KR20230016193A - 베타코로나바이러스에 대한 면역화를 위한 바이러스 백신 벡터 - Google Patents

베타코로나바이러스에 대한 면역화를 위한 바이러스 백신 벡터 Download PDF

Info

Publication number
KR20230016193A
KR20230016193A KR1020227044771A KR20227044771A KR20230016193A KR 20230016193 A KR20230016193 A KR 20230016193A KR 1020227044771 A KR1020227044771 A KR 1020227044771A KR 20227044771 A KR20227044771 A KR 20227044771A KR 20230016193 A KR20230016193 A KR 20230016193A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
immunogen
sars
val
cov
Prior art date
Application number
KR1020227044771A
Other languages
English (en)
Inventor
알렉산드루 아드리안 헨리히
카를-클라우스 콘첼만
Original Assignee
알렉산드루 아드리안 헨리히
카를-클라우스 콘첼만
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알렉산드루 아드리안 헨리히, 카를-클라우스 콘첼만 filed Critical 알렉산드루 아드리안 헨리히
Publication of KR20230016193A publication Critical patent/KR20230016193A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20223—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 (a) 바이러스 입자를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) 바이러스 입자의 외피로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는 재조합 랍도바이러스(rhabdovirus) 벡터, 및/또는
(b) 바이러스-유사 입자(VLP)를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) VLP로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는, 당단백질 (G) 단백질 유전자가 결실되고 트랜스에서 G 단백질이 보충된 재조합 랍도바이러스 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

베타코로나바이러스에 대한 면역화를 위한 바이러스 백신 벡터
본 발명은 (a) 바이러스 입자를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) 바이러스 입자의 외피로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는 재조합 랍도바이러스(rhabdovirus) 벡터, 및/또는
(b) 바이러스-유사 입자(VLP)를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) VLP로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는, 당단백질 (G) 단백질 유전자가 결실되고 트랜스에서 G 단백질이 보충된 재조합 랍도바이러스 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
이 명세서에서, 본 출원 및 제조업체의 매뉴얼을 포함하는 다수의 자료들이 인용된다. 이들 자료의 개시물은 이 발명의 특허성에 관련된다고 간주되지 않으나 이의 전체가 참조로 여기에 통합된다. 보다 구체적으로, 모든 참조된 자료는 각각의 개별적인 자료가 구체적이고 개별적으로 참조로 통합되도록 지시되는 것과 같은 정도로 참조에 의해 통합된다.
백신은 질병 유발 바이러스의 불활성 또는 생 약독화 버전, 표적 바이러스의 면역원성 단백질을 발현하는 이종 바이러스 벡터, 바이러스-유사 입자(VLP)을 포함하는 서브유닛 백신, 또는 개별 면역원성 단백질, 또는 바이러스의 면역원성 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA을 포함할 수 있다.
이전 코로나바이러스 연구에서 알려진 바와 같이, 불활성 또는 생 약독화 코로나바이러스 백신 제제는 효과가 낮고, 더 중요한 것은, 그것이 백신 접종자의 자연 감염인 경우 질병의 항체 의존적 증강(antibody dependent enhancement, ADE)의 위험을 야기한다는 것이다. DNA 제제 또는 합성 안정화 mRNA는 쉽게 구할 수 있지만 전달이 불량하고 항원 발현이 불충분하여 부스트 면역화가 필요할 수 있다. 단백질 서브유닛 백신은 일반적으로 다수의 순차적인 면역화(부스트)가 필요하며 현실적으로 종종 실행 불가능하다.
현재 코로나바이러스, 특히 신종 베타코로나바이러스 SARS-CoV-2(중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2)에 대한 면역화에 사용할 수 있는 백신은 없다. 효율적인 SARS-CoV-2 백신을 만드는 데 해결해야 할 문제는 최고의 전달 시스템(예를 들어, 바이러스 벡터 대 VLP?), 최고의 항원 및 이의 제시(완전 스파이크 (S) 단백질, S의 수용체-결합 도메인(RBD), 막 결합 또는 가용성 단백질 또는 오히려 E 또는 N 단백질)의 선택, 및 항원의 크기를 줄여 중요한 에피토프 및 항원성을 잃지 않고 효과적인 발현 수준을 가능케하며, 질병의 항체 의존적 증강(ADE)을 최소화하는 것을 포함하여 다양하다.
현재 272개 이상의 SARS-CoV-2 백신 후보가 개발 중이다ttps://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines). 한편 여러 COVID-19 백신이 허가되었다. 선두 주자 Covid-19 백신은 융합전 안정화된 형태의 S 항원(Corbett et al., 2020; Polack et al., 2020) 또는 복제 불능 아데노바이러스(Sadoff et al., 2021)의 발현을 위한 명백히 무해한 mRNA 전달을 사용한다. 다행스럽게도 이러한 조합은 안전한 것으로 판명되었으며 팬데믹 퇴치에 큰 가능성이 있다. 그러나 많은 제안된 COVID-19 백신 후보는 융합 전 및 후 형태로 존재하고 및/또는 VSV를 포함하여 복제 가능 바이러스를 기반으로 하는 변형되지 않은 S 단백질을 사용한다. 다행스럽게도 일부 허가된 SARS-CoV-2 백신이 명백한 즉각적인 부작용 없이 COVID-19 질병으로부터 보호하는 면역 반응을 자극할 수 있고 근본적으로 팬데믹의 향후 억제에 기여할 수 있다는 것이 밝혀지는 한편(예를 들어, Corbett et al., 2020; Dagan et al., 2021; Polack et al., 2020; Sadoff et al., 2021) 참조), 모든 연령과 상태의 인간을 신속하게 보호해야 할 필요성을 충족하고 및/또는 바이러스 전염을 예방하기 위해 수많은 다양한 백신 후보들이 개발되고 있다. 항원, 어쥬번트 및 전달 비히클에 대한 신중하고 투명한 평가는 의학적 위험을 예방하고 백신에 대한 대중의 신뢰를 고취하는 데 매우 중요하다.
SARS-CoV-2 및 COVID-19의 사람 간 전염은 2020년 1월 20일에 확인되었으며 그 이후로 질병은 전 세계적인 팬데믹으로 발전하였다. 거의 모든 국가가 영향을 받고 있다. 2020년 5월 18일 현재 470만 명 이상이 SARS-CoV-2 감염 진단을 받았으며 이 중 300,000명 이상이 SARS-CoV-2로 인한 COVID-19 질병으로 사망하였다. 2021년 4월, 전세계적으로 142,118,571건의 사례가 보고되었고 3,030,557명이 COVID-19로 사망하였다.
Abraham, G., & Banerjee, A. K. (1976). Sequential transcription of the genes of vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A, 73(5), 1504-1508. Astori, M., & Kraehenbuhl, J. P. (1996). Recombinant fusion peptides containing single or multiple repeats of a ubiquitous T-helper epitope are highly immunogenic. Mol Immunol, 33(13), 1017-1024. doi:10.1016/s0161-5890(96)00068-5 Baum, A., Fulton, B. O., Wloga, E., Copin, R., Pascal, K. E., Russo, V., . . . Kyratsous, C. A. (2020). Antibody cocktail to SARS-CoV-2 spike protein prevents rapid mutational escape seen with individual antibodies. Science. doi:10.1126/science.abd0831 Bishnoi, S., Tiwari, R., Gupta, S., Byrareddy, S. N., & Nayak, D. (2018). Oncotargeting by Vesicular Stomatitis Virus (VSV): Advances in Cancer Therapy. Viruses, 10(2). doi:10.3390/v10020090 Black, B. L., & Lyles, D. S. (1992). Vesicular stomatitis virus matrix protein inhibits host cell-directed transcription of target genes in vivo. J Virol, 66(7), 4058-4064. Buchholz, U. J., Bukreyev, A., Yang, L., Lamirande, E. W., Murphy, B. R., Subbarao, K., & Collins, P. L. (2004). Contributions of the structural proteins of severe acute respiratory syndrome coronavirus to protective immunity. Proc Natl Acad Sci U S A, 101(26), 9804-9809. doi:10.1073/pnas.0403492101 Conzelmann, K.-K. (2013). Reverse Genetics of Mononegavirales: The Rabies Virus Paradigm. In Y. Nagai (Ed.), Sendai Virus Vector: Advantages and Applications (pp. 1-20). Tokyo: Springer Japan. Corbett, K. S., Edwards, D. K., Leist, S. R., Abiona, O. M., Boyoglu-Barnum, S., Gillespie, R. A., . . . Graham, B. S. (2020). SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature. doi:10.1038/s41586-020-2622-0 Dagan, N., Barda, N., Kepten, E., Miron, O., Perchik, S., Katz, M. A., . . . Balicer, R. D. (2021). BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine in a Nationwide Mass Vaccination Setting. N Engl J Med. doi:10.1056/NEJMoa2101765 Dejnirattisai, W., Zhou, D., Supasa, P., Liu, C., Mentzer, A. J., Ginn, H. M., . . . Screaton, G. R. (2021). Antibody evasion by the P.1 strain of SARS-CoV-2. Cell. doi:10.1016/j.cell.2021.03.055 Edara, V. V., Norwood, C., Floyd, K., Lai, L., Davis-Gardner, M. E., Hudson, W. H., . . . Suthar, M. S. (2021). Infection- and vaccine-induced antibody binding and neutralization of the B.1.351 SARS-CoV-2 variant. Cell Host Microbe, 29(4), 516-521.e513. doi:10.1016/j.chom.2021.03.009 Fathi, A., Dahlke, C., & Addo, M. M. (2019). Recombinant vesicular stomatitis virus vector vaccines for WHO blueprint priority pathogens. Hum Vaccin Immunother, 15(10), 2269-2285. doi:10.1080/21645515.2019.1649532 Fehr, T., Bachmann, M. F., Bucher, E., Kalinke, U., Di Padova, F. E., Lang, A. B., . . . Zinkernagel, R. M. (1997). Role of repetitive antigen patterns for induction of antibodies against antibodies. J Exp Med, 185(10), 1785-1792. doi:10.1084/jem.185.10.1785 Garcia-Beltran, W. F., Lam, E. C., St. Denis, K., Nitido, A. D., Garcia, Z. H., Hauser, B. M., . . . Balazs, A. B. (2021). Multiple SARS-CoV-2 variants escape neutralization by vaccine-induced humoral immunity. Cell, 184(9), 2372-2383.e2379. doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.013 Ghanem, A., & Conzelmann, K. K. (2016). G gene-deficient single-round rabies viruses for neuronal circuit analysis. Virus Res, 216, 41-54. doi:10.1016/j.virusres.2015.05.023 Ghanem, A., Kern, A., & Conzelmann, K. K. (2012). Significantly improved rescue of rabies virus from cDNA plasmids. Eur.J.Cell Biol., 91(1), 10-16. Hangartner, L., Zinkernagel, R. M., & Hengartner, H. (2006). Antiviral antibody responses: the two extremes of a wide spectrum. Nat Rev Immunol, 6(3), 231-243. doi:10.1038/nri1783
Figure pct00001
Hoffmann, M., Arora, P., Groß, R., Seidel, A., Hrnich, B. F., Hahn, A. S., . . Pohlmann, S. (2021). SARS-CoV-2 variants B.1.351 and P.1 escape from neutralizing antibodies. Cell, 184(9), 2384-2393.e2312. doi:10.1016/j.cell.2021.03.036 Hoffmann, M., Kleine-Weber, H., Schroeder, S., Kruger, N., Herrler, T., Erichsen, S., . . . Pohlmann, S. (2020). SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell. doi:10.1016/j.cell.2020.02.052 Hoffmann, M., Wu, Y. J., Gerber, M., Berger-Rentsch, M., Heimrich, B., Schwemmle, M., & Zimmer, G. (2010). Fusion-active glycoprotein G mediates the cytotoxicity of vesicular stomatitis virus M mutants lacking host shut-off activity. J Gen Virol, 91(Pt 11), 2782-2793. doi:10.1099/vir.0.023978-0 Houser, K. V., Broadbent, A. J., Gretebeck, L., Vogel, L., Lamirande, E. W., Sutton, T., . . . Subbarao, K. (2017). Enhanced inflammation in New Zealand white rabbits when MERS-CoV reinfection occurs in the absence of neutralizing antibody. PLoS Pathog, 13(8), e1006565. doi:10.1371/journal.ppat.1006565 Jaume, M., Yip, M. S., Kam, Y. W., Cheung, C. Y., Kien, F., Roberts, A., . . . Altmeyer, R. (2012). SARS CoV subunit vaccine: antibody-mediated neutralisation and enhancement. Hong Kong Med J, 18 Suppl 2, 31-36. Klingen, Y., Conzelmann, K. K., & Finke, S. (2008). Double-labeled rabies virus: live tracking of enveloped virus transport. J.Virol., 82(1), 237-245. Kopecky, S. A., Willingham, M. C., & Lyles, D. S. (2001). Matrix protein and another viral component contribute to induction of apoptosis in cells infected with vesicular stomatitis virus. J Virol, 75(24), 12169-12181. Lamers, M. M., Beumer, J., van der Vaart, J., Knoops, K., Puschhof, J., Breugem, T. I., . . . Clevers, H. (2020). SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. doi:10.1126/science.abc1669 Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., & Rose, J. K. (1995). Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 92(10), 4477-4481. Liu, L., Wei, Q., Lin, Q., Fang, J., Wang, H., Kwok, H., . . . Chen, Z. (2019). Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophage responses during acute SARS-CoV infection. JCI Insight, 4(4). doi:10.1172/jci.insight.123158 Majid, A. M., Ezelle, H., Shah, S., & Barber, G. N. (2006). Evaluating replication-defective vesicular stomatitis virus as a vaccine vehicle. J Virol, 80(14), 6993-7008. doi:10.1128/jvi.00365-06 Matsuura, Y., Tani, H., Suzuki, K., Kimura-Someya, T., Suzuki, R., Aizaki, H., . . . Miyamura, T. (2001). Characterization of pseudotype VSV possessing HCV envelope proteins. Virology, 286(2), 263-275. doi:10.1006/viro.2001.0971 Mebatsion, T. (2001). Extensive attenuation of rabies virus by simultaneously modifying the dynein light chain binding site in the P protein and replacing Arg333 in the G protein. J.Virol., 75(23), 11496-11502. Mebatsion, T., & Conzelmann, K. K. (1996). Specific infection of CD4+ target cells by recombinant rabies virus pseudotypes carrying the HIV-1 envelope spike protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 93(21), 11366-11370. Mebatsion, T., Finke, S., Weiland, F., & Conzelmann, K. K. (1997). A CXCR4/CD4 pseudotype rhabdovirus that selectively infects HIV-1 envelope protein-expressing cells. Cell, 90(5), 841-847. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., & Zimmer, G. (2016). Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses, 8(9). doi:10.3390/v8090254 Muik, A., Wallisch, A.-K., Sanger, B., Swanson, K. A., Muhl, J., Chen, W., . . Sshin, U. (2021). Neutralization of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 pseudovirus by BNT162b2 vaccine-elicited human sera. Science, 371(6534), 1152. doi:10.1126/science.abg6105 Polack, F. P., Thomas, S. J., Kitchin, N., Absalon, J., Gurtman, A., Lockhart, S., . . . Gruber, W. C. (2020). Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 383(27), 2603-2615. doi:10.1056/NEJMoa2034577 Publicover, J., Ramsburg, E., Robek, M., & Rose, J. K. (2006). Rapid pathogenesis induced by a vesicular stomatitis virus matrix protein mutant: viral pathogenesis is linked to induction of tumor necrosis factor alpha. J Virol, 80(14), 7028-7036. Puelles, V. G., Lutgehetmann, M., Lindenmeyer, M. T., Sperhake, J. P., Wong, M. N., Allweiss, L., . . . Huber, T. B. (2020). Multiorgan and Renal Tropism of SARS-CoV-2. N Engl J Med. doi:10.1056/NEJMc2011400 Sadoff, J., Le Gars, M., Shukarev, G., Heerwegh, D., Truyers, C., de Groot, A. M., . . . Schuitemaker, H. (2021). Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. doi:10.1056/NEJMoa2034201 Schnell, M. J., Buonocore, L., Boritz, E., Ghosh, H. P., Chernish, R., & Rose, J. K. (1998). Requirement for a non-specific glycoprotein cytoplasmic domain sequence to drive efficient budding of vesicular stomatitis virus. EMBO J, 17(5), 1289-1296. doi:10.1093/emboj/17.5.1289 Schnell, M. J., Mebatsion, T., & Conzelmann, K. K. (1994). Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J, 13(18), 4195-4203. Supasa, P., Zhou, D., Dejnirattisai, W., Liu, C., Mentzer, A. J., Ginn, H. M., . . . Screaton, G. R. (2021). Reduced neutralization of SARS-CoV-2 B.1.1.7 variant by convalescent and vaccine sera. Cell. doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.033 Szomolanyi-Tsuda, E., & Welsh, R. M. (1998). T-cell-independent antiviral antibody responses. Curr Opin Immunol, 10(4), 431-435. doi:10.1016/s0952-7915(98)80117-9 Walker, P. J., Blasdell, K. R., Calisher, C. H., Dietzgen, R. G., Kondo, H., Kurath, G., . . . Nbsp Ictv Report, C. (2018). ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae. J Gen Virol, 99(4), 447-448. doi:10.1099/jgv.0.001020 Wang, C., Li, W., Drabek, D., Okba, N. M. A., van Haperen, R., Osterhaus, A., . . . Bosch, B. J. (2020). A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection. Nat Commun, 11(1), 2251. doi:10.1038/s41467-020-16256-y Weisblum, Y., Schmidt, F., Zhang, F., DaSilva, J., Poston, D., Lorenzi, J. C., . . . Bieniasz, P. D. (2020). Escape from neutralizing antibodies by SARS-CoV-2 spike protein variants. Elife, 9. doi:10.7554/eLife.61312 Whelan, S. P., Barr, J. N., & Wertz, G. W. (2004). Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Curr.Top.Microbiol.Immunol., 283:61-119., 61-119. Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., & Callaway, E. M. (2007). Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nat Methods, 4(1), 47-49. Wickersham, I. R., Lyon, D. C., Barnard, R. J., Mori, T., Finke, S., Conzelmann, K. K., . . . Callaway, E. M. (2007). Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron, 53(5), 639-647. Xie, X., Liu, Y., Liu, J., Zhang, X., Zou, J., Fontes-Garfias, C. R., . . . Shi, P.-Y. (2021). Neutralization of SARS-CoV-2 spike 69/70 deletion, E484K and N501Y variants by BNT162b2 vaccine-elicited sera. Nature Medicine. doi:10.1038/s41591-021-01270-4 Yinda, C. K., Port, J. R., Bushmaker, T., Offei Owusu, I., Purushotham, J. N., Avanzato, V. A., . . . Munster, V. J. (2021). K18-hACE2 mice develop respiratory disease resembling severe COVID-19. PLoS Pathog, 17(1), e1009195. doi:10.1371/journal.ppat.1009195 Zemp, F., Rajwani, J., & Mahoney, D. J. (2018). Rhabdoviruses as vaccine platforms for infectious disease and cancer. Biotechnol Genet Eng Rev, 34(1), 122-138. doi:10.1080/02648725.2018.1474320 Zhou, D., Dejnirattisai, W., Supasa, P., Liu, C., Mentzer, A. J., Ginn, H. M., . . . Screaton, G. R. (2021). Evidence of escape of SARS-CoV-2 variant B.1.351 from natural and vaccine-induced sera. Cell. doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037
따라서 베타코로나바이러스 감염에 대해 사람을 면역화하고 베타코로나바이러스 감염자를 치료하는 데 사용될 수 있는 조성물의 제공이 시급하다. 이러한 필요성은 본 발명에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 일 양태에서 (a) 바이러스 입자를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) 바이러스 입자의 외피로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는 재조합 랍도바이러스(rhabdovirus) 벡터, 및/또는
(b) 바이러스-유사 입자(VLP)를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) VLP로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는, 당단백질 (G) 단백질 유전자가 결실되고 트랜스에서 G 단백질이 보충된 재조합 랍도바이러스 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
용어 "포함하다/포함하는"은 일반적으로 함유하다/함유하는의 의미로 사용된다, 즉 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허용하는 것을 말한다. 용어 "포함하다" 및 "포함하는"는 또한 보다 제한된 용어 "구성하다" 및 "구성하는"을 포함한다.
