KR20230013671A - 피부 손상, 화상 및 욕창 치료를 위한 패치 및 패치 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물 허파 조직 추출물을 유효성분으로 포함하는 화상 및 욕창의 완화 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 피부 손상에 대한 동물 허파 조직 추출물 및/또는 프로피온산의 보호 효과가 염증억제뿐 아니라 섬유조직의 재생 및 혈관신생촉진과도 관련이 있음을 제시하여 피부 창상치유와 관련한 소재로써 유효성을 나타내며 화상 및 욕창치료와 관련되어 산업적으로 이용가능한 효과를 나타내서 이들 질환의 치료제로 사용될 수 있다.

Description

피부 손상, 화상 및 욕창 치료를 위한 패치 및 패치 제조 방법{Patches for skin damage, burns and pressure ulcer treatment, and their manufacturing methods}

본 발명은 화상 및 욕창의 완화 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

욕창이란, 몸의 접촉면으로부터 받는 압박에 의해 조직의 말초 혈관이 폐색되어 조직의 괴사를 야기하는병태로, 그 치유에는 장기간을 요하는 경우가 많다.

따라서, 장기간, 침구 위에 누운 상태에 있는 노인이나 장기 요양 환자는 욕창(bedsore, 소위 압박 궤양)이 생기기 쉬워, 간호상 큰 문제로 되어 있다. 또한, 욕창은 인간 이외의 동물에서도 발증하는 질병으로, 예를 들어 말의 안장 욕창 (saddlesore)도 욕창의 하나이다.욕창의 치료제로는, 브로멜라인(bromelain)(진료와 신약, 1971년, 제8권, p. 967)을 함유하는 연고, 부클라데신나트륨(bucladesine Na)을 함유하는 연고 등이 있지만, 상기한 치료제는 모두 출혈, 동통 등의 부작용이 알려져 있다.

아울러, 욕창용 베드, 매트리스 등을 사용하여 욕창부위에 통풍이 원활하게 되도록 하는 제품을 사용하고 있으나, 이는 예방을 위한 용품일 뿐 치료제로서 사용될 수 없는 것이다.

따라서, 현재의 욕창치료는 대부분 환자의 자연치유력에 의존하여 치료하고 있는바, 더욱 안전한 방법의 욕창치료가 요구되고 있다.

한편, 화상이란 주로 사고에 의해 발생하며, 원인에 따라서 열에 의한 화상, 전류에 의한 화상, 화학물질에 의한 화상, 방사선에 의한 화상 등으로 분류할 수 있다. 화상의 중증도는 화상을 입은 넓이, 깊이, 화상을 유발한물체의 온도와 접촉 시간, 피부 상태 등에 따라 1도, 2도, 3도 및 4도 화상으로 나누어지며, 2도 화상부터는 흉터를 남길 수 있으며 병원 치료를 요한다.

1도 화상은 피부가 붉게 되고, 따끔거리는 등의 통증을 수반한다. 피부층 중의 가장 바깥층인 표피의 손상을 가져오고, 통증과 홍반을 수반하면서 부어 오르기도 한다. 며칠 안에 증세가 없어지지만, 그 자리에 가벼운 낙설(落屑)과 색소침착이 남는 경우도 있다. 회복 후에는 반흔(흉터)가 남지 않는다. 햇볕화상(sun burn)의 경우는가장 일반적인 1도 화상의 예이다.

2도 화상은 표피와 진피 둘 다에 영향을 미치며, 홍반, 통증, 부종, 그리고 사고 후 24시간 내에 물집을 생기게한다. 이 화상은 또한 한선이나 모공에 영향을 미치기도 한다. 자각적으로는 작열감과 통증이 심하다. 수포가터지면 미란면을 나타내고 다량의 분비액이 나온다. 화상 입은 면적이 체표면적의 약 15% 이상에 이르는 경우에는 특히 주의를 요한다. 수 주일 내로 치유되지만 그 자리에 색소침착이나 색소탈실이 남는 일이 많다. 2차 감염을 일으키면 국소증세는 더욱 심하고 경과도 오래간다.

3도 화상은 표피, 진피, 그리고 하피까지 영향을 미쳐서 피부가 검게 되거나 반투명백색이 되고, 피부 표면 바로 아래 혈관을 응고시킨다. 이 화상부위는 무감각해지게 될 수도 있지만, 환자는 극심한 통증을 느끼며, 피부조직과 구조가 괴사하게 되어 치료에 많은 시간이 걸리고 후에 흉터가 남게 된다. 사고 후 2주일이 지나면, 딱지가 벗겨져 궤양 면이 나타난다. 분비액이 많고, 출혈하기 쉽지만 점차 새로운 조직이 생겨 표피가 재생되어반흔이 남고 치유된다. 피부괴사가 깊은 경우, 또는 2차 감염을 일으킨 경우, 치유가 늦어지고 반흔 표면이 불규칙해져 켈로이드가 생기거나 변형이나 운동장애가 남기도 한다. 화상 입은 면적이 신체 표면적의 10%이상에미치는 경우에는 특히 주의를 요한다.

