KR20200118422A - 동결보존용 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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에버그린 바이오사이언시즈
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Abstract

본 명세서에는 포유류 세포, 조직 및 장기의 동결보존용 조성물이 제공된다. 조성물은 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함한다. 본 명세서에는 또한 복수의 세포의 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키기 위한, 조성물의 사용 방법이 제공되되, 여기서 세포는 조성물과 접촉된다.

Description

동결보존용 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 31일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/612,552호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
관련 기술 분야
포유류 세포, 조직 및 장기의 동결보존(cryopreservation)을 위한 조성물 및 이의 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
과도한 세포사는 간 기증자로부터 얻어진 세포, 조직 및 장기, 또는 배양액에서 성장된 세포의 임상적 사용에 대한 주된 장벽이다. 이 문제는, 세포가 장기간 저장 동안 안정하게 되는 것을 필요로 하는 세포를 입수하는 시간과 세포를 사용하는 시간 사이의 장기간에 걸친 시간 기간이 있을 때 특히 극심하다. 일반적으로, 기증자 세포, 조직 또는 장기 손상 세포 그 자체 속의 그리고 그 내에서의 단리 과정은, 그 자체로 세포외 단백질의 효소적 또는 기계적 제거, 효소적 소화, 혈관 간의 세포 이송, 용액 중 재현탁 및 여과 단계를 수반한다. 세포는 또한 성장실 내로의 파종 동안 상당한 손상을 겪을 수 있으며, 그 과정은 트리튜레이션(trituration)이라 지칭된다. 일상적인 시험관내 세포 조작은 마찬가지로 세포 손상의 주된 원천이다. 배양액 내 세포들은, 우선 이들의 환경으로부터 제거될 세포를 필요로 하는 실험적 처리를 도입하는 절차적 조작, 예컨대, DNA 도입, 및 하류의 일상적인 측정을 위하여, 매트릭스로부터 일상적으로 분리되고, 이들은 성장하여 세포 수의 추가의 증폭 및 후속의 성장을 가능하게 한다. 이들 절차는 흔히 많은 세포의 외부막의 일체성을 파괴시켜, 천공 및 파열을 일으킨다. 세포에의 이러한 물리적 손상은 대사물질이 이들의 세포질로부터 그리고 주변 세포외 공간에 누설되게 한다. 생리학적 수준 상에, 원형질 막 온전성에의 손상은 세포 내 과도한 칼슘 방출, 감소된 ATP 농도, 감소된 NAD 농도, 및 괴사 및 네크롭토시스(necroptosis)를 초래하는 경로의 활성화를 유발한다.
또한, 단리된 세포, 조직 및 장기는 산소화 부족, 유리 라디칼 발생 및 허혈의 상당한 위험에서 제거된 조직 및 장기 내에 세포를 남겨두는 순환의 중단으로 인해 생리학적 손상을 겪는다. 이들 손상은 신속하게 조직의 세포 내에서 괴사 및 네크롭토시스를 유발하여, 특히 동물 또는 인간 조직으로부터 유래된 1차 세포에 대해서 과잉 세포사를 초래하여, 궁극적으로 후속의 임상적 사용을 위한 불충분한 물질을 남긴다. 또한 이들 괴사성 세포가 이웃하는 세포 상에 그들의 내용물을 유출시키고 이들로 하여금 외부로부터의 사멸을 신호전달하게 하는 것이 오랜 동안 인식되어 왔다. 손상-연관 분자 패턴(damage-associated molecular pattern: DAMP)로서 특성화되는 이들 세포 성분의 유출은, 면역원성 반응을 활성화시킴으로써, 이들 분자 자체가 패턴-인식 수용체를 활성화시킬 수 있고 이웃하는 세포가 감지된 염증의 반응으로서 네크롭토시스를 활성화시키게 한다. 또한, 살아있는 세포는 더 적은 능력을 가진 수임(committed) 또는 분화(differentiated) 세포를 더 큰 분화능을 가진 것으로 역전시키는 과정인 탈분화를 겪을 수 있다.
생리학적 손상은 스트레스 시간 동안 세포 대사를 늦추거나 중단시키는 것을 통해서 부분적으로 방지될 수 있다. 하나의 접근법은 단리와 후속 사용 간의 기간 동안 저체온증 온도에서 이식용 장기뿐만 아니라 세포 및 조직을 유지하는 것이다. 세포 배양액 및 개별적인 세포의 경우에 이용 가능한 세포 대사 및 임의의 결과적인 산화 손상을 중단시키는 다른 옵션은 빙점하 온도에서 세포를 보존하는 것이며, 그 과정은 동결 보존이라 불린다. 그러나, 동결보존 자체 및 동결보존과 연관된 냉동-해동 사이클(freeze-thaw cycle)은, 세포의 인접지에서 그리고 때로 세포 내에서 얼음 결정 형성을 통해서 세포에 손상을 일으켜, 재차 (소위 냉동-해결 손상시키기 위하여) 외부 원형질 막의 그리고 내부 세포소기관의 천공 및 파열을 일으킨다. 단리와 동결보존-연관 세포 손상의 조합은 또한 하나의 분화 상태로부터 다른 세포 유형으로의 세포의 전환분화, 또는 세포의 탈분화를 초래할 수 있으므로, 임의의 단리된 세포의 후속 사용을 더욱 복잡하게 할 수 있다.
현재의 방법은 이들 손상으로 인한 세포 손상 및 사멸을 일으키는 것을 해소하지 못하고 세포 및 과잉 손상을 가진 조직 및 장기를 남긴다. 또한, 괴사를 일으키는 것을 멈추기 위한 해법은 구현되지 않았다. 마찬가지로, 몇 가지 진보는, 만약 있다면, 동결보존 수법의 개선을 초래하였고, 분자 경로가 냉동-해동 공정 시 정확히 세포사를 초래하는 것은 이해되지 않는다.
따라서, 단리 과정을 겪는 세포의 괴사, 네크롭토시스 및 물리적 및 생리학적 손상에 기인하는 탈분화를 회피하는 조직, 세포 및 장기를 단리 및/또는 저장하는 방법에 대한 필요성이 계속 진행 중에 있다. 최종적으로, 조직으로부터의 유리 동안, 시험관내에서 세포 조작 과정에서 일어나는 물리적 및 생리학적 손상 세포로부터 유래된 세포 가소성(cellular plasticity), 네크롭토시스 또는 괴사 저감에 대한 필요성이 진행되고 있다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 이의 방법은 이들 필요성을 해소하고, 여기서 조성물의 사용은 동결보존 동안 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 저감시킬 수 있고, 그리고 복수의 세포 내 세포 가소성의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시킬 수 있다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에는 네크롭토시스 저해제(necroptosis inhibitor) 및 Bax 통로 저해제(Bax channel inhibitor)를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 다른 양상에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 화합물, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온 화합물, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드 화합물, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드 화합물, 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸)페닐)유레아 화합물, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온 화합물, 또는 상기 네크롭토시스 저해제 화합물의 유사체, 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 관련된 양상에 있어서, 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 이의 상기 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.2nM 내지 2μM이다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.5nM 내지 50μM이다.
다른 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 초산화물 불균등화효소(superoxide dismutase), 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함한다. 관련된 양상에 있어서, 초산화물 불균등화효소는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소를 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 NAD의 농도는 약 5nM 내지 500μM이다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 ATP의 농도는 약 10nM 내지 1mM이다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 사이클로스포린 A의 농도는 약 1nM 내지 1mM이다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소의 농도는 약 0.001 내지 100 쿠니츠 단위(Kunitz Unit: KU)이다.
다른 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 약 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 약 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 약 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 약 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 약 0.01μM의 사이클로스포린 A, 및 약 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소를 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 조성물은 동결보호제를 더 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 동결보호제는 DMSO, 또는 혈청, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 기재된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에는 동결보존방법이 개시되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함하되, 네크롭토시스 저해제는 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
일 양상에 있어서, 본 명세서에는 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 네크롭토시스 저해제는 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 네크롭토시스 또는 괴사는 노화 또는 질환과 연관된다. 다른 관련된 양상에 있어서, 질환은 심근경색증, 베타-세포 네크롭토시스에 부차적인 당뇨병, 담즙정체성 간 질환, 뇌졸중, 장기 허혈, 허혈-재관류 손상, 간 질환, 암 화학요법 또는 방사선 요법으로부터의 괴사, 외상성 뇌손상, 괴사성 췌장염, 병원체-유도 네크롭토시스, 염증, 또는 신경퇴행성 질환이다.
관련된 양상에 있어서, 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법은 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 시험관내 또는 생체내에서 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 것을 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 복수의 세포는 조직 배양 세포, 1차 세포, 달걀 세포, 조직, 또는 장기 또는 이의 일부, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 조직 배양 세포 또는 1차 세포는 줄기세포, 성체 세포, 전환분화 세포, 탈분화 세포, 또는 분화 세포, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 복수의 세포는 인간 세포 또는 동물 세포를 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 접촉은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수행된다. 다른 관련된 양상에 있어서, 생체내 또는 생체외에서 접촉하는 것은 동물 또는 이의 일부, 장기 또는 이의 일부, 또는 조직의 관류를 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 관류는 심장 관류이다. 다른 관련된 양상에 있어서, 시험관내에서 접촉하는 것은 상기 조성물에 상기 복수의 세포를 침지시키는 것, 상기 복수의 세포의 성장 배지를 상기 조성물로 보충하는 것, 상기 복수의 세포를 비-열 가역성 전기천공을 통해서 상기 조성물로 관류시키는 것, 또는 상기 복수의 세포를 생물반응기에서 상기 조성물로 관류시키는 것을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 상기 복수의 세포의 물리적, 화학적, 또는 열역학적 조작 단계를 더 포함한다. 관련된 양상에 있어서, 열역학적 조작은 상기 복수의 세포를 가열 또는 냉각시키는 것을 포함한다. 관련된 양상에 있어서, 냉각시키는 것은 동결보존 또는 냉동-해동 사이클, 또는 이들의 조합을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 미접촉 복수의 세포와 비교하여, 상기 복수의 세포의 괴사 또는 괴저성 사멸(necroptic death)을 상기 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 예방, 저해 또는 저감시킨다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 상기 복수의 세포를 상기 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 물리적 손상으로부터 보호한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 복수의 세포의 성장 가능성을 미접촉 세포와 비교해서 동결보존 동안 증대시킨다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 복수의 세포에 대한 산화 손상을 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 예방한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 허혈을 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 예방한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 방법은 괴사 경로 신호전달을 저해한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 분화 상태의 변화를 예방, 저해 또는 저감시킴으로써, 미접촉 세포와 비교해서 상기 세포의 동일성(identity)을 안정화시킨다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 대사 중지(metabolic suspension) 상태를 유도한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 대사성 현탁은 산소 대사의 가역적 중단을 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 상기 방법은 미접촉 복수의 세포와 비교해서 상기 세포의 생존율(viability) 또는 잠재적 생존율을 개선시킨다.
다른 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드, 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸)페닐)유레아, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온, 또는 상기 네크롭토시스 저해제 화합물 중 어느 하나의 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에서, 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 상기 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.2nM 내지 2μM이고, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.5nM 내지 50μM이다.
다른 관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에서, 조성물은, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간-초산화물 불균등화효소, 또는 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에서, 상기 NAD의 농도는 약 5nM 내지 500μM이고, 상기 ATP의 농도는 약 10nM 내지 1mM이고, 상기 사이클로스포린 A의 농도는 약 1nM 내지 1mM이고, 상기 망간-초산화물 불균등화효소 또는 상기 아연-초산화물의 농도는 약 0.001KU 내지 100.0KU이다.
다른 관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에서, 네크롭토시스 저해제 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 20nM이고, Bax 통로 저해제 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 5nM이고, 상기 NAD의 농도는 약 0.05nM이고, 상기 ATP의 농도는 약 0.01μM이고, 상기 사이클로스포린 A의 농도는 약 0.01μM이고, 상기 망간-초산화물 불균등화효소 또는 아연-초산화물의 농도는 약 0.1KU이다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에서, 조성물은 동결보호제를 더 포함한다. 다른 관련된 양상에 있어서, 동결보호제는 DMSO, 또는 혈청, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
관련된 양상에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 소정의 실시형태를 추가로 입증하기 위하여 포함되며, 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에서 제시된 구체적인 실시형태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상의 참조에 의해 더욱 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c. 조직 절개 및 세포 조작은 여러 세포 유형에서 반응성 산소종(reactive oxygen species: ROS)(Nox1의 검출), 세포자멸사(apoptosis)(CASP3의 검출), 괴사(PI 및/또는 아넥신 V(Annexin V)에 의한 염색 검출)를 일으킨다. 도 1a는 마우스 피질 뉴런 조직 절개 및 세포 조작이 ROS(Nox1의 검출)를 생성하였음을 도시한다. 무 절개가 약간의 ROS를 일으켰지만(모의), 새롭게 절개된 조직(프레시(fresh))은 ROS 발생의 수-배 증가를 일으켰고, 한편 동결보존용액(용액(Soln))의 내포는 ROS 수준을 감소시켰다. 도 1b는 비조작 조직(모의)에 비해서 절개(프레시) 후에 증대되었지만, 이것은 ROS 발생(도 1a) 또는 괴사(도 1c)보다 더 적은 정도인 한편, 동결보존용액(+용액)의 내포는 이것을 도로 기준선 수준으로 감소시킨 것을 도시한다. 도 1c는, 괴사가 조직 조작이 없는 것(모의)에 비해서 조직 절개 및 세포 조작(프레시) 후에 증대되었고, 그 효과가 동결보존용액(+용액)의 내포에 의해 거의 완전하게 제거된 것을 도시한다. (도 1a 내지 도 1c에 대해서 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 2a 내지 도 2c. 세포 냉동/해동이 시간 경과에 따라서 많은 세포 유형에 있어서 ROS, 세포자멸사 및 괴사 마커의 유의한 증가를 발생하였다. 도 2a는 뉴런의 냉동/해동이 냉동 전 조직(모의)에 비해서 ROS(Nox1의 검출)(냉동(freeze))를 생성시켰고, 그 효과가 동결보존용액의 내포(+용액)에 의해 거의 완전히 없어진 것을 도시한다. 도 2b는 세포자멸사가 냉동 전 조직(모의)에 비해서 냉동/해동(냉동) 후에 약간 증대되었고, 냉동 과정 동안 동결보존용액의 내포(+용액)에 의해 감소된 것을 도시한다. 도 2c는, 괴사가 냉동 전 조직(모의)에 비해서 세포 냉동/해동(냉동) 후 크게 증대되었고, 그 효과가 동결보존용액의 내포(+용액)에 의해 거의 제거된 것을 도시한다. (도 2a 내지 도 2c에 대해서 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.) CypD - 사이클로필린 D(Cyclophilin D)
도 3. 세포 냉동/해동 사이클은 줄기세포로 하여금 운동 뉴런에서 CHAT1의 수준에 의해 측정된 바 이들의 동일성을 손실시키게 한다. 세포를 냉동시키는데 사용된 용액 내 동결보호제는, CHAT1의 수준에 의해 측정된 바 운동 뉴런 동일성을 유지하였다. 도 3은, CHAT1(프레시)을 발현하고, 이어서 0.01μM의 cyspA(사이클로스포린 A), 또는 20nM의 Nec1, 또는 5nM의 iMAC2를 포함하는 용액에서 냉동시킨 줄기세포(운동 뉴런 전구체)는 이들 화합물의 부재하에 냉동된 줄기세포에 비해서 CHAT1을 유지시켜, 동결 후 (동결된) CHAT1+ 세포의 매우 낮은 수준을 나타낸 것을 도시한다. 여기에 도시된 바와 같이, cyspA, Nec1 및 IMAC2의 각각은 냉동 시 줄기세포에 동결보호를 제공하여, 세포 특성을 유지시켰다.
도 4a 내지 도 4b. 프레시 대 냉동된 세포 생존율은 동결보존용액의 일 실시형태에 있어서 절개된 세포(해마 뉴런)의 유지에 의해 분석되었다. 도 4a는 본 명세서에 개시된 동결보존용액이 그 자체로 새롭게 절개된 세포뿐만 아니라, 동결보존용액의 실시형태에서 냉동되고 나서 해동된 세포의 생존율 퍼센트를 증가시킬 수 있었던 것을 도시한다. (용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.) 주로 도 4a 그리고 도면들을 통해서: 프레시는 새롭게 절개된 세포를 나타내고; 프레시+용액은 조성물 용액 중 새롭게 절개된 세포를 나타내며; 냉동은 냉동/해동 세포를 나타내고; 냉동+용액은 조성물 용액 중 냉동/해동 세포를 나타낸다. 도 4b는 세포(해마 뉴런)의 대사 중지가 세포 생존율을 증대시킨 것을 도시하며, 여기서 상이한 성분의 동결보존용액에 의해 제공된 생존율 퍼센트가 도시되어 있다. 뉴런에 대한 세포 생존율은 시험관내에서 7일 후의 측정치이다. 비히클은 동결보존용액 첨가가 없는 한편, 네크로스타틴1(Nec1), 사이클로스포린 A(CspA), iMAC2(iMAC2), 또는 이들 3가지 시약의 조합물(조합)은 냉동/해동 과정 전에 세포에 도입되었다. 일 실시형태(조합 + 관류)에 있어서, 새끼를 어미로부터 분리시키기 바로 수 분 전에 살아있는 임신한 마우스에 3-시약 동결보존용액을 관류시키고, 이어서 해마 뉴런을 E18(배아 일 18) 새끼로부터 단리시켰다. 상이한 성분의 농도는 도 4a에서 사용된 농도의 것들이다.
도 5. 본 명세서에서 사용되는 냉동 과정은 세포를 손상시키는 과냉각 효과를 회피한다. 도 5는 전통적인 배지에 대해서 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™으로도 공지됨)에서 냉각 동안 시간 경과에 따른 온도의 변화의 비교를 도시한다. 전통적인 배지에서 일어나는 온도에서의 조기 하향 스파이크의 현저한 부재를 알 수 있다.
