KR20230015859A - 분리된 미토콘드리아를 포함하는 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

분리된 미토콘드리아를 포함하는 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리된 미토콘드리아를 포함하는, 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 보존액 조성물 및 이를 이용한 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 보존액 조성물은 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 활성을 유지하면서 동시에 장기간 보존성이 우수하다. 이에 따라, 궁극적으로 이식 성공률 향상을 위한 이식의료 분야 뿐만 아니라 재생의료 분야 등에서 유용하게 활용 가능하다.

Description

분리된 미토콘드리아를 포함하는 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 조성물 및 이의 용도{COMPOSITION FOR PRESERVING ISOLATED CELLS, TISSUES, OR ORGANS CONTAINING AN ISOLATED MITOCHONDRIA AND USE THEREOF}
본 발명은 분리된 미토콘드리아를 포함하는, 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 보존액 조성물 및 이를 이용한 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존 방법에 관한 것이다.
장기이식은 기능이 훼손된 조직 또는 장기를 다른 정상 조직 또는 장기로 대체하는 것을 말한다. 1980년대 면역역제제들이 개발되면서 장기이식 수술의 성공률이 높아졌고, 현재까지 우수한 장기이식 수술법이 개발되고 있다. 또한, 한국에서 2020년 '장기 등 이식에 관한 법률'이 시행된 후, 뇌사자의 장기공여에 의한 장기이식 수술 건수가 급격히 증가하였다.
공여자로부터 분리된 조직 또는 장기는 생체외에서 그 기능을 오래 유지하기 어렵기 때문에 최대한 빨리 이식을 해야 생체 이식의 성공률을 높일 수 있다. 하지만 안타깝게도 이식이 필요한 환자에게 분리된 조직 또는 장기가 전달되기까지 시간이 소요되어, 결국 조직 또는 장기를 못쓰게 되거나 이식된 조직 또는 장기의 기능이 떨어지는 문제가 있다. 분리된 조직 또는 장기의 기능이 손상되지 않고 장기 보존할 수 있다면, 훨씬 여유있게 조직 또는 장기를 이송하여 이식받을 환자의 준비가 가능하고, 귀중한 조직이나 장기를 버리지 않으며, 생체 이식 성공률도 높일 수 있을 것이다. 최근 이러한 조직이나 장기 보존을 위한 연구가 이루어지고 있다(WO2021-007275A1).
그러나, 여전히 분리된 조직 또는 장기의 활성을 오랫동안 유지할 수 있는 보존액이나 장치의 개발이 미흡한 실정이다. 따라서, 분리된 조직 또는 장기의 생체 기능을 유지할 수 있으며, 분리된 조직 또는 장기를 장기간 보존할 수 있는 보존액 또는 장치의 개발이 필요한 실정이다.
WO 2021-007275 A1
이에, 본 발명자들은 분리된 세포, 조직, 또는 장기를 장기간 보존할 수 있는 보존액을 개발하고자 노력한 결과, 분리된 미토콘리아를 포함하는 보존액이 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 활성을 장기간 유지할 수 있음을 확인함으로써 효과가 우수한 세포, 조직, 또는 장기 보존액을 개발하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 분리된 미토콘드리아를 포함하는, 분리된 세포, 조직, 또는 장기(organ)의 보존을 위한 보존액 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 세포, 조직, 또는 장기를 상기 보존액 조성물의 존재 하에서 보관하는 단계를 포함하는, 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분리된 미토콘드리아를 포함하는 보존액은 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 활성을 유지하면서 장기간 보존이 가능하다. 따라서, 이식을 위한 생체 조직의 활성이 유지될 수 있을 뿐만 아니라, 궁극적으로 이식 성공률을 높일 가능성이 높다. 이에 따라, 이식의료 분야 뿐만 아니라 재생의료 분야 등에서 산업적 활용 가능성이 높다.
도 1은 분리된 심장을 미토콘드리아를 함유한 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트(Histidine-tryptophan-ketoglutarate: HTK) 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 시간(h)에 대한 정규화된 관류액의 부피를 나타낸 그래프이다.
도 2는 분리된 심장을 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 경우 보관 시간(시)에 따른 근섬유세포의 이미지들이다.
도 3은 분리된 장기를 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 후의 이미지들이다.
도 4는 분리된 신장을 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 경우 신장의 ACE2 효소 활성 정도를 분석한 그래프이다.
