KR20230019108A

KR20230019108A - 안구건조증 치료용 마이크로에멀젼

Info

Publication number: KR20230019108A
Application number: KR1020227042500A
Authority: KR
Inventors: 파비오 카를리; 엘리자베타 치엘리니; 미란 바로니안
Original assignee: 아자드 파르마 아게
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2021-05-31
Publication date: 2023-02-07
Also published as: AU2021285002A1; EP4161485A1; IL297798A; JP2023528633A; CA3185022A1; US20230355522A1; BR112022024295A2; EP3919047A1; WO2021245001A1; CN115666518A

Abstract

본 발명은 안구건조증의 치료와 같은 안구 적용에 특히 적합한 마이크로에멀젼에 관한 것으로서, 이는 적어도 하나의 오일 성분, 수성상, 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제, 적어도 하나의 폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체, 및 적어도 하나의 가교제를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로에멀젼의 제조 방법, 및 안구 적용에서 또는 담체로서 이의 용도에 관한 것이다.

Description

안구건조증 치료용 마이크로에멀젼

본 발명은 안구건조증 (dry eye syndrome)의 치료와 같은 안구 적용에 특히 적합한 마이크로에멀젼 (microemulsion)에 관한 것으로서, 이는 적어도 하나의 오일 성분, 수성상, 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제, 적어도 하나의 폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체, 및 적어도 하나의 가교제를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로에멀젼의 제조 방법, 및 안구 적용에서 또는 담체로서 이의 용도에 관한 것이다.

눈 자극, 건조, 분비물, 이물감 및 시야 흐림과 같은 증상과 관련된 안구건조증 (DES)은 전 세계 인구의 최대 34%에 영향을 미치고 있다. 적절한 치료를 하지 않으면, 만성 DES 병태는 점상 상피 미란 (punctate epithelial erosion) 및 결막 흉터발생으로 안구 표면의 손상을 초래할 수도 있다.

DES의 경미한 증상은 수중유 에멀젼과 같은 인공 눈물을 적용하여 이물감 등을 개선하여 치료할 수 있다. 그러나, 이들 조성물에 존재하는 양이온성 계면활성제 및/또는 보존제는 그 자체가 눈 자극을 유발하는 것으로 의심된다.

DES가 더 심각하게 진행되면 면역억제제이고 눈물액의 생성을 증가시키는 사이클로스포린 A, 또는 인테그린 길항제이고 눈 염증을 감소시키는 리피테그라스트 (lifitegrast)와 같은 활성제를 포함하는 조성물을 적용하여 치료할 수 있다. 그러나, 약물을 장기간 사용하면 의도하지 않은 부작용이 발생할 수 있으며, 환자의 순응도가 낮아질 수 있다.

최근에, 수성 매질 중에 분산된 미세화된 오일 액적을 포함하는 마이크로에멀젼이 DES의 치료와 같은 안구 적용을 위한 유망한 제제인 것으로 밝혀졌다.

EP 3 409 268은 안과적으로 허용 가능한 오메가-3 지방산 함유-오일, 친수성 계면활성제, 소수성 비-공블록 계면활성제 및 물을 포함하는 안과용 수중유 에멀젼을 개시하며, 상기 수중유 에멀젼 조성물은 평균 입자 크기가 직경 1 μm 미만이다. 친수성 계면활성제는 약학적 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 계면활성제, 즉 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성 또는 비-이온성 계면활성제일 수 있다. 추가 성분은 사이클로스포린 A와 같은 활성제, 및 폴리헥사메틸렌 비구아나이드 (PHMB)와 같은 보존제일 수 있다.

WO 2019/036625는 물, 및 다양한 오일 및 이의 유도체로부터 선택된 소수성 성분의 치료적으로 유효한 농도를 포함하는, 포유동물의 눈을 치료하기 위한 조성물을 개시한다. 상기 조성물을 안정화시키기 위해, 유효량의 보존제 성분, 예컨대 벤잘코늄 클로라이드 (BAK)를 포함한다.

이온성 계면활성제, 자극성 보존제 또는 활성제와 같은 안과용 조성물에서 (잠재적으로) 중요한 성분들의 통상적인 적용을 고려할 때, 유해 성분들의 존재를 최소화하거나 또는 방지하는 개선된 약학적 제제를 제공하는 동시에, 우수한 DES 치료 특성을 제공하는 것이 시급하다.

따라서, 본 발명의 목적은 안구건조증 치료에 특히 적합하고 상기 논의된 문제를 극복하는 약학적으로 허용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.

놀랍게도 적어도 하나의 오일 성분, 수성상, 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제, 적어도 하나의 폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체, 및 적어도 하나의 가교제를 포함하는 마이크로에멀젼은 DES에 대한 강력한 활성을 발휘하면서, 예를 들어 이온성 화합물 예컨대 이온성 계면활성제, 또는 안구-자극 활성제 및 보존제의 불리한 적용을 회피하는 것을 발견하였다. 하기에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 마이크로에멀젼은 높은 보관 수명, 개선된 습윤 및 커버리지 (coverage) 특성, 뿐만 아니라 우수한 안구 내약성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 제1 양상은 하기를 포함하는, 마이크로에멀젼에 관한 것이다:

i. 적어도 하나의 오일 성분,

ii. 수성상,

iii. 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제,

iv. 적어도 하나의 폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체, 및

v. 적어도 하나의 가교제.

상기 적어도 하나의 오일 성분 (i)은 수불용성이다. 본원에서 사용된, 용어 "수불용성 (insoluble in water)"은 20℃에서 2.0 g/l 미만, 바람직하게는 0.5 g/l 미만, 보다 바람직하게는 0.2 g/l의 수중 용해도를 의미한다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 적어도 하나의 오일 성분은 지방산 및 지방산 에스테르, 특히 불포화 지방산 및 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

보다 바람직한 일 구체예에서, 상기 적어도 하나의 오일 성분은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다:

- 지방산 트리글리세리드, 예컨대 글리세릴 트리카프레이트, 글리세릴 트리라우레이트, 글리세릴 트리리놀레에이트, 식물 또는 동물 유래의 천연 오일, 예컨대 올리브 오일, 참깨 오일, 해바라기 오일, 대두유, 캐스터 오일, 피마자유 (ricinus oil), 옥수수 오일 및 어유 (fish oil), 그러나 이에 한정되지 않음;

- 지방산 디글리세리드, 예컨대 프로필렌 글리콜 카프릴레이트, 프로필렌 글리콜 카프레이트, 디올레인, 디리놀레에이트, 그러나 이에 한정되지 않음;

- 지방산 모노글리세리드, 예컨대 모노올레인, 모노팔미톨레인, 모노미리스톨레인, 그러나 이에 한정되지 않음;

- 1가 알코올의 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 그러나 이에 한정되지 않음;

- 지방산, 예컨대 올레산, 리놀레산, 어유, 그러나 이에 한정되지 않음;

및 이들의 혼합물.

본원에서 사용된 "지방산 (Fatty acid)"은 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 선택적으로 치환된 탄화수소를 의미하며, 이는 적어도 8개, 바람직하게는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 12개, 보다 바람직하게는 적어도 14개, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 16개, 가장 바람직하게는 적어도 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 최대 34개의 탄소 원자를 가지며, 카복실산 관능기를 갖는다.

본원에서 사용된, 용어 "불포화 (unsaturated)"는 적어도 단일불포화 화합물, 즉 적어도 하나의 다중 결합, 예컨대 이중 결합 또는 삼중 결합, 바람직하게는 이중 결합을 갖는 화합물을 의미한다.

바람직한 일 구체예에서, "1가 알코올 (monohydric alcohol)"은 C_1-8 1가 알코올, 바람직하게는 C_1-5 1가 알코올, 가령 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올이다. 특히, 1가 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올이고, 더욱 바람직하게는 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올이고, 가장 바람직하게는 에탄올 및 이소프로판올이다.

본원에서 사용된, 용어 "지방산 (모노-, 디- 또는 트리-)글리세리드"는 글리세롤의 1개, 2개 또는 3개의 하이드록시 기가 선택적으로 수소화된 합성 또는 천연 지방산(들)에 의해 에스테르화 및/또는 에테르화되는 화합물을 지칭하며, 글리세롤의 남아있는 하이드록시 기 (존재하는 경우)는 미반응 상태로 남을 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 오일 성분 (i)은 지방산 트리글리세리드, 지방산, 1가 알코올의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 불포화 지방산 트리글리세리드, 지방산, 1가 알코올의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 오일 성분 (i)은 지방산, 1가 알코올의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 불포화 지방산, 1가 알코올의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 오일 성분 (i)은 1가 알코올의 지방산 에스테르, 지방산 트리글리세리드 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 1가 알코올의 불포화 지방산 에스테르, 지방산 트리글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 오일 성분 (i)은 지방산, 지방산 트리글리세리드 및 이들의 혼합물, 바람직하게는 불포화 지방산, 지방산 트리글리세리드 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 오일 성분 (i)은 적어도 하나의 1가 알코올의 지방산 에스테르, 바람직하게는 적어도 하나의 1가 알코올의 불포화 지방산 에스테르이다.

일 구체예에서, 오일 성분은 지방산 트리글리세리드 또는/및 지방산 디글리세리드 또는/및 지방산 모노글리세리드가 존재하지 않는다. 바람직한 일 구체예에서, 오일 성분은 지방산 모노- 또는 디글리세리드가 존재하지 않는다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 오일 성분은 지방산 트리글리세리드가 존재하지 않는다.

바람직하게는, 상기 오일 성분 (i)은 에틸 올레에이트, 올레산, 피마자유, 옥수수 오일 또는 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 오일 성분은 1, 2, 3 또는 4개의 상이한 오일 화합물, 특히 1개 또는 2개의 예컨대 에틸 올레에이트 및/또는 올레산을 함유한다.

상기 오일 성분 (i)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여, 바람직하게는 1.0 - 10.0 wt.-%, 더 바람직하게는 2.0 - 8.0 wt.-%, 더욱 바람직하게는 3.0 - 7.0 wt.-%의 양으로 존재한다.

본 발명에 따른 적어도 하나의 오일 성분의 존재는 개선된 안과용 조성물의 제공을 가능하게 한다. 예를 들어, 상기 오일 성분은 눈물막층 재건, 눈으로부터의 수분 증발 감소, 및 안구 표면의 윤활 측면에서 유리하며, 이는 특히 안구건조증의 치료에 유리하다.

본 발명에 따른 수성상 (성분 (ii))은 물, 바람직하게는 물의 약학적으로 허용 가능한 형태, 예컨대 멸균수, 탈이온수 또는 Ph. Eur.에 따른 주사용수를 포함한다.

상기 수성상 (ii)은 예를 들어 pH 값, 점도, 안정성 등을 조정하기에 적합한, 당해 기술 분야에 알려진 수용해성 제제 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 제제 보조제의 예는 완충제 예컨대 인산칼륨, 붕산나트륨 또는 글루콘산나트륨, 등장화제 예컨대 수크로스, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 점도-증가 화합물 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 항미생물 보존제 예컨대 안정화된 옥시클로로 착물 (SOC), 안정화제 예컨대 유화제, 또는 이들의 혼합물이 있으며, 이에 한정되지 않는다.

상기 수성상은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 50.0 - 98.0 wt.-%, 바람직하게는 60.0 -95.0 wt.-%, 더 바람직하게는 70.0 - 90.0 wt.-%의 양으로 존재할 수 있다.

상기 제제 보조제는 수성상의 총량에 기반하여 0 내지 30 wt.-%, 바람직하게는 0 내지 20 wt.-%, 더 바람직하게는 0 내지 15 wt.-%의 양으로 존재할 수 있다.

상기 마이크로에멀젼은 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제 (성분 (iii))를 추가로 포함하며, 이는 오일 성분 (i)과 특히 상이하다. 본원에서 사용된 "비-이온성 계면활성제"는 사용되는 조건하에 이온 전하를 나타내지 않는 계면활성제이다.

적합한 비-이온성 계면활성제는 예를 들어 알킬글루코시드, 폴리옥시알킬렌 알킬 에테르, 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀, 폴리옥시알킬렌 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 블록-코폴리머, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 글리세리드, 폴리옥시알킬렌 스테롤, 폴리옥시알킬렌 식물성 오일, 폴리옥시알킬렌 수소화 식물성 오일, 폴리글리세롤 에테르, 폴리옥시알킬렌 글리세롤 에스테르, 폴리비닐알코올 및 이들의 혼합물이 있다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테롤, 폴리옥시에틸렌으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 마이크로에멀젼은 입체적으로 부피가 큰 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제를 함유한다. 부피가 큰 비-이온성 계면활성제의 예는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 특히 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 더 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르가 있다.