명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "조성물"은 적어도 2개의 성분 또는 구성성분을 포함하는 물질의 조성물을 지칭하며, 여기서 하나의 성분 또는 구성성분은 본 발명의 재조합 랍도바이러스 벡터이다. 다른 성분 또는 구성성분은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 부형제, 수성 용매 또는 물일 수 있다. 적합한 부형제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 허가된 의약품에 대한 비활성 성분 검색을 위한 FDA 데이터베이스에서 찾을 수 있다(https://www.accessdata.fda.gov). 또한 조성물의 성질은 특별히 제한되지 않는다. 조성물은 예를 들어 용액 또는 동결건조물일 수 있고 바람직하게는 용액이다.
랍도바이러스과(rhabdoviridae)에는 18개의 속과 많은 배정되지 않은 종(예: 모우사(Moussa) 바이러스)이 포함된다. 각 속에 배정된 바이러스는 L 단백질 서열의 계통발생학적 분석을 기반으로 한 단일 계통군을 형성하며 일반적으로 부속 유전자의 수와 위치를 포함하여 유사한 게놈 구조를 가지고 있다. 랍도바이러스는 광범위한 척추동물과 식물에서 분리되었다: 많은 것들이 절지동물에서 분리되었다. 리사바이러스(Lyssavirus) 속의 구성원은 치명적인 뇌염(광견병)을 일으킬 수 있는 인간을 포함한 포유류를 감염시킨다. 베지큘로바이러스(Vesiculovirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 티브로바이러스(Tibrovirus), 하파바이러스(Hapavirus), 큐리오바이러스(Curiovirus), 스리푸바이러스(Sripuvirus) 및 레단테바이러스(Ledantevirus) 속의 구성원은 척추동물(포유류, 조류 또는 파충류)을 감염시키고 절지동물에 의해 전염된다. 일부 절지동물 매개 랍도바이러스는 가축 질병과 관련이 있다. 일부는 인간에게 질병을 일으킬 수 있다. 투파바이러스(Tupavirus) 속의 구성원은 척추동물에서만 분리되었다. 노비랍도바이러스(Novirhabdovirus), 스프리비바이러스(Sprivivirus) 및 페랍도바이러스(Perhabdovirus) 속의 구성원은 어류에만 감염되며 일부는 경제적으로 중요한 질병을 일으킨다. 시그마바이러스(Sigmavirus) 속에 속하는 랍도바이러스(Rhabdovirus)는 각각 단일 종의 쌍각충류(dipteran) 파리에만 감염되며 수직으로 전파된다. 알멘드라바이러스(Almendravirus) 속의 구성원은 곤충에서만 복제된다. 식물 랍도바이러스는 시토랍도바이러스(Cytorhabdovirus), 뉴클레오랍도바이러스(Nucleorhabdovirus), 디코라바이러스(Dichorhavirus) 및 바리코사바이러스(Varicosavirus) 속에 배정되며 절지동물 또는 항아리 곰팡이(chytrid fungi)에 의해 전염된다. 많은 질병이 농업 또는 원예에 중요한 질병과 관련이 있다. 본 발명의 재조합 랍도바이러스 벡터의 생성에 사용되는 랍도바이러스는 인간에서 질병을 일으키지 않는 랍도바이러스이다. 예를 들어, 광견병은 광견병 바이러스와 호주 박쥐 리사바이러스를 포함하는 리사바이러스에 의해 발생한다. 따라서 이러한 천연 독성 바이러스는 사용되지 않는다. 약독화된 광견병 바이러스 또는 G-유전자 결실 바이러스만 사용된다. 약독화된 광견병 바이러스는 G 단백질의 잔기 Arg 333의 돌연변이 및/또는 P 단백질의 다인(dynein) 경쇄 결합 모티프의 돌연변이를 갖는 바이러스를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다(Mebatsion, 2001).
본 발명의 항목 (a) 및 (b)에 따라 사용되는 재조합 랍도바이러스 벡터는 유전 물질을 세포로 전달하는 데 사용할 수 있는 바이러스 벡터이며 이 유전 물질은 본 발명에 따른 베타코로나바이러스의 면역원이다. 세포는 살아있는 유기체 내부(생체내) 또는 세포 배양(시험관내)에 존재할 수 있다.
항목 (a)에 따르면, 랍도바이러스의 바이러스 입자가 세포를 감염시키고 바이러스 감염을 전파할 수 있다는 점에 주목하면서 재조합 랍도바이러스 벡터는 면역원을 인코딩하고 발현할 뿐만 아니라 랍도바이러스의 바이러스 입자를 형성하는 데 필요한 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하고 발현한다. 따라서, 본 발명에 따른 바이러스 벡터는 세포 내로 전달될 유전자 및 바이러스 게놈을 인식하고 감염성 바이러스 입자로 패키징하기 위한 바이러스 단백질을 인코딩하는 바이러스 서열을 포함한다. 전체 감염성 바이러스 입자는 당단백질을 포함하는 지질 외피를 포함하는 단백질(캡시드라고 함)의 외피와 핵산으로 구성된다. 따라서 랍도바이러스의 바이러스 입자는 재조합 랍도바이러스 벡터에 의해 인코딩되는 유전 정보를 재조합 랍도바이러스의 바이러스 입자에 의해 감염되는 세포로 효율적으로 수송할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 사용되는 재조합 랍도바이러스 벡터는 벡터에 의해 인코딩되는 유전자 또는 다른 유전 물질을 표적 세포로 전달 및 발현할 수 있는 감염성 재조합 랍도바이러스의 바이러스 입자를 코딩한다. 이러한 감염 과정을 형질도입이라고 하며 감염된 세포는 당업계에서 형질도입된 세포라고도 한다.
항목 (a)의 재조합 랍도바이러스 벡터는 자연적으로 발생하는 랍도바이러스의 바이러스 전체 게놈 및 추가로 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 벡터에 의해 코딩되는 바이러스 입자는 자가 복제 및 확산 및 전염성 감염체에서 이동성 유전 정보라는 점에서 천연 랍도바이러스의 바이러스로 작용하여 세포를 감염시킬 수 있고 트랜스 또는 시스에서 추가 유전자의 보충없이 더 많은 바이러스를 생성할 수 있다.
항목 (a)의 재조합 랍도바이러스 벡터는 또한 슈도타입(pseudotyped) 랍도바이러스의 전체 게놈 및 추가로 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 슈도타입 바이러스 입자는 세포의 감염(즉, 세포 수용체에 대한 부착 및 막 융합)을 매개할 수 있는 외피에 하나 이상의 외부/이종 표면 스파이크/당단백질(들)을 운반한다. 예시로 에볼라 바이러스(VSV-ZEBOV 백신)의 당단백질(G) 또는 광견병 바이러스의 당단백질(G)을 가진 VSV가 있다. 이종 당단백질(들)은 바이러스의 게놈(시스에서)에서 인코딩되거나 형질감염된 플라스미드 또는 안정한 세포주로부터 트랜스에서 제공될 수 있다.
항목 (a)의 재조합 랍도바이러스 벡터는 대안으로 모자이크 랍도바이러스의 전체 게놈 및 추가로 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 모자이크 바이러스 입자는 외피에 당단백질 혼합물을 운반한다. 모든 당단백질 또는 단 하나의 당단백질이 기능적으로 표적 세포에 들어갈 수 있다. 당단백질(G)은 바이러스 입자의 숙주 세포에 대한 부착을 매개하기 때문에 바이러스 입자의 감염성에 필수적이다. 하나 이상의 기능적 당단백질을 사용하면 감염될 수 있는 세포의 레퍼토리가 증가할 수 있다.
항목 (b)에 따르면 재조합 랍도바이러스 벡터는 면역원을 인코딩하고 발현할 뿐만 아니라 VLP를 형성하는 데 필요한 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하고 발현한다. 항목 (b)의 재조합 랍도바이러스 벡터는 G 단백질이 결실되고 트랜스에서 G 단백질이 보충된다. 본원에 사용된 용어 "결실된 G 단백질"은 재조합 랍도바이러스 벡터의 유전 정보의 임의의 유전적 조작을 지칭하며, 재조합 랍도바이러스 벡터가 표적 세포의 감염을 매개할 수 있는 기능적 G 단백질을 더 이상 인코딩하지 않고 및/또는 발현하지 않도록 한다. 논의한 바와 같이 당단백질은 세포 감염에 필수적이다. 결실된 G 단백질 대신 기능적 G 단백질이 트랜스에서 제공된다. 기능적 G 단백질을 트랜스에서 제공하는 단계는 일반적으로 생체외에서 발생한다. 예를 들어, G 단백질이 결실된 재조합 랍도바이러스 벡터는 기능적 당단백질을 발현하는 플라스미드 또는 기능적 당단백질을 발현하는 트랜스제닉 세포와 결합되어야 한다. 플라스미드 또는 트랜스제닉 세포는 기능적 G 단백질과 트랜스에서 당단백질을 제공하여 생체외에서 감염성 바이러스 입자가 형성되도록 한다(기능적 G 단백질이 재조합 랍도바이러스 벡터 자체에 의해 인코딩됨을 나타내기 위해 당업계에서 "시스"가 사용됨을 주목할 것). 재조합 랍도바이러스 벡터 자체는 G 단백질이 결실되기 때문에, 벡터는 시험관내에서 생성된 기술된 G 보충된 바이러스 입자의 초기 형질도입 이벤트 시 다른 세포로 퍼질 수 있는 이동성 유전 정보를 구성하지 않는다. 이러한 이유로 항목 (b)의 벡터는 "단일 라운드 감염성 재조합 랍도바이러스 벡터"라고도 한다. 그것은 바이러스에 의해 인코딩된 유전자를 발현할 수 있지만, 시스에서 기능적 당단백질/스파이크를 인코딩하지 않아 생체내(즉, 트랜스에서 보충을 위한 기능적 G 단백질이 존재하지 않는 경우) 감염성 바이러스 입자가 형성되지 않거나 감염성 새로운 단일 라운드 바이러스가 초기 감염된 세포에서 방출된다. 1차 감염 후 바이러스는 더 이상 전파되지 않는다. 따라서 단일 라운드 바이러스는 특히 바이러스 확산 및 숙주에서의 전파 측면에서 완전히 안전하다. 따라서, 감염성 바이러스 입자 대신에, 항목 (b)의 재조합 랍도바이러스 벡터는 바이러스 유사 입자(VLP)를 형성할 수 있으며, VLP에 대한 추가 세부사항은 아래에서 제공될 것임을 주목한다.
따라서 항목 (b)에 따르면 재조합 랍도바이러스 벡터는 자연적으로 발생하는 랍도바이러스의 게놈을 포함할 수 있지만 기능적 당단백질은 포함하지 않으며 추가로 면역원을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
기능적 G 단백질을 트랜스에서 제공하는 단계는 일반적으로 위에서 기술한 바와 같이 생체외에서 발생하지만, 기능적 당단백질은 또한 생체내에서 즉, 당단백질을 인코딩하는 AAV와 같은 관련 없는 바이러스 벡터와의 공동 감염에 의해 제공될 수 있음을 주목해야 한다. 이것은 처음에 RABVΔG에 감염된 뉴런으로부터 두 번째 시냅스전 뉴런으로의 전염을 허용하지만 그 이상은 허용하지 않는 신경과학에서 잘 확립된 전략이다. 이것은 당업계에서 뉴런의 단일시냅스 추적으로 알려져 있으며(Ghanem & Conzelmann, 2016), 단일 주기 랍도바이러스 벡터 백신이 또 다른 라운드의 세포 감염을 수행하도록 적용할 수 있다.
기능적 당단백질이 트랜스에서 보충되는 랍도바이러스는 또한 본원에서 "슈도타입" 바이러스, 예를 들어 VSV G가 보충된 VSVΔG로 지칭된다. 바이러스는 예를 들어 VSVΔG(VSV G)로 지정될 수 있으며 여기서 괄호 안의 용어는 트랜스에서 제공된 당단백질의 기원을 나타낸다. 마찬가지로 RABVΔG(SAD G)로 부르는 바이러스는 광경병의 SAD 변이주(strain)의 G로 장식될 것이다.
항목 (a) 및 (b)에서 사용된 용어 "재조합"은 랍도바이러스 벡터가 자연에서 발생하지 않고 실험실 방법에 의해 생성되었음을 나타낸다.
항목 (a) 및 (b)의 재조합 랍도바이러스 벡터는 베타코로나바이러스의 면역원을 발현하므로 재조합 랍도바이러스 벡터는 발현 가능한 형태로 면역원을 인코딩하는 핵산 분자의 적어도 하나의 카피를 포함한다. 재조합 랍도바이러스 벡터는 또한 면역원을 인코딩하는 핵산 분자의 2개, 3개 또는 4개 이상의 카피를 포함할 수 있다. 재조합 랍도바이러스 벡터는 바람직하게는 첨부된 실시예에서 설명된 바와 같이 면역원을 인코딩하는 핵산 분자의 1개 또는 2개 카피를 포함한다(또한 도 4 참조). 둘 이상의 카피의 경우, 둘 이상의 카피는 재조합 랍도바이러스 벡터의 한 부위 또는 상이한 부위에 삽입될 수 있다. 첫 번째 경우에 발현은 바람직하게는 하나의 발현 조절 요소(예를 들어, 랍도바이러스 전사 신호 서열 또는 프로모터)를 통해 제어된다. 면역원을 인코딩하는 핵산 분자의 둘 이상의 카피를 벡터에 혼입함으로써 발현된 면역원의 양은 도 9에 예시된 바와 같이 증가될 수 있다. 또한, 상이한 면역원들, 예를 들어, 새로운 SARS-CoV-2 변이체 유래의 적어도 2개의 면역원, 베타코로나바이러스의 동일한 단백질의 2개의 상이한 면역원성 단편, 또는 상이한 코로나바이러스 단백질 또는 2개의 상이한 베타코로나바이러스 유래의 면역원들을 발현하는 것도 가능하다. 이 양태에 대한 추가의 세부사항은 아래에서 제공될 것이다.
바이러스 입자는 바이러스 유사 입자(VLP)와 구별되어야 한다. VLP는 감염성 바이러스 입자와 매우 유사한 분자이지만 기능적 당단백질과 일반적으로 감염성 바이러스 유전 물질을 포함하지 않기 때문에 비감염성이다. 그것들은 바이러스 구조 단백질의 개별적인 발현을 통해 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있으며, 그런 다음 바이러스 유사 구조로 자가 조립될 수 있다.
여기서 사용된 VLP는 외피에 기능적 당단백질이 없는 랍도바이러스 입자이다. 논의된 바와 같이, 이는 예를 들어 이전에 G 단백질이 보충된 단일 라운드 랍도바이러스 벡터로 형질도입된 세포에 의해 방출된다. 게놈은 기능적 G를 인코딩하지 않지만 본원에 개시된 바와 같이 랍도바이러스 외피에 혼입될 수 있는 면역원이므로, 비감염성 랍도바이러스 입자(VLP)는 면역원으로 장식되고 면역 반응을 유도할 것이다.
용어 "발현하는"은 랍도바이러스 벡터가 발현된 후 감염된 세포 내에서 면역원으로 번역되는 발현 가능한 형태의 핵산 서열을 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "면역원"은 유기체의 면역계에 의해 면역 반응을 유도할 수 있는 분자를 지칭한다. 면역원은 특정 유형의 항원이다. 항원은 면역계의 산물에 결합할 수 있는 분자이다. 따라서 면역원은 반드시 항원이지만 항원이 반드시 면역원일 필요는 없다. 베타코로나바이러스의 면역원은 베타코로나바이러스 감염에 대해 대상체의 면역계에 의한 면역 반응을 유도할 수 있다. 대상체는 베타코로나바이러스 감염에 의해 매개되는 질병을 앓거나(치료) 또는 베타코로나바이러스 감염에 의해 매개되는 질병은 대상체에서 예방될 수 있다(백신접종).
베타코로나바이러스(β-CoVs 또는 Beta-CoVs)는 니도바이러스목(Nidovirales)의 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하는 코로나바이러스아과(Orthocoronavirinae)의 코로나바이러스의 4개 속 중 하나이다. 그들은 대부분 인수공통 기원의 외피가 있는 양성 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 베타코로나바이러스의 게놈은 S(spike), E(envelope), M(membrane), N(nucleocapsid) 단백질로 알려진 네 가지 구조 단백질을 인코딩한다. N 단백질은 RNA 게놈을 보유하고 S, E 및 M 단백질은 함께 바이러스 외피를 만든다. 스파이크 단백질은 코로나바이러스의 주요 당단백질(G)이며 다른 G 단백질과 마찬가지로 바이러스가 숙주 세포의 막에 부착되고 융합되도록 하는 역할을 한다. 스파이크 단백질은 코로나바이러스 표면에 왕관과 같은 구조를 형성한다.
막관통 앵커와 관련하여 본원에 사용된 용어 "이종"은 막관통 앵커가 베타코로나바이러스에서, 바람직하게는 어떤 코로나바이러스에서도 발견될 수 없음을 나타낸다. 따라서 C-말단에 이종 막관통 앵커를 운반하는 베타코로나바이러스의 면역원은 자연에서 찾을 수 없다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 또한 랍도바이러스 당단백질과 관련하여 사용될 수 있다. 따라서, VSV 벡터 또는 입자와 조합된 광견병 바이러스 G 단백질로부터 유도된 막관통 앵커는 이종이다.
면역원의 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) 재조합 바이러스 입자 및/또는 바이러스-유사 입자(VLP)의 외피로의 혼입을 위한 막관통 앵커는 세포막뿐만 아니라 랍도바이러스의 바이러스 입자(및 대부분 주로 또한 렌티바이러스 및 레트로바이러스) 및 랍도바이러스, 렌티- 및 레트로바이러스 유래의 VLP의 막에 혼입될 수 있는 아미노산 서열이다. 막관통 앵커는 일반적으로 막 전체에 걸쳐 있다. 면역원의 C-말단에 막관통 앵커가 존재하기 때문에, 면역원은 막관통 앵커가 세포막에 혼입될 때 감염된 세포의 외부, 바이러스 입자 또는 VLP에 제시된다. 세포막에서 발현되는 본 발명의 막관통 앵커는 RABV 및 VSV와 같은 발아(budding) 랍도바이러스 및 가능하게는 렌티바이러스의 세포내 구조와 호환되기 때문에, 면역원은 세포외 공간으로 방출된 비리온에 효율적으로 혼입된다.
보다 상세하게는, 베타코로나바이러스의 면역원의 C-말단에 있는 본 발명에 따른 막관통 앵커의 존재로 인해 본 발명의 조성물을 대상체에게 투여하면 대상체의 면역화 및 면역계에 면역원 표시의 두 가지 기본적인 상이한 메커니즘에 의한 베타코로나바이러스 감염에 대한 대상체 내의 면역 반응의 도출을 초래한다.
한편, 발현된 면역원은 본 발명에 따른 재조합 랍도바이러스 벡터에 의해 감염되는 세포의 세포 표면으로 수송되고 감염된 세포의 표면에 나타난다. 이것은 감염된 세포가 COVID-19 회복기 환자 혈청에 의해 인식된다는 것을 보여주는 첨부된 실시예의 데이터에 의해 입증된다. 따라서, 세포 표면에 대한 면역원의 제시는 면역원에 대한 강한 항체 반응을 유도할 것으로 예상된다.
표준 세포 표면 발현에 의한 면역화 외에도 면역원은 또한 재조합 랍도바이러스의 바이러스 입자의 외피 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP)에 혼입된다. 바이러스 입자는 세포외 공간으로 방출되어 베타코로나바이러스에 대한 전반적인 면역 자극에 추가로 기여할 것으로 예상된다.
참고로, VSV와 같은 랍도바이러스 입자의 외피 단백질은 조밀하고 엄격하게 배열된 배열로 제시되어 파라결정질 층을 형성한다. 따라서 그들은 매우 바람직한 방식으로, 즉 반복적인 표면 에피토프의 형태로 에피토프를 제시한다. 반복 항원은 면역원성이 높고 T 세포가 독립적일지라도 항체 반응을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다(Astori & Kraehenbuhl, 1996; Fehr et al., 1997; Hangartner, Zinkernagel, & Hengartner, 2006; Szomolanyi-Tsuda & Welsh, 1998). 따라서 면역원을 운반하는 랍도바이러스 입자 또는 VLP의 생성은 여기에 기술된 조합된 세포 및 바이러스 입자 면역화 접근법의 전반적인 성공에 실질적으로 기여하는 것으로 간주된다.
