KR20230020363A - Mig6 돌연변이를 포함하는, EGFR 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커 - Google Patents

Mig6 돌연변이를 포함하는, EGFR 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Mig6 돌연변이를 포함하는, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명의 Mig6 segment 1&2 또는 segment 2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*) 및 segment 1 또는 segment 2 점 돌연변이(A353V)는 세포 내 EGFR 또는 돌연변이 EGFR 활성화를 억제하지 못하고, 종양 형성을 촉진하므로, EGFR 표적 항암제의 항암 약리 효과를 예측할 수 있는 바이오마커, 및 상기 특정 Mig6 돌연변이 발현 및 활성 억제를 통해 항암 활성을 나타낼 수 있다.

Description

Mig6 돌연변이를 포함하는, EGFR 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커{Biomarkers for predicting EGFR-targeted drug sensitivity, including Mig6 mutation}
본 발명은 특정 Mig6 돌연변이를 포함하는 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커, 이의 용도 및 상기 바이오마커를 이용한 EGFR 표적 약물 민감성 예측 방법에 관한 것이다.
폐암 및 대장암은 전 세계적으로 발병률과 사망률에서 가장 큰 비중을 가지고 있으며 대부분은 악성종양으로 5년 생존율이 15%를 넘지 못하고, 특히 사망하는 전체 암환자의 1/3은 폐암이 원인일 정도로 예후가 좋지 않다. 표피성장인자 수용체 (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor) 유전자 돌연변이 또는 단백질 과발현이 이들 종양의 유발 및 성장에 직간접적인 중요한 후천성 유전적 요인임이 보고되었으며, 이후 이들 암종에서 암유전체기반 환자 선별을 통한 EGFR 분자표적치료의 중요성이 크게 부각 되고 있다.
구체적으로, EGFR은 ErbB2, ErbB3, ErbB4 등과 함께 세포 표면에 존재하는 리셉터 타이로신 키나아제 (RTK, Receptor Tyrosine Kinase) 그룹의 단백질로 EGF, TGF-alpha, Epiregulin등의 여러 리간드에 의한 활성화를 통해 세포의 성장과 사멸에 관여하는 다양한 세포내 신호 전달에 중요한 역할을 한다.
EGFR 분자표적치료제를 통한 폐암 및 대장암 항암맞춤치료의 효용성은 이미 임상에서 충분히 증명되었으며, 이에 새로운 EGFR 분자표적치료제의 개발 및 임상적용을 위한 연구 개발이 현재 전 세계적으로 활발히 진행 중에 있다. 하지만, 3세대 EGFR-TKI를 포함한 현재 개발된 모든 EGFR 분자표적 약물의 항암 지속력은 EGFR의 돌연변이 등의 원인으로 인해 대부분의 환자에게 나타나는 내성 유발에 의해 매우 짧으며, 이러한 문제점은 유전체기반 항암개인맞춤을 통한 효과적 암환자 치료에 커다란 걸림돌로 작용하고 있다.
한편, Mig6는 세포내 활성화된 EGFR의 효소 기능을 저해하는 EGFR 음성 피드백(negative feedback) 조절 단백질이며, MAPK 신호전달에 의해서 단백질 발현 및 활성이 유도된다고 보고되어 있다. 또한, Mig6의 EGFR 활성화 억제 작용은 활성화된 EGFR의 효소작용에 의해 유도된 Mig6의 EGFR 결합부위 인산화(Y394/Y395)를 통해 이루어진다는 사실을 본 발명자의 선행연구를 통해 밝혀진바 있다. 다만, Mig6 다양한 돌연변이 및 이의 효과에 대해서는 현재까지 알려진 바 없다.
이에, 본 발명자들은 Mig6 돌연변이의 기능을 검증하기 위한 연구를 수행한 결과, Mig6 segment 1&2 또는 segment 2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*) 및 segment 1 또는 segment 2 점 돌연변이(A353V)는 세포 내 EGFR 뿐만 아니라 돌연변이 EGFR의 활성화를 억제하지 못하고, 종양 형성을 촉진하므로, EGFR 표적 항암제의 항암 약리 효과를 예측할 수 있는 중요한 바이오마커, 및 상기 특정 Mig6 돌연변이의 발현 및 활성 억제제를 항암치료 물질로서 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
Soo-Yeon Pakr et al., DNAJB1 negatively regulates Mig6 to promote epidermal growth factoer receptor signaling.(2015.08.01.) S Anastasi et al., The evolution consered EBR module of RALT/Mig6 mediates suppression of the EGFR catalytic activity.(2007.06.18.)
본 발명의 목적은 특정 Mig6 돌연변이를 포함하는 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커, 이의 용도 및 상기 바이오마커를 이용한 EGFR 표적 약물 민감성 예측 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Mig6 segment 1&2 또는 segment 2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*) 및 segment 1 또는 segment 2 점 돌연변이(A353V) 중 어느 하나 이상을 포함하는, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 피검물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 피검물질이 처리된 시료에서 Mig6 돌연변이의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 Mig6 돌연변이의 발현 또는 활성 수준이 무처리 대조군과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계는 포함하는, EGFR 표적 약물 민감도 예측 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 Mig6 돌연변이 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 Mig6 segment 1&2 또는 segment 2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*) 및 segment 1 또는 segment 2 점 돌연변이(A353V)는 세포 내 EGFR 뿐만 아니라, 돌연변이 EGFR의 활성화를 억제하지 못하고, 종양 형성을 촉진하므로, EGFR 표적 항암제의 항암 약리 효과를 예측할 수 있는 중요한 바이오마커, 및 상기 특정 Mig6 돌연변이 발현 및 활성 억제를 통해 항암 활성을 나타낼 수 있다.
