났다 (도 8b). 또한, N-카드헤린 (N-cadherin, CDH2), 비멘틴 (vimentin, VIM), 및 피브로넥틴 (fibronectin, FN1)과 같은 중간엽 마커들의 mRNA 발현을 동일한 조건에서 측정하였을 때에도 MMP의 mRNA 발현과 동일한 양상을 나타냈다 (도 8a 및 8b). 상피 마커 중 하나인 신데칸-1 (syndecan-1, SDC1)은 CAF-P 유래 CM 및 CAF-D 유래 CM 모두에서 중간엽 마커의 발현과 반대 양상을 보였다 (도 8a 및 8b).
상기 결과는 CAF-D는 암세포의 침윤을 촉진하는 CAF-P와 달리 오히려 암세포의 침윤 능력을 저해하는 특성이 있으며, 이는 CAF-D 섬유아세포가 암세포 주변을 감싼 장벽과 같은 역할을 하여, 주변으로 확장하는 것을 억제하기 때문인 것으로 추측된다.
실시예 4. 1차 CAF-P 및 CAF-D의 DNA 마이크로어레이 분석
두 그룹 (CAF-P 및 CAF-D)의 1차 CAF 세포의 유전자 발현 양상을 비교하기 위해, DNA 마이크로어레이 (DNA microarray)를 수행하였으며, 로우 데이터 (raw data)를 quantile 정규화 (quantile normalization)하여 각 그룹의 유전자 발현 프로파일을 확보했다. 마이크로어레이 분석은 각 그룹 (CAF-P 및 CAF-D)별 1차 섬유아세포 3 세트 (총 6 세트)에 대해 수행했다. 발현 변화 (fold change)>1.75 및 p-값<0.05을 기준으로 하여 그룹간에 차등적으로 발현된 유전자들을 선별했다. 이들 유전자들의 히트맵 (heatmap)은 도 9에 나타냈다. 히트맵 유전자 목록은 상향 조절된 유전자 27개 및 하향 조절된 유전자 53개로 이루어졌다. 확인된 유전자 리스트에 대해 DAVID 소프트웨어를 이용하여 분자적 기능 및 생물학적 과정 분석을 수행했다. 결과는 표 1에 나타냈다.
분류 용어 카운트 p-값 유전자
GOTERM-BP Biological Process GO:0030574~collagen catabolic process 3 0.015 COL3A1, ADAMTS14, COL6A6
GO:0032211~negative regulation of telomere maintenance via telomerase 2 0.034 HNRNPU, HNRNPA1
GOTERM_CC Cellular Compartment GO:0005654~nucleoplasm 16 0.018 EED, FUS, HIST1H2BL, GLIS3, HNRNPU, ZBTB20, NR3C2, SEL1L3, PM20D2, RAD51D, DMTF1, POLR1A, AGO2, HNRNPA1, UTRN, FKBP5
GO:0005581~collagen trimer 2 0.043 COL3A1, COL6A6
GOTERM_MF Molecular Function GO:0003676~nucleic acid binding 9 0.006 ZNF681, ZNF250, FUS, AGO2, GLIS3, ZBTB20, ZNF138, HNRNPA1, ZNF431
GO:0046872~metal ion binding 13 0.011 SMG1, ZNF681, ZNF250, GLIS3, ACSM2A, ZBTB20, ADAM20, PDP1, COL3A1, AGAP6, AGO2, ZNF138, ZNF431
GO:0005178~integrin binding 3 0.036 COL3A1, DST, UTRN
GO:0003677~DNA binding 10 0.044 RAD51D, ZNF681, DMTF1, ZNF250, FUS, POLR1A, HIST1H2BL, GLIS3, HNRNPU, ZBTB20
GO:0005178~integrin binding 8 0.046 ADAMTS14, TRIM52, FUS, POLR1A, CHORDC1, PGGT1B, UTRN, NR3C2
DAVID Functional Analysis website를 이용하여 수행한 99개 mRNA의 annotation
생물학적 과정 및 세포 구획 (cellular compartment)에 관한 증폭 분석 (enrichment analysis) 결과, 콜라겐 이화 과정 (catabolic process) 및 콜라겐 삼량체 (collagen trimer)가 유의미한 기능적 주석 용어 (annotation terms)인 것으로 나타났다 (p < 0.05). 상기 마이크로어레이 데이터 내의 다른 콜라겐 mRNA 검색 결과, COL25A1 및 COL26A1가 CAF-P 그룹에 비해 CAF-D그룹에서 1.43 내지 1.49배 더 높게 발현된 것으로 나타났다 (p <0305). CAF-D 대 CAF-P의 각 콜라겐의 배수 비율 (fold ratio)는 하기 표 2에 나타냈으며, 콜라겐 단백질들의 David 기능 주석은 하기 표 3에 나타냈다.