4도 화상은 화상 입은 부위 조직이 탄화되어 검게 변한 경우이며, 피부층 밑에 위치하는 지방층, 인대, 근막,근육, 골조직 등까지 화상을 입은 경우를 말한다. 고압 전기 화상에서 주로 발생하며, 간혹 심재성 2-3도 화상에서 균 감염이 발생한 경우 나타날 수 있다. 화상의 범위가 20% 상인 경우 전신적인 신체 반응이 일어날 수 있는데, 과도한 수액 손실에 따른 저혈압, 쇼크, 급성 신장 기능 부전 등이 발생할 수 있고, 추후 상처 감염이나폐렴, 패혈증, 다발성 장기 기능 부전 증후군 등이 발생하기도 한다. 화상의 치료는 가능한 빨리 초기 화상 창상을 치유하거나 화상부위를 줄이는 것이 중요하다. 초기 화상 환부 드레싱에서 감염 및 염증의 조절, 습윤 환경의 유지, 피부재생을 돕는 성장인자나 사이토카인의 투여, 국소적 헤파린 사용 등을 통한 심부 화상으로의 전환을 방지하는 초기 치료가 강조되고 있다. 이러한 화상 및/또는 욕창 손상의 심각성을 고려할 때, 화상 및/또는 욕창 손상의 치료 또는 예방에 유용한 치료제가 개발된다면 환자의 치료, 상태 개선 및 흉터 감소에 많은 도움이 될 것이다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 욕창치료제를 제공하는 것이다.본 발명의 다른 목적은 신규한 화상 치료제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 동물 허파 조직 추출물을 유효성분으로 포함하는 욕창 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 허파 조직 추출물은 인지질 분획인 것인 것이 바람직하나 이에 한정되지아니한다.

본 발명에 일 실시예에서 상기 인지질 분획은 도 1에 기재된 것과 같이, phosphatidylinositol; 1-Palmitoyl-2- arachidony phosphatidylcholine; 1-palmitoyl-2-linoleoyl phosphatidylcholine; 1-palmitoyl-2-palmitoleonyl phosphatidylcholine; 1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine; dipalmitylphosphatidylcholine;phsphatylethaolamine; sphingomyelin로 구성된 군으로부터 선택된 것이거나 이들 인지질을 전부 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로 유기산 또는 그 염을 포함하는 것이바람직하고, 상기 유기산은 프로피온산인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 또 본 발명은 동물 허파 조직 추출물을 유효성분으로 포함하는 화상 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 허파 조직 추출물은 인지질 분획인 것인 것이 바람직하나 이에 한정되지아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로 유기산 또는 그 염을 포함하는 것이바람직하고, 상기 유기산은 프로피온산인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명에 따른 욕창 치료제 또는 예방제, 화상 치료제에 있어서의 유효성분의 농도는 알맞게 선택할 수 있다. 본 발명에 따른 욕창 치료제 또는 예방제, 화상 치료제는, 경구제로서 투여할 수도 있지만, 외용제로서 창상,욕창 또는 화상의 환부에 국소투여하는 것이 바람직하다.

또한, 욕창의 예방약으로서, 욕창이 될 가능성이 있는 곳에 국소투여하는 것에 의해 욕창이 되지 않거나 또는되기 어렵게 하는 것도 가능하다.

외용제로서는, 통상, 외용제로서 이용하는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 연고제, 크림제,로션제, 도찰제(liniment), 팹(pap)제, 플라스터(plaster)제, 패치(patch)제, 경고(硬膏)제, 겔(gel)제, 액제(液劑), 테이프제 등을 들 수 있다.

상기 제형(劑型)이 연고제 또는 크림제인 경우에는, 기제(基劑)로서 유지성(油脂性) 기제 또는 유제성(乳劑性)기제를 이용할 수 있다.

상기 유지성 기제로서는, 예를 들면, 탄화수소, 고급 알코올, 고급 지방산, 고급 지방산 에스테르, 글리콜류,식물유, 동물유 등을 들 수 있다. 상기 유지성 기제는 통상 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 이용할 수 있다. 상기 탄화수소로서는, 예를 들면, 탄소수 12∼32의 탄화수소, 다양한 탄화수소의 혼합물인 유동 파라핀, 분기(分岐) 형상 파라핀, 고형 파라핀, 백색 바셀린, 황색 바셀린, 스쿠알렌(squalene), 스쿠알란, 플라스티베이스등을 들 수 있다. 이들 중에서 특히 백색 바셀린을 매우 적합한 것으로 들 수 있다. 상기 탄화수소는 통상 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 이용할 수 있다.__

본 발명의 조성물은 화상 및 욕창치료에 대해 하기와 같은 효과를 나타낸다.

본 발명은 피부 I/R손상의 TPF 및 Pi 매개 보호기작을 확인하였다. 본 발명의 결과는 TPF의 처리가 M1 대식세포침윤을 억제하고, M1 대식세포의 전 염증 매개체(proinflammatory mediators)에 의해 유도된 피부염증을 억제한다는 것을 나타낸다. 또한 저농도 TPF의 처리도 Pi의 추가로 인해 고농도 TPF와 유사한 효과를 보일 수 있음을확인하였다.

본 발명은 TPF 및 Pi의 처리가 I/R로 유도된 세포사멸 세포 수가 감소함을 보였다. 이러한 결과는 피부 I/R 후세포사멸 세포의 phagocytosis및 clearance를 증가시켜 이들이 축적되는 것을 막아주고, 이는 I/R 욕창부위에서의 세포사멸과 괴사의 억제 및 압박궤양으로부터 TPF 및 Pi의 보호효과를 보여준다.