면역원에 의해 유도된 항체는 베타코로나바이러스의 감염성을 중화시킬 것으로 기대된다.
본원의 아래 실시예에 나타낸 바와 같이 키메라 SARS-CoV-2 S RBD/광견병 바이러스 G 막관통 앵커를 인코딩하는 VSV 레플리콘으로 동물을 백신접종하면 높은 수준의 SARS-CoV-2 중화 항체가 생성된다.
따라서, 본 발명의 제1 양태의 조성물은 유리하게는 면역원이 감염된 세포의 세포 표면 상에 그리고 추가로 바이러스 입자 및/또는 임의로 VLP의 표면 상에 표시되는 백신접종 접근법을 제공한다(도 1). 면역원 표시의 이 두 가지 기본적인 상이한 메커니즘은 함께 상승적으로 작용하고 하나의 메커니즘만 단독으로 사용하는 것보다 우수한 면역 반응을 도출한다.
아래 실시예에서 또한 나타낸 바와 같이, VSV-미니스파이크 레플리콘을 사용한 백신접종은 COVID-19 질병으로부터 트랜스제닉 K18-hACE2 마우스를 완전히 보호한다.
본 발명의 제1 양태의 바람직한 구체예에 따르면, 베타코로나바이러스는 SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, OC43 및 HKU1로부터 선택되고, 바람직하게는 SARS-CoV-2이다.
MERS-CoV는 중동호흡기증후군(MERS)을 유발하고 SARS-CoV-1은 중증급성호흡기증후군(SARS)을 유발하며 SARS-CoV-2는 COVID-19를 유발하는 새로운 베타코로나바이러스이다. 인간에서 호흡기 감염을 일으키는 베타코로나바이러스의 추가 예는 코로나바이러스 OC43 및 HKU1이다. 논의된 5종의 베타코로나바이러스는 인간 병원균인 그룹 2 코로나바이러스이다. SARS-1, SARS-CoV-2, MERS-CoV는 박쥐 저장소에서 발생한 것으로 추측된다(Cui et al., 2019).
또한 계통발생학적으로 연관된 SARS-1과 SARS-2 바이러스 간에는 면역학적 교차 반응이 있다. SARS-CoV-1 RBD 특이 혈청은 SARS-CoV-2 RBD 단백질 및 교차 중화 SARS-CoV-2 바이러스와 교차 반응하였다. SARS-CoV-1 RBD를 표적으로 하는 인간 Mab도 ELISA에서 약간 약하지만 SARS-CoV-2 RBD에 결합하고 두 바이러스에 의한 배양 세포의 감염을 예방하는 것으로 밝혀졌다(Tian et al., 2020;)(Wang et al., 2020). 따라서 SARS-CoV-2와 SARS-CoV 감염을 동시에 예방하기 위한 SARS-CoV RBD 기반 백신 개발 가능성이 제시되었다. 그러나 가장 강력한 SARS-CoV-1 특이 바이러스 중화 항체(VNA) 중 일부(예: m396, CR3014)는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합하지 못하였다(Tian et al., 2020). 이것은 SARS-CoV의 RBD 차이가 VNA의 교차 반응에 중요하며 적어도 SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2를 특이적으로 표적으로 하는 백신과 항체를 개발하는 것이 여전히 바람직하다는 것을 나타낸다.
어쨌든 면역 반응을 생성하기 위해 여기에 설명된 전략은 SARS-CoV-2뿐만 아니라 모든 베타코로나바이러스에 적용할 수 있다. 논의된 5종의 베타코로나바이러스의 관련성을 고려하여 5종의 베타코로나바이러스 중 하나의 면역원이 5종의 베타코로나바이러스 중 다른 베타코로나바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수도 있다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 면역원은 스파이크(S) 단백질 또는 이의 면역원성 단편이다.
항바이러스 조성물은 대부분 항체, 특히 바이러스가 그의 표적 세포로 들어가는 것을 예방할 수 있는 바이러스 중화 항체(VNA)의 생산을 목표로 한다. 외피로 쌓인 바이러스의 진입은 특정 세포 수용체에 결합하고 바이러스 및 세포막을 융합하여 바이러스 유전 정보를 세포로 방출할 수 있는 바이러스 표면 단백질에 의해 매개된다. 논의한 바와 같이 코로나바이러스의 경우 스파이크 단백질(S)이 진입을 매개한다.
팬데믹 SARS-CoV-2는 박쥐 SARS-CoV RaTG13과 밀접하게 그리고 인간 SARS-CoV-1과는 다소 작은 비율로 관련이 있으며, 단백질은 전반적으로 높은 상동성을 나타낸다(Wu et al., 2020). 전자의 바이러스의 스파이크 단백질은 >97% 아미노산 동일성(Wrapp et al., 2020) 및 SARS-1과 76% 아미노산 동일성(Hoffmann et al., 2020)을 나타내며 동일한 수용체, 즉 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)를 사용하여 진입한다. 주목할 점은 회복기 SARS-1 환자의 혈청이 SARS-CoV-2 진입(Hoffmann et al., 2020; Tai et al., 2020)과 SARS-1 S에 대해 만들어진 일부 단클론 항체(Mab)의 SARS-2의 S 단백질과의 결합을 교차 중화하는 것으로 나타났다(Amanat & Krammer, 2020). 더욱더 먼 관련이 있는 중동호흡기증후군 바이러스(MERS) CoV 바이러스 스파이크는 DPP4(Dipeptidyl peptidase 4)를 수용체로 사용하고 있으며 다른 인간 베타 코로나바이러스는 다른 수용체를 사용할 수 있다(Cui et al., 2019; Letko, Marzi, & Munster, 2020).
SARS-1 및 SARS-2 바이러스의 밀접하게 관련된 스파이크 단백질은 동일한 기능을 가지고 있지만 몇 가지 작지만 중요한 분자 변화로 인해 SARS-CoV-2의 급속한 팬데믹 확산이 초래되었을 수 있다. 첫째, SARS-1에서 발견되는 단일 Arg 잔기가 아니라 S1과 S2 서브유닛 사이의 다염기성 절단 부위가 푸린 및 TMPRSS2와 같은 세포 프로테아제에 의한 S의 더 빠른 활성화를 가능케한다(Hoffmann et al., 2020; Wu et al. , 2020). 또한 ACE2 수용체에 대한 S 단백질의 결합은 10-20배 더 강력하다(Tai et al., 2020; Wrapp et al., 2020). 이로 인해 상기도(upper respiratory tract)와 같이 SARS-1 바이러스에 대해 허용되지 않는 조직에서 보다 효율적인 감염 및 바이러스 생산이 이루어지고 사람 간 전염이 강화된다(Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020). 또한 SARS-CoV-2의 돌연변이 변이체는 소위 관심 변이체(VOI) 또는 우려 변이체(VOC)를 포함하여 지속적으로 등장하고 있다. 돌연변이는 종종 S 단백질에 영향을 미치며 더 큰 S 단백질 안정성, hACE2 결합 증가 또는 조상 SARS-CoV-2 변이체로 인한 자연 감염 또는 백신접종 유도 면역에 대한 기존 면역 반응에서 벗어날 수도 있다(Garcia-Beltran et al., 2021; Markus Hoffmann et al., 2021)(Baum et al., 2020; Weisblum et al., 2020). 하기 실시예에서 기술된 바와 같이, VSV 미니스파이크 레플리콘을 사용한 백신접종은 가장 중요한 VOC를 중화시키는 항체를 유도한다.
기도 외에도 SARS-CoV-2는 신장, 심장, 간, 뇌, 장 등 여러 기관에서 검출될 수 있다(Lamers et al., 2020; Puelles et al., 2020).
SARS-CoV-1의 경우 SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질은 VNA 유도를 위해 모든 백신에 포함되는 선호 항원이며, 이는 S에 결합하는 항체가 S와 ACE2 수용체의 올바른 결합 및 후속 막 융합 과정을 방해할 수 있기 때문이다(Chen, Strych, Hotez, & Bottazzi, 2020; Du et al., 2009; He et al., 2005). 실제로, SARS-CopV1의 S는 재조합 PIV3 바이러스로 백신접종 후 상당한 양의 VNA를 유도하는 유일한 구조 단백질인 것으로 밝혀졌다(Buchholz et al., 2004).
홍역 바이러스, MVA 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등을 포함한 바이러스 벡터에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 전략이 눈앞에 다가왔다(Amanat & Krammer, 2020; Chen et al., 2020). 또한 표면에 스파이크를 탑재한 VLP도 실행 가능한 옵션이다. 또한 DNA 또는 mRNA 전달에 기초한 핵산 기반 접근법에는 스파이크 서열이 포함된다. 2020년 4월에 70개 이상의 후보 nCoV 백신이 개발 중이었으며(https://www.who.int/blueprint/priority-diseases/key-action/novel-coronavirus-landscape-ncov.pdf)(COVID-19 후보 백신의 표 초안 - 2020년 4월 20일), (Thanh Le et al., 2020, Amanat & Krammer, 2020), 대부분의 후보는 전체 스파이크 단백질 또는 S RBD를 포함한다. 인간 지원자의 면역화를 위해 SARS-CoV-2 스파이크를 인코딩하는 안정화된 mRNA를 사용하는 임상 시험도 미국에서 이미 시작되었다.
상기 이유 때문에 본 발명에 따라 사용되는 면역원은 바람직하게는 베타코로나바이러스의 스파이크(S) 단백질 또는 이의 면역원성 단편이다.
SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2의 S 단백질의 높은 유사성을 고려할 때, 특히 VSV 및 RABV 벡터의 nCoV 스파이크 발현은 면역화 후 보호용 SARS CoV-2/COVID 항체 생산으로 이어질 것으로 예상된다.
SARS CoV-2의 스파이크(S) 단백질의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NOs: 2 및 3에 표시된다. SEQ ID NO: 4는 SARS CoV-2의 스파이크(S) 단백질의 인간 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열이다.
그러나 효과적인 betaCoV 스파이크 백신 개발의 장애물은 S 단백질의 큰 크기이다. 천연 nCoV S는 1273개의 아미노산과 >150 kDa의 거대하고 심하게 글리코실화된 막관통 단백질로, 많은 바이러스 벡터에 너무 무거운 짐이 될 수 있다.
이 적재하중(payload)은 벡터의 차선의 복제 및/또는 이들 벡터로부터의 면역원의 차선의 발현을 초래할 수 있다. 또한, 전체 스파이크가 사용될 때 단백질의 관련 또는 무관한 도메인에 위치하는 다양한 항원성의 수많은 에피토프가 면역 시스템에 제시된다. 즉, 관련된 에피토프와 관련 없는 에피토프가 항체 자극을 위해 경쟁할 수 있다. 전장 S는 다양한 면역 반응과 항체를 자극할 수 있지만, 이들 모두가 바이러스 중화 항체를 유도하는 데 작동하지는 않는다. 바이러스 감염성을 중화시키지 않는 일부 항체는 HIV 및 에볼라 바이러스의 외피 당단백질에 있는 항원 부위에 의해 유도된 항체와 같이 자연 감염 후 질병의 항체 의존성 증강(ADE)을 유발하여 유해할 수 있다(Jiang, Lin, & Neurath, 1991; Nakayama et al., 2011; Takada, Watanabe, Okazaki, Kida, & Kawaoka, 2001). 실제로 중화 항체가 없는 토끼에서 메르스 재감염 후 염증이 증가하는 현상이 관찰되었으며(Houser et al., 2017), 재조합 SARS-CoV-1 스파이크 백신에 대한 연구는 중화 및 증강 항체(Jaume et al., 2012)의 유도를 제안하였으며, 전장 SARS-CoV 스파이크 당단백질 및 SARS-CoV 바이러스에 도전한 사람들은 바이러스 부하가 더 낮지만 항체 의존적 증강(ADE)으로 인해 급성 폐 손상을 겪는 것으로 보고되었다(Liu et al., 2019). 따라서 효과적인 바이러스 중화 항체를 보다 특이적으로 유도하도록 면역계에 지시하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 제1 양태의 보다 바람직한 구체예에 따르면, 면역원성 단편은 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)으로 구성되거나 이를 포함하고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 단편 또는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고 선호도가 증가하는 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함한다.
본원에 언급된 서열 동일성은 바람직하게는 BLAST(기본 국소 정렬 검색 도구)(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)로 결정된다.
중화에 가장 관련이 있는 도메인은 ACE2 수용체에 직접 결합하는 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)인 것으로 여겨진다. 예를 들어, SARS-CoV-2의 RBD는 S의 S1 서브유닛에 위치하며 SARS-CoV-1의 RBD와 서열이 유사하다. ACE2와 접촉하는 RBD의 일부인 수용체 결합 모티프(RBM) 분석(F. Li, Li, Farzan, & Harrison, 2005; W. Li et al., 2003, Li et al., 2005a)은 SARS-S에 의한 ACE2 결합에 필수적인 대부분의 아미노산 잔기가 SARS-CoV-2-S에서 보존되었음을 밝혔다(Hoffmann et al., 2020; Shang et al., 2020; Tai et al., 2020; Yan et al., ., 2020). 그러나 SARS-CoV-2 RBD는 SARS-CoV-1 RBD보다 인간 및 박쥐 ACE2 수용체에 훨씬 더 높은 결합 친화성을 나타낸다(Tai et al., 2020). 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 위해(Tai et al., 2020) 인간 IgG1(hFc)의 C-말단 Fc를 포함하는 S 단백질의 잔기 331 내지 524(NITN...HAPATV (SEQ ID NOs: 18 및 19)), 또는 잔기 319-591(RVQP...CVNF (SEQ ID NOs: 20 및 21))[S 신호 펩타이드(아미노산 1-14, 189 MFIF...TSGS (SEQ ID NOs: 22 및 23) + 헥사히시티딘 태그](Wrapp et al., 2020)는 SARS 회복기 혈청 항체에 결합할 수 있으며 혈청학적 시험에 사용할 수 있다.
상기 이유 때문에 면역원으로서 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)으로 구성되거나 이를 포함하는 단편의 사용이 특히 유리하다. SEQ ID NO: 1은 첨부된 실시예에서 사용된 SARS-CoV-2 RBD(즉, 스파이크 단백질 S의 아미노산 위치 314 내지 541)를 포함하는 서열이며 본원에서 "미니스파이크"라고 하는 면역원의 맥락에서 사용된다. 미니스파이크에 대한 자세한 내용은 아래에서 제공된다. SARS-CoV-2 RBD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1에 표시된다.
SEQ ID NO: 1의 변이체(즉, 스파이크 단백질 S의 아미노산 위치 314 내지 541)의 바람직한 예는 다음 돌연변이 중 하나 이상, 바람직하게는 1 내지 3개를 포함한다: K417N, K417T, L452R, E484K, E484Q, N501Y. SEQ ID NO: 1의 변이체의 추가 예는 [E484K], [E484K, N501Y], [K417N, E484K], [K417T, E484K], [K417N, E484K, N501Y], [K417T, E484K, N501Y] 또는 [L452R, E484K, N501Y] 뿐만 아니라 [E484Q], [E484Q, N501Y], [K417N, E484Q], [K417T, E484Q], [K417N, E484Q, N501Y], [K417T, E484Q, N501Y], [L452R, E484Q, N501Y] 또는 [L452R, T478K]를 갖는 SEQ ID NO: 1이다. 실시예 9 및 11에서 추가로 논의된 바와 같이 SARS-CoV-2 RBD의 이러한 돌연변이는 영국(B.1.1.7; 20I/501Y.V1), 남아프리카(B.1.351; 20H/501Y.V2), 브라질(P1; 20J/501Y.V3) 및 인도(B.1.617; 20A)의 SARS-CoV-2 우려 변이체(VOC)에서 확인되었다. VOC는 일반적으로 야생형 SARS-CoV-2보다 전염성이 더 높다.
본 발명의 제1 양태의 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 면역원성 단편은 300개 미만의 아미노산, 바람직하게는 250개 미만의 아미노산, 가장 바람직하게는 230개 미만의 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 제1 양태의 더욱 바람직한 구체예에 따르면, 면역원성 단편은 150 내지 300개의 아미노산, 바람직하게는 200 내지 250개의 아미노산, 가장 바람직하게는 220 내지 240개의 아미노산으로 구성된다.
첨부된 실시예에서 사용된 스파이크 단백질의 면역원성 단편은 228개의 아미노산으로 구성된다. 논의된 바와 같이, 너무 큰 면역원을 인코딩하는 핵산 분자의 사용은 차선의 바이러스 복제 및/또는 면역원 발현을 초래할 수 있다. 또한 논의된 바와 같이, 바이러스 벡터는 SARS-CoV-2의 변이체를 포함하여 면역원을 인코딩하는 핵산 분자의 하나 이상의 카피 또는 상이한 면역원을 인코딩하는 둘 이상의 상이한 핵산 분자를 포함할 수 있다.
이러한 바이러스 벡터의 설계를 위한 전제 조건은 2개 이상의 카피를 하나의 바이러스 벡터에 혼입할 수 있을 만큼 충분히 작은 면역원을 인코딩하고, 다른 한편으로는, 바이러스 중화 항체의 개발을 위해 면역계의 충분한 자극을 제공하는 면역원을 인코딩하는 핵산 분자의 설계이다. 위에 표시된 수의 아미노산으로 구성된 면역원성 단편은 이러한 전제 조건을 충족하는 것으로 여겨진다.
특히, 실시예에 예시된 바와 같은 작은 크기의 미니스파이크 및 미니스파이크 유전자는 단일 벡터로부터 다수의 카피를 발현할 수 있게 하여 벡터 작제물로부터 발현된 항원 용량을 증강시킨다. 실시예에 도시된 바와 같이, 미니스파이크(bimini, tri-miniconstructs)의 2개 또는 3개 카피를 발현하는 VSVdeltaG 및 전장 VSV가 쉽게 생성될 수 있다. 광견병 바이러스 생백신에 대해서도 이전에 다수의 반복 유전자 서열을 발현할 가능성이 되시되었다(Faber et al., 2007).
벡터의 전체 면역원성 부분의 크기 및 특성은 본 발명의 제4 양태와 관련하여 더 자세히 설명될 것이다. 본 발명의 제4 양태와 관련하여 기술된 바와 같은 면역원성 부분에 대한 추가 세부사항은 본 발명의 제1 양태에 준용하여 적용된다.
예시된 전체 면역원성 부분(미니스파이크 작제물)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16에 도시되고 이 미니스파이크 작제물은 SEQ ID NO: 17의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 면역원성 단편은 바람직하게는 SEQ ID NO: 16에 포함된 SEQ ID NO: 1을 포함하거나 이로 구성된다. SEQ ID NO: 1 대신에 면역원성 단편은 또한 상기 본원에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 또한 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고, 선호도가 증가하거나 SEQ ID NO: 17과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고, 선호도가 증가하는 아미노산 서열이 본원에 기재되어 있다.
본 발명의 제1 양태의 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 랍도바이러스는 바람직하게는 랍도바이러스 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 광견병 바이러스(RABV)이거나, G 단백질 유전자가 결실되고 트랜스에서 보충된 VSV 또는 RABV(즉, 각각 VSVㅿG 및 RABVㅿG)이다.
VSV 및 관련된 RABV는 모노네가바이러스목(Mononegavirales)(즉, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스)(Walker et al., 2018) 내의 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계통(30개 속 포함)의 잘 연구된 프로토타입 구성원이며 각각 베지큘로바이러스(Vesiculovirus) 및 리사바이러스(Lyssavirus) 속에 속한다. VSV는 가축을 포함한 유제동물 그룹에서만 질병을 일으킬 수 있지만 일반적으로 인간, 영장류 및 기타 동물에서는 그렇지 않다.
