KR20230005939A - 종양 미세환경에서 면역조절을 위한 히스톤 데아세틸라제 억제제 - Google Patents

종양 미세환경에서 면역조절을 위한 히스톤 데아세틸라제 억제제 Download PDF

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무-수안 양
이-홍 우
즈-하오 추
청-한 초우
예-수 차오
치아-난 첸
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그레이트 노벨 테라퓨틱스 바이오테크 ＆ 메디컬즈 코포레이션
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Abstract

화합물 클래스 I HDAC 억제제, 이의 제조 및 적용이 제공된다. 화합물은 종양 미세환경(TME)에서 후성적 면역조절 활성을 가지고, 종양 세포의 성장을 억제한다.
[화학식 I]
Figure pct00040

Description

종양 미세환경에서 면역조절을 위한 히스톤 데아세틸라제 억제제
본 개시는 일반적으로 클래스 I HDAC 억제제의 화합물, 이의 제조, 및 적용에 관한 것이다. 특히, 화합물은 종양 미세환경(TME)에서 후성적 면역조절 활성을 가지고, 따라서 종양 세포의 성장을 억제한다.
면역요법은 여러 진행성 암의 치료를 위한 표준 치료가 되었다. 면역요법의 돌파구는 항-PD-1/항-PD-L1/항-CTLA-4 항체와 같은 면역 체크포인트 억제제(ICI)의 개발 및 임상 적용이다. 그러나, ICI는 면역-관련 부작용을 유발할 수 있으며, 더 중요하게는 소수의 환자만이 치료적 이점을 얻는다(낮은 반응률). 역동적이고 복잡한 종양 미세환경(TME)은 종양에 대한 면역 반응을 결정하기 위한 핵심 인자이다. TME의 조성물은 암 세포 및 정상 조직 세포와 짜여진 많은 상이한 면역 세포를 포함한다. 많은 성장 인자, 사이토카인 및 케모카인은 TME에서 상이한 세포에 의해 분비된다.
CTL(세포독성 T 림프구)은 암 세포의 직접 사멸에 특이적인 적응 면역의 일차 면역 세포이다. CTL은 CTL 불활성화를 야기하는 TME로 침투하는 다중 면역억제 세포에 민감하다. 널리 공지된 면역억제 세포는 Treg(조절 T 세포), M-MDSC(단핵구-골수성-유래 억제자 세포), PMN-MDSC(다형핵-골수-유래 억제자 세포), 및 TAM(종양-관련 대식세포)을 포함한다. 이러한 면역억제 세포는 CTL에 의해 매개되는 암 세포를 사멸시키는 세포독성 효과의 억제에 기여한다. CTL의 기능장애를 초래하는 이러한 면역억제 세포에 의해 실행되는 상이한 메커니즘이 존재한다.
ICI 요법이 암을 근절하기 위해 면역 활성화를 증가시키는 데 효과적인 것으로 나타났지만, 이러한 요법은 여전히 일차 및 후천성 약물 내성의 미해결 문제에 직면하고 있다. 이러한 면역 요법에 대한 일차 및 후천적 내성을 유발하는 내인성 인자는 유전적 및 후성적 메커니즘을 포함하며, 이는 면역편집과 같은 과정을 통해 종종 MHC I의 하향조절 또는 항원 발현의 손실을 일으켜 항원 제시의 전반적인 손실을 초래한다. 따라서, 항원 프로세싱 및 제시 기구의 상향조절에 의해 항종양 면역을 자극하기 위해 TME에서 면역조절 활성을 갖는 화합물의 개발이 필요하다.
간단히 말해서, 본 개시의 구현예는 TME에서 후성적으로 면역조절될 수 있는, 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물을 포함하는 클래스 I HDAC 억제제 화합물을 제공한다. 암과 같은 다양한 질환 또는 병태의 치료를 위한 이러한 화합물의 사용 방법이 또한 제공된다.
일 구현예에서, 본 개시는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
[상기 식에서, W 및 Y는 각각 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되며;
R1은 수소, 할로겐, C1-C3 알킬 및 할로겐화된 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 일치환, 이치환, 삼치환 또는 사치환일 수 있으며;
C1 및 C2는 단일 결합 또는 이중 결합에 의해 연결된 C 원자이며;
Ar은 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택되며:
Figure pct00002
여기서, Ar은 실선을 통해 C2에 연결되며;
R2는 R1에 대해 기재된 것과 동일한 의미를 가지며;
R3은 수소 또는 C1-C3 알킬임].
일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 6-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피리딘-3-카복사미드로서, 이는 GNTbm-01로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-02로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 4-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)벤즈아미드로서, 이는 