본 발명에서는 고농도 TPF 및 저농도 TPF+Pi처리에 의해 욕창부위의 상처회복이 촉진되고 더불어 콜라겐 함량이증가됨을 확인하였다. 또한 진피 내 콜라겐 type I/Ⅲ 생성비율을 확인하여 TPF 및 Pi의 처리가 I/R 후 피부 욕창부위의 정상조직 회복에 중요한 역할을 하고 있음을 확인하였다. 또한 I/R 욕창부위의 혈관분포를 평가하여I/R 영역의 혈관주위세포수가 대조군 마우스보다 유의하게 많다는 것을 발견하였다. 본 발명은 피부 I/R 손상에대한 TPF 및 Pi의 보호 효과가 염증억제 뿐 아니라 섬유조직의 재생 및 혈관신생촉진과도 관련이 있음을 제시한다.

상기의 결과들을 종합적으로 보았을 때, 본 발명은 TPF가 욕창치유 속도를 가속화하는 동시에 항염증, 콜라겐생성유도, 혈관생성 및 피부장벽회복을 통한 조직재생 활성에 기여하여 피부 I/R 손상에 의해 유발된 압박궤양의 형성을 억제한다고 결론을 내린다. 또한 Pi의 추가시 저농도의 TPF로도 고농도의 TPF와 유사한 효과를 보일수 있음을 증명하였다. TPF의 지속적 치료는 욕창(decubitus) 궤양 및 다른 허혈성 궤양을 포함하여 피부 창상치유와 관련한 소재로써 유효성을 나타내며 산업적 활용이 가능함을 보여준다.

도 1은 돼지 허파 조직에서 추출한 인지질 분획을 나타내는 그림으로, 정제된 인지지 분획은 HPLC- ELSDsystem(Waters e2695 Waters 2424(ELSD))을 이용하여 분석하였다. 컬럼은 waters Xbridge column C18 5.0μm(4.6mm*150mm)을 이용하였다. #1, phosphatidylinositol; #2, 1-Palmitoyl-2- arachidonyphosphatidylcholine; #3, 1-palmitoyl-2-linoleoyl phosphatidylcholine; #4, 1-palmitoyl-2-palmitoleonylphosphatidylcholine; #5, 1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine; #6, dipalmityl phosphatidylcholine;#7 & #8, phsphatylethaolamine; #9, sphingomyelin.
도 2는 피부 I/R 후 압박궤양형성에 대한 TPF와 propionate의 효과를 나타낸 그림, (A) 상처 치유 모델의 개략도. 쥐의 등 쪽 피부를 면도하고, I/R cycle을 두 번 실시한 후. 대조군(PBS)와 시험물질(SS, 4% TPF, 2% TPF+Pi)를 하루 2번 드레싱 하여 욕창 치유에 대해 20 일 동안 평가 하였다. (B) C57BL/6 마우스에서 I/R 손상후 욕창부위의 사진. (C) C57BL/6 마우스에서 I/R 손상 후 욕창면적의 크기변화. I/R 유도 후의 마우스 궤양 크기를 100% 값으로 지정하였다.(D) C57BL/6 마우스에서 I/R 손상 후 상처부위 TEWL.(E) 시험물질 처리 후의 마우스 무게변화.
도 3은 피부 I/R에 의한 상처부위 염증반응에 대한 TPF와 propionate의 효과를 나타낸 그림, (A 및 B) C57BL/6마우스에서 I/R 손상 4일 후 상처부위의 조직사진. (Red arrow : mast cell), Scale bar, 100μm.도 4는 I/R 피부손상 후 침윤하는 대식세포 억제에 대한 TPF와 propionate의 효과를 나타낸 그림, (A) I/R 피부손상 후 4일 째에 침윤되는 호중구와 대식세포를 MPO 및 CD68 항체로 염색한 피부 욕창부위의 조직사진. (B)iNOS (M1 대식세포), Arg-1 (M2 대식세포) 항체로 염색한 피부 욕창부위의 조직사진.(C) I/R 후 4일에 iNOS 및arginase-1의 발현수준 RT-PCR과 immunoblot으로 정량.(D) I/R 후 4일에 MCP-1, IL-1β, IL-6 및 TNFα의 mRNA발현 수준 정량. Scale bar, 100μm. *p<0.05, **p<0.01
도 5는 I/R 피부손상 후 세포사멸 억제에 대한 TPF와 propionate의 효과를 나타낸 그림, (A) C57BL/6 마우스에서 I/R 손상 4일 후 H&E, TUNEL 염색을 이용한 피부 욕창부위의 조직사진.(B) I/R 손상 4일 후 피부욕창부위의세포사멸 세포수.(C) I/R 후 4일에 Bax 및 cleaved caspase-3의 발현수준 immunoblot으로 정량. Scale bar,100μm. *p<0.05, **p<0.01
도 6은 I/R 피부손상 후 섬유조직 회복에 대한 TPF와 propionate의 효과를 나타낸 그림, (A) C57BL/6 마우스에서 I/R 손상 12일 후 H&E, masson’s trichome, picro-sirius red, αSMA 항체 염색을 이용한 피부 욕창부위의조직사진. (B) C57BL/6 마우스에서 I/R 손상 16일 후 H&E, picro-sirius red 염색을 이용한 피부 욕창부위의조직사진.Scale bar, 100μm.
도 7은 I/R 피부손상 후 피부장벽 개선에 대한 TPF와 propionate의 효과를 나타낸 그림, C57BL/6 마우스에서I/R 손상 16일 후 H&E, filaggrin, involucrin 항체 염색을 이용한 피부 욕창부위의 조직사진. Scale bar, 100μm.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다. 실시예 1:돼지 허파에서 인지질 분획의 정제

