KR20230013492A - 이타콘산을 생산하는 신규 대사 경로 및 이를 이용한 이타콘산의 생산 방법 - Google Patents

이타콘산을 생산하는 신규 대사 경로 및 이를 이용한 이타콘산의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이타콘산 생산을 위한 신규 대사 경로 및 상기 대사 경로가 도입된 이타콘산 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 이타콘산 대사 경로가 도입된 이타콘산 생산용 재조합 미생물은 이타콘산의 생산량 및 수율이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 이타콘산 생산용 재조합 미생물은 TCA 회로 중간 물질이 아닌 해당 과정의 중간 물질을 사용하는바, 추가 개량을 통해 이타콘산 생산 수율을 더욱 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 신규 이타콘산 대사 경로 및 이를 도입한 재조합 미생물은 이타콘산의 경제성을 높일 수 있는 바, 이타콘산이 활용되는 합성수지, 라텍스 및 식품첨가물 등의 산업 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

이타콘산을 생산하는 신규 대사 경로 및 이를 이용한 이타콘산의 생산 방법{Novel itaconic acid production pathway and method of itaconic acid production}
본 발명은 이타콘산 생산을 위한 신규 대사 경로 및 상기 대사 경로가 도입된 이타콘산 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다.
이타콘산(itaconic acid)은 5개의 탄소로 이루어진 디카르복실산이며, 구조적 특성으로 인하여 플라스틱 및 라텍스 등과 같은 다양한 고분자 물질 합성의 전구체로 사용될 수 있기 때문에 산업적인 가치가 크다. 따라서 2004년에는 미국 에너지부(United State Department of Energy)로부터 상위 12 바이오 기반의 플랫폼 화합물(Top 12 bio-based platform chemicals)에 선정되기도 하였다.
이타콘산을 생물학적으로 생산하는 것은 자연에서 스스로 이타콘산을 생산하는 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus)를 통해 이루어질 수 있지만, 잘 알려지지 않은 균주의 특성으로 인하여 발효 과정이 다루기 어렵고, 비용 또한 많이 소모된다. 뿐만 아니라 상기 아스퍼질러스 테레우스는 개량을 위한 유전자 조작이 어렵고, 이타콘산 이외에 다양한 부산물들의 생산을 통제하는 것이 어렵기 때문에 정제 과정에서 비용이 많이 소모된다는 한계도 있다.
이에 따라 더욱 효율적으로 이타콘산을 생산하기 위해, 이타콘산 생산용 재조합 미생물을 구축하기 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 그 중 가장 많이 이루어지고 있는 연구는 균주의 특성 및 유전자 조작이 용이한 미생물인 대장균을 통해 이타콘산을 더욱 효율적으로 생산하고자 하는 연구이다. 대장균을 통해서는 아스퍼질러스 테레우스의 시스-아코니트산 탈탄산효소(cis-aconitate decarboxylase, CAD)를 이종발현 시킴으로써 이타콘산을 생산할 수 있음이 확인 되었지만, 이종 발현시에 효소 발현과 활성이 동종 발현에 비해 매우 낮기 때문에 높은 수율의 이타콘산 생산에는 어려움이 있었다. 더불어, 기존 생산 회로의 경우 TCA 회로 중간 물질을 전구체로 활용하는데 대장균 내에서는 TCA 중간체의 축적이 어려워 생산에 한계가 존재하였다.
