KR20230014086A - 사멸성 만능 줄기 세포 - Google Patents

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KR20230014086A
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자우-난 리
유타 리
토니 퉁-인 리
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액셀러레이티드 바이오사이언시스 코포레이션
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Abstract

배아외 줄기 세포, 예컨대 영양막 줄기 세포로부터 시험관내에서 생산된 사멸성 만능 줄기 세포, 이의 조성물 및 이의 용도가 본원에 개시되어 있다. 또한, 세포 집단을 생산하기 위해 하나 이상의 유도제와 함께 시험관내에서 생산된 사멸성 만능 줄기 세포를 배양하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 또한, 본원에 개시된 세포 및 이로부터 분화된 세포를 활용함으로써 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있다.

Description

사멸성 만능 줄기 세포
상호 참조
본 출원은 2020년 5월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 63/020,247의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
배경
기존의 배아 줄기 세포 및 iPS 세포의 특정 단점을 극복하기 위한 대안으로서 다양한 질환 또는 병태를 치료하기 위한 신규 줄기 세포에 대한 필요성이 존재한다.
참조로 포함
본원의 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 본원의 용어 및 포함된 참고문헌의 용어 사이에 충돌이 있는 경우, 본원의 용어가 우선한다.
이러한 발명의 내용란에 제공된 본 발명의 실시양태는 단지 예시를 위한 것이며, 본원에 개시된 선택적인 실시양태의 개요를 제공하기 위한 것이다. 예시적이고 선택적인 발명의 내용란은 임의의 청구범위의 범주를 제한하지 않으며, 본원에 개시되거나 고려된 본 발명의 실시양태의 전체 범주를 제공하지 않으며, 본 개시내용 또는 임의의 청구된 본 발명의 실시양태의 범주를 제한하거나 구속하는 것으로 해석되어서는 안된다.
많은 측면 중 일부에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현하고, 여기서 MPSC 집단은 MPSC 배양 시작으로부터 90일 이내에 최대 적어도 89 집단 배가에 도달할 수 있다. 일부 경우에, MPSC 집단은 MPSC 배양 시작으로부터 90일 이내에 약 89 내지 약 100 집단 배가에 도달할 수 있다. 일부 경우에, MPSC 집단은 MPSC 배양 시작으로부터 약 12일 이내에 약 25 내지 약 30 집단 배가, 약 30일 이내에 약 50 내지 약 55 집단 배가, 및/또는 약 63일 이내에 약 75 내지 약 80 집단 배가에 도달할 수 있다. 일부 경우에, MPSC 집단은 약 22 내지 약 27시간, 예를 들어 약 25시간 내에 배가될 수 있다. 일부 측면에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현하고, 여기서 MPSC 집단은 병원체가 없다.
일부 경우에, 본원에 개시된 MPSC는 병원체가 없다. 일부 경우에, MPSC는 박테리아가 없다. 일부 경우에, MPSC는 바이러스, 예를 들어 시토메갈로바이러스가 없다. 일부 경우에, MPSC는 EBV (엡스타인-바 바이러스), HAdV (인간 아데노바이러스), HCMV (인간 시토메갈로바이러스), 간염 바이러스 (예를 들어, A형 간염, B형 간염 및/또는 C형 간염), 인간 헤르페스 바이러스 (예를 들어, HHV 6 (인간 헤르페스 바이러스 6) 및/또는 HHV 8 (인간 헤르페스 바이러스 8)), 인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV1 (인간 면역결핍 바이러스 1), HIV2 (인간 면역결핍 바이러스 2)), 인간 파필로마바이러스 (예를 들어, HPV16, HPV18 등), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (예를 들어, HSV 1 (헤르페스 심플렉스 1), HSV 2 (헤르페스 심플렉스 2) 등), 인간 T-림프친화성 바이러스 (예를 들어, HTLV 1 (인간 T-림프친화성 바이러스 1), HTLV 2 (인간 T-림프친화성 바이러스 2) 등), VZV (수두 바이러스), 코리네박테리움 보비스(Corynebacterium bovis), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.) (HAC2), 한타바이러스 (예를 들어, 한타안, 서울 또는 신 놈브레), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 미코플라스마 종(Mycoplasma sp.), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 병원체가 없다.
일부 경우에, 본원에 개시된 MPSC 또는 MPSC를 포함하는 집단은 베타 인간 융모막 고나도트로핀 (b-HCG), 열 충격 단백질 90 (HSP90), 꼬리형 호메오박스 2 (CDX2), 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 (FGFR1), pAKT, pCREB1 (CAMP 반응성 요소 결합 단백질 1), 인간 림프구 항원 A (HLA-A), HLA-B 또는 HLA-C 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC 집단은 살해 세포 이뮤노글로불린 유사 수용체 4 (KIR2DL4), FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L), NKp46, T 세포 수용체 (TCR), 이뮤노글로불린-유사 전사체 4 (ILT-4), CD49f, CD3, CD4, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD16, CD19, CD34, CD38, CD44, CD56, CD90/Thy-1, CD105, CD141, CD146, CD166 또는 CD107a 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC 집단은 인터류킨 6 (IL-6), IL-8, 단핵구 화학유인물질 단백질-1 (MCP-1), CLXL2, 혈소판-유래 성장 인자 AA (PDGF-AA), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 플라스미노겐 활성화제 억제제 1 (PAI-1) 또는 IL-10 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC의 적어도 일부는 Ki-67, 열 충격 단백질 70 (HSP70), p53 또는 신시틴 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC 집단 (예를 들어, 적어도: 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)은 CD44, CD90, CD105, CD146, CD166, HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 중 하나 이상의 단백질을 발현한다. 일부 경우에, MPSC의 적어도 일부는 CD19, CD45 또는 HLA-DR 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC의 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과는 CD19, CD45 또는 HLA-DR 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC 집단은 CD16 또는 CD56 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC의 적어도 일부는 CD3을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC의 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과는 CD3을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC 집단의 적어도 65% 또는 적어도 70%는 HLA-G를 발현한다. 일부 경우에, HLA-G는 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 또는 HLA-G7 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, HLA-G는 HLA-G2, HLA-G4, HLAG-6 또는 HLA-G7 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, HLA-G는 HLAG-6 또는 HLA-G7 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, MPSC 집단의 15% 미만 (예를 들어, 10% 미만)은 HLA-G1을 발현한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 MPSC 집단의 적어도 10%는 모노클로날이다. 일부 경우에, MPSC 집단의 약 13% 내지 약 15%는 모노클로날이다. 일부 경우에, 적어도 약 1×106개의 MPSC가 집단에 존재한다. 일부 경우에, MPSC는 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 안정적인 핵형을 갖는다. 일부 경우에, MPSC는 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 집단 배가로부터의 염색체 이상을 경험하지 않는다. 일부 경우에, 여기서 MPSC는 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 동결 및 해동으로부터의 실질적인 염색체 이상을 경험하지 않는다.
일부 경우에, 본 개시내용은 MPSC의 계대배양물을 배양 배지에 약 1,000 내지 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하는 단계, 및 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 MPSC 집단을 성장시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단을 성장시키는 방법으로서, MPSC의 계대배양물을 배양 배지에 약 1,000 내지 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하는 단계, 및 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현한다. 일부 경우에, 배양 배지는 동물 구성성분이 없다. 일부 경우에, 배양 배지는 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청이 없다. 일부 경우에, 세포는 3일 동안 배양된다. 일부 경우에, 세포는 4일 동안 배양된다. 일부 경우에, MPSC는 약 2,000 내지 약 4,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 MPSC 집단을 하나 이상의 유도제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 생산하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 생산된 세포는 외배엽 세포를 포함할 수 있다. 생산된 세포는 중배엽 세포를 포함할 수 있다. 생산된 세포는 내배엽 세포를 포함할 수 있다. 생산된 세포는 췌장 세포 또는 췌장 선조 세포를 포함할 수 있고, 임의로 유도제는 2-메르캅토에탄올 및 니코틴아미드를 추가로 포함할 수 있는 bFGF (염기성 섬유모세포 성장 인자)를 포함한다. 한 실시양태에서, PPC는 β-HCG, CDX2, HLA-G 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, PPC는 β-HCG 및 CDX2; β-HCG 및 HLA-G; CDX2 및 HLA-G; 또는 HCG, CDX2 및 HLA-G를 포함한다. 임의로, 일부 경우에, PPC는 PDX1, FOXA2, SOX9 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 생산된 세포는 신경 세포 또는 신경 선조 세포를 포함할 수 있고, 임의로 유도제는 레티노산을 포함한다. 한 실시양태에서, NCS 세포는 레티노산 수용체 베타 (RAR-β), CDX2, HLA-G 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, NCS 세포는 RAR-β 및 CDX2; RAR-β 및 HLA-G; CDX2 및 HLA-G; 또는 RAR-β, CDX2 및 HLA-G를 포함한다. 임의로, 일부 경우에, PPC는 N-CAD, 신경상피 줄기 세포 단백질 (NESTIN), SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 (SOX2), 페어드 박스 6 (PAX6), 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 생산된 세포는 간 세포 또는 간 선조 세포를 포함할 수 있고, 임의로 유도제는 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 예컨대 FGF2, 스테로이드, 예컨대 덱사메타손, 및 시토카인, 예컨대 온코스타틴 M을 포함하며, 이는 골 형태발생 단백질 (BMP), 예를 들어 BMP4 및/또는 간 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, FGF는 FGFR1에 결합하고, 이는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF8, FGF10, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 또는 FGF23이다. 일부 경우에, 스테로이드는 글루코코르티코이드 스테로이드, 예를 들어 덱사메타손, 베타메타손, 부데소나이드, 코르티손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 또는 트리암시놀론이다. 일부 경우에, 시토카인은 인터류킨 6 (IL-6) 그룹 시토카인, 예를 들어 온코스타틴 M, 예를 들어 인간 온코스타틴 M, IL-6, 인터류킨-11, 백혈병 억제 인자 (LIF), 섬모상 신경영양성 인자 (CNTF), 카디오트로핀-1 (CT-1), 및 카디오트로핀-유사 시토카인 (CLC)이다. 생산된 세포는 자연 살해 세포를 포함할 수 있고, 유도제는 FGF, 예를 들어 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF8, FGF10, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 또는 FGF23을 포함한다. 한 실시양태에서, 자연 살해 세포는 CD16+, CD56+ 및 CD3-이다. 일부 경우에, 자연 살해 세포는 추가로 HLA-G+ 및 CDX2+이다.
생산된 세포는 지방세포, 연골세포, 골세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포 및 연골세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포 및 골세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 연골세포 및 골세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포, 연골세포 및 골세포를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포를 포함한다. 지방세포는 렙틴, 호메오박스 C8 (HOXC8), 호메오박스 C9 (HOXC9), 언커플링 단백질 1 (Ucp1), 세포 사멸 유도 DFFA 유사 이펙터 A (CIDEA), PR 도메인 함유 16 (PRDM16), Zic 패밀리 구성원 1 (Zic1), LIM 호메오박스 8 (Lhx8), Eva1, 상피 간질 상호작용 1 (Epsti1), Cd137, 막횡단 단백질 26 (Tmem26), T-박스 전사 인자 1 (Tbx1), Glu/Asp 풍부 카르복시-말단 도메인 1을 갖는 Cbp/P300 상호작용 트랜스활성화제 (Cited1), 단신 호메오박스 2 (Shox2), 아미노산 수송체 ASC-1, 아미노산 수송체 PAT2, 퓨린성 수용체 P2RX5, 지방 트리글리세리드 리파제 (ATGL), 카베올린 1 (CAV1), 지방산 결합 단백질 4 (FABP4), 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 4 (COX4), 라민 B1 (LMNB1), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 경우에, 지방세포는 백색 지방세포를 포함하고, 여기서 백색 지방세포는 렙틴, HOXC8, HOXC9 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 경우에, 지방세포는 갈색 지방세포를 포함하고, 여기서 갈색 지방세포는 Ucp1, CIDEA, PRDM16, Zic1, Lhx8, Eva1, Epsti1 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 경우에, 지방세포는 베이지색 지방세포를 포함하고, 여기서 베이지색 지방세포는 Cd137, Tmem26, Tbx1, Cited1, Shox2 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 경우에, 지방세포는 베이지색 지방 세포 전구체를 포함하고, 여기서 베이지색 지방 세포 전구체는 CD137, TMEM26 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 연골세포를 포함한다. 연골세포는 아넥신 A6, CD44, CD151, ITM2A, 서열 유사성 구성원 20-B를 갖는 패밀리 (FAM20B), 포크헤드 박스 C1 (FoxC1), FoxC2, SOX5, SOX6, SOX9, 아그레칸, 카텝신 B, 콘드로어드헤린 유사 (CHADL), 콘드로어드헤린, 콜라겐 II, 콜라겐 IV, 연골 산성 단백질 1 (CRTAC1), 더마탄 술페이트 프로테오글리칸 3 (DSPG3), 인테그린 결합 시알로단백질 (IBSP)/시알로단백질 II, 마트릴린-1, 마트릴린-3, 마트릴린-4, MIA, 오토라플린/OTOR, URB 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 골세포를 포함한다. 골세포는 전골모세포, 골모세포, 포매 골모세포, 유골 골세포, 무기질화 골세포 또는 성숙 골세포를 포함할 수 있다. 골세포는 RUNX 패밀리 전사 인자 2 (RUNX2), 오스테오칼신 (OCN), E11, 상아질 매트릭스 산성 인단백질 1 (DMP1), 포스페이트 조절 엔도펩티다제 상동체 X-연결 (PHE)X, 매트릭스 세포외 인당단백질 (MEPE), 스클레로스틴, 캡핑 액틴 단백질, 겔솔린 유사 (CapG), ORP150 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 경우에, 골세포는 전골모세포를 포함하고, 전골모세포는 RUNX2를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 전골모세포를 포함하고, 전골모세포는 RUNX2를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 골모세포를 포함하고, 골모세포는 RUNX2 및 OCN을 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 포매 골모세포를 포함하고, 포매 골모세포는 OCN, E11, DMP1, PHEX 및 CapG를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 유골 골세포 또는 무기질화 골세포를 포함하고, 유골 골세포 또는 무기질화 골세포는 OCN, E11, DMP1, PHEX, MEPE 및 CapG를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 성숙 골세포를 포함하고, 여기서 성숙 골세포는 DMP1, PHEX, MPEP, 스클레로스틴, CapG 및 ORP150을 포함한다.
또 다른 측면에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G를 발현하고, 여기서 MPSC 집단은 인돌아민 2-3 데옥시게나제 (IDO) 분비에 대해 음성, 키뉴레닌 분비에 대해 음성, 및 인터류킨 2 (IL-2) 분비에 대해 양성 중 하나 이상을 포함하는 표현형을 포함한다. 한 경우에, MPSC 집단은 인돌아민 2-3 데옥시게나제 (IDO) 분비에 대해 음성, 키뉴레닌 분비에 대해 음성, 및 인터류킨 2 (IL-2) 분비에 대해 양성의 표현형을 포함한다.