바람직한 일 구체예에서, 성분 (iii)은 상기 정의된 바와 같은 지방산 모노글리세리드 또는/및 지방산 디글리세리드가 존재하지 않는다.

상기 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제 (iii)의 총량은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여, 바람직하게는 0.40 - 10.00 wt.-%의 범위, 더 바람직하게는 0.50 - 5.0 wt.-%의 범위, 더욱 바람직하게는 1.0 - 5.0 wt.-%의 범위에 있다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 오일 성분 (i)과 상이한 적어도 2개의 구조적으로 상이한 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 2가지 구조적으로 상이한 비-이온성 계면활성제를 조합함으로써, 오일 성분 (i) 및 수성상 (ii) 간의 상호작용으로 인해 수상에서 오일이 미세하게 분산된다. 특히, 마이크로에멀젼은 2, 3 또는 4개, 바람직하게는 2개의 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

바람직하게는, 상기 마이크로에멀젼은 각각 제1/제2 비-이온성 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트(Tween 80®)/폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 (Tween 20®), 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80®)/폴리옥실(2) 세틸에테르 (Brij 52®), 폴리옥실(2) 세틸에테르 (Brij 52®)/폴리옥실(20) 세틸에테르 (Brij 58®) 및 폴리옥실(20) 세틸에테르 (Brij 58®)/폴리옥실(10) 세틸에테르 (Brij 56®)의 조합으로부터 선택되는, 적어도 2개, 특히 2개의 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

제1 비-이온성 계면활성제 대 제2 비-이온성 계면활성제의 비율은 10:1 - 1:1, 특히 2:1 - 1:1일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 Tween 80® (제1 비-이온성 계면활성제) 및 Tween 20® (제2 비-이온성 계면활성제)을 2:1 내지 1:1의 비율로 포함한다.

상기 마이크로에멀젼은 적어도 하나의 폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체 (성분 (iv))를 추가로 포함하며, 이는 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 0.001 내지 0.100 wt.-%, 바람직하게는 0.020 내지 0.050 wt.-%의 양으로 존재할 수 있다.

본원에서 사용된 "폴리사카라이드"는 글리코시드 결합에 의해 상호 연결된 모노사카라이드 반복 유닛을 포함하는 탄수화물 폴리머이다. 폴리사카라이드는 한 가지 타입의 반복 유닛, 즉 호모폴리사카라이드, 또는 2가지 이상의 타입의 반복 유닛, 즉 헤테로폴리사카라이드를 가질 수 있다. 폴리사카라이드 분자당 반복 유닛의 수는 적어도 10, 예컨대 40-3000 또는 200-2500일 수 있다. 특히, 폴리사카라이드는 (변형된) 글루코스, 프럭토스 및/또는 글리세르알데히드 반복 유닛을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 성분 (iv)는 폴리사카라이드 염이다. 폴리사카라이드 염은 음이온성, 양이온성 또는 쯔비터이온성 폴리사카라이드 및 적어도 하나의 타입의 반대 이온을 포함한다. 적합한 반대 이온은 음이온 전하를 갖는 폴리사카라이드의 경우 알칼리 및/또는 알칼리 토금속 이온, 예컨대 Na⁺, K⁺, Ca²⁺, 또는 Mg²⁺, 및 양이온 전하를 갖는 폴리사카라이드의 경우 할라이드 예컨대 Cl^- 또는 Br로부터 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 성분 (iv)은 폴리사카라이드 유도체이다. 본 발명에 따른 폴리사카라이드 유도체는 화학적으로 변형된 폴리사카라이드, 예컨대 알킬화, 하이드록시알킬화, 설폰화, 니트레이트화, 카복시알킬화 또는/및 크산토겐화 폴리사카라이드이다. 폴리사카라이드의 변형에 의해, 예를 들어 수용해도와 관련하여 각각의 적용에 맞게 특성 프로파일이 맞춤화된 화합물이 제공된다.

바람직한 일 구체예에서, 성분 (iv)은 히알루론산, 펙틴, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 예를 들어 카복시메틸 셀룰로스, 알긴산, 카라기난, 키토산, 이의 염 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염, 특히 히알루론산 나트륨으로부터 선택된다.

폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체의 존재는 마이크로에멀젼의 수화 특성의 측면에서, 예를 들어 안구건조증의 치료에서 안구 표면에 수분 공급에 유리할 수 있다.

상기 마이크로에멀젼은 적어도 하나의 가교제 (성분 (v))를 추가로 포함한다. 성분 (v)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여, 0.005 내지 0.100 wt.-%, 바람직하게는 0.01 - 0.075 wt.-%, 더 바람직하게는 0.01 - 0.050 wt.-%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 가교제 (v)는 특히 성분 (iv)을 가교시킬 수 있다. 성분 (v)은 물리적 가교제 예컨대 이온성 가교제, 및 화학적 가교제 예컨대 라디칼 가교제, 또는 축합 반응 또는 부가 반응을 유도하는 가교제로부터 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 성분 (v)는 적어도 하나의 카복실기 또는 이의 염을 가질 수 있고, 바람직하게는 폴리카복실산, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 말레산, 이의 염 또는 이들의 혼합물이다.

다른 구체예에서, 성분 (v)은 양이온성 가교제 예컨대 다가 금속 이온, 특히 Ca²⁺ 또는 Mg²⁺, 이의 염 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

성분 (iv) 대 성분 (v)의 중량비는 1:1 - 1:20, 바람직하게는 1:1 - 1:2일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 히알루론산 또는 이의 염 (성분 (iv)) 및 시트르산 또는 이의 염 (성분 (v))을 1:1 - 1:2의 중량비로 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 공-계면활성제 (성분 (vi))를 포함할 수 있다. 상기 공-계면활성제는 비-이온성 계면활성제 (iii) 및 오일 성분 (i)과 상이하며, 예를 들어 비-이온성 계면활성제, 모노알코올, 폴리올 및 이들의 혼합물, 특히 모노알코올, 폴리올 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

상기 공-계면활성제는 - 계면활성제 (iii)로서 - 오일 성분 (i) 및 수성상 (ii) 사이의 계면에 축적된다. 적어도 하나의 공-계면활성제를 혼입함으로써, 계면층이 더 조밀하게 패킹되어, 더 많은 발수성이 있어서, 계면에서 분자 응집의 가능성을 줄인다.

적합한 공-계면활성제는 지방산과 폴리글리세롤 에스테르, 폴리옥시알킬화 알킬에테르, 디올, 1가 알코올, 폴리옥시알킬화 (수소화) 오일, 당 알코올 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 공-계면활성제는 폴리글리세롤-6-디올레에이트, 에탄올, n-프로판올, 1,2-프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터 오일, 소르비톨, 글리세롤로 구성된 그룹으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 공-계면활성제는 에탄올, 1,2-프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글리세롤 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.

바람직한 일 구체예에서, 상기 공-계면활성제는 지방산 모노- 및/또는 디글리세리드가 존재하지 않는다.

공-계면활성제의 양은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 1.00 내지 5.00 wt.-%, 바람직하게는 2.00 내지 5.00 wt.-%의 범위일 수 있다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 하기를 포함한다:

성분 (i)으로서 적어도 하나의 1가 알코올의 지방산 에스테르, 특히 에틸 올레에이트,

성분 (ii)으로서 약학적으로 허용 가능한 물,

성분 (iii)으로서 적어도 하나의 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르, 특히 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80^®) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트 (Tween 20^®),

성분 (iv)으로서 히알루론산 또는 이의 염, 특히 히알루론산 나트륨,

성분 (v)으로서 시트르산 또는 이의 염, 특히 시트르산 칼슘, 및

선택적으로 공-계면활성제 (vi) 소르비톨.

특히 바람직한 일 구체예에서, 성분 (i)은 에틸 올레에이트이고, 성분 (iii)은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80^®) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 (Tween 20^®)의 혼합물이며, 성분 (v)는 시트르산 칼슘이다.

바람직하게는, 성분 (i) 내지 (vi)는 에멀젼의 총 중량에 기반하여 하기 양으로 존재한다:

1.0 - 10.0 wt.-% 성분 (i), 바람직하게는 에틸 올레에이트,

50.0 - 98.0 wt.-% 성분 (ii), 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 물,

0.40 - 10.00 wt.-% 성분 (iii), 바람직하게는 Tween 80® 및 Tween 20®,

0.001 - 0.050 wt.-%, 바람직하게는 0.020 - 0.050 wt.-%, 성분 (iv), 바람직하게는 히알루론산 또는 이의 염,

0.005 - 0.100 wt.-% 성분 (v), 바람직하게는 시트르산 또는 이의 염, 및

선택적으로 1.00 - 5.00 wt.-% 성분 (vi), 바람직하게는 소르비톨.

바람직한 일 구체예에서, 성분 (ii) 대 성분 (i)의 중량 비율은 50:1 미만, 더 바람직하게는 20:1 미만, 더욱 바람직하게는 20:1 내지 10:1이다.

따라서, 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 수중유 마이크로에멀젼이며, 이는 오일 성분의 개별 액적이 연속 수성상 내에 분포하는 것을 의미한다.

오일 성분 액적의 평균 평균값 직경 (mean average diameter)은 5 내지 10,000 nm의 범위, 바람직하게는 10 내지 2,000 nm의 범위, 보다 바람직하게는 50 내지 1,000 nm의 범위일 수 있다 (ISO/DIS 22412에 따라 측정). 상기 직경은 또한 오일 성분/수성상 계면에서 조립하는 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 매우 안정하며, 즉 액적 크기는 실온, 즉 20℃ 및 주위 압력, 즉 1 bar에서 바람직하게는 6개월의 기간 동안, 더 바람직하게는 8주 동안, 경시적으로 변하지 않고 유지된다.

임의의 이론에 구애됨이 없이, 유리한 마이크로에멀젼 안정성은 적어도 하나의 폴리사카라이드 (iv) 및 성분 (iv)을 가교할 수 있는 적어도 하나의 가교제 (v)의 존재와 관련이 있다. 마이크로에멀젼의 수성상에서 폴리사카라이드-기반 폴리머 네트워크를 형성함으로써, 성분 (iv) 및 (v)는 오일 액적이 예를 들어 응집, 유착, Oswald 숙성, 침강 및 크리밍 (creaming)을 겪는 것을 방지한다. 따라서, 균일한 구조를 갖고 유지하는 마이크로에멀젼이 제공된다.

더욱이, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 잠재적으로 유해한 성분들 예컨대 보존제, 예를 들어 PHMB 또는 BAK, 및 이온성 계면활성제, 특히 눈 자극을 유발하는 양이온성 계면활성제가 존재하지 않는다.

일 구체예에서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 약물이 존재하지 않는다.

용어 "약물"은 인간 및/또는 동물의 질병 또는 의학적 병태를 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 특성을 갖는 인간 또는 동물 신체에 사용하기 위한 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 의미한다. 약물은 약리학적, 면역학적 또는 대사 작용을 통해 생리학적 기능을 회복, 수정 또는 영향을 주기 위해; 또는 의학적 진단의 근거로서 제공하기 위해 인간 또는 동물의 신체에 사용되거나 또는 인체 또는 동물에 투여될 수 있다.