도 5는 분리된 심근세포를 MitoTrackerTM로 염색된 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 후 미토콘드리아의 이동을 확인한 공초점 현미경 촬영 사진이다. 여기서, hPl-mito는 인간 혈소판 유래 미토콘드리아(Human Platlet derived mitochondria)를 표시한 것이다.
도 6은 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 분리된 심근세포를 보관한 후 심근세포 생존율 증가 정도를 확인한 도면으로, WST-1 assay 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 분리된 심근세포를 보관한 후 심근세포 생존율 증가 정도를 확인한 도면으로, 세포내 ATP 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 분리된 심장 조직을 보관한 후 심장 조직내 미토콘드리아의 이동을 확인한 공초점 현미경 촬영 사진이다.
도 9는 분리된 심장을 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 경우 심장의 ATP 합성 효소 활성 정도를 분석한 그래프이다.
도 10은 분리된 심장을 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 경우 심장의 시트레이트 합성 효소 활성 정도를 분석한 그래프이다.
도 11은 분리된 신장을 다양한 농도로 미토콘드리아를 함유한 미토콘드리아-HTK 용액에 보관한 경우 신장의 ACE2 효소 활성 정도를 분석한 그래프이다.
도 12는 분리된 신장을 활성화 또는 불활성화된 다양한 유래의 미토콘드리아-HTK 용액에 보관한 경우 신장의 ACE2 효소 활성 정도를 분석한 그래프이다.
미토콘드리아를 포함하는 보존액 조성물
본 발명의 일 측면은 분리된 미토콘드리아를 포함하는, 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 보존액 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "미토콘드리아(mitochondria)"는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate, ATP) 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 상기 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸 뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "분리된 미토콘드리아"는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic)으로부터 수득된 미토콘드리아를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "자가 미토콘드리아"는 동일 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 용어 "동종 미토콘드리아"는 개체와 같은 종에 속하고, 대립유전자에 대해서는 다른 유전자형을 가지는 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다. 또한, 용어 "이종 미토콘드리아"는 개체와 다른 종에 속하는 개체의 조직 또는 세포로부터 수득된 미토콘드리아를 의미한다.
이때, 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 미토콘드리아는 개체의 조직 또는 세포로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 체세포, 생식세포 또는 줄기세포로부터 수득된 것일 수 있으며, 혈액세포 또는 혈소판으로부터 분리된 것일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 정상인 세포로부터 수득된 정상적인 미토콘드리아일 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 체외에서 배양된 자가 또는 타가 세포로부터 수득된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "세포"는 생물을 구성하는 구조적 또는 기능적 단위로서, 세포막으로 둘러싸인 세포질로 구성되어 있고, 단백질 및 핵산 등의 생체분자를 포함하는 것을 의미한다. 상기 세포는 세포막 내부에 미토콘드리아를 포함하는 세포를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어, "체세포"는 개체를 구성하는 세포 중 생식세포를 제외한 세포를 의미한다. 상기 체세포는 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판, 점막세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 미토콘드리아 활성이 뛰어난 근육세포 또는 간세포로부터 수득된 것일 수 있다. 또한, 자가 또는 타가 혈액 PBMC 세포로부터 수득된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "혈소판"은 혈액의 유형성분인 혈구의 하나로, 골수에서 생성되어 혈관이나 조직이 손상된 후 지혈과 혈액 응고에 중요한 역할을 한다. 상기 미토콘드리아는 자가 또는 타가 혈소판에서 수득된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "생식세포"는 생식에 참여하는 세포로 유성생식으로 번식하는 생물의 배우자인 정자와 난자 및 이들을 발생시키는 모든 단계에 있는 조상 세포들을 포함한다. 상기 미토콘드리아는 자가 또는 타가 생식세포에서 수득된 것일 수 있다. 상기 생식세포는 정자 또는 난자일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "줄기세포"는 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포를 의미한다. 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포, 조직 유래 줄기세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이때, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, 인간 탯줄 유래일 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 개체로부터 분리되거나 체외 배양된 세포 또는 조직 시료를 농축하여 파쇄한 후 수득할 수 있다. 또한, 상기 미토콘드리아는 동결 보관 후 해동한 세포 또는 조직 시료를 파쇄한 후 수득할 수 있다.
또한, 상기 미토콘드리아는 동결 건조, 동결 보관, 또는 동결 보관 후 해동된 세포 또는 조직 시료로부터 수득된 것일 수 있으나, 수득되는 미토콘드리아의 생물학적 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 특별히 제한되지는 않는다.