VSV 및 RABV의 바이러스 RNA는 매우 안정적인 나선형 뉴클레오캡시드(NC; RNP)로 구성되며 인코딩된 정보는 NC에서 분리된 하위게놈 mRNA의 순차적 및 극성 전사에 의해 표현된다(검토를 위해 Abraham & Banerjee, 1976; Whelan, Barr, & Wertz, 2004 참조). VSV 및 RABV 게놈은 3'-N-P-M-G-L-5' 순서로 5개의 유전자(전사 단위; TU)만 포함한다. N(핵단백질), P(인단백질) 및 L(대형 중합효소)은 RNA 캡슐화(N) 및 RNA 합성(L+P)에 참여하며 바이러스 RNA 합성을 위한 주형으로 NC만 사용한다. M(기질단백질) 및 G(당단백질)는 세포막에서 발아(budding)하는 동안 RNP의 조립 및 막 외피에 관여한다. RABV와 VSV의 역유전학은 잘 확립되어 있으며(Conzelmann, 2013; Lawson, Stillman, Whitt, & Rose, 1995; M.J. Schnell, Mebatsion, & Conzelmann, 1994), 외래 유전자를 인코딩하는(예를 들어, 외래 항원 또는 면역원을 인코딩하는) 추가 다중 전사 단위(ATU)를 게놈에 도입할 수 있다. VSV와 RABV 모두 이종 생백신 벡터로 널리 사용되고 있으며 재조합 VSV는 종양 용해성 바이러스 요법에 추가로 사용되고 있다(Bishnoi, Tiwari, Gupta, Byrareddy, & Nayak, 2018; Fathi, Dahlke, & Addo, 2019; Majid, Ezelle, Shah, & Barber, 2006; Zemp, Rajwani, & Mahoney, 2018). 전체 세포질 복제 및 DNA 단계의 결여 때문에, 랍도바이러스 벡터는 숙주 게놈으로의 외래 서열의 가능한 혼입과 관련하여 안전한 것으로 간주된다.
RABV 및 VSV와 같은 랍도바이러스의 특히 유리한 특징은 당단백질 유전자(소위 "델타 G", "dG", "ㅿG", "G-결핍" 바이러스)를 결실시키고 트랜스에서 G 단백질을 보충할 수 있는 가능성이다. 이는 초기 감염된 세포에서 더 이상 확산될 수 없는 발현 벡터를 생성하므로 완전히 안전하다.
일반적으로 동종 G 단백질(GP)은 이종 바이러스 표면 단백질 또는 "스파이크" 또는 당단백질을 포함하는 다른 막관통 단백질로 대체될 수 있다. 이것은 시스 또는 트랜스에서 일 수 있다. 시스에서 외부 당단백질은 바이러스(대리 바이러스)에 의해 인코딩된다. 외래 GP가 바이러스 진입 단백질로서 기능을 하는 경우, 생성된 재조합 VSV의 친화성은 이종 GP에 의해 결정되며; VSV G 유전자가 EBOV GP 유전자로 대체된 최근 허가된 VSV-ZEBOV 백신에 의해 설명된 바와 같다(Fathi et al., 2019). 기능적 바이러스 당단백질로 트랜스에서 ㅿG 바이러스의 보충은 1회 감염 라운드를 수행할 수 있지만 G 단백질이 감염된 세포에서 발현되지 않기 때문에 더 이상 확산될 수 없는 감염성 슈도타입 바이러스 입자를 생성하며, 이는 다른 세포의 감염을 매개할 수 있다(Ghanem & Conzelmann , 2016) .
이 "외피 전환"은 기능적 부착 및 융합 단백질이 사용되는 경우 바이러스 감염을 특정 세포로 표적화할 수 있게 한다(Matsuura et al., 2001; Mebatsion & Conzelmann, 1996; Mebatsion, Finke, Weiland, & Conzelmann, 1997; Wickersham, Lyon, et al., 2007).
중요한 점은 효율적인 외래 단백질 혼입에 대한 요구 사항이 RABV와 VSV에 대해 다르다는 것이다. 효율적인 RABV 슈도타이핑(pseudotyping)에는 RABV G와 유사한 세포질 꼬리가 필요하지만(Mebatsion & Conzelmann, 1996), VSV는 훨씬 더 무차별적이며 nCoV-스파이크 단백질(M. Hoffmann et al., 2020) 또는 RABV G 세포질 꼬리를 포함하여 짧은 세포질 꼬리(M. J. Schnell et al., 1998)가 있는 거의 모든 풍부하게 발현된 단백질을 혼입한다(Moeschler, Locher, Conzelmann, Kramer, & Zimmer, 2016). 이러한 발견의 한 가지 실제 적용/결과는 다음과 같다: SARS-2 스파이크와 같은 외부 단백질이 RABV G 세포질 꼬리를 운반할 때 RABVㅿG 및 VSVㅿG 슈도타입 입자와 VLP 모두에 매우 잘 혼입된다.
RABV와 VSV의 생물학에도 중요한 차이점이 있다. RABV는 천천히 복제되고 장기간 감염을 일으키는 반면, VSV는 전형적인 뺑소니 바이러스이다. 즉, 매우 빠르게 복제되는 바이러스이며 다량의 RNA와 단백질을 발현하고 매우 높은 역가로 성장한다. VSV의 강력한 바이러스 RNA 합성 기계 외에도 강력한 숙주 세포 전사 차단은 VSV 기질(M) 단백질에 의해 실행된다(Black & Lyles, 1992). 이것은 외래 항원을 포함하여 바이러스 인코딩된 단백질의 우선 생산으로 이어진다. 즉, VSV는 높은 수준의 유전자 발현 기계이므로 VSV 백신 벡터는 많은 양의 항원과 면역원을 빠르게 발현한다.
따라서 상기 바람직한 구체예의 옵션 중에서, 옵션 VSV 및 G 단백질 유전자 결실 및 슈도타입 VSV가 바람직하다. VSV 및 G 단백질 유전자 결실 및 슈도타입 VSV는 바람직한 "응급 백신"이다. 응급 백신은 항원 단백질을 다량으로 신속하게 발현할 수 있어 단 한 번의 주사만으로도 면역 반응을 일으키고 백신접종자에게 무해한 이종 벡터 바이러스이다.
특히 M(M51R), Mㅿ51 또는 Mq와 같은 VSV M 단백질에 도입된 돌연변이 때문에 숙주 유전자 발현을 차단하지 않는 VSV 버전도 있다(M. Hoffmann et al., 2010; Kopecky, Willingham, & Lyles, 2001; Publicover, Ramsburg, Robek, & Rose, 2006). 이러한 벡터는 숙주 세포의 폐쇄를 막을 수는 없지만 숙주 항바이러스 방어 및 면역 활성화의 강력한 팔인 I형 및 III형 인터페론(IFN) 시스템의 유도를 포함하여 고유한 숙주 항바이러스 면역 반응을 활성화한다. VSV M 돌연변이는 특정 환경에서 유리하다. 또한, VSV 및 RABV를 포함하는 재조합 랍도바이러스 벡터는 작은 약물에 의해 바이러스 복제를 중지시킬 수 있는 제어 메커니즘(SMASH-System)을 장착할 수 있다(Ghanem and Conzelmann, WO 2020/021090 A1). 비상시 또는 원하는 기능이 충족될 때 복제 적격 백신 또는 종양 용해 바이러스의 복제 및 확산을 중지하는 능력은 생물학적 안전과 관련이 있다.
요약하면, 재조합 VSV는 효능 및 안전성 면에서 모두 프라임(prime) 백신 벡터이다. 자체 G 단백질(VSV-EBOV) 대신에 에볼라 바이러스 당단백질(GP)을 인코딩하는 재조합 VSV는 아프리카에서 에볼라 발병 후 설명된 바와 같이 에볼라 바이러스 감염 및 질병을 예방하는 데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 특히, 복제 가능한 VSV-EBOV는 현재 EU에서 에볼라 질병에 대한 응급 백신으로 허가되었다. 이것은 백신 벡터로서 VSV의 우수한 우수성을 보여준다. VSV 벡터는 근육내 면역화에 특히 적합하다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 베타코로나바이러스의 면역원은 N-말단에 소포체에 높은 수준의 번역을 촉진하는 신호 펩타이드를 포함하되, 신호 펩타이드는 바람직하게는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG의 중쇄로부터 유래된다.
신호 펩타이드는 분비 경로로 향하는 새로 합성된 대부분의 단백질의 N-말단에 존재한다. 이러한 단백질은 세포막에 삽입되는 것들을 포함한다. 신호 펩타이드의 코어는 단일 알파-나선을 형성하는 경향이 있고 "h-영역"이라고도 하는 소수성 아미노산의 긴 스트레치(약 5-16 잔기 길이)를 포함한다. 또한, 많은 신호 펩타이드는 양전하를 띤 짧은 아미노산 스트레치로 시작하며, 이는 내부 양전하 규칙(positive-inside rule)으로 알려진 것에 의해 전좌 동안 폴리펩타이드의 적절한 토폴로지를 강화하는 데 도움이 될 수 있다. N-말단에 가까운 위치 때문에 "n-영역"이라고 한다. 신호 펩타이드의 끝에는 일반적으로 신호 펩티다아제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산 스트레치가 있어 절단 부위로 명명된다.
소포체에 높은 수준의 번역을 촉진하는 신호 펩타이드의 많은 예는 당업계에 알려져 있으며 베타코로나바이러스 면역원의 N-말단에 이러한 신호 펩타이드를 추가하면 감염된 세포의 막으로의 면역원 혼입이 촉진될 것이다.
신호 펩타이드의 비제한적이지만 바람직한 예는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG의 중쇄로부터 유래된 신호 펩타이드이다. IgG의 중쇄로부터 유래된 신호 펩타이드의 바람직한 예는 실시예에서 사용된 SEQ ID NO: 5(신호 펩타이드 IgH HV 3-7 아미노산 서열) 및 SEQ ID NO: 6(신호 펩타이드 IgH HV 3-13 뉴클레오티드 서열)에 도시되어 있다.
다른 적합한 신호 펩타이드의 예는 SEQ ID NOs: 7 내지 13에 도시되어 있다. 그 예는 각각 면역글로불린 중쇄 가변 3-21(IGHV3-21), 면역글로불린 중쇄 가변 1-46(IGHV1-46), 고친화성 면역글로불린 감마 Fc 수용체 I(FCGR1A), IgG 수용체 FcRn 라지 서브유닛 p51(FCGRT), 혈청 알부민(ALB), 프로락틴(PRL) 및 아주로시딘 프리프로프로테인(AZU1)으로부터 유래된 신호 펩타이드이다.
본 발명의 제1 양태의 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 막관통 앵커는 랍도바이러스 당단백질의 줄기로부터 유래되고, 바람직하게는 리사바이러스 속의 구성원으로부터 유래되며, 더욱 바람직하게는 광견병(RABV) 백신 변이주 SAD B19로부터 유래되고(분자 클론 SAD L16), 가장 바람직하게는 RABV SAD L16 G 단백질의 G 엑토도메인의 막 근위 부분, 막관통 및 세포질 꼬리를 포함하거나 이로 구성된다.
실시예에 사용된 미니스파이크 작제물은 SARS-CoV-2 S 단백질, 특히 RBD의 면역원성 부분과 RBD 항원의 운반체로서 랍도바이러스 G 단백질의 줄기에서 유래된 구조적 부분을 결합한다.
랍도바이러스 G 단백질의 "줄기"는 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) 재조합 랍도바이러스의 바이러스 입자 및 존재하는 경우 바이러스-유사 입자(VLP)의 외피로의 면역원의 혼입을 위한 막관통 앵커를 형성하는 랍도바이러스 G 단백질의 일부이다.
특히 리사바이러스 속의 랍도바이러스 G 단백질의 줄기는 바이러스 입자 표면에 삼량체 형태의 G 단백질을 생성하는 것으로 보고되었다(Buthelezi et al. (2016), Virology, 498:250-256). 또한 코로나바이러스의 스파이크 단백질은 바이러스 입자 표면에서 삼량체로 조립되어 논의된 독특한 코로나를 형성한다. 그러므로 특히 리사바이러스 속 유래의 랍도바이러스 G 단백질의 줄기의 이용은 RABV 외피를 포함하여 랍도바이러스 외피에 잘 혼입되는 삼량체 구조를 갖는 면역원이 형성되는 것으로 여겨진다. 미니스파이크의 삼량체 구조는 베타코로나바이러스의 자연적으로 발생하는 스파이크 단백질과 매우 유사한 면역원의 제시를 가능하게 한다. 이는 차례로 바이러스 중화 항체의 형성을 수반하는 효율적인 보호 면역 반응을 달성하기에 유리한 것으로 간주된다.
실시예에 사용된 랍도바이러스 G 단백질의 줄기는 광견병(RABV) 백신 변이주 SAD B19(분자 클론 SAD L16)에서 유래한다. 이 줄기는 RABV SAD L16 G 단백질의 G 엑토도메인의 막 근위 부분, 막관통 및 세포질 꼬리로 구성된다. 실시예에 사용된 줄기가 가장 바람직하고 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 가지며 SEQ ID NO: 15에 의해 인코딩된다. 줄기는 또한 SEQ ID NO: 14와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
SEQ ID NO: 14 판독
GSGSVIPLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL,
이중 밑줄 친 아미노산이 합성 링커이고 앵커의 막 스패닝 부분에 밑줄이 그어져 있음을 주목할 것. 미니스파이크 구조의 개략도는 도 2에 나와 있다.
이 줄기를 사용하면 ㅿG 벡터의 경우 VSV 및 RABV VLP를 모두 생성할 수 있고, 아래의 실시예와 도면에 설명된 대로 모자이크 VSV 및 RABV 바이러스 벡터가 사용되는 경우 모자이크 VSV 및 RABV 바이러스를 생성할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 재조합 랍도바이러스 벡터는 베타코로나바이러스의 면역원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개의 카피를 포함하되, 벡터는 벡터의 한 부위 또는 다른 부위에 이들 카피를 포함한다.
위에서 논의된 바와 같이, 베타코로나바이러스의 면역원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개 카피를 포함하는 재조합 랍도바이러스 벡터는 바이러스 벡터당 더 많은 면역원 카피가 발현되기 때문에 유리하다. 이것은 차례로 항 바이러스 면역 반응의 강도를 더욱 증강시킬 것으로 예상된다.
재조합 랍도바이러스는 게놈 내 임의의 유전자 위치(#1, #2, #3, #4, #5, 또는 #6)에서 베타코로나바이러스의 면역원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(들)을 일괄[즉 G와 L 사이에 3개의 미니스파이크] 또는 분산(즉, 위치 2에 하나, 위치 4에 하나 등)하여 포함할 수 있어 표준 랍도게놈은 (3'-N-P-M-G-L-5') 예를 들어 #1: 3'-s-N-P-M-G-L, #5: (3'-N-P-M-G-s-L)임을 주목할 것. 델타 G 바이러스의 경우 미니스파이크 유전자의 삽입이 가능한 위치는 #4, 즉 G 유전자가 결실된 자리이다.
미니스파이크 작제물의 작은 크기는 다수의 미니스파이크 카피의 도입을 용이하게 할 뿐만 아니라 스파이크 단백질의 다른 면역원성 부분 및/또는 코로나바이러스 N, M 또는 E 단백질의 면역원성 부분의 추가 도입도 용이하게 한다.
본 발명의 제1 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 조성물은 VLP를 추가로 포함하되, VLP는 바람직하게는 기능적 G 단백질 유전자가 트랜스에서 보충되지 않는 G 단백질 유전자가 결실된 랍도바이러스이다.
부착 및/또는 융합 불능 막 단백질 또는 당단백질의 일부 또는 면역원만으로 G 단백질 결핍 바이러스 벡터를 보충하는 경우, 바이러스 유사 입자(VLP)가 생성된다. 조성물이 본원에 기재된 바와 같은 면역원을 포함하고 랍도바이러스 외피에 혼입되기에 적합한 경우, 면역원으로 장식된 VLP가 생성되고 형질도입된 세포로부터 방출될 것이다. 따라서, 그러한 VLP는 대상체에게 투여시 대상체에서 세포외 면역원의 농도 및 양(abundance)을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 조성물은 약학적 조성물 또는 진단용 조성물이고 바람직하게는 백신 조성물이다.
본 발명에 따르면, 용어 "약학적 조성물"은 대상체, 바람직하게는 인간 대상체에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 인용된 화합물을 포함한다. 이는 임의로 본 발명의 화합물의 특성을 변경하여 예를 들어 그의 기능을 안정화, 조정 및/또는 활성화할 수 있는 추가 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 고체, 액체 또는 기체 형태일 수 있고, 특히 분말(들), 정제(들), 용액(들) 또는 에어로졸(들)의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 선택적으로 그리고 추가로 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며 인산염 완충 식염수, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액, DMSO를 포함하는 유기 용매 등을 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 적절한 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 투여 요법은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 한 환자에 대한 투여량은 환자의 키, 신체 표면적, 연령, 투여할 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강 및 동시에 투여되는 기타 약물을 포함하여 많은 요인에 따라 달라진다. 주어진 상황에 대한 치료적 유효량은 일상적인 실험에 의해 쉽게 결정될 것이며 일반 임상의 또는 의사의 기술 및 판단 범위 내에 있다. 일반적으로, 약학적 조성물의 규칙적인 투여로서의 요법은 약 1000 내지 약 100000 CCID50(세포 배양 감염 용량 50%) 양의 항목 (a)의 재조합 랍도바이러스 벡터 및/또는 약 105 내지 약 108 FFU(포커스 형성 단위) 양의 항목 (b)의 랍도바이러스 벡터를 포함해야 한다. 용어 "약"은 바람직하게는 +/- 20%, 가장 바람직하게는 +/- 10%이다.
변화를 관찰하는 데 필요한 치료 기간과 반응이 발생하기 위한 치료 후 간격은 원하는 효과에 따라 다르다. 특정 함량은 당업자에게 잘 알려진 B 및 T 세포 면역 반응에 대한 통상적인 시험에 의해 결정될 수 있다. 백신 조성물은 백신을 받는 대상체에게 특정 전염병에 대한 활성 및 후천성 면역을 제공하는 약학적 조성물의 특정 형태이다.
본 발명에서 용어 "진단용 조성물"은 대상체, 바람직하게는 인간 대상체에서 질병의 존재를 확인하기 위한 조성물에 관한 것이다. 그렇지 않으면 진단용 조성물은 약학적 조성물과 유사한 방식으로 제형화될 수 있다. 차이점은 이 두 조성물의 다른 의도된 용도이다. 이 경우 대상체는 면역원에 대한 항체의 존재 여부를 확인할 수 있다.
본 발명은 제2 양태에서 베타코로나바이러스 감염 및 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 제1 양태의 조성물에 관한 것이다.
상기 제1 양태의 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제2 양태에 준용하여 적용된다.
또한 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에서 베타코로나바이러스 감염 및 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염을 치료 또는 예방하는 방법이 본원에 기술되어 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 조성물의 투여는 대상체에서 베타코로나바이러스 감염에 대한 면역 반응을 개시한다. 따라서 본 발명의 조성물은 베타코로나바이러스 감염의 치료 및 예방, 특히 베타코로나바이러스 감염에 대한 백신접종에 적합하다.
본 발명의 제2 양태의 바람직한 구체예에 따르면, 조성물은 근육 투여된다.
상기 논의된 바와 같이, 재조합 랍도바이러스 벡터는 바람직하게는 VSV 벡터이다. VSV 벡터는 특히 근육(i.m.) 투여에 적합하다. i.m. 면역화의 경우, VSV는 근육 세포에서 높은 수준의 발현 기계이므로 권장되고 선호되지만 RABV 벡터는 i.m. 백신접종에도 적합하다.
본 발명의 제2 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 조성물은 경구 투여된다.
SAD와 같은 RABV 변이주 및 Rabitec®과 같은 EU-허가된 SAD 유래 생백신은 특히 경구 백신접종에 특히 유용하다. 따라서 미니스파이크 인코딩 복제 광견병 기반 백신을 사용한 경구 백신접종이 가능하다. 보다 바람직한 구체예는 VSVㅿG 및 RABVㅿG를 포함하는 G-결핍 랍도바이러스 백신을 사용하는 것이다. SAD L16의 당단백질(G)은 편도선 세포를 감염시키기에 이상적이며 편도선은 인후 뒤쪽에 있는 작은 기관임에 주목할 것. 가장 바람직하게는, ㅿG 벡터는 SAD G 또는 SAD G 유도체, 즉 VSVㅿG(SAD-G) 또는 RABVdG(SAD-G)로 슈도타입이 되어 경구 면역화에 바람직하다. SAD G를 사용한 슈도타입 VSVㅿG에 대한 실행가능성은 도 10에 묘사된다.
본 발명의 제2 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 용도는 본 발명의 제1 양태의 조성물 또는 외피에 키메라 면역원을 제시하는 바이러스-유사 입자를 사용한 부스트 면역화를 추가로 포함한다.
초기 면역화 후 부스트 면역화는 면역원에 대한 재노출이다. 해당 면역원에 대한 면역을 증가시키기 위한(예: 1차 면역화가 충분하지 않은 경우, 보호 수준에 도달하거나, 시간이 지남에 따라 해당 항원에 대한 기억이 감소한 후 보호 수준을 복원하기 위한) 것이다.