프로브 셋 ID (Probe Set ID) 유전자 약어 (Gene Symbol) 유전자 명칭 (Gene Name) 배수 변화 (Fold Change; CAF-D/CAF-P) p-값
16888610 COL3A1 collagen type III alpha 1 chain 2.362 0.041
16945543 COL6A6 collagen type VI alpha 6 chain 2.156 0.050
16978896 COL25A1 collagen type XXV alpha 1 chain 1.434 0.030
17049717 COL26A1 collagen type XXVI alpha 1 chain 1.488 0.004
ID 종 (Species) GOTERM_CC_DIRECT
COL3A1 Homo sapiens GO:0005576~extracellular region
COL6A6 Homo sapiens GO:0005576~extracellular region
COL25A1 Homo sapiens GO:0005576~extracellular region
COL26A1 Homo sapiens GO:0005576~extracellular region
ID 종 GOTERM_CC_DIRECT
COL3A1 Homo sapiens GO:0007160~cell-matrix adhesion, GO:0007179~transforming growth factor beta receptor signaling pathway, GO:0007229~integrin-mediated signaling pathway
COL6A6 Homo sapiens GO:0007155~cell adhesion, GO:0030574~collagen catabolic process,
COL25A1 Homo sapiens GO:0030574~collagen catabolic process, GO:0060385~axonogenesis involved in innervation,
COL26A1 Homo sapiens GO:0010811~positive regulation of cellsubstrate adhesion, GO:0030574~collagen catabolic process,
ID 종 GOTERM_CC_DIRECT
COL3A1 Homo sapiens hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway, hsa04510:Focal adhesion, hsa04512:ECMreceptor interaction, hsa04611:Platelet activation, hsa05146:Amoebiasis,
COL6A6 Homo sapiens hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway,hsa04510:Focal adhesion,hsa04512:ECM-receptor interaction ,hsa04974:Protein digestion and absorption,
도 10은 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 히트맵을 나타낸다. 4 세트의 일차 CAF-P 및 CAF-D 시료 각각에 대해 qPCR을 수행하여 콜라겐 mRNA 발현을 확인하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1의 mRNA 발현 수준은 CAF-P 그룹에 비해 CAF-D 그룹에서 현저히 높았다. 또한, 동일한 조건에서 COL3A1 및 COL6A6 단백질 수준은 CAF-D에서 증가되어 있었다 (도 12 및 13). DNA 마이크로어레이 또는 웨스턴 블롯 분석에서, α-SMA의 발현은 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. CAF-D의 특성은 암 진행을 지연시키거나 억제한다는 점에서 NTF와 유사하기 때문에, 본 발명자들은 4 세트의 CAF-D 및 NTF-D에서 네 가지 COL (collagen) 유전자의 발현을 비교했다. 도 14에 나타낸 바와 같이, COL 유전자들의 mRNA 발현은 NTF-D 그룹에 비해 CAF-D 그룹에서 증가한 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 CAF-D가 NTF로부터 분화된 것임을 시사하며, 4 가지 유전자 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1가 CAF-D 및 CAF-P의 특성 차이에 기여한다는 것을 보여준다.