추출방법은 Moon et. al (Mol Biol Rep. 2012 39:4237-4247)이 기술한 방법을 이용하였다. 간략하게, 신선한 돼지 허파 조직에 식염수를 첨가하여 믹서로 파쇄한 후, CaCl2를 5mM 농도가 되도록 첨가하여수용성 파쇄액 안에서 인지질의 침전을 촉진하였다. 파쇄한 시료를 원심 분리하여 침전물을 얻은 다음, 침전물을 클로로포름:메탄올(1:2) 유기용매로 녹여 내여 전체 지방 분획(total lipid fraction)을 얻었다. 얻어진 전체 지방 분획을 실리카 오픈 컬럼에 적용하여, 지방산 및 중성 지방 등을 용출시켜 제거하고 인지질 분획(total phospholipid fraction, TPF)을 따로 모아서 얻었다. 정제된 인지질 분획은 진공회전증발기를 이용하여농축 한 후, 섭씨 -70도에서 동 건조하였다. 시료는 사용전까지 -20도씨에 보관하였다.

추출 공정에서 인지질들을 용이하게 침전시키기 위하여 CaCl2 용액을 적용하였음으로 최종 인지질 분획에 잔존칼슘의 함량의 유무를 조사하였다. Ca2+ 검출은 Quantichrom™ Calcium Assay Kit (DICA-500, BioAssy System,USA)를 이용하였고, 유기 용매 추출 과정에서 Ca2+ 이온들이 모두 제거되었음을 확인하였다.

실시예 2: 조성물의 제조

상기 정제된 돼지 허파 추출 인지질 분획(TPF)을 10 microM propionate / propionic acid (pH 5.8) 용액에 혼탁하여 사용하였다. TPF의 최종 농도는 20mg/ml가 되도록 제조하였다.

실험예:

1)시험재료

- 전체 인지질 분획(Total phospholipid fraction, TPF), Propionate (propionic acid, Pi) 2)실험 방법 시험동물

종 및 계통: C57BL/6 (Female) 공급원 및 생산자: 마우스는 (주)중앙실험동물 (서울, 한국)을 통해 생산된 품종을 공급받는다. 입수 및 시험물질 처리 : 6주령에 입수하여 7일간 적응시킨 후 magnet을 이용한 욕창을 유도 한다. 그 후 시험물질 (silver sulfadiazine, 4% TPF, 2% TPF+Pi)를 dressing으로 하루에 2번 3주 동안 처리한다. 군 구성 및 시험 디자인

표 1은 군 구성 및 처리용량 설정

시험 평가 항목

욕창유도부위 회복수준 평가 : 육안평가, TEWL, 체중변화, wound size 염증반응 개선 평가 : mast cell, neutrophil, macrophage 침윤 섬유조직 회복 평가 : 콜라겐 형성 및 Ⅰ/Ⅲ 구성 비율 혈관생성 정도 평가 : αSMA 발현확인 피부장벽 개선 평가 : filaggrin, involucrin 발현확인 세포사멸 예방 평가 : apoptotic cell 확인 욕창 유사 손상 유발 Magnetic plate Ischemia/Reperfusion model (I/R).

I/R 주기 모델은 이전에 보고된 바 있다. 마우스를 마시킨 후, 등을 면도하고. 피부를 부드럽게 당겨 놓고,평균 중량이 2.4g 및 1,000G magnetic force (직경, 12 mm; 두께, 5 mm) 인 세라믹 자석사이에 위치하게 한다근육을 제외한 경피, 진피조직은 자석 플레이트 사이에 위치하여, 평균 압력 2,000 mmHg을 받을 수 있도록한다. 12 시간 간격으로 허혈과 관류를 반복하여 2회 반복 할 수 있도록 하고. 각 실험 일정에 맞게 평가를 진행한다. 드레싱 욕창유발 후 욕창의 발생을 육안으로 확인한 후 욕창이 발생된 부위에 실험군과 대조군 모두 욕창부위를 먼저생리식염수로 세척하였다. 시험물질을 적신 습윤 거즈 드레싱으로 욕창부위를 덮은 후 TegadermTM(3M HealthCare, St. Paul,MN, USA)을 이용해 봉합하였다. 고정을 위해 VetWrapTM(3M)으로 한번 더 감싼다. 드레싱 교환은 하루에 두 번(오전/저녁) 3주 동안 실시하였다.