또한, 상기 미토콘드리아는 손상되지 않고, 생물학적 활성이 정상인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 생물학적 활성이 정상인 미토콘드리아는 (i) 막 전위를 가지는 것, (ii) 미토콘드리아 내에서 ATP를 생성하는 것 및 (iii) 미토콘드리아 내에서 ROS를 제거하거나 ROS의 활성을 감소시키는 것으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 특성을 가지는 것일 수 있다.
상기 보존액 조성물은 히스티딘, 트립토판 및 케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 케토글루타레이트는 알파-케토글루타레이트(alpha-ketoglutarate)일 수 있다.
상기 조성물은 히스티딘, 트립토판 및 케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상과 분리된 미토콘드리아의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 조성물 중 분리된 미토콘드리아의 농도는 약 0.01 μg/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 100 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 90 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 80 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 70 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 60 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 50 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 40 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 30 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 20 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 9 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 8 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 7 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 6 μg/mL, 약 0.01 μg/mL 내지 약 5 μg/mL, 약 0.1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 0.5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 1 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 약 2.5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL, 또는 약 5 μg/mL 내지 약 10 μg/mL일 수 있다.
상기 조성물 중 히스티딘의 농도는 약 1 mM 내지 약 500 mM, 약 5 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 25 mM 내지 약 500 mM, 약 50 mM 내지 약 500 mM, 약 75 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 500 mM, 약 125 mM 내지 약 500 mM, 약 150 mM 내지 약 500 mM, 약 175 mM 내지 약 500 mM, 약 198 mM 내지 약 500 mM, 약 100 mM 내지 약 400 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 또는 약 100 mM 내지 약 198 mM일 수 있다.
상기 조성물 중 트립토판의 농도는 약 1 μM 내지 약 100 mM, 약 1 μM 내지 약 90 mM, 약 1 μM 내지 약 80 mM, 약 1 μM 내지 약 70 mM, 약 1 μM 내지 약 60 mM, 약 1 μM 내지 약 50 mM, 약 1 μM 내지 약 40 mM, 약 1 μM 내지 약 30 mM, 약 1 μM 내지 약 20 mM, 약 1 μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 10 μM 내지 약 10 mM, 약 100 μM 내지 약 10 mM, 약 0.5 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1.5 mM 내지 약 10 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 10 mM일 수 있다.
상기 조성물 중 케토글루타레이트의 농도는 약 1 μM 내지 약 100 mM, 약 1 μM 내지 약 90 mM, 약 1 μM 내지 약 80 mM, 약 1 μM 내지 약 70 mM, 약 1 μM 내지 약 60 mM, 약 1 μM 내지 약 50 mM, 약 1 μM 내지 약 40 mM, 약 1 μM 내지 약 30 mM, 약 1 μM 내지 약 20 mM, 약 1 μM 내지 약 10 mM, 약 1 μM 내지 약 5 mM, 약 10 μM 내지 약 10 mM, 약 100 μM 내지 약 10 mM, 약 250 μM 내지 약 10 mM, 약 500 μM 내지 약 10 mM, 약 750 μM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 5 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 2 mM일 수 있다.
또한, 상기 보존액 조성물은 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 장기보존을 위한 저온보관용액 또는 동결보존액을 더 포함할 수 있다.
상기 저온보관용액은 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch, HES), N-아세틸 시스테인(N-Acetyl Cystein, NAC) 및 덱사메타손(Dexamethasone, DEX)을 포함할 수 있다. 상기 HES는 테트라-하이드록시에틸 스타치(tetra-hydroxyethyl starch, T-HES), 펜타-하이드록시에틸 스타치(penta-hydroxyethyl starch, P-HES) 또는 헥사-하이드록시에틸 스타치(hexa-hydroxyehtyl starch, H-HES)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 저온보관용액은 필수아미노산, 인슐린 및 포도당을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 동결보존액은 하이드록시에틸 스타치(hydroxyethyl starch, HES) 및 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)을 포함할 수 있다. 상기 동결보존액은 DMEM 혹은 MEM과 같은 세포 배양배지, PlasmaLyte 혹은 PBS와 같은 생리 완충액을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 동결보존액은 아세트아미드, 아가로스, 알기네이트, 1-아날린, 알부민, 암모늄 아세테이트, 부탄디올, 콘드로이틴 설페이트, 클로로포름, 콜린, 디에틸렌 글리콜, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 술폭시드 (DMSO), 에리스리톨, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 글루코스, 글리세롤, α-글리세롤포스페이트, 글리세롤 모노아세테이트, 글리신, 하이드록시에틸 전분, 이노시톨, 락토스, 염화 마그네슘, 황산 마그네슘, 말토스, 만니톨, 만노스, 메탄올, 메틸 아세트아미드, 메틸포름아미드, 메틸 우레아, 페놀, 플루로닉 폴리올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 프롤린, 프로필렌 글리콜, 피리딘 N-옥사이드, 리보스, 세린, 브롬화 나트륨, 염화 나트륨, 요오드화 나트륨, 질산 나트륨, 황산 나트륨, 솔비톨, 수크로스, 트레할로스, 트리에틸렌 글리콜, 트리메틸아민 아세테이트, 우레아, 발린, 자일로센, 덱스트린, 덱스트란 및 이소말토올리고당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부가적인 동결 보호 물질을 포함할 수 있다.