도 1은 여러 암종에서 유래한 Mig6 돌연변이 중 선별된 돌연변이를 표시한 도이다.
도 2는 293T 세포주에서 Mig6 돌연변이의 EGFR 활성화 억제 효과를 웨스턴 블랏팅으로 확인한 도이다.
도 3은 293T 세포주에서 Mig6 돌연변이 및 정상 EGFR의 결합을 웨스턴 블랏팅을 통해 확인한 도이다.
도 4의 (A)는 Mig6 돌연변이 및 EGFR 동시 과발현 NIH-3T3 세포주에서 웨스턴 블랏팅 결과를, (B)는 콜로니 형성 분석 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 293T 세포주에서 Mig6 돌연변이 및 EGFR L858R의 결합을 웨스턴 블랏팅을 통해 확인한 도이다.
도 6은 ErbB2 돌연변이를 가지는 뇌종양 세포주에 과발현시킨 Mig6 돌연변이 효과를 확인한 도이다.
도 7은 ErbB2 돌연변이를 가지는 뇌종양 세포주에서 과발현시킨 Mig6 효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Mig6 돌연변이를 포함하는, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 바이오마커 조성물을 이용한 EGFR 표적 약물 민감성 예측은 하기 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 피검물질을 처리하는 단계; 및
2) 상기 피검물질이 처리된 시료에서 Mig6 돌연변이의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
3) 상기 Mig6 돌연변이의 발현 또는 활성 수준이 무처리 대조군과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계는 포함하는, EGFR 표적 약물 민감도 예측 방법.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 생물학적 시료는 종양 시료인 것이 바람직하고, 상기 종양 시료는 정상 EGFR 양성 또는 EGFR 돌연변이 양성 종양인 것이 바람직하다.
또한, 상기 방법에 있어서, 단계 2)에 피검물질의 EGFR 활성 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 상기 Mig6는 세포내 활성화된 EGFR의 효소 기능을 저해하는 EGFR 음성 피드백(negative feedback) 조절 단백질로, 하기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질일 수 있다.
[서열번호 1]
MSIAGVAAQE IRVPLKTGFL HNGRAMGNMR KTYWSSRSEF KNNFLNIDPI TMAYSLNSSA QERLIPLGHA SKSAPMNGHC FAENGPSQKS SLPPLLIPPS ENLGPHEEDQ VVCGFKKLTV NGVCASTPPL TPIKNSPSLF PCAPLCERGS RPLPPLPISE ALSLDDTDCE VEFLTSSDTD FLLEDSTLSD FKYDVPGRRS FRGCGQINYA YFDTPAVSAA DLSYVSDQNG GVPDPNPPPP QTHRRLRRSH SGPAGSFNKP AIRISNCCIH RASPNSDEDK PEVPPRVPIP PRPVKPDYRR WSAEVTSSTY SDEDRPPKVP PREPLSPSNS RTPSPKSLPS YLNGVMPPTQ SFAPDPKYVS SKALQRQNSE GSASKVPCIL PIIENGKKVS STHYYLLPER PPYLDKYEKF FREAEETNGG AQIQPLPADC GISSATEKPD SKTKMDLGGH VKRKHLSYVV SP
상기 Mig6 돌연변이는 서열번호 1로 기재된 Mig6 단백질에서 Mig6 E184*, Mig6 R286Qfs*7, Mig6 E384*, Mig6 S391*, Mig6 A353V, Mig6 H393R 및 Mig6 Y395del로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 상기 돌연변이가 아닐 경우, 구체적인 예로 Mig6 R202C, 즉 Mig6 단백질의 202번째 아미노산인 아르기닌(Arg. R)이 시스테인(Cys, C)로 돌연변이 될 경우, 정상 Mig6와 동일한 효과를 가지므로, 본 발명의 바이오마커로 사용될 수 없으므로, 본 발명의 바이오마커로는 Mig6 E184*, Mig6 R286Qfs*7, Mig6 E384*, Mig6 S391*, Mig6 A353V, Mig6 H393R 및 Mig6 Y395del를 사용하여야 한다.
또한, 상기 EGFR 돌연변이는 EGFR del19, EGFR del19/T790M, EGFR del19/T790M/C797S, EGFR L858R, EGFR L858R/T790M 및 EGFR L858R/T790M/C797S 및 Erb2 L755S로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 EGFR 돌연변이인 것이 바람직하다.
상기 본 발명의 Mig6 돌연변이는 정상 EGFR 뿐만 아니라 돌연변이 EGFR를 활성화하고, 종양을 유도하는 것이 바람직하다.