이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, TCA 회로의 중간 물질을 사용하는 이타콘산 생산방식이 아닌 해당 과정의 중간 물질을 사용하는 신규 이타콘산 대사 경로를 구축하였다. 또한 상기 대사 경로를 도입한 재조합 미생물이 이타콘산 생산능이 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 CimA3.7 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 Mii 유전자를 포함하는 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트를 포함하는 이타콘산 생산용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 이타콘산 생산용 재조합 벡터가 도입된 이타콘산 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 이타콘산 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 CimA3.7 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 Mii 유전자를 포함하는 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트를 포함하는 이타콘산 생산용 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 이타콘산 생산용 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 이타콘산 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계;를 포함하는 이타콘산 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 이타콘산 대사 경로가 도입된 이타콘산 생산용 재조합 미생물은 이타콘산의 생산량 및 수율이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 이타콘산 생산용 재조합 미생물은 TCA 회로 중간 물질이 아닌 해당 과정의 중간 물질을 사용하는바, 추가 개량을 통해 이타콘산 생산 수율을 더욱 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 신규 이타콘산 대사 경로 및 이를 도입한 재조합 미생물은 이타콘산의 경제성을 높일 수 있는 바, 이타콘산이 활용되는 합성수지, 라텍스 및 식품첨가물 등의 산업 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 대장균의 신규 이타콘산 생산 경로를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 신규 이타콘산 생산 경로를 포함하는 재조합 미생물의 시트라말산 및 이타콘산 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 신규 이타콘산 생산 경로를 포함하고, 발효산 대사 경로 관련 유전자가 결실된 재조합 미생물의 시트라말산 및 이타콘산 생산량(A) 및 수율(B)을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 신규 이타콘산 생산 경로를 포함하고, 발효산 대사 경로 관련 유전자 및 TCA 회로 유입 경로 관련 유전자가 결실된 재조합 미생물의 시트라말산 및 이타콘산 생산량(A) 및 수율(B)을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 CimA3.7 유전자 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 Mii 유전자를 포함하는 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트 및 이를 포함하는 이타콘산 생산용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 이타콘산은 탄소 5 개로 이루어진 디카르복실산으로, 구조적 특성으로 인하여 플라스틱 및 라텍스 등과 같은 고분자 합성의 전구체로 이용된다.
본 발명에 있어서, CimA((R)-citramalate synthase) 유전자는 메타노콕쿠스 자나스치(Methanococcus jannaschii) 유래의 시트라말산 합성효소CimA((R)-citramalate synthase)로, 피루브산과 아세틸조효소 A로부터 시트라말산(citramalic acid)을 합성한다고 알려져 있다. 또한 상기 효소를 기반으로 개량된 CimA3.7은 효소 활성이 향상되고 피드백 저해를 받지 않는 것이 알려져 있다. 본 발명의 CimA3.7 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시된다.
본 발명에 있어서, Mii(3-methylitaconate isomerase) 유전자는 유박테리움 바케리(Eubacterium barkeri) 유래의 메틸이타콘산(methylitaconate)를 디메틸말리에이트(dimethylmaleate)로 전환시킬 수 있는 활성이 보고된 바 있다. 본 발명의 Mii 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시된다.
본 발명에 있어서, LeuCD(3-isopropylmalate dehydratase) 유전자는 대장균 내에 존재하는 3-이소프로필 말레이트 탈수효소로, 시트라말산을 시트라코닉산(citraconic acid)로 전환하는 특성 또한 가지고 있다. 본 발명의 LeuC 및 LeuD 유전자는 각각 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시된다.
본 발명의 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열번호 12 또는 13의 염기서열로 표시되는 5‘ UTR을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 5' UTR(untranslated region)은 mRNA의 5' 말단과 3'말단에 있는 비번역부위로, 일반적으로 mRNA의 5' 비번역 부위(5' untranslated region: 5' UTR)는 유전자 발현 과정에서 여러 가지 기능을 수행하나 이러한 기능 중, 가장 큰 특징은 mRNA 번역 효율 조절에 관여하는 것이다. 번역개시 코돈의 인접한 상부에 존재하는 5' UTR의 염기서열은 번역 단계의 효율에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있으며, 이러한 5' UTR의 길이는 백 베이스 (base) 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 되어 있고, 3' UTR의 길이는 그보다 더 긴 몇 킬로베이스(kilo base)로 이루어져 있다. 또한, 원핵생물에 5' UTR에 위치한 리보솜 결합 부위 시퀀스로 알려진 샤인-달가노 시퀀스 (Shine-Dalgarno sequence)와 같이 정해진 위치는 아니지만 진핵생물에서도 리보솜 결합 부위 시퀀스라 할 수 있는 5’ UTR에 속한 시퀀스들에 관한 연구 결과가 보고된 바 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 발현 카세트는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 Tac 프로모터를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 발현 카세트는 프로모터와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 생산하기 위해 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 목적 단백질 발현 카세트는 구체적으로, 프로모터 서열 하류에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.
또한, 유전자의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 각 유전자에 해당하는 서열번호의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
상기 ‘작동 가능하게 연결’이란 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, ‘재조합 유전자 발현 카세트’는 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 재조합 미생물을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 있어 상기 재조합 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여도 상기와 같이 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다. 재조합 유전자 발현 카세트를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자 조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법이 있다.