한편, 상기 보존액 조성물에는 IAP(세포 사멸 저해제), rho-관련 단백질 키나제(ROCK) 신호 경로 저해제 및/또는 EGF, FGF, PDGF, IGF, EPO, BDNF, TGF, TNF 및/또는 VEGF와 같은 생장 인자에 속하는 단백질이 더 포함될 수 있다.
또한, 상기 보존액 조성물에는 항산화제, 삼투 조절제 및 에너지 공급원 중에서 선택된 하나 이상의 첨가물이 포함될 수 있다.
상기 항산화제는 이에 제한되지는 않으나, 알파 토코페롤(비타민 E), 알파 토코페롤 아세테이트, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니돌, 부틸화 하이드록시퀴논, 부틸화 하이드록시톨루엔, 하이드록시시쿠마린, 에틸 갈레이트, 프로필 갈레이트, 옥틸 갈레이트, 라우릴 갈레이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 트리하이드록시부틸로페논, 디메틸페놀, 레시틴, 조효소 Q10, 에탄올아민 또는 이들의 배합물 등일 수 있다.
상기 삼투 조절제는 이에 제한되지는 않으나, 덱스트란, 염화 나트륨, 포도당, 소르비톨, 자일리톨, 만니톨, 덱스트로스, 중탄산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 락트산나트륨, 링거용액, 락테이트화시킨 링거 용액, 하이드록시에틸 전분, 라피노오스, 글라이세롤 또는 이들의 조합 등일 수 있다.
상기 에너지 공급원은 이에 제한되지는 않으나, 아데노신-5-트리포스페이트(ATP, adenosine 5'-triphosphate), 아데노신-5-트리포스페이트 이나트륨 염, 글루코스, 말토스, 만노스, 갈락토스 또는 프럭토스 등이 있고, 아데노신-5-트리포스페이트(ATP, adenosine 5'-triphosphate) 및/또는 아데노신-5-트리포스페이트 이나트륨 염일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 보존액 조성물은 히스티딘, 트립토판 및 케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분 이외에, 아데노신, 글루타티온, BES(N,N-bis[2-hydroxyethyl]-2-aminoethanesulfonic acid), HES(hydroxyethyl starch), PEG(polyethylene glycol)를 유효성분으로 할 수 있다. 또한, 이에 제한되지는 않으나, 저온 보관에 사용되는 EC(Euro-Collins) 용액, UW(University of Wisconsin) 용액(Via-span®), Celsior®, Custodiol®, IGL-1®, BGP-HMP(N,N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid(BES)-gluconate-polyethylene glycol [BGP]-based solution(hypothermic machine perfusion [HMP]) 용액, BGP-CS(cold storage) 용액 등도 첨가할 수 있다.
상기 세포, 조직, 또는 장기는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 포유동물은 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다.
상기 세포, 조직, 또는 장기는 생체 이식을 위한 것일 수 있다.
상기 세포는 조직이나 장기를 구성하는 세포가 포함되며, 그 예로는 이에 제한되지는 않으나, 근육세포, 간세포, 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 줄기세포, 또는 점막세포일 수 있다.
상기 조직은 피부, 근육, 각막, 연골, 신경 및 뼈로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 장기는 심장, 간, 신장, 소장, 위, 췌장, 폐, 담낭, 신경, 피부, 혈관, 치아, 안구, 각막, 뇌, 척수, 갑상선, 골수, 근육, 흉선, 비장, 대장, 고환 및 난소로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 보존액 조성물은 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 장기보존 효율을 높일 수 있는 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 물, 당류(예컨대, 수크로스, 라피노스(raffinose), 전분), pH 완충물질(예컨대, 인산나트륨, 인산칼륨), ATP, 완충제, 알부민, 또는 항산화물질(예컨대, 비타민 E)일 수 있다.