특히, 본 발명의 마이크로에멀젼은 안구 질환 또는 병태 예컨대 안구건조증을 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 사이클로스포린, 리피테그라스트, 리툭시맙, 토실리주맙, 리보글리타존, 마프라코라트, 레졸빙 (resolving), 타소티시닙, 토파시티닙, 보클로스포린, 티모신, 에카베트, 리멕솔론, 레바미파이드, 디쿠아포솔, 브롬페낙 및/또는 덱사메타손이 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 박테리아 또는 바이러스 기원의 눈 감염의 질병 또는 병태를 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 시프로플록사신, 오플록사신, 네오마이신, 토브라마이신, 간시클로비르, 팜시클로비르, 발간시클로비르, 아시클로비르 및/또는 헥사미딘이 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 염증의 질병 또는 병태를 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 덱사메타손, 플루오로메톨론, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 케토롤락, 디클로페낙, 인도메타신, 케토롤락, 네파페낙, 및/또는 브롬페낙이 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 녹내장의 질병 또는 병태를 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 브린졸아미드, 아세타졸아미드, 도르졸아미드, 브리모니딘, 카르테올롤, 베탁솔, 티몰롤, 레보부놀, 라타노프로스트, 타플루프로스트, 비마토프로스트 및/또는 트라보프로스트가 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 동공 확장을 유도하고, 특정 안구 구성요소의 염증 병태, 예를 들어 홍채염, 고리염, 안구전위증을 치료하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 아트로핀, 사이클로펜톨레이트, 트로피카미드 및/또는 스코폴라민이 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 눈 충혈의 질환 또는 병태를 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 테트리졸린, 나파졸린, 안타졸린이 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 알레르기성 안구 질환의 질병 또는 병태를 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 아젤라스틴, 에메다스틴, 레보카바스틴, 올로파타딘, 케토티펜이 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 마이크로에멀젼은 특히 당뇨병성 망막병증 또는 노화 관련 황반 질환의 질병 또는 병태를 치료, 완화 및/또는 예방하기 위한 약물이 존재하지 않는다. 예를 들어, 마이크로에멀젼은 아플리버셉트, 라니비주맙, 베바시주맙이 존재하지 않을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 적어도 하나의 추가 약물 (성분 (vii))을 포함한다. 특히, 성분 (vii)은 하기 비-제한적인 목록으로부터 선택된다: 리툭시맙, 토실리주맙, 리보글리타존, 마프라코라트, 레졸빙, 타소티시닙, 토파시티닙, 보클로스포린, 티모신, 에카베트, 리멕솔론, 레바미파이드, 디쿠아포솔, 브롬페낙, 덱사메타손, 시프로플록사신, 오플록사신, 네오마이신, 토브라마이신, 간시클로비르, 팜시클로비르, 발간시클로비르, 아시클로비르, 헥사미딘, 덱사메타손, 플루오로메톨론, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 케토롤락, 디클로페낙, 인도메타신, 케토롤락, 네파페낙, 브롬페낙, 브린졸아미드, 아세타졸아미드, 도르졸아미드, 브리모니딘, 카르테올롤, 베탁솔, 티몰롤, 레보부놀, 라타노프로스트, 타플루프로스트, 비마토프로스트, 트라보프로스트, 아트로핀, 사이클로펜톨레이트, 트로피카미드, 스코폴라민, 테트리졸린, 나파졸린, 안타졸린, 아젤라스틴, 에메다스틴, 레보카바스틴, 올로파타딘, 케토티펜, 아플리버셉트, 라니비주맙 및 베바시주맙.

상기 적어도 하나의 추가 약물 (vii)은 오일 성분 (i) 중에 용해될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 적어도 하나의 추가 약물 (vii)은 수성상 (ii) 중에 용해될 수 있다.

성분 (vii)의 양은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 0.001-10.0 wt.-%, 바람직하게는 0.001-1.0 wt.-%의 범위일 수 있다.

추가의 일 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼을 제조하는 방법에 관한 것이다:

(a) 성분들 (i), (iii), (iv), (v), 선택적으로 (vi), 및 선택적으로 (vii)의 혼합물을 제조하는 단계, 및

(b) 성분 (ii)을 단계 (a)에서 수득된 혼합물에 교반하면서 부가하는 단계.

단계 (a)에서 혼합물을 제조하는 단계는 자기 교반기, 패들 교반기, 수동 진탕, 또는 균질화기와 같은 당해 기술 분야에 알려진 통상적인 수단에 의해 수행된다.

단계 (a)에서 수득된 혼합물에 수성상 (성분 (ii))을, 예를 들어 0.5 - 3시간 동안 교반하면서 부가한다. 성분 (ii)의 부가는 한번에 또는 여러 부분으로 수행될 수 있다.

바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 안정한 마이크로에멀젼을 수득하기 위해서는 적은 양의 에너지 투입만으로도 충분하다. 바람직하게는, 자기 교반기, 패들 교반기 또는 수동 진탕으로 단계 (b)에서 혼합물을 교반하는 것으로 충분하다. 대안으로서, 균질화기 또는 고에너지 균질화기가 사용될 수 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 전술한 방법에 의해 수득 가능한 마이크로에멀젼에 관한 것이다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 마이크로에멀젼을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학적 조성물은 특히 안구 적용, 바람직하게는 안구건조증의 예방, 완화 및/또는 치료에 적합하다.

또한, 본 발명은 안구 적용, 바람직하게는 안구건조증의 예방, 완화 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 마이크로에멀젼 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 담체, 특히 약물 담체 예컨대 안과용 약물 담체로서 본원에 기재된 마이크로에멀젼의 용도에 관한 것이다. 담지될 잠재적 약물은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같다.

본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시된다.

도 1: 음성 대조군 (NC)에 비해 단일 처리 후에 인간 상피 세포의 세포 생존율 퍼센트.
도 2: 음성 대조군 (NC)에 비해 반복 처리 후에 인간 상피 세포의 세포 생존율 퍼센트.
도 3: 음성 대조군 (NC) 및 양성 건조 대조군과 비교하여 다양한 안과용 조성물 (P1-P4)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 조직학적 분석.
도 4: 음성 대조군 (RQ = 1)에 비해 36시간 동안 건조 스트레스 유도 (dryness stress induction) 중에 다양한 안과용 조성물 (P1 = Cationorm®, P2 = Artelac® Splash, P3 = Systane® UD, P4 = ME)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 바이오마커 패턴.
도 5: 음성 대조군 (RQ = 1)에 비해 36시간 동안 건조 스트레스 유도 후 6시간 동안 다양한 안과용 조성물 (P1 = Cationorm®, P2 = Artelac® Splash, P3 = Systane® UD, P4 = ME)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 바이오마커 패턴.
도 6: 음성 대조군 (RQ = 1)에 비해 36시간 동안 건조 스트레스 유도 후 24시간 동안 다양한 안과용 조성물 (P1 = Cationorm®, P2 = Artelac® Splash, P3 = Systane® UD, P4 = ME)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 바이오마커 패턴.
도 7: 음성 대조군 (NC) 및 양성 건조 대조군 (PC)과 비교하여 36시간 동안 건조 스트레스 유도 중에 다양한 안과용 조성물 (P1 = Cationorm®, P2 = Artelac® Splash, P3 = Systane® UD, P4 = ME)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 TEER 분석.
도 8: 음성 대조군 (NC) 및 양성 건조 대조군 (PC)과 비교하여 36시간 동안 건조 스트레스 유도 후 6시간 및 24시간 동안 다양한 안과용 조성물 (P1 = Cationorm®, P2 = Artelac® Splash, P3 = Systane® UD, P4 = ME)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 TEER 분석.
도 9: HCE 음성 대조군 (참조 형태에 해당) 및 인 비트로 안구건조증 모델 (양성 대조군)의 조직학적 분석.
도 10: 양성 건조 대조군과 비교하여 다양한 안과용 조성물 (P1 = ME, P2 = Xiidra® Lifitegrast)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 조직학적 분석.
도 11: 음성 대조군 (NC 40h+24h, RQ = 1)에 비해 40시간 건조 스트레스 유도 (PC 40h) 및 24시간 회복 (PC 40h+24h) 후에 인 비트로 안구건조증 모델의 바이오마커 패턴.
도 12: 양성 대조군 (PC 40h+24h, RQ = 1)에 비해 40시간 동안 건조 스트레스 유도 후 24시간 동안 다양한 안과용 조성물 (P1 = ME, P2 = Xiidra® Lifitegrast)로 처리한 인 비트로 안구건조증 모델의 바이오마커 패턴.
도 13: 각막 플루오레세인 염색 효과. ME5% (A)는 참조 화합물 (B)에서 관찰된 것과 유사하게, 15일째와 비교하여 28일째에 각막 플루오레세인 염색이 개선되었다. ME7% (C)는 개선된 각막 플루오레세인 스코어에 대한 통계적 경향을 보였다. 미처리 안구 (D)의 각막 플루오레세인 염색은 15일 내지 28일 사이에 유의미한 차이가 없었다. 데이터는 중앙값 (선), 25/75번째 백분위수 (박스) 및 범위 (whiskers)를 나타내는 box/whisker 플롯으로 제시된다. 개별 데이터 포인트는 충전된 원으로 표시된다. 안구의 수 (n)는 그룹당 20개였다.

실시예

실시예 1 - 마이크로에멀젼 제조

5.00 g의 에틸 올레에이트, 1.00 g의 Tween 80®, 0.50 g의 Tween 20®, 4.10 g의 d-소르비톨, 0.026 g의 소듐 히알루로네이트, 및 0.03 g의 칼슘 시트레이트를 반응 용기에 제공하고, 1M 수성 NaOH를 부가하여 pH를 6.8-7.4의 값으로 조정하였다. 그 다음에, 화합물들을 실온에서 1-4시간 동안 교반하에 혼합하였다.

다음, 주사용수를 반응 용기에 실온에서 1-4시간 동안 교반하에 서서히 부가하였다.

수득된 혼합물을 공극 크기가 0.22 μm인 멸균 여과를 사용하여 멸균하였다.

생성된 마이크로에멀젼의 정량적 조성(%)을 하기에 보고한다.

실시예 1의 조성 (wt-%):

에틸 올레에이트 (i) 5.00%

TWEEN 80® (iii) 1.00%

TWEEN 20® (iii) 0.50%

d-소르비톨 (vi) 4.10%

소듐 히알루로네이트 (iv) 0.026%

칼슘 시트레이트 (v) 0.03%

NaOH 1M q.s.

물 (ii) 100% 부가

실시예 2 - 마이크로에멀젼 안정성

상이한 마이크로에멀젼의 물리적 안정성을 가교제의 농도에 따라 평가하였다. 실시예 1에 따라 3개의 마이크로에멀젼을 제조하였고, 칼슘 시트레이트의 농도는 0, 0.03 또는 0.06 wt.-%였다.

상기 3개의 마이크로에멀젼의 물리적 안정성을 Turbiscan™ 장치를 사용하여 평가하였다. 상기 장치는 튜브의 전체 길이에 걸쳐 바닥에서 상단까지 수직 튜브에 배치한 마이크로에멀젼의 투과 및 후방 산란광을 결정한다. 유화된 오일 액적이 바닥 (즉, 침전) 또는 상단 (즉, 크리밍)으로 이동하면 경시적으로 TSI (Turbiscan 지수)의 큰 변화가 발생하며, 이는 투과/후방 산란광의 합으로부터 파생된다. 즉, TSI 값이 높을수록 마이크로에멀젼이 분리되는 경향을 나타낸다.

칼슘 시트레이트 농도에 따른 물리적 균일성의 변화율을 도출하기 위해, 마이크로에멀젼 (ME) 제조 후 48시간 동안 여러 시점에서 TSI를 측정하였다. 표 1은 계산된 TSI 변화율을 나타낸다.

ME에서 칼슘 시트레이트%	TSI 변화율/h
0	0.094 TSI/h
0.03	0.018 TSI/h
0.06	0.020 TSI/h

상기 데이터는 0.03 wt.-%의 칼슘 시트레이트를 부가하면 가교제가 존재하지 않는 (0% 칼슘 시트레이트) 마이크로에멀젼과 비교하여 액적의 이동이 크게 감소하여 마이크로에멀젼의 물리적 안정성이 크게 향상되고; 0.06 wt.-%의 가교제를 부가하면 어떠한 부가 효과도 나타내지 않는 것을 보여준다.

실시예 3 - 접촉각 측정

실시예 1에 따라 마이크로에멀젼 조성물을 제조하고, 다용량 점안 용기에 옮겼다. 그 다음에, 마이크로에멀젼 (ME) 10방울을 용기 팁을 닦지 않고 폴리머 PE 기판에 차례로 주입하였다. Wettabilty Tester Lorentzen-Wettre를 사용하여 접촉각과 관련하여 각 방울을 분석하였다.

비교예로서, 안구건조증 치료를 위한 상업적으로 이용 가능한 안과용 조성물인 DROPSTAR^®, HYALISTIL^®, XILOIAL^®, HYABAK^®, 및 VISMED^®의 접촉각을 그에 따라 측정하였다.

접촉각은 하기 표 2에 표시되어 있다 (10회 반복으로부터의 평균값 및 표준 편차 S.D.).