도 6a 내지 도 6d. 생존율 및 성장률: 프레시 대 냉동된 세포 생존율 시간 과정: 뉴런 및 지방(지방 조직) 줄기세포. 도 6a는 새롭게 절개된 세포가 본 명세서에 개시된 동결보존용액(프레시+용액)에 현탁되거나, 또는 본 명세서에 개시된 동결보존용액(냉동+용액)의 실시형태에서 절개되고 이어서 냉동된 경우 피질 뉴런 세포 생존율이 유지된 것을 도시한다. 도 6b는 이러한 냉동 조건 및 비냉동 조건이 적용되는 세포를 평판 배양한 후 시간(일자) 경과에 따른 뉴런 생존율 퍼센트의 시간 과정을 도시한다. 동결보존용액의 내포는 냉동 전 10% DMSO에 노출된 동일 세포(냉동) 또는 동결보호제의 어떠한 냉동도 없이 새롭게 절개된 세포(프레시)와 비교되었다. 도 6c는, 새롭게 절개된 세포가 본 명세서에 개시된 동결보존용액(프레시+용액)에 현탁되거나 또는 본 명세서에 개시된 동결보존용액(냉동+용액)의 실시형태에서 절개되고 이어서 냉동된 경우 지방(지방 조직-유래) 줄기세포 생존율이 유지된 것을 도시한다. 도 6d는 이러한 냉동 조건 및 비냉동 조건이 적용되는 세포를 평판 배양한 후 시간(일자) 경과에 따른 지방 줄기세포 생존율 퍼센트의 시간 과정을 도시한다. 동결보존용액의 내포는 냉동 전 10% DMSO에 노출된 동일 세포(냉동) 또는 동결보호제의 어떠한 냉동도 없이 새롭게 절개된 세포(프레시)와 비교되었다. (도 6a 내지 도 6d에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 7a 내지 도 7b. 동결보존용액을 이용한 절개 및 냉동/해동 후의 1차 간 간세포의 세포자멸사. 도 7a는, 본 명세서에 개시된 용액의 부재 중에 현탁된 세포(모의)와 비교된, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 신선한 세포 및 냉동된 세포로부터의 조기 세포사멸 세포(1차 간 간세포)에 대한 동결보호제의 효과의 비교를 도시한다. 동결보존용액(모의)으로 처리되지 않은 냉동된 세포에 대해서, 이러한 세포를 냉동 전에 10% DMSO에 현탁시켰다. 카스파제3(녹색)은 배양액 중 조기 세포사멸 상태에서 세포를 표지화시킨다. 도 7b는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 또는 이러한 용액의 부재하에 현탁된(모의) 신선한 또는 동결 해동된 세포에서의 (아넥신 V 표지화에 의해 정의된 바와 같은) 세포사멸 세포의 수를 도시한다. 동결보존용액의 첨가는 세포사멸 세포의 수를 저감시켰다. (도 7a 내지 도 7b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 8a 내지 도 8b. 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 피질 뉴런 세포의 절개 및 냉동/해동 후의 괴사. 도 8a는, 본 명세서에 개시된 용액의 부재 중에 현탁된 세포와 비교된, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 신선한 세포 및 냉동된 세포의 용액으로부터의 괴사성 세포의 존재의 비교를 도시한다. 항-사이클로필린 항체는 배양액 중 조기 세포사멸 상태에서 세포를 표지화시킨다. 도 8b는 동결보존용액의 실시형태에서 또는 이러한 용액의 부재하에 수행된 절개 후의 괴사성 세포의 퍼센트를 도시한다. (도 8a 내지 도 8b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 9a 내지 도 9b. 피질 뉴런 조직 절개 및 냉동/해동 후의 반응성 산소종(ROS)(마커로서의 Nox1) 발생. 도 9a는 신선한(식염수 단독에서 절개되고 냉동되지 않은) 뉴런, 동결보존용액에서 절개된 신선한 뉴런(프레시+용액), 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 한편 냉동되고 이어서 해동된 뉴런(냉동+용액) 또는 통상의 동결보호제(10% DMSO, 다이메틸 설폭사이드)의 존재에서 행한 뉴런(냉동)에서의 Nox1 염색을 도시한다. 신선한 또는 해동된 뉴런을 평판 배양하고, 부착시키고 나서 4시간 동안 고착 및 표지화를 행하였다. NADPH 옥시다제(Nox1)는 세포에서 ROS를 표지화시킨다. NeuN은 피질 뉴런(신경교세포 없음)을 염색시킨다. 도 9b는 새롭게 절개된 피질 뉴런 조직 단독(신선한, 청색 막대), 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태의 현탁액에서 절개된 신선한 피질 뉴런 조직(프레시+용액, 적색 막대), 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에서 현탁된 냉동되고 이어서 해동된 세포(냉동+용액, 황색 막대), 또는 10% DMSO의 존재하에 냉동되고 이어서 해동된 세포(녹색 막대)에서의 ROS 발생(Nox1 강도)을 도시한다. (도 9a 내지 도 9b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 10a 내지 도 10b. 운동 뉴런 마커의 뉴런 계통은 조성물 용액에 비해서 통상의 동결보호제(10% DMSO)를 사용한 것보다 유의하게 보존된다. 도 10a는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 존재 또는 부재(10% DMSO 단독)에서 냉동 전 또는 후의 뉴런의 현미경사진을 나타낸다. 도 10b는 통상의 동결보존용액(10% DMSO), 및 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태("냉동 조성물 후")에서의 냉동 전후의 세포에서의 운동 뉴런 세포 동일성(CHAT1-양성, S100-양성 면역형광 신호의 존재에 의해 측정됨)를 도시한다. (도 10a 내지 도 10b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 11a 내지 도 11b. 1차 마우스 간 세포(간세포)는 1차 마우스 간 세포(간세포)는, 조성물 용액의 존재 하에 냉동/해동 후, 새롭게 절개된 조직에 비해서 행한 것과 유사한 생리학적 특성을 도시한다. 도 11a는, 갈락토사민-유도 전사의 일반적인 척도로서, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 존재 또는 부재(신선한, 냉동되지 않은)하에 인큐베이팅되고, 그리고 간략하게 항체-접합 유리딘(antibody-conjugated uridine)(적색 염색)에 대해서 고착 및 염색 전 갈락토사민 없이(-갈락토사민) 또는 갈락토사민으로 자극된, 신선한 간 세포 및 냉동된 간 세포(청색 염색)의 비교를 도시한다. 도 11b는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에서 현탁된 신선한 및 냉동된 세포의 간 세포 전사 활성도의 비교를 도시하며, 여기서 간 세포 활성도는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 존재에서 세포가 유지된 경우 냉동/해동 후 유사하다. 막대는 항체-접합 유리딘 염색(임의 단위)의 척도가 된다. (도 11a 내지 도 11b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 12. 네크로스타틴의 몇 가지 유사체는 냉동/해동 후에 이들의 동결방지 효과가 유사하게 작용하도록 연구되고 발견되었다. 도 12는 상이한 네크로스타틴을 포함하는 동결보존용액의 효과를 도시하며, 여기서 네크로스타틴(Nec1(적색 막대), Nec2(황색 막대), Nec3(녹색 막대)의 존재는 통상의 동결보호제(10% DMSO)로 동결보존된 대조 세포(비히클, 청색 막대)에 비해서 1차 마우스 피질 뉴런 세포의 생존율 퍼센트를 유의하게 증대시켰다. 상이한 네크로스타틴의 농도는 20nM이고, "용액"의 다른 성분은 동일, 즉, 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소인 채로 유지된다.
도 13a 내지 도 13b. 네크로스태틱(necrostatic) 경로는 조성물 용액에 의해 중단된다. 도 13a는 통상의 동결보존용액(10% DMSO)에서의 그리고 본 명세서에 개시된 동결보존용액("조성물 냉동")의 실시형태에서의 냉동 전후의 1차 마우스 간 세포(간세포)의 영상을 도시한다. 여기서 세포는 네크롭토시스용 마커로서 HMBG1(녹색)을 인식하는 항체로 염색되어 있다. 도 13b는, 괴사유발(necroptotic) 마커가, 10% DMSO("DMSO 냉동")에 비해서, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에서의 세포 현탁액에서 유의하게 저해된 것을 나타낸다. (본 명세서에서 사용된 동결보존용액은 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소였다.)
도 14. 네크롭토시스-유도 THP-1 세포 내 TNF-알파 생산은 동결보존용액인 EVERGREEN™ 배지 용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™으로도 공지됨)으로 유의하게 저감되었다. 전염증성 사이토카인을 생산하기 위하여 THP-1 세포를 배양하고 지질다당류(LPS)와 조합한 괴사 세포 용해물에 의해 유도한 후의 IL-6에 대한 ELISA 검정 결과. 모의 자극(1-3), LPS 자극 단독 (4-6), 동결보존 프로토콜에 사용된 10% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 하의 LPS 자극(7 내지 9), 동결보존 프로토콜에 사용된 100% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 하의 LPS 자극(10 내지 12) 후의 TNF-알파 수준(pg/㎖). (*) 모의(1 내지 3)와 LPS 단독(4 내지 6) 간, 그리고 LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 10% EVERGREEN™ 배지 용액(7 내지 9) 간의 유의차(p<0.01). (**) LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 100% EVERGREEN™ 배지 용액(10 내지 12) 간의 유의차(p<0.001).
도 15. 네크롭토시스-유도 THP-1 세포 내 IL-6 생산은 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™으로도 공지됨)으로 유의하게 저감되었다. 전염증성 사이토카인을 생산하기 위하여 THP-1 세포를 배양하고 지질다당류(LPS)와 조합한 괴사 세포 용해물에 의해 유도한 후의 ELISA 검정 결과. IL-6 수준(pg/㎖)은 (1 내지 3) 모의 자극, (4 내지 6) LPS 자극 단독, (7 내지 9) 동결보존 프로토콜에 사용된 10% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 하의 LPS 자극, (10 내지 12) 동결보존 프로토콜에 사용된 100% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 하의 LPS 자극 후에 측정되었다. (*) 모의(1 내지 3)와 LPS 단독(4 내지 6) 간, 그리고 LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 10% EVERGREEN™ 배지 용액(7 내지 9) 간의 유의차(p<0.01). (**) LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 100% EVERGREEN™ 배지 용액(10 내지 12) 간의 유의차(p<0.001).
도 16. 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™으로도 공지됨)은 사이토카인 방출 척도의 유의한 일관성을 산출하였다. 변산도 퍼센트(percent variability)는 각 (3회의) 실험(n=3)의 오차 퍼센트를 평균하고 각 군의 (자극된, 10% EVERGREEN™, 100% EVERGREEN™) 변산도 퍼센트를 모의(대조) 자극된 군 생존율에 대한 비로서 표현함으로써 계산되었다. 이것으로부터, EVERGREEN™ 배지 용액(10% 수준과 100% 수준 둘 다에서)을 사용하지 않고도 생존율의 대략 100% 증가가 있다.
도 17. 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™으로도 공지됨)은 DMSO에 비해서 냉동/해동 후에 유의하게 일관된 뉴런 생존율을 제공하였다. EVERGREEN™ 배지 용액은 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에 비해서 1차 마우스 해마 뉴런을 냉동시키는데 사용되었고, 해동 후의 생존율을 측정하고 플롯팅하였다. 5개의 독립적인 실험을 측정하였다.
도 18. 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™으로도 공지됨)은 냉동/해동 후 뉴런 세포 생존율의 유의한 일관성을 유도하였다. 변산도 퍼센트는 각 실험(n=5)의 중앙값을 평균하여 각 군의 개별적인 측정치를 이 평균치에 대한 개별적인 값의 비로서 표현함으로써 계산되었다. 이것으로부터, 편차 퍼센트를 계산하고 중앙값에 대한 비로서 표현하였다. 이것으로부터, EVERGREEN™ 배지 용액을 사용하지 않고도 생존율의 대략 300% 증가가 있다.
도 19A 내지 도 19H. 해마 뉴런은 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™으로도 공지됨)을 이용해서 냉동/해동하기 (새롭게 절개됨) 전 및 후에 구별하기 어려운 생리학적 특성을 도시한다. 17 내지 19 배아 일 뉴런의 패치 클램프는 자발적 뉴런 활성도와 유발된 뉴런 활성도 둘 다로부터의 전류 및 전압 프로파일을 도시한다. 도 19A는 (휴지 막 전위(resting membrane potential)에서의) 전체 세포 전류 클램프 기록을 나타내는 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도(network activity)를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 20 밀리볼트(㎷) 크기를 나타내고 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19B는 (휴지 막 전위에서의) 전체 세포 전류 클램프 기록을 나타내는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 후의 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 20 밀리볼트(㎷) 크기를 나타내고 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19C는 활동 전위 방전의 평균 빈도를 나타내는 전류 클램프 데이터에 대한 5분 기록 간격에 걸친 누적 빈도를 도시한다. 값은 적어도 4개의 독립적인 실험의 평균±SE(표준 오차)이고, 이는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전 또는 후에 통계학적 유의차(p>0.7, 스튜던트 t-검정)를 보이지 않는다. 도 19D는 (-60㎷에서) 전체 세포 전압 클램프 기록을 나타내는 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 200 피코암페어(pA) 크기를 나타내고, 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19E는 (-60㎷에서) 전체 세포 전압 클램프 기록을 나타내는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 후의 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 200 피코암페어(pA) 크기를 나타내고, 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19F는 활동 전위 방전의 평균 빈도를 나타내는 전압 클램프 데이터에 대한 5분 기록 간격에 걸친 누적 빈도를 도시한다. 값은 적어도 4개의 독립적인 실험의 평균±SE(표준 오차)이고, 이는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전 또는 후에 통계학적 유의차(p>0.8)를 보이지 않는다. 도 19G는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전(하부 선, 새롭게 절개된) 및 후(우측 선(trace)) 둘 다의 두 인접한 연결된 해마 뉴런으로부터의 휴지 전위에서의 전류 클램프 모드(하부 선) 및 시냅스후 흥분성 시냅스 반응(상부 선)(하부 시냅스전 뉴런으로부터의 액손의 말미에서 흑색 원으로서 좌측에 개략적으로 도시됨)을 나타내는 유발 시냅스전 활동 전위(evoked pre-synaptic action potential)를 도시한다. 여기서, 흥분성 시냅스후 전류(excitatory post synaptic current: EPSC)는 처리 간에 통계학적으로 차이가 없다(처리 전의 실제값 71+/-23pA 대 처리 후의 값 76+/-28pA). 대표적인 선(트레이스)은 n=19 내지 22개의 뉴런, 각 처리에 대해서 적어도 3개의 독립적인 실험(p>0.7, 스튜던트 t-검정)으로부터 유래된다. 수직 막대는 전류 클램핑된 뉴런에 대해서 20 피코암페어(pA)(시냅스전, 하부 선) 및 흥분성 시냅스 반응에 대해서 20 밀리볼트(㎷)(시냅스후, 상부 선)를 나타내고; 수평 막대는 20 밀리초(㎳)의 기록을 나타낸다. 도 19H는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전(폐쇄 원) 및 후(개방 원) 둘 다의 19개 해마 뉴런(G 부분에서 측정됨)에 대한 시냅스전 반응 대 시냅스후 반응(전/후)에 대한 유발 활동 전위 진폭비를 도시한다. 평균 비는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전후의 뉴런에 대해서 통계학적으로 차이가 없다(p>0.7, 스튜던트 t-검정)(냉동/해동 전에 대한 평균값 71+/- 23pA 대 냉동/해동 후에 대한 76+/-28pA). X값은 각 처리에 대한 뉴런 수에 대응한다.
이하의 상세한 설명에서, 많은 구체적인 상세가 본 명세서에 제시된 조성물 및 방법의 철저한 이해를 제공하기 위하여 제시된다. 다른 경우에, 잘 알려진 방법, 절차 및 성분들은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물 및 방법, 그리고 결과적인 괴사 및 네크롭토시스의 저해, 허혈 및 산화 손상의 억제, 세포 생존율의 개선, 세포의 성장 가능성의 증대 및 세포 동일성의 안정화를 이해하기 어렵게 하지 않도록 하기 위하여 상세히 설명되지 않았다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에는, 네크롭토시스 저해제 및 Bax 통로 저해제를 포함하는, 포유류 세포, 조직, 장기 및 이의 일부의 동결보존용 조성물이 개시되어 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 포유류 세포, 조직 및 장기의 동결보존방법이 개시되되, 해당 방법은, (a) 상기 세포, 조직, 또는 장기 또는 이의 일부를, 네크롭토시스 저해제 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 세포, 조직, 또는 장기 또는 이의 일부를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다. 추가의 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 세포 조작의 시험관내에서의 세포 조작 과정에서, 조직으로부터의 유리 동안, 그리고 동결보존 및 이의 냉동-해동 사이클 동안 초래되는 물리적 및 생리학적 손상 세포에 기인하는 세포 괴사를 억제, 예방 또는 회피하는 방법이 개시되어 있다.
조성물
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에는 네크롭토시스 저해제 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 당업자라면 네크롭토시스가 임의의 형태의 활성 괴사(살아있는 세포 또는 조직의 사멸)를 포괄할 수 있음을 이해할 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 괴사는 세포막 및 소기관 파괴, 세포 팽윤 및 미토콘드리아 손상을 포함하고, 세포 용해가 후속되고 염증 반응 수반한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 네크롭토시스는 특히 조직으로부터의 염증 신호 및 스트레스에 대한 반응을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 네크롭토시스는 조절 괴사를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 네크롭토시스는 괴사(세포사)의 활성 또는 프로그램된 형태를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스는 수용체-상호작용 단백질 키나제-1(receptor-interacting protein kinase-1: RIPK1)에 따른 괴사 세포사를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스는 수용체-상호작용 단백질 키나제-3(RIPK3)에 따른 괴사 세포사를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스는 괴사와 유사한 형태학적 특징을 초래하는 조절된 카스파제-독립적 세포사 기전의 저해제를 포함한다.　몇몇 실시형태에 있어서, TNF-수용체의 활성화는 RIPK1 활성화 및 네크로솜(necrosome)을 형성하는 RIPK3의 후속의 동원을 초래한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스는 비-세포사멸 세포사 경로를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 활성 괴사의 임의의 형태를 저해하는 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 괴사의 임의의 형태를 저해하는 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 네크롭토시스의 임의의 형태를 저해하는 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 수용체-상호작용 단백질 키나제-1(RIPK1)에 따른 괴사 세포사의 저해제를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 수용체-상호작용 단백질 키나제-3(RIPK3)에 따른 괴사 세포사의 저해제를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 괴사와 유사한 형태학적 특징을 초래하는 조절된 카스파제-독립적 세포사 기전의 저해제를 포함한다.
이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 수용체 상호작용 단백질 키나제(RIPK)의 활성도는 세포가 네크롭토시스를 겪는데 중요한 것으로 드러났다. 또한, RIP 키나제의 활성도는 또한 염증을 유도하고 또한 추가의 네크롭토시스를 촉진시킬 수 있는 세포로부터의 TNF 알파와 같은 염증 매개제의 방출을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 일 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 RIPK 저해제를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 RIP1 저해제를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 RIP3 저해제를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온(네크로스타틴-1s) 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s의 구조는 하기 화학식 1로 표시된다:
Figure pct00001
화학식 I.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온", "5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸이미다졸리딘-2,4-다이온", "7-Cl-O-MH-Trp", "네크로스타틴-1s", "Nec-1s", "Nec-1 안정한", "RIPK1 저해제 II", "수용체-상호작용 단백질 1 저해제 II", "괴사 저해제 IV", 및 "7N-1"은 모두 동일한 의미 및 자격을 가지고 호환 가능하게 사용될 수 있다.