임의의 이러한 측면, 실시양태 및/또는 경우에서, 본 발명자들은 줄기 세포가 면역-특권, 염색체 안정적 (종양발생성이 아님), 무병원체 및 만능성임을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 프로그램화된 자연 살해 (NK), 연골, 골, 지방, 뉴런, 췌장, 간 및 세크레톰 세포에 대한 현저한 배가 시간 및 성장 특징을 갖는 이의 줄기 세포의 효율적인 분화를 입증하였다.
본 발명의 다양한 측면은 특히 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 특색 및 장점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조함으로써 얻어질 것이다:
도 1은 90일의 시간 프레임에서 집단 배가에 의해 측정된 MPSC의 3일 성장 곡선을 보여주는 라인 차트이다.
도 2a-2d는 상이한 집단 배가에서 4개의 상이한 MPSC 샘플의 캐리오스타트(KARYOSTAT)™ 분석의 전체 게놈 도면을 보여준다. 도 2a는 16.5 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이다. 도 2b는 44.5 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이다. 도 2c는 62.6 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이다. 도 2d는 71.5 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이다.
도 3은 HLA-G 이소타입에 대해 염색된 MPSC의 유동 세포계측 분석을 보여준다.
도 4는 HLA-G 이소타입의 경우 4H84 항체 및 대조군의 경우 마우스 IgG1로 염색된 MPSC의 유동 세포계측 분석을 보여준다.
도 5a-5d는 특이적 분자 바이오마커를 발현함으로써 MPSC의 특징화를 보여준다. MPSC는 분자 바이오마커, 예컨대 β-hCG, HLA-G, HSP90 및 CDX2를 발현하지만 (도 5a), 일부, 예컨대 ki67, 신시틴, HSP70, p53은 음성이다 (도 5b). (도 5c) MPSC는 FACS 분석에 의해 이소타입 대조군 및 비염색 세포와 비교하여 HLA-A, B, C (좌측 패널) 및 4H84 항체에 의해 검출된 표면 및 가용성 HLA-G (우측 패널)를 발현한다. (도 5d) 세포 표면 및 세포내에서와 비교하여 세포 표면에서 MPSC에서 HLA-G 이소형의 대표적인 FACS 분석.
도 6a-6g는 MPSC에서 면역 세포의 분자 바이오마커의 발현을 보여준다. 영상화 또는 FACS 분석에 의해, MPSC는 NK 세포 (도 6a), T 세포 (도 6b), 수지상 세포 (도 6c 및 도 6d), 대식세포 (도 6e), 및 줄기 세포 선조 (도 6f 및 도 6g)의 다양한 분자 바이오마커를 발현한다. 특이적 바이오마커는 이미지 또는 플롯 상에 표시된다.
도 7은 33 계대에 걸친 MPSC1 (▲; 상단 라인), MPSC2 (■), MPSC3 (▼), 및 MPSC4 (●)에 대한 예시적인 성장 곡선을 제공한다.
도 8a는 IDO 분비 검정의 표준 곡선을 예시한다.
도 8b는 대조군과 비교하여 다양한 농도의 IFN-γ 자극에서 3개의 세포주의 IDO 분비의 결과를 예시한다. 이 데이터는 대조군과 비교하여 IDO 분비에 대한 효과가 없음을 나타내는 "음성"이다.
도 9a는 키뉴레닌 분비 검정의 표준 곡선을 예시한다.
도 9b는 대조군 및 배지 단독과 비교하여 24, 48 및 72시간에서 3개의 상이한 농도에서 키뉴레닌 분비에 대한 IFN-γ 자극의 효과의 결과를 예시한다. 이 데이터는 대조군과 비교하여 키뉴레닌 분비에 대한 효과가 없음을 나타내는 "음성"이다.
도 10a는 IL-2 분비 검정의 표준 곡선을 예시한다.
도 10b는 대조군 및 배지 단독과 비교하여 24, 48 및 72시간에서 3개의 상이한 농도에서 IL-2 분비에 대한 IFN-γ 자극의 효과의 결과를 예시한다. 이 데이터는 세포가 대조군과 비교하여 IL-2 분비를 증가시킨다는 것을 나타내는 "양성"이다.
도 10c는 대조군과 비교하여 24시간의 공동배양에서 약 3000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다.
도 10d는 대조군과 비교하여 24시간의 공동배양에서 약 2000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다.
도 10e는 대조군과 비교하여 48시간의 공동배양에서 약 3000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다.
도 10f는 대조군과 비교하여 48시간의 공동배양에서 약 2000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다. MPSC는 활성화된 Jurkat 세포에 의한 IL-2 분비를 감소시키기보다는 증가시켰다.
도 11a는 72시간에 세포 수를 예시하는 그래프이다. 각 막대에서, 죽은 세포는 상단에 있고, 살아있는 세포는 아래쪽에 있다.
도 11b는 각 유형의 배지에서 집단 배가를 예시하는 그래프이다.
도 12a는 상이한 배양일에 세포 카운트를 나타내는 그래프이다. △D2-D6= 44,000,000개 세포.
도 12b는 배양 동안 % 살아있는 세포를 나타내는 그래프이다.
도 12c는 접착 vs. 현탁 배양을 비교하는 집단 배가를 나타내는 그래프이다. △D2-D6= 4.9 PD. 접착 배양은 초기에 현탁 배양보다 빠르게 배가되었지만, 시간 경과에 따라, 현탁 배양은 더 높은 비율의 집단 배가를 달성하였다.
시험관내에서 생산된 신규 고유한 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC), 이의 조성물, 및 다양한 표현형의 분화된 세포 (예를 들어, 췌장, 신경, 간, 면역조절, 또는 자연 살해 세포 표현형)의 생성 또는 장애 (예를 들어, 당뇨병, 신경 손실 또는 변성, 간 질환, 암, 염증, 바이러스 감염, 또는 자가면역 질환)의 치료 또는 병태 (예를 들어, 피부 병태)의 개선에서의 이의 용도가 본원에 개시되어 있다. MPSC는 이전의 영양막 줄기 세포와 구별되며, 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 장점을 갖는다: 빠르고 확장가능한 집단 배가; 입증된 병원체-비함유 프로파일; 면역 특권이 높고 이식에 적합함; 예외적인 염색체 안정성을 갖음, 예를 들어 적어도 71 집단 배가의 안정적인 핵형을 보유함; 및 시토카인, 케모카인 및 엑소좀이 풍부한 강력한 세크레톰을 생산함. MPSC는 배아 줄기 세포와 구별되며, 윤리적으로 공급되고 배양된다. MPSC는 사멸성이지만 (예를 들어, 한정적인 증식 능력을 갖음), 배아 줄기 세포 및 iPS 세포보다 훨씬 더 빠르게 집단 배가에 도달할 수 있다. 태반, 제대 또는 골수로부터의 세포와 달리, MPSC는 만능성이며, 인간을 형성하는 세 가지 주요 세포 그룹으로 분화 또는 성숙할 수 있다: 외배엽 (피부, 뉴런 및 신경계 발생), 내배엽 (위장관 및 호흡기관, 내분비선, 간 또는 간세포-유사 세포, 및 췌장 또는 췌장 세포 형성), 및 중배엽 (골 (골세포), 지방, 연골 (연골세포), 대부분의 순환계, 근육, 결합 조직, 면역 세포 등 형성). 또한, MPSC는 비-종양발생성이며, 예를 들어 면역 적격 래트의 연구에서 입증된 바와 같이 종양 또는 기형종을 유도하지 않는다.
하나 이상의 본 발명의 실시양태의 세부사항은 본원의 첨부된 도면, 청구범위 및 설명에 기재되어 있다. 본원에 개시되고 고려된 본 발명의 실시양태의 다른 특색, 목적 및 장점은 명시적으로 배제되지 않는 한 임의의 다른 실시양태와 조합될 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 청구된 대상이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며, 청구된 임의의 대상을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원에서, 단수의 사용은 특별히 달리 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함한" 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"의 사용은 제한적이 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정 값 또는 범위, 예를 들어 참조 숫자 값의 ± 15%로 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양을 포함하고, 예를 들어 "약 5 μL"는 "약 5 μL" 및 또한 "5 μL"를 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 실험 오차 내에 있을 것으로 예상되는 양을 포함한다.
용어 "치료하는", "치료" 등은 본원에서 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 일부 경우에, 개체 (예를 들어, 간-연관 질환 또는 장애를 앓고 있고/거나 유전적으로 소인이 있는 것으로 의심되는 개체는 본원에 기재된 세포 제제로 예방적으로 치료되고, 이러한 예방적 치료는 간-연관 질환 또는 장애 또는 이의 징후 또는 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다. 일부 경우에, 개체는 치료적으로 치료되고 (예를 들어, 개체가 간-연관 질환 또는 장애를 앓고 있는 경우), 이러한 치료적 치료는 질환 또는 장애에 대한 부분적 또는 완전한 치유를 유발하고/거나, 질환 또는 장애에 기인하는 유해 효과를 역전시키고/거나, 질환 또는 장애를 안정화시키고/거나, 질환 또는 장애의 진행을 지연시키고/거나, 질환 또는 장애의 퇴행을 유발한다.
치료를 필요로 하는 구역으로의 본원에 개시된 세포의 투여 (예를 들어, 이식)는 예를 들어 및 제한 없이, 수술 동안 국소 주입, 주사, 카테터 또는 임플란트에 의해 달성되고, 상기 임플란트는 막, 예컨대 실라스틱 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
조성물을 포유동물에 "이식하는" 것은 관련 기술분야에 확립된 임의의 방법에 의해 포유동물의 신체에 조성물을 도입하는 것을 지칭한다. 도입되는 조성물은 "이식조직편"이고, 포유동물은 "수용자"이다. 이식조직편 및 수용자는 동계, 동종이계 또는 이종일 수 있다. 또한, 이식은 자가 이식일 수 있다.
용어 "단리된"은 세포 또는 세포 집단과 관련하여 사용될 때 세포 또는 세포 집단이 유래될 수 있는 숙주 유기체로부터 분리되어 있고 숙주 유기체에 존재하지 않는 세포 또는 세포 집단의 상태를 지칭한다. 일부 경우에, 단리된 세포는 동일한 숙주 유기체로부터 단리되거나 유래된 다른 세포와 접촉한다. 일부 경우에, 단리된 세포는 정제되고 임의의 다른 세포로부터 분리된다. 일부 경우에, 단리된 세포는 줄기 세포로부터 시험관내에서 유래된다.
"유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 치료제의 양이다. 장애를 치료 또는 호전시키기 위한 조성물의 유효량은 장애의 증상을 감소 또는 제거하기에 충분한 조성물의 양이다.
본원에서 사용된 섹션 표제는 조직화 목적만을 위한 것이며, 설명된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
세포 및 조성물
많은 측면 중 일부에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현하고, 여기서 MPSC 집단은 MPSC 배양 시작으로부터 90일 이내에 최대 적어도 89 집단 배가에 도달할 수 있다. 일부 경우에, MPSC 집단은 MPSC 배양 시작으로부터 90일 이내에 최대 적어도 89-100 집단 배가에 도달할 수 있다. 일부 경우에, MPSC 집단은 MPSC 배양 시작으로부터 12일 이내에 약 25 내지 약 30 집단 배가, 약 30일 이내에 약 50 내지 약 55 집단 배가, 및/또는 약 63일 이내에 약 75 내지 약 80 집단 배가에 도달할 수 있다. 일부 경우에, MPSC 집단은 약 22 내지 약 27시간, 예를 들어 약 25시간 내에 배가될 수 있다. 일부 측면에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현하고, 여기서 MPSC 집단은 병원체가 없다. 일부 경우에, MPSC는 p53, 신시틴, Ki67, 열 충격 단백질 70 (HSP70) 또는 이들의 임의의 조합의 발현이 결핍되어 있다. 일부 경우에, MPSC는 인간 세포이다. 일부 경우에, MPSC는 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 고양이, 원숭이 또는 유인원으로부터 기원 또는 유래된다.
또 다른 측면에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G를 발현하고, 여기서 MPSC 집단은 인돌아민 2-3 데옥시게나제 (IDO) 분비에 대해 음성, 키뉴레닌 분비에 대해 음성, 및 인터류킨 2 (IL-2) 분비에 대해 양성 중 하나 이상을 포함하는 표현형을 포함한다. 한 경우에, MPSC 집단은 인돌아민 2-3 데옥시게나제 (IDO) 분비에 대해 음성, 키뉴레닌 분비에 대해 음성, 및 인터류킨 2 (IL-2) 분비에 대해 양성의 표현형을 포함한다. 이 표현형은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 MPSC에 대해 예상하는 것과 반대이다. 세포는 표면 표현형 마커에 의해 중간엽 줄기 세포처럼 보이지만, 기능적으로 상이한 방식으로 행동한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 MPSC는 병원체가 없다. 일부 경우에, MPSC는 박테리아가 없다. 일부 경우에, MPSC는 바이러스, 예를 들어 시토메갈로바이러스가 없다. 일부 경우에, MPSC는 EBV (엡스타인-바 바이러스), HAdV (인간 아데노바이러스), HCMV (인간 시토메갈로바이러스), 간염 바이러스 (예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염), 헤르페스 바이러스 (예를 들어, HHV 6 (인간 헤르페스 바이러스 6), HHV 8 (인간 헤르페스 바이러스 8) 등), 인간 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV1 (인간 면역결핍 바이러스 1), HIV2 (인간 면역결핍 바이러스 2)), 인간 파필로마바이러스 (HPV; 예를 들어, HPV16, HPV18 등), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (예를 들어, HSV 1 (헤르페스 심플렉스 1), HSV 2 (헤르페스 심플렉스 2)), 인간 T-림프친화성 바이러스 (예를 들어, HTLV 1 (인간 T-림프친화성 바이러스 1), HTLV 2 (인간 T-림프친화성 바이러스 2)), 수두 바이러스 (VZV), 코리네박테리움 보비스, 코리네박테리움 종 (HAC2), 한타바이러스 (예를 들어, 한타안, 서울 또는 신 놈브레), LCMV (림프구성 맥락수막염 바이러스), 미코플라스마 종, 트레포네마 팔리둠, 시토메갈로바이러스 (CMV), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 병원체가 없다.