미토콘드리아를 포함하는 관류 또는 재관류용 조성물
본 발명의 다른 측면은 분리된 미토콘드리아를 포함하는 관류(perfusion) 또는 재관류(re-perfusion)를 위한 조성물을 제공한다.
상기 관류(perfusion)는 분리된 세포, 조직, 또는 장기에 관류액을 주입하거나 계속 흘려보내 원형질을 인공액으로 치환하는 것일 수 있다. 상기 재관류(re-perfusion)는 분리된 세포, 조직, 또는 장기에 혈액 공급이 일시적으로 중단되었다가 다시 혈액의 흐름을 복구하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 비경구 투여용 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 액제일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 하나 이상의 첨가제(additives)를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 부형제(excipients), 희석제(diluents), 부착방지제(anti-adherents), 보존제(preservatives), 담체(vehicles), 계면활성제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 염류, 예를 들어 MgCl2, CaCl2, NaCl, KCl, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
보존액 조성물을 이용한 세포, 조직, 또는 장기의 보존 방법
본 발명의 또 다른 측면은 분리된 세포, 조직, 또는 장기를 분리된 미토콘드리아를 포함하는 보존액 조성물의 존재 하에서 보관하는 단계를 포함하는 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존 방법을 제공한다.
상기 세포, 조직, 장기, 미토콘드리아 및 보존액 조성물은 전술한 바와 같다.
본 명세서에 사용된 용어 "보존액 조성물의 존재 하에서"는 본 발명의 보존액 조성물을 보존 대상, 즉 세포, 조직, 또는 장기 등과 접촉시키는 것을 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포, 조직, 또는 장기 등을 본 발명의 보존액 조성물에 침지함으로써, 보존액과 보존 대상을 접촉시켜 세포, 조직, 또는 장기 등을 보존하는 방법이다. 보존 대상에 대한 보존액의 양은 특별히 제한되지는 않으나, 보존 대상이 완전히 침지하는 양 이상의 양이 바람직할 수 있다.
보존 용기는 특별히 제한되지 않고, 밀봉 용기 및 해방 용기의 어느 것도 사용가능하다. 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 호기 조건(산소, 이산화탄소, 질소 등의 기체가 자유롭게 통기 가능한 조건)을 유지할 수 있는 용기일 수 있다.
상기 보관은 냉장 상태에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 냉장 상태는 약 -4℃ 내지 약 25℃, 약 -4℃ 내지 약 20℃, 약 -4℃ 내지 약 15℃, 약 -4℃ 내지 약 10℃, 약 -2℃ 내지 약 10℃, 약 -2℃ 내지 약 8℃, 약 0℃ 내지 약 15℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 0℃ 내지 약 8℃, 약 0℃ 내지 약 6℃, 약 0℃ 내지 약 5℃, 약 0℃ 내지 약 4℃, 약 0℃ 내지 약 3℃, 또는 약 2℃ 내지 약 5℃일 수 있다.
한편, 본 발명의 보존액 조성물 중에 보존 대상을 침지하여 동결 보존하는 경우, 원하는 바에 따라 보존액 조성물에 공지의 동결 보호제(예컨대, DMSO, 글리세린 등)를 첨가할 수도 있다.
상기 보관은 목적에 따라 적절한 기간을 설정할 수 있다. 구체적으로, 보관은 이에 제한되지는 않으나, 약 10일 이하, 약 9일 이하, 약 8일 이하, 약 7일 이하, 약 0시간 내지 약 7일, 약 0시간 내지 약 6일, 약 0시간 내지 약 5일, 약 0시간 내지 약 4일, 약 0시간 내지 약 3일, 약 0 시간 내지 약 2일, 약 0 시간 내지 약 42 시간, 약 0 시간 내지 약 36 시간, 약 0 시간 내지 약 30 시간, 약 0 시간 내지 약 24 시간, 약 0 시간 내지 약 18 시간, 약 0 시간 내지 약 12 시간, 약 0 시간 내지 약 9 시간, 약 0 시간 내지 약 6 시간, 또는 약 0 시간 내지 약 3 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 방법은 세포로부터 미토콘드리아를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세포로부터 미토콘드리아를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 세포로부터 미토콘드리아를 분리하는 단계는 세포를 용해시키는 단계 및 용해물로부터 미토콘드리아를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리는 원심분리로 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 분리된 미토콘드리아 함유 용액의 적용에 따른 심장 기능 확인
실시예 1.1. 혈소판의 준비
약 40 mL 내지 약 50 mL의 농축된 인간 혈소판을 2,000xg로 약 30분 동안 원심분리하였다. 혈장(plasma)이 포함된 상층액을 제거하고, 생성된 혈소판 침전물(pellet)을 수득하였다. 수득한 혈소판 침전물은 혈장과 동일한 부피의 TTG 혼합 보존용액(0.195 M 트레할로오스, 20 mM Tris 및 65 mM 글리신: TTG)으로 재현탁하였다. 재현탁된 혈소판 침전물을 1 mL씩 분주하고, 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 1.2. 혈소판으로부터 미토콘드리아의 수득
냉동보관된 혈소판을 약 5분 동안 볼텍싱(vortexing)하여 해동 및 파쇄하고, 약 5분 동안 2,000xg로 원심분리하였다. 생성된 상층액을 12,000xg로 10분 동안 원심분리하여 침전된 미토콘드리아를 수득하였다.