당업자라면, 용어 "유사체"가 서로의 구조와 유사한 구조를 갖지만 작용기 또는 하위구조와 같은 소정의 성분에 관하여 이와 상이한 임의의 화합물을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 용어 "유사체"는 "유사체 화합물"과 호환 가능하게 사용된다.
당업자라면, 용어 "네크로스타틴-1s 유사체"가 네크로스타틴-1s의 구조와 유사한 구조를 갖지만, 하나의 원자 또는 원자의 군 또는 작용기 또는 하위구조를 다른 원자 또는 원자의 군 또는 작용기 또는 하위구조로 대체하는 것과 같이 소정의 성분에 관하여 달리하는 화합물을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다.
다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 당업계에 공지된 임의의 네크로스타틴-1s 유사체이다.
다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 (네크로스타틴-1s) 화합물 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드(Nec-5) 화합물 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 화합물(Nec-7) 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인 화합물(네크로스타틴-1; Nec-1), 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, Nec-1은 하기 화학식 II의 구조로 표시된다:
Figure pct00002
화학식 II.
다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온 화합물(Nec-3a), 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드 화합물(Nec-4), 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드 화합물(네크로설폰아마이드), 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸) 페닐)유레아 화합물 (RIP1 저해제 III), 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드(Nec-5) 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 화합물(Nec-7), 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인 화합물(Nec-1), 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온 화합물(Nec-3a), (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드 화합물(Nec-4), (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드 화합물(네크로설폰아마이드), 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸)페닐)유레아 화합물 (RIP1 저해제 III), 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온 (GSK'963), 또는 상기 네크롭토시스 저해제 화합물 중 어느 하나의 유사체, 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 5-(1H-인돌-3-일메틸)-3-메틸-2-티옥소-4-이미다졸리디논 (네크로스타틴-1) 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "5-(1H-인돌-3-일메틸)-3-메틸-2-티옥소-4-이미다졸리디논"은, 네크로스타틴-1, "5-(인돌-3-일메틸)-3-메틸-2-티오-히단토인", "메틸티오히단토인-DL-트립토판", 또는 "MTH-DL-트립토판", "MTH-Trp", "RIP1 저해제 I", "네크로솜 저해제 I", "수용체-상호작용 단백질 1 저해제 I", "괴사 저해제 II" 또는 "Nec-1"과 호환 가능하게 사용될 수 있고, 이들은 모두 동일한 양 및 의미를 갖는다.
당업자라면, 용어 "네크로스타틴-1 유사체"가 네크로스타틴-1의 구조와 유사한 구조를 갖지만, 하나의 원자 또는 원자의 군 또는 작용기 또는 하위구조를 다른 원자 또는 원자의 군 또는 작용기 또는 하위구조로 대체하는 것과 같이 소정의 성분에 관하여 달리하는 화합물을 포괄할 수 있음을 이해할 것이다. 다수의 네크로스타틴-1 유사체는 당업계에 기재되어 있고 본 명세서에 상정된다(예컨대, 미국 특허 제8,324,262호, 칼럼 1-31 및 51-52; 미국 특허 제8,658,689호, 칼럼 2-31; 미국 특허 제9,108,955호 칼럼 2-31; 및 제9,499,521호 칼럼 2-5, 12-20 및 49-57; 미국 특허 출원 공개 일련 번호: 2005/0119260, 단락 [0008]-[0103]; 2013/0158024, 단락 [0009]-[0166]; 2010/0190836, 단락 [0009]-[0168]; 2012/0122889, 단락 [0008]-[0266]; 및 2014/0024657, 단락 [0008]-[0423] 및 [447]; PCT 특허 출원 공개 일련 번호 WO 2014152182, 제2-4, 6-9, 11-14 페이지; 및 WO 2016094846, 제2-4, 13-19 및 39-50 페이지; 및 EPO 특허 출원 공개 일련 번호 EP 3017825 단락 [0009], [0021] 및 [0025] 참조, 이들은 모두 이들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨).
다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 당업계에 공지된 임의의 네크로스타틴-1 유사체 또는 네크로스타틴-1s 저해제이다.
다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제는 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온(Nec-1s), 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드(Nec-5) 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 화합물(Nec-7), 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인 화합물(Nec-1), 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온 화합물(Nec-3a), (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드 화합물(Nec-4), (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드 화합물(네크로설폰아마이드), 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸)페닐)유레아 화합물(RIP1 저해제 III), 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온 화합물(GSK'963), 또는 상기 네크롭토시스 저해제 중 어느 하나의 유사체, 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 미토콘드리아는 세포자멸사 및 조절 괴사 둘 다의 중심 조정자인 것으로 여겨진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조절 괴사 동안, 미토콘드리아는, 미토콘드리아가 팽윤되고, ATP를 생성하는 그들의 능력을 소실하고, 이어서 파열되는 "비적응"(maladaptive)이라 불리는 과정에서 기능장애로 된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 비적응 과정은 미토콘드리아 투과성 전이 기공(mitochondrial permeability transition pore: MPTP)의 개구에 의해 부분적으로 구동되며, 이 과정은 이어서 Bax 및 Bak 단백질-매개 신호전달을 활성화시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, Bax(Bcl-2-연관 X 단백질)는 사이토졸에서 주로 발견되는 단백질이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 괴사의 개시 시, Bax는 입체형태 변이를 겪고 미토콘드리아막과 연관되게 되며, 여기서 이는 미토콘드리아막 내에서 다량체성 기공을 형성한다.
다수의 Bax 통로 저해제는 당업계에 기재되어 있었고 본 명세서에서 상정된다(예컨대, PCT 특허 출원 공개 일련 번호 WO 2014110476, 제18 내지 40 페이지; 및 EPO 특허 출원 공개 일련 번호 EP 1094063, 제5 내지 14 페이지 참조, 이들은 모두 이들의 전문이 참조에 의해 편입된다). 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제는 당업계에 공지된 임의의 Bax 통로 저해제이다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제는 Bax 통로 저해제의 유사체, 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 네크롭토시스 저해제와, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 Bax 통로 저해제를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온, 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 화합물, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온 화합물, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드 화합물, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드 화합물, 또는 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸) 페닐)유레아 화합물, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된 네크롭토시스 저해제, 또는 상기 네크롭토시스 저해제 화합물의 유사체, 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 Bax 통로 저해제, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 조성물은, 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온, 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 화합물, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온 화합물, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드 화합물, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일) 아크릴아마이드 화합물, 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸)페닐)유레아 화합물, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온 화합물을 포함하는 군으로부터 선택된 네크롭토시스 저해제, 또는 상기 네크롭토시스 저해제 화합물의 유사체, 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물을 포함하는 Bax 통로 저해제, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
당업자라면 용어 "이성질체"가 광학 이성질체 및 유사체, 구조 이성질체 및 유사체, 입체형태 이성질체 및 유사체 등을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 광학 이성질체는, 거울상이성질체로도 알려져 있고, 일 실시형태에 있어서 중첩 가능하지 않은(동일하지 않은) 서로의 거울상인 2개의 입체 이성질체 중 하나를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 이성질체는 네크롭토시스 저해제 화합물의 광학 이성질체를 포함한다. 당업자라면 본 명세서에 개시된 네크롭토시스 저해제 화합물이 적어도 하나의 카이럴 중심을 함유할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에서 사용된 네크롭토시스 저해제 화합물은 광학 활성 및 라세미 형태로 존재할 수 있다. 몇몇 화합물은 또한 다형태를 나타낼 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물이, 본 명세서에서의 동결보존방법에 유용한 특성을 갖는 형태인, 임의의 라세미, 광학 활성, 다형태 또는 입체-이성질체 형태, 또는 이들의 혼합물을 포괄할 수 있는 것이 이해되어야 한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 네크롭토시스 저해제 화합물의 임의의 라세미, 광학 활성, 다형태 또는 입체-이성질체 형태, 또는 이들의 혼합물은 본 명세서에 개시된 세포 가소성의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법에 유용한 특성을 가질 수 있다.
당업자라면 용어 "거울상이성질체"가 서로 중첩될 수 없는 완전한 거울상인 2가지 입체이성질체 중 하나이고 카이럴성 중심을 갖는 화합물을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 거울상이성질체는 평면-편광광을 회전시키는 능력이 서로 다르고 CIP(Cahn-Ingold-Prelog)-규칙에 따라서 S- 또는 R-거울상이성질체로서 분류될 수 있다. S- 및 R- 입체형태는 카이럴 중심 탄소 원자에 대해서 4개의 치환체의 3-차원 배향을 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 순수한 (R)-이성질체이다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 순수한 (S)-이성질체이다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 (R) 이성질체와 (S) 이성질체의 혼합물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물은 동등량의 (R) 이성질체 및 (S) 이성질체를 포함하는 라세미 혼합물이다. 광학 활성 형태를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 재결정화 수법에 의한, 광학 활성 출발 물질로부터의 합성에 의한, 카이럴 합성에 의해 또는 카이럴 정지 상을 이용하는 크로마토그래피 분리에 의한 라세미 형태의 분할).
일 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제 화합물은 순수한 (R)-이성질체이다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제 화합물은 순수한 (S)-이성질체이다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제 화합물은 (R) 이성질체와 (S) 이성질체의 혼합물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제 화합물은 동등량의 (R) 이성질체 및 (S) 이성질체를 포함하는 라세미 혼합물이다. 광학 활성 형태를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 재결정화 수법에 의한, 광학 활성 출발 물질로부터의 합성에 의한, 카이럴 합성에 의해 또는 카이럴 정지 상을 이용하는 크로마토그래피 분리에 의한 라세미 형태의 분할).
당업자라면, 용어 "호변이성질체"가 분자의 하나의 원자의 양성자가 다른 원자로 이동함으로써 원래의 화합물의 구조 이성질체를 형성하는 현상에 의해 생성된 화합물을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 문헌[Jerry March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structures, Fourth Edition, John Wiley & Sons, pages 69-74 (1992)] 참조. 호변이성질체는 또한 평형 상태로 존재하고 하나의 이성질체 형태로부터 다른 이성질체 형태로 용이하게 전환되는 2가지 이상의 구조 이성질체 중의 하나를 지칭한다. 그 예는 케토-엔올 호변이성질체, 예컨대, 아세톤/프로펜-2-올 등, 고리-사슬 호변이성질체, 예컨대, 글루코스/2,3,4,5,6-펜타하이드록시-헥산알, 방향족 호변이성질체 등을 포함한다. 본 명세서에 기재된 화합물은 1종 이상의 호변이성질체를 가질 수 있고, 따라서 각종 이성질체를 포함할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 형태는 본 명세서에 개시된 조성물에 명확하게 포함된다.
당업자라면 용어 "유도체"가, 본 명세서에 개시된 공정에서 사용하기에 적합한 임의의 약제학적으로 허용 가능한 유도체 또는 비-약제학적으로 허용 가능한 유도체를 포함할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 당업자라면 비-약제학적으로 허용 가능한 유도체가 약제학적 용도에 적합한 화합물 및 유도체를 제조하는데 사용될 수 있는 것임을 이해할 것이다. 일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 사용되는 또는 제조되는 유도체는 약제학적으로 허용 가능한 유도체이다.
당업자라면 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"이, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 유익/유해비에 상응하는 염을 포함할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 적합한 염에 대한 검토를 위하여, 문헌[Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19]을 참조한다.
전형적으로, 약제학적으로 허용 가능한 염은 적절한 경우 목적하는 산 또는 염기를 사용해서 용이하게 제조될 수 있다. 염은 용액으로부터 석출되고, 여과에 의해 수집될 수 있거나, 또는 용매의 증발에 의해 회수될 수 있다. 염은 또한 본 명세서에 개시된 조성물의 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 동소에서 또는 별도로 유리 염기기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
염은 염기성 질소 원자와 산의 반응에 기인하는 산 부가염을 포함할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염" 내에 포함되는 염은 본 명세서에 개시된 화합물의 비독성 염을 지칭한다. 적합한 부가염은 비독성염을 형성하는 산으로부터 형성되고, 그 예는 아세테이트, p-아미노벤조에이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 비스메틸렌살리실레이트, 바이설포네이트, 바이타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 칼슘 에테테이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 클라뷸라네이트, 시트레이트, 사이클로헥실설파메이트, 이염산염, 에테테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에탄다이설포네이트, 에탄설포네이트, 폼메이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글루타레이트, 글리콜레이트, 글리콜릴아르세닐레이트, 헤미설페이트, 헥실레조르시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 염산염, 인산수소염, 하이드로아이오다이드, 하이드록시나프토에이트, 아이오다이드, 아세티오네이트, 이타코네이트, 락테이트, 락토바이오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸브로마이드, 메틸니트레이트, 메틸설페이트, 모노칼륨 말레이트, 뮤케이트, 납실레이트, 나이트레이트, N-메틸글루카민, 옥살레이트, 옥살로아세테이트, 파모에이트(엠보네이트), 팔메이트, 팔미테이트, 판토테네이트, 포스페이트/다이포스페이트, 피루베이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 사카레이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 서브아세테이트, 석시네이트, 설페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트, 트라이에티오다이드, 트라이플루오로아세테이트 및 발레레이트이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에서 제조된 염은 석시네이트, 글루타레이트 및 헤미설페이트 염을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 0.2nM 내지 2μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 0.2nM 내지 약 0.5nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 0.5nM 내지 약 5nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 5nM 내지 약 50nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 50nM 내지 약 500nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 50nM 내지 약 100nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 100nM 내지 약 200nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 200nM 내지 약 300nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 300nM 내지 약 400nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 400nM 내지 약 500nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 500nM 내지 약 1μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 500nM 내지 약 600nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 600nM 내지 약 700nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 700nM 내지 약 800nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 800nM 내지 약 900nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 900nM 내지 약 1μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1μM 내지 약 2μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1μM 내지 약 1.1μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1μM 내지 약 1.2μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.2μM 내지 약 1.3μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.3μM 내지 약 1.4μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.4μM 내지 약 1.5μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.5μM 내지 약 1.6μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.6μM 내지 약 1.7μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.7μM 내지 약 1.8μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.8μM 내지 약 1.9μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 1.9μM 내지 약 2.0μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 2μM 내지 약 200μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 농도는 약 200μM 내지 약 500μM의 범위를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크롭토시스 저해제의 최종 농도는 약 0.2nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 최종 농도는 약 2.0nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 최종 농도는 약 20nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 최종 농도는 약 200nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 저해제의 최종 농도는 약 2μM이다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 0.2nM 내지 2μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 0.2nM 내지 약 0.5nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 0.5nM 내지 약 5nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 5nM 내지 약 50nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 50nM 내지 약 500nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 50nM 내지 약 100nM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 100nM 내지 약 200nM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 200nM 내지 약 300nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 300nM 내지 약 400nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 400nM 내지 약 500nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 500nM 내지 약 1μM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 500nM 내지 약 600nM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 600nM 내지 약 700nM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 700nM 내지 약 800nM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 800nM 내지 약 900nM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 900nM 내지 약 1μM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1μM 내지 약 2μM를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1μM 내지 약 1.1μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1μM 내지 약 1.2μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.2μM 내지 약 1.3μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.3μM 내지 약 1.4μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.4μM 내지 약 1.5μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.5μM 내지 약 1.6μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.6μM 내지 약 1.7μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.7μM 내지 약 1.8μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.8μM 내지 약 1.9μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 1.9μM 내지 약 2.0μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 2μM 내지 약 200μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 네크로스타틴-1s 화합물의 농도는 약 200μM 내지 약 500μM의 범위를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크로스타틴-1s 화합물, 또는 네크로스타틴-1s의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 0.2nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크로스타틴-1s 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 2.0nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크로스타틴-1s 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 20nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크로스타틴-1s 화합물, 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 200nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 네크로스타틴-1s 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 2μM이다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 Bax 통로 저해제의 농도는 약 0.5nM 내지 약 50μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제의 농도는 약 0.5nM 내지 약 5nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제의 농도는 약 5nM 내지 약 50nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제의 농도는 약 50nM 내지 약 500nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제의 농도는 약 500nM 내지 약 5μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, Bax 통로 저해제의 농도는 약 5μM 내지 약 50μM의 범위를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.5nM 내지 약 50μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염은 약 0.5nM 내지 약 5nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 5nM 내지 약 50nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 50nM 내지 약 500nM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 500nM 내지 약 5μM의 범위를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 5μM 내지 약 50μM의 범위를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 상기 Bax 통로 저해제의 최종 농도는 약 0.5nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 상기 Bax 통로 저해제의 최종 농도는 약 5nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 상기 Bax 통로 저해제의 최종 농도는 약 50nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 상기 Bax 통로 저해제의 최종 농도는 약 500nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 상기 Bax 통로 저해제의 최종 농도는 약 5μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 상기 Bax 통로 저해제의 최종 농도는 약 50μM이다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 0.5nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 5nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 50nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 500nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 5μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 최종 농도는 약 50μM이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 아데노신 트라이포스페이트(ATP)를 더 포함한다. 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 몇몇 실시형태에서 세포 ATP 및 반응성 산소종의 소실이 (둘 다 미토콘드리아 비적응 과정의 결과로서) 일어나는데 이는 세포에게 유해하고 또한 괴사성 신호 전달로 향하게 되는 것으로 여겨진다. 또한, 몇몇 실시형태에 있어서, ATP의 고갈은 미토콘드리아에 의한 Ca2+ 흡수를 허용하여, 투과성 전이 기공PTP) 개방을 초래하고, 이는, 몇몇 실시형태에 있어서, 사이토크롬 C 방출, 미토콘드리아 팽윤 및 사멸을 초래한다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 중 상기 ATP는 조직으로부터의 세포 해리 및 동결보존에 의해 촉래된 세포막 파괴로 인해 ATP의 소실을 역전 또는 경감시킴으로써, 괴사유발 압력을 완화시킨다. 추가의 실시형태에 있어서, 조성물 중 ATP는 미토콘드리아 호흡의 둔화의 최소화를 통해서 미토콘드리아 기능을 보존시키고, 또한 세포를 파괴하는 과정에서 소실된 세포 대사산물의 보충을 돕는다.