일부 경우에, 본원에 개시된 MPSC 또는 MPSC를 포함하는 집단은 b-HCG, HSP90, CDX2, FGFR1, pAKT, pCREB1, HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC 집단은 KIR2DL4, Flt3L, NKp46, TCR, ILT-4, CD49f, CD3, CD4, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD16, CD19, CD34, CD38, CD44, CD56, CD90/Thy-1, CD105, CD141, CD146, CD166 또는 CD107a 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC 집단은 IL-6, IL-8, MCP-1, CLXL2, PDGF-AA, VEGF, PAI-1 또는 IL-10 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC의 적어도 일부는 Ki-67, HSP70, p53 또는 신시틴 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC 집단 (예를 들어, 적어도: 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%)은 CD44, CD90, CD105, CD146, CD166, HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 중 하나 이상의 단백질을 발현한다. 일부 경우에, MPSC의 적어도 일부는 CD19, CD45 또는 HLA-DR 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC의 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과는 CD19, CD45 또는 HLA-DR 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC 집단은 CD16 또는 CD56 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현한다. 일부 경우에, MPSC의 적어도 일부는 CD3을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC의 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과는 CD3을 발현하지 않는다. 일부 경우에, MPSC 집단의 적어도 65% 또는 적어도 70%는 HLA-G를 발현한다. 일부 경우에, HLA-G는 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 또는 HLA-G7 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, HLA-G는 HLA-G2, HLA-G4, HLAG-6 또는 HLA-G7 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, HLA-G는 HLAG-6 또는 HLA-G7 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에, MPSC 집단의 15% 미만 (예를 들어, 10% 미만)은 HLA-G1을 발현한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 MPSC 집단의 적어도 10%는 모노클로날이다. 일부 경우에, MPSC 집단의 약 13% 내지 약 15%는 모노클로날이다. 일부 경우에, 적어도 약 1 x 106개의 MPSC가 집단에 존재한다. 일부 경우에, MPSC는 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 안정적인 핵형을 갖는다. 일부 경우에, MPSC는 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 집단 배가로부터의 염색체 이상을 경험하지 않는다. 일부 경우에, 여기서 MPSC는 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 동결 및 해동으로부터의 실질적인 염색체 이상을 경험하지 않는다.
일부 경우에, 본원에 제공된 세포, 예를 들어 MPSC는 유전적으로 변형된다. 일부 경우에, 세포는 외인성 유전자, 예를 들어 트랜스진을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "트랜스진" 및 이의 문법적 등가물은 유기체로 전달되는 유전자 또는 유전적 물질을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 트랜스진은 유기체에 도입되는 유전자를 함유하는 DNA의 스트레치 또는 세그먼트일 수 있다. 트랜스진이 유기체로 전달되면, 유기체는 트랜스제닉 유기체로 지칭된다. 트랜스진은 트랜스제닉 유기체에서 RNA 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 단백질)를 생산하는 이의 능력을 유지할 수 있다. 트랜스진은 상이한 핵산, 예를 들어 RNA 또는 DNA로 구성될 수 있다. 트랜스진은 조작된 T 세포 수용체를 코딩할 수 있다 (예를 들어, TCR 트랜스진). 트랜스진은 TCR 서열을 포함할 수 있다. 트랜스진은 종양유전자를 포함할 수 있다. 트랜스진은 면역 종양유전자를 포함할 수 있다. 트랜스진은 재조합 아암을 포함할 수 있다. 트랜스진은 조작된 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 면역 종양유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양 저해제 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 단백질분해를 직접적으로 또는 간접적으로 촉진하는 단백질을 코딩한다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양용해 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양 세포의 표적화에서 림프구를 도울 수 있다. 일부 경우에, 트랜스진은 T 세포 인핸서 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양용해 바이러스 유전자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 경우에, 트랜스진은 항암 수용체이다. 일부 경우에, 트랜스진은 항혈관신생 인자이다. 일부 경우에, 트랜스진은 세포독성 유전자이다. 예시적인 트랜스진은 CD28, 유도성 공동-자극제 (ICOS), CD27, 4-1BB (CD137), ICOS-L, CD70, 4-1BBL, 신호 3, 시토카인, 예컨대 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58), HLA 클래스 I 유전자, B7, CD80, CD83, CD86, CD32, CD64, 4-1BBL, CD3, CD1d, CD2, 막-결합 IL-15, 막-결합 IL-17, 막-결합 IL-21, 막-결합 IL-2, 말단절단된 CD19, VEGF, 카스파제, 케모카인, 또는 상기 중 임의의 것에 대한 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)를 코딩하는 하나 이상의 유전자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 트랜스진은 세포 또는 조직 복구에 수반하는 단백질 (예를 들어, DNA 복구와 연관된 단백질, 면역 반응 (예를 들어, 인터페론 및 인터류킨), 및 구조적 단백질)을 코딩한다. 일부 경우에, 트랜스진은 성장 인자 수용체를 코딩한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 MPSC는 TCR, B 세포 수용체 (BCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 트랜스진을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 MPSC는 종양유전자 수용체를 코딩하는 트랜스진을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 세포를 포함하는 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에게 정맥내 투여하기 위한 제약 조성물로서 제형화된다. 일부 경우에, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 강장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에서의 임의의 통증을 호전시키기 위한 국소 마취제를 포함한다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합되도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
한 측면에서, 본원에 개시된 세포를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에, 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다. 이러한 담체는 염수, 완충된 염수, 덱스트로스, 물 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 콜로이드성 분산액 시스템이 사용된다. 콜로이드성 분산액 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드 및 지질-기반 시스템 (수중유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀, 및 리포솜 포함)을 포함한다.
사용 방법
일부 측면에서, 본원에 개시된 MPSC 집단을 하나 이상의 유도제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 생산하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에, 생산된 세포는 외배엽 세포이다. 일부 경우에, 생산된 세포는 중배엽 세포이다. 일부 경우에, 생산된 세포는 내배엽 세포이다. 일부 경우에, 생산된 세포는 췌장 세포 또는 췌장 선조 세포이고, 임의로 유도제는 bFGF (염기성 섬유모세포 성장 인자)를 포함하고, 일부 경우에 2-메르캅토에탄올 및 니코틴아미드를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, PPC는 β-HCG, CDX2, HLA-G 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, PPC는 β-HCG 및 CDX2; β-HCG 및 HLA-G; CDX2 및 HLA-G; 또는 HCG, CDX2 및 HLA-G를 포함한다. 임의로, 일부 경우에, PPC는 PDX1, FOXA2, SOX9 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 생산된 세포는 신경 세포 또는 신경 선조 세포이고, 임의로 유도제는 레티노산을 포함한다. 한 실시양태에서, NCS 세포는 RAR-β, CDX2, HLA-G 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, NCS 세포는 RAR-β 및 CDX2; RAR-β 및 HLA-G; CDX2 및 HLA-G; 또는 RAR-β, CDX2 및 HLA-G를 포함한다. 임의로, 일부 경우에, PPC는 N-CAD, NESTIN, SOX2, PAX6 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 생산된 세포는 간 세포 또는 간 선조 세포이고, 임의로 유도제는 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 예컨대 FGF2, 스테로이드, 예컨대 덱사메타손, 및 시토카인, 예컨대 온코스타틴 M을 포함하고, 일부 경우에 이는 골 형태발생 단백질 (BMP), 예를 들어 BMP4 및/또는 간 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, FGF는 FGFR1에 결합하고, 이는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF8, FGF10, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 또는 FGF23이다. 일부 경우에, 스테로이드는 글루코코르티코이드 스테로이드, 예를 들어 덱사메타손, 베타메타손, 부데소나이드, 코르티손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손 또는 트리암시놀론이다. 일부 경우에, 시토카인은 인터류킨 6 그룹 시토카인, 예를 들어 온코스타틴 M, 예를 들어 인간 온코스타틴 M, 인터류킨-6, 인터류킨-11, 백혈병 억제 인자 (LIF), 섬모상 신경영양성 인자 (CNTF), 카디오트로핀-1 (CT-1), 및 카디오트로핀-유사 시토카인 (CLC)이다. 일부 경우에, 및 일부 경우에, 세포는 자연 살해 세포이고, 유도제는 FGF, 예를 들어 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF8, FGF10, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22 또는 FGF23을 포함한다. 일부 경우에, MPSC는 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포의 30일 (또는 3-4주) 및 4-단계 분화와 비교하여 1-단계 프로토콜로 1일 안에 신경 선조 세포로 분화할 수 있다. 일부 경우에, MPSC는 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포의 8 내지 15일 및 4 내지 5-단계 분화와 비교하여 1-단계 프로토콜로 1일 안에 인슐린-생산 췌장 선조 세포로 분화할 수 있다. 일부 경우에, MPSC는 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포의 12 내지 21일 및 3-단계 분화와 비교하여 2-단계 프로토콜로 6일 안에 간세포-유사 세포로 분화한다.
한 측면에서, 생산된 세포는 지방세포, 연골세포, 골세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 중간엽 간질 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포 및 연골세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포 및 골세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 연골세포 및 골세포를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포, 연골세포 및 골세포를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 지방세포를 포함한다. 지방세포는 렙틴, HOXC8, HOXC9, Ucp1, CIDEA, PRDM16, Zic1, Lhx8, Eva1, Epsti1, Cd137, Tmem26, Tbx1, Cited1, Shox2, 아미노산 수송체 ASC-1, 아미노산 수송체 PAT2, 퓨린성 수용체 P2RX5, ATGL, CAV1, FABP4, COX4, LMNB1 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 경우에, 지방세포는 백색 지방세포를 포함하고, 여기서 백색 지방세포는 렙틴, HOXC8, HOXC9 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 경우에, 지방세포는 갈색 지방세포를 포함하고, 여기서 갈색 지방세포는 Ucp1, CIDEA, PRDM16, Zic1, Lhx8, Eva1, Epsti1 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 경우에, 지방세포는 베이지색 지방세포를 포함하고, 여기서 베이지색 지방세포는 Cd137, Tmem26, Tbx1, Cited1, Shox2 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 경우에, 지방세포는 베이지색 지방 세포 전구체를 포함하고, 여기서 베이지색 지방 세포 전구체는 CD137, TMEM26 또는 이들의 조합을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 연골세포를 포함한다. 연골세포는 아넥신 A6, CD44, CD151, ITM2A, FAM20B, FoxC1, FoxC2, SOX5, SOX6, SOX9, 아그레칸, 카텝신 B, CHADL, 콘드로어드헤린, 콜라겐 II, 콜라겐 IV, CRTAC1, DSPG3, IBSP/시알로단백질 II, 마트릴린-1, 마트릴린-3, 마트릴린-4, MIA, 오토라플린/OTOR, URB 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 생산된 세포는 골세포를 포함한다. 골세포는 전골모세포, 골모세포, 포매 골모세포, 유골 골세포, 무기질화 골세포 또는 성숙 골세포를 포함할 수 있다. 골세포는 RUNX2, OCN, E11, DMP1, PHEX, MEPE, 스클레로스틴, CapG, ORP150 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 한 경우에, 골세포는 전골모세포를 포함하고, 전골모세포는 RUNX2를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 전골모세포를 포함하고, 전골모세포는 RUNX2를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 골모세포를 포함하고, 골모세포는 RUNX2 및 OCN을 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 포매 골모세포를 포함하고, 포매 골모세포는 OCN, E11, DMP1, PHEX 및 CapG를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 유골 골세포 또는 무기질화 골세포를 포함하고, 유골 골세포 또는 무기질화 골세포는 OCN, E11, DMP1, PHEX, MEPE 및 CapG를 포함한다. 또 다른 경우에, 골세포는 성숙 골세포를 포함하고, 여기서 성숙 골세포는 DMP1, PHEX, MPEP, 스클레로스틴, CapG 및 ORP150을 포함한다.
일부 경우에, 본원에 개시된 세포는 대상체에게 정맥내, 피하, 경피, 흡입, 경구, 근육내 또는 종양내로 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 포유동물이다. 일부 경우에, 대상체는 영장류이다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다.
일부 경우에, 본원에 개시된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 항원-보유 표적 세포를 사멸시키는 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에, 항원-보유 표적 세포는 암 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 고형 종양 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 혈액암 세포이다. 일부 경우에, 암 세포는 방광암 세포, 골암 세포, 뇌암 세포, 유방암 세포, 결장직장암 세포, 식도암 세포, 위장암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 비강암 세포, 비인두암 세포, 구강암 세포, 구인두암 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 위암 세포, 피부암 세포, 갑상선암 세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 암 세포는 조혈 악성종양, 두경부 편평 세포 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 육종, 흑색종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암 (예를 들어, 자궁경부의 암종), 결장직장암, 식도암, 위장암, 간암, 폐암, 비강암, 비인두암, 구강암, 구인두암, 난소암, 전립선암, 위암, 피부암, 갑상선암 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 암으로부터 유래된다. 암은 원발성 암을 포함한다. 대안적으로, 암은 전이성 암을 포함한다. 일부 경우에, 항원-보유 표적 세포는 병원체이다. 일부 경우에, 병원체는 바이러스, 박테리아, 원생동물, 프리온, 진균 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 방법은 항원-보유 표적 세포 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 100%를 사멸시킨다. 일부 경우에, 방법은 항원-보유 표적 세포 집단의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 100%를 사멸시킨다.
일부 경우에, 본원에 개시된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 염증 경로를 하향조절하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에, 방법은 이식조직편 거부, 감염, 감염과 연관된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 전신 발병 청소년 특발성 관절염 (JIA), 염증성 장 질환 (IBD), 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 천식, 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 크론병, 궤양성 결장염, 과민성 장 증후군, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 피부근염, 포도막염, 페이로니병, 셀리악병, 담낭 질환, 필로니달병, 복막염, 건선, 혈관염, 외과적 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 췌장염, 수술 외상, 이식편-대-숙주 질환, 심장 질환, 골흡수, 화상 환자, 심근 경색, 파제트병, 골다공증, 패혈증, 간 또는 폐 섬유증, 치주염, 또는 저염산증을 포함하는 질환 또는 병태를 치료한다. 일부 경우에, 방법은 I형 당뇨병, 다발성 경화증, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 경피증, 다발성 근염, 만성 활동성 간염, 혼합 결합 조직 질환, 원발성 담즙성 경변증, 악성 빈혈, 자가면역 갑상선염, 특발성 애디슨병, 백반증, 글루텐-민감성 장병증, 그레이브스병, 중증 근무력증, 자가면역성 호중구감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 류마티스성 관절염, 경변증, 심상성 천포창, 자가면역성 불임, 굿파스쳐병, 수포성 유천포창, 원판상 루푸스, 궤양성 결장염, 고밀도 침착병, 염증성 장 질환, 건선, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 자가면역 질환을 치료한다. 일부 경우에, 방법은 1형 당뇨병을 치료한다. 일부 경우에, 방법은 이식조직편 거부를 호전시킨다.