실시예 5. 두경부암 환자 조직에서의 콜라겐 단백질에 대한 IHC 분석
실시예 4에서 확인한 콜라겐 단백질들의 발현 경향성이 환자 조직에서도 재현되는지 확인하기 위해, 두경부암 환자 조직에서 콜라겐 단백질 수준을 확인하였다 (도 15). COL3A1 및 COL6A6 단백질 수준은 CAF-P 그룹에 비해 CAF-D 그룹에서 높았다. 즉, CAF-P 그룹은 약한 양성 염색 양상을 보인 반면, CAF-D의 COL3A1 및 COL6A6 단백질은 암 상피세포의 경계를 따라 더 강한 염색을 나타냈다. 이와 같은 결과는 환자 조직에서도 CAF-D 및 CAF-P간 콜라겐 유전자 (COL3A1, COL6A6 등)가 동일한 발현 차이를 보인다는 것을 보여준다.
또한, 본 발명의 연구에 참여한 환자들의 특성을 하기 표 4에 정리했다. 이에 따르면, CAF의 유형은 종양 단계 (tumor stage)와도 상관관계가 있는 것으로 보인다.
CAF 나이 성별 최초 부위 (primary site) 분화 (differentiation) 림프절 전이 TMN 단계 흡연 음주
P 38 F 잇몸 양호 (well) N T4aN0M0 4A N N
48 F 볼점막 중간 (moderate) Y T1N1M0 3 Y Y
76 M 잇몸 영역 (gingival area) 중간 N T4N0M0 4 N N
D 53 M 구강 바닥 (mouth floor) 양호 N T1N0M0 1 Y Y
64 M 구강 바닥 중간 N T2N0M0 2 N N
47 M 혀의 앞면 (ventral surface) 양호 N T1N0M0 1 Y N
실시예 6. 마우스 모델에서 FaDu 및 CAF-P/CAF-D에 의한 종양 발생 확인
다음으로, 마우스의 뺨의 구강 점막에 FaDu 스페로이드를 주사하면서, CAF-P (우측 뺨 구강 점막) 또는 CAF-D (좌측 뺨 구강 점막)를 공동-주입 (co-injection)하여 섬유아세포 유형에 따른 종양 형성 (tumorigenesis)을 비교했다. 그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 CAF-P와 함께 주입된 FaDu-유래 종양의 크기는 CAF-D와 함께 주입된 것에 비해 두드러지게 큰 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상피세포 및 섬유아세포를 포함한 종양 조직에서 인간-특이적 Ku80 바이오마커의 발현을 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과, 종양 조직이 광범위하게 염색된 것을 확인할 수 있었는데 (도 17), 이는 마우스 뺨에 주입된 FaDu 및 CAF 세포에 의해 이종이식 종양 형성 (xenograft tumor formation)이 잘 일어났음을 보여주는 것이다. CAF-D가 함께 주입된 FaDu-유래 마우스 종양 조직은 CAF-P가 함께 주입된 것에 비해 COL3A1,　COL6A6,　COL25A1, 및　COL26A1의 mRNA 발현이 높은 것으로 나타났다 (도 18). 반면, MMP2,　MMP9, 및　MMP14의 mRNA 발현은 콜라겐 mRNA 발현과 정반대의 양상을 나타냈다.
즉, 상기 in vivo 실험 결과로부터, CAF-D는 CAF-P에 비해 종양 성장을 촉진하는 능력이 현저히 떨어지며, 이와 같은 특성의 차이는 4 가지 콜라겐 유전자 COL3A1,　COL6A6,　COL25A1, 및　COL26A1의 발현 증가에서 비롯된 것임을 알 수 있다.