실시예 1.3. 분리된 심장의 안정화
심장의 기능을 확인하기 위해, 우선 분리된 심장을 안정화시켰다.
구체적으로, SD(Sprague-Dawley) 래트(12주령, 수컷)를 케타민으로 마취한 후 희생시켰다. 래트의 심장을 적출하고, 분리된 심장은 대동맥-카테터를 통해 랑겐도르프(Langendorff)에 설치하였다. 분리된 심장을 크렙스-헨셀라이트(Krebs-Henseleit) 용액으로 약 20분간 관류시켜 심장을 세척하였다. 심장의 대동맥을 통해 냉장보관된 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트(Histidine-tryptophan-ketoglutarate: HTK) 용액을 주사하고 약 10분간 관류하여 심장을 안정화시켰다.
상기 HTK 용액은 198 mM 히스티딘, 2 mM 트립토판, 1 mM 케토글루타레이트, 30 mM 만니톨, 4 mM MgCl2, 15 μM CaCl2, 15 mM NaCl 및 9 mM KCl을 포함한다.
실시예 2. 미토콘드리아 함유 용액의 적용에 따른 적출된 심장에서의 관류액 유지 확인
실시예 1.2.에서 준비된 미토콘드리아를 HTK 용액에 첨가하여 5 μg/mL의 미토콘드리아를 포함하는 미토콘드리아-HTK 용액을 준비하였다.
실시예 1.3.에서 준비된 안정화된 심장에 5 μg/mL의 미토콘드리아를 포함하는 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액을 약 2분 동안 주입하였다. 이후, 심장을 각각 150 μg/30 mL의 미토콘드리아-HTK 용액과 30 mL의 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 담그고, 약 4℃에서 보관하였다. 각 10시간, 12시간 및 29시간 경과 후, 보관된 심장을 대동맥-카테터를 통해 랑겐도르프에 설치하고, 크렙스-헨셀라이트 용액을 흘려주었다. 심장을 통해 흘러나오는 관류액의 양을 측정하였다. 이때, 관류액의 양 변화는 심장 박동 의존적인 것으로 심장 박동과 관련된다. 이에 따라, 시간 경과에 따른 정규화된 관류액의 부피(mL)를 측정하여 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 9, 10, 12 및 29시간에서 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에서만 보관한 경우에 비해 미토콘드리아-HTK 용액에 보관한 경우에 심장의 관류액이 약 20% 증가하였다.
또한, 심장을 분리한 이후에 분리된 심장을 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 뒤 심장 박동의 지속 시간을 확인하였다.
심장 분리 후 9시간에서, 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 심장의 박동이 확연히 구분되었다. 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 심장은 9시간 경과 후 심장 박동이 매우 약하였으나, 미토콘드리아-HTK 용액에 보관한 심장은 9시간 경과 후에도 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 경우에 비해 더 빠르고 일정한 심장박동이 있었다.
따라서, 분리된 심장이 미토콘드리아를 함유한 용액의 존재 하에서 장기간 심장의 수축성을 유지함을 확인하였다.
실시예 3. 미토콘드리아 함유 용액의 적용에 따른 적출된 심장에서의 근섬유세포 유지 확인
실시예 2.에서 관류액을 측정한 심장으로부터 근섬유세포를 분리하였다. 분리된 세포의 상태를 현미경으로 관찰하였다. 분리된 심장을 미토콘드리아-HTK 용액 또는 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에 보관한 경우 보관 시간(9, 10, 12 및 29시간)에 따른 근섬유세포의 이미지를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아-HTK 용액에서 보관한 경우 심장의 심근세포가 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에서 보관한 세포에 비해 약 2 내지 약 3배 많이 분리되었다.