피부병변 육안관찰 평가

허혈로 손상된 피부 조직의 모습을 평가하고, 산술화 하여 수치화 시킨다. 관찰 기간에 따른 병변 부위 회복을 넓이로 평가하였다. 욕창면적은 근거리 육안 사진촬영 (DSLR, Dermascope)을 하여 측정하였다. 실험군과 대조군모두 욕창 유발 2일째에 육안으로 욕창 발생을 확인 한 후, 3주 동안 모두 10회에 걸쳐 사진촬영을 하였다. 사진이 일부 소실된 것과 육안으로 확인이 어려운 마우스는 제외하고 8마리의 자료를 분석에 사용하였다. 촬영된욕창발생 부위는 imageJ software v1.44 (NIH, Bethesda, USA)를 이용하여 그 면적을 계산하였다.조직병리학적 평가 (H&E, Toluidine blue, Masson’s trichrome, Sirius Red) 조직 손상 발생에 따른 다양한 피부조직 회복을 관찰하기 위해 욕창 유도 후 4일, 8일, 12일, 16일에 마우스로부터 피부조직을 분리한 후 10 % paraformaldehyde (PFA)로 고정시킨 후 파라핀 왁스에 삽입하였다. 조직 절편은 마이크로톰에 의해 5 μm 직렬 횡단면으로 절단되었다. 절삭된 조직은 유리 슬라이드 (Probe On PlusTM,Fisher Scientific, PA, USA)로 옮겨져 탈지, 탈수를 거쳐 H&E(피부조직변화), Toluidine blue(mast cellinfiltration), Masson’s trichrome & Sirius Red (섬유조직회복) 염색을 이용하여 조직학적 분석을 실시하였다. 각 염색법을 통하여 시험물질이 염증 반응 및 세포침윤의 감소와 섬유조직회복에 관여하는지 평가하였다. 면역 조직 화학 염색법 피부조직에 침윤된 염증세포를 분별하고, 피부장벽 개선을 확인하기 위한 특정 항체를 이용하여 침윤된 세포의성격을 구별하고 피부의 변화를 확인하였다. 염증반응 개선 (MPO, CD68, iNOS, Arg-1), 피부장벽 개선(Filaggrin, Involucrin), 혈관생성 (αSMA), 세포사멸 (TUNEL) 등 허혈 손상 유발에 관여하는 단백질 특정 마커들을 이용하여 면역 조직 화학 염색을 시행한 후 관찰하여 비교 분석하였다. 형광 이미지는 Confocalmicroscopy (LSM 700, ZEISS, Jena, Germany)을 사용하여 획득하였다. Immunoblot assay 분리된 피부조직을 PRO-PREP (iNtRON, Seongnam, Korea)에 용해시킨 후, 14,000 g에서 20분간 원심 분리하여상층액을 실험에 사용하였다. 단백질 농도는 BCA kit (Fisher Scientific, hampton, NH, USA)를 사용하여 정량하였다. 분리된 상층액 (총 단백질량 30 μg)을 8~12 % gel SDS-PAGE를 이용하여 전기영동으로 분리된 단백질은PVDF membrane (Millipore, Danvers, MA, USA)에 transfer하였다. Transfer된 PVDF membrane을 5 % 탈지분유에1시간동안 blocking 한 다음 1차 항 (Bax, Cleaved caspase-3, GAPDH)를 membrane과 4℃에서 12시간동안 반응시키고. TBST로 washing 한 후 1차 항체에 대한 특이적 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.Membrane 세척 후 ECL용액 (Millipore)으로 발색 후 ChemiDoc ™XRS +System (Bio-RAD, Hercules, CA, USA)을이용하여 측정하였다.

욕창치유시 발현되는 염증성 사이토카인 변화 관찰 상처치유과정에 관여하는 염증사이토카인(MCP-1, IL-1β, IL-6, TNFα)의 유전자 발현변화를 real-time PCR을이용하여 비교 분석한다. 총 RNA는 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 분리된 피부조직으로부터 추출하였다. 전체 RNA 주형으로부터 단일 가닥 cDNA 합성은 Prime ScriptTM

RT마스터 믹스 (Takara,Tokyo, Japan)로 수행하였다. 생성된 cDNA를 CFX-96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 함께 qPCR 2x PreMIXSYBR (Enzynomics, Seoul, Korea)을 사용하여 real time PCR 실시하였다. 모든 유전자를 증폭하는데 사용된PCR은 95℃에서 10분 간 denaturation 과정을 거친 후, 40 cycle (95℃ 10초, 60℃ 15초, 72℃ 30초) 의 조건으로 수행되었다. 발현 데이터는 ΔCt 정량화 방법을 사용하여 사이클 임계치 (Ct) 값으로 계산하였다. GAPDH를이용하여 정량화하였다.

통계학적 유의성 검증

본 발명의 데이터는 “(평균 ± 표준편차)“로 표시하였으며, 각 데이터의 통계 분석은 정규성 분석에 따라 ttest를시행하였다. 그룹 간 대비하여 p<0.05 수준으로 유의성을 판단하였다. (*p<0.05, **p<0.01)__ 상기 실험예의 결과는 하기와 같다. 마우스에서 허혈성 피부손상 (cutaneous ischemia/reperfusion-I/R) 후 욕창형성에 대한 TPF와 propionate의보호 효과 평가