일 실시형태에 있어서, 상기 ATP는 약 10nM 내지 약 1mM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 ATP는 약 10nM 내지 약 100nM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 ATP는 약 100nM 내지 약 1μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 ATP는 약 1μM 내지 약 10μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 ATP는 약 10μM 내지 약 100μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 ATP는 약 100μM 내지 약 100mM의 농도로 존재한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 ATP의 최종 농도는 약 10nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 ATP의 최종 농도는 약 100nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 ATP의 최종 농도는 약 1μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 ATP의 최종 농도는 약 10μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 ATP의 최종 농도는 약 100μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 ATP의 최종 농도는 약 1mM이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD) 화합물을 더 포함한다. 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 몇몇 실시형태에 있어서, NAD의 세포 손실이 추가적으로, 몇몇 실시형태에 있어서, 해당작용(glycolysis)의 저해 및 단백질의 시르투인 계열(sirtuin family)의 활성도의 감소를 포함하는 각종 기전을 통한 세포 괴사에 기여하는 것으로 여겨진다. NAD 고갈의 추가의 효과는, 몇몇 실시형태에 있어서, NADP/NADPH 생산의 저감이다. 몇몇 실시형태에 있어서, NADPH는 생합성 반응에 대한 환원 당량 및 ROS(반응성 산소종)의 괴사유발-유도 신호에 대한 보호를 제공한다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 낮은 NAD 수준은 괴사유발 세포사의 몇몇 매개제의 활성화를 촉발시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 내 상기 NAD는, 몇몇 실시형태에 있어서, 조직 또는 동결보존으로부터의 세포 해리에 의해 세포막 파괴로 인한 NAD의 손실을 역전 또는 경감시킨다. 다른 실시형태에 있어서, 조성물 내 상기 NAD는 괴사유발 신호전달을 억제한다.
몇몇 실시형태에 있어서, NAD의 보충은 해마에서 NAD 수준의 감소 및 허혈/재관류 손상 후에 리소좀으로부터 카텝신 B의 후속의 방출을 방지한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 높은 세포내 NAPDH는 CaMKII로 하여금 카스파제-2를 인산화하고 비활성화시키며, 이는 카스파제-2를 이의 프로-카스파제 비활성 효소 형태로 유지시킴으로써 괴사의 방지를 포함하는 다수의 효과를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, NAD는 또한 세포의 분화 상태에 영향을 미치고, 그의 활성화 상태를 유지시켜 탈분화 및 자체 재생 프로그램을 방지한다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 냉동 조성물에 NAD의 첨가는 화학적 환원 경로의 재생을 보장함으로써 과잉 세포사 및 손실을 방지한다. 또한, NAD로부터 유도되는 충분한 세포 NADPH는, 카스파제로 하여금 분화 경로를 따른 회귀를 방지하면서 세포사(괴사)를 회피하도록 충분히 낮은 활성도를 유지하게 한다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 내 NAD는, 몇몇 실시형태에 있어서, 조직 또는 동결보존으로부터의 세포 해리에 의해 초래된 막 파괴로 인한 스트레스를 경험하는 세포에서 세포 분화를 억제하고 세포 동일성의 유지를 지지한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 NAD는 약 5nM 내지 약 500μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 NAD는 약 5nM 내지 약 50nM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 NAD는 약 5nM 내지 약 50nM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 NAD는 약 50nM 내지 약 500nM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 NAD는 약 500nM 내지 약 5μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 NAD는 약 5μM 내지 약 50μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 NAD는 약 50μM 내지 약 500μM의 농도로 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 NAD의 최종 농도는 약 5nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 NAD의 최종 농도는 약 50nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 NAD의 최종 농도는 약 500nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 NAD의 최종 농도는 약 5μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 NAD의 최종 농도는 약 50μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 NAD의 최종 농도는 약 500μM이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 사이클로스포린 A를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 사이클로필린 D(CypD)의 저해제를 더 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 저해제는 사이클로스포린 A이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 사이클로스포린 A는 칼슘 활성화에 부차적인 미토콘드리아의 팽윤을 간섭하는 면역억제제이고, 몇몇 실시형태에 있어서, 간을 비롯한 임의의 세포 유형에서 반응성 산소종-유도 괴사성 사멸에 대해서 보호하는 것으로 드러났다. 몇몇 실시형태에 있어서, 사이클로필린 D(cypD)는, 미토콘드리아 매트릭스에 존재하고 MPTP를 제어하고, 몇몇 실시형태에 있어서, 괴사세포사를 초래하는 미토콘드리아 기능장애의 조기 판별에 중심이 되는 펩티딜-프롤릴 이성화효소이다.
이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 몇몇 실시형태에 있어서, 사이클로필린 D는 MPTP의 개방 상태의 제어를 통해서 조절 괴사, 또는 네크롭토시스를 조절하고, 그리고 사이클로스포린 A에 의한 이의 저해는 간세포의 칼슘- 및 산화 스트레스 유도사를 보호하는 것으로 드러난 것으로 여겨진다. 몇몇 실시형태에 있어서, CypD 저해는 또한 허혈 손상으로부터의 보호를 초래하고, 몇몇 실시형태에 있어서, 근이영양증을 포함하는 신경퇴행성 질환의 몇몇 양상을 또한 간 독성 모델에서 구제할 수 있다. 따라서, 허혈-재관류 손상에 기인하는 네크롭토시스는, 몇몇 실시형태에 있어서, CypD 활성도에 민감하여, 이를 손상-매개 세포사의 이러한 형태에 직접 연루시킨다.
일 실시형태에 있어서, 상기 사이클로스포린 A는 약 1nM 내지 약 1mM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 사이클로스포린 A는 약 1nM 내지 약 10nM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 사이클로스포린 A는 약 10nM 내지 약 100nM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 사이클로스포린 A는 약 100nM 내지 약 1μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 사이클로스포린 A는 약 1μM 내지 약 10μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 사이클로스포린 A는 약 10μM 내지 약 100μM의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 사이클로스포린 A는 약 100μM 내지 약 1mM의 농도로 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 사이클로스포린 A의 최종 농도는 약 1nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 사이클로스포린 A의 최종 농도는 약 10nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 사이클로스포린 A의 최종 농도는 약 100nM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 사이클로스포린 A의 최종 농도는 약 1μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 사이클로스포린 A의 최종 농도는 약 10μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 사이클로스포린 A의 최종 농도는 약 100μM이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 사이클로스포린 A의 최종 농도는 약 1mM이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 초산화물 불균등화효소를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 초산화물 불균등화효소는 Cu-Zn 초산화물 불균등화효소이다. 다른 실시형태에 있어서, 초산화물 불균등화효소는 Fe-Mn 초산화물 불균등화효소이다. 일 실시형태에 있어서, 초산화물 불균등화효소는 포유류 초산화물 불균등화효소이다. 다른 실시형태에 있어서, 초산화물 불균등화효소는 인간 초산화물 불균등화효소이다. 포유류는 3종류의 초산화물 불균등화효소, 즉, 세포질 형태인 SOD-1이라 불리는 유형 1, 미토콘드리아 형태인 SOD2라 불리는 유형 2 및 세포외 형태인 SOD3이라 불리는 유형 3을 갖는다.
이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 세포, 조직, 또는 장기의 이들의 자연 환경으로부터의 제거가 몇몇 실시형태에 있어서 허혈을 초래하는 통상의 산소화 및 대사 영양분의 파괴를 초래하고, 이는 이어서 몇몇 실시형태에 있어서, 과산화물, 초산화물, 및 하이드록실 라디칼과 같은 과잉 반응성 산소종(ROS)의 발생 및 칼슘 과부하를 초래하는 것으로 여겨진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 높은 수준의 반응성 산소는 세포 구조를 손상시키고, 산화 스트레스를 일으키며, 이에 의해서, 몇몇 실시형태에 있어서, 괴사를 유도한다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 중의 상기 초산화물 불균등화효소는 허혈-유도 반응성 산소종을 중화시킨다. 초산화물 불균등화효소는, 일 실시형태에 있어서, 인간 또는 동물 조직으로부터 정제된 천연 초산화물 불균등화효소일 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 초산화물 불균등화효소는 인간, 동물 또는 박테리아 세포 배양액에서 발현되고 후속적으로 정제되는 재조합 초산화물 불균등화효소이다. 재조합 단백질을 발현시키고 정제시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Sambrook et al, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989), Ausubel et al. (CURRENT PROTOCOLS　IN　MOLECULAR BIOLOGY Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, New York, 1987)] 참조.
일 실시형태에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소는 약 0.001 쿠니츠 단위(KU) 내지 약 100 KU의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소는 약 0.001 KU 내지 약 0.01 KU의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소는 약 0.01 KU 내지 약 0.1 KU의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소는 약 0.1 KU 내지 약 1 KU의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소는 약 1 KU 내지 약 10 KU의 농도로 존재한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소는 약 10 KU 내지 약 100 KU의 농도로 존재한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 초산화물 불균등화효소의 최종 농도는 약 0.001 쿠니츠 단위(KU)이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 초산화물 불균등화효소의 최종 농도는 약 0.01 KU이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 초산화물의 최종 농도는 약 0.1 KU이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 초산화물 불균등화효소의 최종 농도는 약 1 KU이다 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 초산화물 불균등화효소의 최종 농도는 약 10 KU이다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물에 포함된 초산화물 불균등화효소의 최종 농도는 약 100 KU이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "쿠니츠 단위"는 쿠니츠 검정에 정의된 바와 같은 효소 활성의 단위를 나타낸다(Kunitz M., 1950 Crystalline Deoxyribonuclease II. Digestion of Thymus Nucleic Acid. The Kinetics of Reaction: J. Gen. Physiol., 33 363-377).
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 네크롭토시스 저해제, 예를 들어, 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 Bax 통로 저해제, 예를 들어, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은, 괴사 저해제, Bax 통로 저해제, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온) 화합물, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 및 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온) 화합물, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소(EVERGREEN™ 배지 용액 또는 EVERLAST™)를 포함한다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 동결보호제를 더 포함한다. 당업자라면, 용어 "동결보호제"가 제제 없는 냉각 효과와 비교해서 샘플이 영하의 온도로 냉각되어 가온 후에 샘플에 대한 손상을 실질적으로 초래하지 못할 경우 세포 샘플(예컨대, 세포 배양액, 조직, 또는 장기)에서 얼음 결정 형성을 최소화하는 화학 물질을 포괄할 수 있음을 이해할 것이다. 적합한 동결보호제는 천연 또는 합성일 수 있고, 폴리비닐 피롤리돈, 덱스트란, 말토덱스트린, 2,3-부탄다이올, 하이드록시에틸 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 글리세롤, 다이메틸폼아마이드, 수크로스, 라피노스, 말토덱스트린, 스타키오스, 락토스, 전분, 트레할로스, 글루코스, 사이클로덱스트린(예컨대, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린 또는 이들의 혼합물), 만니톨, 덱스트로스, 카복시메틸 셀룰로스, 혈청(인간, 동물 또는 적절한 영양 지원을 위해 필수인 보충제를 가진 합성 대체물), 및 기타 통상적으로 사용되는 제제(예컨대, pH 안정제, 당, 아미노산, 안정제, 항생제), 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있고, 각각은 본 명세서에 개시된 조성물의 독립적인 실시형태를 나타낸다. 다수의 추가의 동결보호제는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제8,440,390호, 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 편입됨).
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 중의 동결보호제의 양은 1 중량% 내지 15 중량%의 범위를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 적어도 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 최대 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 조성물 중의 동결보호제는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 중의 DMSO의 양은 1 중량% 내지 15 중량%의 범위를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 중 DMSO의 양은 3 중량% 내지 10 중량%의 범위를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 적어도 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 최대 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물 중 동결보호제는 혈청을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 혈청은 인간 혈청, 동물 혈청, 또는 세포, 조직 및/또는 장기의 적절한 영양 지원을 위해 필수적인 보충제를 포함할 수 있는 합성 혈청 대체물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 혈청은 인간 혈청을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 혈청은 동물 혈청을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 혈청은 합성 혈청 대체물을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 합성 혈청 대체물은 세포, 조직 및/또는 장기의 적절한 영양 지원을 위해 필수인 보충제를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 중 혈청의 양은 1 중량% 내지 15 중량%의 범위를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물 중의 혈청의 양은 3 중량% 내지 10 중량%의 범위를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 적어도 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 양은 최대 약 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 약 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량% 또는 15 중량%이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 DMSO 또는 혈청, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 동결보호제를 더 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 당업계에 공지된 임의의 동결보호제를 더 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 괴사 저해제, Bax 통로 저해제, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 및 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 동결보호제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 동결보호제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 동결보호제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
당업자라면, 담체 및 부형제에 관하여 용어 "약제학적으로 허용 가능한"이, 화합물, 재료, 조성물 및/또는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 유익/유해비와 상응하는, 과잉의 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하는데 적합한 투여 형태를 포괄하는 것임을 이해할 것이다.
당업자라면 용어 "약제학적으로-허용 가능한 담체"가 하나의 장기, 또는 신체의 일부로부터 다른 장기 또는 신체의 부분으로 대상 화합물을 운송 또는 수송하는 것과 연루된, 약제학적으로-허용 가능한 재료, 조성물 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 또는 물질을 캡슐화하는 용매를 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 양립 가능하고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 약제학적으로-허용 가능한 담체로서 역할할 수 있는 재료의 몇몇 예는, 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 80(즉, Tween 80); 분말 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탤크; 예컨대, 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대, 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원-무함유수; 등장성 식염수; 링거액; 에틸 알코올; pH 완충용액; 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; 및 약제학적 제형에서 이용되는 기타 비독성의 양립성 물질을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 1종 이상의 약제학적 부형제 또는 기타 첨가제를 포함한다. 이러한 부형제 또는 첨가제는 1종 이상의 안정화 폴리올, 예컨대, 고차 다당류/중합체(제어 방출 촉진용), 스테아르산마그네슘, 류신 또는 트라이류신(윤활제로서), 및 인지질 또는 계면활성제를 포함할 수 있다.
당업자라면 용어 "약제학적으로 허용 가능한 부형제"가 환자에게 비독성이고 비-염증성의 특성을 갖고 본 명세서에 기재된 화합물 이외의 임의의 성분(예를 들어, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 부형제는, 예를 들어, 부착방지제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축조제, 붕해제, 염료(착색제), 유연제, 유화제, 충전제(희석제), 막형성제 또는 코팅제, 착향제, 향료, 활택제(유동 증진제), 윤활제, 보존제, 인쇄용 잉크, 흡착제, 현탁 또는 분산제, 감미제 또는 수화수(waters of hydration)를 포함할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 예시적인 부형제는, 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 탄산칼슘, 인산칼슘(이염기성), 스테아르산칼슘, 크로스카멜로스, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 스테아르산마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정성 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전호화 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 셸락, 이산화규소, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 시트르산나트륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 소르비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 스테아르산, 수크로스, 탤크, 이산화티타늄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및 자일리톨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
당업자라면 용어 "pH - 안정제"가 완충제 및 pH-조절제를 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 적합한 pH - 안정제는 삼염기성 인산나트륨, 무수 탄산나트륨, 글리신, 시트르산 등 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 착향제는 당업자에게 잘 알려져 있고, 과일향, 프레스코포트 플레이버 퍼마실(Frescofort Flavour Permaseal), 그레나딘 플레이버 퍼마실(Grenadine Flavour Permaseal) 및 투티 프루티 플레이버(Tutti Frutti Flavour) 또는 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
당업자라면 용어 "당(sugar)"이 모두 잘 알려진 단당류, 이당류 및/또는 올리고당, 예를 들어, 약제학적 산업에서 유용한 수크로스(사카로스), 글루코스, 프럭토스, 말토스, 락토스, 갈락토스 및/또는 전분 가수분해물을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 본 발명의 조성물의 실시형태는 특히 당으로서 수크로스를 함유하는 것을 특징으로 한다.
당업자라면 용어 "아미노산"이 단백질이 포함되는 천연형 아미노카복실산, 또는 자연에서 발견되지 않는 합성 아미노산 중 하나를 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다.
당업자라면 용어 "항생제"가 많은 계열의 미생물에 대해서 효과적인 광범위 항생제, 및 개별적인 미생물 종에 대해서 특이적으로 효과적인 좁은 범위 항생제를 비롯한, 미생물 감염성 질환의 치료를 위한 약리학적으로 활성인 물질을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다.
일 실시형태에 있어서, 용어 "약"은, 표시된 수 또는 수의 범위로부터 0.0001 내지 5%의 편차를 지칭한다. 일 실시형태에 있어서, 용어 "약"은, 표시된 수 또는 수의 범위로부터 1 내지 10%의 편차를 지칭한다. 일 실시형태에 있어서, 용어 "약"은, 표시된 수 또는 수의 범위로부터 최대 25%까지의 편차를 지칭한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "포함하는" 또는 이의 문법적 형태는, 표시된 활성제, 예컨대, 본명세서에 개시된 화합물의 내포뿐만 아니라, 기타 활성제, 및 약제학적 산업에서 공지된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 유연제, 안정제 등의 내포를 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "본질적으로 로 이루어진"은, 단지 활성 성분이 표시된 활성 성분이지만 다른 화합물이 제형을 안정화, 보존 등 하기 위하여 포함될 수 있지만, 표시된 활성 성분의 치료 효과에 직접 연루되지 않는 조성물을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "본질적으로 로 이루어진"은 표시된 활성 성분의 것과는 다른 기전을 통해서 치료 효과를 발휘하는 성분을 지칭할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "본질적으로 로 이루어진"은 표시된 활성 성분의 것과는 다른 화합물의 부류에 속하고 치료 효과를 발휘하는 성분을 지칭할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "본질적으로 로 이루어진"은 본 명세서에 개시된 상이한 작용 기전을 통해서 작용함으로써 표시된 활성 성분과는 다른 화합물의 부류에 속하고 치료 효과를 발휘하는 성분을 지칭할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "본질적으로 로 이루어진"은 활성 성분의 방출을 용이하게 하는 성분을 지칭할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 용어 "이루어진"은, 활성 성분 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 조성물을 지칭한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 괴사 저해제, Bax 통로 저해제, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 네크롭토시스 저해제, Bax 통로 저해제, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온) 화합물, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 및 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소로 본질적으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온) 화합물, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어진다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 괴사 저해제, Bax 통로 저해제, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 네크롭토시스 저해제, Bax 통로 저해제, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온) 화합물, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 및 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소로 이루어진다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온) 화합물, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소로 이루어진다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 기술하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 1종의 화합물"은 복수의 화합물(이들의 혼합물을 포함)을 포함할 수 있다.