바이러스-유사 입자는 바람직하게는 본 발명의 제1 양태와 관련하여 본원에서 상기 기재된 바와 같다.
부스트 면역화는 근육(i.m.) 또는 경구로 투여될 수 있다. 부스트 면역화는 바람직하게는 경구 또는 직접 경로를 포함하여 VSV 및 RABV 전장 및 델타 G 벡터에 의한 프라임 백신접종을 반복하여 수행된다. 또한 프라임 및 부스트 백신은 다양한 적용 경로와 바이러스를 사용할 수 있다. 예를 들어 프라임 백신접종은 i.m. 부스트 구강 경로를 사용하거나 그 반대의 경우도 가능하다. 유사하게, VSV 벡터는 프라임(i.m. 또는 경구)을 위해 사용될 수 있고 RABV 벡터는 부스트(i.m. 또는 경구)를 위해 사용될 수 있으며 그 반대도 가능하다. 바람직한 양태에서, 재조합 VSV 또는 VSVㅿG로 슈도타입이 된 델타 G VSVㅿG가 프라임 백신접종에 사용되는 경우, 부스트 면역화는 또 다른 랍도바이러스 당단백질의 당단백질로 슈도타입이 된 VSVㅿG를 사용해야 한다. 이 전략은 프라임 백신접종 후 생성된 VSV G 항체에 의한 부스트 효율에 대한 가능한 간섭을 피하는 데 적합하다.
본 발명은 제3 양태에서 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플, 가장 바람직하게는 대상체로부터 얻은 혈청 샘플을 기반으로 대상체에서 베타코로나바이러스 감염 및 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염을 진단하기 위한 제1 양태의 조성물에 관한 것이다.
상기 양태의 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제3 양태에 준용하여 적용된다.
도 5 및 6에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명의 제1 양태의 조성물은 또한 베타코로나바이러스 SARS-CoV에 감염되었고 항체를 발달시킨 대상체를 식별하기 위한 진단에 사용되어 그들의 면역 상태를 평가할 수 있다.
본 발명은 제4 양태에서 (i) RBD가 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고 선호도가 증가하는 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함하는 베타코로나바이러스의 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD); 이의 C-말단에 (ii) 랍도바이러스 당단백질의 줄기, 바람직하게는 리사바이러스 속의 구성원, 보다 바람직하게는 광견병(RABV) 백신 변이주 SAD B19(분자 클론 SAD L16)에서 유래되며, 및 가장 바람직하게는 RABV SAD L16 G 단백질의 G 엑토도메인의 막 근위부, 막관통 및 세포질 꼬리를 포함하거나 이로 구성되는 막관통 앵커; 및 (iii) N-말단에 소포체에 높은 수준의 번역을 촉진하는 신호 펩타이드를 포함하는 베타코로나바이러스의 면역원성 작제물에 관한 것이다.
상기 제1, 제3 양태의 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제4 양태에 준용하여 적용된다. 특히 성분 (i) 내지 (iii) 베타코로나바이러스의 면역원성 작제물은 본 출원의 제1 양태와 관련하여 상기 본원에서 보다 상세하게 기재되어 있으며, 이러한 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제4 양태에 준용하여 적용된다.
제4 양태의 베타코로나바이러스의 면역원성 작제물은 (i) 베타코로나바이러스의 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)이 강력한 면역 반응 생성을 위한 면역원으로 특히 적합하고, (ii) 막관통 앵커는 감염된 세포의 표면 뿐만 아니라 면역 반응의 강도를 추가로 증강시키는 바이러스 입자 및 바이러스 유사 입자 상에 면역원을 제시하므로 항-베타코로나바이러스 면역 반응을 유도하기 위해 특히 유리하다. 마지막으로, 신호 펩타이드(iii)는 감염된 세포의 세포 표면에 면역원이 효과적으로 제시되도록 도와준다.
제4 양태의 베타코로나바이러스의 면역원성 작제물은 자연에서 발생하지 않으므로 "조작된" 또는 "키메라" 면역원으로 지정될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 천연 면역원과 비교하여, 제4 양태의 면역원성 작제물은 베타코로나바이러스, 특히 SARS-CoV2에 대한 면역 반응의 개시와 관련하여 최적화되거나 개선된다.
본 발명의 제4 양태의 바람직한 구체예에 따르면, 신호 펩타이드는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG의 중쇄로부터 유래된다.
또한 이러한 신호 펩타이드는 본 출원의 제1 양태와 관련하여 상기 본원에서 보다 상세히 기술되었다.
본 발명의 제4 양태의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 면역원성 작제물은 500개 미만의 아미노산, 바람직하게는 400개 미만의 아미노산, 보다 바람직하게는 380개 미만의 아미노산, 가장 바람직하게는 370개 미만의 아미노산으로 구성된다.
또한 이러한 면역원성 작제물 및 특히 이의 면역원성 부분(ii)은 본 출원의 제1 양태와 관련하여 상기 본원에서 보다 상세하게 기술되었다. 이러한 크기 범위 내에서 면역원성 작제물을 사용함으로써 바이러스 벡터에서 면역원의 효율적인 발현 및 면역원의 2개 또는 3개 카피를 발현하는 바이러스 벡터의 생성을 위해 면역원을 인코딩하는 핵산 서열의 상이한 변이체의 하나 이상, 예를 들어 2개 또는 3개 동일한 카피 또는 카피들을 이용할 가능성이 보장될 수 있다.
면역원성 작제물은 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열("미니스파이크" 작제물)을 포함하거나 SEQ ID NO: 17의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 면역원성 작제물은 또한 SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고 선호도가 증가하거나, SEQ ID NO: 17과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고 선호도가 증가하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 1은 SEQ ID NO: 16에 포함되기 때문에, 면역원성 작제물은 SEQ ID NO: 1 대신에 상기 본원에 기술된 바와 같이 SEQ ID NO: 1의 변이체일 수도 있다.
본 발명의 제4 양태의 추가 바람직한 구체예에 따르면, 베타코로나바이러스는 SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, OC43 및 HKU1로부터 선택되고, 바람직하게는 SARS-CoV-2이다.
본 발명의 제1 양태와 관련하여 논의된 바와 같이, 이들 5종의 베타코로나바이러스는 공지된 인간 병원체이다.
제4 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 제4 양태의 면역원성 작제물을 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있으며 바람직하게는 DNA이다.
본 발명은 제5 양태에서 본 발명의 제4 양태의 면역원성 작제물을 발현하거나 본 발명의 제4 양태의 핵산 분자를 포함하는 바이러스 백신 벡터 또는 플라스미드 또는 DNA 또는 RNA 제제에 관한 것이다.
상기 양태의 정의 및 바람직한 구체예는 본 발명의 제5 양태에 준용하여 적용된다.
바이러스 백신 벡터는 면역원성 작제물 또는 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 바이러스 전달 시스템으로 제형화될 수 있다. 플라스미드 또는 DNA 또는 RNA 제제 바이러스 백신 벡터는 면역원성 작제물 또는 핵산을 세포에 전달하기 위한 비바이러스 전달 시스템으로 제형화될 수 있다.
바이러스 백신 벡터는 바람직하게는 본 출원에 따라 정의된 재조합 랍도바이러스 벡터이다.
본 발명의 제5 양태의 추가의 바람직한 구체예에 따르면, 바이러스 백신 벡터는 RNA 바이러스 백신 벡터, 바람직하게는 홍역 바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스(PIV), 또는 DNA 바이러스 백신 벡터, 바람직하게는 변형된 백시니아-앙카라-바이러스(MVA), 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)이다.
바이러스 벡터는 유전 물질을 세포에 전달하기 위해 분자 생물학자들이 일반적으로 사용하는 도구이다. 이 과정은 살아있는 유기체 내부(생체내) 또는 세포 배양(시험관내)에서 수행될 수 있다. 바이러스는 감염 세포 내에서 게놈을 효율적으로 운반하기 위해 특수화된 분자 메커니즘을 진화시켰다. RNA 바이러스 백신은 RNA 바이러스에서 유래되며 DNA 바이러스 백신은 DNA 바이러스에서 유래된다.
RNA 바이러스 백신 벡터의 비제한적 예는 홍역 바이러스 또는 파라인플루엔자 바이러스(PIV)이다. 홍역 바이러스는 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 계열에 속한다. 감염은 평생 면역을 부여한다. 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV)는 인간 파라인플루엔자를 일으키는 바이러스이다. HPIV는 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열에 속하는 4개의 별개의 단일 가닥 RNA 바이러스의 측계통(paraphyletic) 군이다.
DNA 바이러스 백신 벡터의 비제한적인 예는 변형된 백시니아-앙카라-바이러스(Modified-Vaccinia-Ankara-Virus(MVA)), 아데노바이러스(Adenovirus) 또는 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus(AAV))이다. 변형된 백시니아 앙카라-바이러스(MVA)는 폭스바이러스의 약독화 백신 바이러스이다. 아데노바이러스 벡터는 유전자 전달에서 가장 널리 사용되는 바이러스 중 하나이다. 이들은 패키징 용량이 약 35kb인 외피가 없는 이중가닥(ds) DNA 바이러스 벡터이다. 50개 이상의 상이한 아데노바이러스 혈청형이 존재하며 6종으로 분류된다. AAV는 인간과 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 바이러스이다. 이들은 디펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus) 속에 속하며 파르보바이러스과(Parvoviridae)에 속한다. 이 바이러스는 거의 100% 확실하게 인간 19번 염색체의 특정 부위에 유전 물질을 삽입할 수 있다.
본 명세서, 특히 특허청구범위에서 특징지어지는 구체예에 관하여, 종속항에 언급된 각 구체예는 상기 종속항이 의존하는 각 청구항(독립 또는 종속)의 각 구체예와 조합되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 독립항 1이 3개의 대안 A, B, C를 인용하고, 종속항 2는 3개의 대안 D, E, F를 인용하며, 청구항 3은 청구항 1과 2에 종속하여 3개의 대안 G, H, I을 인용하는 경우, 특별히 달리 언급하지 않는 한, 본 명세서는 조합 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I 에 대응하는 구체예를 명확하게 개시하고 있음을 이해해야 한다.
유사하게, 또한 독립 및/또는 종속 청구항이 대안을 인용하지 않는 경우에도, 종속항이 복수의 선행항을 다시 참조하는 경우, 종속항에 포함된 요지의 모든 조합은 명시적으로 개시된 것으로 간주된다. 예를 들어, 독립항 1, 청구항 1을 인용하는 종속항 2, 청구항 2 및 1 모두를 인용하는 종속항 3의 경우, 청구항 3, 1의 요지의 조합은 청구항 3, 2 및 1의 요지의 조합이 그렇듯이 명확하고 모호하지 않게 개시된다. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항을 인용하는 또 다른 종속항 4가 존재하는 경우, 청구항 4, 2 및 1, 청구항 4, 3 및 1, 뿐만 아니라 청구항 4, 3, 2 및 1의 청구항 4 및 1의 요지의 조합이 명확하고 모호하지 않게 개시된다.
위의 고려 사항은 첨부된 모든 청구범위에 준용하여 적용된다.
도 1 - 감염된 세포의 표면(항목 1)과 바이러스 유사 입자의 표면(항목 2)에 동시에 베타코로나바이러스 면역원이 제시되는 개략도.
도 2 - (A) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 및 SARS-CoV-2 스파이크의 RBD를 포함하는 키메라 랍도바이러스 미니스파이크의 도식적 표현. (B) 랍도바이러스 미니스파이크의 서열. 신호 서열과 막관통 서열은 밑줄, 링커는 이탤릭체, SARS-nCoV-2 잔기는 굵은 글씨로 표시된다.
도 3 - (A) pCAGGs-minispike로 형질감염된 HEK293T 세포(레인 2) 및 VSVㅿG-minispike-eGFP로 감염된 BHK-21 세포(레인 4)에서 미니스파이크의 발현. 레인 1은 무관한 벡터 형질감염, 레인 3은 미니스파이크 및 G의 C-꼬리를 인식하는 펩타이드 혈청에 대한 양성 대조군으로서 pCAGGS-RABV G로 형질감염된 HEK293T 세포를 나타낸다. 이종 크기의 밴드는 미니스파이크의 글리코실화를 나타낸다. 레인 4는 재조합 VSVdG 미니스파이크를 도시한다. (B) pCAGGs-minispike로 형질감염된 HEK293T 세포에서 미니스파이크 단백질의 복합 글리코실화(레인 1-3). 추출물을 PNGase F로 처리하여 모든 N-결합 올리고당을 절단하거나(레인 1), 처리하지 않은 상태로 두거나(레인 2), Endo H로 처리하여 N-결합 만노스가 풍부한 올리고당을 절단하지만 고도로 가공된 복합 올리고당은 절단하지 않았다. 레인 4-6은 동시에 처리된 RABV G를 보여준다(4: PNGaseF, 5, 미처리, 6: EndoH).
도 4 - 여기에 사용된 재조합 VSV 및 RABV 바이러스 작제물의 개략도.
도 5 - VSVdG-minispike eGFP에 감염된 BHK-21은 회복기 COVID-19 환자 혈청에서 인식된다. (A) 감염된 비고정 세포 배양물을 표시된 환자 혈청과 함께 인큐베이션한 다음 형광 항-인간 IgG 항체(상단 패널)와 함께 인큐베이션하였다. 하단 패널은 세포 배양에서 eGFP 형광을 보여준다(벡터 대조군). (B) COVID-19 환자 혈청은 아세톤 고정 세포 배양에서 미니스파이크 단백질을 인식한다. ELISA 양성 혈청은 미니스파이크 발현 세포를 인식한다(왼쪽 이미지). 혈청 항체는 Alexa555로 표지된 항-인간 IgG 2차 항체로 염색되었다.
도 6 - VSVdG-bi-minispike(VSVdG-bimini) 감염 세포는 회복기 COVID-19 환자 혈청에 의해 인식된다. BHK-21 세포를 VSVdG-bimini 바이러스로 16시간 동안 감염시키고 아세톤 고정 후 COVID-19 환자 혈청(#1-4, 9-10) 또는 건강한 사람의 혈청(#5,6,8)과 이어서 항-인간 IgG-Alexa488(녹색 형광)과 함께 배양되었다.
도 7 - VSV 바이러스 입자에 미니스파이크 단백질의 혼입. 형질감염된 pCAGGS-VSV G로부터 VSV-G를 발현하는 HEK293T 세포에서 무세포 VSVdG-minispike-eGFP 입자(레인 1-3)를 생성하고 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 레인 1에서는 비농축 세포 배양 상등액을 적용하였고, 레인 2 및 3에서는 수크로스 쿠션을 통해 초원심분리기로 정제한 비리온을 적용하였다. 레인 4와 5는 각각 BHK 세포에서 성장한 표준 VSVdG-eGFP 및 전장 wt VSV-eGFP의 스톡을 포함한다. 레인에는 3x10E6 감염 단위가 로딩되었다. 블롯을 항-VSV 혈청(왼쪽 패널) 및 키메라 SARS-CoV-2/랍도바이러스 미니스파이크(오른쪽 패널)의 RABV G 유래 C-꼬리를 인식하는 혈청과 함께 배양하였다. VSV 바이러스 입자로의 효율적인 혼입은 많은 양의 경쟁 VSV G 단백질이 존재하는 경우에도 달성된다(레인 2).
도 8 - G가 결여된 VSVdG 미니스파이크 VLP의 제조. VSVdG-eGFP(VSVG)는 미니스파이크 단백질로만 장식된 VLP를 생산하기 위해 비-G-보충 세포를 감염시키는 데 사용되었다. 감염 1일 후 세포 배양 상등액을 수확하고 초원심분리로 VLP를 정제하였다. VLP는 미니스파이크 단백질 검출을 위해 HCA-혈청 및 G 단백질 검출을 위한 VSV 혈청으로 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. G(+ G)의 존재 하에 생성된 입자와 대조적으로, VSV G는 비보충 세포로부터의 VLP에서 검출되지 않았다(레인: G 없음).
도 9 - 유전자 카피 수는 미니스파이크 단백질의 발현 수준을 결정한다. 미니스파이크 단백질의 발현 수준에 대해 표시된 바이러스로 감염된 세포의 용해물은 HCA-5 혈청으로 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 정규화를 위해 액틴 및 VSV 항체를 사용하였다. 전장 VSV 벡터에 인코딩된 미니스파이크 유전자의 2개 카피는 단백질의 더 높은 발현을 유도한다. 관련 없는 추가 유전자(eGFP 리포터)의 존재는 일반적으로 발현 수준을 약화시킨다. 따라서, 전장 VSV의 경우 순위는 VSV-Bimini > -bimini-eGFP > -minispike > -minispike-eGFP이다. VSV 델타 G 버전인 VSVdG-bimini는 VSV-bimini보다 적은 1개 유전자를 인코딩하여 가장 많은 양의 미니스파이크를 발현한다.
도 10 - RABV 바이러스 입자에서 미니스파이크 단백질의 혼입. 형질감염된 플라스미드로부터 발현된 스파이크 단백질 및 랍도바이러스 G 작제물은 슈도타입 VSVdG-eGFP 및 RABV SADdG-eGFP에 사용되었다. 예측한 바와 같이 미니스파이크 구조는 VSV 및 RABV VLP를 모두 생성하는 데 적합하다. 또한, VSVdG는 경구 면역화 동안 편도선 세포로의 효율적인 진입을 지원하는 RABV G(왼쪽 패널)를 사용하여 슈도타입이 될 수 있다.
도 11 - VSVㅿG-minispike-eGFP 백신접종을 이용한 면역화는 BALB/c 마우스에서 높은 수준의 SARS-CoV2 중화 항체를 유도한다. (A) 면역화 도식. BALB/c 마우스는 VSV G-보충된 VSVΔG-minispike-eGFP 및 VSV G-보충된 VSVΔG-eGFP 또는 PBS을 포함하는 대조군의 1x106 감염 단위를 사용하여 i.m.으로 면역화되었다. 면역화 후 28일에 4마리의 백신접종된 마우스로부터 혈청을 채취한 반면, 8마리의 마우스는 동량의 바이러스를 사용하여 i.m. 부스트 면역화를 받았다. (B) SARS-CoV-2의 임상 분리주로 수행된 혈청 중화 시험. 지시된 바와 같이 백신접종된 마우스 및 대조군 마우스로부터의 혈청의 중화 역가는 세포변성 효과가 관찰되지 않은 가장 높은 희석의 역수로 표현된다. 각 점은 표시된 시점에서 한 동물의 데이터를 나타낸다. 막대는 각 그룹의 평균을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 프라임 백신접종(28일, 하늘색)만 받은 마우스에서 상당한 중화 활성이 관찰되었다. 부스트 면역화는 중화 역가를 더욱 상당히 증강시켰다(35일 및 56일). (C) 개별 마우스 혈청에 의한 VSVㅿG(S) 슈도타입 바이러스의 중화. 28일(프라임 면역화만 받음) 또는 35일 및 56일(프라임 및 부스트 면역화 받음)에 수집된 마우스 혈청을 표시된 대로 연속 희석하고 중화 VSV(S) 슈도타입 입자에 대해 분석하였다. VeroE6 세포를 감염시키기 전에 GFP-인코딩 슈도타입 비리온을 마우스 혈청 또는 배지 대조군의 희석을 증가시키면서 함께 배양하였다. 그래프는 배지 대조군(100%)과 희석에 따른 GFP 양성 세포의 백분율을 보여준다. 데이터의 점은 3가지 기술 반복의 평균을 나타내고 막대는 표준 편차를 나타내며 통계적 유의성은 일원 ANOVA에 의해 결정되었다.
도 12 - 백신접종된 마우스와 COVID-19 환자의 유사한 바이러스 중화 역가. ELISA에 의해 S 항체에 대해 양성으로 시험된 백신접종된 마우스 및 인간 면역 혈청의 VSVΔG(S) 중화 활성을 비교하였다. 그래프는 배지 대조군과 관련하여 희석에 따른 GFP 양성 세포의 백분율을 보여준다. ELISA-양성 인간 혈청은 VSV(S)-중화 활성을 나타냈고 표시된 희석에서 활성을 나타내는 회색 상자에 포함된다. 프라임 백신접종된 마우스(d28)는 인간 환자와 거의 비슷한 중화 활성을 나타냈고, 부스트 백신접종된 마우스(d35 및 d56)는 우수한 활성을 나타냈다. 각 상자의 하단 및 상단은 각각 첫 번째와 세 번째 사분위수를 나타낸다. 위스커는 각각 하한 및 상한 사분위수의 최저 및 최고 데이터의 점을 나타낸다. 통계적 유의성을 결정하기 위해 학생의 t-검정 및 일원 ANOVA를 수행하였다.