본 발명의 돌연변이를 검출할 수 있는 제제는 돌연변이된 유전자 부위를 증폭하여 검출하는데 필요한 제제를 의미하며, 해당 기술분야의 통상의 기술자 수준에서 유전자 증폭에 사용될 수 있는 제제들을 모두 포함하는 개념이다. 바람직하게는 중합효소연쇄반응(PCR)에 필요한 제제를 의미할 수 있으며, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 또는 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification), 노던 블롯(Northern blot), cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응 및 인 시투(in situ) 혼성화 반응일 수 있다.
또한, 돌연변이 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하여 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 특정 Mig6 돌연변이를 선별하고(도 1 참고), Quik Change site-directed mutagenesis (Agilent)를 이용한 다양한 Mig6 돌연변이 플라스미드 제작한 후, 염기서열 분석법으로 돌연변이가 만들어 진 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 293T 세포주에서 Mig6 돌연변이의 EGFR 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여, 293T 세포주에 정상 EGFR과 Mig6 돌연변이를 48 시간 동안 일시적으로 형질감염시켜 주었고, EGF 25ng/mL를 5 분 동안 처리한 후 진행한 결과, Mig6 segment 1&2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*)는 EGFR의 활성을 억제하지 못했고, Segment 2 (A353V, H393R, Y395del)에 존재하는 점 돌연변이들 또한 EGFR의 활성을 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 따라서, Mig6의 기능을 상실한 상기 특정 돌연변이는 세포 내 비이상적 EGFR 활성화를 억제하지 못하고, 결과적으로 종양 형성에 기여할 수 있음을 확인하였다(도 2 참고).
또한, 본 발명자들은 293T 세포주에서 일시적 형질감염 방법으로 정상 EGFR과 Mig6와의 결합 및 Mig6 돌연변이의 인산화를 확인하기 위하여, EGFR 및 Mig6 과발현 293T 세포주에서 EGF 25ng/mL 15분 처리한 조건으로 실험을 진행한 결과, 기능 상실 Mig6 돌연변이에서는 EGFR과의 결합이 유도되지 않고, Mig6의 인산화도 이루어지지 않은 것을 확인하였다(도 3 참고).
또한, 본 발명자들은 Mig6 돌연변이의 EGFR 활성화 억제 효과를 확인하기 위하여, EGFR 및 Mig6 과발현 NIH-3T3 세포주에서 EGF 10ng/mL 15 분 처리한 조건으로 실험 진행한 결과로 기능 상실 특정 돌연변이가 EGFR 활성을 억제하지 못함을 확인하였고(도 4(A) 참고), Mig6 돌연변이의 종양 형성 억제 효과를 확인하기 위하여 상기 조건으로 실험 진행 2 내지 3주 후 콜로니 형성 분석 방법을 수행한 결과로 기능 상실 Mig6 돌연변이가 콜로니 형성을 억제하지 못하고, 결과적으로 종양 형성에 기여할 수 있음을 확인하였다(도 4(B) 참고).
또한, 본 발명자들은 293T 세포주에서 일시적 형질감염 방법으로 돌연변이 EGFR의 활성 억제 및 Mig6와의 결합을 확인하기 위하여, 자가인산화 활성을 가지는 EGFR L858R 돌연변이에 기능상실 돌연변이(R286Qfs*7, H393R, Y395Del)와 대조군으로 기능을 수행하는 돌연변이(R202C) 이용해 293T 세포주에서 활성 억제 및 결합 여부를 확인 결과, 상기 기능 상실 돌연변이에서는 EGFR과의 결합 불능인 것을 확인하였다(도 5 참고).
또한, 본 발명자들은 Mig6 과발현 뇌종양 세포의 성장 억제 효과를 확인한 결과, 정상 Mig6은 뇌종양 세포의 성장을 억제하였으나, 기능상실 돌연변이 (R286Qfs*7, H393R, Y395del)에서는 세포의 성장이 억제되지 못하였음을 확인하였다. 따라서, Mig6 돌연변이가 암 환자에서 존재할 때, 정상 Mig6가 발현하고 있을 때 보다 종양 형성이 촉진됨을 확인하였다(도 6 참조).
아울러, 본 발명자들은 뇌종양 세포에서 돌연변이 EGFR 및 Mig6 사이의 상호작용을 확인한 결과, 돌연변이 EGFR의 활성으로 뇌종양 세포주의 종양이 형성되고, 돌연변이 EGFR 및 Mig6의 상호작용을 통해 Mig6 과발현으로 활성화된 EGFR 돌연변이를 억제하는 것을 확인하였다(도 7 참조).
따라서, 본 발명의 Mig6 segment 1&2 또는 segment 2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*) 및 segment 1 또는 segment 2 점 돌연변이(A353V)는 세포 내 EGFR 뿐만 아니라 돌연변이 EGFR 활성화를 억제하지 못하고, 종양 형성을 촉진하므로, EGFR 표적 항암제의 항암 약리 효과를 예측할 수 있는 중요한 바이오마커로 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 Mig6 돌연변이 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 Mig6 돌연변이 발현 억제제는 Mig6 돌연변이 유전자에 상보적으로 결합하는 shRNA, siRNA, 리보자임 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, Mig6 돌연변이 활성 억제제는 Mig6 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
한편, 상기 Mig6 돌연변이 단백질의 활성 억제제, 구체적으로 Mig6 segment 1&2 또는 segment 2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*) 및 segment 1 또는 segment 2 점 돌연변이(A353V) 단백질의 특이적으로 결합하여 Mig6 돌연변이 단백질 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 Mig6 돌연변이 단백질의 아미노산 서열을 기초로 당업자가 용이하게 제작할 수 있다.