본 발명에 있어서, 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서 재조합 벡터는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 이타콘산 생산용 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 것을 말한다. 본 발명에서 ‘형질전환’은 본 발명에 따른 프로모터, 또는 추가적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입 하는 것을 의미한다. 또한, 형질전환 된 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이타콘산 생산용 재조합 미생물은 하나 또는 복수 개의 재조합 벡터가 도입될 수 있으며, 상기 하나 또는 복수 개의 재조합 벡터가 각각 미생물에 도입될 수 있다. 또한, 상기 재조합 벡터는 미생물에 순차적으로 도입될 수 있고, 상호 간 순서가 바뀌어 도입될 수도 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 이타콘산 생산용 재조합 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 에스케리치아(Escherichia) 속 미생물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 대장균 중 아세트산에 대한 내성을 가지는 야생형 대장균 W 균주를 이용하였다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 LeuC 유전자 및 LeuD 유전자가 과발현된 것이 바람직하며, 이를 재조합 균주 WT로 명명하였다. 재조합 균주 WT는 CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD 유전자가 과발현된 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 Tac 프로모터 및 5‘ UTR을 포함하는 LeuCD 과발현용 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 LeuCD 과발현용 발현 카세트는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 Tac 프로모터 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 5‘ UTR을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 상기 WT 균주에서 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 btuE 유전자가 더 결실된 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 btuE 유전자가 결실된 것이다. 상기 균주를 재조합 균주 B로 명명하였다. 재조합 균주 B는 CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD 유전자가 과발현되었으며, btuE 유전자가 결실된 것이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 재조합 균주 B에서 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 LeuB 유전자가 결실된 것이 바람직하며, 이를 재조합 균주 BL로 명명하였다. 재조합 균주 BL은 CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD 유전자가 과발현되었으며, btuE 및 LeuB 유전자가 결실된 것이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 재조합 균주 BL에서 서열번호 7의 염기서열로 표되는 ldhA 유전자; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 adhE 유전자;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자가 결실된 것이 바람직하다. 보다 상세하게는, 상기 재조합 균주 B에서 (i) ldhA 유전자가 결실된 균주는 재조합 균주 BLL로, (ii) adhE 유전자가 결실된 균주는 재조합 균주 BLA로, (iii) IdhA 및 adhE 유전자가 결실된 균주는 재조합 균주 BLLA로 명명하였다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 ldhA 유전자; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 adhE 유전자;가 모두 결실되고, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 ackA 유전자가 추가 결실된 것이 바람직하다. 다시 말해, 상기 재조합 미생물은 재조합 균주 BLLA에서 ackA 유전자가 결실된 것으로, 재조합 균주 BLLAA로 명명하였다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 미생물은 재조합 균주 BLLAA에서 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 gltA 유전자가 결실된 것이 바람직하며, 이를 재조합 균주 BLLAAG로 명명하였다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 이타콘산 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계;를 포함하는 이타콘산 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양조건은 통상의 에스케리키아 속 미생물의 배양에 사용되는 배지이면 어느 것이나 사용될 수 있으나, 본 발명의 미생물의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 배지는 탄소원으로서 포도당, 피루베이트 등을 포함할 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃로 설정할 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 이타콘산은 추가로 정제 또는 회수하는 단계를 포함할 수 있으며, 미생물 또는 배양물로부터 이타콘산을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당업자는 공지된 여러 정제 공정 중 필요에 따라 선택하여 활용할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 신규 이타콘산 생산 경로 구축 및 이를 도입한 재조합 미생물 제작
Mii(3-methylitaconate isomerase) 유전자의 기질 비특이성(substrate nonspecificity)를 활용하여, 시트라코닉산(citraconate)을 이타콘산(itaconate)으로 전환하는 신규 생합성 회로를 상기 CimA3.7(서열번호 1) 및 Mii(서열번호 2) 유전자를 발현시켜 구축하였다. 신규 생합성 경로는 도 1에 나타내었다.
구체적으로, CimA3.7 및 Mii 유전자는 Tac 프로모터와 합성 5' UTR을 포함한 재조합 발현 카세트를 활용하여 대장균 W 내에서 발현시켰다. 대조군과 구축된 균주 WC 및 WCM은 다음과 같다.