도 13 - 트랜스제닉 마우스는 VSVΔG-minispike-eGFP로 단일 면역화 후 SARS-CoV-2 유도 호흡기 질환으로부터 보호된다. (A) 면역화 및 공격접종(challenge)의 도식. C57BL/6 K18-hACE2 마우스(그룹당 5마리)에 VSV-ΔG-minispike-eGFP(패널 B-G에 파란색으로 표시) 또는 VSV-ΔG-eGFP(패널 B-G에 빨간색으로 표시)를 4주 간격으로 1회(프라임, 검은색 화살표) 또는 2회(부스트, 회색 화살표) 면역화(1x106 ffu 근육내 주사)하고, 1x104 TCID50 SARS-CoV-2(Wetzlar 분리주)로 공격접종하고 마지막 면역화 후 4주 후에 비강으로 투여하였다. 마우스를 14일 동안 질병의 발달에 대해 매일 모니터링하였다. (B-D) 프라임 면역화 후 공격접종(challenge)의 임상 질환 평가. (E-G) 프라임/부스트 면역화 후 공격접종의 임상 질환 평가. (B 및 E) 체중 감소, 일반적인 외양 및 행동에 의해 평가된 임상 점수 발달. 3: 건강함; 4-6: 가벼운 질병; 7-9: 심각한 질병; 10-12: 빈사상태. (C 및 F) 생존 플롯. (D 및 G) 공격접종 감염 시 체중에 대한 개별 마우스의 체중. 점선은 임상 점수의 한계를 나타낸다(>95%: 점수 = 1, 85-95%: 점수 = 2; 80-85%: 점수 = 3; <80%: 점수 = 4).
도 14 - VSVΔG-minispike-eGFP 백신접종된 마우스로부터의 혈청에 의한 우려 변이체(VOC)의 중화. (A) 신흥 SARS-CoV-2 변이체에서 표시된 S 단백질을 운반하는 VSVΔG 슈도타입 바이러스로 백신접종된 마우스(#r, 56d)의 혈청과 함께 배양하고 VeroE6 세포의 감염성을 확인하였다. SA(B.1.351)를 포함한 천연 변이체 S 단백질을 보유하는 모든 바이러스는 효과적으로 중화되었다(IC50 > 1:800). 인공 S 단백질(인도 RBD 서열이 있는 Wuhan(D614G))은 약간 낮은 감수성을 나타냈다(IC50 > 1:600). (B) 백신접종된 마우스(마우스 "r", BNT162-b2 이중 백신접종 대상체(백신접종 후 KD), 회복기 COVID-19 환자(Post-Covid Px) 및 S 단클론 항체(SmAb)의 혈청 중화 활성 비교) 데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 것이다.
실시예는 본 발명을 예시한다.
실시예 1 - 랍도바이러스 미니스파이크의 설계
SARS-CoV-2의 서열(중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 분리물 Wuhan-Hu-1, 완전한 게놈, NCBI 참조 서열: NC_045512.2)은 S 유전자의 전체 RBD 코딩 서열과 몇 개의 플랭킹 잔기(잔기 314-541, QTSN...KCVNF, (SEQ ID NOs: 24 및 25))(즉, Wrapp et al. 2020 및 Tai et al., 2020에 설명된 RBD 구조와 다름)에 걸쳐 있는 합성 인간 코돈 최적화 DNA를 준비하는 데 사용되었다. 인간 IgG(Ig G HV 3-13)에서 유래한 업스트림 신호 펩타이드를 직접 첨가하여 ER에 높은 수준의 번역을 촉진하였다. C-말단에서 RBD는 짧은 합성 링커(GSGS, (SEQ ID NO: 26))를 통해 SAD G의 G 엑토도메인의 막 근위 부분(줄기), 막관통 및 세포질 꼬리를 함유하는 RABV SAD L16 G 단백질로부터 유래된 막관통/줄기 앵커에 융합되었다. 전체 작제물은 번역 중에 절단되는 신호 서열(+1 정지 코돈)을 포함하여 367개의 아미노산 잔기를 포함한다(도 2).
RABV G 막관통/줄기 앵커는 dsRed 융합 단백질(Klingen, Conzelmann, & Finke, 2008)의 표면 발현 및 광견병 바이러스 혼입을 중재하는 데 성공적으로 사용된 이전에 설명한 것과 동일하다. RABV 줄기 작제물은 N-글리코실화 부위를 함유하지 않지만, 2개의 N-글리코실화 추정 부위는 2개의 인근 위치에서 미니스파이크의 RBD 부분에 존재하며(NITNLCPFGEVFNAT (SEQ ID NO: 27)), 이는 키메라 단백질의 올바른 수송 및 폴딩을 지원하고 단백질 분석을 용이하게 할 수 있다(도 2).
형질감염된 pCR3-minispike로부터 HEK293T 세포에서의 미니스파이크 작제물의 발현은 항-RABV C-꼬리 펩타이드 혈청, HCA-5를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석되었다(도 3A, 레인 2). 발현된 미니스파이크 단백질은 예측된 크기 범위였으며, 이동의 가변성을 나타내어, 전체 세포 용해물에서와는 다르게 글리코실화된 미니스파이크 종과 비글리코실화된 미니스파이크 종의 존재를 시사한다. 미니스파이크 단백질의 N-글리코실화 및 복합 N-글리코실화는 각각 PNGase F 및 EndoH 분해에 의해 확인되었다(도 3B). 이것은 ER 및 골지체를 통한 키메라 미니스파이크 단백질의 성공적인 수송을 나타낸다.
실시예 2 - 미니스파이크를 발현하는 VSV 및 RABV의 생성
재조합 VSVΔG 및 미니스파이크 작제물을 인코딩하는 전장 복제 가능 rVSV를 얻기 위해, 수포성 구내염 인디애나 바이러스(VSIV)의 플라스미드 클론, pVSV-eGFP(Lawson et al., 1995; M. J. Schnell et al., 1998)는 먼저 VSV G ORF를 미니스파이크 ORF로 교환하여 pVSV ΔG minispike-eGFP를 생성하는 데 사용되었다. 전장 pVSV-minispike-eGFP는 eGFP 카세트를 ΔG 작제물 형태의 minispike-eGFP 카세트와 교환하여 생성되었다.
그런 다음 바이러스 미니스파이크 작제물은 eGFP를 삭제하는데 사용하여 각각 리포터 유전자, pVSVㅿG-minispike 및 VSV-minispike가 결여된 바이러스를 생성하였다. 미니스파이크의 두 카피를 발현하는 VSV 및 VSVdG는 VSVΔG-bi-minispike 및 VSV-bi-minispike를 생성하기 위해 eGFP를 미니스파이크 유전자의 두 번째 카피로 교체하거나 VSVdG-bi-mini-eGFP 및 VSV bi-mini-eGFP에 대한 추가 미니스파이크 유전자 삽입에 의해 생성되었다.
cDNA로부터의 VSV 구제는 바이러스 T7 RNA 중합효소 및 VSV 헬퍼 단백질 N, P 및 L을 인코딩하는 발현 플라스미드(pCAG-T7, -N, -P, -L; 모두 추가유전자에서 유래됨)와 함께 바이러스 안티게놈 RNA의 T7 RNA 중합효소-구동된 전사를 지시하는 cDNA 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포에서 수행되었다.
미니스파이크 유전자를 발현하는 RABVΔG-eGFP는 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다(Ghanem, Kern, & Conzelmann, 2012; Wickersham, Finke, Conzelmann, & Callaway, 2007).
재조합 VSV 및 RABV 바이러스의 구조는 도 4에 나타내었다.
실시예 3 - VSV-발현된 미니스파이크는 세포 표면에서 제시되며 COVID-19 환자 혈청에 의해 인식된다.
바이러스 구제 후 VSVΔG-minispike를 사용하여 BHK-21을 감염시킴으로써 바이러스 인코딩된 미니스파이크 단백질의 발현을 확인하였다(도 3, 레인 4). 다시, 다른 크기의 글리코실화된 미니스파이크 단백질은 RABV G 꼬리 혈청을 사용한 웨스턴 블롯에 의해 세포 용해물에서 검출되었다.
키메라 미니스파이크에서 RBD 도메인의 올바른 구조를 검사하기 위해 VSVdG-minispike 또는 VSVdG-bi-mini를 사용하여 낮은 MOI로 감염된 BHK-21 세포를 이전에 공인 진단 협회에서 ELISA에 의해 양성으로 시험된 COVID-19 환자의 혈청으로 탐침하였다. 1:300의 희석에서 양성 환자의 혈청은 Alexa-555 표지된 항인간 IgG 항체에 의해 결정된 바와 같이 감염된 세포를 인식하였다. COVID-19 음성 혈청에서는 신호가 얻어지지 않았다. Anti-RABV C-tail 혈청 및 eGFP 면역 형광을 사용하여 바이러스에 감염된 세포를 구별하였다. 미니스파이크 발현 세포는 아세톤으로 고정한 후와 고정하지 않은 살아있는 세포 모두에서 혈청에 의해 유사하게 인식되었다(각각 도 5, 패널 A 및 B). VSVΔG-bimini 바이러스의 미니스파이크를 발현하는 세포 역시 인식되었다(도 6).
염색이 VSV 특이 항체가 아닌 SARS-CoV-2 특이 항체에 의해 유발됨을 확증하기 위해 VSVΔG minispike-eGFP 및 VSVΔG-tag-BFP와의 공동 감염을 수행하였다. 독점적으로 녹색 형광 세포는 환자 IgG 항체에 의해 인식되었지만 파란색 형광 세포는 인식되지 않았다(표시되지 않음). 이들 실험은 재조합 랍도바이러스에서 발현된 미니스파이크 단백질은 SARS-CoV-2 감염 및 COVID-19 질병에 대한 반응으로 만들어진 천연 항체에 의해 인식되는 구조를 나타내며, SARS-CoV-2의 천연 RBD와 유사한 구조로 폴딩됨을 나타낸다. 따라서 하나 이상의 유전자에서 미니스파이크를 발현하는 랍도바이러스 벡터는 COVID-19 백신으로 적합하다.
실시예 4 - 미니스파이크-슈도타입 바이러스 및 바이러스-유사 입자(VLP)
VSVΔG에서 발현된 미니스파이크 단백질은 VSV 외피-호환 RABV G 막 앵커 및 C-꼬리를 포함하므로, 미니스파이크가 감염된 세포에서 생성된 VSV 입자에 혼입되는 것으로 예상되었다. 이를 확인하기 위해 VSV-G를 발현하는 HEK293T 세포에서 VSVΔG-minispike 스톡을 생성하고 초원심분리에 의해 수크로스 쿠션 위에 농축하였다(도 7). 스톡 중 하나를 준비하기 위해 VSV G는 VSVΔG 감염 전 6시간에만 발현되었으며, 다른 하나의 경우 VSV-G는 감염 전 24시간 동안 높은 수준으로 축적되도록 하였다. 감염 24시간 후 바이러스를 수확한 후 초원심분리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 등가의 감염 단위(10E6) 바이러스를 가공처리하고 전체 VSV 혈청(도 7A) 및 항-RABV C-꼬리 혈청(도 7B)으로 블롯을 분석하여 미니스파이크의 RABV 유래 부분을 검출하였다. 모든 미니스파이크를 인코딩하는 비리온 제제에서 미니스파이크 단백질이 검출되었고, 마치 삼량체와 같이 바이러스 막으로 효율적인 혼입을 나타냈다(도 7B, 레인 1-3). 참고로, VSV G의 상당한 과발현조차도 미니스파이크가 비리온으로 혼입되는 것을 예방할 수 없었으며(레인 2 및 3 비교), VSV VLP로의 강력하고 경쟁적인 혼입을 나타낸다.
미니스파이크 단독, 즉 G가 없는 경우 미니스파이크 장식 및 비감염성 VLP를 생성하기에 충분하다는 것을 입증하기 위해 앞에서 설명한 것처럼 VSVdG-minispike-eGFP는 비-G-보충 세포에서 성장하였으며 세포 배양 상등액에 존재하는 입자는 수확되었다. 실제로, G-형질감염된 세포에서 생성된 입자와 대조적으로, G가 결여된 순수한 VLP는 비-보충 세포에서 생성되었다(도 8).
실시예 5 - 미니스파이크 유전자 카피 수는 발현 수준을 결정한다.
VSV 벡터의 게놈에서 미니스파이크 유전자의 추가 카피가 단백질의 증강된 발현을 유도하는지 확인하기 위해, 우리는 eGFP 리포터 유전자의 존재 또는 부재에서 직렬로 2개의 미니스파이크 유전자를 인코딩하는 VSV(VSV-bimini 또는 VSV-bi-minispike)를 구축하였다(게놈 구조에 대해서는 도 4 참조). 살아있는 바이러스는 플라스미드에서 쉽게 구제되었다. 단일 미니스파이크 유전자만을 함유하는 bimini-벡터 및 상응하는 VSV의 면역원 발현을 비교하기 위해, 세포를 동시에 감염시키고 미니스파이크 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 실제로, 이중 유전자 용량 벡터는 단일 유전자 용량 벡터에 비해 더 높은 미니스파이크 단백질 수준의 축적을 가져왔다. 예상한 바와 같이, VSV 벡터(총 7개 또는 8개 유전자가 인코딩됨)에 여분의 eGFP 유전자가 존재하면 단일 및 이중 미니스파이크 유전자 용량 VSV에서 미니스파이크 발현이 감소한다. eGFP 유전자가 결여된 VSVdG-bimini에서 가장 높은 발현이 얻어졌는데, 이 벡터는 총 6개의 유전자만을 인코딩하기 때문이다.
실시예 6 - RABV 바이러스 입자에서 미니스파이크 단백질의 혼입
미니스파이크 단백질의 설계는 재조합 벡터로부터의 발현 시 VSV 및 RABV 입자 및 VLP 모두가 생성된다는 이점을 갖는다. RABV 입자로의 혼입을 설명하기 위해 상이한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 작제물, 미니스파이크 및 RABV SAD G 단백질이 형질감염된 플라스미드에서 발현되고, 슈도타입 VSVdG-eGFP 및 RABV SADdG-eGFP에 사용되었다. 예측한 바와 같이 미니스파이크 작제물은 VSV 및 RABV VLP를 모두 생성하는 데 적합하다. 주목할 점은 미니스파이크가 실제 SAD G 만큼 효율적으로 또는 훨씬 더 잘 RABVdG 외피에 혼입된다는 것이다(도 10). VSVdG와 RABV SAD G의 성공적인 보충(왼쪽 패널)은 또한 편도선 세포의 감염 및 경구 면역화를 위한 SAD G-슈도타입 VSV 벡터의 적합성을 설명하였다.
실시예 7 - VSVΔG-minispike-eGFP로 면역화하면 BALB/c 마우스에서 높은 수준의 SARS-CoV2 중화 항체가 유도된다.
면역 반응을 유도하기 위한 단일 라운드 VSVΔG 미니스파이크 레플리콘의 적합성 및 충분성을 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 근육(i.m.) 투여에 의해 VSVΔ-minispike-eGFP(G)로 면역화하였다. 바이러스 스톡은 비바이러스성 G 베지클의 과도한 형성을 예방하기 위해 제한된 VSV G 보충, 즉 단지 6시간의 VSV G 발현 하에서 생산되었다. 4마리의 마우스는 1x106 감염 입자의 단일 용량을 투여받았고, 8마리의 마우스는 프라임 백신접종 후 28일에 동일한 바이러스 준비 및 용량으로 추가 부스트를 받았다. 대조군으로서 VSVㅿG-eGFP(VSV G)(각 조건에 대해 n=2) 또는 PBS(각 조건에 대해 n=1)로 동일한 방식으로 면역화된 마우스를 사용하였다. 프라임 백신접종을 투여받은 4마리의 마우스를 28일에 희생시키고, 혈청을 채취하기 위해 각각 35일(n=4) 및 56일(n=4)에 4마리의 부스트된 마우스를 희생시켰다(도 11A).
바이러스 중화 분석은 독일 Wetzlar에서 분리한 SARS-CoV-2 바이러스로 수행되었다. 특히, 한 번만 면역화된 4마리 마우스 모두 1:20-1:40 희석 범위에서 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출 가능한 역가를 나타냈다. 부스트 백신접종은 중화 역가를 1:160-1:640으로 추가로 증가시켰다(도 11B).
독립적인 분석에서 프라임 면역화 후 주목할 만한 중화 역가를 확인하기 위해, 우리는 또한 기능적 S 단백질인 VSV-eGFP-ㅿG-GLuc(SㅿC19)로 슈도타입 VSV 입자를 생산하였다. VSV 슈도타입 바이러스를 사용한 중화 시험은 단일 프라임 백신접종을 받은 마우스에서 상당한 수준의 S-중화 항체의 유도 및 부스트 면역화에 의한 중화 활성의 추가 증강을 확인하였다(도 11C).
백신접종된 마우스와 COVID-19 환자의 혈청 중화 활성을 직접 비교하기 위해 VSV-eGFP-ㅿG-GLuc(SㅿC19) 중화 분석을 사용하였다. 가장 흥미롭게도, 한 번만 면역화된 마우스 그룹(도 12에서 d 28로 표시된 상자)은 COVID-19 환자 그룹과 거의 동일한 용량의 중화 항체를 발달시키므로, 이는 단일 라운드 VSVㅿG-minispike-eGFP 레플리콘으로 백신접종하여 체액성 면역의 강력한 유도를 설명한다. 부스트 면역화는 중화 역가를 더욱 증강시켜 환자의 역가를 능가한다(도 12).
이러한 결과는 작은 항원인 SARS-CoV-2의 RBD가 안전한 확산 결핍 단일 라운드 생물안전 수준 1 랍도바이러스 레플리콘으로부터 본 키메라 미니스파이크 단백질의 형태로 제시된다면 높은 수준의 중화 항체를 이끌어내기에 충분하다는 것을 보여준다.
실시예 8 - K18-hACE2 마우스는 VSVㅿG-minispike-eGFP로 단일 면역화 후 SARS-CoV-2 유발 호흡기 질환으로부터 보호된다.
VSVㅿG-minispike-eGFP 백신의 보호 능력을 평가하기 위해 이전에 중증 COVID-19와 유사한 호흡기 질환이 발병하는 것으로 나타난 형질전환 K18-hACE2 C57BL/6 마우스를 사용하였다(Yinda et al., 2021). 5마리의 마우스 각각은 이전과 같이 VSVㅿG-minispike-eGFP 또는 VSVㅿG-eGFP 대조군으로 면역화되었고, 프라임 면역화 또는 상응하는 부스트 면역화 후 SARS-CoV-2 Wetzlar의 104 TCID50으로 비강내로 공격감염되었다(도 13A). VSVㅿG-eGFP 대조군으로 면역화된 마우스는 감염 후 빠르면 5일째에 시작하여 호흡기 질환을 발생시켰고(도 13 B 및 E), 이는 다음 3-4일에 걸쳐 진행되었으며, 동물은 궁극적으로 감염 후 6-9일에 질병에 걸렸다(도 13C,F). 이 동물들은 초기 체중의 약 10-15%만 감소했으며(도 13 D,G), 이는 그들이 주로 호흡기 증후군을 경험했음을 나타낸다. 대조적으로, VSVㅿG-minispike-eGFP로 면역화된 마우스는 질병의 임상적 징후를 경험하지 않았고(도 13 B, E), 모든 동물은 연구 동안 체중 감소가 거의 또는 전혀 없이(도 13 D, G) 감염에서 살아남았다(도 13C, F). 이것은 단일 면역화로 치명적인 COVID-19 호흡기 질환의 발병을 예방했기 때문에 VSVㅿG-minispike-eGFP 레플리콘 백신의 보호력을 보여준다.
실시예9 - VSVㅿG-minispike-eGFP 백신접종에 대한 반응으로 유도된 항체는 우려 변이체를 중화한다.