제제	평균	S.D.
ME	38.3	5.8
DROPSTAR^®	119.3	4.4
HYALISTIL^®	114.3	4.9
XILOIAL^®	118.2	4.6
HYABAK^®	112.1	4.9
VISMED ^®	115.1	4.3

낮은 접촉각은 각막 표면에 적용되는 경우 안과용 조성물의 증가된 습윤성 및 커버리지 특성에 해당한다. 따라서, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼 (ME)은 비교 조성물 DROPSTAR^®, HYALISTIL^®, XILOIAL^®, HYABAK^®, 및 VISMED^®에 비해 습윤성 및 커버리지 특성과 관련하여 개선된 효능을 명확하게 보여준다.

실시예 4 - 액적 중량 재현성

실시예 1에 따라 마이크로에멀젼 조성물을 제조하고, 다용량 점안 용기에 옮겼다. 그 다음에, 마이크로에멀젼 (ME) 10방울을 용기 팁을 닦지 않고 폴리머 PE 기판에 차례로 주입하였다. 각 방울은 분석 저울을 사용하여 개별적으로 칭량하였다.

비교예로서, 다용량 점안 용기로부터 물을 주입하고, 그에 따라 칭량하였다.

액적 중량은 표 3에 표시된다.

액적	m(ME), mg	m(물), mg
1	24.2	27.3
2	25.1	28.8
3	24.7	25.2
4	27.0	25.8
5	26.8	29.1
6	26.6	29.2
7	26.3	28.7
8	26.6	29.7
9	27.1	28.6
10	27.5	30.4
평균 중량 (변동 계수 CV)	26.2 ± 1.1 mg CV 4.3%	28.3 ± 1.7 mg CV 5.9%

장기 안정성 및 재현성을 조사하기 위해, 표 4에 표시된 바와 같이 액적 중량을 1개월 동안 매일 결정하였다.

일	m(ME), mg	일	m(ME), mg
1	24.3	16	25.8
2	22.6	17	24.9
3	24.6	18	25.8
4	26.1	19	21.4
5	26.0	20	23.7
6	25.9	21	27.7
7	24.4	22	24.9
8	26.0	23	26.6
9	25.0	24	24.8
10	25.4	25	28.2
11	21.0	26	23.9
12	24.7	27	26.0
13	22.4	28	22.2
14	24.6	29	24.3
15	21.6	30	23.5

표 3에 표시된 액적 중량으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 마이크로에멀젼의 액적 중량 재현성이 매우 높으며, 이는 순수한 물의 액적 중량 재현성에 상응한다.

최대 30일의 보관 후에도, 재현성을 유지할 수 있어서, 전체 평균 액적 중량은 24.6 ± 1.8 mg (CV: 7.1 %)을 제공한다. 높은 재현성은 안구 병태 또는 질병의 치료 및 일정한 투여량을 제공하기 위해 안과용 조성물에서 특히 중요하다.

실시예 5 - 오염 챌린지 테스트

실시예 1에 따라 마이크로에멀젼 조성물을 제조하고, 다용량 점안 용기에 옮겼다. 그 다음에, 용기 팁을 고도로 오염된 환경 (10x6 CFU/ml의 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylooccus Aureus))과 접촉시키고, 마이크로에멀젼 액적을 PBS 배양 배지에 주입하였다. 상기 배양 배지를 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하고, 잠재적 오염은 스타필로코커스 아우레우스 CFU/ml 농도를 계수하여 결정하였다.

또한, 상기 다용량 용기를 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하고, 잠재적 오염은 주입된 액적의 농도 1 ml 당 스타필로코커스 아우레우스 CFU를 계수하여 결정하였다.

두 샘플들에 대해, 조사된 마이크로에멀젼의 무균성을 확인하였다.

실시예 6 - 세포 생존율

실시예 1에 따라 마이크로에멀젼 조성물을 제조하고, 다용량 점안 용기에 옮겼다. 그 다음에, 인간 각막 상피 (HCE) 세포를 사용한 표준 MTT 분석을 수행하였고, 여기서 세포는 24시간 동안 마이크로에멀젼의 단일 액적 (ME, 단일 처리)에 노출되거나, 또는 연속 3일 동안 1일 2회 단일 액적 (ME, 72시간 동안 반복 처리)에 노출되었다.

비교예로서, 식염수 용액 (음성 대조군, NC), 0.01% 벤잘코늄 클로라이드 (BAK) 수성 용액, 및 양이온성 마이크로에멀젼 Cationorm®으로 처리한 후에 세포 생존율을 그에 따라 조사하였다.

단일 및 반복 적용 후 인간 각막 상피 세포의 결정된 세포 생존율 퍼센트는 각각 도 1 및 2에 표시된다. 본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 보존제 용액 (BAK) 및 무-보존제 시판 제품인 Cationorm®과 비교하여 단일 및 반복 적용 모두에서 유의미하게 더 높은 세포 생존율 값을 보여주었다.

실시예 7 - 인 비보 내약성

5마리의 수컷 긴꼬리 원숭이 (Cynomolgus macaques)를 통제된 환경 (Toxikon laboratories, Toxikon Corp. MA, USA)에서 사용하였고; 이들은 연속 4일 동안 매일 마이크로에멀젼을 각 눈에 한 방울 (30μl)을 투여하였다.

자격을 갖춘 검사자가 세극등 (slit lamp)을 사용하여 안과 검사를 수행하였다. 결과는 Draize and McDonald-Shadduck 스코어링 시스템과 결합된 안구 병변 등급분류에 대한 분류 시스템에 따라 스코어링하였다.

표 5-8에서는 투여 전 데이터 및 마이크로에멀젼의 마지막 투여 후 24시간 후에 수득된 데이터가 개시되어 있다.

안구의 투여 전 평가

	결막				각막		홍채
동물 번호	안구	충혈 (0-3)	결막부종 (0-4)	분비물 (0-3)	혼탁도 (0-4)	면적 (0-4)	(0-4)
1	우측	0	0	0	0	0	0
1	좌측	0	0	0	0	0	0
2	우측	0	0	1	0	0	0
2	좌측	0	0	1	0	0	0
3	우측	0	0	0	0	0	0
3	좌측	0	0	0	0	0	0
4	우측	0	0	0	0	0	0
4	좌측	0	0	0	0	0	0
5	우측	0	0	0	0	0	0
5	좌측	0	0	0	0	0	0

마이크로에멀젼의 마지막 투여 후 24시간에 안구 평가

안구의 투여 전 평가

동물 번호	안구	플루오레세인 염색 (0-4)	파누스 (0-2)	방수 흐림 (0-3)	동공 빛 반사 (0-2)	수정체 (0-1)
1	우측	0	0	0	0	0
1	좌측	0	0	0	0	0
2	우측	0	0	0	0	0
2	좌측	0	0	0	0	0
3	우측	0	0	0	0	0
3	좌측	0	0	0	0	0
4	우측	0	0	0	0	0
4	좌측	0	0	0	0	0
5	우측	0	0	0	0	0
5	좌측	0	0	0	0	0

마이크로에멀젼의 마지막 투여 후 24시간에 안구의 평가

본 발명에 따른 마이크로에멀젼으로 처리한 후 모든 관찰 시간에서 처리한 동물의 안구에서, 다양한 안구 부분, 즉 결막 (충혈, 결막부종, 분비물), 각막 (혼탁도, 면적), 홍채, 수정체, 방수 흐림, 파누스의 임상적 관찰 및 안구 검사 중에 현저한 변화는 발견되지 않았다.

실시예 8 - 안구건조증의 인 비트로 모델

1. 도입

건조 중에 상피 수분 통로 내의 수분 흐름 손상을 재현하는 안구건조증의 인 비트로 모델을 사용하여 수분 통로 수화 (water channel hydration)를 통한 탈수 방지 및 항상성 회복에 있어서 상업적으로 이용 가능한 안과용 조성물 Cationorm® (P1), Artelac® Splash (P2), 및 Systane® UD (P3) 뿐만 아니라 실시예 1에 따른 마이크로에멀젼 (P4)의 효능을 조사하였다.

SkinEthic에서 상업적으로 이용 가능한 재구성된 인간 각막 상피 (HCE) 0.5 cm²을 사용하여 안구건조증과 관련된 형태학적, 세포적 및 생화학적 변형: 염증, 구조적 구획의 변형, 관련 마커의 발현 및 미세융모 "네트워크"를 유도하기 위해 배양 조건을 수정하여 가역적이고 심각하지 않은 각막 건조를 모방하는 인 비트로 DES 모델을 설정하였다.

2가지 상이한 프로토콜을 적용하였다:

조성물 P1-P4를 일련의 HCE 조직에 적용하고, 건조 스트레스를 유도하기 위해 36시간 동안 통제된 조건 (낮은 RH < 40%, T = 40℃)으로 즉시 옮겼다 (처리전 시리즈).

조성물 P1-P4를 36시간의 건조 스트레스로부터 생성된 일련의 DES 모델에 적용하였고, 6시간 및 24시간 동안 표준 조건에서 추가로 배양하였다 (처리후 시리즈).

하기 파라미터를 두 시리즈 모두에서 평가하였다:

장벽 기능 투과성

특정 바이오마커의 유전자 발현

조직-형태 및 주사 전자 현미경 (SEM) 분석

식염수 용액으로 처리하고 표준 조건에서 배양한 HCE 조직 (음성 대조군) 및 건조 조건에서 36시간 동안 배양하고 표준 배양 조건에서 6시간 및 24시간 동안 회수한 DES 모델 (양성 대조군)과 비교하였다.

2. 실험 디자인

HCE 조직이 보관 상태에서 회수될 수 있도록 표준 배양 조건에서 2-3시간 후에, 하기를 해결하기 위해 2가지 상이한 프로토콜을 수행하였다:

조성물의 예방 효능 (처리전 시리즈)

항상성 회복에 대한 조성물 효능 (처리후 시리즈)

처리전 시리즈

조직 회수 후에, 각 조성물 15 μL를 HCE 조직의 표면에 적용하고, 건조 스트레스를 유도하기 위해 조직을 정의된 제어 조건 (낮은 상대 습도 (RH) < 40%, T = 40℃)으로 36시간 동안 즉시 옮겼다. 이 프로토콜을 사용하여 건조에 대응하는 제품의 효능을 평가하였다.

처리후 시리즈

조직 회수 후에, 36시간 동안 건조 스트레스를 유도하는데 사용되는 정의된 제어 조건 (낮은 RH < 40%, T = 40℃)으로 HCE 조직을 옮겼다. 건조 조건에서 36시간 후에, 각 조성물 15 μL를 DES 모델에 직접 균일하게 적용하고, 상기 모델을 표준 배양 조건에서 6시간 및 24시간 동안 추가 배양하여 항상성 회복에 대한 제품 효능을 평가하였다.

결과를 하기와 비교하였다:

음성 대조군 (NC): HCE 조직을 식염수 용액 (0.9% NaCl, 15 μL)으로 처리하고, 표준 조건에서 36시간 동안 배양하고, 표준 배양 조건에서 6시간 및 24시간 동안 회수하였다.

양성 대조군 (PC; 건조): HCE 조직을 건조 조건 (RH < 40%, T = 40℃의 CO₂ 인큐베이터)에서 36시간 동안 배양하고, 표준 배양 조건 (37℃, 5% CO₂)에서 6시간 및 24시간 동안 회수하였다.

처리 전후에, 두 시리즈 모두에 대해 장벽 기능 특성을 TEER (transepithelial electrical resistance) 측정으로 평가하였다 (두 시리즈의 경우 t = 0h, 및 2개의 치료후 시리즈의 경우 t = 36h에서 대조군에서만).

노출 기간의 종료 시에, 두 시리즈 모두에 대해 DES 모델을 식염수로 헹구고, 다음 분석을 위해 샘플을 제조하였다:

하기를 포함하는 특정 유전자-시그니처의 qRT-PCR에 의한 유전자 발현: 염증 (TNF-α), 수분 통로 (AQP-3), 세포외 기질 모델링 (MMP-9) 및 방어 뮤신 (MUC-4)의 바이오마커 (중복)

헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색에 의한 조직-형태 (간소화)

상응하는 배지를 수집하고, 추가 분석을 위해 -20℃에 보관하였다.

3. 테스트 시스템

0.5 cm²의 EPISKIN 재구성 인간 각막 상피 (HCE 조직)를 평가에 사용하였다. 간략하게, 구조화된 상피를 형성하기 위해 상피 인간 불멸화 세포 (HICEC)를 폴리카보네이트 필터 상에 배치하고 표준 조건에서 화학적으로 정의된 배지에서 5일 동안 공기-액체 계면에서 배양하였다.