또한, 상기 암은 EGFR 돌연변이를 갖는 암인 것이 바람직하고, 상기 암은 상기 암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, EGFR 내성암인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 Mig6 segment 1&2 또는 segment 2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*) 및 segment 1 또는 segment 2 점 돌연변이(A353V)는 세포 내 EGFR 또는 돌연변이 EGFR 활성화를 억제하지 못하고, 종양 형성을 촉진하므로, Mig6 돌연변이 발현 억제제 또는 활성 억제제는 암, 특히 EGFR 내성 암 예방 및 치료용 조성물로 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 암 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 구체적인 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 Mig6 특정 돌연변이의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 구체적으로 약 1 ng/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> Mig6 돌연변이 재조합 플라스미드 제작
<1-1> Mig6 돌연변이 선별
Mig6 돌연변이와 종양 유발의 연관성을 규명하기 위하여, TCGA 및 COSMIC 데이터베이스를 통해 다양한 종양에 존재하는 Mig6 돌연변이를 선별하였다. 이때 총 27개의 암종에 존재하는 102종의 Mig6 돌연변이 중 2회 이상 반복적으로 발견되는 15종, 및 주요한 발암 유전자로 알려진 BRAF, KRAS, NRAS, HRAS, EGFR 및 PIK3CA와 함께 발견되는 Mig6를 제외한 11종의 돌연변이를 선별하고, 이와 함께, 기능적으로 중요한 Mig6 segment 1, 2부분에 존재하는 19종의 돌연변이 중 2회 이상 발견되는 돌연변이 1종, 및 1회 발견되었지만 기능적으로 중요한 4종의 돌연변이를 추가로 선별하여, 총 15종의 Mig6 segment 1＆2 도메인이 결실된 돌연변이 및 Mig6 segment 1＆2 부분에 존재하는 점 돌연변이가 최종 선별된 것을 확인하였다(도 1).
<1-2> tag이 융합된 재조합 Mig6 cDNA
Human Mig6를 발현하는 재조합 플라스미드를 제작하기 위해 PCR (polymerase chain reaction)을 이용해 pCMV5-Mig6 vector를 주형으로 하여 cDNA를 증폭하였다. 이때 cDNA의 5’말단에는 BamHⅠ(GGATCC)과 MYC tag (MEQKLISEEDL)를, 3’말단에는 SalⅠ (GTCGAC)을 증폭시키는 프라이머 (2 Forward 5’- ACCGGATCCATGGAACAAAAACTCATCT CAGAAGAG, 1 Forward 5’ - TCAGAAGAGGATCTGCTCGAGATGTCAATA-3’와 reverse 5’- GCGGCCGGCCTAGGTACCTTGTTTTTGAG-3’)를 이용하여 tag-MYC이 융합된 Mig6 cDNA를 증폭하였다. PCR 진행 후 PCR 생성물과 primer 및 PCR reagent는 gel purification을 통해 1.5kb 부분의 Mig6 PCR 생성물만을 잘라낸 뒤 Qiagen gel purification kit를 사용해 분리하였고, 생성된 tag이 달린 PCR 생성물의 서열은 염기서열분석법(Sanger sequencing)으로 확인하였다.
<1-3> Cloning 방법을 이용한 재조합 Mig6 플라스미드 제작
상기 <1-2>에서 염기서열 분석법으로 확인한 tag-MYC이 달린 Mig6 cDNA를 사용해 pBabe puro vector (addgene)에 재조합 플라스미드 (pB(p)MYC-Mig6)를 제작하였다. 증폭된 PCR 생성물에 BamHⅠ(NEB #R3136)과 SalⅠ (NEB #R3138S) 제한효소 처리를 37℃에서 16시간 동안 진행하고 gel purification을 통해 제한효소 처리된 PCR 생성물만 정제하였고, 주형이 되는 pBabe puro vector도 마찬가지로 같은 제한효소 처리 후 self-ligation을 막기 위해 Alkaline phosphatase (NEB #M0371S)를 37℃ 1시간 처리해 주었다. 이후, Vector와 cDNA를 1:3 비율로 1.5mL epppendorf tube에 넣어주고 T4 ligase(NEB #M0202S)를 사용하여 ligation을 진행하고 재조합이 이루어진 Mig6 플라스미드를 제작하였다. 만들어진 플라스미드는 전기영동 방법과 염기서열 분석법으로 확인하였다.