본 출원을 통해서, 본 명세서에 개시된 각종 실시형태는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기술은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 본 명세서에 개시된 조성물의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되어서는 안되는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 설명은 그 범위 내의 개별적인 수치뿐만 아니라 모든 가능한 하위 범위를 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 1 내지 3, 1 내지 4,1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 고려되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
수치 범위가 본 명세서에서 표시될 때마다, 표시된 범위 내의 임의의 인용된 수(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 첫 번째 표시 숫자와 두 번째 표시 숫자의 "범위에 이르는/사이의 범위"란 어구 및 첫 번째 표시 숫자에서부터 두 번째 표시 숫자까지의 "범위에 이르는/범위"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되고, 첫 번째 표시 숫자와 두 번째 표시 숫자 및 이들 사이의 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.
키트
또한, 본 명세서에서는 위에서 기재된 조성물의 요소를 포함하는 사용 준비된 키트가 개시되어 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 본 명세서에 개시된 화합물 또는 조성물 및 본 명세서에 기재된 사용 방법에 적합한 1종 이상의 기타 성분을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 괴사 저해제, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 Bax 통로 저해제 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 네크롭토시스 저해제, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 Bax 통로 저해제 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 네크로스타틴-1s 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 Bax 통로 저해제 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 중의 요소의 하나 또는 둘은 재구성될 건조 분말로서 제공된다. 이러한 실시형태에 있어서, 키트는 건조제를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 중의 하나 또는 두 요소는 액체로서 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물 중의 요소는, 일반적으로 화합물 또는 요소를 다른 성분과 혼합함으로써 또는 화합물 또는 조성물을 다른 성분에 적용함으로써, 예컨대, 조성물에 세포 성장 매체를 보충함으로써 사용 전에 조성물의 제조를 위한 개별적인 바이알 내 키트에 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 1종 이상의 동결보호제, 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 이들 추가의 성분 중 1종 초과의 조합을 더 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 투여용 조성물의 혼합 및 제조용의 모든 필요한 브래킷 및 용기를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트 내 조성물의 요소들은 사전 혼합된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트의 조성물은 멸균성이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 키트는 패키징 재료를 더 포함한다. 몇몇 구체적인 실시형태에 있어서, 패키징 재료는 기밀성이다. 이들 실시형태에 있어서, 패키징 재료는 선택적으로 불활성 기체, 예컨대, 질소, 아르곤 등으로 채워질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 패키징 재료는 금속 포일 용기, 예컨대, 밀봉된 알루미늄 파우치 등을 포함한다. 이러한 패키징 재료는 당업자에게 잘 알려져 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 키트는 개시된 조성물의 요소 또는 화합물을 조합하는 방법 그리고 선택적으로 투여용 조성물을 형성하기 위하여 개시된 조성물을 다른 성분(예컨대, 동결보호제, 담체 또는 부형제)과 조합하는 방법을 기술하는 설명서를 더 포함한다.
방법
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 냉동-해동 사이클 동안 괴사 경로의 진행을 방지하고 조직으로부터의 유리 동안 시험관내에서 세포 조작에 기인하는 물리적, 화학적 및 열역학적 손상을 복구하는 작용을 한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 동결보존되고 있는 세포, 조직 또는 장기에서 괴사를 억제하는 작용을 한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 세포, 조직 또는 장기에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 저해 또는 저감시키는 작용을 한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은, 대상체에서 노화 또는 질환과 연관된 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는데 유용하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 복수의 세포의 동결보존방법에 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법에 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법에서 사용하기 위한 조성물은 위에서 기재된 바 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 조성물 중 어느 하나는 본 명세서에 기재된 사용 방법에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법에서 사용하기 위한 조성물 내에 포함된 성분의 조합 및 농도는 위에서 상세히 기재된 바 있다.
일 실시형태에 있어서 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다. 네크롭토시스 저해제 및 Bax 통로 저해제의 비제한적인 예는 위에서 상세히 개시된 바 있다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크로스타틴-1s 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 네크롭토시스 저해제, 및 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 Bax 통로 저해제, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하고, 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함하고, 여기서 네크롭토시스 저해제 화합물 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제 화합물은 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물, Bax 통로 저해제 화합물을 포함하고, 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함하되, 여기서 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸)페닐)유레아, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온,, 또는 이의 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 약 0.2nM 내지 2μM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 0.5nM 내지 50μM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 5nM 내지 500μM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 약 10nM 내지 1mM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 약 1nM 내지 1mM의 사이클로스포린 A 및 0.001 KU 내지 100 KU의 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 약 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 50μM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 약 10nM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 약 10nM의 사이클로스포린 A, 및 약 0.1 KU의 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법이 제공되되, 해당 방법은 (a), 복수의 세포를 본 명세서에서 위에서 기재된 바와 같은 임의의 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계, 및 (b) 복수의 세포를 포함하는 조성물을 냉각시키는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은, 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하고 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은, 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하고, 그리고 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드, 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸) 페닐)유레아, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온, 또는 상기 네크롭토시스 저해제 화합물 중 어느 하나의 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 복수의 세포를, 약 0.2nM 내지 2μM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 0.5nM 내지 50μM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 5nM 내지 500μM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 약 10nM 내지 1mM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 약 1nM 내지 1mM의 사이클로스포린 A 및 0.001 KU 내지 100 KU의 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 복수의 세포를, 약 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염, 약 50μM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 약 10nM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 약 10nM의 사이클로스포린 A, 및 약 0.1 KU의 망간-초산화물 불균등화효소, 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세에서는 복수의 세포에서 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 네크롭토시스 또는 괴사는 노화 또는 질환과 연관된다. 당업자라면, 용어 "질환"이 유기체의 일부 또는 전부에 영향을 미치고 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사를 포함하는, 특정 비정상 병태, 구조의 장애 또는 기능을 포괄할 수 있는 것을 이해할 것이다. 일 실시형태에 있어서, 질환은 심근경색증이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 베타-세포 네크롭토시스에 부차적인 당뇨병이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 담즙정체성 간 질환이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 뇌졸중이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 장기 허혈이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 허혈-재관류 손상이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 간 질환이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 암 화학요법 또는 방사선 요법으로부터의 괴사이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 외상성 뇌손상이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 괴사성 췌장염이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 병원체-유도 네크롭토시스이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 염증이다. 다른 실시형태에 있어서, 질환은 신경퇴행성 질환이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 질환은 심근경색증, 베타-세포 네크롭토시스에 부차적인 당뇨병, 담즙정체성 간 질환, 뇌졸중, 장기 허혈, 허혈-재관류 손상, 간 질환, 암 화학요법 또는 방사선 요법으로부터의 괴사, 외상성 뇌손상, 괴사성 췌장염, 병원체-유도 네크롭토시스, 염증, 신경퇴행성 질환을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 괴사 또는 괴저성 사멸의 발생을 예방, 저해 또는 저감시키는 본 명세서에 개시된 방법은 상기 복수의 세포의 단리, 조작, 저온 배양 또는 동결보존 및 이의 냉동-해동 사이클 동안 사용된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 세포 가소성, 또는 괴사 또는 괴저성 사멸의 발생을 예방, 저해 또는 저감시키는 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 용도를 포함한다.
당업자라면, 용어 "복수의 세포"가 생체내 또는 시험관내 배양에서 성장되거나 또는 생체외 배양액에서 유지된 임의의 포유류 세포 또는 세포의 군을 포괄할 수 있는 것을 이해할 것이다. 본 명세서에 개시된 사용 방법에 대해서 상정된 세포의 군은 임의의 다세포 샘플을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 다세포 샘플은 단일 세포 유형 또는 다세포 유형, 조직, 장기, 장기의 일부, 전체 유기체의 특정 분절(유기체 내에 있든지 또는 유기체로부터 제거되었든 추출되었든지 간에)을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 복수의 세포는 전체 유기체를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은, 줄기세포, 성체 세포, 전환분화 세포, 탈분화 세포, 분화 세포를 포함하는 1차 세포를 비롯하여, 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 배양되든지 간에, 임의의 세포 유형과 사용하기에 적합하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 개시된 방법과 적합한 세포 유형은, include 생식 세포(난모세포 및 정모세포), 줄기세포, 선포 세포, 지방세포, 폐포 세포, 에나멜아세포, 섬유륜 세포, 거미막 세포, 별아교세포, 배반엽, 두개관 세포, 암성 세포(선암종, 섬유육종, 교모세포종, 간세포암s, 흑색종, 골수성 백혈병, 신경모세포종, 골육종, 육종) 심장근육세포, 연골세포, 척삭종 세포, 크롬친화성 세포, 난구 세포, 내피 세포, 내피-유사 세포, 초성화 세포(Ensheathing cell), 상피 세포, 섬유아세포, 섬유아세포-유사 세포, 배아 세포, 간세포, 혼성세포, 인슐린 생산 세포, 간질 세포, 섬, 각질세포, 림프구 세포, 대식세포, 비만세포, 멜라닌 세포, 반월상 세포, 혈관간막 세포, 간충직 전구체 세포, 단핵구, 단핵 세포, 골수아세포, 근원세포, 근섬유모세포, 뉴런 세포, 핵 세포, 상아질모세포, 난모세포, 조골세포, 조골세포-유사 세포, 파골세포, 파골세포 전구체 세포, 난형 세포, 모유두 세포, 실질 세포, 혈관주위세포, 치주인대 세포, 골막 세포, 혈소판, 허파꽈리세포, 지방선구세포, 심막외전구(Proepicardium) 세포, 신장 세포, 살리스피어(Salisphere) 세포, 슈반(Schwann) 세포, 분비 세포, 평활근 세포, 정자 세포, 성상 세포, 줄기세포, 줄기세포-유사 세포, 세르톨리 세포, 기질 세포, 활막 세포, 윤활막세포, T 세포, 힘줄세포, T-림프아구, 영양세포s, 요로상피 세포, 유리질 세포 등; 예를 들어, 제한 없이 이하의 조직 중 어느 하나: 지방 조직, 부신, 양수, 양막낭, 대동맥, 동맥(경동맥, 관상동맥, 폐), 담관, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌(대뇌피질 포함), 유방, 기관지, 연골, 자궁경관, 융모막 융모, 결장, 결막, 결합 조직, 각막, 치수(Dental Pulp), 십이지장, 경막, 귀, 자궁내막종, 자궁내막, 식도, 눈, 포피, 쓸개, 신경절, 잇몸, 두경부, 심장, 심장판막, 해마, 장골, 척추사이원반, 관절, 경정맥, 신장, 무릎, 눈물샘, 인대, 간, 폐, 림프절, 유선, 하악골, 뇌막, 중배엽, 미소혈관계, 점막, 근육-유래(MD), 골수성 백혈병, 골수종, 코, 비인두, 신경, 수핵(Nucleus Pulposus), 구강 점막, 난소, 췌장, 이하선, 음경, 태반, 전립선, 신장, 기도, 망막, 침샘, 복재 정맥, 좌골 신경, 골격근, 피부, 소장, 괄약근, 척추, 비장, 위, 활막(Synovium), 치아, 힘줄, 고환, 갑상선, 편도, 기관, 탯줄 동맥, 탯줄, 제대혈, 탯줄 정맥, 탯줄(와튼젤리(Wartons Jelly)), 요로, 자궁, 맥관구조, 심실, 성대주름 및 세포, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는 상기 세포, 예를 들어, 제한 없이, 이하의 종들 중 어느 하나: 개코원숭이, 버펄로, 고양이, 닭, 소, 개, 염소, 기니피그, 햄스터, 말, 인간, 원숭이, 마우스, 돼지, 메추라기, 토끼 등으로부터 유래되는 상기 조직을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포는 조직 배양 세포, 1차 세포, 생식 세포, 예를 들어, 달걀 세포 및/또는 정자, 조직, 장기 또는 이의 일부, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 상기 조직 배양 세포 또는 1차 세포는 줄기세포, 성체 세포, 전환분화 세포, 탈분화 세포, 또는 분화 세포, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포는 인간 세포 또는 동물 세포를 포함한다.
당업자라면, 용어 "생체내"가 살아있는 유기체 상에서 그의 자연 상태에서 수행되는 본 명세서에 기재된 사용 방법을 포괄하는 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 생체내에서 접촉시키는 것은 동물 또는 이의 일부의 관류를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 생체내에서 접촉시키는 것은 무손상 동물에서 장기 또는 이의 일부의 관류를 포함한다.
당업자라면, 용어 "생체외"가 유기체 외부에서 수행되는 본 명세서에 기재된 사용 방법을 포괄하는 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 생체외에서 접촉시키는 것은, 세포가 유래되는 유기체(만약 이들이 1차 세포인 경우) 외부의 인공 환경(멸균 조건)에서 세포를 자연 조건의 최소의 변경으로 노출시키는 것을 포괄할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 생체외에서 접촉시키는 것은 대상체로부터 제거된 장기 또는 이의 일부의 관류를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 생체외에서 접촉시키는 것은 대상체로부터 제거된 조직 또는 이의 일부의 관류를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대상체는 동물 또는 인간을 포함한다.
당업자라면, 용어 "시험관내"가 인공 환경에서 일어나는 본 명세서에 기재된 사용 방법을 포괄하는 것임을 이해할 것이다. 예를 들어, 일 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 시험관내에서 접촉시키는 것은, 시험관에서 또는 반응 용기에서, 세포 배양액에서 또는 페트리 접시에서 또는 유기체(예컨대, 동물) 내라기보다는 오히려 당업계에 공지된 다른 인공 환경에서, 본 명세서에 개시된 조성물을 복수의 세포와 혼합하는 것을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 것은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 일어난다.
본 명세서에 개시된 방법은, 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계를 제공함으로써, 동결보존을 비롯한 유도체화 및 단리 또는 하류 조작의 공정 동안 손상이 일어나기 전에 세포를 보존하고 보호한다. 접촉시키는 단계는, 예를 들어, 유기체로부터 복수의 세포의 제거에 선행하는 몇몇 실시형태에 있어서 생체내에서 일어날 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 생체내에서 접촉시키는 단계는 유기체의 모든 세포 및 장기에 본 발명의 조성물을 전신 전달하는 것이다. 다른 실시형태에 있어서, 생체내에서 접촉시키는 단계는 세포의 입수 부위에서 국소적으로 본 발명의 조성물을 국소 전달하는 것이다. 적합한 전달 방법은 당업자에게 즉각적으로 명백할 것이고, 주사, 정맥내 관류, 관상동맥내 심근 관류, 카테터에 의한 동맥내 장기 관류, 관상동(coronary sinus) 관류, 심장내 관류 또는 당업계에 공지된 임의의 방법을 포함한다.
비-열 가역성 전기천공, 또는 3-차원 배양을 이용하는 관류 생물반응기 시스템의 과정을 통해서 전체 조직에, 예를 들어, 이식을 위하여 살아있는 장기에 이 조성물의 적용이 또한 가능하다. 이들 화합물은 큰 세포 침투능을 가지므로, 이들은 광범위한 적용 및 종에 걸쳐 생물학적 조직 및 재료의 보호를 위하여 이상적이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 접촉시키는 단계는, 예를 들어, 유기체로부터 단리된 세포에 또는 조직 배양액에 시험관내에서 수행된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 단계는 입수 직전에 본 명세서에 개시된 조성물에 복수의 세포를 침지시키는 것을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 단계는 입수 후 잠시 동안 조성물에 복수의 세포를 침지시키는 것을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 단계는 시험관내 배양의 성장 배지를 본 명세서에 개시된 조성물로 교체하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 단계는 시험관내 배양의 성장 배지를 본 명세서에 개시된 조성물로 보충하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 단계는 비-열 가역성 전기천공을 통해서 본 명세서에 개시된 조성물에 의한 신속한 주입을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 단계는 관류 생물반응기에서 본 명세서에 개시된 조성물에 함침된 복수의 세포를 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 단계는 3-D 배양액에서 본 명세서에 개시된 조성물에 함침된 복수의 세포를 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 것은 복수의 세포를 생체내 또는 생체외에서 접촉시키는 단계를 포함하되, 여기서 상기 접촉시키는 것은 동물 또는 이의 일부, 장기 또는 이의 일부, 또는 조직의 관류를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은 동물 또는 인간에 심장을 통한 관류를 통해서 도입됨으로써, 수초 내에 모든 장기 및 세포에 진입한다. 이들 공급원으로부터 단리된 조직 및 장기는 이어서 평판 배양, 이송 또는 냉동될 때까지 후속 단계를 통해서 조성물에서 유지된다. 이것은 이 과정 동안 해리된 세포를 포함하며, 이는 후속의 평판 배양 또는 냉동될 때까지 용액에서 유지된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대상체로부터 유래된 장기는 소정의 장기 이식 절차로 처리되며, 이의 필요로 되는 임의의 용액은 괴사 및 네크롭토시스가 회피되고 조직 내 세포가 보호되도록 하는 조성물을 함유하도록 재구성된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 관류는 심장 관류를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 시험관내에서 접촉시키는 것은 본 명세서에 개시된 조성물에 복수의 세포를 침지시키거나, 또는 복수의 세포의 성장 배지를 본 명세서에 개시된 조성물로 보충하거나, 또는 복수의 세포를 비-열 가역성 전기천공을 통해서 본 명세서에 기재된 조성물로 관류시키거나, 또는 생물반응기에서 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물로 관류시키는 것을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 생물반응기는 복수의 세포를 확장시켜 전파시키는데 사용된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 생물반응기는 세포의 배양을 위하여 사용될 수 있고, 이때 조건은 높은 세포 농도에 적합하다. 다른 실시형태에 있어서, 생물반응기는 세포의 확장을 위한 폐쇄 시스템을 제공한다. 다른 실시형태에 있어서, 다수의 생물반응기는 세포 확장을 위하여 연속하여 사용된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 생물반응기는 일회용 생물반응기이다. 다른 실시형태에 있어서, 사용된 생물반응기는 다회용 생물반응기이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 생물반응기는 공정의 파라미터를 모니터링하고 제어하기 위한 제어 유닛을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물은, 예를 들어, 비-열 가역성 전기천공, 또는 3-차원 배양을 이용하는 관류 생물반응기 시스템을 통해 동물 또는 인가능로부터 유래된 조직으로 신속하게 주입된다. 기타 조직 주입 기전은 또한 유사하게 사용될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 조직은 시험관내 공급원으로부터 유래될 수 있고, 이를 위하여 조성물은 성장 배지 또는 기타 지지 용액의 대체 시 시험관내에서 주입될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 인간 대상체로부터 유래된 조직은 입수 시 본 명세서에 개시된 조성물로 회수되고 관류될 수 있다. 이것은 조직 단리 직후에 입수 위치에서 또는 시험관내에서 국소로 조성물로 전처리를 통해서 달성될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조직은 조성물 용액으로 사전 충전된 용기에 입수되어 동시에 배치될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 동물 또는 인가능로부터 유래된 조직은 본 명세서에 개시된 조성물에 배치되고 가공처리되어 세포를 유리시켜 세포를 동결보존하거나 또는 세포는 세포 배양을 위하여 시험관내에서 사용되게 한다. 여기서 조직 및 세포는 연속해서 조성물에 적용되고 용액 중 변화는 조성물의 적절한 첨가에 의해 수반되어 괴사 및 네크롭토시스로부터의 보전 및 보호를 가능하게 한다.