상기 모델을 하기 표 9에 표시된 바와 같이 눈 자극 또는 심각한 눈 손상에 대한 분류 및 라벨링이 필요하지 않은 화학물질을 확인하기 위한 대체 방법으로서 EURL ECVAM (SkinEthic^TM HCE Eye Irritation Test Method)에 의해 검증하였다.

DES 모델의 평가

명칭	재구성된 인간 각막 상피 HCE/S/5	상태
배치 (BATCH)	17-HCE-042
제조자	EPISKIN
5일째 두께	75 μm
5일째 조직학 (세포층의 수 ≥)	6개의 세포층	허용됨
5일째 세포 생존율 (1≤O.D≤2.5)	O.D. 2.0 (CV= 5.9 %)	허용됨
IC50 결정 (1mg/mL ≤IC50 ≤3.5mg/mL)	2 mg/mL	허용됨

그 다음에, HCE 조직을 무균 기류 캐빈하에 아가로스 영양 용액으로부터 꺼내고, 실온에서 유지 배지 (1 mL/웰)로 사전 충전된 6-웰 플레이트로 신속하게 옮기고, 37℃, 5% CO₂, 포화된 습도에서 밤새 인큐베이션하였다.

4. 방법

4.1 조직-형태학적 분석

조직학적 평가는 물리적 및 분자적 조사를 확인하고, 조사된 조성물 및 생조직 간의 상호작용을 더 깊이 이해하는데 유용한 보완적인 엔드포인트이다.

처리의 종료 시에, HCE 조직을 식염수 용액으로 헹구고, 10% 포르말린에 고정시켰다. 샘플을 파라핀 블록에 봉입시키고, 5 μm의 절편을 수득하였다. 슬라이드를 VitroScreen 절차에 따라 표준 H&E로 염색하였다.

광학 현미경 (40x) 하에서 조직학적 샘플을 분석하였다: 음성 대조군과 비교하여 전체적인 형태 및 이의 변형을 동일한 조직의 적어도 3개의 절편에서 분석하였다.

4.2 TEER 측정

TEER (trans-epithelial-electrical-resistance)은 밀착 연접 안정성 (tight junction stability)에 대한 간접적인 평가이며, 결과적으로 상피 조직의 장벽 기능의 기능성을 직접 측정한다: 이는 구조 및 조직 두께와 연결된 장벽의 전반적인 저항성을 반영한다.

전술한 처리 절차 및 분석할 조성물의 제거 후에, 표준 프로토콜에 따라 경상피 전기 저항성 (trans-epithelial-electrical resistance)을 측정하였다.[KJ1]

Ω의 로 데이터 (Raw Data)를 기록하고, 추가로 처리하였다. 생물학적 복제 평균은 3개의 기술적 복제에 대해 계산하였고, 하기 식에 따라 조직 표면 (0.5 cm²)을 고려하여 수정하였다:

Ω (평균 3회 측정) 샘플 × 조직 표면 (0.5 cm²)

그 다음에 생물학적 복제 Ω 평균을 계산하였다. 테스트 항목 결과를 음성 대조군과 비교하였다.

4.3 실시간 PCR

형광-기반 PCR: Taqman 분석과 함께 Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.

RNAqueous 방법은 총 RNA 형태의 세포 샘플을 추출하는데 사용되는 신속, 무-페놀, 필터 기반 RNA 단리 시스템이다. 고용량 cDNA 역전사 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상대 정량화는 검정 샘플 (calibrator sample)의 동일한 서열에 비해 테스트 샘플의 핵산 서열의 발현의 변화를 결정한다. GAPDH는 입력량을 정규화하기 위해 내인성 대조군 유전자로서 사용하였다. 추출된 RNA를 아가로스 겔 1%에 로딩하여 RNA 무결성을 평가하였고: 리보솜 밴드 18S 및 28s를 검출하였다.

절차

2가지 처리 (36시간 + 6시간 및 36시간 + 24시간)의 종료 시에, 표준 프로토콜에 따라 RNA 추출, cDNA 역전사 및 유전자 발현 분석을 위해 조직을 용해 버퍼에 수집하였다.

열순환기 ABI 7500 Fast에 의해 생성된 RT-PCR의 형광 데이터는 내부 소프트웨어 SDS 2.0.6에 의해 수집하였다. PCR 반응의 각 사이클은 PCR 산물의 2배 증가에 해당하기 때문에, 역치 사이클 수의 차이는 검정 샘플과 비교하여 특정 유전자의 발현의 2배 차이를 나타내며, 유의미한 것으로 간주될 수 있다. 소프트웨어에서 오류를 계산하는데 95%의 신뢰 수준이 사용된다. 검정 샘플 (RQ = 1)과 비교하여 유전자가 "1배" 상향 조절 (상대 정량화 (RQ) > 2) 또는 하향 조절 (RQ < 0.5)되는 경우 값은 유의미한 것으로 허용되었다. 사용된 내부 기기 신뢰 수준은 95%이었다.

5. 결과

5.1 조직학적 분석: H&E 염색

각 조직학적 슬라이드에 3개의 수직 조직 절편을 준비하였다. 하나의 선택된 슬라이드에서 3개의 선택된 부분의 3개의 현미경 획득 (40x)을 수행하였다. 각 샘플에 대해, 선택한 수직 절편의 가장 대표적인 획득을 본원에 보고하였다.

대조군 조직 (NC)의 형태는 배양 시간 동안 유의미하게 변형되지 않았으며, 기대된 바와 같이 HCE 조직 두께는 이 시간 동안 증가하여 양호한 증식 상태를 확인하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 스트레스 유도 기간의 종료 즉시 건조 대조군 (양성 대조군)은 음성 대조군과 비교하여 하기 형태학적 변형을 나타내었다:

HCE 조직 두께의 유의미한 감소

편평층 구조 장애

치밀하고 압축된 세포외 기질

소수의 picnotic 핵 및 변형된 세포대 세포 연결

건조 스트레스 기간 후에 참조 형태의 회복이 부분적으로 관찰되었다: 특히 6시간 후 HCE 조직 두께는 약간 증가하였지만 세포외 기질은 독성 징후를 보였다; 24시간 후에 표피 편평층은 조직 완전성을 회복하기 위한 방어 기전으로서 뮤신 (진보라색)의 비정상적인 생성을 나타내었다.

처리전 시리즈

P1로 처리한 DES 모델은 감소된 HCE 조직 두께, 편평층에서의 손상 및 독성 징후를 보였다.

P2로 처리한 DES 모델은 음성 대조군과 상이하지 않은 형태 및 두께를 보였다.

P3으로 처리한 DES 모델은 음성 대조군과 상이하지 않은 형태 및 두께를 보였지만, 날개 세포층 (wing cells layer)에서 세포 팽창 및 세포외 기질 변형의 유의미한 징후를 볼 수 있었다.

P4로 처리한 DES 모델은 음성 대조군과 상이하지 않은 형태 및 두께를 보였으므로, 건조 스트레스에 대한 우수한 보호를 제공하였다.

처리후 시리즈

적용된 조성물 (P1, P2, P3 및 P4)에 따라 6시간 및 24시간의 회복 기간 동안 건조 HCE 조직에 대한 처리 효과를 도 3에 도시하였다.

P1로 처리한 DES 모델은 6시간 후 초기에 참조 형태의 회복을 보였지만, HCE 조직 두께가 감소하고 편평층에서 유의미한 독성 징후를 보였다.

P2로 처리한 DES 모델은 6시간 후 초기에 참조 형태의 회복을 보였지만, HCE 두께가 감소하고 세포외 기질 및 편평층에서 유의미한 독성 징후를 보였고, 이는 24시간 샘플에서 더 명확하였다.

음성 대조군에 따른 형태 및 두께는 P3으로 처리한 DES 모델에서 부분적으로 회복되었고; 그러나 24시간 판독에서, 세포외 기질은 변형된 것으로 나타났고, 방어 점액의 생성이 증가하였다.

음성 대조군의 형태 및 두께는 P4로 처리한 DES 모델에서 초기 (6시간 후) 회복되었으며, 이는 생성물이 건조 스트레스에 의해 유발된 손상의 양호한 회복을 결정하였음을 나타내며; 24시간 판독에서, 세포외 기질은 약간만 변형된 것으로 나타났다.

5.2 실시간 PCR

검출된 바이오마커의 생물학적 역할:

TNF-α 과발현은 조직 염증 반응에서 결정적이다. TNF 알파는 항시적으로 또는 자극의 결과로 발현되는 사이토카인이다. TNF 알파 유전자 전사는 성숙전 (premature) 및 자극 직후이다. 이 폴리펩티드는 염증의 주요 매개인자이다. 이의 농도, 세포 노출 기간 및 다른 매개인자의 존재에 따라, 생물학적 효과의 복잡한 네트워크가 국소 및 전신의 유익한 효과 또는 손상을 결정할 수 있다.

MMP-9는 안구 표면에 존재하는 가장 중요한 젤라티나제 (gelatinase)이다. 이 효소는 각막 상피 장벽 기능을 유지하는 밀착 연접 단백질 (예: ZO-1 및 occludin) 및 각막 상피 기저막의 구성 요소를 포함하는 다양한 기질을 용해한다. 이는 각막 상피 박리를 조절하는 생리학적 역할을 하는 것으로 나타났다. 높은 수준의 MMP-9는 건성 각결막염 (keratoconjunctivitis sicca: KCS) 환자, 특히 궤양 환자의 누액에 투여된다. 눈물 MMP-9 활성 수준은 각막 질병의 중증도와 직접적인 상관관계가 있다. KCS에서 MMP-9 활성 증가는 부분적으로 각막 상피 장벽 기능 손상, 각막 상피 박리 증가 및 각막 표면 불규칙성의 원인이 될 수 있다.

MUC-4는 눈 표면의 수분을 유지하는 역할을 하는 뮤신이다. 뮤신 네트워크는 안구 표면을 습윤 상태로 유지하고 유해 환경 조건으로부터 보호한다. 안구 표면에서의 기능은 활택제 및 청소 분자로 작용하는 겔-형성 뮤신 분비에 기인한다. DES가 안구 뮤신의 변화를 일으킨다는 몇 가지 증거가 있다. MUC-4 상향조절은 뮤신 생성을 자극하는 방어 신호로서 작용하는 초기 마커로 해석될 수 있다.

AQP-3은 삼투 구배에 반응하여 세포막을 가로질러 물을 운반하는 필수 막 단백질이다. AQP-3은 낮은 수준으로 각막 상피에서 및 주로 증식하는 기저 세포층에서 발현된다. 안구 표면에서, AQP-3 상향조절은 상피 재표면화를 가속화할 것으로 예측된다. AQP-3의 증가는 눈물 삼투압 안정화의 결과로 수분 함량의 증가를 자극하는 긍정적인 효과가 있다. 건조 상태에서, AQP-3은 과발현되어 기저층으로부터 조직의 상층으로 전위되어 높은 막 수분 투과성을 반영하고 변형된 수분 통로에서 AQP-3의 기능적 역할을 확인하였다.

모든 데이터는 음성 대조군 (상대 정량화 (RQ) = 1로 설정)에 대해 정규화되었다. RQ ≤ 0.5는 유의미한 하향조절로 분류된 반면에, RQ ≥ 2는 유의미한 상향조절로 분류되었다. 건조 (양성) 대조군과 비교하여 건조 스트레스에 대한 또는 건조 스트레스 회복에 대한 긍정적인 효능을 갖는 것으로 조성물은 정의되었고, TNF-α가 하향조절되거나/조절되지 않은 경우, AQP-3은 조절되지 않았고, MMP-9는 하향조절되거나/조절되지 않았으며, MUC-4는 조절되지 않았다.

도 4에서, 처리전 시리즈에 대한 RQ 결과가 보고된다.

스트레스 종료 직후 양성 대조군 (PC)은 AQP-3, MMP-9 및 MUC-4의 유의미한 상향조절을 보였다. 결과는 수분 보유 능력의 손상 및 안구 표면 장벽 손상에 대한 방어를 반영한다. 이때 TNF-α는 발현되지 않았다.

건조 스트레스의 유도 중에 항상성 거동을 유지하는 긍정적인 효능은 본 발명에 따른 마이크로에멀젼 (P4)에 기인할 수 있으며, 여기서 표적 유전자의 조절은 검출되지 않았다.

P1은 건조 (양성) 대조군과 비교하여 MUC-4의 발현 감소 및 생성물 독성 (조직학에 의해 밑줄이 그어진 바와 같음)과 관련된 TNF-α의 과발현을 유도하였다.