- 대조군 : 야생형 대장균 W
- WC : CimA3.7 유전자(서열번호 1)가 도입된 대장균 W
- WCM : CimA3.7(서열번호 1) 및 Mii(서열번호 2) 유전자가 도입된 대장균 W
실시예 2. 신규 이타콘산 생산 경로를 도입한 재조합 미생물의 시트라말산 및 이타콘산 생산 확인
신규 이타콘산 생산 경로를 도입한 재조합 미생물을 통한 이타콘산 생산을 확인하기 위하여, 상기 구축된 균주(WC 및 WCM)를 배양하였다. 구체적으로, 상기 3종의 균주를 각각 고체 LB 아가 플레이트에 배양하여 개별 군집을 확보하였다. 확보된 개별 군집을 시험관에서 37℃ 200 rpm 조건에서 약 12시간 동안 배양하였다. 배양된 균주를 300 mL 둥근 플라스크에 담긴 20 mL의 M9 배지에 1/100 희석 접종하고, IPTG를 1M의 농도로 첨가한 후 30℃, 200 rpm 조건으로 배양하였다. 그 후 OD600 값이 1 내지 2에 도달하면 300 mL 둥근 플라스크에 담긴 20 mL의 M9 배지에 OD600 값이 0.05이 되도록 접종하고 IPTG를 1M의 농도로 첨가하였다. 이후 균주를 30℃, 200 rpm 조건으로 배양하였다. 실시예 2에서 사용한 M9 배지에는 glucose가 20 g/L, yeast extract가 5 g/L로 첨가되었다. 배양 중 6시간 마다 10 M NaOH를 이용하여 pH를 7.0로 유지하였다. 배양 24시간 후, 배양액 1 mL를 원심분리를 통해 배양세포를 배양액과 분리한 후, 상층 배양액을 취하여 HPLC를 이용하여 정량분석하였다. HPLC 분석은 Aminex HPX-87H 칼럼을 고정상으로 하고, 5 mM 황산수용액을 이동상으로 하여 분당 0.6 mL의 이동상 속도 조건하에서 진행되었으며, 검출에는 Shodex RI-101 기기를 이용하였다. 시트라말산 및 이타콘산 생산 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군인 야생형 대장균 W 균주는 시트라말산 및 이타콘산을 모두 생산하지 못했다. 또한 WC 균주는 시트라말산은 생산하였으나, 이타콘산은 생산하지 못했다. 반면에 WCM 균주는 시트라말산 및 이타콘산을 모두 생산하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 신규 이타콘산 생산 경로를 도입한 재조합 미생물(즉, WCM 균주)는 이타콘산을 생산할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 3. 발효산 생산 경로 관련 유전자 결실을 통한 이타콘산 생산능이 향상된 재조합 미생물 제작
이타콘산 생산 효율을 향상시키기 위하여, 실시예 1에서 이타콘산 생산능이 확인된 WCM 균주에 LeuC(서열번호 3) 및 LeuD(서열번호 4)를 과발현시킨 재조합 미생물을 제작하였고, 이를 WT로 명명하였다. 상기 LeuCD는 Tac 프로모터와 합성 5' UTR을 포함한 재조합 플라스미드를 도입하여 과발현시켰다.
또한 상기 WT 균주로부터 발효산 생산 경로 관련 유전자 btuE(서열번호 5), leuB(서열번호 6), ldhA(서열번호 7), adhE(서열번호 8) 또는 ackA(서열번호 9) 유전자를 결실시킨 재조합 미생물을 구축하였다. 유전자 결실은 FRT-KanR-FRT 단편을 포함하는 재조합 벡터 혹은 DNA 단편을 도입하여 진행하였다. 상기 발효산 생산 경로는 이타콘산 생산 경로와 경쟁적인바, 이타콘산 생산을 저해한다.
실시예 1에서 이타콘산 생산이 확인된 WCM 균주로부터 LeuCD를 과발현시킨 균주를 기본으로, 구축된 발효산 생산 경로 관련 유전자가 결실된 재조합 균주 7종은 다음과 같다.