살아있는 동물의 심장을 통한 관류(transcardiac perfusion)를 통한 본 명세서에 개시된 조성물의 도입(여기서, 예를 들어, 동물은 임신한 암컷 성체 동물을 포함함)은, 뇌와 같은 특권을 가진 장기를 포함하는 신체 축을 가로지르는 배아 조직에의 침투를 비롯하여, 모든 장기 및 세포의 신속한 보존을 초래한다. 또한, 본 명세서에 기재된 조직 또는 임의의 복수의 세포에의 간단한 시험관내 도입은, 신속한 침투 및 활성화를 허용한다. 이것은 "대사 중지"의 유형인 조직 또는 세포 입수 수법에서 세포가 죽기 시작하기 전에 세포 대사 상태의 보존을 전달하는 놀라운 신규한 방법을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포는, 해당 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계 후에 물리적, 화학적 또는 열역학적 조작이 적용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포는, 해당 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계와 동시에 물리적, 화학적 또는 열역학적 조작이 적용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포는, 해당 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계 전에 물리적, 화학적 또는 열역학적 조작이 적용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법 동안 추가의 처리 단계는 동물 또는 인간, 이의 장기, 또는 이의 조직으로부터 유래된 복수의 세포로부터 개별적인 세포를 유리시키는 것을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 추가의 처리는 세포외 단백질의 단백질 가수분해 소화를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 추가의 처리는 세포 선별을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 추가의 처리는, 예를 들어, 세포 성장 또는 분화를 유도 또는 억제하기 위하여 각종 화학적 및 신호전달 분자로 세포를 처리하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 추가의 처리는, 예컨대, 세포를 농축시키기 위하여 세포의 원심분리 및 재현탁을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 모든 중간 조작은 세포가 본 명세서에 개시된 조성물에 함침되는 동안 수행된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 모든 중간 조작은 본 명세서에 개시된 조성물로 보충된 성장 배지에 세포가 함침되는 동안 수행된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 복수의 세포를 가열 또는 냉각시키는 것을 포함하는 열역학적 조작을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 냉각시키는 것은 동결보존 또는 냉동-해동 사이클, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 냉각시키는 것은 다수의 냉동-해동 사이클을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포를 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물을 냉각시키는 단계는 본 명세서에 개시된 조성물에 함침되거나 이에 의해 관류된 복수의 세포의 전체적인 온도를 저감시키는 것을 수반한다. 일 실시형태에 있어서, 온도는 예를 들어, 장기 저장 동안 동결 온도 이하로 저감된다. 다른 실시형태에 있어서, 온도는 후속의 사용, 예컨대, 이식, 재이식 또는 세포의 추가의 조작, 예컨대, 복수의 세포로부터 특정 유형의 세포의 분리 전에 단기 또는 중기 동안 어는점에 가까운 값으로 저감된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포는 본 명세서에 개시된 조성물에 함침되거나 이로 관류되며, 여기서 세포를 포함하는 조성물은 급속 냉각된다. 다른 실시형태에 있어서, 복수의 세포는 본 명세서에 개시된 조성물에 함침되거나 이로 관류되고, 점차로 냉각된다. 다른 실시형태에 있어서, 급속 냉각은 냉각되고 있는 세포에서 단백질의 변성을 방지하기 위하여 수행된다. 다른 실시형태에 있어서, 점차적인 냉각은, 냉각되고 있는 세포의 대사 중지 상태를 유도시키기 위하여 수행된다.
본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 복수의 세포를 조성물과 접촉시키기 전에 사전 냉각된다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 복수의 세포를 조성물과 접촉시키기 전에 사전 가온된다. 본 명세서에 개시된 방법의 몇몇 실시형태에 있어서, 조성물은 복수의 세포를 조성물과 접촉시킴과 동시에 냉각된다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포의 대사 중지 상태를 유도하는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 복수의 세포의 대사 중지 상태를 유도하는 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 선택적으로 복수의 세포를 냉각시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대사 중지 상태는 산소 대사의 가역적 중단을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대사 중지의 상태는 이의 본 명세서에 기재된 동결보존방법 및/또는 냉동-해동 사이클 동안 또는 후에 유도된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대사 중지 상태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 복수의 세포에에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법 동안 또는 후에 유도된다.
당업자라면 용어 "대사 중지"가 산소 대사의 중단을 비롯하여, 대사적 생화학 경로의 늦춤 및/또는 중단을 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 대사 중지 상태를 유도함으로써 세포의 생존율을 보호하고 세포의 동일성을 보존한다. 예를 들어, 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 새로운 세포 유형으로 재프로그래밍화, 탈분화 또는 교차분화되는 줄기세포 및 성체 세포의 대사 중지를 유도하며, 여기서 재프로그래밍화, 탈분화 또는 교차분화된 세포의 동일성이 유지된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대사 중지를 유도하는 본 명세서에 개시된 방법은 세포 대사 상태를 보존함으로써, 조직 또는 세포 입수 절차에 의해 초래된 스트레스로 인한 세포사를 방지한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 대사 중지를 유도하는 본 명세서에 개시된 방법은 세포 생존율을 증대시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물을 이용하는 본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉된 복수의 세포의 분화 상태의 변화를 예방, 저해 또는 저감시키며, 여기서 세포의 동일성은 미접촉 세포 집단, 또는 당업계에 공지된 조성물과 접촉된 집단과 비교해서 안정화된다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 이들의 세포 동일성을 유지하는 복수의 세포를 초래한다. 다른 실시형태에 있어서, 세포 동일성은 상기 세포의 냉각 동안 유지된다. 다른 실시형태에 있어서, 세포 동일성은 상기 세포의 냉동 동안 유지된다. 다른 실시형태에 있어서, 세포 동일성은 상기 세포의 동결보존의 일부로서 수행된 냉동-해동 사이클 동안 그리고 후에 유지된다. 다른 실시형태에 있어서, 세포 동일성은 상기 세포의 물리적 조작 동안 유지된다. 다른 실시형태에 있어서, 세포 동일성은 상기 세포의 저장 동안 유지된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉되지 않은 복수의 세포와 비교해서, 동결보존방법 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 상기 복수의 세포의 괴사 또는 괴저성 사멸을 예방, 저해 또는 저감시킨다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉되지 않은 복수의 세포와 비교해서, 냉동-해동 사이클을 포함하는 방법 동안 상기 복수의 세포의 괴사 또는 괴저성 사멸을 예방, 저해 또는 저감시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은 동결보존단계 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 복수의 세포를 물리적 손상으로부터 보호한다. 다른 실시형태에 있어서, 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클로 인한 물리적 손상은 냉동 시 얼음 형성으로 인한 세포 수축 및 탈수를 포함한다. 세포내 물의 신속한 소실은 초기 세포내 얼음 결정 형성의 결과로서 일어나 삼투압 강도 증가를 초래한다. 이러한 물의 손실은 세포 대사산물의 임계 수준의 부수적인 손실을 가져온다. 예를 들어, 다른 실시형태에 있어서, ATP 및 NAD는 이러한 동결보존 과정 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 소실될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 세포는 원형질 막에서 일시적으로 물리적으로 "찔려(poked)" 개방되어, 대사물질이 소실될 수 있는 개방 구멍을 일시적으로 노출시킨다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 세포 내에 과도한 칼슘 방출을 저해 또는 저감, 세포로부터의 과도한 ATP 방출을 저해 또는 저감, 세포로부터의 과도한 NAD 방출을 저해 또는 저감시킴으로써, 또는 괴사 및 네크롭토시스, 또는 이들의 임의의 조합을 초래하는 경로의 활성화를 저해함으로써 복수의 세포를 보호한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 산소화 부족, 유리 라디칼 발생 또는 허혈, 또는 이들의 임의의 조합을 저해 또는 저감시킴으로써 복수의 세포, 예를 들어, 장기 또는 이의 부분, 또는 조직을 보호한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법은, 세포 내 Ca2+ 농도 증가, NAD 및 ATP 수준 감소를 초래하는 세포 내 PARP의 활성화, 또는 반응성 산소종의 증가, 또는 이들의 임의의 조합을 저해 또는 저감시킴으로써 복수의 세포를 보호한다.
당업자라면 용어 "물리적 손상"이 생리학적 세포 기능 또는 세포사의 임의의 파괴를 포괄할 수 있는 것임을 이해할 것이다. 생리학적 세포 기능의 파괴에 대한 비제한적인 예는 산화 스트레스(예를 들어, 지질 과산화, DNA 및 RNA 산화, 및 단백질 산화), 비-특이적 당화반응, 단백질 미스폴딩, DNA 돌연변이, 임의의 세포 구조의 온전성의 상실, 대사 스트레스, 열역학적 스트레스, 온도 변동 충격, 이온화 및 비이온화 방사선 손상 및 화학적 스트레스(예를 들어, 산 또는 염기성 물질에의 노출)를 포함한다. 따라서, 몇몇 실시형태에서의 표현 "물리적 손상으로부터의 보호"는, 본 명세서에 개시된 조성물과 접촉되지 않은 대조 세포와 비교할 때, 세포사를 방지 또는 감소시키거나, 또는 세포 기능의 열화를 방지 또는 감소시키는 것 중 어느 하나를 포괄한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 동결보존방법은 상기 복수의 세포의 성장 가능성을 미접촉 복수의 세포 또는 공지된 동결보존용액과 접촉된 복수의 세포와 비교해서 증대시킨다. 다른 실시형태에 있어서, 세포의 저장 시간 프레임은 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 동결보존 후에 증가된다. 다른 실시형태에 있어서, 동결보존방법은 상기 복수의 세포의 성장 가능성을 증대시키고, 여기서 본 명세서에 개시된 조성물의 사용은, 당업계에 공지된 조성물을 이용해서 동결보존된 세포와 비교해서, 우수한 해동 후 세포 생존율, 성장 가능성 및 종 및 세포 유형에 걸친 분화 특징을 제공한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 단리, 조작, 저온 배양, 또는 동결보존 및 이의 냉동-해동 사이클 동안 복수의 세포에서 성장 가능성을 증대시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 선택적으로 복수의 세포를 냉각시키는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 방법은 조직 또는 장기 내 단리된 세포 또는 세포들의 건강 및 생존율을 보존함으로써, 이식, 재생 및 생식 의학 용도, 예컨대, 바이오뱅킹(biobanking), 그리고 체외수정(in-vitro fertilization)을 위한 세포의 보존에서의 세포의 의학적 잠재성 및 이용성을 증대시킨다. 따라서, 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 체외수정을 위한 세포의 보존 방법이 제공되되, 해당 방법은, (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 선택적으로 복수의 세포를 냉각시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 개인화된 세포 의학 샘플의 바이오뱅킹 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 선택적으로 복수의 세포를 냉각시키는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 재생 의료(regenerative medicine) 및 성형 수술(cosmetic surgery)을 위한 세포 보존 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 선택적으로 복수의 세포를 냉각시키는 단계를 포함한다.
당업자라면, 용어 "성장 가능성을 증대시킨다"가 본 명세서에 개시된 조성물로 처리되지 않은 대조 세포와 비교할 때 세포의 유사분열 세포 분열률의 임의의 측정 가능한 증가를 포괄할 수 있음을 이해할 것이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 개시된 조성물을 이용하는 본 명세서에 개시된 방법은 미접촉 복수의 세포, 또는 당업계에 공지된 조성물에 의해 접촉된 복수의 세포와 비교해서 세포의 생존율 또는 잠재적 생존율을 개선시킨다.
생애 동안 세포 손상의 주된 원인은 산화적 세포 호흡 경로, 및 에너지 생산과 유지의 통상의 과정을 통하는 것에 의한다. 이것은 다양한 세포 스트레서(cellular stressor) 및 환경 조건하에 증대되고, 이 동안에 이들 변화를 보상하는 세포 머시너리(cellular machinery)의 능력이 제대로 발휘되지 못한다. 스트레서는 많은 세포 기질에 대해 과잉 산화 손상으로부터 보호하는 머시너리에 부담을 주어, 손상을 신속하게 점차적으로 확대시켜 세포 생존율에 대한 취약한 단계를 유발하는 피드백 루프를 초래한다.
이 취약성을 초래하는 조건의 일례는 동결보존 냉동-해동 과정 동안 일어나는 온도 변동 충격이다. 또한, 생검 동안 동물 장기의 절개 동안 조직으로부터의 세포의 단리, 또는 세포 요법 목적을 위한 생물반응기에서 성장 및 분화를 위한 줄기세포의 단리는 모두 이 과정에서 손상을 초래한다. 이 손상은, 충분한 산소화(허혈)의 부족 또는 삼투질 농도의 변화를 비롯한, 조직 및 장기로부터 세포를 제거할 때의 물리적 손상, 이러한 세포의 제거를 용이하게 하는 제제를 도입할 때의 화학적 손상, 및 세포가 그들의 대사 영양분 공급원으로부터 제거될 때의 환경 손상을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 조성물을 이용하는 본 명세서에 개시된 동결보존방법은, 미접촉 복수의 세포 또는 공지된 동결보존용액과 접촉된 복수의 세포에 비해서 상기 복수의 세포에 대한 산화 손상을 방지한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 조성물을 이용하는 본 명세서에 개시된 동결보존방법은, 미접촉 복수의 세포 또는 공지된 동결보존용액과 접촉된 복수의 세포에 비해서, 이의 냉동-해동 사이클의 상기 동결보존 동안 복수의 세포의 허혈을 방지한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키거나 동결보존하기 위한 본 명세서에 개시된 방법은 복수의 세포 내에서 괴사 경로 신호전달을 저해한다. 다른 실시형태에 있어서, 괴사 경로의 저해는 임의의 수준의 경로에서 있을 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 동결보존방법에 제공되되, 여기서 상기 방법은 복수의 세포의 대사 중지 상태를 동결보존 및 이의 냉동-해동 사이클 동안 유도하고, 상기 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 복수의 세포를 냉각시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 본 명세서에서는 복수의 세포의 생존율을 개선시키는 방법이 제공되되, 해당 방법은 (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 선택적으로 복수의 세포를 냉각시키는 단계를 포함한다.
실시예
조직 절개 및 세포 조작이 몇 가지 세포 유형에서 연구되었다. 여러 세포 유형에서 반응성 산소종(ROS)의 비교 수준이 Nox1 수준의 함수로서 측정되었고; 세포자멸사의 비교 수준이 CASP3 수준의 함수로서 측정되었으며; 괴사의 비교 수준이 PI 및/또는 아넥신 V에 의한 염색의 함수로서 측정되었다.
실시예 1. 동결보존용액은 조직 절개 및 세포 조작에 기인하는 반응성 산소종(ROS), 세포자멸사 및 괴사의 수준을 저감시켰다.
마우스 피질 뉴런 조직의 조직 절개 및 세포 조작이 동결보존용액(용액, 용액)의 존재 및 부재에서 연구되었다. (도 1a 내지 도 1c에 대해서, 용액/용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.) 새롭게 절개된 조직(프레시)의 조직 절개 및 세포 조작은 반응성 산소종(ROS)을 생성한 반면(도 1a), 절개 없는 조직(모의)에서 약간의 ROS가 관찰되었다. 새롭게 절개된 조직(프레시)은 ROS 발생의 수-배 증가를 일으켰고, 한편 동결보존용액(용액)의 내포는 새롭게 절개된 조직(프레시+용액)에서 ROS 수준을 감소시켰다(도 1a).
도 1b는 비조작 조직(모의)에 비해서 절개(프레시) 후에 증대되었지만, 이것은 ROS 발생(도 1a) 또는 괴사(도 1c)보다 더 적은 정도인 한편, 동결보존용액(+용액)의 내포는 이것을 도로 기준선 수준으로 감소시킨 것을 도시한다. 도 1c는, 괴사가, 조직 조작이 없는 것(모의)에 비해서 조직 절개 및 세포 조작(프레시) 후에 증대되었고, 그 효과가 동결보존용액의 내포(+용액)에 의해 거의 완전하게 제거된 것을 도시한다.
실시예 2. 동결보존용액은 세포 냉동에 이은 후속의 해동으로 인해 반응성 산소종(ROS), 세포자멸사 및 괴사의 수준을 저감시켰다.
세포 뉴런의 냉동/해동이 시간 경과에 따라서 많은 세포 유형에 있어서 ROS, 세포자멸사 및 괴사 마커에 관하여 연구되었다. (도 2a 내지 도 2c에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.) (CypD - 사이클로필린 D) 뉴런의 냉동/해동은 냉동 전 조직(모의)에 비해서 ROS(Nox1의 검출)(냉동)를 생성하였고, 그 효과는 동결보존용액의 내포(+용액)에 의해 거의 완전히 제거되었다(도 2a). 세포자멸사는 냉동 전 조직(모의)에 비해서 냉동/해동(냉동) 후에 약간 증대되었고, 그 효과는 냉동 과정 동안 동결보존용액의 내포(+용액)에 의해 감소되었다(도 2b). 괴사는 냉동 전 조직(모의)에 비해서 세포 냉동/해동(냉동) 후에 크게 증대되었고, 그 효과는 동결보존용액의 내포(+ 용액)에 의해 거의 제거되었다(도 2c).
실시예 3. 동결보호제 용액에서 냉동된 운동 뉴런 줄기세포는 운동 뉴런 동일성을 유지시켰다.
세포 냉동/해동 사이클은 줄기세포로 하여금 운동 뉴런에서 CHAT1의 수준에 의해 측정된 바 이들의 동일성을 손실하게 한다. 배양되고 CHAT1(프레시)을 발현하고 이어서 0.01μM의 cyspA(사이클로스포린 A), 또는 20nM의 Nec1, 또는 5nM의 iMAC2를 포함하는 용액에서 냉동된 줄기세포(운동 뉴런 전구체)는, 이들 화합물의 부재하에 냉동된 줄기세포에 비해서 CHAT1 수준을 유지시켜, 동결 후 (동결된) CHAT1+ 세포의 매우 낮은 수준을 나타낸 것을 도시한다(도 3). 여기(도 3)에 도시된 바와 같이, cyspA, Nec1 및 IMAC2의 각각은 냉동 시 줄기세포에 대한 동결보호를 제공하여, 세포 특성을 유지시켰다. 세포를 냉동시키는데 사용된 용액 내 동결보호제는 CHAT1의 수준에 의해 측정된 바 운동 뉴런 동일성을 유지시켰다.