P2 및 P3은 전반적으로 동일한 특징, 즉 MUC-4의 발현 감소를 보였고, AQP-3, MMP-9 및 TNF-α에는 영향을 미치지 않았다. 그러나 TNF-α에 대한 RQ 값이 1.7인 P3은 유의미한 상향조절 수준에 근접하였다.

도 5에서 처리후 시리즈 36시간 + 6시간에 대한 RQ 결과가 보고된다.

AQP-3은 스트레스 6시간 후 양성 대조군 (PC)에서 여전히 상향조절되었으며, 이는 수분 보유 능력의 불균형을 나타낸다. MMP-9 및 TNF-α 전사 활성은 손상된 HCE 항상성을 시사하는 유의성 수준에 근접하였다.

P1은 염증 경로 및 AQP-3 불균형을 감소시키는데 효과적이지 않았으며, 유전자 과발현에 기반한 건조 스트레스에 대응하는 효과를 보이지 않았다.

P2 및 P3 모두 양성 대조군과 비교하여 AQP-3 및 MMP-9 과발현을 약간 감소시켰다. 또한, P3은 TNF-α의 유의미한 과발현과 관련이 있었다.

본 발명에 따른 마이크로에멀젼 (P4)은 AQP-3 발현 수준을 감소시키는데 효과적이었고, HCE 항상성 균형 (MMP-9 및 TNFα의 조절 없음)을 회복시키는데 유의미하게 효과적이었다.

도 6에서 처리후 시리즈 36시간 + 24시간에 대한 RQ 결과가 보고된다.

양성 대조군 (PC)은 건조 스트레스로부터의 회복을 나타내는 표적 유전자의 생리학적 발현 (유의미한 발현 수준 없음)을 회복하였다.

P1은 여전히 염증 자극을 결정하고 있었다.

P2 및 P3은 양성 대조군과 상이하지 않은 효능을 보였다.

본 발명에 따른 마이크로에멀젼 (P4)은 높은 항-염증 효능을 나타내는 MMP-9 및 TNF-α의 하향 조절을 유도하였다.

5.3 TEER 측정: 장벽 기능 특성

HCE 장벽 무결성의 물리적 파라미터인 TEER (trans-epithelial electrical resistance)을 사용하여 건조 모델 및 조성물이 (처리전 시리즈) 스트레스 유도 동안 및 (처리후 시리즈) 스트레스 유도 후에 점막 상피 수준에서 이온 파라세포 플럭스 (ion paracellular flux)에 미치는 영향을 특성화하였다.

처리전 (t = 0h) TEER 값은 밀착 연접 구조의 무결성 및 상피 두께에 연결된 장벽의 전반적인 저항성을 반영한다.

도 7에는 처리전 시리즈에 대한 건조 조건에서 36시간 후 Ohm*cm²로 표시되는 TEER의 결과가 보고되어 있다.

음성 대조군 (NC)과 비교하여 건조 조건 (PC)에서 인큐베이션된 DES 모델의 TEER 값에서 유의미한 변형은 관찰되지 않았다.

P1은 건조 대조군과 비교하여 유의미한 TEER 감소를 보였다 (-60%).

P2는 건조 대조군과 비교하여 유의미한 변형을 보이지 않았다 (-9%).

P3 및 본 발명에 따른 마이크로에멀젼 (P4)은 건조 대조군 조직과 비교하여 유의미한 TEER 증가를 보였다 (각각 + 27% 및 + 29%).

도 8에는 처리후 시리즈에 대한 표준 배양 조건에서 36시간 건조 + 6시간 및 24시간 처리 후에 Ohm*cm²로 표시되는 TEER의 결과가 보고되어 있다.

음성 대조군 (NC)과 비교하여 건조 조건 (PC)에서 인큐베이션된 HCE 조직의 TEER 값에서 유의미한 변형은 관찰되지 않았다.

건조 조건에서 36시간 + 표준 조건에서 6시간 처리 후에, 테스트한 모든 조성물과 건조 대조군을 비교하여 유의미한 변형은 관찰되지 않았다.

건조 조건에서 36시간 + 표준 조건에서 24시간 처리 후에

P1은 건조 대조군과 비교하여 TEER의 유의미한 감소가 관찰되었다 (-58%);

P2 및 P3은 건조 대조군과 비교하여 유의미한 변형이 관찰되지 않았다 (각각 + 7% 및 + 8%);

P4는 건조 대조군과 비교하여 TEER 감소가 관찰되었다 (-23%).

실시예 9 - 안구건조증의 인 비트로 모델

1. 도입

실시예 9에서, 상기 기재된 HCE 안구건조증 모델을 사용하여 실시예 1에 따라 제조된 본 발명의 마이크로에멀젼 (P1) 및 상업적으로 이용 가능한 안과용 조성물 XIIDRA® Lifitegrast 5% (참조 제품, P2)의 효능을 평가하고 비교하였다.

상기 조성물 P1 및 P2를 이전에 40시간 동안 건조 스트레스를 가한 HCE 조직에 적용하고, 표준 조건에서 24시간 동안 추가로 배양하였다.

하기 파라미터를 평가하였다:

바이오마커의 유전자 발현:

- 수분 통로 조절에 역할을 하는 AQP-3;

- 세포외 기질 분해에 역할을 하는 MMP-9;

- 염증 반응에서 역할을 하는 ICAM-1;

- 염증 반응에서 역할을 하는 TNF-α;

- 염증 반응에서 역할을 하는 TLR4;

- 히알루론산 흡수의 조절에서 역할을 하는 CD44

조직학적 분석 (H&E 염색)

조성물 P1 및 P2로 처리한 DES 모델의 결과를 표준 조건에서 배양하고 식염수 용액으로 처리한 HCE 조직 (음성 대조군) 및 건조 조건에서 40시간 동안 배양하고, 회수하고 표준 배양 조건에서 24시간 동안 식염수 용액으로 처리한 HCE 조직 (양성 DES 대조군)과 비교하였다.

2. 실험 디자인

HCE 조직을 전술한 바와 같이 제조하고 (실시예 8 참조), 정의된 제어 조건 (낮은 RH < 40%, T = 40℃)으로 옮기고, 40시간 동안 건조 스트레스를 유도하는데 사용하였다.

그 다음에, 15 μL의 조성물 P1 또는 P2를 DES 모델에 직접 균일하게 적용하고, DES 모델을 표준 배양 조건에서 24시간 동안 추가로 배양하여 항상성 회복에 대한 생성물 효능을 평가하였다.

결과를 하기와 비교하였다:

음성 대조군 (NC), 즉 HCE 조직을 표준 조건에서 40시간 동안 배양한 다음에, 식염수 용액 (0.9% NaCl, 15 μL)으로 처리하고, 표준 배양 조건에서 24시간 동안 회수하였다.

양성 대조군 (DES): HCE 조직을 건조 조건 (RH < 40%, T = 40℃의 CO₂ 인큐베이터)에서 40시간 동안 배양한 다음에, 식염수 용액 (0.9% NaCl, 15 μL)으로 처리하고, 표준 배양 조건에서 24시간 동안 회수하였다.

노출 기간의 종료 시에, DES 모델을 식염수 용액으로 헹구고, 다음 분석을 위해 샘플을 준비하였다:

수분 통로 (AQP-3), 세포외 기질 모델링 (MMP-9), 염증 (TNF-α, ICAM-1, TLR-4) 및 히알루론산 흡수의 조절 (CD44)에 영향을 미치는 특정 유전자 시그니처의 RT-qPCR에 의한 유전자 발현 (3중)

H&E 염색에 의한 조직-형태 (중복)

조직-형태학적 분석 및 실시간 PCR을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다.

3. 결과

3.1 조직학적 분석: H&E 염색

3개의 수직 조직 절편을 각 조직학적 슬라이드에 준비하였다; 하나의 선택된 슬라이드에서 3개의 선택된 부분의 3개의 현미경 획득을 각 생물학적 복제에 대해 수행하였다. 각 샘플에 대해 선택된 수직 절편의 대표적인 획득이 본원에 보고된다.

음성 대조군 모델의 형태는 배양 시간 동안 유의미하게 변형되지 않았으며, 기대된 바와 같이 HCE 조직 두께는 이 시간 동안 증가하여 우수한 증식 상태를 확인하였다 (도 9 참조).

건조 대조군 (양성 대조군)은 음성 대조군과 비교하여 하기 형태학적 변형을 나타내었다:

HCE 조직 두께의 감소

소수의 picnotic 날개 세포

표재 세포층에 의한 뮤신 생성의 감소

건조 스트레스 기간 후에 참조 형태의 회복이 부분적으로 관찰되었다. 표재층은 세포 주위에 뮤신 형성을 나타내었고, 또한 HCE 조직 두께는 40시간 + 24시간 처리 후에 음성 대조군과 유사한 값으로 증가하였다.

적용된 조성물 (P1 및 비교 조성물 P2)에 따라 24시간의 회복 기간 중에 건조 HCE 조직에 대한 처리 효과는 도 10에 표시되어 있다.

본 발명에 따른 마이크로에멀젼 P1로 처리한 DES 모델은 40시간 + 24시간 처리 후에 음성 대조군과 비교하여 완벽하게 보존된 기저 세포, 비-변형된 날개 세포로 매트릭스 리모델링, 및 조직 두께의 약간의 증가를 보여주었다.

P2로 처리한 DES 모델은 40시간 + 24시간 처리 후에 음성 대조군과 비교하여 소수의 picnotic 핵을 갖는 부분적으로 보존된 기저 세포, 소수의 picnotic 핵을 갖는 날개 세포 팽창, 표재 세포층의 상피 무결성의 유의미한 변형, 및 조직 두께의 약간의 증가를 보여주었다.

3.2 실시간 PCR

선택된 바이오마커의 생물학적 역할은 실시예 8 (MMP-9, AQP-3, TNF-α) 및 하기에 기재되어 있다.

CD44 (히알루론산 수용체)는 편재적으로 발현되는 세포 표면 프로테오글리칸이며, 히알루론산 (HA)에 대한 주요 세포 표면 수용체이다. HA는 고분자량의 선형 폴리머이며, 세포외 기질의 주요 성분이다. 이는 공간 충전, 관절 윤활, 세포가 이동할 수 있는 매트릭스 제공 등 다양한 기능을 제공하며, 지속적으로 수분을 제공하면 수중에서 이의 중량의 최대 1000배로 결합한다. HA는 또한 정상 표피 기능에 필수적인 상피 증식 과정에서 뿐만 아니라 조직 회복에서 재상피화 과정에서 조작인자 (manipulator)로서 기능한다.

TLR4 (Toll-유사 수용체 4)는 NF-kB의 활성화를 자극하는 패턴 인식 수용체이며, 선천성 및 적응성 면역 반응의 유도와 함께 염증유발 사이토카인의 생성을 상향조절한다. DES에서, 피브로넥틴, 히알루론산 및 헤파란 설페이트를 포함한 세포외 기질 성분의 분해는 TLR4의 내인성 생물활성화제를 생성한다. 결과적으로, TLR4 발현은 안구 표면의 건조 스트레스에 대한 염증 반응의 증가와 함께, DES에서 상향조절된다.

ICAM-1 (세포간 부착 분자 1, 또한 CD54로 알려짐)은 신호전달 분자로 간주되며, 상피 세포에 의한 동원 잠재적 항원 제시에 의해 안구 표면 염증을 촉진한다. 내인성 ICAM-1 발현의 증가는 DES 환자의 결막 및 부속 눈물분비 조직에 존재하는 상피 세포에서 검출된다. ICAM-1 상향조절은 IL-1α 및 TNF-α에 의해 유발되고, 백혈구 표면에서 수용체 LFA1의 인식을 통해 염증이 있는 안구 부위로 백혈구 동원을 자극한다.

도 11은 건조 스트레스 (PC, 40시간)를 받고 표준 조건에서 24시간 동안 인큐베이션된 후에 대조군 조직의 상대 정량화 (RQ) 값을 나타낸다. 결과는 음성 대조군 (NC 40h + 24h, RQ = 1로 설정, 실시예 8 참조)에 대해 표시되고, 40시간의 건조 스트레스 후 DES 모델의 확립 및 후속 회복 단계를 반영한다.