- WT : CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD가 과발현된 대장균 W
- B : CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD가 과발현되었으며, btuE가 결실된 대장균 W
- BL : CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD가 과발현되었으며, btuE 및 LeuB가 결실된 대장균 W
- BLL : CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD가 과발현되었으며, btuE, LeuB 및 ldhA가 결실된 대장균 W
- BLA : CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD가 과발현되었으며, btuE, LeuB 및 adhE가 결실된 대장균 W
- BLLA : CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD가 과발현되었으며, btuE, LeuB, ldhA 및 adhE가 결실된 대장균 W
- BLLAA : CimA3.7 및 Mii 유전자가 도입되고, LeuCD가 과발현되었으며, btuE, LeuB, ldhA, adhE 및 ackA가 결실된 대장균 W
구축된 7종의 재조합 균주를 배양하여 이타콘산을 생산 및 정량하였다. 이타콘산의 생산 및 정량은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 진행하였다. 다만, 실시예　3에서 사용한 M9 배지에는 glucose가 5 g/L, yeast extract가 5 g/L로 첨가되었다. 구축된 재조합 균주의 시트라말산과 이타콘산의 생산성 및 수율은 각각 도 3a 및 b에 나타내었다.
도 3a 및 b에 나타낸 바와 같이, 본 실시예에서 구축된 재조합 균주 LeuCD 과발현 및 발효산 생산 경로 결실을 통해 시트라말산 생산이 현저히 증가하였고, 이에 따라 이타콘산의 생산 또한 현저히 증가한 것을 확인하였다.
실시예 4. TCA 회로 유입 경로 관련 유전자 결실을 통한 이타콘산 생산능이 향상된 재조합 미생물 제작
상기 실시예 3에서 구축된 재조합 균주 BLLAA에 TCA 회로 유입 경로의 결실을 위해 gltA 유전자(서열번호 10)을 결실시켰으며, 이를 재조합 균주 BLLAAG로 명명하였다. 상기 gltA 유전자의 결실은 상기 실시예 3에서 유전자를 결실시킨 방법과 동일하게 FRT-KanR-FRT 단편을 포함하는 재조합 벡터 혹은 DNA 단편을 도입하여 진행하였다.
구축된 재조합 균주 BLLAAG와 상기 실시예 3에서 구축된 재조합 균주 WT 및 BLLAA을 배양하여 이타콘산을 생산 및 정량하였다. 이타콘산의 생산 및 정량은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 진행하였다. 구축된 재조합 균주의 시트라말산과 이타콘산의 생산성 및 수율은 각각 도 4a 및 b에 나타내었다.
도 4a 및 b에 나타낸 바와 같이, 재조합 균주 BLLAA는 시트라말산 수율이 재조합 균주 WT 대비 약 1.66 배 증가하였다. 특히 재조합 균주 BLLAAG는 시트라말산 수율이 재조합 균주 BLLAA 대비 약 1.57배 증가하였고, 재조합 균주 WT 대비 약 2.61배 증가하였다. 또한, 재조합 균주 BLLAAG는 이타콘산 생산 수율이 재조합 균주 WT 대비 약 3.05 배 증가하였다. 재조합 균주 BLLAAG의 시트라말산과 이타콘산의 합산 수율은 0.48 g/g glucose로, 높은 수율로 이타콘산을 생산 가능함을 확인하였다.