실시예 4. 동결보존용액은 냉동 절개된 해마 뉴런의 세포 생존율을 유지시켰다.
프레시 대 냉동된 세포 생존율은 동결보존용액의 일 실시형태에 있어서 절개된 세포(해마 뉴런)의 유지에 의해 분석되었다. 뉴런에 대한 세포 생존율은 시험관내에서 7일 후에 측정되었다. 비히클에는 동결보존용액 첨가가 없었던 한편, 네크로스타틴1(Nec1), 사이클로스포린 A(CspA), iMAC2(iMAC2), 또는 이들 3가지 시약의 조합물(조합)은, 냉동/해동 과정 전에 세포에 도입되었다. 일 실시형태(조합 + 관류)에 있어서, 새끼를 어미로부터 분리시키기 바로 수 분 전에 살아있는 임신한 마우스에 3-시약 동결보존용액을 관류시키고, 이어서 해마 뉴런을 E18(배아 일 18) 새끼로부터 단리시켰다. 상이한 성분의 농도는 도 4a에서 사용된 농도의 것들이다. (용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.) 주로 도 4a 그리고 도면들을 통해서: 프레시는 새롭게 절개된 세포를 나타내고; 프레시+용액은 조성물 용액 중 새롭게 절개된 세포를 나타내며; 냉동은 냉동/해동 세포를 나타내고; 냉동+용액은 조성물 용액 중 냉동/해동 세포를 나타낸다. 본 명세서에 개시된 동결보존용액 그 자체는 새롭게 절개된 세포뿐만 아니라 동결보존용액의 실시형태에서 냉동되고 나서 해동된 세포의 생존율 퍼센트를 증가시키는 것이 가능하였다(도 4a). 세포(해마 뉴런)의 대사 중지는 세포 생존율을 증가시켰는데, 여기서 상이한 성분의 동결보존용액에 의해 제공된 생존율 퍼센트가 도시되어 있다(도 4b).
실시예 5. 동결보존용액의 사용은 세포를 손상시키는 과냉각 효과를 회피한다.
비교 연구는 전통적인 배지에 대해서 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소)에서 냉각 동안 시간 경과에 따른 온도의 변화에 대해서 행하였다(도 5). 전통적인 배지에서 일어나는 온도에서의 조기 하향 스파이크의 현저한 부재가 있었다(도 5, 삽도). 따라서, 이들 결과는, 본 명세서에서 사용되는 냉동 과정이 세포를 손상시키는 과냉각 효과를 회피한다.
실시예 6. 동결보존용액은 시간 경과에 따라서 피질 뉴런 세포 및 지방 줄기세포의 세포 생존율을 유지시켰다.
신선한 그리고 냉동된 둘 다의 피질 뉴런 및 지방(지방 조직) 줄기세포에 대한 생존율 및 성장률이 동결보존용액에 관하여 시간 경과에 따라서 관찰되었다. (도 6a 내지 도 6c에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
피질 뉴런 세포 생존율은, 새롭게 절개된 세포가 본 명세서에 개시된 동결보존용액(프레시+용액)에 현탁되거나, 또는 본 명세서에 개시된 동결보존용액(냉동+용액)의 실시형태에서 절개되고 이어서 냉동된 경우 유지되었다(도 6a). 도 6b는 이러한 냉동 조건 및 비냉동 조건이 적용되는 세포를 평판 배양한 후 시간(일자) 경과에 따른 뉴런 생존율 퍼센트의 시간 과정을 도시한다. 동결보존용액의 내포는 냉동 전 10% DMSO에 노출된 동일 세포(냉동) 또는 동결보호제의 어떠한 냉동도 없이 새롭게 절개된 세포(프레시)와 비교되었다.
유사하게, 지방(지방 조직-유래) 줄기세포 생존율은, 새롭게 절개된 세포가 본 명세서에 개시된 동결보존용액(프레시+용액)에 현탁되거나 또는 본 명세서에 개시된 동결보존용액(냉동+용액)의 실시형태에서 절개되고 이어서 냉동된 경우 유지되었다(도 6c). 도 6d는 이러한 냉동 조건 및 비냉동 조건이 적용되는 세포를 평판 배양한 후 시간(일자) 경과에 따른 지방 줄기세포 생존율 퍼센트의 시간 과정을 도시한다. 동결보존용액의 내포는 냉동 전 10% DMSO에 노출된 동일 세포(냉동) 또는 동결보호제의 어떠한 냉동도 없이 새롭게 절개된 세포(프레시)와 비교되었다.
실시예 7. 동결보존용액은 절개 및 냉동/해동 후 세포사멸 세포의 수를 저감시켰다.
동결보존용액을 이용하여 그리고 이용하지 않은 채 절개 및 냉동/해동 후의 1차 간 간세포의 세포자멸사가 연구되었다. (도 7a 내지 도 7b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.) 도 7a는, 본 명세서에 개시된 용액의 부재 중에 현탁된 세포(모의)와 비교된, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 신선한 세포 및 냉동된 세포로부터의 조기 세포사멸 세포(1차 간 간세포)에 대한 동결보호제의 효과의 비교를 도시한다. 동결보존용액(모의)으로 처리되지 않은 냉동된 세포에 대해서, 이러한 세포를 냉동 전에 10% DMSO에 현탁시켰다. 카스파제3(녹색)은 배양액 중 조기 세포사멸 상태에서 세포를 표지화시킨다. 도 7b는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 또는 이러한 용액의 부재하에 현탁된(모의) 신선한 또는 동결 해동된 세포에서의 (아넥신 V 표지화에 의해 정의된 바와 같은) 세포사멸 세포의 수를 도시한다. 동결보존용액의 첨가는 세포사멸 세포의 수를 저감시켰다.
실시예 8. 동결보존용액은 절개 및 냉동/해동 후 괴사성 세포의 수를 저감시켰다.
본 명세서에 개시된, 동결보존용액의 실시형태의 존재 또는 부재하에 현탁된 뉴런 세포의 절개 및 냉동/해동 후의 괴사가 연구되었다. (도 8a 내지 도 8b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 8a는, 본 명세서에 개시된 용액의 부재 중에 현탁된 세포와 비교된, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 신선한 세포 및 냉동된 세포의 용액으로부터의 괴사성 세포의 존재의 비교를 도시한다. 항-사이클로필린 항체는 배양액 중 조기 세포사멸 상태에서 세포를 표지화시킨다. 도 8b는 동결보존용액의 실시형태에서 또는 이러한 용액의 부재하에 수행된 절개 후의 괴사성 세포의 퍼센트를 도시한다. 동결보존용액의 첨가는 괴사성 세포의 수를 저감시켰다.
실시예 9. 동결보존용액은, 통상의 동결보호제인 DMSO에 비해서, 절개 및 냉동/해동 후 반응성 산소종(ROS)의 발생을 저감시켰다.
본 발명의 동결보존용액(용액) 대 통상의 동결보호제(DMSO)에 관하여 절개 및 냉동/해동 후의 피질 뉴런 조직 내 반응성 산소종(ROS)(마커로서의 Nox1)의 발생이 연구되었다. (도 9a 내지 도 9b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 9a는 신선한(식염수 단독에서 절개되고 냉동되지 않은) 뉴런, 동결보존용액에서 절개된 신선한 뉴런(프레시+용액), 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에 현탁된 한편 냉동되고 이어서 해동된 뉴런(냉동+용액) 또는 통상의 동결보호제(10% DMSO, 다이메틸 설폭사이드)의 존재에서 행한 뉴런(냉동)에서의 Nox1 염색을 도시한다. 신선한 또는 해동된 뉴런을 평판 배양하고, 부착시키고 나서 4시간 동안 고착 및 표지화를 행하였다. NADPH 옥시다제(Nox1)는 세포에서 ROS를 표지화시킨다. NeuN은 피질 뉴런(신경교세포 없음)을 염색시킨다. 도 9b는 새롭게 절개된 피질 뉴런 조직 단독(신선한, 청색 막대), 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태의 현탁액에서 절개된 신선한 피질 뉴런 조직(프레시+용액, 적색 막대), 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에서 현탁된 냉동되고 이어서 해동된 세포(냉동+용액, 황색 막대), 또는 10% DMSO의 존재하에 냉동되고 이어서 해동된 세포(녹색 막대)에서의 ROS 발생(Nox1 강도)을 도시한다. 본 발명의 동결보존용액(용액)의 첨가는, 통상의 동결보호제인 DMSO에 관하여 ROS의 발생을 저감시켰다.
실시예 10. 동결보존용액은 통상의 동결보호제인 DMSO보다 더욱 유의하게 운동 뉴런 마커의 뉴런 계통을 보존하였다.
운동 뉴런 마커의 뉴런 계통의 보존(MN 줄기세포 동일성)이 본 발명의 동결보존용액 대 통상의 동결보호제인 DMSO의 비교로서 연구되었다. (도 10a 내지 도 10b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.) 도 10a는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 존재 또는 부재(10% DMSO 단독)에서 냉동 전 또는 후의 뉴런의 현미경사진을 나타낸다. 도 10b는 통상의 동결보존용액(10% DMSO), 및 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태("냉동 조성물 후")에서의 냉동 전후의 세포에서의 운동 뉴런 세포 동일성(CHAT1-양성, S100-양성 면역형광 신호의 존재에 의해 측정됨)를 도시한다. MN 줄기세포 동일성은, 조성물 용액을 이용한 후에, 통상의 동결보호제인 DMSO를 사용한 후보다 더 큰 정도로 보존되었다. 운동 뉴런 마커의 뉴런 계통은 조성물 용액과 비교해서 통상의 동결보호제(10% DMSO)를 이용한 것보다 유의하게 보존되었다.
실시예 11. 동결보존용액은 냉동/해동 후에 간 세포 활성도를 보존하였다.
신선한 샘플과 비교해서, 냉동/해동 후 간 세포 활성도에 대한 동결보존용액의 효과가 연구되었다. (도 11a 내지 도 11b에 대해서, 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소.)
도 11a는, 갈락토사민-유도 전사의 일반적인 척도로서, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 존재 또는 부재(신선한, 냉동되지 않은)하에 인큐베이팅되고, 그리고 간략하게 항체-접합 유리딘(적색 염색)에 대해서 고착 및 염색 전 갈락토사민 없이(-갈락토사민) 또는 갈락토사민으로 자극된, 신선한 간 세포 및 냉동된 간 세포(청색 염색)의 비교를 도시한다. 도 11b는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에서 현탁된 신선한 및 냉동된 세포의 간 세포 전사 활성도의 비교를 도시하며, 여기서 간 세포 활성도는 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 존재에서 세포가 유지된 경우 냉동/해동 후 유사하다. 막대는 항체-접합 유리딘 염색(임의 단위)의 척도가 된다. 1차 마우스 간 세포(간세포)는, 조성물 용액의 존재 하에 냉동/해동 후, 새롭게 절개된 조직에 비해서 행한 것과 유사한 생리학적 특성을 도시한다.
실시예 12. 동결방지 효과에 관하여 네크로스타틴의 몇 가지 유사체의 비교.
네크로스타틴의 몇 가지 유사체는 냉동/해동 후에 이들의 동결방지 효과가 유사하게 작용하도록 연구되고 발견되었다. 도 12는 상이한 네크로스타틴을 포함하는 동결보존용액의 효과를 도시하며, 여기서 네크로스타틴(Nec1(적색 막대), Nec2(황색 막대), Nec3(녹색 막대)의 존재는 통상의 동결보호제(10% DMSO)로 동결보존된 대조 세포(비히클, 청색 막대)에 비해서 1차 마우스 피질 뉴런 세포의 생존율 퍼센트를 유의하게 증대시켰다. 상이한 네크로스타틴의 농도는 20nM이고, "용액"의 다른 성분은 동일, 즉, 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소인 채로 유지된다.
실시예 13. 동결보존용액은 간 세포에서 괴사유발 마커를 저해하였다.
1차 마우스 간 세포(간세포)에서의 괴사유발 마커의 발현은 본 발명의 동결보존용액 또는 통상의 동결보존용액 DMSO 중 어느 하나에서 냉동 전 및 냉동 후에 연구되었다. (본 명세서에서 사용된 동결보존용액은 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소이었다).
도 13a는 통상의 동결보존용액(10% DMSO)에서의 그리고 본 명세서에 개시된 동결보존용액("조성물 냉동")의 실시형태에서의 냉동 전후의 1차 마우스 간 세포(간세포)의 영상을 도시한다. 여기서 세포는 네크롭토시스용 마커로서 HMBG1(녹색)을 인식하는 항체로 염색되어 있다. 도 13b는, 괴사유발 마커가, 10% DMSO("DMSO 냉동")에 비해서, 본 명세서에 개시된 동결보존용액의 실시형태에서의 세포 현탁액에서 유의하게 저해된 것을 나타낸다.
실시예 14. 네크롭토시스-유도 THP-1 세포 내 TNF-알파 생산은 동결보존용액의 사용으로 유의하게 저감되었다.
네크롭토시스-유도 THP-1 세포 내 NF-알파 생산은 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™)에 관하여 연구되었다. 요약하면, 괴사 세포 용해물을 먼저 생성하고 THP-1 세포 사이토카인 생산에 대한 검정에 사용하였다. THP-1 세포를 취하고, 1백만개 세포/㎖에서 완전 배지(2mM 글루타민, 10% 태아소 혈청, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640)에 60㎜ 접시 상에서 배양하고, 0.5 ㎍/㎖의 LPS로 자극시킴으로써 괴사 세포 용해물을 생성하였다. 대략 12시간 후, 세포를 수집하고, 이어서 PBS(10X 용적으로 2회)로 간단히 세척하고, 이어서 1백만개 세포/㎖의 완전 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 이들 세포는 액체 질소로 냉동시키고 37℃에서 해동시키는 것을 반복함으로써(5 내지 6 사이클) 괴사 유도에 사용하였다. 4℃에서 20분 동안 15K R.P.M.(24K×g)에서 원심분리에 의해 이들로부터 용해물을 제조하고, 이어서 신선한 배지와 함께 50% 용적/용적 비에서 신선하게 배양된 THP-1 세포에 첨가하였다. 이 배지에, 0.5 ㎍/㎖에서의 LPS를 또한 최대 사이토카인 생산을 위하여 첨가하였다. 제조 프로토콜에 따라서 ELISA 키트(R&D Systems, 미네소타주 미니애폴리스)를 이용해서 배양된 상청액에서 TNF-알파 및 IL-6 단백질 농도를 측정하였다. 각 샘플은 표준 공지된 사이토카인 단백질 측정치를 기준으로 해서 두 벌로 검정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균치 + 평균치의 표준오차(S.E.M.)이다. p값은 스튜던트 t-검정을 이용해서 계산되었다.
전염증성 사이토카인을 생산하기 위하여 THP-1 세포를 배양하고 지질다당류(LPS)와 조합된 괴사 세포 용해물에 의해 유도된 후의 TNF-알파에 대한 TELISA 검정 결과. 도 14는 모의 자극(1-3), LPS 자극 단독(4 내지 6), 동결보존 프로토콜에서 사용된 10% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 중 LPS 자극(7 내지 9), 동결보존 프로토콜에서 사용된 100% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 중 LPS 자극(10 내지 12) 후의 TNF-알파 수준(pg/㎖)을 도시한다. (*) 모의(1 내지 3)와 LPS 단독(4 내지 6) 간 그리고 LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 10% EVERGREEN™ 배지 용액(7 내지 9) 간의 유의차(p<0.01). (**) LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 100% EVERGREEN™ 배지 용액(10 내지 12) 간의 유의차(p<0.001).
네크롭토시스-유도 THP-1 세포 중 TNF-알파 생산은 본 발명의 EVERGREEN™ 동결보존용액으로 유의하게 저감되었다.
실시예 15. 네크롭토시스-유도 THP-1 세포 내 IL-6 생산은 동결보존용액으로 유의하게 저감되었다.
네크롭토시스-유도 THP-1 세포 내 IL-6 생산은 본 발명의 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™)의 효과에 관하여 연구되었다.
요약하면, 괴사 세포 용해물을 먼저 생성하고, THP-1 세포 사이토카인 생산에 대한 검정에서 사용하였다. THP-1 세포를 취하여 1백만개 세포/㎖에 완전 배지(2mM 글루타민, 10% 태아소 혈청, 100U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640)에 60㎜ 접시 상에서 배양하고, 0.5 ㎍/㎖의 LPS로 자극시킴으로써 괴사 세포 용해물을 생성하였다. 대략 12시간 후, 세포를 수집하고, 이어서 PBS(10X 용적으로 2회)로 간단히 세척하고, 이어서 1백만개 세포/㎖의 완전 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 이들 세포는 액체 질소로 냉동시키고 37℃에서 해동시키는 것을 반복함으로써(5 내지 6 사이클) 괴사 유도에 사용하였다. 4℃에서 20분 동안 15K R.P.M.(24K×g)에서 원심분리에 의해 이들로부터 용해물을 제조하고, 이어서 신선한 배지와 함께 50% 용적/용적 비에서 신선하게 배양된 THP-1 세포에 첨가하였다. 또한 이 배지에, 0.5 ㎍/㎖의 LPS를 최대 사이토카인 생산을 위하여 첨가하였다. 제조 프로토콜에 따라서 ELISA 키트(R&D Systems, 미네소타주 미니애폴리스)를 이용해서 배양된 상청액에서 TNF-알파 및 IL-6 단백질 농도를 측정하였다. 각 샘플은, 표준 공지된 사이토카인 단백질 측정치를 기준으로 해서 두 벌로 검정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균치 + 평균치의 표준오차(S.E.M.)이다. p값은 스튜던트 t-검정을 이용해서 계산되었다.
전염증성 사이토카인을 생산하기 위하여 THP-1 세포를 배양하고 지질다당류(LPS)와 조합된 괴사 세포 용해물에 의해 유도된 후의 IL-6에 대한 ELISA 검정 결과. 도 15는 (1 내지 3) 모의 자극, (4 내지 6) LPS 자극 단독, (7 내지 9) 동결보존 프로토콜에 사용된 10% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 하의 LPS 자극, (10 내지 12) 동결보존 프로토콜에 사용된 100% 활성 수준의 EVERGREEN™ 배지 용액의 존재 하의 LPS 자극 후에 측정된 IL-6 수준(pg/㎖)을 도시한다. (*) 모의(1 내지 3)와 LPS 단독(4 내지 6) 간, 그리고 LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 10% EVERGREEN™ 배지 용액(7 내지 9) 간의 유의차(p<0.01). (**) LPS 단독(4 내지 6)과 LPS + 100% EVERGREEN™ 배지 용액(10 내지 12) 간의 유의차(p<0.001).