40시간의 스트레스 유도 직후에, DES 양성 대조군은 AQP-3의 유의미한 상향조절을 보였다. AQP-3 과발현은 수분 보유 능력의 조절장애 및 수분 통로의 변형에 의한 막 수분 투과성 증가를 반영하여, DES 모델이 확립되었음을 확인하였다. 이러한 발견은 또한 조직학적 수준에서 볼 수 있는, 건조 스트레스로 인한 HCE 조직의 두께 감소에 의해 입증되었다.

24시간의 회복 기간 후에, AQP-3은 DES 양성 대조군에서 여전히 상향조절되었고 (그러나, 유의미하지 않은 발현 수준임), 이는 건조 스트레스로부터의 회복을 나타낸다. 조사 중인 다른 유전자는 유의미하게 조절되지 않았지만, MMP-9 발현은 40시간에서 DES와 비교하여 약간 증가한 것으로 나타났다.

도 12에는 건조 스트레스 (PC)를 받은 조직 및 표준 조건에서 인큐베이션 후 기간 동안 24시간 동안 테스트 조성물 P1 및 P2로 처리한 조직의 RQ 값이 도시되어 있다. 결과는 DES 대조군 (PC 40h + 24h는 1로 설정됨)에 대해 표시된다.

P1 및 P2로의 처리는 AQP-3의 하향조절에 의해 표시되는, 수분 투과성 불균형을 줄이는데 효과적이었다.

P1로 처리한 후에 MMP-9 하향조절이 관찰되었다. 이러한 감소는 각막 장벽 기능 및 박리의 손상을 초래하는 기질 및 밀착 연접 단백질 분해를 억제하는데 본 발명에 따른 마이크로에멀젼의 긍정적인 효과를 나타낸다.

비교 조성물 P2로 처리한 후에 반대의 결과가 관찰되었으며, 여기서 MMP-9의 상향 조절은 P2가 불규칙한 세포외 기질 및 밀착 연접 단백질 분해를 야기하여 각막 손상 치유의 지연을 촉진할 수 있음을 나타내었다.

P2로 처리한 후에 관찰된 ICAM-1의 상향조절은 이 조성물이 안구 표면 염증을 촉진하여, 염증이 있는 안구 표면으로 백혈구의 잠재적 동원을 촉진할 수 있음을 시사한다. 그러나, 이러한 결과는 이러한 인 비트로 모델에서 맥락화될 필요가 있으며: Xiidra®의 작용 기전은 실제로 염증 반응의 억제 (즉, 염증 부위의 백혈구 동원)와 함께, 백혈구 막에 대한 ICAM-1 수용체인 LFA의 결합을 기반으로 한다. 이러한 모델은 면역학적 구성 요소 (면역 세포 예컨대 백혈구)를 포함하지 않기 때문에, ICAM-1의 상향 조절은 다운스트림 염증 반응에 영향을 미치지 않아야 한다. 또한, ICAM-1 상향조절은 TLR4 활성화와 상관관계가 없으며, 실제로 하향조절되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 Xiidra® Lifitegrast가 항염증제로서 직접적인 효과가 있음을 나타낸다.

P1을 사용한 처리는 염증 반응에 관여하는 유전자를 조절하지 않았으며, 더욱이 TLR4는 하향조절되어 (RQ 값이 유의성 수준에 매우 근접함), 전반적인 항염증 효과를 시사한다.

2가지 제품 모두는 히알루론산 수용체 CD44에 유의미한 조절 효과를 보이지 않았다.

4. 결론

2가지 제제에 대해 수득된 결과를 표 10에 요약하였다.

	P1	P2 (비교예)
형태 (H&E)	조직이 생존 가능하고 형태가 보존된 것으로 나타남 → 제제의 보호 효과	각막 상피 표면의 변형 및 기저 수준에서 독성 징후가 거의 없음
수분 균형 (AQP3)	AQP3의 하향조절 → 수분 투과성 불균형의 감소 및 HCE 수화 항상성 회복에서의 효능
세포외 기질 분해 (MMP9)	MMP-9의 하향조절 → 각막 장벽 기능 손상에 대한 추가 보호 효능이 있는 세포외 기질 분해의 억제	MMP9의 상향조절 → 잠재적 불규칙한 세포외 기질 분해, 각막 손상 치유의 지연
염증 반응 (ICAM1, TNFα, TLR4)	염증 경로에 연결된 유전자는 TLR4의 경우 조절되지 않거나 또는 약간 하향 조절됨 → 항염증 반응	TLR-4의 활성화 없이 ICAM-1의 상향조절 → 백혈구 동원과 함께 안구 표면 염증의 잠재적인 증가 (그러나 이러한 결과는 맥락화될 필요가 있음, 상기 참조)
HA 흡수의 조절 (CD44)	히알루론산 수용체 CD44에 대한 유의미한 조절 효과 없음

실시예 10 - 마우스에서 안구건조증에 대한 마이크로에멀젼 효과의 평가

1. 안구건조증의 유도 (SiccaSystem^TM)

건조 환경 및 스코폴라민 (scopolamine) 투여 (SiccaSystem^TM)의 조합을 사용하여 마우스에서 안구건조증을 유도하였다. 스코폴라민 패치의 작은 조각 (패치의 대략 1/12)을 양쪽 귀에 배치하여 마우스에게 스코폴라민을 투여하였다. 패치를 1일 2회 확인하고, 필요한 경우 재배치하였다. 3일마다 패치를 교체하였다. 동시에, 마우스를 제어된 건조 환경 (SiccaSystem^TM, 5-10% 습도, 15 L/min 기류)에 두었다.

2. 치료 프로토콜

만성 안구건조증을 유도하기 위해 Siccasystem™에 16일 노출시킨 후에 치료를 시작하였다. 마이크로에멀젼 및 참조 화합물인 레스타시스 (Restasis)를 12일 동안 1방울 (10 μl)씩 양쪽 눈에 국소 적용하여 1일 2회 투여하였다.

3. 각막 상피 손상의 정량화

마우스를 메데토미딘:케타민:식염수 1:1.5:2.5 (0.6 mg/kg^-1 메데토미딘 및 45 mg/kg^-1 케타민에 해당)의 칵테일을 사용하여 마취하고, 체중 10 g당 30 μl를 피하 주사하였다. 마취 역전 (아티파메졸 염산염: 식염수 1:9)을 연구 15일째에 사용하였다. 1개의 소듐 플루오레세인 스트립의 1/6 (166 ng에 해당)을 각막에 10초 동안 배치하였다. 각막 상피 손상은 연구 15일째 및 연구 28일째에 Leica DM MC165FC 긴 작동-거리 현미경 (long working-distance microscope) (Leica Microsystems)을 사용하여 사진으로 촬영하여 등록하였다.

각막 표면 염증의 중증도는 플루오레세인 반점 및 패치를 하기와 같이 맹목적으로 스코어링하여 평가하였다:

없음 = 0;

약간의 점상 염색 = 1;

점상 염색이 강하지만 확산되지 않음 = 2;

작은 양성 플라크 영역 = 3; 및

대면적 플루오레세인 플라크 = 4.

4. 결과

도 13에 도시된 바와 같이, ME5%는 15일째부터 28일째까지 각막 플루오레세인 염색의 통계적으로 유의미한 개선을 보여주었다 (Wilcoxon matched-pairs signed rank test, P < 0.05; 도 13B). 이러한 감소는 참조 화합물인 Restasis®에 의한 효과와 유사하였다 (P < 0.05; 도 13D). ME7%는 개선된 각막 플루오레세인 염색 스코어에 대한 통계적 경향을 보였다 (P = 0.17; 도 13C). 대조적으로, 미처리한 눈의 각막 플루오레세인 염색은 15일 내지 28일 사이에 유의미한 차이가 없었다 (P > 0.99; 도 13A).

결론

본 발명에 따른 마이크로에멀젼은 안구건조증에 대해 매우 강력한 활성을 발휘하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 치유 효과는 각막 수화 및 항상성 증가, 수분 손실의 감소 및 스캐폴드 상호연결 조직의 유지와 같이 다요인적이며, 예기치 않은 염증 감소가 관찰되었다.

매우 강한 DES 조건에 노출된 후 본 발명의 마이크로에멀젼으로 처리된 인 비트로 인간 각막 상피에 대해 수행된 유전자-발현 분석은 DES: MMP-9 (각막 상피 기저막의 생체고분자 성분 및 세포간 밀착 연접의 분해를 유도하여 각막 박리 및 궤양을 유발하는 효소), AQP-3 (물 분자를 운반하여, 수분 손실을 유발하는 운반체 단백질), CD44 (조직 수화 및 세포간 공간 충전의 주요 인자인 히알루론산의 농도의 생화학적 제어) 및 TLR4 (염증성 사이토카인의 생성을 활성화하는 세포막 Toll-유사 수용체)와 관련된 바이오마커의 예상치 못한 감소를 보여주었다; 이러한 다인자 감소는 최근 DES 치료를 위해 특별히 출시된 약물인 Xiidra® Lifitegrast에 의해 유도된 효과보다 훨씬 더 컸다 (도 12 참조).

DES 유도 조건을 사용한 인 비트로 인간 각막 상피에 대한 다른 연구에서, 본 발명의 마이크로에멀젼을 사용한 치료를 CATIONORM® (양이온성 마이크로에멀젼), ARTELAC® SPLASH (히알루론산 용액) 및 SYSTANE® UD (겔화 폴리머 용액)와 비교하였다. 바이오마커 MMP-9는 모든 3개의 시판 제품보다 본 발명의 마이크로에멀젼에 의해 2배 이상 하향조절되는 결과를 초래하였다; DES에 의해 과발현되는 염증-관련 제제인 폴리펩티드 사이토카인 TNF-알파는 본 발명의 마이크로에멀젼에 의해 ARTELAC® SPLASH의 효과와 유사한 비율 만큼, SYSTAN®E UD보다 2배 이상 만큼, 및 CATIONORM®보다 800% 이상 만큼 하향조절되었고, 이는 실제로 염증을 증가시키는 결과를 초래하였다 (도 6 참조).

본 발명의 마이크로에멀젼의 매우 양호한 안과적 내약성이 인 비트로 (인간 각막 상피 세포) 및 인 비보 (토끼 및 원숭이) 모두에서 입증되었다. 항-DES 시판 제품인 CATIONORM® (양이온성 마이크로에멀젼)과의 비교에서 본 발명의 마이크로에멀젼에 대해 훨씬 더 높은 내약성을 입증하였으며, 결과적으로 무독성인 반면에, 상기 양이온성 마이크로에멀젼은 인간 각막 세포에 대해 독성이 있는 것으로 밝혀졌다 (도 1 참조).

또한 본 발명의 마이크로에멀젼의 다른 생체약학적 파라미터는 시판되는 다른 항-DES 제품보다 개선된 것으로 밝혀졌다. 습윤성, 즉 각막을 모방한 폴리머 표면 상의 마이크로에멀젼 액적의 확산성은 XILOIAL®, HYALISTIL®, VISMED®, HYABAK®, 및 DROPSTAR®의 습윤성보다 훨씬 더 높았다. 전체 각막 표면의 더 나은 잠재적 커버리지는 DES의 다양한 측면에 대해 더 강력한 효능으로 이어질 수 있다 (표 2 참조).

하기 항목들의 주제가 또한 본 발명에 포함된다.

1. 하기를 포함하는 마이크로에멀젼:

i. 적어도 하나의 오일 성분,

ii. 수성상,

iii. 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제,

iv. 적어도 하나의 폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체, 및

v. 적어도 하나의 가교제.

2. 항목 1에 있어서, 상기 오일 성분 (i)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 1.0 - 10.0 wt.-%의 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼.

3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 오일 성분 (i)은 지방산 및 지방산 에스테르, 특히 불포화 지방산 및 지방산 에스테르로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.

4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 오일 성분 (i)은 지방산 트리글리세리드 예컨대 식물 또는 동물로부터 유래된 천연 오일, 지방산 디글리세리드 예컨대 디올레인 또는 디리놀레에이트, 지방산 모노글리세리드 예컨대 모노올레인 또는 모노팔미톨레인, 1가 알코올의 지방산 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트, 지방산 예컨대 올레산 또는 리놀레산, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.

5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 오일 성분 (i)은 에틸 올레에이트, 올레산, 피마자유 (ricinus oil), 옥수수 오일 또는 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.

6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 수성상 (ii)은 물 및 선택적으로 수용해성 제제 보조제, 예컨대 완충제, 등장화제, 점도-증가 화합물, 항미생물 보존제, 항산화제, 안정화제, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 마이크로에멀젼.