별개의 RBD 항원 부위의 동시 제시는 동종 바이러스에 대한 백신의 효율성뿐만 아니라 SARS-CoV-2 우려 변이체(VOC)의 출현 및 확산 측면에서도 관련이 있다. 여러 돌연변이 SARS-CoV-2 변이주는 2020년 말에 나타났고 빠르게 확장되어 지배적인 변이주가 되었다. 최근 등장한 VOC에는 영국/UK(B.1.1.7), 남아프리카(B.1.351; 501Y.V2) 및 브라질(P.1) 변이체가 포함되며 각각 9개, 10개 및 12개의 돌연변이를 획득하였다. S 단백질 유전자는 바이러스의 전염 및 확산을 촉진하거나 백신 유도 항체 또는 치료 항체에 대한 민감성을 감소시킨다(Baum et al., 2020; Weisblum et al., 2020). ACE2 결합 RBD 표면의 돌연변이는 중화 항체 반응이 주로 이 영역을 표적으로 하기 때문에 가장 큰 관심사이다. B.1.1.7 RBD에는 단일 N501Y 돌연변이가 포함되어 있다. B.1.351은 RBD(K417N, E484K 및 N501Y)에 세 가지 변화가 있고 P.1은 ACE2에 대해 증가된 친화성을 부여하는 매우 유사한 삼중항 돌연변이(K417T, E484K 및 N501Y)를 가지고 있다. 환자와 백신 유도 항체에 의한 B.1.351의 중화는 감소했으며, BioNTech/Pfizer 백신의 경우 중화의 9배 감소가 보고되었다(Zhou et al., 2021). 유사한 RBD 돌연변이에도 불구하고 P.1은 중화에 대한 저항성이 낮아 수용체 결합 도메인(RBD) 외부의 변화도 중화에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다(Dejnirattisai et al., 2021).
VSV-ㅿG-minispike 면역화 후 생성된 RBD 항체가 VOC에 대해 활성이 있는지를 평가하기 위해, 마우스 혈청은 안정화 D614G 돌연변이를 지닌 일반적인 우한 바이러스(Wuhan (D614G), UK(B.1.1.7), 브라질(P.1.) 및 남아프리카(B.1.351) 바이러스 변이체 뿐만 아니라 지금까지 자연에서 발생하지 않은 키메라 스파이크 작제물(인도 B.1.617.1의 RBD를 갖는 우한(D614G)) 유래의 스파이크 변이체로 슈도타입 된 VSV를 사용하여 중화 분석에 사용되었다. 특히, 백신접종된 마우스로부터의 혈청은 남아프리카 스파이크 단백질(B.1.371)을 갖는 바이러스를 포함하는 모든 바이러스 변이체를 중화시켰다(도 14A). B.1.351은 현재 가장 큰 우려 변이로, 허가된 백신(Astra Zeneca의 ChAdOx, Vaxzevria)이 이전에 조상 우한 바이러스 변이체에 감염된 환자를 이 변이체로부터 보호하지 못하고 B.1.351 감염 및 질병으로부터 보호받지 못하기 때문이다. 그러나 다행스럽게도 BNT162b2(Comirnaty; BioNTech/Pfizer) 또는 mRNA-1273(Moderna Biotech)과 같은 다른 백신은 보호적이다(Edara et al., 2021; Muik et al., 2021; Xie et al., 2021). 특히, 남아프리카 변이체 B.1.351에 대한 VSVㅿG-minispike-eGFP 면역화된 마우스의 중화 역가는 BNT162b2-백신된 대표적인 환자 혈청으로부터의 중화 역가를 초과하였으며(도 14B), 이는 VOC B.1.351에 대한 미니스파이크의 보호를 나타낸다. 영국 B.1.1.7, 브라질 P.1 및 키메라 UK/인도 변이체에 대한 중화 역가는 미니스파이크-면역화 마우스 및 BNT162b2-백신접종자에 대해 유사하였으며, 이는 이들 변이체에 대한 보호도 나타낸다. 이전에 지적한 바와 같이(Supasa et al., 2021), 회복기 혈청의 중화 역가는 모든 변이체에서 가장 낮았다. 결과는 여기에 설명된 진짜 WuhanRBD 서열을 포함하는 미니스파이크로 면역화하면 새로운 SARS-CoV-2 변이체를 중화할 수 있는 항체를 이끌어낸다는 것을 보여준다.
실시예 10 - SARS-CoV-2 변이체의 미니스파이크의 구축
VSVㅿG-minispike-eGFP로 인코딩된 우한 미니스파이크는 원래 SARS-CoV-2(우한)뿐만 아니라 우려 변이체의 스파이크 단백질을 운반하는 VSV 슈도타입에 대한 중화 항체를 유도하였다. 어쨌든, 훨씬 더 광범위한 보호를 달성하기 위해 변이체에서 유래된 미니스파이크를 인코딩하도록 VSVㅿG-minispike 레플리콘 백신을 변형하는 것이 유리할 수 있다. 따라서 가장 중요한 우려 변이체의 돌연변이를 가진 미니스파이크 작제물이 생산되었다: pCR3 minispike [E484K], [E484K, N501Y], [K417N, E484K], [K417N, E484K, N501Y](남아프리카에 해당, B.1.351), [K417T, E484K, N501Y](브라질에 해당, P.1), [L452R, E484K, N501Y], [L452R](Cal.20C에 해당), [L452R, E484Q](B.1.617.1에 해당) 및 [L452R;T478K](Cal.20C에 해당) B.1.617.2에 해당) 및 VSVㅿG-minispike-eGFP에 삽입된 해당 서열.
개별 미니스파이크 변이체를 인코딩하는 VSVㅿG 레플리콘 외에도 두 개의 다른 미니스파이크를 인코딩하는 레플리콘 예를 들어, VSVㅿG-minispike[Wuhan]+minispike[E484K]-eGFP이 생성되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Hennrich, Alexandru Adrian Conzelmann Karl-Klaus <120> VIRAL VACCINE VECTOR FOR IMMUNIZATION AGAINST A BETACORONAVIRUS <130> AD1806 PCT <160> 27 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 228 <212> PRT <213> SARS-CoV2 isolate Wuhan-Hu-1 <220> <223> RBD part of SARS-CoV2 <400> 1 Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe 1 5 10 15 Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr 20 25 30 Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys 35 40 45 Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe 50 55 60 Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr 65 70 75 80 Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln 85 90 95 Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu 100 105 110 Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu 115 120 125 Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg 130 135 140 Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr 145 150 155 160 Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr 165 170 175 Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr 180 185 190 Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro 195 200 205 Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys 210 215 220 Cys Val Asn Phe 225 <210> 2 <211> 1273 <212> PRT <213> SARS-CoV2 isolate Wuhan-Hu-1 <220> <223> Spike protein amino acid sequence <400> 2 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr 130 135 140 Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu 165 170 175 Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe 180 185 190 Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr 195 200 205 Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu 210 215 220 Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr 225 230 235 240 Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser 245 250 255 Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala 275 280 285 Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys 290 295 300 Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val 305 310 315 320 Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys 325 330 335 Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 545 550 555 560 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val 565 570 575 Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe 580 585 590 Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val 595 600 605 Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile 610 615 620 His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser 625 630 635 640 Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val 645 650 655 Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala 660 665 670 Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 675 680 685 Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser 690 695 700 Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile 705 710 715 720 Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val 725 730 735 Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu 740 745 750 Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr 755 760 765 Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln 770 775 780 Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 785 790 795 800 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser 805 810 815 Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly 820 825 830 Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp 835 840 845 Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu 850 855 860 Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly 865 870 875 880 Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile 885 890 895 Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr 900 905 910 Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn 915 920 925 Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala 930 935 940 Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn 945 950 955 960 Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val 965 970 975 Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln 980 985 990 Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val 995 1000 1005 Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu 1010 1015 1020 Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val 1025 1030 1035 1040 Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala 1045 1050 1055 Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu 1060 1065 1070 Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His 1075 1080 1085 Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile 1205 1210 1215 Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile 1220 1225 1230 Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys 1235 1240 1245 Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val 1250 1255 1260 Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr 1265 1270 <210> 3 <211> 3822 <212> DNA <213> SARS-CoV2 isolate Wuhan-Hu-1 <220> <223> Spike protein gene nucleotide sequence <400> 3 atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60 agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120 aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180 aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240 aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300 ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360 aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420 ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480 tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540 ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600 tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660 tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720 ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780 ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840 gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900 tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960 caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020 gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080 tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140 ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200 gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260 tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320 cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380 ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440 aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500 aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560 ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620 ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680 cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740 acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800 ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860 cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920 aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980 gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040 cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100 gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160 agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220 tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280 acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340 gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400 aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460 ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520 cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580 ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640 acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700 caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760 aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820 acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880 acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940 ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000 cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060 tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120 gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180 gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240 atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300 cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360 tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420 ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480 tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540 aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600 caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660 atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720 tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780 tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822 <210> 4 <211> 3822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human codon-optimized Spike gene nucleotide sequence <400> 4 atgttcgtgt ttctggtgct gctgcctctg gtgtccagcc agtgtgtgaa cctgaccacc 60 agaacacagc tgcctccagc ctacaccaac agctttacca gaggcgtgta ctaccccgac 120 aaggtgttca gatccagcgt gctgcactct acccaggacc tgttcctgcc tttcttcagc 180 aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg tccggcacca atggcaccaa gagattcgac 240 aaccccgtgc tgcccttcaa cgacggggtg tactttgcca gcaccgagaa gtccaacatc 300 atcagaggct ggatcttcgg caccacactg gacagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360 aacaacgcca ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420 ctgggcgtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aaagcgagtt ccgggtgtac 480 agcagcgcca acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc ctttcctgat ggacctggaa 540 ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600 ttcaagatct acagcaagca cacccctatc aacctcgtgc gggatctgcc tcagggcttc 660 tctgctctgg aacccctggt ggatctgccc atcggcatca acatcacccg gtttcagaca 720 ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca cctggcgata gcagcagcgg atggacagct 780 ggtgccgccg cttactatgt gggctacctg cagcctagaa ccttcctgct gaagtacaac 840 gagaacggca ccatcaccga cgccgtggat tgtgctctgg atcctctgag cgagacaaag 900 tgcaccctga agtccttcac cgtggaaaag ggcatctacc agaccagcaa cttccgggtg 960 cagcccaccg aatccatcgt gcggttcccc aatatcacca atctgtgccc cttcggcgag 1020 gtgttcaatg ccaccagatt cgcctctgtg tacgcctgga accggaagcg gatcagcaat 1080 tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac tccgccagct tcagcacctt caagtgctac 1140 ggcgtgtccc ctaccaagct gaacgacctg tgcttcacaa acgtgtacgc cgacagcttc 1200 gtgatccggg gagatgaagt gcggcagatt gcccctggac agacaggcaa gatcgccgac 1260 tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggctgtgtga ttgcctggaa cagcaacaac 1320 ctggactcca aagtcggcgg caactacaat tacctgtacc ggctgttccg gaagtccaat 1380 ctgaagccct tcgagcggga catctccacc gagatctatc aggccggcag caccccttgt 1440 aacggcgtgg aaggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggctt tcagcccaca 1500 aatggcgtgg gctatcagcc ctacagagtg gtggtgctga gcttcgaact gctgcatgcc 1560 cctgccacag tgtgcggccc taagaaaagc accaatctcg tgaagaacaa atgcgtgaac 1620 ttcaacttca acggcctgac cggcaccggc gtgctgacag agagcaacaa gaagttcctg 1680 ccattccagc agtttggccg ggatatcgcc gataccacag acgccgttag agatccccag 1740 acactggaaa tcctggacat caccccttgc agcttcggcg gagtgtctgt gatcacccct 1800 ggcaccaaca ccagcaatca ggtggcagtg ctgtaccagg acgtgaactg taccgaagtg 1860 cccgtggcca ttcacgccga tcagctgaca cctacatggc gggtgtactc caccggcagc 1920 aatgtgtttc agaccagagc cggctgtctg atcggagccg agcacgtgaa caatagctac 1980 gagtgcgaca tccccatcgg cgctggcatc tgtgccagct accagacaca gacaaacagc 2040 cccagacggg ccagatctgt ggccagccag agcatcattg cctacacaat gtctctgggc 2100 gccgagaaca gcgtggccta ctccaacaac tctatcgcta tccccaccaa cttcaccatc 2160 agcgtgacca cagagatcct gcctgtgtcc atgaccaaga ccagcgtgga ctgcaccatg 2220 tacatctgcg gcgattccac cgagtgctcc aacctgctgc tgcagtacgg cagcttctgc 2280 acccagctga atagagccct gacagggatc gccgtggaac aggacaagaa cacccaagag 2340 gtgttcgccc aagtgaagca gatctacaag acccctccta tcaaggactt cggcggcttc 2400 aatttcagcc agattctgcc cgatcctagc aagcccagca agcggagctt catcgaggac 2460 ctgctgttca acaaagtgac actggccgac gccggcttca tcaagcagta tggcgattgt 2520 ctgggcgaca ttgccgccag ggatctgatt tgcgcccaga agtttaacgg actgacagtg 2580 ctgcctcctc tgctgaccga tgagatgatc gcccagtaca catctgccct gctggccggc 2640 acaatcacaa gcggctggac atttggagct ggcgccgctc tgcagatccc ctttgctatg 2700 cagatggcct acagattcaa cggcatcgga gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760 aagctgatcg ccaaccagtt caacagcgcc atcggcaaga tccaggacag cctgagcagc 2820 acagcaagcg ccctgggaaa gctgcaggac gtggtcaacc agaatgccca ggcactgaac 2880 accctggtca agcagctgtc ctccaacttc ggcgccatca gctctgtgct gaacgatatc 2940 ctgagcagac tggacaaggt ggaagccgag gtgcagatcg acagactgat caccggaagg 3000 ctgcagtccc tgcagaccta cgttacccag cagctgatca gagccgccga gattagagcc 3060 tctgccaatc tggccgccac caagatgtct gagtgtgtgc tgggccagag caagagagtg 3120 gacttttgcg gcaagggcta ccacctgatg agcttccctc agtctgcccc tcacggcgtg 3180 gtgtttctgc acgtgacata cgtgcccgct caagagaaga atttcaccac cgctccagcc 3240 atctgccacg acggcaaagc ccactttcct agagaaggcg tgttcgtgtc caacggcacc 3300 cattggttcg tgacccagcg gaacttctac gagccccaga tcatcaccac cgacaacacc 3360 ttcgtgtctg gcaactgcga cgtcgtgatc ggcattgtga acaataccgt gtacgaccct 3420 ctgcagcccg agctggacag cttcaaagag gaactggata agtactttaa gaaccacaca 3480 agccccgacg tggacctggg cgatatcagc ggaatcaatg ccagcgtcgt gaacatccag 3540 aaagagatcg accggctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgacctg 3600 caagaactgg ggaagtacga gcagtacatc aagtggccct ggtacatctg gctgggcttt 3660 atcgccggac tgattgccat cgtgatggtc acaatcatgc tgtgttgcat gaccagctgc 3720 tgtagctgcc tgaagggctg ttgtagctgt ggcagctgct gcaagttcga cgaggacgat 3780 tctgagcccg tgctgaaggg cgtgaaactg cactacacat aa 3822 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Signal peptide IgH HV 3-7 amino acid sequence <400> 5 Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val 20 <210> 6 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Signal peptide IgH HV 3-13 nucleotide sequence <400> 6 atggaactgg gactgtcttg ggtgttcctg gtggccattc tggaaggcgt gcagtgcgag 60 gtg 63 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Immunoglobulin heavy variable 3-21 (IGHV3-21) <400> 7 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val 20 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Immunoglobulin heavy variable 1-46 (IGHV1-46) <400> 8 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I (FCGR1A) <400> 9 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IgG receptor FcRn large subunit p51 (FCGRT) <400> 10 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly 20 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Serum albumin (ALB) <400> 11 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 12 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Prolactin (PRL) <400> 12 Met Asn Ile Lys Gly Ser Pro Trp Lys Gly Ser Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Ser Val Ala Pro 20 25 <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Azurocidin preproprotein (AZU1) <400> 13 Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ala <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem/transmembrane anchor amino acid sequence <400> 14 Gly Ser Gly Ser Val Ile Pro Leu Val His Pro Leu Ala Asp Pro Ser 1 5 10 15 Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His 20 25 30 Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro 35 40 45 Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu 50 55 60 Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser 65 70 75 80 Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val 85 90 95 Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser 100 105 110 Gly Gly Glu Thr Arg Leu 115 <210> 15 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Stem/transmembrane anchor nucleotide sequence <400> 15 ggcagcggca gcgtgatccc tctggttcat cctctggccg atcctagcac cgtgttcaag 60 gatggggacg aagccgagga tttcgtggaa gtgcatctgc ccgatgtgca caaccaggtg 120 tcaggcgttg acctgggcct gcctaactgg ggcaaatacg tgctgctttc tgccggcgct 180 ctgacagccc tgatgctgat catcttcctg atgacctgct gtcggagagt gaacagaagc 240 gagcccactc agcacaacct gagaggcaca ggcagagaag tgtccgtgac acctcagagc 300 ggcaagatca tcagcagctg ggagagccac aagtctggcg gcgagacaag actctga 357 <210> 16 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Minispike amino acid sequence <400> 16 Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu 20 25 30 Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu 35 40 45 Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys 50 55 60 Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala 65 70 75 80 Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn 85 90 95 Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly 100 105 110 Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp 115 120 125 Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp 130 135 140 Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile 165 170 175 Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu 180 185 190 Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr 195 200 205 Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu 210 215 220 Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn 225 230 235 240 Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly Ser Gly Ser Val Ile Pro 245 250 255 Leu Val His Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp 260 265 270 Glu Ala Glu Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln 275 280 285 Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu 290 295 300 Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met 305 310 315 320 Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu 325 330 335 Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile 340 345 350 Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 355 360 365 <210> 17 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Minispike ORF nucleotide sequence <400> 17 atggaactgg gactgtcttg ggtgttcctg gtggccattc tggaaggcgt gcagtgcgag 60 gtgcagacca gcaactttag agtgcagccc accgagagca tcgtgcggtt ccccaacatc 120 accaatctgt gccctttcgg cgaggtgttc aacgccacca gattcgcctc tgtgtacgcc 180 tggaaccgga agcggatcag caattgcgtg gccgactaca gcgtgctgta caacagcgcc 240 agcttcagca ccttcaagtg ctacggcgtg tcccctacca agctgaacga cctgtgcttc 300 accaacgtgt acgccgacag cttcgtgatc agaggcgacg aagtgcggca gattgcccct 360 ggacagacag gcaagatcgc cgattacaac tacaagctgc ccgacgactt caccggctgt 420 gtgattgcct ggaacagcaa caacctggac agcaaagtcg gcggcaacta caactacctg 480 taccggctgt tccggaagtc caacctgaag cctttcgagc gggacatcag caccgagatc 540 tatcaggccg gcagcacccc ttgcaatggc gtggaaggct tcaactgcta cttcccactg 600 cagtcctacg gcttccagcc tacaaacggc gtgggctacc agccttacag agtggtggtg 660 ctgagcttcg agctgctgca tgctcctgcc acagtgtgcg gccctaagaa aagcaccaac 720 ctggtcaaga acaaatgcgt gaacttcggc agcggcagcg tgatccctct ggttcatcct 780 ctggccgatc ctagcaccgt gttcaaggat ggggacgaag ccgaggattt cgtggaagtg 840 catctgcccg atgtgcacaa ccaggtgtca ggcgttgacc tgggcctgcc taactggggc 900 aaatacgtgc tgctttctgc cggcgctctg acagccctga tgctgatcat cttcctgatg 960 acctgctgtc ggagagtgaa cagaagcgag cccactcagc acaacctgag aggcacaggc 1020 agagaagtgt ccgtgacacc tcagagcggc aagatcatca gcagctggga gagccacaag 1080 tctggcggcg agacaagact ctga 1104 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of RBD construct <400> 18 Asn Ile Thr Asn 1 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of RBD construct <400> 19 His Ala Pro Ala Thr Val 1 5 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of RBD construct <400> 20 Arg Val Gln Pro 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of RBD construct <400> 21 Cys Val Asn Phe 1 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of RBD construct <400> 22 Met Phe Ile Phe 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Part of RBD construct <400> 23 Thr Ser Gly Ser 1 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flanking residues <400> 24 Gln Thr Ser Asn 1 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flanking residues <400> 25 Lys Cys Val Asn Phe 1 5 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Short synthetic linker <400> 26 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Two putative N-Glycosylation sites in the RBD part of the minispike <400> 27 Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr 1 5 10 15

Claims (15)

  1. (a) 바이러스 입자를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) 바이러스 입자의 외피로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는 재조합 랍도바이러스(rhabdovirus) 벡터, 및/또는
    (b) 바이러스-유사 입자(VLP)를 형성할 수 있고 베타코로나바이러스의 면역원을 발현할 수 있되, 면역원은 C-말단에 (i) 감염된 세포의 세포막 및 (ii) VLP로의 면역원의 혼입을 위한 이종 막관통 앵커를 포함하는, 당단백질 (G) 단백질 유전자가 결실되고 트랜스에서 G 단백질이 보충된 재조합 랍도바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    베타코로나바이러스는 SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, OC43 및 HKU1으로부터 선택되고, 바람직하게는 SARS-CoV-2인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    면역원은 스파이크 (S) 단백질 또는 이의 면역원성 단편인 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    면역원성 단편은 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD)으로 구성되거나 이를 포함하고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1로 표현되는 단편 또는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고 선호도가 증가하는 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함하는 조성물.