　실시예 7. 콜라겐 발현이 녹다운된 CAF-D가 FaDu의 마트리젤 침윤능에 미치는 효과 확인
다음으로, FaDu 스페로이드의 침윤능 (invasive potential)에 있어, siCOL3A1로 형질주입 (transfection)된 CAF-유래 CM이 미치는 영향을 확인했다. siCOL3A1의 녹다운 (knockdown) 효율은 도 19에 나타냈다. COL3A1 발현을 녹다운한 후 스페로이드의 마트리젤 침윤 능력을 관찰한 결과, 대조군 siRNA가 형질주입된 CAF-D-유래 CM에서는 FaDu 스페로이드의 침윤능에 어떠한 변화도 없었으나, COL3A1 발현이 녹다운된 CAF-D-유래 CM에서는 14일이 지난 후 FaDu 스페로이드의 침윤 정도가 크게 향상된 것을 확인할 수 있었다 (도 20a). 이를 정량화하였을 때, 상대적인 침윤능 및 스페로이드 크기에서 상응하는 차이를 확인할 수 있었다 (도 20b). 또한, 도 21에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 유전자 발현이 녹다운된 CAF-D 유래 CM에서 배양시 FaDu 스페로이드의 MMP mRNA 발현이 증가한 것으로 나타났다. 상기 결과는 COL3A1 등 콜라겐 단백질이 CAF의 암 성장 혹은 침윤의 촉진 기능을 저해한다는 것을 증명한다.
실시예 8. COL 유전자 발현 수준에 따른 두경부암 환자의 생존율 확인
마지막으로, R (3.3.1 버전)을 이용해 COL 유전자의 발현 수준에 따른 두경부암 환자의 생존율을 분석하였다. 전체 생존율 정보는 TCGA (The Cancer Genome Atlas)로부터 다운로드하였다. Kaplan-Meier 생존 분석 결과, COL6A6 및 COL26A1의 발현이 높을수록 환자의 생존율이 더욱 높은 것으로 나타난 바 (도 22), 콜라겐 유전자의 발현은 환자의 생존과 강력한 양의 상관관계에 있다는 것을 보여준다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 두경부암 환자의 섬유아세포가 형태학적으로 두 가지 그룹 (CAF-P 및 CAF-D)으로 구별될 수 있음을 확인하였다. 암-관련 섬유아세포는 대개 암세포의 성장 및 침윤을 촉진하는 것으로 알려져 있으나, 본 발명자들은 CAF-D의 암 진행 촉진 능력이 CAF-P에 비해 현저히 떨어진다는 것을 발견하였으며, 이는 COL3A1,　COL6A6,　COL25A1, 및　COL26A1의 발현 증가에서 비롯된 것임을 구체적인 실험을 통해 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
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Thr Gly Pro Gln Asn Tyr Ser Pro Gln Tyr Asp Ser Tyr Asp Val 145 150 155 160 Lys Ser Gly Val Ala Val Gly Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Gly Pro Ala 165 170 175 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Thr Ser Gly His Pro Gly 180 185 190 Ser Pro Gly Ser Pro Gly Tyr Gln Gly Pro Pro Gly Glu Pro Gly Gln 195 200 205 Ala Gly Pro Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ile Gly Pro Ser 210 215 220 Gly Pro Ala Gly Lys Asp Gly Glu Ser Gly Arg Pro Gly Arg Pro Gly 225 230 235 240 Glu Arg Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ile Lys Gly Pro Ala Gly Ile 245 250 255 Pro Gly Phe Pro Gly Met Lys Gly His Arg Gly Phe Asp Gly Arg Asn 260 265 270 Gly Glu Lys Gly Glu Thr Gly Ala Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Gly 275 280 285 Leu Pro Gly Glu Asn Gly Ala Pro Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Ala 290 295 300 Pro Gly Glu Arg Gly Arg Pro Gly Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Arg 305 310 315 320 Gly Asn Asp Gly Ala Arg Gly Ser Asp Gly Gln Pro Gly Pro Pro Gly 325 330 335 Pro Pro Gly Thr Ala Gly Phe Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Glu 340 345 350 Val Gly Pro Ala Gly Ser Pro Gly Ser Asn Gly Ala Pro Gly Gln Arg 355 360 365 Gly Glu Pro Gly Pro Gln Gly His Ala Gly Ala Gln Gly Pro Pro Gly 370 375 380 Pro Pro Gly Ile Asn Gly Ser Pro Gly Gly Lys Gly Glu Met Gly Pro 385 390 395 400 Ala Gly Ile Pro Gly Ala Pro Gly Leu Met Gly Ala Arg Gly Pro Pro 405 410 415 Gly Pro Ala Gly Ala Asn Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly 420 425 430 Glu Pro Gly Lys Asn Gly Ala Lys Gly Glu Pro Gly Pro Arg Gly Glu 435 440 445 Arg Gly Glu Ala Gly Ile Pro Gly Val Pro Gly Ala Lys Gly Glu Asp 450 455 460 Gly Lys Asp Gly Ser Pro Gly Glu Pro Gly Ala Asn Gly Leu Pro Gly 465 470 475 480 Ala Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro Gly Phe Arg Gly Pro Ala Gly Pro 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Gly Glu Lys Gly Pro Ala Gly Glu Arg Gly Ala Pro 500 505 510 Gly Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Arg Asp Gly 515 520 525 Val Pro Gly Gly Pro Gly Met Arg Gly Met Pro Gly Ser Pro Gly Gly 530 535 540 Pro Gly Ser Asp Gly Lys Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gln Gly Glu Ser 545 550 555 560 