<1-4> Quik Change site-directed mutagenesis (Agilent)를 이용한 돌연변이 플라스미드 제작
Agilent 사이트에서 제공하는 방법으로 돌연변이를 제작하기 위한 프라이머 15쌍을 제작하고, pB(p)MYC-Mig6 플라스미드를 이용해 Mig6 돌연변이 5종을 제조하였다. Agilent에서 제공하는 PCR 조건으로 실험 진행하였고, 생성된 돌연변이 플라스미드를 제외한 PCR 시 주형으로 사용되었던 플라스미드를 제거하기 위해 DpN1 1㎕ 넣고 효소 처리를 37℃에서 1시간 동안 진행하였다. 주형을 제거한 mutagenesis 생성물을 이용하여 DH5α competent cell 50㎕에 β-mercaptoethanol 2㎕와 Mig6 돌연변이 플라스미드 2.5㎕를 넣고 얼음 위에서 30분 incubation 후 42℃에서 1분, 다시 얼음 위에서 30분 incubation 한 뒤, 항생제가 들어있지 않은 LB broth 배지 450㎕을 넣고 37℃ 220rpm 조건으로 1시간 동안 incubation 하였다. 그 뒤 agar 고체배지에서 37℃, 16시간 동안 incubation 진행하는 방법으로 transformation을 진행하여 단일 콜로니를 수득하였다. 얻어진 콜로니를 액체배지에서 배양 후 DNA를 추출하였고, 염기서열 분석법으로 돌연변이가 만들어진 것을 확인하였다.
<실시예 2> Mig6 돌연변이 재조합 플라스미드 제작
상기 <실시예 1>에서 제조한 플라스미드를 이용해 Mig6가 과발현된 세포를 제작하였다.
구체적으로, 바이러스를 이용해 플라스미드를 운반하기 위해서 293T 세포주에 일시적인 형질 감염(Transient transfection) 방법으로 바이러스를 제조하였다. Opti-MEM 배지 750㎕에 X-treme gene 9 24㎕과 virus packing gene (Addgene, mouse 세포에 레트로바이러스로 감염시킬 경우 pCL-eco 4㎍을, human 세포에 렌티바이러스를 감염시킬 경우 pSPAX2 2㎍ + pMD2G 2㎍을 사용) 4㎍, 유전자 발현 플라스미드 4㎍을 넣고 30분 상온에서 incubation 한 뒤 바이러스 만들기 전 5×106 개의 293T 세포주를 배양해 둔 10cm plate에 분주해 주었다. 일시적인 형질 감염 24시간 후 새로운 배지 10mL로 교체해 주고, 또 다시 24시간 뒤 바이러스를 회수하였다. 이때 바이러스와 세포를 걸러주기 위해서 바이러스만 통과할 수 있는 0.45μm pore 필터로 바이러스를 걸러주고, 293T 세포에는 새로운 배지 10mL을 넣고 생성되지 않은 바이러스를 추가로 회수하기 위해 24시간 뒤 같은 방법을 반복하였다. 이후 만들어진 바이러스는 -80℃에서 보하였고, 만들어진 바이러스를 이용하여 3×106 개의 NIH-3T3 (Korean Cell Line Bank) 세포를 배양해 둔 10cm plate에 먼저 pB(p)MYC-Mig6 바이러스 6mL과 polybrene 10㎍/mL을 함께 넣고 37℃에서 16시간 동안 감염시키는 방법으로 총 2회 감염을 진행하였고, puromycin 2㎍/mL 농도로 감염이 되지 않은 세포를 제거해 주어 NIH-3T3 Mig6 과발현 세포주를 만들어 주었고, Mig6 과발현 세포주에 같은 방법으로 pB(h)EGFR-WT vector 바이러스를 감염시켜주었다. pB(h)EGFR-WT의 경우에는 발현하는 양을 조절하기 위해 1회만 감염시킨 뒤 hygromycin 500㎍/mL 농도로 감염되지 않은 세포를 제거해 주었다. Human 세포인 뇌종양 세포(LN229)에는 pLX302 Mig6 vector와 pMD2G, pSPAX2 vector를 이용해 렌티바이러스를 만들고, 바이러스를 배지와 1/2로 희석 후 4시간 1번 감염하는 방법으로 과발현 세포주를 제작하였고, 감염 여부는 마찬가지로 항생제인 puromycin으로 감염된 세포만을 분별해 주었다.
<실험예 1> 293T 세포주에서 Mig6 돌연변이의 EGFR 활성화 억제 확인
Mig6 돌연변이 단백질의 활성화 억제 여부를 Mig6 돌연변이가 EGFR의 활성을 조절하는지 알아보기 위해 293T 세포주에 정상 EGFR과 Mig6 돌연변이 및 대조군으로 사용될 정상 Mig6와 Y394F/Y395F 돌연변이를 일시적 형질감염(transient transfection) 방법으로 동시 발현시켜 활성된 EGFR과 EGFR의 하위 신호 체계인 pStat5 및 Mig6의 기능을 확인하였다.
구체적으로, 6-well culture pate에 5×106 개의 293T 세포주를 배양하였다. 다음날 1.5ml tube에 Mig6 돌연변이 플라스미드 1.75㎍과 정상 EGFR 플라스미드 0.25㎍, transfection reagent인 fugene 6 6㎕를 optimem 배지 100㎕속에 첨가 후 20분 반응시킨 뒤 293T 세포주에 처리하였다. 총 48시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 조건의 배양기에서 반응 진행하였으며, 32시간째 혈청을 첨가하지 않은 배지로 교체해 혈청 속 요소들에 의한 실험 조건 변화 요인을 배제하였다. 세포 용출액을 얻기 전 5분 동안 EGFR의 리간드인 EGF 25ng/㎕를 처리해 준 뒤 용출액을 추출하였다.