  5. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)의 랍도바이러스는 바람직하게는 랍도바이러스 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 광견병 바이러스(RABV)이고, 및/또는 (b)의 랍도바이러스는 바람직하게는 G 단백질 유전자가 결실된 슈도타입 VSV 또는 RABV인 조성물.
  6. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    베타코로나바이러스의 면역원은 N-말단에 소포체에 높은 수준의 번역을 촉진하는 신호 펩타이드를 포함하되, 신호 펩타이드는 바람직하게는 면역글로불린, 바람직하게는 IgG 및 가장 바람직하게는 IgG의 중쇄에서 유래되는 조성물.
  7. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    막관통 앵커는 랍도바이러스 당단백질의 줄기에서 유래되고, 바람직하게는 리사바이러스(Lyssavirus) 속 구성원에서 유래되며, 보다 바람직하게는 광견병(RABV) 백신 변이주 SAD B19(분자 클론 SAD L16)에서 유래되고 및 가장 바람직하게는 RABV SAD L16 G 단백질의 G 엑토도메인의 막 근위 부분, 막관통 및 세포질 꼬리를 포함하거나 이로 구성되는 조성물.
  8. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 랍도바이러스 벡터는 베타코로나바이러스의 면역원을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개의 카피를 포함하되, 벡터는 벡터의 한 부위 또는 상이한 부위에 이들 카피를 포함하는 조성물.
  9. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 추가로 VLP를 포함하되, VLP는 바람직하게는 G 단백질 유전자가 결실되고 트랜스에서 기능적 G 단백질 유전자가 보충되지 않은 랍도바이러스인 조성물.
  10. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    베타코로나바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염을 예방 또는 치료하는 데 사용하기 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 사용은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물 또는 그들의 외피에 키메라 면역원을 제시하는 바이러스-유사 입자를 사용한 부스트 면역화를 더 포함하는 조성물.
  12. 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플 및 가장 바람직하게는 대상체에서 얻은 혈청 샘플을 기반으로 대상체에서 베타코로나바이러스 감염, 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염을 진단하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  13. (i) 베타코로나바이러스의 스파이크 수용체 결합 도메인(RBD), 여기서 RBD는 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 적어도 95% 동일하고 선호도가 증가하는 SEQ ID NO: 1의 변이체를 포함하며, 및 이의 C-말단에,
    (ii) 랍도바이러스 당단백질의 줄기, 바람직하게는 리사바이러스(Lyssavirus) 속 구성원, 보다 바람직하게는 광견병(RABV) 백신 변이주 SAD B19(분자 클론 SAD L16)에서 유래되며 및 가장 바람직하게는 RABV SAD L16 G 단백질의 G 엑토도메인의 막 근위 부분, 막관통 및 세포질 꼬리를 포함하거나 이로 구성되는 막관통 앵커, 및
    (iii) N-말단에 소포체에 높은 수준의 번역을 촉진하는 신호 펩타이드를 포함하는 베타코로나바이러스의 면역원성 작제물.
  14. 제13항의 면역원성 작제물을 인코딩하는 핵산 분자.
  15. 제13항의 면역원성 작제물을 발현하거나 제14항의 핵산 분자를 포함하는 바이러스 백신 벡터 또는 플라스미드 또는 DNA 또는 RNA 제제.
KR1020227044771A 2020-05-20 2021-05-19 베타코로나바이러스에 대한 면역화를 위한 바이러스 백신 벡터 KR20230016193A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20175797 2020-05-20
EP20175797.8 2020-05-20
PCT/EP2021/063273 WO2021233989A1 (en) 2020-05-20 2021-05-19 Viral vaccine vector for immunization against a betacoronavirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230016193A true KR20230016193A (ko) 2023-02-01

Family

ID=70802678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227044771A KR20230016193A (ko) 2020-05-20 2021-05-19 베타코로나바이러스에 대한 면역화를 위한 바이러스 백신 벡터

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230190917A1 (ko)
EP (1) EP4153311A1 (ko)
KR (1) KR20230016193A (ko)
IL (1) IL298333A (ko)
WO (1) WO2021233989A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023010176A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 The University Of Melbourne Vaccine construct and uses thereof
CN114717205A (zh) * 2022-03-29 2022-07-08 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种冠状病毒RBDdm变异体及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3439695B1 (en) * 2016-04-04 2022-05-04 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Multivalent vaccines for rabies virus and coronaviruses
WO2020021090A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Conzelmann Karl Klaus Conditionally cytotoxic agents
CN111088283B (zh) * 2020-03-20 2020-06-23 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗

Non-Patent Citations (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Abraham, G., & Banerjee, A. K. (1976). Sequential transcription of the genes of vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A, 73(5), 1504-1508.
Astori, M., & Kraehenbuhl, J. P. (1996). Recombinant fusion peptides containing single or multiple repeats of a ubiquitous T-helper epitope are highly immunogenic. Mol Immunol, 33(13), 1017-1024. doi:10.1016/s0161-5890(96)00068-5
Baum, A., Fulton, B. O., Wloga, E., Copin, R., Pascal, K. E., Russo, V., . . . Kyratsous, C. A. (2020). Antibody cocktail to SARS-CoV-2 spike protein prevents rapid mutational escape seen with individual antibodies. Science. doi:10.1126/science.abd0831
Bishnoi, S., Tiwari, R., Gupta, S., Byrareddy, S. N., & Nayak, D. (2018). Oncotargeting by Vesicular Stomatitis Virus (VSV): Advances in Cancer Therapy. Viruses, 10(2). doi:10.3390/v10020090
Black, B. L., & Lyles, D. S. (1992). Vesicular stomatitis virus matrix protein inhibits host cell-directed transcription of target genes in vivo. J Virol, 66(7), 4058-4064.
Buchholz, U. J., Bukreyev, A., Yang, L., Lamirande, E. W., Murphy, B. R., Subbarao, K., & Collins, P. L. (2004). Contributions of the structural proteins of severe acute respiratory syndrome coronavirus to protective immunity. Proc Natl Acad Sci U S A, 101(26), 9804-9809. doi:10.1073/pnas.0403492101
Conzelmann, K.-K. (2013). Reverse Genetics of Mononegavirales: The Rabies Virus Paradigm. In Y. Nagai (Ed.), Sendai Virus Vector: Advantages and Applications (pp. 1-20). Tokyo: Springer Japan.
Corbett, K. S., Edwards, D. K., Leist, S. R., Abiona, O. M., Boyoglu-Barnum, S., Gillespie, R. A., . . . Graham, B. S. (2020). SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature. doi:10.1038/s41586-020-2622-0
Dagan, N., Barda, N., Kepten, E., Miron, O., Perchik, S., Katz, M. A., . . . Balicer, R. D. (2021). BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine in a Nationwide Mass Vaccination Setting. N Engl J Med. doi:10.1056/NEJMoa2101765
Dejnirattisai, W., Zhou, D., Supasa, P., Liu, C., Mentzer, A. J., Ginn, H. M., . . . Screaton, G. R. (2021). Antibody evasion by the P.1 strain of SARS-CoV-2. Cell. doi:10.1016/j.cell.2021.03.055
Edara, V. V., Norwood, C., Floyd, K., Lai, L., Davis-Gardner, M. E., Hudson, W. H., . . . Suthar, M. S. (2021). Infection- and vaccine-induced antibody binding and neutralization of the B.1.351 SARS-CoV-2 variant. Cell Host Microbe, 29(4), 516-521.e513. doi:10.1016/j.chom.2021.03.009
Fathi, A., Dahlke, C., & Addo, M. M. (2019). Recombinant vesicular stomatitis virus vector vaccines for WHO blueprint priority pathogens. Hum Vaccin Immunother, 15(10), 2269-2285. doi:10.1080/21645515.2019.1649532
Fehr, T., Bachmann, M. F., Bucher, E., Kalinke, U., Di Padova, F. E., Lang, A. B., . . . Zinkernagel, R. M. (1997). Role of repetitive antigen patterns for induction of antibodies against antibodies. J Exp Med, 185(10), 1785-1792. doi:10.1084/jem.185.10.1785
Garcia-Beltran, W. F., Lam, E. C., St. Denis, K., Nitido, A. D., Garcia, Z. H., Hauser, B. M., . . . Balazs, A. B. (2021). Multiple SARS-CoV-2 variants escape neutralization by vaccine-induced humoral immunity. Cell, 184(9), 2372-2383.e2379. doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.013
Ghanem, A., & Conzelmann, K. K. (2016). G gene-deficient single-round rabies viruses for neuronal circuit analysis. Virus Res, 216, 41-54. doi:10.1016/j.virusres.2015.05.023
Ghanem, A., Kern, A., & Conzelmann, K. K. (2012). Significantly improved rescue of rabies virus from cDNA plasmids. Eur.J.Cell Biol., 91(1), 10-16.
Hangartner, L., Zinkernagel, R. M., & Hengartner, H. (2006). Antiviral antibody responses: the two extremes of a wide spectrum. Nat Rev Immunol, 6(3), 231-243. doi:10.1038/nri1783
Hoffmann, M., Arora, P., Groß, R., Seidel, A., Hrnich, B. F., Hahn, A. S., . . Pohlmann, S. (2021). SARS-CoV-2 variants B.1.351 and P.1 escape from neutralizing antibodies. Cell, 184(9), 2384-2393.e2312. doi:10.1016/j.cell.2021.03.036
Hoffmann, M., Kleine-Weber, H., Schroeder, S., Kruger, N., Herrler, T., Erichsen, S., . . . Pohlmann, S. (2020). SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell. doi:10.1016/j.cell.2020.02.052
Hoffmann, M., Wu, Y. J., Gerber, M., Berger-Rentsch, M., Heimrich, B., Schwemmle, M., & Zimmer, G. (2010). Fusion-active glycoprotein G mediates the cytotoxicity of vesicular stomatitis virus M mutants lacking host shut-off activity. J Gen Virol, 91(Pt 11), 2782-2793. doi:10.1099/vir.0.023978-0
Houser, K. V., Broadbent, A. J., Gretebeck, L., Vogel, L., Lamirande, E. W., Sutton, T., . . . Subbarao, K. (2017). Enhanced inflammation in New Zealand white rabbits when MERS-CoV reinfection occurs in the absence of neutralizing antibody. PLoS Pathog, 13(8), e1006565. doi:10.1371/journal.ppat.1006565
Jaume, M., Yip, M. S., Kam, Y. W., Cheung, C. Y., Kien, F., Roberts, A., . . . Altmeyer, R. (2012). SARS CoV subunit vaccine: antibody-mediated neutralisation and enhancement. Hong Kong Med J, 18 Suppl 2, 31-36.
Klingen, Y., Conzelmann, K. K., & Finke, S. (2008). Double-labeled rabies virus: live tracking of enveloped virus transport. J.Virol., 82(1), 237-245.
Kopecky, S. A., Willingham, M. C., & Lyles, D. S. (2001). Matrix protein and another viral component contribute to induction of apoptosis in cells infected with vesicular stomatitis virus. J Virol, 75(24), 12169-12181.
Lamers, M. M., Beumer, J., van der Vaart, J., Knoops, K., Puschhof, J., Breugem, T. I., . . . Clevers, H. (2020). SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. doi:10.1126/science.abc1669
Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., & Rose, J. K. (1995). Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc Natl Acad Sci U S A, 92(10), 4477-4481.
Liu, L., Wei, Q., Lin, Q., Fang, J., Wang, H., Kwok, H., . . . Chen, Z. (2019). Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophage responses during acute SARS-CoV infection. JCI Insight, 4(4). doi:10.1172/jci.insight.123158
Majid, A. M., Ezelle, H., Shah, S., & Barber, G. N. (2006). Evaluating replication-defective vesicular stomatitis virus as a vaccine vehicle. J Virol, 80(14), 6993-7008. doi:10.1128/jvi.00365-06
Matsuura, Y., Tani, H., Suzuki, K., Kimura-Someya, T., Suzuki, R., Aizaki, H., . . . Miyamura, T. (2001). Characterization of pseudotype VSV possessing HCV envelope proteins. Virology, 286(2), 263-275. doi:10.1006/viro.2001.0971
Mebatsion, T. (2001). Extensive attenuation of rabies virus by simultaneously modifying the dynein light chain binding site in the P protein and replacing Arg333 in the G protein. J.Virol., 75(23), 11496-11502.
Mebatsion, T., & Conzelmann, K. K. (1996). Specific infection of CD4+ target cells by recombinant rabies virus pseudotypes carrying the HIV-1 envelope spike protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 93(21), 11366-11370.
Mebatsion, T., Finke, S., Weiland, F., & Conzelmann, K. K. (1997). A CXCR4/CD4 pseudotype rhabdovirus that selectively infects HIV-1 envelope protein-expressing cells. Cell, 90(5), 841-847.
Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., & Zimmer, G. (2016). Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses, 8(9). doi:10.3390/v8090254
Muik, A., Wallisch, A.-K., Sanger, B., Swanson, K. A., Muhl, J., Chen, W., . . Sshin, U. (2021). Neutralization of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 pseudovirus by BNT162b2 vaccine-elicited human sera. Science, 371(6534), 1152. doi:10.1126/science.abg6105
Polack, F. P., Thomas, S. J., Kitchin, N., Absalon, J., Gurtman, A., Lockhart, S., . . . Gruber, W. C. (2020). Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. N Engl J Med, 383(27), 2603-2615. doi:10.1056/NEJMoa2034577
Publicover, J., Ramsburg, E., Robek, M., & Rose, J. K. (2006). Rapid pathogenesis induced by a vesicular stomatitis virus matrix protein mutant: viral pathogenesis is linked to induction of tumor necrosis factor alpha. J Virol, 80(14), 7028-7036.
Puelles, V. G., Lutgehetmann, M., Lindenmeyer, M. T., Sperhake, J. P., Wong, M. N., Allweiss, L., . . . Huber, T. B. (2020). Multiorgan and Renal Tropism of SARS-CoV-2. N Engl J Med. doi:10.1056/NEJMc2011400
Sadoff, J., Le Gars, M., Shukarev, G., Heerwegh, D., Truyers, C., de Groot, A. M., . . . Schuitemaker, H. (2021). Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. doi:10.1056/NEJMoa2034201
Schnell, M. J., Buonocore, L., Boritz, E., Ghosh, H. P., Chernish, R., & Rose, J. K. (1998). Requirement for a non-specific glycoprotein cytoplasmic domain sequence to drive efficient budding of vesicular stomatitis virus. EMBO J, 17(5), 1289-1296. doi:10.1093/emboj/17.5.1289
Schnell, M. J., Mebatsion, T., & Conzelmann, K. K. (1994). Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J, 13(18), 4195-4203.
Supasa, P., Zhou, D., Dejnirattisai, W., Liu, C., Mentzer, A. J., Ginn, H. M., . . . Screaton, G. R. (2021). Reduced neutralization of SARS-CoV-2 B.1.1.7 variant by convalescent and vaccine sera. Cell. doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.033
Szomolanyi-Tsuda, E., & Welsh, R. M. (1998). T-cell-independent antiviral antibody responses. Curr Opin Immunol, 10(4), 431-435. doi:10.1016/s0952-7915(98)80117-9
Walker, P. J., Blasdell, K. R., Calisher, C. H., Dietzgen, R. G., Kondo, H., Kurath, G., . . . Nbsp Ictv Report, C. (2018). ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae. J Gen Virol, 99(4), 447-448. doi:10.1099/jgv.0.001020
Wang, C., Li, W., Drabek, D., Okba, N. M. A., van Haperen, R., Osterhaus, A., . . . Bosch, B. J. (2020). A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection. Nat Commun, 11(1), 2251. doi:10.1038/s41467-020-16256-y
Weisblum, Y., Schmidt, F., Zhang, F., DaSilva, J., Poston, D., Lorenzi, J. C., . . . Bieniasz, P. D. (2020). Escape from neutralizing antibodies by SARS-CoV-2 spike protein variants. Elife, 9. doi:10.7554/eLife.61312
Whelan, S. P., Barr, J. N., & Wertz, G. W. (2004). Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Curr.Top.Microbiol.Immunol., 283:61-119., 61-119.
Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., & Callaway, E. M. (2007). Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nat Methods, 4(1), 47-49.
Wickersham, I. R., Lyon, D. C., Barnard, R. J., Mori, T., Finke, S., Conzelmann, K. K., . . . Callaway, E. M. (2007). Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron, 53(5), 639-647.
Xie, X., Liu, Y., Liu, J., Zhang, X., Zou, J., Fontes-Garfias, C. R., . . . Shi, P.-Y. (2021). Neutralization of SARS-CoV-2 spike 69/70 deletion, E484K and N501Y variants by BNT162b2 vaccine-elicited sera. Nature Medicine. doi:10.1038/s41591-021-01270-4
Yinda, C. K., Port, J. R., Bushmaker, T., Offei Owusu, I., Purushotham, J. N., Avanzato, V. A., . . . Munster, V. J. (2021). K18-hACE2 mice develop respiratory disease resembling severe COVID-19. PLoS Pathog, 17(1), e1009195. doi:10.1371/journal.ppat.1009195
Zemp, F., Rajwani, J., & Mahoney, D. J. (2018). Rhabdoviruses as vaccine platforms for infectious disease and cancer. Biotechnol Genet Eng Rev, 34(1), 122-138. doi:10.1080/02648725.2018.1474320
Zhou, D., Dejnirattisai, W., Supasa, P., Liu, C., Mentzer, A. J., Ginn, H. M., . . . Screaton, G. R. (2021). Evidence of escape of SARS-CoV-2 variant B.1.351 from natural and vaccine-induced sera. Cell. doi:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.037

Also Published As

Publication number Publication date
EP4153311A1 (en) 2023-03-29
IL298333A (en) 2023-01-01
US20230190917A1 (en) 2023-06-22
WO2021233989A1 (en) 2021-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mezhenskaya et al. M2e-based universal influenza vaccines: a historical overview and new approaches to development
AU2017203189B2 (en) Expression systems
EP0871482B1 (en) Recombinant vesiculoviruses and their uses
Dietzschold et al. New approaches to the prevention and eradication of rabies
US20210338804A1 (en) Vaccine Compositions For Preventing Coronavirus Disease
KR20090034297A (ko) 인플루엔자에 대한 항바이러스제 및 백신
Scher et al. Rhabdoviruses as vectors for vaccines and therapeutics
US20230190917A1 (en) Viral vaccine vector for immunization against a betacoronavirus
US20230346919A1 (en) Sars cov-2 vaccines and high throughput screening assays based on vesicular stomatitis virus vectors
WO2021220319A1 (en) Polynucleotides encoding sars-cov-2 antigens and use thereof in the medical field as vaccines
WO2017040203A1 (en) Generation of infectious influenza viruses from virus-like particles
CN117098551A (zh) 编码截短的ns1蛋白和sars-cov受体结合域的流感病毒
US20230227848A1 (en) Coronavirus vaccine constructs and methods of making and using same
JP2022547786A (ja) ハンタウイルス抗原性組成物
WO2023150638A2 (en) Omicron coronavirus vaccine constructs and methods of making and using same
JP2021522854A (ja) ＨＳＶ−２−ＤＥＬＴＡ−ｇＤ ワクチンおよびそれらの生産および使用のための方法
AU2022368453A1 (en) Chimeric betacoronavirus spike polypeptides
EP0871738A1 (fr) Pseudo-particules virales recombinantes et applications vaccinales et antitumorales
CA2370278C (en) Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides
US11274282B2 (en) Vesicular stomatitis vectors encoding Crimean-Congo hemorrhagic fever antigen
US20230398201A1 (en) Gene shuffled lyssavirus vaccine
KR20240052044A (ko) 코로나바이러스과 바이러스에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 바이러스-유사 입자
EP1721982B1 (en) Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides
Parker Effect of a Codon Optimized DNA Prime on Induction of Anti-Influenza Protective Antibodies