종합적으로 본 발명자들은 신규한 이타콘산 생산 경로를 구축하고, 이를 도입한 재조합 미생물의 이타콘산 생산수율이 증가된 것을 확인하였다. 나아가, 상기 재조합 미생물에 추가 유전자 조작을 통해, 이타콘산 생산 수율을 극대화시켰다. 따라서 본 발명의 재조합 미생물은 이타콘산 생산 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> POSTECH Research and Business Development Foundation <120> Novel itaconic acid production pathway and method of itaconic acid production <130> 1-94 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1119 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CimA3.7 <400> 1 atgatggttc gcatttttga caccactctg cgcgatgggg aacagactcc cggtgttagt 60 ttaacaccta atgacaagtt agaaatcgca aagaagcttg acgaacttgg tgtagatgtt 120 atcgaggcgg gttcagcagt aacgtcaaaa ggcgagcgcg agggaatcaa attgatcact 180 aaggagggcc tgaacgctga gatttgcagt tttgtacgcg cgcttcccgt cgatattgat 240 gcagctttgg aatgtgatgt tgattcggtt catttggttg tcccaacatc gccgattcac 300 atgaagtata agctgcgcaa gaccgaggac gaagttttag tcacagctct gaaggccgtg 360 gaatatgcta aggaacaggg attaatcgtg gagttatccg cagaggacgc aacacgctca 420 gatgttaact tcttaatcaa acttttcaat gagggtgaga aagtaggagc ggatcgtgta 480 tgtgtttgcg acaccgtcgg agtcttgacc ccgcagaaga gccaagagtt atttaaaaaa 540 attacagaga atgttaactt gcccgtttca gtacattgcc ataatgactt tggtatggca 600 acggctaacg cttgttcagc agtactgggt 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cgcagtcgcg 360 ccggaagaga gcggattcta tgcccgtatg gtcagcaaag gccgtgcacc gctgtacccg 420 gatgatattt tatggaattt tgaaaaattc ctggttggca gggacggaaa agtcatccag 480 cgtttttccc cggatatgac gccggaagat cccattgtga tggaaagcat taaactggcg 540 ttggcaaaat aa 552 <210> 6 <211> 1092 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LeuB <400> 6 atgtcgaaga attaccatat tgccgtattg ccgggggacg gtattggtcc ggaagtgatg 60 acccaggcgc tgaaagtgct ggatgccgtg cgcaaccgct ttgcgatgcg catcaccacc 120 agccattacg atgtaggcgg cgcagccatt gataaccacg ggcaaccact gccgcctgcg 180 acggttgaag gttgtgagca agccgatgcc gtgctgtttg gctcggtagg cggcccgaag 240 tgggaacatt taccaccaga ccagcaacca gaacgcggcg cgctgctgcc tctgcgtaag 300 cacttcaaat tattcagcaa cctgcgcccg gcaaaactgt atcaggggct ggaagcattc 360 tgtccgctgc gtgcagacat tgccgcaaac ggcttcgaca tcctgtgtgt gcgcgaactg 420 accggcggca tctatttcgg tcagccaaaa ggccgcgaag gtagcggaca atatgaaaaa 480 gcctttgata ccgaggtgta tcaccgtttt gagatcgaac gtatcgcccg catcgcgttt 540 gaatctgctc gcaagcgtcg ccacaaagtg acgtcgatcg ataaagccaa cgtgctgcaa 600 tcctctattt tatggcggga gatcgttaac gagatcgcca cggaataccc ggatgtcgaa 660 ctggcgcata tgtacatcga caacgccacc atgcagctga ttaaagatcc atcacagttt 720 gacgttctgc tgtgctccaa cctgtttggc gacattctgt ctgacgagtg cgcaatgatc 780 actggctcga tggggatgtt gccttccgcc agcctgaacg agcaaggttt tggactgtat 840 gaaccggcgg gcggctcggc accagatatc gcaggcaaaa acatcgccaa cccgattgca 900 caaatccttt cgctggcact gctgctgcgt tacagcctgg atgccgatga tgcggcttgc 960 gccattgaac gcgccattaa ccgcgcatta gaagaaggca ttcgcaccgg ggatttagcc 1020 cgtggcgctg ccgccgttag taccgatgaa atgggcgata tcattgcccg ctatgtagca 1080 gaaggggtgt aa 1092 <210> 7 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhA <400> 7 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60 gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120 actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180 ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240 aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300 gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360 caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420 actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480 cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540 gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600 atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660 gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720 caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780 gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840 ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900 gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960 ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990 <210> 8 <211> 2676 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> adhE <400> 8 atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtaaa aaaagcccag 60 cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc cgccgctctg 120 gctgctgcag atgctcgaat cccactcgcg aaaatggccg ttgccgaatc cggcatgggt 180 atcgtcgaag ataaagtgat caaaaaccac tttgcttctg aatatatcta caacgcctat 240 aaagatgaaa aaacctgtgg tgttctgtct gaagacgaca cttttggtac catcactatc 300 gctgaaccaa tcggtattat ttgcggtatc gttccgacca ctaacccgac ttcaactgct 360 atcttcaaat cgctgatcag tctgaagacc cgtaacgcca ttatcttctc cccgcacccg 420 cgtgcaaaag atgccaccaa caaagcggct gatatcgttc tgcaggctgc tatcgctgcc 480 ggtgctccga aagatctgat cggctggatc gatcaacctt ctgttgaact gtctaacgca 540 ctgatgcacc acccagacat caacctgatc ctcgcgactg gtggtccggg catggttaaa 600 gccgcataca gctccggtaa accagctatc ggtgtaggcg cgggcaacac tccagttgtt 660 atcgatgaaa ctgctgatat caaacgtgca gttgcatctg tactgatgtc caaaaccttc 720 gacaacggcg taatctgtgc ttctgaacag tctgttgttg ttgttgactc tgtttatgac 780 gctgtacgtg aacgttttgc aacccacggc ggctatctgt tgcagggtaa agagctgaaa 840 gctgttcagg atgttatcct gaaaaacggt gcgctgaacg cggctatcgt tggtcagcca 900 gcctataaaa ttgctgaact ggcaggcttc tctgtaccag aaaacaccaa gattctgatc 960 ggtgaagtga ccgttgttga tgaaagcgaa ccgttcgcac atgaaaaact gtccccgact 1020 ctggcaatgt accgcgctaa agatttcgaa gacgcggtag aaaaagcaga gaaactggtt 1080 gctatgggcg gtatcggtca tacctcttgc ctgtacactg accaggataa ccaaccggct 1140 cgcgtttctt acttcggtca gaaaatgaaa acggcgcgta tcctgattaa caccccagcg 1200 tctcagggtg gtatcggtga cctgtataac ttcaaactcg caccttccct gactctgggt 1260 tgtggttctt ggggtggtaa ctccatctct gaaaacgttg gtccgaaaca cctgatcaac 1320 aagaaaaccg ttgctaagcg agctgaaaac atgttgtggc acaaacttcc gaaatctatc 1380 tacttccgcc gtggctccct gccaatcgcg ctggatgaag tgattactga tggccacaaa 1440 cgtgcgctca tcgtgactga ccgcttcctg ttcaacaatg gttatgctga tcagatcact 1500 tccgtactga aagcagcagg cgttgaaact gaagtcttct tcgaagtaga agcggacccg 1560 accctgagca tcgttcgtaa aggtgcagaa ctggcaaact ccttcaaacc agacgtgatt 1620 atcgcgctgg gtggtggttc cccgatggac gccgcgaaga tcatgtgggt tatgtacgaa 1680 catccggaaa ctcacttcga agagctggcg ctgcgcttta tggatatccg taaacgtatc 1740 tacaagttcc cgaaaatggg cgtgaaagcg aaaatgatcg ctgtcaccac cacttctggt 1800 acaggttctg aagtcactcc gtttgcggtt gtaactgacg acgctactgg tcagaaatat 1860 ccgctggcag actatgcgct gactccggat atggcgattg tcgacgccaa cctggttatg 1920 gacatgccga agtccctgtg tgctttcggt ggtctggacg cagtaactca cgccatggaa 1980 gcttatgttt ctgtactggc atctgagttc tctgatggtc aggctctgca ggcactgaaa 2040 ctgctgaaag aatatctgcc agcgtcctac cacgaagggt ctaaaaatcc ggtagcgcgt 2100 gaacgtgttc acagtgcagc gactatcgcg ggtatcgcgt ttgcgaacgc cttcctgggt 2160 gtatgtcact caatggcgca caaactgggt tcccagttcc atattccgca cggtctggca 2220 aacgccctgc tgatttgtaa cgttattcgc tacaatgcga acgacaaccc gaccaagcag 2280 actgcattca gccagtatga ccgtccgcag gctcgccgtc gttatgctga aattgccgac 2340 cacttgggtc tgagcgcacc gggcgaccgt actgctgcta agatcgagaa actgctggca 2400 tggctggaaa cgctgaaagc tgaactgggt attccgaaat ctatccgtga agctggcgtt 2460 caggaagcag acttcctggc gaacgtggat aaactgtctg aagatgcatt cgatgaccag 2520 tgcaccggcg ctaacccgcg ttacccgctg atctccgagc tgaaacagat tctgctggat 2580 acctactacg gtcgtgatta tgtagaaggt gaaactgcag cgaagaaaga agctgctccg 2640 gctaaagctg agaaaaaagc gaaaaaatcc gcttaa 2676 <210> 9 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ackA <400> 9 atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcactgaa atttgccatc 60 atcgatgcag taaatggtga agagtacctt tctggtttag ccgaatgttt ccacctgccc 120 gaagcacgta tcaaatggaa aatggacggc aataaacagg aagcggcttt aggtgcaggc 180 gccgctcaca gcgaagcgct caactttatc gttaatacta ttctggcaca aaaaccagaa 240 ctgtctgcgc agctgactgc tatcggtcac cgtatcgtac acggcggcga aaagtatacc 300 agctccgtag tgatcgatga gtctgttatt cagggtatca aagatgcagc ttcttttgca 360 ccgctgcaca acccggctca cctgatcggt atcgaagaag ctctgaaatc tttcccacag 420 ctgaaagaca aaaacgttgc tgtatttgac accgcgttcc accagactat gccggaagag 480 tcttacctct acgccctgcc ttacaacctg tacaaagagc acggcatccg tcgttacggc 540 gcgcacggca ccagccactt ctatgtaacc caggaagcgg caaaaatgct gaacaaaccg 600 gtagaagaac tgaacatcat cacctgccac ctgggcaacg gtggttccgt ttctgctatc 660 cgcaacggta aatgcgttga cacctctatg ggcctgaccc cgctggaagg tctggtcatg 