세포 용출액은 RIPA buffer에 phosphatase inhibitors (Sodium orthovanadate, BGP)와 protease inhibitors(Aprotinin, Leupeptin, PMSF)를 이용하여 제작하였다. 이후 SDS-PAGE를 진행하였고, 러닝 과정은 젤 1개 당 25mA로 95분 동안 진행하였으며, 젤에 있는 단백질을 nitrocellulose membrane으로 옮기는 과정은 100V에서 120분 동안 진행하였다. 그 후 nitrocellulose membrane을 5% skim milk로 상온에서 1시간 동안 blocking 진행하고, 1차 항체를 4℃ 조건에서 16시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응 후 TBST buffer (Tris Buffered Saline + Tween 20)로 10분씩 3회 wash 진행해 주었고, 2차 항체 반응을 상온에서 1시간 진행하였다. 마찬가지로 2차 항체 반응 후 TBST로 3회 wash 시켜준 후 단백질 발현을 ECL solution (Enhanced Chemiluminescence)을 이용하여 1분 동안 membrane과 반응한 뒤 CheBi detector를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 모든 Mig6 segment 1&2 결실 돌연변이(E184*, R286Qfs*7, E384*, S391*)는 EGFR의 활성을 억제하지 못했고, Segment 2 (A353V, H393R, Y395del)에 존재하는 점 돌연변이들 또한 EGFR의 활성을 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
따라서, Mig6의 기능을 상실한 돌연변이는 세포 내 비이상적 EGFR 활성화를 억제하지 못하고, 결과적으로 종양 형성에 기여할 수 있음을 확인하였다(도 2).
<실험예 2> 293T 세포주에서 일시적 형질감염 방법으로 정상 EGFR과 Mig6 돌연변이와의 결합 및 Mig6 돌연변이의 인산화 확인
상기 <실험예 1>에서 Mig6 돌연변이가 EGFR 활성을 억제하지 못하는 결과와 관련하여, EGFR과 Mig6 돌연변이의 결합 및 Mig6 돌연변이 인산화 여부가 EGFR 활성 억제 여부에 영향을 미치는지 알아보기 위해 293T 세포주에 정상 EGFR과 Mig6의 각 돌연변이를 동시 과발현시킨 후, 세포 용출액을 이용하여 면역침강법을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 293T 세포주에 EGFR과 Mig6 돌연변이를 동시 과발현 시켰다. 이후 15분 동안 EGF 25ng/㎕를 처리해 준 뒤 세포용출액을 획득한 다음 EGFR에 달린 Tag-HA로 면역침강법을 진행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 기능 상실 Mig6 돌연변이는 EGFR과의 결합이 유도되지 않는 것을 확인하였다. 또한 Mig6의 인산화를 확인할 수 있는 항체 (p-Mig6)로 인산화 여부를 확인한 결과, Y394F/Y395F 돌연변이의 인산화가 이루어지지 않은 것을 확인하였다.
따라서, Mig6의 EGFR 활성 억제 기능 수행을 위해서는 Mig6와 EGFR의 결합 및 인산화가 필요하다는 결과를 확인하였다(도 3).
<실험예 3> NIH3T3 세포주에서 Mig6 돌연변이의 EGFR 활성화 및 종양 형성 억제 확인
<3-1> 웨스턴 블랏팅을 이용한 NIH3T3 세포주에서 Mig6 돌연변이의 EGFR 활성화 억제 확인
상기 <실험예 1>의 결과를 검증하기 위하여 NIH-3T3 세포주에 EGFR과 Mig6의 각 돌연변이를 동시 과발현시킨 후, 세포 용출액을 이용해 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
구체적으로, <실시예 2>에서 개시한 바와 같이 EGFR과 Mig6를 동시 과발현하는 세포주를 제작한 후, 10cm cell culture plate에 세포를 배양하고 2일 뒤 혈청을 빼준 배지로 약 16시간 동안 교체해주었다. 이후 EGF 10ng/ml을 15분 동안 처리해 준 후 상기 <실험예 1>에 기술한 바와 마찬가지로 세포 용출액을 제작하고 웨스턴 블랏팅을 진행하였다.
그 결과, 도 4(A)에 나타낸 바와 같이 EGFR의 활성을 억제하지 못하는 Mig6 돌연변이가 NIH-3T3 세포주 모델에서도 EGFR 활성을 억제하지 못하는 것을 확인하였다(도 4(A)).
<3-2> 콜로니 형성 분석 방법을 이용한 NIH3T3 세포주에서 Mig6 돌연변이의 종양 형성 억제 확인
상기 <실험예 1>의 결과를 검증하기 위하여 NIH-3T3 세포주에 EGFR과 Mig6의 각 돌연변이를 동시 과발현시킨 후, <실시예 3>의 방법에 따라 EGF 10ng/ml을 처리하고 2 내지 3주 후 콜로니 형성 분석 방법을 수행하였다.