Gly Arg Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Pro Arg Gly Gln Pro Gly 565 570 575 Val Met Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Asn Asp Gly Ala Pro Gly Lys 580 585 590 Asn Gly Glu Arg Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro 595 600 605 Gly Lys Asn Gly Glu Thr Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Thr Gly 610 615 620 Pro Gly Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu 625 630 635 640 Gln Gly Leu Pro Gly Thr Gly Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro 645 650 655 Gly Glu Pro Gly Pro Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 660 665 670 Gly Lys Gly Asp Ala Gly Ala Pro Gly Glu Arg Gly Pro Pro Gly Leu 675 680 685 Ala Gly Ala Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu 690 695 700 Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Ala Gly 705 710 715 720 Thr Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Gly Leu Gly Ser 725 730 735 Pro Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Ala Asp 740 745 750 Gly Val Pro Gly Lys Asp Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Ile Gly 755 760 765 Pro Pro 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Claims (16)

  1. 두경부암의 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서,
    (S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는지 확인하는 단계를 포함하고,
    상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 조직은 종양 기질 (tumor stroma)인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 세포는 암 관련 섬유아세포 (cancer associated fibroblast)인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 대조군은 정상인 또는 비전이성 두경부암 환자로부터 분리된 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 수준은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS, 및 단백질칩으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA 수준은 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅(northern blotting), 서던 블랏팅(southern blotting), In situ 교잡법, DNA 칩, 및 RNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 두경부암 치료 물질의 스크리닝 방법으로서,
    (S1) 두경부암 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
    (S2) 상기 시험물질을 처리한 시료와 처리하지 않은 대조군 시료에서 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준; 또는 콜라겐 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (S3) 대조군 시료와 비교해 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준; 또는 콜라겐 단백질의 활성 정도를 증가시킨 시험물질을 두경부암 치료 물질로 선별하는 단계를 포함하고,
    상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  9. 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 두경부암의 예후 예측용 조성물로서, 상기 콜라겐 유전자는 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 두경부암의 예후 예측용 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 키트는 하기 두경부암의 예후 예측 방법이 기재된 설명서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 키트:
    (S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    (S2) 상기 단계 (S1)에서 측정된 콜라겐 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우, 두경부암의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 단계.
  14. 콜라겐 단백질, 상기 단백질의 활성화제, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효 성분으로 포함하는 두경부암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 콜라겐 단백질은 COL3A1, COL6A6, COL25A1, 및 COL26A1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
    상기 COL3A1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함함;
    상기 COL6A6 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함함;
    상기 COL25A1 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함함; 또는
    상기 COL26A1 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함함.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 두경부암의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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