720 ggtacccgtt ctggtgatat cgatccggcg atcatcttcc acctgcacga caccctgggc 780 atgagcgttg acgcaatcaa caaactgctg accaaagagt ctggcctgct gggtctgacc 840 gaagtgacca gcgactgccg ctatgttgaa gacaactacg cgacgaaaga agacgcgaag 900 cgcgcaatgg acgtttactg ccaccgcctg gcgaaataca tcggtgccta cactgcgctg 960 atggatggtc gtctggacgc tgttgtattc actggtggta tcggtgaaaa tgccgcaatg 1020 gttcgtgaac tgtctctggg caaactgggc gtgctgggct ttgaagttga tcatgaacgc 1080 aacctggctg cacgtttcgg caaatctggt ttcatcaaca aagaaggtac ccgtcctgcg 1140 gtggttatcc caaccaacga agaactggtt atcgcgcaag acgcgagccg cctgactgcc 1200 tga 1203 <210> 10 <211> 1284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gltA <400> 10 atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 60 ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 120 ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 180 gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 240 tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 300 tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 360 ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 420 gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 480 gccgcgttcc gcctgctgtc gaaaatgccg accatggccg cgatgtgtta caagtattcc 540 attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 600 atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 660 gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 720 accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 780 tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 840 tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 900 ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 960 gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct 1020 atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg 1080 aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc 1140 accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 1200 agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 1260 tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1284 <210> 11 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tac promotor <400> 11 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatt 55 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cimA3.7 5'UTR <400> 12 aaacaaaaaa aaaggagcat cctca 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mii 5'UTR <400> 13 aaacacaaga aaaggagcat ccaga 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> leuCD 5'UTR <400> 14 aaagaatcgg aaaggagcat caaca 25

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 CimA3.7 유전자 및
    서열번호 2의 염기서열로 표시되는 Mii 유전자를 포함하는 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 서열번호 12 또는 13의 염기서열로 표시되는 5‘ UTR을 더 포함하는 것인, 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 Tac 프로모터를 더 포함하는 것인, 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트.
  4. 제1항에 따른 이타콘산 생산 경로 도입용 발현 카세트를 포함하는 이타콘산 생산용 재조합 벡터.
  5. 제4항에 따른 재조합 벡터가 도입된 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 LeuC 유전자 및 LeuD 유전자가 과발현된 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 Tac 프로모터 및 5‘ UTR을 포함하는 LeuCD 과발현용 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 LeuCD 과발현용 발현 카세트는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 Tac 프로모터 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 5‘ UTR을 포함하는 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 btuE 유전자가 결실된 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 LeuB 유전자가 결실된 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 ldhA 유전자; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 adhE 유전자;로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자가 결실된 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 ldhA 유전자; 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 adhE 유전자;가 모두 결실되고,
    서열번호 9의 염기서열로 표시되는 ackA 유전자가 추가 결실된 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 재조합 미생물은 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 gltA 유전자가 결실된 것인, 이타콘산 생산용 재조합 미생물
  14. 제5항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 이타콘산 생산용 재조합 미생물을 배양하는 단계;를 포함하는 이타콘산 생산 방법.
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