구체적으로, 콜로니 형성 분석 실험은 Select agar powder (invitrogene #30391-023)를 이용한 soft agar assay로 진행되었으며, ddH20 (double-distilled water) 50㎖에 selet agar 2.5g을 넣어 5% 농도로 만들어준 뒤 120℃에서 20분 동안 멸균 후 사용하였다. 실험 전 고체상태의 agar를 55℃의 항온수조에 넣어 액체상체로 굳지 않도록 유지시키고, agar와 함께 사용할 배지도 50㎖ 튜브에 옮겨 55℃로 온도를 유지하였다. 상기 5% agar와 배지를 섞어 제조한 0.5% agar를 bottom agar로 사용하기 위하여, 6-well culture pate에 2㎖씩 1조건당 3개의 well에 분주하였고, agar가 굳도록 상온에서 40분간 보관하였다. 또한 5% agar와 배지를 섞어 제조한 0.4% agar를 top agar로 사용하였으며, 37℃로 온도를 낮춘 다음 45,000개의 세포와 3.5㎖의 top agar를 섞고 agar가 굳기 전 상기 bottom agar 위에 1㎖씩 3개의 well에 분주하였으며, 실험 조건에 따라 세포와 함께 리간드를 처리하기도 하였다. 이후 top agar가 완전히 굳으면 5% CO2 조건의 37℃ 배양기에서 약 2 내지 3주 동안 배양한 다음 해부현미경을 이용하여 콜로니 수를 분석하고, Image J (NIH) 프로그램을 통하여 콜로니 수를 분석하고 상대적인 비율로 계산하였다.
그 결과, 도 4(B)에 나타낸 바와 같이 EGFR의 활성을 억제하지 못하는 Mig6 돌연변이가 NIH-3T3 세포주 모델에서도 콜로니 형성을 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
따라서, Mig6 기능을 상실한 돌연변이는 콜로니 형성을 억제하지 못하고, 결과적으로 종양 형성에 기여할 수 있음을 확인하였다(도 4(B)).
<실험예 4> 293T 세포주에서 일시적 형질감염 방법으로 돌연변이 EGFR의 활성 억제 및 Mig6와의 결합 확인
정상 EGFR에서만이 아닌, 돌연변이 EGFR에도 여전히 정상 Mig6는 기능을 억제하고, 돌연변이는 억제 기능을 수행하지 못하는지 확인하기 위하여, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 293T 세포주를 이용하여 실험을 진행하였다. 정상 EGFR로 진행 한 실험과 마찬가지로 EGFR L858R과 Mig6 돌연변이 중 억제하지 못하는 돌연변이(R286Qfs*7, H393R, Y395Del)와 비교군으로 사용될 기능을 수행하는 돌연변이(R202C)를 가지고 실험을 진행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 293T 세포주에 EGFR L858R과 Mig6 돌연변이를 동시 과발현 시켰다. 이후 NP40 buffer(50mM Tris-HCl pH7.4, 1% NP-40, 140mM NaCl, 5mM EDTA)로 같은 phosphatase inhibitor와 protease inhibitor를 넣고 세포용출액을 획득하였다. 세포용출액 1000㎍에 1차 항체 3㎕와 protein A-agarose bead 35㎕를 넣고 11rpm, 4℃ 조건에서 16시간 동안 면역침강법을 진행하였고, 16시간 후 4000rpm으로 1분 동안 원심분리를 진행해 bead만 분리해 주고, 상층액은 제거해 준 뒤 NP40 buffer 1mL로 washing 과정을 수행하였다. Washing 과정은 5회 진행해 주었다. Bead에서 NP40 buffer를 완전히 제거해 준 뒤, 2XSDS를 35㎕ 넣고 100℃에서 7분간 열을 가해 주었다. 그 후 SDS-PAGE를 진행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 L858R 돌연변이도 정상 Mig6에 의해서 활성이 억제되는 것을 확인하였고, 정상 EGFR에서 기능하지 못했던 Mig6 돌연변이도 L858R에서 마찬가지로 기능하지 못함을 확인하였다. 또한 EGFR L858R과의 결합 역시 기능 상실 Mig6 돌연변이는 불가하다는 것을 확인하였다. 반면에 비교군으로 사용된 기능을 수행하는 돌연변이(R202C)는 L858R 돌연변이에서도 Mig6가 활성을 억제함을 확인하였다.
상기 실험을 통해 정상 EGFR 뿐만 아니라 돌연변이 EGFR 역시 Mig6가 활성을 억제할 수 있다는 것과, 기능 상실 돌연변이 Mig6는 정상 EGFR 뿐만 아니라 돌연변이 EGFR도 억제하지 못한다는 결과를 확인하였다(도 5).
<실험예 5> Mig6 과발현 뇌종양 세포의 성장 억제 효과 확인
EGFR의 ErbB 그룹의 일부인 ErbB2에 L755S 돌연변이를 가지는 LN229 뇌종양 세포주에 Mig6를 과발현 시킨 후 세포성장을 비교하였다.
구체적으로 LN229 세포주에 상기 <실시예 2>에서 개시한 바와 같이 Mig6 과발현 세포주를 제작하였다. 이후 6-well culture plate에 이들 세포주를 배지 2ml(DMEM+10%FBS+1% P/S) 2ml에 20,000개씩 3개의 well에 분주하고 EGF 리간드를 10ng/mL 농도로 처리한 뒤 3일 간격으로 세포 수를 측정하였다. 1개의 well 당 2회씩 총 1가지 조건당 6번 세포 수를 측정하였고, 3일마다 배지와 EGF를 교체해 주었다. 세포의 수는 Cell counter를 이용해 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 결과, Mig6 돌연변이 R202C는 정상 Mig6 와 유사한 세포 성장을 보이며 대조군(Luciferase)에 비해 세포 성장이 억제된 것을 확인하였다. 반면에, 기능상실 돌연변이 (R286Qfs*7, H393R, Y395del)에서는 세포의 성장이 억제되지 못하였음을 확인하였다.