또 다른 측면에서, 본원의 세포를 포함하는 제약 조성물을 세포가 대상체 (예를 들어, 대상체의 간)에게 이식하기에 유효한 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 병태를 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에, 세포는 제약상 허용되는 담체로 투여된다. 일부 경우에, 제약상 허용되는 담체는 염수, 예를 들어 포스페이트 완충 염수, 또는 소 태아 혈청을 포함한다. 일부 경우에, 세포는 ml당 약 1×106 내지 약 100×106개 세포, ml당 약 1×106 내지 약 250×106개 세포, ml당 약 1×106 내지 약 500×106개 세포, 또는 ml당 약 10×106 내지 약 40×106개 세포를 함유하는 현탁액으로 투여된다. 일부 경우에, 세포는 약 1-5 ml, 1-10 ml, 1-50 ml, 1-100 ml, 또는 10-150 ml의 부피로 투여된다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 일부 경우에, 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사를 포함한다. 일부 경우에, 주사는 간 정맥에 투여된다. 일부 경우에, 주사는 간 동맥에 투여된다. 일부 경우에, 병태는 간-연관 질환 또는 장애, 예를 들어 급성 간 질환이다. 일부 경우에, 병태는 간부전이다. 일부 경우에, 간-연관 질환 또는 장애는 알라질 증후군, 알파 1 항-트립신 결핍증, 자가면역성 간염, 양성 간 종양, 담도 폐쇄증, 경변증, 간의 낭성 질환, 알콜-관련 간 질환 및 비-알콜 지방 간 질환 (NAFLD)을 포함하는 지방 간 질환, 갈락토스혈증, 담석, 길버트 증후군, 혈색소침착증, 간 낭종, 간암, 임신 중 간 질환 (임의로, 임신 중 급성 지방 간, 임신 중 간내 담즙정체, 자간전증, 또는 HELLP 증후군 (예를 들어, 용혈, 상승된 간 시험, 낮은 혈소판)), 신생아 간염, 원발성 담즙성 경변증, 원발성 경화성 담관염, 포르피린증, 라이 증후군, 사르코이드증, 독성 간염, 1형 글리코겐 축적병, 티로신혈증, 바이러스성 간염, 윌슨병, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 개시된 세포의 투여 방식은 전신 정맥내 주사 및 의도된 활성 부위로의 직접 주사 (예를 들어, 내시경 역행 주사)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제제는 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 일부 경우에, 투여는 전신적 국소화된 투여이다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 세포를 대상체에게 이식하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, 대상체는 세포에 의해 주사된다 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 경피, 내시경 역행 주사, 또는 복강내). 일부 경우에, 대상체는 이식 전에 면역저해제로 치료되지 않는다. 일부 경우에, 방법은 환자를 면역저해제, 예를 들어 FK-506, 사이클로스포린 또는 항-글루탐산 데카르복실라제 65-킬로달톤 이소형 (GAD65) 항체로 치료하는 것을 추가로 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 세포는 세포를 특정 조직으로 표적화하기에 적합한 전달 시스템에 의해 표적화된 부위 (예를 들어, 간의 결함 섹션)에 전달된다. 예를 들어, 세포는 표적화된 부위에서 세포(들)의 저속 방출을 허용하는 전달 비히클에 캡슐화된다. 전달 비히클은 특정 조직으로 특이적으로 표적화되도록 변형될 수 있다. 표적화된 전달 시스템의 표면은 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 리포솜-표적화된 전달 시스템의 경우, 표적화 리간드를 리포솜 이중층과 안정적으로 회합된 상태로 유지하기 위해 지질 그룹은 리포솜의 지질 이중층에 혼입될 수 있다.
본원에 기재된 세포의 투여는 임의로 (1) 주사된 세포의 양을 증가 또는 감소시키거나; (2) 주사 횟수를 다양하게 하거나; 또는 (3) 세포 전달 방법을 다양하게 함으로써 개체에게 맞춤화될 수 있다.
검출 방법
상기 기재된 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 유동 세포계측, 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 면역침전, 자기 비드 선택, 및 이들 세포 표면 마커 중 하나를 발현하는 세포의 정량화에 의해 측정될 수 있다. 바이오마커 RNA 발현 수준은 예를 들어 RT-PCR, Qt-PCR, 마이크로어레이, 노던 블롯 또는 다른 유사한 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
"발현을 검출하는 것" 또는 "발현 수준"을 검출하는 것은 생물학적 샘플에서 바이오마커 단백질 또는 유전자의 발현 수준 또는 존재를 결정하기 위한 것이다. 그러므로, "발현을 검출하는 것"은 바이오마커가 발현되지 않거나, 검출가능하게 발현되지 않거나, 낮은 수준으로 발현되거나, 정상 수준으로 발현되거나, 또는 과발현되는 것으로 결정되는 경우를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 바이오마커의 발현 또는 존재는 예를 들어 면역조직화학 기술 또는 핵산-기반 기술, 예컨대 제자리 혼성화 및 RT-PCR을 사용하여 핵산 수준에서 결정된다. 일부 경우에, 하나 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재는 핵산 증폭을 위한 수단, 핵산 시퀀싱을 위한 수단, 핵산 마이크로어레이 (DNA 및 RNA)를 활용하는 수단, 또는 특이적으로 라벨링된 프로브를 사용한 제자리 혼성화를 위한 수단에 의해 수행된다.
일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 것은 겔 전기영동을 통해 수행된다. 일부 경우에, 결정은 막으로의 전달 및 특이적 프로브와의 혼성화를 통해 수행된다. 일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 것은 진단 영상화 기술에 의해 수행된다. 일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는 것은 검출가능한 고체 기질에 의해 수행된다. 일부 경우에, 검출가능한 고체 기질은 항체로 기능화된 상자성 나노입자이다.
일부 경우에, 바이오마커의 발현 또는 존재는 RNA (예를 들어, mRNA) 수준이다. 일부 경우에, RNA (예를 들어, mRNA) 수준을 검출하는 기술은 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 어레이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
mRNA 수준의 검출을 위한 한 가지 방법은 단리된 mRNA를 검출되는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 혼성화하는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 수반한다. 핵산 프로브는 예를 들어 전장 cDNA 또는 이의 일부, 예컨대 길이가 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 뉴클레오티드이고 본원에 기재된 바이오마커를 코딩하는 게놈 DNA 또는 mRNA에 대해 엄격한 조건 하에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 프로브와 mRNA의 혼성화는 바이오마커 또는 다른 표적 관심 단백질이 발현되고 있음을 나타낸다.
일부 경우에, mRNA는 고체 표면 상에 고정화되고, 예를 들어 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에서 실행하고 mRNA를 겔로부터 막, 예컨대 니트로셀룰로스로 전달함으로써 프로브와 접촉된다. 일부 경우에, 프로브(들)는 고체 표면 상에 고정화되고, mRNA는 예를 들어 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)와 접촉된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 바이오마커 또는 다른 관심 단백질을 코딩하는 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위한 공지된 mRNA 검출 방법을 쉽게 채택한다.
샘플에서 관심 mRNA의 수준을 결정하기 위한 대안적인 방법은 예를 들어 RT-PCR, 리가제 연쇄 반응, 자기-지속적인 서열 복제, 전사 증폭 시스템, Q-베타 레플리카제, 롤링 서클 복제 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭 프로세스를 수반하고, 이어서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출이 뒤따른다. 이들 검출 체계는 이러한 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 일부 경우에, 바이오마커 발현은 정량적 플루오로제닉 RT-PCR (예를 들어, 택맨(TAQMAN)® 시스템)에 의해 평가된다.
관심 RNA의 발현 수준은 멤브레인 블롯 (예컨대, 혼성화 분석, 예컨대 노던, 도트 등에 사용됨), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유 (또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링된다. 발현의 검출은 또한 용액에서 핵산 프로브를 사용하는 것을 포함한다.
일부 경우에, 마이크로어레이는 하나 이상의 바이오마커의 발현 또는 존재를 결정하는데 사용된다. 핵산 마이크로어레이는 많은 수의 유전자의 발현 수준의 동시 측정을 위한 한 가지 방법을 제공한다. 각 어레이는 고체 지지체에 부착된 재현가능한 패턴의 캡처 프로브로 이루어진다. 라벨링된 RNA 또는 DNA는 어레이 상의 상보적 프로브에 혼성화된 후, 레이저 스캐닝에 의해 검출된다. 어레이 상의 각 프로브에 대한 혼성화 강도가 결정되고, 상대적 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적 값으로 변환된다. 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이는 샘플 내 다수의 RNA에 대한 유전자 발현 프로파일을 결정하는데 특히 유용하다.
일부 경우에, 어레이는 사실상 임의의 형상의 표면 또는 심지어 다수의 표면 상에 제작된다. 일부 경우에, 어레이는 평면 어레이 표면이다. 일부 경우에, 어레이는 비드, 겔, 중합체 표면, 섬유, 예컨대 광섬유, 유리 또는 임의의 다른 적절한 기질 상의 펩티드 또는 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 어레이는 올-인클루시브 장치의 진단 또는 다른 조작을 허용하는 방식으로 패키징된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 바이오마커의 발현 또는 존재는 예를 들어 특이적 바이오마커 단백질에 대해 지정된 항체를 사용하여 단백질 수준에서 결정된다. 이들 항체는 다양한 방법, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 멀티플렉싱 기술, 면역침전 또는 면역조직화학 기술에 사용된다. 일부 경우에, 바이오마커의 검출은 ELISA에 의해 성취된다. 일부 경우에, 바이오마커의 검출은 전기화학발광 (ECL)에 의해 성취된다.
생물학적 샘플에서 바이오마커를 특이적으로 식별하고 정량화하기 위한 임의의 수단이 고려된다. 그러므로, 일부 경우에, 생물학적 샘플에서 관심 바이오마커 단백질의 발현 수준은 해당 바이오마커 단백질 또는 이의 생물학적 활성 변이체와 특이적으로 상호작용할 수 있는 결합 단백질에 의해 검출된다. 일부 경우에, 라벨링된 항체, 이의 결합 부분 또는 다른 결합 파트너가 사용된다. 본원에서 사용될 때 단어 "라벨"은 "라벨링된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 일부 경우에, 라벨은 그 자체로 검출가능하거나 (예를 들어, 방사성동위원소 라벨 또는 형광 라벨), 효소 라벨의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매한다.
바이오마커 단백질의 검출을 위한 항체는 기원이 모노클로날 또는 폴리클로날이거나, 합성적으로 또는 재조합적으로 생산된다. 복합체화된 단백질의 양, 예를 들어 결합 단백질, 예를 들어 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 회합된 바이오마커 단백질의 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 단백질 검출 방법론을 사용하여 결정된다. 면역학적 검정 설계, 이론 및 프로토콜의 상세한 검토는 관련 기술분야의 수많은 문헌에서 찾아볼 수 있다.
항체를 라벨링하기 위해 사용되는 마커의 선택은 적용에 따라 달라질 것이다. 그러나, 마커의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 결정가능하다. 이들 라벨링된 항체는 임의의 관심 바이오마커 또는 단백질의 존재를 검출하기 위한 조직학적 어플리케이션 뿐만 아니라 면역검정에서 사용된다. 라벨링된 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이다. 또한, 관심 단백질을 검출하는데 사용하기 위한 항체는 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 방사성 원자, 효소, 발색단 또는 형광 모이어티, 또는 비색 태그로 라벨링된다. 태그부착 라벨의 선택은 또한 원하는 검출 한계에 의존할 것이다. 효소 검정 (예를 들어, ELISA)은 전형적으로 효소 기질과 효소-태그부착된 복합체의 상호작용에 의해 형성된 착색된 생성물의 검출을 허용한다. 검출가능한 라벨로서 작용하는 방사성핵종은 예를 들어 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 및 Pd-109를 포함한다. 검출가능한 라벨로서 작용하는 효소의 예에는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 발색단 모이어티는 플루오레세인 및 로다민을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 이들 라벨에 접합된다. 예를 들어, 효소 및 발색단 분자는 커플링제, 예컨대 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드 등에 의해 항체에 접합된다. 대안적으로, 접합은 리간드-수용체 쌍을 통해 발생한다. 적합한 리간드-수용체 쌍의 예에는 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘, 및 항체-항원이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 생물학적 샘플 내의 하나 이상의 바이오마커 또는 다른 관심 단백질의 발현 또는 존재는 방사성면역검정 또는 효소-연결 면역검정 (ELISA), 경쟁적 결합 효소-연결 면역검정, 도트 블롯, 웨스턴 블롯, 크로마토그래피, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 검정에 의해 결정된다. 그러므로, 검출 검정은 단계, 예컨대 이뮤노블롯팅, 면역확산, 면역전기영동 및 면역침전을 수반하나 이에 제한되지는 않는다.
세포를 수득하는 방법
일부 경우에, 배아외 포유동물 줄기 세포 (예를 들어, 영양막 줄기 세포)는 본원에 개시된 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC)를 제조하기 위한 공급원 세포일 수 있다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포는 배아를 방해하거나 파괴하지 않는 방식으로 양수, 양막, 와튼 젤리, 융모막 융모 또는 자궁외 임신으로부터 단리된다.
일부 경우에, MPSC는 항생제, 예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신 또는 이들의 임의의 조합이 없는 배양 배지에서 수득된다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포를 수득하기 위한 배양 배지는 레티노산이 없다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포를 수득 및/또는 계대하는 배양 배지는 메르캅토에탄올, 니코틴아미드 또는 이들의 조합이 없다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포를 수득 및/또는 계대하는 배양 배지는 덱사메타손, 재조합 인간 온코스타틴 M, BMP4, HGF 또는 이들의 임의의 조합이 없다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포를 수득 및/또는 계대하는 배양 배지는 무이종, 예를 들어 동물 구성성분이 없다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포를 수득 및/또는 계대하는 배양 배지는 인간 유래 구성성분 및 동물-유래 구성성분, 예를 들어 화학적으로 정의된 배지가 없다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포를 수득 및/또는 계대하는 배양 배지는 혈청이 없다. 일부 경우에, 포유동물 줄기 세포를 수득 및/또는 계대하는 배양 배지는 소 태아 혈청이 없다.
일부 경우에, 본 개시내용은 MPSC의 계대배양물을 배양 배지에 약 1,000 내지 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하는 단계, 및 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 MPSC 집단을 성장시키는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단을 성장시키는 방법으로서, MPSC의 계대배양물을 배양 배지에 약 1,000 내지 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하는 단계, 및 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시되어 있으며, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현한다. 일부 경우에, 배양 배지는 동물 구성성분이 없다. 일부 경우에, 배양 배지는 혈청, 예를 들어 소 태아 혈청이 없다. 일부 경우에, 세포는 약 3일 동안 배양된다. 일부 경우에, 세포는 약 4일 동안 배양된다. 일부 경우에, MPSC는 약 2,000 내지 약 4,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩된다.
일부 경우에, 포유동물 줄기 세포는 양수천자 생검 또는 양수로부터 단리될 수 있다. 한 경우에, 양수천자는 임신 동안 태아를 둘러싸고 있는 양수의 작은 샘플을 수득하기 위해 사용되는 절차일 수 있다. 한 경우에, 양수천자는 염색체 이상에 대한 증가된 위험에 있는 임신 15주차 내지 20주차 사이의 여성, 예를 들어 분만 시 연령이 35세 이상이거나, 또는 염색체 이상 또는 신경관 결함에 대한 증가된 위험을 나타내는 비정상적인 산모 혈청 (혈액) 스크리닝 시험을 갖는 여성에게 제공될 수 있다. 한 경우에, 바늘, 예를 들어 길고 가늘고 속이 빈 바늘이 복부를 통해 자궁 및 양막낭으로 초음파 가이드와 함께 사용될 수 있다. 미리 결정된 양의 양수, 예를 들어 1 온스가 주사기로 채취될 수 있다.