7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 수성상 (ii)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 50.0 - 98.0 wt.-%의 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼.

8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제 (iii)는 알킬글루코시드, 폴리옥시알킬렌 알킬 에테르, 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀, 폴리옥시알킬렌 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 블록-코폴리머, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 글리세리드, 폴리옥시알킬렌 스테롤, 폴리옥시알킬렌 식물성 오일, 폴리옥시알킬렌 수소화 식물성 오일, 폴리글리세롤 에테르, 폴리옥시알킬렌 글리세롤 에스테르, 폴리비닐알코올, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.

9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (iii)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 0.40 내지 10.00 wt.-%의 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼.

10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (iii)은 특히 제1/제2 비-이온성 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80®)/폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트 (Tween 20®), 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80®)/폴리옥실(2) 세틸에테르 (Brij 52®), 폴리옥실(2) 세틸에테르 (Brij 52®)/폴리옥실(20) 세틸에테르 (Brij 58®) 및 폴리옥실 (20) 세틸에테르 (Brij 58®)/폴리옥실(10) 세틸에테르 (Brij 56®)의 조합으로부터 선택되는, 적어도 2개의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 것인 마이크로에멀젼.

11. 항목 10에 있어서, 상기 제1 비-이온성 계면활성제 대 제2 비-이온성 계면활성제의 비율은 10:1 - 1:1, 특히 2:1 - 1:1인 것인 마이크로에멀젼.

12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (iv)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 0.001 내지 0.100 wt.-%, 바람직하게는 0.020 내지 0.050 wt.-%의 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼.

13. 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (iv)은 히알루론산, 펙틴, 셀룰로스 유도체, 예를 들어 카복시메틸 셀룰로스, 알긴산, 카라기난, 키토산, 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염, 특히 히알루론산 나트륨으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.

14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (v)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 0.005 내지 0.100 wt.-%의 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼.

15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (v)은 성분 (iv)을 가교시킬 수 있는 것인 마이크로에멀젼.

16. 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (v)은 적어도 하나의 카복실기 또는 이의 염을 갖고, 바람직하게는 폴리카복실산, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 말레산, 이의 염 또는 이들의 혼합물인 것인 마이크로에멀젼.

17. 항목 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (v)은 양이온성 가교제 예컨대 다가 금속 이온, 특히 Ca²⁺ 또는 Mg²⁺, 이의 염 또는 이들의 혼합물인 것인 마이크로에멀젼.

18. 항목 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 공-계면활성제 (vi)를 추가로 포함하는 것인 마이크로에멀젼.

19. 항목 18에 있어서, 상기 공-계면활성제 (vi)는 비-이온성 계면활성제, 모노 알코올, 폴리올 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.

20. 항목 18 또는 19에 있어서, 상기 공-계면활성제 (vi)는 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 1.00 내지 5.00 wt.-%의 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼.

21. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분 (iv) 대 성분 (v)의 중량비는 1:1 - 1:20, 바람직하게는 1:1 - 1:2인 것인 마이크로에멀젼.

22. 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 마이크로에멀젼은 수중유 마이크로에멀젼인 것인 마이크로에멀젼.

23. 항목 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 오일 액적의 평균 평균값 직경 (mean average diameter)은 5 내지 10,000 nm, 바람직하게는 50 내지 1000 nm의 범위인 것인 마이크로에멀젼.

24. 항목 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서,

성분 (i)으로서 적어도 하나의 1가 알코올의 지방산 에스테르,

성분 (ii)으로서 약학적으로 허용 가능한 물,

성분 (iii)으로서 적어도 하나의 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르,

성분 (iv)으로서 히알루론산 또는 이의 염,

성분 (v)으로서 시트르산 또는 이의 염; 및

선택적으로 공-계면활성제 (vi)로서 소르비톨을 포함하는 것인 마이크로에멀젼.

25. 항목 24에 있어서,

성분 (i)은 에틸 올레에이트이고,

성분 (iii)은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (Tween 80^®) 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 (Tween 20^®)의 혼합물이며,

성분 (v)은 시트르산 칼슘인 것인 마이크로에멀젼.

26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 성분들 (i) 내지 (vi)은 에멀젼의 총 중량에 기반하여 하기 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼:

1.0 - 10.0 wt.-%의 성분 (i),

50.0 - 98.0 wt.-%의 성분 (ii),

0.40 - 10.00 wt.-%의 성분 (iii),

0.001 - 0.050 wt.-%, 바람직하게는 0.020 - 0.050 wt.-%의 성분 (iv),

0.005 - 0.100 wt.-%의 성분 (v), 및

선택적으로 1.00 - 5.00 wt.-%의 성분 (vi).

27. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 약물, 구체적으로 리툭시맙, 토실리주맙, 리보글리타존, 마프라코라트, 레졸빙, 타소티시닙, 토파시티닙, 보클로스포린, 티모신, 에카베트, 리멕솔론, 레바미파이드, 디쿠아포솔, 브롬페낙, 덱사메타손, 시프로플록사신, 오플록사신, 네오마이신, 토브라마이신, 간시클로비르, 팜시클로비르, 발간시클로비르, 아시클로비르, 헥사미딘, 덱사메타손, 플루오로메톨론, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 케토롤락, 디클로페낙, 인도메타신, 케토롤락, 네파페낙, 브롬페낙, 브린졸아미드, 아세타졸아미드, 도르졸아미드, 브리모니딘, 카르테올롤, 베탁솔, 티몰롤, 레보부놀, 라타노프로스트, 타플루프로스트, 비마토프로스트, 트라보프로스트, 아트로핀, 사이클로펜톨레이트, 트로피카미드, 스코폴라민, 테트리졸린, 나파졸린, 안타졸린, 아젤라스틴, 에메다스틴, 레보카바스틴, 올로파타딘, 케토티펜, 아플리버셉트, 라니비주맙, 베바시주맙으로부터 선택된 약물이 존재하지 않는 것인 마이크로에멀젼.

28. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 추가의 약물 (vii), 구체적으로 리툭시맙, 토실리주맙, 리보글리타존, 마프라코라트, 레졸빙, 타소티시닙, 토파시티닙, 보클로스포린, 티모신, 에카베트, 리멕솔론, 레바미파이드, 디쿠아포솔, 브롬페낙, 덱사메타손, 시프로플록사신, 오플록사신, 네오마이신, 토브라마이신, 간시클로비르, 팜시클로비르, 발간시클로비르, 아시클로비르, 헥사미딘, 덱사메타손, 플루오로메톨론, 하이드로코르티손, 프레드니솔론, 케토롤락, 디클로페낙, 인도메타신, 케토롤락, 네파페낙, 브롬페낙, 브린졸아미드, 아세타졸아미드, 도르졸아미드, 브리모니딘, 카르테올롤, 베탁솔, 티몰롤, 레보부놀, 라타노프로스트, 타플루프로스트, 비마토프로스트, 트라보프로스트, 아트로핀, 사이클로펜톨레이트, 트로피카미드, 스코폴라민, 테트리졸린, 나파졸린, 안타졸린, 아젤라스틴, 에메다스틴, 레보카바스틴, 올로파타딘, 케토티펜, 아플리버셉트, 라니비주맙, 베바시주맙으로부터 선택된 약물을 포함하는 것인 마이크로에멀젼.

29. 항목 28에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 약물 (vii)은 오일 성분 (i)에 용해되는 것인 마이크로에멀젼.

30. 항목 28 또는 29에 있어서, 상기 성분 (vii)은 마이크로에멀젼의 총 중량에 기반하여 0.001-10.0 wt.-%의 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼.

31. 항목 1 내지 30 중 어느 하나에 따른 마이크로에멀젼을 제조하는 방법으로서,

(b) 성분 (ii)을 단계 (a)에서 수득된 혼합물에 교반하면서 부가하는 단계를 포함하는 마이크로에멀젼을 제조하는 방법.

32. 항목 31에 따른 방법에 의해 수득 가능한 마이크로에멀젼.

33. 항목 1 내지 30 또는 32 중 어느 하나에 따른 마이크로에멀젼을 포함하는 약학적 조성물.

34. 항목 33에 있어서, 안구 적용을 위한 것인 약학적 조성물.

35. 항목 1 내지 30 및 32 중 어느 하나, 또는 항목 33 또는 34에 있어서, 안구 적용, 바람직하게는 안구건조증의 예방, 완화 및/또는 치료에 사용하기 위한 것인 마이크로에멀젼 또는 약학적 조성물.

36. 담체, 구체적으로 약물 담체, 예컨대 안과용 약물 담체로서, 항목 1 내지 30 또는 32 중 어느 하나에 따른 마이크로에멀젼의 용도.

Claims

하기를 포함하는 마이크로에멀젼 (Microemulsion):
i. 적어도 하나의 오일 성분,
ii. 수성상,
iii. 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제,
iv. 적어도 하나의 폴리사카라이드, 이의 염 또는 유도체, 및
v. 적어도 하나의 가교제.
청구항 1에 있어서, 상기 오일 성분 (i)은 지방산 및 지방산 에스테르, 특히 불포화 지방산 및 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 올레산, 피마자유 (ricinus oil), 옥수수 오일 또는 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 적어도 하나의 비-이온성 계면활성제 (iii)는 알킬글루코시드, 폴리옥시알킬렌 알킬 에테르, 폴리옥시알킬렌 알킬 페놀, 폴리옥시알킬렌 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 블록-코폴리머, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시알킬렌 글리세리드, 폴리옥시알킬렌 스테롤, 폴리옥시알킬렌 식물성 오일, 폴리옥시알킬렌 수소화 식물성 오일, 폴리글리세롤 에테르, 폴리옥시알킬렌 글리세롤 에스테르, 폴리비닐알코올, 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 (iv)은 히알루론산, 펙틴, 셀룰로스 유도체, 예를 들어 카복시메틸 셀룰로스, 알긴산, 카라기난, 키토산, 바람직하게는 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염, 특히 히알루론산 나트륨으로부터 선택되는 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 (v)은 성분 (iv)을 가교시킬 수 있는 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 (v)은 적어도 하나의 카복실기 또는 이의 염을 갖고, 바람직하게는 폴리카복실산, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 말레산, 이의 염 또는 이들의 혼합물인 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성분 (v)은 양이온성 가교제 예컨대 다가 금속 이온, 특히 Ca²⁺ 또는 Mg²⁺, 이의 염 또는 이들의 혼합물인 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 비-이온성 계면활성제, 모노 알코올, 폴리올 및 이들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 공-계면활성제 (vi)를 추가로 포함하는 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로에멀젼은 수중유 마이크로에멀젼인 것인 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 9 중 어느 항에 있어서, 상기 성분들 (i) 내지 (vi)은 에멀젼의 총 중량에 기반하여 하기 양으로 존재하는 것인 마이크로에멀젼:
1.0 - 10.0 wt.-%의 성분 (i),
50.0 - 98.0 wt.-%의 성분 (ii),
0.40 - 10.00 wt.-%의 성분 (iii),
0.001 - 0.050 wt.-%, 바람직하게는 0.020 - 0.050 wt.-%의 성분 (iv),
0.005 - 0.100 wt.-%의 성분 (v), 및
선택적으로 1.00 - 5.00 wt.-%의 성분 (vi).
청구항 1 내지 10 중 어느 항에 따른 마이크로에멀젼을 제조하는 방법으로서,
(a) 성분들 (i), (iii), (iv), (v), 선택적으로 (vi), 및 선택적으로 (vii)의 혼합물을 제조하는 단계, 및
(b) 성분 (ii)을 단계 (a)에서 수득된 혼합물에 교반하면서 부가하는 단계를 포함하는 마이크로에멀젼을 제조하는 방법.
청구항 11에 따른 방법에 의해 수득 가능한 마이크로에멀젼.
청구항 1 내지 10 또는 12 중 어느 항에 따른 마이크로에멀젼을 포함하는 약학적 조성물로서, 바람직하게는 안구 적용을 위한 것인 약학적 조성물.
청구항 1 내지 10 및 12 중 어느 항, 또는 청구항 13에 있어서, 안구 적용, 바람직하게는 안구건조증의 예방, 완화 및/또는 치료에 사용하기 위한 것인 마이크로에멀젼 또는 약학적 조성물.
담체, 구체적으로 약물 담체, 예컨대 안과용 약물 담체로서, 청구항 1 내지 10 또는 12 중 어느 항에 따른 마이크로에멀젼의 용도.