Total phospholipid fraction (TPF)의 욕창 및 피부압박궤양 (cutaneous pressure ulcer)에 미치는 영향을 확인하였다. C57BL/6 마우스에 I/R 손상 후 형성된 욕창부위에 생리식염수, silver sulfadiazine (SS), 4% TPF,2% TPF+Propionate(Pi)를 드레싱 한 후 상처면적을 비교하였다. 본 발명에서는 간단하고, 재현성 있고, 비 침습성인 실험용 마우스 모델을 이용하여 in vivo에서 I/R에 의한 피부압박궤양의 발병 기전을 평가하였다 (그림2A) 4% TPF를 추가한 시험물질의 드레싱처리는 I/R 후에 피부압박궤양의 형성을 유의하게 억제하고 있음을 확인하였다. 또한 더 적은 농도인 2% TPF에 Pi를 첨가한 시험물질의 처리역시 4% TPF와 유사한 수준으로 피부압박궤양의 형성을 억제하였다. I/R에 의해 유발된 욕창 부위의 초기 욕창면적의 차이가 있는지를 비교해 본 결과실험군(SS, 4% TPF, 2% TPF+Pi)과 대조군(Control) 모두 면적이 비슷하게 형성되어 실험 전 욕창 크기는 동질함을 확인하였다 (그림 2B). 드레싱 처치 4일 후, 4% TPF, 2% TPF+Pi 처리 마우스의 욕창면적은 대조군 마우스의욕창면적의 약 70 ~ 85% 수준으로 회복이 더 빠르게 진행되고 있음을 보였다 (그림 2B 및 C; SS: 93%, 4% TPF:75%, 2% TPF+Pi: 85%). 단, 초기 욕창면적의 감소는 2% TPF+Pi를 처리한 군에서 다소 낮은 비율을 보였지만 6일(각 25%, 26%) 이후로는 감소비율이 비슷해지는 경향을 보였다. 4% TPF로 드레싱한 마우스의 욕창면적의 크기는드레싱 후 4일 이후에 현저하게 감소하였고, 2% TPF+Pi로 드레싱한 마우스는 6일 이후에 욕창면적이 크게 감소한 반면에 대조군 마우스의 상처봉합(wound closure) 시간은 TPF 처리 후 상처봉합 시간보다 길어 욕창의 회복속도에 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다. 다음으로 상처부위 피부의 수분증발에 대한 피부수분손실량(Transepidermal water loss, TEWL)을 측정하였다 (그림 2D). 욕창이나 화상의 경우 각질의 기능이 손상되거나각질이 아예 없어진 상태에서, 수분증발이 증가하게 된다. TEWL을 측정한 결과 드레싱 초기에는 그 차이는 발견하지 못하였지만 상처크기가 약 50%이상 회복된 6일 이후에는 피부수분손실량이 대조군에 비해 TPF를 드레싱한그룹에서 전반적으로 감소되는 경향을 보였다. 특히 4% TPF와 2% TPF+Pi간의 효과차이는 관찰되지 않았다. 또한각 시험물질에 대한 유해성을 확인하려 마우스의 무게를 측정한 결과 이상점은 나타나지 않았다 (그림 2E). 본실험의 결과는 TPF가 I/R 후에 부분적으로 피부압박궤양의 형성을 보호한다는 것을 보여준다. 이중에서도 욕창의 초기회복속도에 고농도(4%) TPF가 더 좋은 효과를 보였으나 이후에는 저농도(2%) TPF에 Pi가 첨가된 시험물질도 비슷한 회복속도를 보여주었고, 두 시험물질 모두 SS보다 더 좋은 효과가 있음을 보였다 마우스에서 I/R 손상 후 상처부위의 염증 반응에 대한 TPF와 propionate의 효과 I/R 손상 4일 후 염증세포의 침윤을 관찰하기 위하여 조직학적 변화를 관찰하였다. 치유가 잘 되지 않는 압박궤양과 같은 조건에서는 ROS와 여러 효소들을 가지고 있는 호중구 (neutrophil) 침윤이 고착화 되면서 만성 염증상태에 이르게 되는데, 이러한 궤양의 치유는 염증이 제어가 된 후에 진행이 된다. 또한 비정상적인 치유의 과정은 섬유증(fibrosis)를 유발하기도 하는데 종종 이러한 섬유성병변은 비만세포(mast cell)의 증가가 관여하기도 한다. 일반적으로 비만세포는 상처치유 과정 중에 증가하며 효소, 히스타민 및 여러 활성 아민(amine)으로채워진 과립을 방출하여 염증을 일으킨다 비만세포에서 방출되는 활성 아민은 주변혈관이 새는 원인이 되고 따라서 단핵세포가 손상 부위로 신속히 이동 할 수 있게 한다. 본 실험에서는 toluidine blue 염색을 이용하여 욕창형성부위의 비만세포 침윤정도를 측정하여 염증반응의 정도를 관찰하였다 (그림 3). 대조군의 경우 I/R에 의한 피부손상 시 비만세포의 침윤이 상당히 증가하였다. 하지만 SS, 4% TPF 및 2% TPF+Pi를 처리한 그룹에서는비만세포의 침윤정도가 상당히 감소했음을 볼 수 있다 (그림 3A 및 B). 그리고 통계적으로 2% TPF+Pi를 처리한그룹이 비만세포의 침윤억제에 가장 좋은 효과를 보이고 있다. 이 결과들은 TPF가 염증반응을 매개하는 지방세포 침윤의 감소를 유도함으로써 염증반응을 줄여주고 있음을 보여주고 Pi의 첨가로 인해 그 효과가 증가하고 있음을 제시한다.