일부 경우에, 본원의 포유동물 줄기 세포는 예를 들어 생식 요법, 예컨대 시험관내 수정 (IVF)과 함께 착상전 유전적 진단 (PGD) 동안 할구 생검으로부터 수득될 수 있다. 한 경우에, 본원의 세포는 배반포의 생검을 위한 방법에 의해 생산될 수 있으며, 여기서 배반포의 나머지는 이식되고 임신을 초래하고 나중에는 출산을 초래하며, 예를 들어 투명대를 배반포로부터 제거한 후, 배반포를 생검한다.
일부 경우에, 본원의 포유동물 줄기 세포는 출생전 융모막 융모 샘플링 (CVS)으로부터 수득될 수 있다. 한 경우에, CVS는 염색체 이상 및 특정 다른 유전적 문제에 대해 시험하기 위해 태반으로부터 조직 샘플을 채취하는 것을 수반하는 출생전 시험일 수 있다. 한 경우에, CVS는 임신 10주차 내지 12주차 사이에 수행될 수 있다. 한 경우에, CVS 절차는 경자궁경부를 통해 이루어지며, 예를 들어 자궁경부를 통해 태반으로 카테터를 삽입하여 조직 샘플을 수득한다. 한 경우에, CVS 절차는 경복부를 통해 이루어지며, 복부 및 자궁을 통해 태반으로 바늘을 삽입하여 조직 샘플을 수득한다.
일부 경우에, 본원의 포유동물 줄기 세포는 임신 1기 융모막 융모 샘플링 (예를 들어, 8+3주 내지 12+0주 임신 연령) 또는 제왕절개 분만으로부터의 만기 태반으로부터 단리될 수 있다. 융모막 조직을 양막으로부터 분리하고/거나, 다지고/거나, 효소적으로 소화시킬 수 있다 (예를 들어, 약 3 ml의 TRYPLE® 셀렉트(Select) 효소로, 예를 들어 약 15분 동안). 후속적으로, 세포를 원심분리하고/거나 (예를 들어, 약 150 × g +/- 10%에서, 예를 들어 약 5분 동안), 카운트하고/거나, 배지 (예를 들어, 스테뮬레이트(STEMULATE)™ 인간 혈소판 용해물 세포 배양 배지 보충제를 갖는 α-MEM 또는 메센컬트(MESENCULT)™-ACF 플러스 배양 키트)에 재플레이팅한다 (예를 들어, ㎠당 약 100개 세포). 한 경우에, 단리된 세포는 플라스틱 접착성일 수 있다. 한 경우에, 세포는 약 4 내지 약 8 계대에서 사용될 수 있다.
일부 경우에, 융모막 융모는 자궁외 임신 (예를 들어, 임신 연령: 수정 후 약 5 내지 약 8주, 약 6 내지 약 8주, 또는 약 4 내지 약 8주)을 갖는 여성에서 파열되지 않은 착상전 배아의 나팔관으로부터 수득될 수 있다. 작은 융모 조직을 적합한 배지 (예를 들어, 무혈청 α-MEM)에서 잘게 다지고, 현미경법 하에 식별한 후, 일정 기간 (예를 들어, 약 15분) 동안 트립신처리 (예를 들어, 약 3 ml의 TRYPLE® 셀렉트 효소 사용)하고, 배지 (예를 들어, 스테뮬레이트™ 인간 혈소판 용해물 세포 배양 배지 보충제를 갖는 α-MEM 또는 메센컬트™-ACF 플러스 배양 키트)를 첨가하여 반응을 중지할 수 있다. 접착성 세포를 수득하고, 적합한 조건에서 (예를 들어, 5% CO2에서 37 ℃에서 스테뮬레이트™ 인간 혈소판 용해물 세포 배양 배지 보충제를 갖는 조건화된 α-MEM 또는 메센컬트™-ACF 플러스 배양 키트에서) 배양할 수 있다.
키트/제조 물품
하나 이상의 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품이 본원에 개시되어 있다. 이러한 키트는 하나 이상의 컨테이너, 예컨대 바이알, 튜브 등을 수용하도록 구획화된 담체, 패키지 또는 컨테이너를 포함하며, 각각의 컨테이너(들)는 본원에 기재된 방법에 사용되는 별도의 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 컨테이너는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 시험 튜브 등을 포함한다. 일부 경우에, 컨테이너는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다.
본원에 제공된 제조 물품은 패키징 재료를 함유한다. 제약 패키징 재료의 예에는 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 컨테이너, 병, 및 선택된 제형 및 의도된 사용 방식에 적합한 임의의 패키징 재료가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 컨테이너(들)는 임의로 본원에 개시된 바와 같은 조성물에 세포를 포함한다. 이러한 키트는 임의로 본원에 기재된 방법에서의 이의 사용과 관련된 식별 설명 또는 라벨 또는 지침을 포함한다.
키트는 전형적으로 내용물 및/또는 사용 지침을 나열한 라벨, 및 사용 지침이 있는 패키지 삽입물을 포함한다. 지침 세트가 또한 전형적으로 포함될 것이다.
일부 경우에, 라벨은 컨테이너 상에 있거나 컨테이너와 회합되어 있다. 일부 경우에, 라벨을 형성하는 글자, 숫자 또는 다른 기호가 컨테이너 자체에 부착, 몰딩 또는 에칭되는 경우, 라벨은 컨테이너 상에 있으며; 예를 들어 패키지 삽입물로서 컨테이너를 또한 보유하는 리셉터클 또는 담체 내에 존재하는 경우, 라벨은 컨테이너와 회합되어 있다. 일부 경우에, 내용물이 특정 치료적 적용에 사용되어야 함을 나타내는 라벨이 사용된다. 라벨은 또한 본원에 기재된 방법에서와 같이 내용물의 사용 지침을 나타낸다.
의약, 조성물 및 이의 용도
본원에 기재된 방법에 의해 생산된 세포를 포함하는 조성물 (예를 들어, 시험관내 조성물, 제약 조성물 등) 및 의약이 본원에 개시되어 있다. 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함하는 원하는 정도의 순도를 갖는 조성물 또는 의약 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000))은 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합될 때 성분이 생물학적 활성을 유지하도록 허용하고 대상체의 면역계와 반응하지 않는 임의의 물질을 포함한다. 예에는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충된 염수 용액, 물, 에멀젼 예컨대 오일/물 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충된 염수 또는 일반 (0.9%) 염수이다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적인 방법에 의해 제형화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]; 및 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).
허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
시험관내 배양 또는 검정을 위한 본원에 기재된 생산된 세포의 용도가 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 세포는 면역형광 또는 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 검정에 사용하기 위한 것일 수 있다. 일부 경우에, 생산된 세포는 신경 줄기 세포 (NCS), 췌장 선조 세포 (PPC), 외배엽 세포, 중배엽 세포, 내배엽 세포, 간 세포 또는 간 선조 세포일 수 있다.
안전성 및 유효성에 대해 신약을 시험하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 신경 줄기 세포 (NSC)의 용도가 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 시험 작용제를 생산된 세포를 포함하는 배양물과 접촉시킬 수 있고, 효과를 결정할 수 있다. 시험 작용제가 세포에 독성이 있는 경우, 배양물의 증식이 감소 및/또는 사멸할 수 있다. 시험 작용제가 효능있는 경우, 배양물의 증식이 증가할 수 있다. 신경 줄기 세포의 경우, 시험 작용제는 운동 뉴런의 생산을 유도할 수 있다. 시험관내 또는 생체내에서 운동 뉴런을 생산하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 신경 줄기 세포 (NSC)의 용도가 본원에 기재되어 있다. 운동 뉴런 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 신경 줄기 세포 (NSC)의 용도가 본원에 기재되어 있다. 척수 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 신경 줄기 세포 (NSC)의 용도가 본원에 기재되어 있다. 시험관내에서 인공 조직 또는 장기를 생산하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 신경 줄기 세포 (NSC)의 용도가 본원에 기재되어 있다.
안전성 및 유효성에 대해 신약을 시험하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 췌장 선조 세포 (PPC)의 용도가 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 시험 작용제를 생산된 세포를 포함하는 배양물과 접촉시킬 수 있고, 효과를 결정할 수 있다. 시험 작용제가 세포에 독성이 있는 경우, 배양물의 증식이 감소 및/또는 사멸할 수 있다. 시험 작용제가 효능있는 경우, 배양물의 증식이 증가할 수 있다. PPC의 경우, 시험 작용제는 내분비 세포 및/또는 외분비 세포의 생산을 유도할 수 있다. 시험관내 또는 생체내에서 내분비 세포 및/또는 외분비 세포를 생산하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 PPC의 용도가 본원에 기재되어 있다. 췌장 손상에 의해 유발되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 PPC의 용도가 본원에 기재되어 있다. 췌장 손상의 치료를 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 PPC의 용도가 본원에 기재되어 있다. 시험관내에서 인공 조직 또는 장기 (예를 들어, 췌장)를 생산하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 PPC의 용도가 본원에 기재되어 있다.
실시예
본 출원은 본 출원의 예시적인 실시양태로서 제공되는 하기 비제한적인 실시예를 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 실시양태를 보다 완전하게 예시하기 위해 제시되지만, 본 출원의 광범위한 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. MPSC는 89 집단 배가에 도달하였다
배아외 줄기 세포 (예를 들어, 영양막 줄기 세포)는 공급원 세포로서 인간 공여자로부터 유래되었다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 세포를 배양하여 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC)로 성장시키기 위해 여러 비제한적 배양 배지를 시험하였다.
표 1. MPSC 성장을 위한 배양 배지.
Figure pct00001
시딩 밀도를 10,000에서 2,000 - 4,000개 세포/㎠로 낮추는 것은 MPSC에 대한 집단 배가 수를 개선하였다. 3000 - 5000개 세포/㎠의 밀도로 시딩된 세포의 3일 계대배양은 유사한 PD 수를 생성한다. 4000/3000개 세포/㎠로 시딩된 세포의 3일/4일 계대배양을 번갈아 하는 것은 이전 계대에 대해 4000개 세포/㎠에서 3일 계대배양과 유사한 PD 수를 생성한다. 배양 환경은 21% O2/ % CO2, 또는 2% O2/ 5% CO2/ 93% N2일 수 있다.
90일에 걸친 일부 성장 결과, 즉 3일-계대배양의 30 계대는 도 1에 표시되며, 이는 90일의 시간 프레임에서 집단 배가 (PD)에 의해 측정된 MPSC의 3일-계대배양 성장 곡선을 보여주는 라인 차트이다. MPSC는 약 12일에 최대 25 PD, 약 30일에 최대 50 PD, 약 63일에 최대 75 PD, 약 90일에 최대 89 PD에 도달하였다.
MPSC는 무이종 배지에서 배양될 때 ~27시간의 배가 시간으로 ~70-80 배가의 연장된 집단 배가 능력을 보유한다. 세포가 집단 배가하는데 평균 약 27시간이 걸리며, 이는 방정식 T= td / log2[(2 - y)/(1 - y)]로 계산될 수 있으며, 여기서 T는 세포 주기의 지속기간이고, td는 세포 수의 평균 2배 시간이고, y는 G0 단계에서 세포의 비율이다.
이러한 연장된 배가 능력은 MPSC를 산업적 규모에서 확장을 위한 이상적인 세포 집단으로 만들어, 공여자 또는 생물학적 공급원으로부터 반복된 단리에 대한 필요성을 제거한다. MPSC의 큰 배치 크기 잠재력은 단일 파생물로부터 충분한 MPSC를 생성하여, 치료제 개발 및 제조를 간소화하고, 다중 은행과 연관된 생성물 변동성 및 상이한 공여자로부터 비교가능한 제품의 제조 및 출시 비용을 감소시킴으로써 클리닉에서 줄기 세포 기반 치료제의 실현을 가속화할 것이다.
실시예 2. MPSC는 염색체 이상을 갖지 않는다
도 2a-2d는 상이한 집단 배가로부터의 4개의 상이한 MPSC 샘플로부터의 캐리오스타트™의 전체 게놈 도면을 보여준다. 캐리오스타트™ 검정은 염색체 이상의 디지털 시각화를 허용할 수 있다. 검출될 수 있는 구조적 이상의 크기는 염색체 이득의 경우 약 > 2 Mb (메가베이스)이고 염색체 손실의 경우 약 > 1 Mb이다. 게놈 DNA를 세포로부터 정제하고, 게놈 DNA를 캐리오스타트™용 진칩(GENECHIP)®에 첨가하였다. 진칩®은 염색체의 변이체의 카피 수를 결정할 수 있다. 도 2a-2d는 모든 체세포 및 성염색체를 하나의 프레임에 표시하는 전체 게놈 도면을 보여준다. 도 2a는 16.5 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이고, 도 2b는 44.5 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이고, 도 2c는 62.6 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이고, 도 2d는 71.5 집단 배가로부터의 MPSC 샘플이다. 평활 신호 플롯 (우측 y-축)은 마이크로어레이에서 프로브의 신호 강도를 도시하는 log2 비율의 평활화이다. 값 2는 정상적인 카피 수 상태를 나타낼 수 있다 (CN = 2). 값 3은 염색체 이득을 나타낼 수 있다 (CN = 3). 값 1은 염색체 손실을 나타낼 수 있다 (CN = 1). 회색 신호는 각 개별 염색체 프로브에 대한 원시 신호를 나타내는 반면, 검은색 신호는 카피 수 및 이상 (있는 경우)을 식별하는데 사용되는 정규화된 프로브 신호를 나타낸다. 관찰가능한 염색체 이상은 도 2a-d에서 발견되지 않았다. MPSC 세포는 염색체 이상 없이 다중 집단 배가를 거칠 수 있다. 예를 들어, 모노클론 집단을 확장한 후 나중에 사용하기 위해 동결할 수 있다. 일단 세포가 모노클론의 동결된 스톡 배양물로부터 성장되면, 세포는 실질적인 염색체 이상 없이 확장될 수 있다. MPCS의 염색체 안정성은 불멸과 연관된 유전적 이상 또는 돌연변이를 종종 나타내는 인간 배아 줄기 세포 및 iPSC에 비해 또 다른 장점을 제공한다.