따라서, Mig6 돌연변이가 암 환자에서 존재할 때, 정상 Mig6 가 발현하고 있을 때 보다 종양 형성이 촉진되는 것을 확인하였다(도 6).
<실험예 6> Mig6 과발현 뇌종양 세포에서 EGFR 및 Mig6 사이의 상호작용 확인
ErbB2 L755S 돌연변이를 가지는 LN229 뇌종양 세포주에서 Mig6에 의한 ErbB2 경로 활성 억제 및 세포 증식 억제 능력이 ErbB2 및 Mig6 사이의 상호작용에 의한 것인지 확인하기 위하여, 293T 세포주를 이용하여 실험을 진행하였다.
구체적으로, 293T 세포주에 pLX-ErbB2 L755S 플라스미드와 정상 Mig6 및 돌연변이 Mig6를 일시적 형질 감염 방법으로 발현시킨 후 두 물질간 상호작용을 면역 침강법을 이용을 진행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 ErbB2 L755S 돌연변이도 정상 Mig6에 의해서 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 반면에 비교군으로 사용된 기능을 수행하는 돌연변이(R202C)를 제외한 기능 상실 돌연변이(R286Qfs*7, H393R, Y395del)에서는 ErbB2와 Mig6간 상호작용이 이루어지지 않는 것을 확인하였다.
상기 실험을 통해 LN299 세포주에서 Mig6를 과발현 시켰을 때 ErbB2 및 Mig6 사이의 상호작용을 통해 경로의 활성이 억제되어 종양 형성 능력이 감소할 수 있다는 것과, 기능 상실 돌연변이 Mig6는 293T 세포주에서 ErbB2의 활성을 억제하지 못한다는 결과를 확인하였다
따라서, ErbB2의 활성으로 LN229 뇌종양 세포주의 종양이 형성되며, ErbB2 및 Mig6 사이의 상호작용을 통해 Mig6의 과발현으로 활성된 ErbB2를 억제하는 것을 확인하였다(도 7).
결론적으로, 본 발명은 Mig6 돌연변이가 EGFR과의 결합 또는 Y394F/Y395F 돌연변이의 인산화 불능으로 인하여 EGFR의 활성화를 효과적으로 억제하지 못하고, 이러한 Mig6 돌연변이를 포함하는 세포가 EGFR 활성화를 촉진시켜 종양 형성을 유도할 수 있음을 확인함으로써, 특정 Mig6 돌연변이가 EGFR의 활성화 유도, 즉 EGFR 표적 항암제의 항암 약리 효과를 예측할 수 있는 바이오마커, 및 상기 특정 Mig6 돌연변이 발현 및 활성 억제를 통해 항암 활성을 나타낼 수 있다.

Claims (17)

  1. Mig6 돌연변이를 포함하는, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 표적 약물 민감성 예측용 바이오마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 Mig6는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 Mig6 돌연변이는 Mig6 E184*, Mig6 R286Qfs*7, Mig6 E384*, Mig6 S391*, Mig6 A353V, Mig6 H393R 및 Mig6 Y395del로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 EGFR는 EGFR 돌연변이인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 EGFR 돌연변이는 EGFR del19, EGFR del19/T790M, EGFR del19/T790M/C797S, EGFR L858R, EGFR L858R/T790M 및 EGFR L858R/T790M/C797S 및 ErbB2 L755S로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 Mig6 돌연변이는 EGFR를 활성화하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 Mig6 돌연변이는 종양을 유도하는 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  8. 1) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 피검물질을 처리하는 단계; 및
    2) 상기 피검물질이 처리된 시료에서 Mig6 돌연변이의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 상기 Mig6 돌연변이의 발현 또는 활성 수준이 무처리 대조군과 비교하여 감소된 피검물질을 선별하는 단계는 포함하는, EGFR 표적 약물 민감도 예측 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 단계 1)의 생물학적 시료는 종양 시료인 것을 특징으로 하는, EGFR 표적 약물 민감도 예측 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 종양 시료는 EGFR 돌연변이 양성 종양인 것을 특징으로 하는, EGFR 표적 약물 민감도 예측 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 발현 수준은 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase ChainReaction), 노던 블롯(Northern blot), cDNA 마이크로어레이 혼성화 반응 및 인 시투(in situ) 혼성화 반응으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는, EGFR 표적 약물 민감도 예측 방법.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 활성 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는, EGFR 표적 약물 민감도 예측 방법.
  13. Mig6 돌연변이 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 Mig6 돌연변이 발현 억제제는 Mig6 돌연변이 유전자에 상보적으로 결합하는 shRNA, siRNA, 리보자임 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 Mig6 돌연변이 활성 억제제는 Mig6 돌연변이 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 암은 EGFR 돌연변이를 갖는 암인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 암은 상기 암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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S Anastasi et al., The evolution consered EBR module of RALT/Mig6 mediates suppression of the EGFR catalytic activity.(2007.06.18.)
Soo-Yeon Pakr et al., DNAJB1 negatively regulates Mig6 to promote epidermal growth factoer receptor signaling.(2015.08.01.)

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