따라서, 미토콘드리아를 함유한 용액의 존재 하에서 심장을 보관할 경우에 미토콘트리아가 없는 경우에 비해 심장의 심근세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 분리된 미토콘드리아 함유 용액에 보관된 심장, 간 및 신장의 기능 확인
실시예 4.1. 분리된 심장, 간 및 신장의 기능 확인을 위한 준비
C57BL6 마우스(7주령, 수컷)를 케타민으로 마취한 후, 심장, 간 및 신장을 적출하였다. 적출된 심장, 간 및 신장을 PBS로 혈액 및 이물이 제거되도록 수차례 세척하였다. 세척이 완료된 장기는 냉장보관한 미토콘드리아-불포함 HTK 용액과 미토콘드리아-HTK 용액에 각각 담근 뒤 냉장보관하였다.
실시예 4.2. 미토콘드리아-함유 용액의 적용에 따른 적출된 심장, 간 및 신장의 색도 변화 확인
실시예 4.1.에서 보관된 심장, 간 및 신장을 PBS로 수차례 세척한 뒤 사진 촬영하여 색도를 비교하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 심장은 미토콘드리아-HTK 용액에서 보관된 경우 선홍색이 유지되었고, 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에서 보관된 경우 붉은색이 사라졌다. 간 및 신장에서도 유사한 결과를 보였다.
실시예 4.3. 미토콘드리아-함유 용액의 적용에 따른 적출된 신장에서의 효소 활성 유지 확인
실시예 4.1.에서 보관된 신장을 60시간 및 160시간 후에 각각 전체 신장을 균질화한 뒤, 신장에서 발현이 높은 ACE2(Angiotensin II Converting Enzyme)의 활성을 ACE2 Activity Assay Kit(Catalog # K897-100, Biovision)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 측정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, ACE2의 활성은 미토콘드리아-불포함 HTK 용액과 미토콘드리아-HTK 용액에서 시간이 증가함에 따라 활성이 높아졌다. 특히, 미토콘드리아-HTK 용액에서 신장을 보관한 경우에 미토콘드리아-불포함 HTK 용액에서만 보관한 경우보다 ACE2의 활성이 천천히 증가됨, 즉, ACE2 활성의 증가가 지연됨을 확인하였다.
즉, 장기 분리 이후 지속적인 에너지 감소 및 스트레스의 증가로 인해 ACE2의 발현 및 활성이 증가하게 되는데, 이러한 결과를 통해 증가된 ACE2의 활성이 미토콘드리아를 처리함에 따라 장기 내 스트레스 감소 및 에너지를 제공함으로써 ACE2의 활성이 감소됨을 알 수 있었다.
실시예 5. 적출된 심장에서 미토콘드리아-함유 용액의 적용에 따른 효과 확인
실시예 5.1. 적출한 심장으로부터 심근세포 분리
적출한 심장의 좌심실 조각에 콜라게나아제(Collagenase, Worthington Biochemical Co. Cat. No. LS004194) 및 프로테아제(Protease, Sigma Aldrich, Cat. No. p4630)를 5분간 처리한 후, 2,000g로 원심분리하여 심근세포(Cardiomyocyte)를 수득하였다.
실시예 5.2. 분리된 미토콘드리아의 염색
혈소판으로부터 분리한 미토콘드리아를 미토콘드리아 특이적 염색 시약인 MitoTrackerTM(ThermoFisher, Cat. No. M7512)로 10분간 염색하였다. 이후, 12,000g로 원심분리하여 상층액을 제거하고, 미토콘드리아 분리 용액으로 재현탁하였다.
실시예 5.3. 미토콘드리아-함유 용액의 적용에 따른 심근세포 생존율 증가 확인
실시예 5.1.에서 분리한 심근세포를 미토콘드리아-불포함 HTK 용액과 실시예 5.2.에서 준비한 염색된 미토콘드리아-HTK 용액에서 9시간 동안 보관한 후, 공초점 현미경을 이용하여 미토콘드리아의 이동을 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 심근세포 내로 용액 내의 미토콘드리아가 이동한 것을 확인하였다.
또한, 심근세포 내로 이동한 미토콘드리아에 의한 생존율의 증가는 WST-1(water-soluble tetrazolium salt)과 세포내 ATP 측정 결과에서 확인되었다(도 6 및 도 7).