실시예 3. 특이적 분자 바이오마커의 발현에 의한 MPSC의 특징화
MPSC는 면역-특권 마커 HLA-G를 발현한다. 성인 또는 출생후 인간 중간엽 간질 세포와 달리, 본원의 MPSC는 백혈구 상의 HLA-G 수용체에 결합하여 활성화된 T 세포에서 아폽토시스의 촉발, 자연 살해 (NK) 세포 및 수지상 세포의 활성의 조정, 및 T-세포 증식의 억제를 포함한 수많은 메커니즘을 통해 면역 기능을 저해하는 태반에 독점적인 주요 조직적합성 복합체 클래스 I 항원인 인간 백혈구 항원-G (HLA-G)를 발현한다. 도 3을 참조하면, 이 도면은 1차 항체 4H84로 염색된 MPSC를 보여준다. 도 3에서, MPSC를 메센컬트® ACF 플러스 배지에서 배양물로부터 수확하였다. 세포를 유동 세포계측 세척 완충액 (깁코(Gibco) DPBS, 염화칼슘 또는 염화마그네슘, 약 2% 소 태아 혈청 및 약 0.1% 아지드화나트륨이 실질적으로 없음)에 재현탁하고, 샘플당 약 0.25-0.5 × 106개 세포를 유동 세포계측 튜브에 분취하고, 세포를 원심분리하였다. 세포를 실온에서 약 15분 동안 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정하였다. 일부 경우에, 고정 후, 세포를 약 500 μl (마이크로리터)의 냉 투과화 완충액 III (BD 바이오사이언시스)으로 투과화시킨 후, 세포를 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 투과화는 세포내 물질이 염색되는 것을 허용하였다. 인큐베이션 후, 세포를 유동 세포계측 세척 완충액으로 세척하고, 원심분리하고, 유동 세포계측 염색 완충액 (R&D 시스템)에 재현탁하였다. 1차 항체 염색은 HLA-G 1차 항체 (예를 들어, 4H84 항체)의 희석물을 세포에 첨가하고 실온에서 인큐베이션하였을 때 발생하였다. 세포를 유동 세포계측 세척 완충액으로 여러 번 세척하였다. 1차 항체가 세포에 결합된 후, 2차 항체를 첨가하였다. 2차 항체 절차는 암실에서 진행되었다. 2차 항체를 유동 세포계측 염색 완충액에 약 1:2000의 희석률로 첨가하였다. 세포를 약 100 μl의 희석된 2차 항체 용액에 재현탁하고, 약 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 유동 세포계측 세척 완충액으로 여러 번 세척하였다. 세포를 세척한 후, 세포를 유동 세포계측 염색 완충액에 약 0.5 × 106개 세포의 농도로 재현탁하였다. 세포를 재현탁한 후, 세포를 유동 세포계측에 의해 샘플링하였다. 1차 항체 MEM-G/11은 막 결합된 HLA-G1 이소형을 인식할 수 있다. 1차 항체 4H84 항체는 HLA-G의 7개의 이소형의 알파 도메인을 인식할 수 있다. 도 3은 1차 항체 HLA-G 4H84로 투과화 및 염색된 MPSC를 보여준다. 염색은 MPSC 내 또는 상의 HLA-G 이소형의 존재를 보여준다. 염색은 1:50 1차 항체 희석물 중 약 76%의 세포가 이소타입 대조군과 비교하여 양성임을 보여준다. 도 4는 1차 항체 4H84 (하단 패널) 및 1차 이소타입 대조군 항체 마우스 IgG1 (상단 패널)로 염색된 세포를 보여준다. 세포는 IgG1 항체로 제한된 염색을 보여주고, 사건의 99.64%는 4H84 항체로 염색되었으며, 이는 항체가 MPSC에 특이적임을 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이 MPSC에서 HLA-G의 발현은 세포가 면역 특권 부위, 예를 들어 태아에 접근하는 것을 허용할 수 있다.
본원의 MPSC는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 측정된 바와 같이 특징적인 마커를 발현함으로써 인간 MSC 표현형 및 형태학을 나타내었으며, 하기 표 2를 참조한다.
표 2. 중간엽 간질 세포 - 유사 표현형을 나타내는 마커의 발현
Figure pct00002
본원의 MPSC는 중간엽 간질 세포 (MSC)에 대한 대안으로서 해결책을 제공할 수 있다. 인간 MSC는 면역저해 효과를 발휘하고, 시험관내에서 삼중-계통 분화를 나타내고, 다양한 적응증에 대해 환자에게 안전하게 전달되었으며, 틈새 적응증, 예컨대 자가면역-매개 항문주위 누공 및 이식편 대 숙주 질환을 치료하도록 승인되었다. 그러나, MSC-기반 요법의 광범위한 채택은 세포 노화에 도달하기 전에 약 30-40 배가의 집단 배가 한계로 인해 MSC의 대량 배치를 제조할 수 없기 때문에 방해를 받았다.
본원의 MPSC는 FACS에 의해 측정된 바와 같이 자연 살해 세포 표현형을 나타내었으며, 하기 표 3을 참조한다.
표 3. 자연 살해 세포 표현형을 나타내는 마커의 발현
Figure pct00003
MPSC는 β-hCG, HLA-G, 열 충격 단백질 90 (HSP90) 및 CDX2를 포함하는 다양한 세포 바이오마커를 면역세포화학적으로 발현하였다 (도 5a). 그러나, MPSC는 증식 마커 Ki-67, HSP70, 종양 저해제 p53, 및 세포-세포 융합체 단백질 신시틴을 발현하지 않았으며 (도 5b), 이는 MPSC가 TE-분화된 영양막의 제1 위치를 나타낸다는 개념을 뒷받침한다. 구체적으로, MPSC는 상이한 항체를 사용하여 유동 세포계측 분석 (FACS)에 의해 HLA-A,B,C 및 표면 및 세포내 HLA-G를 발현하였다 (도 5c; 도 5d). 그러나, 이들은 HLA-DR을 발현하지 않았다.
도 5d는 MPSC에서 HLA-G 이소형의 대표적인 FACS 이미지이다. 모든 7개의 이소형 중 극소수가 세포 표면에서 검출되었지만 (상단 좌측 칼럼), Ab 4H84를 사용함으로써 투과화된 MPSC에서 모든 HLA-G 7 이소형의 68.7%가 검출되었다 (좌측 하단 칼럼). 세포 표면에서 HLA-G G1이 거의 검출되지 않았지만 (상단 중앙 칼럼), Ab MEM-G/11에 의해 HLA-G G1의 8.1% (상단 중앙 칼럼)가 검출되었다. 유사하게, 세포 표면에서 HLA-G G1, G3, G5가 거의 검출되지 않았지만 (상단 우측 칼럼), Ab MEM-G9에 의해 HLA-G 중 어느 것도 검출되지 않았다.
인간 MPSC는 면역 세포-연관 바이오마커를 나타낸다. 세포를 면역세포화학 및 FACS 분석으로 특징화하였다. 결과는 MPSC가 하기를 포함하는 면역 세포와 연관된 다양한 바이오마커를 발현한다는 것을 보여주었다: NK 세포의 분화 클러스터 (CD)56, CD16dim, 억제 수용체 KIR2DL4, CD11b, 활성화 수용체 NKp46 및 CD10 (도 6a); T 세포의 TCR, CD49f, ILT-4, CD3, CD4, CD8, CD44, CD90/Thy-1, CD44 및 CD166 (도 6b); 수지상 세포의 CD19 및 CD141 (도 6c 및 6d); 대식세포의 CD14 (도 6e); 조혈 줄기 세포의 Flt3L (도 6f) 및 CD34 (도 6g); 및 림프구의 CD38 (도 6g). 후속적으로, MPSC에서 상기 바이오마커의 발현을 8개의 독립적 세포주로 분석하여, NK 및 T 세포 바이오마커의 유사한 패턴을 나타내었으며, 여기서 (CD16+CD56)+ 세포 및 CD107(+) 세포는 MPSC에서 가장 높은 발현을 나타내었다. NK 세포 및 T 세포의 바이오마커는 MPSC에서 가장 많은 면역 세포를 점유한 반면, CD107(+)CD(16+56)(+) 세포 및 CD8(+)CD(16+56)(+) 세포는 FACS 분석에 의해 MPSC에서 가장 많은 세포 집단을 점유하였다.
실시예 4. 상당한 부분의 MPSC는 모노클로날이다
MPSC 배양물로부터 MPSC 모노클론을 수득하였다. 세포 유형을 기록하기 위해 MPSC를 도립 현미경에 배치하여 성장시켰다. 오래된 배지를 제거하고, 세포를 멸균 PBS로 세척하였다. TRYPLE® 용액을 MPSC 배양물에 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 약 6분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 분리하였다. 배양 배지를 세포에 첨가하여 TRYPLE® 반응을 중지시켰다. 세포를 수집하고, 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 계산하였다. 약 200개의 세포를 제거하고, 원심분리기 튜브에 배치하였다. 배지를 보충하고, 세포를 멀티채널 피펫으로 96 웰 플레이트에 나누었다. 96 웰 플레이트를 37 ℃, 5% CO2에서 성장시키고, 약 14일 동안 인큐베이션하였다. 이 프로세스 동안 2-3일마다 배지를 변경하였다. 오래된 배지를 세척하고, TRYPLE® 용액을 세포에 첨가하였다. 짧은 인큐베이션 후, 배양 배지를 첨가하여 TRYPLE® 반응을 중지시키고, 세포를 6 웰 플레이트로 이동시키고, 37 ℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 100mm 디쉬로 계대배양할 때까지 2-3일마다 배양 배지를 변경하고, 37 ℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 2-3일마다 배지를 변경하였다. 모노클론 세포는 80-95% 두께에 도달하였을 때 동결시켰다. 공여자 자궁외 조직으로부터, 세포를 혼합된 세포와 함께 야생형 계대로서 확장하거나 모노클론으로 확장하였다. 다중 용량을 제공하도록 모노클론을 확장하였다. 예를 들어, 공여자 자궁외 조직으로부터 유래된 100만 개의 세포마다 약 125,000개의 모노클론을 배양할 수 있다. 각 모노클론은 7×1028개 세포에 대한 잠재력을 갖는다. 용량당 1억 개의 세포에서, 각 모노클론은 7×1020 용량을 만들 수 있다. 수집된 각 자궁외 조직으로부터의 총 잠재력: 125,000 × 7×1020 용량 = 8.8×1025 용량. 각 MPSC 모노클론은 완전 생성물 사이클을 지원할 수 있다.
1M 세포의 모든 바이알은 잠재적으로 순 약 130,000개의 모노클론일 수 있다. 하기 표 4를 참조한다.
표 4. MPSC 중 모노클론 백분율
Figure pct00004
실시예 5. MPCS는 병원체가 없다
공급원 세포가 감염되었는지 또는 병원체가 없는지에 관계없이, 본원에서 수득된 인간 MPCS 세포는 병원체가 없었다. MPSC의 9개 세포주를 시험하였다. 코리네박테리움 보비스, 코리네박테리움 종 (HAC2), EBV, HAdV, 한타안 한타바이러스, HCMV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, HHV 6, HHV 8, HIV1, HIV2, HPV16, HPV18, HSV 1, HSV 2, HTLV 1, HTLV2, LCMV, 미코플라스마 종, 서울 한타바이러스, 신 놈브레 한타바이러스, 트레포네마 팔리둠, VZV를 검출하기 위해 PCR 평가를 수행하였다. 모든 세포주는 h-IMPACT I 패널에서 25개 병원체 모두에 대해 음성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 6. 최적화 HLA-G FACS 염색 (표면 vs. 세포내)
MPSC 야생형 (WT) 세포주 1 (MPSC1)을 영양 배지 + 세포 부착 기재에서 배양하고, 5% CO2와 함께 37 ℃에서 12회 계대하였다. 세포 표면 및 세포내 염색을 위해 고정 및 투과화된 세포를 준비하였다. 염색 조건은 하기 표 5와 같다:
표 5:
Figure pct00005
1차 항체 히스토그램 결과는 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200 희석에 대해 하기 표 6에 나타낸다.
표 6.
Figure pct00006
1차 항체 도트 플롯 결과 (A-FL1 vs. SSC)는 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200 희석에 대해 하기 표 7에 나타낸다.
표 7.
Figure pct00007
1차 항체 도트 플롯 결과 (FL1 vs. FL2)는 1:25, 1:50, 1:100 및 1:200 희석에 대해 하기 표 8에 나타낸다.
표 8:
Figure pct00008
MPSC1을 영양 배지 + 세포 부착 기재에서 배양하고, 5% CO2와 함께 37 ℃에서 7회 (19.8 집단 배가) 계대하였다. HLA-G 4H84 항체 및 HLA-G MEM-G/11 항체를 사용한 세포 표면 및 세포내 염색을 위해 고정 및 투과화된 세포를 준비하였다. 표면 염색 후 고정된 세포를 HLA-G MEM-G/11 항체로 분석하였다. 결과는 하기 표 9에 나타낸다.
표 9:
Figure pct00009
대조군과 비교한 FLA-G 4H86 도트 플롯 결과 (FL1 vs. SSC)와 함께 MPSC 1의 HLA-G 염색은 표 10에 나타낸다:
표 10:
Figure pct00010
실시예 7. 발달 세포 은행의 생성 및 이의 평가
4개의 배아외 줄기 세포주 (예를 들어, 인간 영양막 줄기 세포)를 공급원 세포로서 활용하였다: 사멸성 만능 줄기 세포주 1 (MPSC1), MPSC2, MPSC3 및 MPSC4. 세포주를 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재)에서 별도로 배양함으로써 세포 은행을 개발하였다. 세포의 계대배양물을 3000 - 4000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하고, 3일 또는 4일 동안 배양하였다. 연구의 종점은 10 PD, 35 PD, 55 PD, 및 70 PD였다. 그 후, FACS 특징화, MPSC/NK 마커, 및 HLA-G에 의해 표현형을 평가하였다. 또한, 생산된 세포의 기능성을 평가하였다.
실시예 8. MPSC/NK 생산, 표현형 및 기능성 실험
사멸성 만능 줄기 세포주 1 (MPSC1)
사멸성 만능 줄기 세포주 1 (MPSC1)을 공급원 세포로서 활용하였다. 배양물을 3000/4000개 세포/㎠로 시딩하고, 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트 + 세포 부착 기재)에서 배양하고, 확장하였다. 2개의 세포 은행 (CB)을 동결하였다: CB2: 31.3 PD 및 CB3: 53.1 PD. 표현형 및 기능성 검정을 수행하였다.
C1 특징화는 하기와 같았다: MPSC1을 기능성에 대해 평가하였다 (삼중-계통 분화 및 세크레톰 분석).
C2 특징화는 하기와 같았다: MPSC1 P13, 40.3 PD를 FACS에 의해 MSC/NK 마커 및 표현형 결정을 위한 HLA-G 및 기능성 (삼중-계통 분화 및 세크레톰 분석)에 대해 평가하였다.
사멸성 만능 줄기 세포주 2
사멸성 만능 줄기 세포주 2 (MPSC2)를 공급원 세포로서 활용하였다. 배양물을 3000/4000개 세포/㎠로 시딩하고, 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재)에서 배양하고, 확장하였다. 3개의 세포 은행 (CB)을 동결하였다: CB1: 8.1 PD; CB2: 29.3 PD; 및 CB3: 47.4 PD. 표현형 및 기능성 검정을 수행하였다. 평균 배가 시간 (P4-P6)은 26.9시간이었다.