마우스에서 I/R 손상 후 상처부위 대식세포 침윤에 대한 TPF와 propionate의 효과 호중구(neutrophil) 및 대식세포(macrophage)는 염증 및 혈관신생을 조절하여 I/R손상에 관여한다. 본 실험에서는 피부 I/R 손상 후 호중구 및 대식세포의 침윤 및 활성에 대한 TPF 및 Pi의 영향을 분석하였다. I/R손상 이후드레싱 4일 후, 진피의 부종과 피하선에서의 염증세포 침윤이 조직학적으로 관찰되었다 (그림 4). 그리고 MPO와CD68 항체를 이용하여 I/R 후 호중구와 대식세포의 침윤을 확인 한 결과 시험군 (SS, 4% TPF 및 2% TPF+Pi)를__ 처리한 그룹에서는 호중구와 대식세포의 수가 대조군과 비교하여 유의하게 감소되었다. 이는 TPF가 호중구 및대식세포의 축적 또는 기능을 조절할 수 있음을 시사하고 저농도(2%)의 TPF와 함께 Pi의 처리는 고농도(4%)의TPF와 비슷하거나 그 이상의 효과를 보이고 있음을 보여준다 (그 4A 및 C). 피부 내 국소 미세환경은classically activated macrophage (M1 대식세포)와 alternatively activated macrophage (M2 대식세포)의 발달을 촉진 시킨다 M1 대식세포는 초기 조직손상 반응에서 관촬되며, MCP-1, NO, IL-1, IL-6, IL-12 및 TNFα를포함한 전염증성 매개체의 분비에 의한 염증을 유도한다. 반면에 M2 대식세포는 초기 및 중간단계에서 필수적인역할을 하는데, 염증의 해소를 유도하고 조직 복구를 촉진한다. 따라서 본 실험은 I/R 부위에서 M1 및 M2 대식세포의 변화를 조사하였다. 우리는 먼저 각 그룹별로 iNOS (M1 marker)와 Arg-1 (M2 marker) mRNA의 발현을 확인하였다 (그림 4C). I/R 유도 후 증가된 iNOS mRNA 수준은 SS, 4% TPF 및 2% TPF+Pi를 처리 한 그룹에서 유의하게 감소하였다. 하지만 Arg-1의 mRNA 수준은 약간 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다.Immunoblot assay로 확인한 iNOS 및 Arg-1 발현변화도 비슷한 경향을 나타내었다 (그림 4C). 이어서 조직형광염색으로 조직 내 침윤을 확인하였다. I/R 손상 초기 M1 및 M2 대식세포는 상당히 증가되어 있다. 반면에 SS, 4%TPF 및 2% TPF+Pi를 처리하였을 시 총 iNOS+M1대식세포의 수는 유의하게 감소하였고, Arg-1+M2 대식세포는 약간 감소했음을 보였다 (그림 4B). 단, iNOS 및 Arg-1 발현량의 변화를 비교해 보았을 때 욕창초기 TPF에 의한대식세포 감소량이 M1 대식세포에 더 집중되어 보인다. 다음으로 real-time PCR을 이용하여 I/R 손상부위에서M1 대식세포에 의해 분비될 수 있는 전염증성 사이토카인 및 케모카인 MCP-1, IL-1β, IL-6, TNFα의 mRNA수준에 대한 TPF 및 Pi의 효과를 조사하였다. SS, 4% TPF 및 2% TPF+Pi 드레싱은 I/R 손상으로 증가된 염증 유발성사이토카인 및 케모카인의 mRNA수준을 유의하게 억제했다 (그림 4D). 단, 4% TPF와 2% TPF+Pi 사이에 유의한 차이는 나타나지 않았다. 본 실험을 통하여 4% TPF 및 2% TPF+Pi가 I/R 후에 유도되는 호중구 및 대식세포의 조직내 침윤을 감소시켜주고 피부염증을 완화시킬 수 있음을 시사하고, 저농도(2%)의 TPF에 Pi의 첨가는 고농도(4%)의 TPF와 비슷한 효과를 보일 수 있음을 제시한다.

마우스에서 I/R 손상 후 세포사멸 억제에 대한 TPF와 propionate의 효과 I/R에 의해 발생된 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)는 피부세포들의 세포사멸(apoptosis)를 유도할수 있고, 2차 괴사 (necrosis)에 의해 유발된 염증반응을 일으킬 수 있다. I/R 유도로 손상된 피부의 세포사멸에 대한 TPF 및 Pi의 효과를 확인하기 위해 피부조직에 TUNEL 염색을 수행하였다. 4일차 피부조직의 I/R 유도부위에서 4% TPF 및 2%, TPF+Pi를 드레싱한 그룹의 사멸된 세포수가 대조군마우스와 비교하여 감소된 것이 확인되었다 (그림 5A 및 B). 추가로 세포사멸에 관여하는 단백질의 변화를 확인하였다. Bax 및 cleaved caspase-3는세포사멸이 발생하였을 시 활성화되는 단백질로 세포사멸 마커로 사용된다. 4% TPF 및 2% TPF+Pi의 처리는 I/R손상 시 유도된 Bax 및 cleaved caspase-3의 활성을 감소시켰다 (그림 5C). 단, 두 그룹간의 유의한 차이는 발견되지 않았지만 저농도(2%)에 Pi의 첨가로 고농도(4%) TPF의 효과를 나타낼 수 있음을 보였다. 이러한 결과들은 4% TPF, 2% TPF+Pi가 피부 I/R 손상에 의해 유도된 세포사멸 세포의 형성 및 축적을 억제할 수 있음을 시사한다.