실시예 5.4. 미토콘드리아-함유 용액의 적용에 따른 심장 조직내 미토콘드리아 이동 확인
적출한 심장을 미토콘드리아-불포함 HTK 용액과 실시예 5.2.에서 준비한 염색된 미토콘드리아-HTK 용액에 보관하고 9시간 후 고정하여 절편화하였다. 이후, 공초점 현미경을 이용하여 조직내로 이동한 미토콘드리아를 확인하였다(도 8).
실시예 5.5. 미토콘드리아-함유 용액의 적용에 따른 심장 조직내 미토콘드리아 효소의 활성 증가 확인
보관 중인 적출된 심장 조직으로부터 미토콘리아를 분리한 뒤, ATP 합성 효소 및 시트레이트(citrate) 합성 효소의 활성을 각각 측정하였다. 그 결과, 도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아-HTK 용액을 적용한 경우에 ATP 합성 효소 및 시트레이트 합성 효소 모두 현저하게 더 높은 활성을 나타내었다.
실시예 6. 미토콘드리아의 농도에 따른 신장에서의 효소 활성 유지 확인
보관 시간 192시간 및 미토콘드리아-HTK 용액의 농도 의존적 처리(0, 5, 10, 15 및 20 μg/ml)를 제외하고, 실시예 4.1.과 동일한 방법으로 신장을 준비하고 ACE2 활성을 측정하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, ACE2의 활성은 미토콘드리아에 의해 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.
실시예 7. 미토콘드리아 유래 및 활성화 여부에 따른 미토콘드리아-함유 용액의 적용에 따른 효소 활성 유지 확인
보관 시간 192시간과 미토콘드리아 유래 및 활성화 차이를 지닌 미토콘드리아-HTK 용액의 처리를 제외하고, 실시예 4.1.과 동일한 방법으로 신장을 준비하고 ACE2 활성을 측정하였다. 이때, 불활성화된 미토콘드리아는 소니케이션(sonication) 후 56℃에서 30분간 가열 처리한 것이다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 열불활성화된 각각의 미토콘드리아 적용 시에는 ACE2의 활성을 감소시키지 못하였으나, 제대혈 중간엽 줄기세포(UC-MSC), 혈소판, 말초혈액 단핵구세포(PBMC)에서 분리한 다양한 유래의 미토콘드리아에 의해서는 ACE2의 활성이 감소함을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 분리된 미토콘드리아를 포함하는, 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 보존액 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미토콘드리아는 혈소판, 근육세포, 간세포, 섬유아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 줄기세포, 또는 점막세포로부터 수득된 것인, 보존액 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 히스티딘, 트립토판 및 케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함한 것인, 보존액 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 히스티딘, 트립토판 및 케토글루타레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상과 분리된 미토콘드리아의 혼합물을 포함하는 것인, 보존액 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물 중 분리된 미토콘드리아의 농도는 0.01 μg/mL 내지 1 mg/mL인 것인, 보존액 조성물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 조성물 중 히스티딘의 농도는 1 mM 내지 500 mM인 것인, 보존액 조성물.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 조성물 중 트립토판의 농도는 1 μM 내지 100 mM인 것인, 보존액 조성물.
  8. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 조성물 중 케토글루타레이트의 농도는 1 μM 내지 100 mM인 것인, 보존액 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 세포, 조직, 또는 장기는 포유동물 유래의 세포, 조직, 또는 장기인 것인, 보존액 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간인 것인, 보존액 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 세포, 조직, 또는 장기는 생체 이식을 위한 것인, 보존액 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 장기는 심장, 간, 신장, 소장, 위, 췌장, 폐, 담낭, 신경, 피부, 혈관, 치아, 안구 및 각막으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 보존액 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 관류(perfusion) 또는 재관류(re-perfusion)를 위한 것인, 보존액 조성물.
  14. 분리된 세포, 조직, 또는 장기를 분리된 미토콘드리아를 포함하는 보존액 조성물의 존재 하에서 보관하는 단계를 포함하는, 분리된 세포, 조직, 또는 장기의 보존 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 보관은 냉장 상태에서 수행되는 것인, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 보관은 10일 이하 동안 수행되는 것인, 방법.
KR1020220090762A 2021-07-23 2022-07-22 분리된 미토콘드리아를 포함하는 세포, 조직, 또는 장기의 보존을 위한 조성물 및 이의 용도 KR20230015859A (ko)

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