C1 특징화는 하기와 같았다: MPSC2 계대 5 (P5), 11.2 계대 배가 (PD)를 FACS에 의해 MSC/NK 마커 및 표현형 결정을 위한 HLA-G 및 기능성 (삼중-계통 분화 및 세크레톰 분석)에 대해 평가하였다.
C2 특징화는 하기와 같았다: MPSC2 P16, 36.9 PD를 FACS에 의해 MSC/NK 마커 및 표현형 결정을 위한 HLA-G 및 기능성 (삼중-계통 분화 및 세크레톰 분석)에 대해 평가하였다.
사멸성 만능 줄기 세포주 3
사멸성 만능 줄기 세포주 3 (MPSC3)을 공급원 세포로서 활용하였다. 배양물을 3000/4000개 세포/㎠로 시딩하고, 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재)에서 배양하고, 확장하였다. 3개의 세포 은행 (CB)을 동결하였다: CB1: 8.1 PD; CB2: 25.5 PD; 및 CB3: 37.3 PD. 표현형 및 기능성 검정을 수행하였다. 평균 배가 시간 (P4-P6)은 32.7시간이었다.
C1 특징화는 하기와 같았다: MPSC3 계대 5 (P5), 10.2 계대 배가 (PD)를 FACS에 의해 MSC/NK 마커 및 표현형 결정을 위한 HLA-G 및 기능성 (삼중-계통 분화 및 세크레톰 분석)에 대해 평가하였다.
C2 특징화는 하기와 같았다: MPSC3 P18, 33.3 PD를 FACS에 의해 MPSC/NK 마커 및 표현형 결정을 위한 HLA-G 및 기능성 (삼중-계통 분화 및 세크레톰 분석)에 대해 평가하였다.
사멸성 만능 줄기 세포주 4
사멸성 만능 줄기 세포주 (MPSC4)를 공급원 세포로서 활용하였다. 배양물을 3000/4000개 세포/㎠로 시딩하고, 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재)에서 배양하고, 총 약 6.5 PD로 확장하였다. 세포를 동결하거나, FACS 분석에 의해 중간엽 줄기 세포 (MSC)/ 자연 살해 NK 마커 및 HLA-G에 대해 특징화하였다. P4-P5로부터의 평균 배가 시간은 대략 43.7시간이었다.
성장 곡선
4개의 MPSC 세포주의 성장 곡선은 도 7에 나타낸다. 이 실험을 위한 MPSC1은 2회의 동결/해동 사이클을 거쳤으며, 이는 배양에서 최대 PD 수를 감소시켰을 가능성이 있다.
MPSC1, MPSC2, MPSC3 및 MPSC4에 대한 세포 은행 (CB) 1, 2, 3 및 4의 성장 곡선 및 수집물에 대한 제2 실험의 결과를 수득하였다. MPSC4의 배가는 느렸고, 해당 세포주에 대한 실험은 중단되었다.
Figure pct00011
표현형 특징화를 각 세포주에 대해 하기 계대 배가 (PD) 시간에서 수행하였다:
Figure pct00012
MPSC/NK 마커 및 HLA-G의 세포 표면 항원 발현을 FACS를 통해 평가하였다. 또한, 표준 배양 전도에서 플라스틱에 대한 접착성 및 골모세포, 지방세포 및 연골모세포로의 다능성 분화 잠재력을 평가하였다.
Figure pct00013
C1 및 C2에 대한 MPSC 마커, HLA-G의 FACS 특징화는 하기와 같다:
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
기능성: 하기 분화 프로토콜을 사용하여 삼중-계통 분화를 평가하였다:
Figure pct00017
MPSC3은 지방생성 분화 배지에서 7주 후에 지방세포로의 분화를 나타내지 않았다. 대조적으로, MPSC1 및 MPSC2는 각각 5.5주 및 7주에 지방세포로 분화하는 능력을 나타내었다. 데이터는 표시되지 않았다.
3주차에, MPSC1, MPSC2 및 MPSC3 C1 세포는 대조군과 비교하여 알리자린 레드 염색을 활용하여 골형성을 나타내었다. 데이터는 표시되지 않았다.
실시예 9. 저산소증에 의해 유도된 분화
배아외 줄기 세포주 (예를 들어, 인간 영양막 줄기 세포)를 컨플루언시에 도달할 때까지 (예를 들어, 약 3000개 세포/㎠ 내지 약 9000개 세포/㎠, 또는 약 6000개 세포/㎠) 영양 배지 (예를 들어, 세포 부착 기재를 갖는 메센컬트™)에서 성장시켰다. 세포를 세척하고, 배지를 보충제 없이 대체하였다. 챔버에서 저산소증을 유도하였다 (예를 들어, 2% O2 기체 혼합물에서 약 24시간 동안 배양). 배지를 수집하고 사용할 때까지 동결하였다. 3개 세포주 모두로부터의 배지를 큐안티바디™ 인간 킬로플렉스 어레이(QUANTIBODY™ Human Kiloplex Array) (레이바이오테크™ 라이프, 인크.(RAYBIOTECH™ Life, Inc.))를 사용하여 시험하여 1000개의 단백질을 정량적으로 분석하였다. MPSC1 및 MPSC2에 대한 실험을 반복하였다. 간략하게, 샘플을 프로세싱하고, 분석물질 농도 (pg/mL)를 결정하고, 표준 곡선과 비교하였다. 데이터는 검출 한계 (LOD) 미만의 % 샘플, LOD 초과이지만 <3×LOD인 % 샘플, 최상의 신뢰 구간 내의 % 샘플, 및 최대값 초과의 % 샘플로서 결정되었다.
MPSC의 집단 배가 및 배가 시간은 하기와 같다. DT 시간 (hrs.)*: 완전 세포 회복을 허용하기 위해 해동 직후 처음 2 계대를 배제하고 해동 시 연속 3 계대에 걸쳐 계산된 평균 배가 시간. ** PD: 상응하는 배양 조건에 대해 배양에서 달성된 최대 집단 배가 수.
Figure pct00018
MPSC 음성 마커에 대한 C1 세포의 FACS 특징화는 하기와 같다:
Figure pct00019
MPSC 양성 마커에 대한 C1 세포의 FACS 특징화는 하기와 같다:
Figure pct00020
NK 양성 마커에 대한 C1 세포의 FACS 특징화는 하기와 같다:
Figure pct00021
췌장 선조 세포 및 신경 줄기 세포로의 MPSC 분화를 결정하였다. 3개의 상이한 농도 및 3개의 상이한 시점에서 FACS 분석 및 mRNA 분석을 수행하기 위해 샘플을 수집하였다.
Figure pct00022
실시예 10. 면역저해성 세포의 생성 및 IDO 분비 평가
3개의 배아외 줄기 세포주 (예를 들어, 인간 영양막 줄기 세포)를 공급원 세포로서 활용하였다: 사멸성 만능 줄기 세포주 1 (MPSC1) P5 세포, MPSC2 P8 세포, 및 MPSC3 P8 세포. 세포를 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재)에서 별도로 배양하였다. 세포의 계대배양물을 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하고, 약 3일 동안 배양하고, 24시간 동안 0 ng/mL (대조군), 약 20 ng/mL, 약 50 ng/mL 또는 약 100 ng/mL의 인터페론 감마 (IFN-γ)로 처리하였다. 그 후, 세포 및 상청액을 수집하였다. 얻어진 MPSC 세포의 면역저해 능력을 ELISA를 통해 평가하였다.
IFN-γ 자극 시 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 분비를 평가하였다. 도 8a는 검정에 대한 표준 곡선을 예시한다. 도 8b는 대조군과 비교하여 IDO 분비에 대한 다양한 농도의 IFN-γ 자극에서의 3개의 세포주의 결과를 예시한다. IFN-γ로 프라이밍된 MPSC는 IDO 분비를 통계적으로 증가시키는 것으로 밝혀지지 않았다.
실시예 11. 면역저해성 세포의 생성 및 키뉴레닌 분비 평가
인간 영양막 줄기 세포주 1 (MPSC1) P5 세포를 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재)에서 배양하였다. 세포의 계대배양물을 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하고, 약 3일 동안 배양하고, 24, 48 및 72시간 동안 0 ng/mL (대조군), 약 20 ng/mL, 약 50 ng/mL 또는 약 100 ng/mL의 인터페론 감마 (IFN-γ)로 처리하였다. 그 후, 세포 및 상청액을 수집하였다.
IFN-γ 자극 시 키뉴레닌 분비를 평가하였다. 도 9a는 검정에 대한 표준 곡선을 예시한다. 도 9b는 대조군 및 배지 단독과 비교하여 24, 48 및 72시간에서 3개의 상이한 농도에서 키뉴레닌 분비에 대한 IFN-γ 자극의 효과의 결과를 예시한다. IFN-γ로 프라이밍된 MPSC 세포는 키뉴레닌 분비를 통계적으로 증가시키는 것으로 밝혀지지 않았다.
실시예 12. 면역저해성 세포의 생성 및 IL-2 분비 평가
사멸성 만능 줄기 세포주 1 (MPSC1) P5 세포를 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재)에서 배양하였다. Jurkat 세포 (약 100,000개 세포/mL)를 24시간 동안 1 μg/mL 깁코® 피토헤마글루티닌, M 형태 (PHA-M) + 50 ng/mL 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)로 활성화시켰다.
MPSC1 세포 및 Jurkat 세포의 공동배양을 확립하였다. 샘플은 (1) MPSC1 단독, (2) MPSC1 + 휴지 Jurkat 세포, (3) MPSC1 + 활성화된 Jurkat 세포, 및 (4) 활성화된 Jurkat 세포 단독이었다. MPSC를 약 2000 내지 약 3000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하였다. Jurkat 세포를 약 50,000 내지 약 500,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 24 또는 48시간 동안 공동배양하고, 상청액을 수집하였다. IL-2 분비를 ELISA를 통해 평가하였다. 도 10a는 검정에 대한 표준 곡선을 예시한다. 도 10b는 24 및 48시간에서 IL-2 분비에 대한 IFN-γ 자극의 효과의 결과를 예시한다. MPSC1 및 활성화된 Jurkat 세포의 공동배양은 가장 높은 IL-2 분비를 유도하였다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 도 10c는 대조군과 비교하여 24시간의 공동배양에서 약 3000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 도 10d는 대조군과 비교하여 24시간의 공동배양에서 약 2000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 도 10e는 대조군과 비교하여 48시간의 공동배양에서 약 3000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 도 10f는 대조군과 비교하여 48시간의 공동배양에서 약 2000개 세포/㎠의 MPSC 시딩 밀도의 효과를 예시한다. 용량 의존적 증가가 관찰되었다. MPSC는 활성화된 Jurkat 세포에 의한 IL-2 분비를 감소시키기보다는 증가시켰다. 샘플의 FACS 표현형을 결정하였으며, 24 및 48시간 (hr)에서의 결과가 하기 제공된다.
Figure pct00023
실시예 13. 줄기 세포의 췌장 선조 세포 (PPC) 또는 신경 줄기 세포 (NSC)로의 분화
MPSC1
대략 1×106개 세포의 줄기 세포 (예를 들어, MPSC1 P4)를 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재, 또는 MEM-알파 + 스테뮬레이트)에서 해동하였다. 그 후, 세포를 P5에서 확장하였다: 4000개 세포/㎠ 메센컬트™ + 세포 부착 기재 또는 4000개 세포/㎠ MEM-알파 + 스테뮬레이트. PPC 또는 NSC 분화는 P6에서 시작되었다. 배양 및 분화 조건은 하기와 같다:
Figure pct00024
마이크로담체에 대한 접착 및 현탁액 확장에 대해 세포를 평가하였다. 확장은 100 mL 생물반응기에서 발생하였다.
MPSC2
대략 1×106개 세포의 줄기 세포 (예를 들어, MPSC2 P4)를 영양 배지 (예를 들어, 메센컬트™ + 세포 부착 기재, 또는 MEM-알파 + 스테뮬레이트)에서 해동하였다. 그 후, 세포를 P5에서 확장하였다: 5000개 세포/㎠ 메센컬트™ + 세포 부착 기재 또는 5000개 세포/㎠ MEM-알파 + 스테뮬레이트. PPC 또는 NSC 분화는 P6에서 시작되었다. 배양 및 분화 조건은 하기와 같다:
Figure pct00025
분화 실험 설정
Figure pct00026
신경 줄기 세포 FACS 특징화
MPSC1 배양 조건 1: 신경 줄기 세포 마커
Figure pct00027
MPSC1 배양 조건 2: 신경 줄기 세포 마커
Figure pct00028
MPSC2 배양 조건 1: 신경 줄기 세포 마커
Figure pct00029
MPSC2 배양 조건 2: 신경 줄기 세포 마커
Figure pct00030
생산된 세포의 NCS 마커는 NCAD, NESTIN, SOX2, PAX6 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 한 경우에, NCS 세포는 N-CAD, NESTIN, SOX2 및 PAX6 중 하나를 포함한다. 한 경우에, NCS 세포는 NCAD, NESTIN, SOX2 및 PAX6 중 2개를 포함한다 (예를 들어, NCAD 및 NESTIN, NCAD 및 SOX2, NCAD 및 PAX6, NESTIN 및 SOX2, NESTIN 및 PAX6, 또는 SOX2 및 PAX6). 한 경우에, NCS 세포는 NCAD, NESTIN, SOX2 및 PAX6 중 3개를 포함한다 (예를 들어, CAD/NESTIN/SOX2, CAD/NESTIN/PAX6, NESTIN/SOX2/PAX6). 한 경우에, NCS 세포는 NCAD, NESTIN, SOX2 및 PAX6 모두를 포함한다.
MPSC1 배양 조건 1: 췌장 선조 세포 마커
Figure pct00031
MPSC1 배양 조건 2: 췌장 선조 세포 마커
Figure pct00032
볼드체는 FBF 처리 후 지속적으로 증가 또는 감소된 마커를 나타낸다.
Figure pct00033
MPSC2 배양 조건 1: 췌장 선조 세포 마커
Figure pct00034
MPSC2 배양 조건 2: 췌장 선조 세포 마커
Figure pct00035
생산된 세포의 PPC 마커는 PDX1, FOXA2, SOC9 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 한 경우에, PPC 세포는 PDX1, FOXA2 및 SOC 중 하나를 포함한다. 또 다른 경우에, PPC 세포는 PDX1, FOXA2 및 SOC 중 2개를 포함한다. 예를 들어, PPC는 PDX1 및 FOXA2, PDX1 및 SOC, 또는 FOXA2 및 SOC를 포함할 수 있다. 또 다른 경우에, PPC 세포는 PDX1, FOXA2 및 SOC 모두를 포함한다.
실시예 14. MPSC 제조 규모 확대
Figure pct00036
Figure pct00037
MPSC1 세포 (약 10000개 세포/㎠)를 진탕기 상에서 마이크로담체와 함께 배양하였다. (1) 메센컬트™, (2) 메센컬트™ + BSA, (3) 메센컬트™ + PLU, 또는 (4) 루스터(Rooster) 배지에서 3일 확장 후, 세포를 트립판-블루 배제 시험 및 살아있는/죽은 영상화에 의해 분석하였다.