마우스에서 I/R 손상 후 상처부위 섬유조직 회복과 혈관생성에 대한 TPF와 propionate의 효과 피부 I/R 손상 후 12일, 16일 째에 섬유조직의 회복에 대한 TPF 및 Pi의 효과를 조사하였다. 12일에 표피의 재생은 TPF를 처리한 모든 그룹에서 완성이 되었으나 대조군과 SS를 처리한 그룹에서는 일부 진행 중이었고, 부종과 출혈은 거의 회복되었다 (그림 6A). Masson’s trichrome 과 picro-sirius red를 통해 조직 진피 내 콜라겐의 함유 정도를 비교하였으며 이로 인해 섬유조직의 회복정도를 파악하였다. 대조군에 비해 SS, 4% TPF 및 2%TPF+Pi를 처리한 모든 그룹에서 진피의 섬유화 된 조직이 증가하였음을 확인하였다. 정상 진피는 약 80%의 typeI 콜라겐과 20%의 type Ⅲ 콜라겐을 포함한다. 일반적으로 창상 후 24시간이 지나면 침투된 섬유아세포(fibroblast)가 type I과 type Ⅲ 콜라겐을 합성, 분비하여 새로운 기질 (matrix)를 형성하기 시작한다. 육아조직 (granuloma tissue)은 정상조직보다는 type Ⅲ 콜라겐이 훨씬 증가하지만 그래도 type I 콜라겐이 주된 성분을 이루고 정상조직에 가까워질수록 type I 콜라겐의 비율이 증가하게 된다. 우리는 I/R 유도 후 진피 내 콜라겐 생성 비율을 보기위해 16일차에 picro-sirius red로 염색하였다 (그림 6B). I/R 유도 후 PBS만 처리한 대조군에서는 진피 상층부에 얇고 녹색 및 황색을 띤 type Ⅲ 콜라겐의 비율이 상대적으로 높은 것을 볼 수 있다.하지만 S.S., 4% TPF 및 2% TPF+Pi를 드레싱한 시험군에서는 심부에서 볼 수 있듯이 교차구성을 보이는 좀 더두껍고 성숙된 적색, 적황색의 type I 콜라겐 섬유가 형성되어 있다. 이는 I/R에 의한 피부압박궤양의 치유과정후반에 tissue remodeling을 촉진하면서 빠른 정상적인 피부로의 회복을 유도하고 있음을 제시한다. 단, 4% TPF및 2% TPF+Pi간의 유의한 차이는 확인되지 않았으나 저농도(2%)의 TPF에 Pi의 첨가로 고농도(4%) TPF의 처리와 비슷한 효능을 보일 수 있음을 시사한다.

추가적으로, 피부 재생과정에서 미세혈관 밀도를 함께 관찰하기 위해 αSMA 면역염색을 한 결과 미세혈관은 주로 욕창부위 가까이에 위치한 진피 유두층과 심부에 출현하였다 (그림 6A). αSMA-양성 미세혈관 밀도는 대조군에 비해 시험군에서 유의하게 증가하였고, 4% TPF 및 2% TPF+Pi간의 유의한 차이는 보이지 않는다. 마우스에서 I/R 손상 후 피부장벽 개선에 대한 TPF와 propionate의 효과 표피층의 재생은 I/R 손상 후 16일에 모든 군에서 완전하지는 않았으나 거의 대부분 상피의 재형성이 이루어졌다. I/R유도 후 회복된 상피의 구성 및상태확인을 위해 면역조직화학염색을 시행하였다. 그림 7에서 확인할 수있듯이, S.S., 4% TPF 및 2% TPF+Pi의 처리는 상피세포의 분화지표인 filaggrin과 involucrin의 발현이 대조군에 비해 증가하였다. 각질형성세포 (keratinocyte)는 유극층 (spinous layer)의 세포가 과립층 (granularlayer)에서 각질층으로 최종 분화함에 따라 그 형태와 생화학적 특성을 근본적으로 변화시키는 것으로 표피의보호막 기능을 획득한다. 불용성 각질화형 케라틴 (K1, K10)이 filaggrin의 활동에 의해 응집되어 케라틴 패턴이라 불리는 층상에서 막상의 구조를 형성하여 각질층의 수분유지를 유효하게 하는 기능을 하기도 한다. 세포막에서는 involucrin, loricrin등의 후기 각질화 과정에 유효한 단백질이 칼슘의존성 transglutaminase 등 다수의 효소활성에 의해 세포막의 내측에 다리를 놓아 불용성의 근연대를 형성한 후 각질형성세포를 벗겨지기 어려운 강인한 층상의 구조물로 재구성하여 보호막으로서의 기능을 완성시키기에 표피층의 재생 후 분화를 통한 이들의 발현은 정상적인 표피의 구성에 중요하다 본 연구에서는 I/R 손상 후 고농도(4%) TPF, 저농도(2%) TPF+Pi드레싱이 빠른 표피층의 재생과 더불어 각질형성세포의 분화를유도하여 피부장벽을 개선함으로써 정상적인 피부를 회복시키는데 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (1)

1. 동물 허파 조직 추출물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 허파 조직 추출물은 인지질 분획이고, 상기 조성물은 추가적으로 유기산 또는 그 염을 포함하고, 상기 유기산은 프로피온산인 포함하는 욕창 치료용 조성물.
   

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