네크롭토시스-유도 THP-1 세포의 IL-6 생산은 본 발명의 EVERGREEN™ 동결보존용액에 의해 유의하게 감소되었다.
실시예 16. 동결보존용액을 이용하는 IL-6 사이토카인 방출 척도의 일관성.
본 발명의 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™)은 사이토카인 방출 척도의 유의한 일관성을 나타냈다(도 16). 변산도 퍼센트는 각 (3회의) 실험(n=3)의 오차 퍼센트를 평균하고 각 군의 (자극된, 10% EVERGREEN™, 100% EVERGREEN™) 변산도 퍼센트를 모의(대조) 자극된 군 생존율에 대한 비로서 표현함으로써 계산되었다. 이것으로부터, EVERGREEN™(10% 수준과 100% 수준 둘 다에서)을 사용하지 않고도 생존율의 대략 100% 증가가 있다.
실시예 17. 냉동/해동 후의 뉴런 생존율의 일관성은 통상의 동결보존용액에 의한 것보다 본 발명의 동결보존용액에 의해 더 크다.
본 발명의 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™)은 통상의 동결보존용액인 DMSO에 비해서 냉동/해동 후 유의하게 일관해서 더 높은 뉴런 생존조를 제공하였다(도 17). EVERGREEN™ 배지 용액은 다이메틸 설폭사이드(DMSO)에 비해서 1차 마우스 해마 뉴런을 냉동시키는데 사용되었고, 해동 후의 생존율을 측정하고 플롯팅하였다. 5개의 독립적인 실험을 측정하였다.
실시예 18. 통상의 동결보존용액에 비해서 본 발명의 동결보존용액에 의한 냉동-해동 후의 뉴런 세포 생존율의 일관성.
본 발명의 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™)은, 통상의 동결보존용액인 DMSO에 비해서 냉동/해동 후 뉴런 세포 생존율의 유의한 일관성을 유도하였다(도 18). 변산도 퍼센트는 각 실험(n=5)의 중앙치를 평균하고 각 군의 개별적인 측정치를 이 평균치에 대한 개별적인 값의 비로서 표현함으로써 계산하였다. 이것으로부터, 편차 퍼센트를 계산하고 중앙값에 대한 비로서 표현하였다. 이것으로부터, EVERGREEN™ 배지 용액을 사용하지 않고도 생존율의 대략 300% 증가가 있다.
실시예 19. 본 발명의 동결보존용액에 의한 냉동-해동 후 유지된 뉴런 세포 활성도.
뉴런 세포 활성도에 대한 본 발명의 동결보존용액(EVERGREEN™ 배지 용액: 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 0.01μM의 사이클로스포린 A 및 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소; EVERLAST™)의 냉동-해동 효과가 연구되었다.
요약하면, 해마 뉴런은 새롭게 절개되거나(전) 또는 Evergreen 배지에서 냉동된 후 48 내지 72시간 후에 해동되고(후), 시험관내에서 배양액에 배치되었다. 시험관내에서 17 내지 19일 후 뉴런 배양액은 Zeiss Axiozoom 스테이지에서 기록실에 배치되고, 표준 기록 매체에서 세척되었다. 뉴런은 하기를 함유하는 패치 클램프 피펫으로 기록되었다: 130mM K-글루코네이트, pH 7.3, 10mM KCl, 0.1mM EGTA, 5mM NaCl, 10mM HEPES, 0.3mM 나트륨-GTP, 및 5mM 포스포크레아틴, 1mM Mg-ATP(5 내지 10㏁ 저항 범위). 신호는 AxoPatch 200A/AxoClamp2 증폭기에서 증폭되고 pClamp8로 기록되었다.
도 19A는 (휴지 막 전위에서의) 전체 세포 전류 클램프 기록을 나타내는 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 20 밀리볼트(㎷) 크기를 나타내고 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19B는 (휴지 막 전위에서의) 전체 세포 전류 클램프 기록을 나타내는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 후의 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 20 밀리볼트(㎷) 크기를 나타내고 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19C는 활동 전위 방전의 평균 빈도를 나타내는 전류 클램프 데이터에 대한 5분 기록 간격에 걸친 누적 빈도를 도시한다. 값은 적어도 4개의 독립적인 실험의 평균±SE(표준 오차)이고, 이는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전 또는 후에 통계학적 유의차(p>0.7, 스튜던트 t-검정)를 보이지 않는다.
도 19D는 (-60㎷에서) 전체 세포 전압 클램프 기록을 나타내는 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 200 피코암페어(pA) 크기를 나타내고, 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19E는 (-60㎷에서) 전체 세포 전압 클램프 기록을 나타내는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 후의 새롭게 절개된 마우스 뇌로부터의 해마 뉴런이 배양액 중 네트워크 활성도를 입증하는 것을 도시한다. 수직 막대는 200 피코암페어(pA) 크기를 나타내고, 수평 막대는 2초(sec)의 기록을 나타낸다. 도 19F는 활동 전위 방전의 평균 빈도를 나타내는 전압 클램프 데이터에 대한 5분 기록 간격에 걸친 누적 빈도를 도시한다. 값은 적어도 4개의 독립적인 실험의 평균±SE(표준 오차)이고, 이는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전 또는 후에 통계학적 유의차(p>0.8)를 보이지 않는다.
도 19G는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전(하부 선, 새롭게 절개된) 및 후(우측 선) 둘 다의 두 인접한 연결된 해마 뉴런으로부터의 휴지 전위에서의 전류 클램프 모드(하부 선) 및 시냅스후 흥분성 시냅스 반응(상부 선)(하부 시냅스전 뉴런으로부터의 액손의 말미에서 흑색 원으로서 좌측에 개략적으로 도시됨)을 나타내는 유발 시냅스전 활동 전위를 도시한다. 여기서, 흥분성 시냅스후 전류(EPSC)는 처리 간에 통계학적으로 차이가 없다(처리 전의 실제값 71+/-23pA 대 처리 후의 값 76+/-28pA). 대표적인 선(트레이스)은 n=19 내지 22개의 뉴런, 각 처리에 대해서 적어도 3개의 독립적인 실험(p>0.7, 스튜던트 t-검정)으로부터 유래된다. 수직 막대는 전류 클램핑된 뉴런에 대해서 20 피코암페어(pA)(시냅스전, 하부 선) 및 흥분성 시냅스 반응에 대해서 20 밀리볼트(㎷)(시냅스후, 상부 선)를 나타내고; 수평 막대는 20 밀리초(㎳)의 기록을 나타낸다. 도 19H는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전(폐쇄 원) 및 후(개방 원) 둘 다의 19개 해마 뉴런(G 부분에서 측정됨)에 대한 시냅스전 반응 대 시냅스후 반응(전/후)에 대한 유발 활동 전위 진폭비를 도시한다. 평균 비는 EVERGREEN™ 배지 용액을 이용한 냉동/해동 전후의 뉴런에 대해서 통계학적으로 차이가 없다(p>0.7, 스튜던트 t-검정)(냉동/해동 전에 대한 평균값 71+/- 23pA 대 냉동/해동 후에 대한 76+/-28pA). X값은 각 처리에 대한 뉴런 수에 대응한다.
따라서, 해마 뉴런은 Evergreen 배지를 사용해서 (신선하게 절개되기) 전 및 냉동/해동 후 구별하기 어려운 생리학적 특성을 나타낸다. 17 내지 19 배아 일의 뉴런의 패치 클램프는 자발 뉴런 활성도와 유발 뉴런 활성도 둘 다로부터의 전류 및 전압 프로파일을 나타낸다.
구체적인 실시형태의 상기 설명은 본 발명의 일반적인 속성을 충분히 드러나게 하여, 그 밖의 것들이, 현재의 지식을 적용함으로써, 과도한 실험 없이 그리고 포괄적인 개념으로부터 벗어나는 일 없이, 이러한 구체적인 실시형태를, 각종 응용을 위하여 용이하게 변형 및/또는 적응시킬 수 있게 하고, 따라서, 이러한 적응 및 변형은 개시된 실시형태의 등가물의 의미 및 범위 내에서 이해되도록 의도되어야 한다. 본 명세서에서 이용되는 어법 또는 용어는 제한이 아니라 설명의 목적을 위한 것임이 이해되어야 한다. 각종 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 재료 및 단계는 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 각종 대안적인 형태를 취할 수 있다.

Claims (56)

  1. 조성물로서,
    네크롭토시스 저해제(necroptosis inhibitor) 화합물 및 Bax 통로 저해제(Bax channel inhibitor) 화합물을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 상기 Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온, 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온 화합물, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온 화합물, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드 화합물, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드 화합물, 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸) 페닐)유레아 화합물, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온 화합물, 또는 상기 네크롭토시스 저해제 화합물의 유사체, 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염은, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 상기 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.2nM 내지 2μM인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.5nM 내지 50μM인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 또는 초산화물 불균등화효소(superoxide dismutase), 또는 이들의 임의의 조합물을 더 포함하는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소는 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소를 포함하는, 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 NAD의 농도는 약 5nM 내지 500μM인, 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ATP의 농도는 약 10nM 내지 1mM인, 조성물.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클로스포린 A의 농도는 약 1nM 내지 1mM인, 조성물.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초산화물 불균등화효소의 농도는 약 0.001- 100 쿠니츠 단위(KU)인, 조성물.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20nM의 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온), 약 5nM의 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 약 0.05mM의 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 약 0.01μM의 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 약 0.01μM의 사이클로스포린 A, 및 약 0.1 쿠니츠 단위의 망간 초산화물 불균등화효소 또는 아연 초산화물 불균등화효소를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 동결보호제를 더 포함하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 동결보호제는 DMSO, 또는 혈청, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는, 조성물.
  16. 동결보존 방법으로서,
    (a) 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)의 상기 복수의 세포를 포함하는 상기 조성물을 냉각시키는 단계를 포함하되,
    상기 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 상기 Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 동결보존 방법.
  17. 복수의 세포에서 세포 가소성(cellular plasticity), 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법으로서,
    상기 복수의 세포를, 네크롭토시스 저해제 화합물 및 Bax 통로 저해제 화합물을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 네크롭토시스 저해제 화합물은 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하고, 상기 Bax 통로 저해제는 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 네크롭토시스 또는 괴사는 노화 또는 질환과 연관된, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 질환은 심근경색증, 베타-세포 네크롭토시스에 부차적인 당뇨병, 담즙정체성 간 질환, 뇌졸중, 장기 허혈, 허혈-재관류 손상, 간 질환, 암 화학요법 또는 방사선 요법으로부터의 괴사, 외상성 뇌손상, 괴사성 췌장염, 병원체-유도 네크롭토시스, 염증, 또는 신경퇴행성 질환인, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 것은, 상기 세포 가소성, 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 시험관내 또는 생체내 또는 생체외에서 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 것을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포는 조직 배양 세포, 1차 세포, 달걀 세포, 조직, 또는 장기 또는 이의 일부, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조직 배양 세포 또는 1차 세포는 줄기세포, 성체 세포, 전환분화 세포, 탈분화 세포, 또는 분화 세포, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포는 인간 세포 또는 동물 세포를 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수행되는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 생체내 또는 생체외에서의 접촉은 동물 또는 이의 일부, 장기 또는 이의 일부, 또는 조직의 관류를 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 관류는 심장 관류인, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  27. 제24항에 있어서, 시험관내에서 접촉시키는 것은, 상기 조성물에 상기 복수의 세포를 침지시키는 것, 상기 복수의 세포의 성장 배지를 상기 조성물로 보충하는 것, 상기 복수의 세포를 비-열 가역성 전기천공을 통해서 상기 조성물로 관류시키는 것, 또는 상기 복수의 세포를 생물반응기에서 상기 조성물로 관류시키는 것을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포의 물리적, 화학적 또는 열역학적 조작 단계를 더 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 열역학적 조작은 상기 복수의 세포를 가열 또는 냉각시키는 것을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 냉각시키는 것은 동결보존 또는 냉동-해동 사이클, 또는 이들의 조합을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  31. 제16항 및 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은, 미접촉 복수의 세포와 비교하여, 상기 복수의 세포의 괴사 또는 괴저성 사멸을 상기 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 예방, 저해 또는 저감시키는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  32. 제16항 및 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 복수의 세포를 상기 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 물리적 손상으로부터 보호하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  33. 제16항 및 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 복수의 세포의 성장 가능성을 미접촉 세포와 비교해서 동결보존 동안 증대시키는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  34. 제16항 및 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 복수의 세포에 대한 산화 손상을 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 예방하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  35. 제16항 및 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 허혈을 동결보존 또는 이의 냉동-해동 사이클 동안 예방하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  36. 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 괴사 경로 신호전달을 저해하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  37. 제16항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 분화 상태의 변화를 예방, 저해 또는 저감시킴으로써, 미접촉 세포와 비교해서 상기 세포의 동일성(identity)을 안정화시키는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  38. 제16항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 세포의 대사 중지(metabolic suspension) 상태를 유도하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 대사 중지는 산소 대사의 가역적 중단을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  40. 제16항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 미접촉 복수의 세포와 비교해서 상기 세포의 생존율(viability) 또는 잠재적 생존율을 개선시키는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  41. 제16항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네크롭토시스 저해제는 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 3-p-메톡시페닐-5,6-테트라메틸레노티에노[2,3-d]피리미딘-4-온-2-머캅토에틸사이나이드 화합물, (Z)-5-((3-(4-플루오로페닐)-1H-피라졸-4-일)메틸렌)-2-이미노-3-(티아졸-2-일)티아졸리딘-4-온, 5-(인돌-3-일메틸)-(2-티오-3-메틸)히단토인, 메틸-티오히단토인-트립토판 화합물, 1-([3S,3aS]-3-[3-플루오로-4-[트라이플루오로메톡시]페닐]-8-메톡시-3,3a,4,5-테트라하이드로-2H-벤조[g]인다졸-2-일)-2-하이드록시에탄온, (S)-N-(1-[2-클로로-6-플루오로페닐]에틸)-5-사이아노-1-메틸-1H-피롤-2-카복스아마이드, (E)-N-(4-(N-(3-메톡시피라진-2-일)설파모일)페닐)-3-(5-나이트로티오페네-2-일)아크릴아마이드, 1-(4-(4-아미노퓨로[2,3-d]피리미딘-5-일)페닐)-3-(2-플루오로-5-(트라이플루오로메틸)페닐)유레아, 또는 2,2-다이메틸-1-(5(S)-페닐-4,5-다이하이드로-피라졸-1-일)-프로판-1-온, 또는 상기 네크롭토시스 저해제 중 어느 하나의 유도체, 이성질체, 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  42. 제16항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물 또는 상기 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.2nM 내지 2μM이고, 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 0.5nM 내지 50μM인, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  43. 제16항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(NAD), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 사이클로스포린 A, 망간-초산화물 불균등화효소, 또는 아연-초산화물 불균등화효소, 또는 이들의 임의의 조합을 더 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 NAD의 농도는 약 5nM 내지 500μM이고, 상기 ATP의 농도는 약 10nM 내지 1mM이고, 상기 사이클로스포린 A의 농도는 약 1nM 내지 1mM이고, 상기 망간-초산화물 불균등화효소 또는 상기 아연-초산화물의 농도는 약 0.001KU 내지 100.0KU인, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 네크롭토시스 저해제 화합물인 5-((7-클로로-1H-인돌-3-일)메틸)-3-메틸-2,4-이미다졸리딘다이온 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 20nM이고, Bax 통로 저해제인 3,6-다이브로모-α-(1-피페라진일메틸)-9H-카바졸-9-에탄올 이염산염 화합물, 또는 이의 유사체, 유도체, 이성질체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 농도는 약 5nM이고, 상기 NAD의 농도는 약 0.05nM이고, 상기 ATP의 농도는 약 0.01μM이고, 상기 사이클로스포린 A의 농도는 약 0.01μM이고, 상기 망간-초산화물 불균등화효소 또는 상기 아연-초산화물의 농도는 약 0.1KU인, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  46. 제16항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 동결보호제를 더 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 동결보호제는 DMSO, 또는 혈청, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  48. 제16항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는, 복수의 세포에서 세포 가소성, 또는 네크롭토시스 또는 괴사의 발생을 치료, 예방, 저해 또는 저감시키는 방법.
  49. 과잉 괴사 및 괴사유발 세포사를 예방하는데 사용하기 위한 조성물로서,
    괴사- 또는 네크롭토시스-유도 손상-연관 분자 패턴(damage-associated molecular pattern: DAMP)의 적어도 하나의 저해제를 포함하는, 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 저해제는 항체, 단백질, 펩타이드, 소분자 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는, 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 DAMP는 리폭시게나제 저해제, 스핑고미엘린분해효소 저해제, 포스포리파제 저해제, 세라미다제 저해제 패턴-인식 수용체(PRR) 리간드, 톨-유사 수용체(TLR) 리간드, 레티노산-유도 유전자 I-유사 수용체(RIG-I-유사) 수용체(RLR) 리간드, 뉴클레오타이드-결합 도메인 및 류신-풍부 반복 함유 분자(NLR) 리간드, C-형 렉틴 수용체(CLR) 리간드, 또는 사멸 수용체 리간드를 포함하는, 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 리간드는 고이동도 그룹 박스 1 단백질(HMGB1), 열-충격 단백질(HSP), 리보뉴클레오단백질(RNP), 전령 리보핵산(mRNA), 고이동도 그룹 뉴클레오솜 결합 도메인 1(HMGN1), 하이알루로난, 바이글리칸, 헤파린 황산염, U1 소핵소체 리보뉴클레오단백질(snRNP), 미토콘드리아 DNA, 또는 이중-가닥 RNA(dsRNA)을 포함하는, 조성물.
  53. 제51항에 있어서, 상기 사멸 수용체는 종양 괴사 인자 수용체 1(TNFR1), 종양 괴사 인자 수용체 2(TNFR2), CD95/FAS 수용체, TNF-관련 세포사멸-유도 리간드 수용체 1(TRAILR1) 및 TRAILR2를 포함하는, 조성물.
  54. 제51항에 있어서, 상기 사멸 수용체 리간드는, 탈유비퀴틴화 효소, 사멸 도메인을 가진 FAS-연관 단백질(FADD), 리보플라빈 키나제(RFK), 종양 괴사 인자, TNFR2, FAS 리간드(FASL 또는 CD95L), 및 TNFR-연관 사멸 도메인(TRADD)을 포함하는, 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 탈유비퀴틴화 효소는, A20(TNFAIP3), OTUD7b, 원주세포종증(cylindromatosis)(cylD) 및 USP21을 포함하는, 조성물.
  56. 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, pH 안정제, 당, 아미노산, 또는 항생제, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는, 조성물.
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