도 11a는 72시간에 세포 수를 예시하는 그래프이다. 각 막대에서, 죽은 세포는 상단에 있고, 살아있는 세포는 아래쪽에 있다. 도 11b는 각 유형의 배지에서 집단 배가를 예시하는 그래프이다.
실시예 15. 생물반응기에서 MPSC 확장
마이크로담체와 함께 MPSC (약 4,600개 세포/㎠)를 약 7일 동안 25 rpm에서 100 mL PBS 생물반응기에서 루스터 MXC XF 배지에서 배양하였다. 세포 카운트 및 생존성을 결정하였다. 접착 vs. 현탁 배양을 비교하여 세포 마크의 FACS 특징화를 수행하였다.
도 12a는 상이한 배양일에 세포 카운트를 나타내는 그래프이다. △D2-D6= 44,000,000개 세포. 도 12b는 배양 동안 % 살아있는 세포를 나타내는 그래프이다. 도 12c는 접착 vs. 현탁 배양을 비교하는 집단 배가를 나타내는 그래프이다. △D2-D6= 4.9 PD. 접착 배양은 초기에 현탁 배양보다 빠르게 배가되었지만, 시간 경과에 따라, 현탁 배양은 더 높은 비율의 집단 배가를 달성하였다.
접착 및 현탁 세포 배양에 대한 MPSC 및 NK 마커는 하기 나타낸 바와 같다.
Figure pct00038
Figure pct00039
추가 최적화
Figure pct00040
결과의 요약
성장 곡선 분석은 상이한 MPSC 계통 간의 상이한 성장 특성을 보여준다: MPSC4 < MPSC3 < MPSC2 < MPSC1. MSC/NK 마커에 대한 FACS 특징화는 MPSC4 세포주에 대한 이종 세포 집단을 보여주며; MPSC2, MPSC3 및 MPSC1 세포주는 동종이고 코어 MSC 마커를 발현한다. 메센컬트™ 및 MEM-α+스테뮬레이트 배지를 사용한 PPC 및 NSC로의 단기 분화는 배지-의존적 마커 발현을 보여주며; MPSC1 및 MPSC2 세포주 둘 모두는 분화 후 PPC, NSC 및 MPSC 마커의 조합을 발현한다. 활성화된 T 세포 유사 계통 (예를 들어, Jurkat 세포)과의 공동배양에서, MPSC는 Jurkat 세포에서 활성화된 IL-2 분비를 자극할 수 있었다.
일부 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서만 제공된다. 본 발명을 벗어나지 않고 수많은 변형, 변화 및 치환이 발생할 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.

Claims (95)

  1. 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단으로서, MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현하고, MPSC 집단은 MPSC 배양 시작으로부터 약 90일 이내에 적어도 89 집단 배가에 도달할 수 있는 것인 MPSC 집단.
  2. 제1항에 있어서, MPSC 배양 시작으로부터 약 12일 이내에 약 25 내지 약 30 집단 배가, 약 30일 이내에 약 50 내지 약 55 집단 배가, 및/또는 약 63일 이내에 약 75 내지 약 80 집단 배가에 도달할 수 있는 MPSC 집단.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 22 내지 약 27시간 내에 배가될 수 있는 MPSC 집단.
  4. 제3항에 있어서, 약 25시간 내에 배가될 수 있는 MPSC 집단.
  5. 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단으로서, MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현하고, MPSC 집단은 병원체가 없는 것인 MPSC 집단.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 박테리아가 없는 것인 MPSC 집단.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 바이러스가 없는 것인 MPSC 집단.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 시토메갈로바이러스가 없는 것인 MPSC 집단.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 EBV (엡스타인-바 바이러스), 인간 아데노바이러스 (HAdV), 인간 시토메갈로바이러스 (HCMV), 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 파필로마바이러스 (HPV), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV), 수두 바이러스 (VZV), 코리네박테리움(Corynebacterium), 한타바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 미코플라스마, 트레포네마 또는 이들의 임의의 조합인 병원체가 없는 것인 MPSC 집단.
  10. 제9항에 있어서, MPSC가 간염 바이러스가 없고, 여기서 간염 바이러스가 A형 간염, B형 간염, C형 간염 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  11. 제9항에 있어서, MPSC가 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)가 없고, 여기서 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV)가 인간 헤르페스 바이러스 6 (HHV 6), 인간 헤르페스 바이러스 8 (HHV 8) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  12. 제9항에 있어서, MPSC가 인간 면역결핍 바이러스가 없고, 여기서 인간 면역결핍 바이러스가 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV1), 인간 면역결핍 바이러스 2 (HIV2) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  13. 제9항에 있어서, MPSC가 인간 파필로마바이러스가 없고, 여기서 인간 파필로마바이러스가 HPV16, HPV18 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  14. 제9항에 있어서, MPSC가 헤르페스 심플렉스 바이러스가 없고, 여기서 헤르페스 심플렉스 바이러스가 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV 1), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV 2) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  15. 제9항에 있어서, MPSC가 인간 T-림프친화성 바이러스가 없고, 여기서 인간 T-림프친화성 바이러스가 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV 1), 인간 T-림프친화성 바이러스 (HTLV 2) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  16. 제9항에 있어서, MPSC가 코리네박테리움이 없고, 여기서 코리네박테리움이 코리네박테리움 보비스(Corynebacterium bovis), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp.) (HAC2) 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  17. 제9항에 있어서, MPSC가 한타바이러스가 없고, 여기서 한타바이러스가 한타안 한타바이러스, 서울 한타바이러스, 신 놈브레 한타바이러스 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, b-HCG, HSP90, CDX2, FGFR1, pAKT, pCREB1, HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현하는 MPSC 집단.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, KIR2DL4, Flt3L, NKp46, TCR, ILT-4, CD49f, CD3, CD4, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD16, CD19, CD34, CD38, CD44, CD56, CD90/Thy-1, CD105, CD141, CD146, CD166, CD107a 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현하는 MPSC 집단.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, IL-6, IL-8, MCP-1, CLXL2, PDGF-AA, VEGF, PAI-1, IL-10 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상의 단백질을 추가로 발현하는 MPSC 집단.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC의 적어도 일부가 Ki-67, HSP70, p53, 신시틴 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는 것인 MPSC 집단.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, CD44, CD90, CD105, CD146, CD166, HLA-A, HLA-B, HLA-C 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 단백질을 발현하는 MPSC 집단.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC의 적어도 일부가 CD19, CD45, HLA-DR 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는 것인 MPSC 집단.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC의 96% 초과가 CD19, CD45, HLA-DR 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 단백질을 발현하지 않는 것인 MPSC 집단.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, CD16, CD56 또는 이들의 조합을 발현하는 MPSC 집단.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC의 적어도 일부가 CD3을 발현하지 않는 것인 MPSC 집단.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC의 96% 초과가 CD3을 발현하지 않는 것인 MPSC 집단.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC 집단의 적어도 65%가 HLA-G를 발현하는 것인 MPSC 집단.
  29. 제28항에 있어서, HLA-G가 HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, HLA-G7 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, HLA-G가 HLA-G2, HLA-G4, HLAG-6, HLA-G7 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, HLA-G가 HLAG-6, HLA-G7 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC 집단의 15% 미만이 HLA-G1을 발현하는 것인 MPSC 집단.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC 집단의 적어도 10%가 모노클로날인 MPSC 집단.
  34. 제25항에 있어서, MPSC 집단의 약 13% 내지 약 15%가 모노클로날인 MPSC 집단.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1 × 106개 MPSC를 포함하는 MPSC 집단.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 안정적인 핵형을 갖는 것인 MPSC 집단.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 집단 배가로부터의 염색체 이상을 나타내지 않는 것인 MPSC 집단.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 어레이-기반 전체-게놈 검정에 의해 측정된 바와 같이 동결 및 해동으로부터의 실질적인 염색체 이상을 나타내지 않는 것인 MPSC 집단.
  39. 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단을 성장시키는 방법으로서, MPSC의 계대배양물을 배양 배지에 약 1,000 내지 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하는 단계, 및 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단을 성장시키는 방법으로서, MPSC의 계대배양물을 배양 배지에 약 1,000 내지 약 5,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩하는 단계, 및 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 MPSC 집단은 HLA-G 및 인슐린을 발현하는 것인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 배양 배지가 동물 구성성분이 없는 것인 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 혈청이 없는 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 배양 배지가 소 태아 혈청이 없는 것인 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 약 3일 동안 배양되는 것인 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC가 약 4일 동안 배양되는 것인 방법.
  46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, MPSC의 계대배양물이 약 2,000 내지 약 4,000개 세포/㎠의 밀도로 시딩되는 것인 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세포 집단.
  48. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 MPSC 집단을 하나 이상의 유도제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포를 생산하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 외배엽 세포인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 중배엽 세포인 방법.
  51. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 내배엽 세포인 방법.
  52. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 췌장 세포 또는 췌장 선조 세포 (PPC)인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 하나 이상의 유도제가 bFGF (염기성 섬유모세포 성장 인자)를 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 하나 이상의 유도제가 2-메르캅토에탄올 및 니코틴아미드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, PPC가 β-HCG, CDX2, HLA-G 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, PPC가 β-HCG 및 CDX2; β-HCG 및 HLA-G; CDX2 및 HLA-G; 또는 HCG, CDX2 및 HLA-G를 포함하는 것인 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, PPC가 PDX1, FOXA2, SOX9 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  58. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 신경 세포 (NCS) 또는 신경 선조 세포인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 하나 이상의 유도제가 레티노산을 포함하는 것인 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, NCS 세포가 RAR-β, CDX2, HLA-G 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, NCS 세포가 RAR-β 및 CDX2; RAR-β 및 HLA-G; CDX2 및 HLA-G; 또는 RAR-β, CDX2 및 HLA-G를 포함하는 것인 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, NCS 세포가 N-CAD, NESTIN, SOX2, PAX6 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 것인 방법.
  63. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 간 세포 또는 간 선조 세포인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 하나 이상의 유도제가 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 스테로이드 및 시토카인을 포함하는 것인 방법.
  65. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 자연 살해 세포이고, 유도제가 FGF를 포함하는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 자연 살해 세포가 CD16+, CD56+ 및 CD3-인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 자연 살해 세포가 추가로 HLA-G+ 및 CDX2+인 방법.
  68. 제48항에 있어서, 생산된 세포가 지방세포, 연골세포, 골세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 생산된 세포가 지방세포 및 연골세포를 포함하는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 생산된 세포가 지방세포 및 골세포를 포함하는 것인 방법.
  71. 제68항에 있어서, 생산된 세포가 연골세포 및 골세포를 포함하는 것인 방법.
  72. 제68항에 있어서, 생산된 세포가 지방세포, 연골세포 및 골세포를 포함하는 것인 방법.
  73. 제68항에 있어서, 생산된 세포가 지방세포를 포함하는 것인 방법.
  74. 제68항에 있어서, 지방세포가 렙틴, HOXC8, HOXC9, Ucp1, CIDEA, PRDM16, Zic1, Lhx8, Eva1, Epsti1, Cd137, Tmem26, Tbx1, Cited1, Shox2, 아미노산 수송체 ASC-1, 아미노산 수송체 PAT2, 퓨린성 수용체 P2RX5, ATGL, CAV1, FABP4, COX4, LMNB1 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 지방세포가 백색 지방세포를 포함하는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 백색 지방세포가 렙틴, HOXC8, HOXC9 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  77. 제73항 또는 제74항에 있어서, 지방세포가 갈색 지방세포를 포함하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 갈색 지방세포가 Ucp1, CIDEA, PRDM16, Zic1, Lhx8, Eva1, Epsti1 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  79. 제73항 또는 제74항에 있어서, 지방세포가 베이지색 지방세포를 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 베이지색 지방세포가 Cd137, Tmem26, Tbx1, Cited1, Shox2 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  81. 제73항 또는 제74항에 있어서, 지방세포가 베이지색 지방 세포 전구체를 포함하는 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 베이지색 지방 세포 전구체가 CD137, TMEM26 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  83. 제68항에 있어서, 생산된 세포가 연골세포를 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 연골세포가 아넥신 A6, CD44, CD151, ITM2A, FAM20B, FoxC1, FoxC2, SOX5, SOX6, SOX9, 아그레칸, 카텝신 B, CHADL, 콘드로어드헤린, 콜라겐 II, 콜라겐 IV, CRTAC1, DSPG3, IBSP/시알로단백질 II, 마트릴린-1, 마트릴린-3, 마트릴린-4, MIA, 오토라플린/OTOR, URB, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  85. 제68항에 있어서, 생산된 세포가 골세포를 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 골세포가 전골모세포, 골모세포, 포매 골모세포, 유골 골세포, 무기질화 골세포 또는 성숙 골세포를 포함하는 것인 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 골세포가 RUNX2, OCN, E11, DMP1, PHEX, MEPE, 스클레로스틴, CapG, ORP150 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  88. 제85항 또는 제86항에 있어서, 골세포가 전골모세포를 포함하고, 여기서 전골모세포가 RUNX2를 포함하는 것인 방법.
  89. 제85항 또는 제86항에 있어서, 골세포가 전골모세포를 포함하고, 여기서 전골모세포가 RUNX2를 포함하는 것인 방법.
  90. 제85항 또는 제86항에 있어서, 골세포가 골모세포를 포함하고, 여기서 골모세포가 RUNX2 및 OCN을 포함하는 것인 방법.
  91. 제v항에 있어서, 골세포가 포매 골모세포를 포함하고, 여기서 포매 골모세포가 OCN, E11, DMP1, PHEX 및 CapG를 포함하는 것인 방법.
  92. 제85항 또는 제86항에 있어서, 골세포가 유골 골세포 또는 무기질화 골세포를 포함하고, 여기서 유골 골세포 또는 무기질화 골세포가 OCN, E11, DMP1, PHEX, MEPE 및 CapG를 포함하는 것인 방법.
  93. 제85항 또는 제86항에 있어서, 골세포가 성숙 골세포를 포함하고, 여기서 성숙 골세포가 DMP1, PHEX, MPEP, 스클레로스틴, CapG 및 ORP150을 포함하는 것인 방법.
  94. 사멸성 만능 줄기 세포 (MPSC) 집단으로서, MPSC 집단은 HLA-G를 발현하고, MPSC 집단은 인돌아민 2-3 데옥시게나제 (IDO) 분비에 대해 음성, 키뉴레닌 분비에 대해 음성, 및 인터류킨 2 (IL-2) 분비에 대해 양성 중 하나 이상을 포함하는 표현형을 포함하는 것인 MPSC 집단.
  95. 제94항에 있어서, MPSC 집단이 인돌아민 2-3 데옥시게나제 (IDO) 분비에 대해 음성, 키뉴레닌 분비에 대해 음성, 및 인터류킨 2 (IL-2) 분비에 대해 양성의 표현형을 포함하는 것인 MPSC 집단.
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