GNTbm-03으로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-((E)-4-(피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-04로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-((E)-4-(피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-05로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-06으로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-(4-(6-메틸피리딘-3-일)부탄아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-08로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-((E)-4-(피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-(트리플루오로메틸)페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-11로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-(트리플루오로메틸)페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-12로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-(4-(6-메틸피리딘-3-일)부탄아미도)-N-(2-아미노페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-19로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 5-(4-(6-메틸피리딘-3-일)부탄아미도)-N-(2-아미노-4-(트리플루오로메틸)페닐)피리딘-2-카복사미드로서, 이는 GNTbm-25로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 4-((E)-4-(피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-(트리플루오로메틸)페닐)벤즈아미드로서, 이는 GNTbm-33으로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 4-(4-(피리딘-3-일)부탄아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)벤즈아미드로서, 이는 GNTbm-37로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 4-((E)-4-(피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노페닐)벤즈아미드로서, 이는 GNTbm-38로 명명된다. 일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 4-((E)-4-(피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)벤즈아미드로서, 이는 GNTbm-39로 명명된다.
다른 구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 화합물을 포함하는 약학적 조성물 또는 조합물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 개시는 TME의 후성적 면역조절 및/또는 암의 치료를 위한 방법으로서, 방법은 유효량의 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물 중 임의의 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물 또는 조합물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 방법은 종양 세포의 세포 주기 정지를 유도하고, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하고, 히스톤 H3 아세틸화를 유도하고, 면역 기억을 유도하고, CTL을 활성화하고, 면역억제 세포를 감소시키기 위한 것이다.
다른 구현예에서, 본 개시는 TME의 후성적 면역조절 및/또는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 TME의 후성적 면역조절 및/또는 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 유효량의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물 또는 약학적 조성물 또는 조합물의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 의약은 종양 세포의 세포 주기 정지를 유도하고, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하고, 히스톤 H3 아세틸화를 유도하고, 면역 기억을 유도하고, CTL을 활성화하고, 면역억제 세포를 감소시키기 위한 것이다.
다른 구현예에서, 본 개시는 대상체에서 클래스 I HDAC와 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물 또는 약학적 조성물 또는 조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 개시는 클래스 I HDAC와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 클래스 I HDAC와 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 유효량의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물 또는 약학적 조성물 또는 조합물의 용도를 제공한다.
도 1은 화합물 GNTbm-01, GNTbm-02, 및 GNTbm-03의 구조를 도시한다.
도 2는 NMR 및 고해상도 MS 스펙트럼을 도시한다: (a) 화합물 GNTbm-01의 1H-NMR 분광 데이터, (b) 화합물 GNTbm-02의 1H-NMR 분광 데이터, (c) 화합물 GNTbm-03의 1H-NMR 분광 데이터, (d) 화합물 GNTbm-01의 고해상도 MS 분광 데이터, (e) 화합물 GNTbm-02의 고해상도 MS 분광 데이터, (f) 화합물 GNTbm-03의 고해상도 MS 분광 데이터.
도 3은 처리 후 위상차 광 현미경에 의해 관찰된 세포 형태를 도시한다: 세포 형태의 변화는 위상차 광 현미경에 의해 관찰되었다. (a) MDA-MB-231 세포, (b) SW48 세포, (c) M10 세포.
도 4는 MDA-MB-231 세포에서 G0/G1 단계에서 GNTbm-02 유도된 세포 주기 정지의 평가로부터의 결과를 도시한다: 평가는 용량-의존 및 시간-의존 방식으로 MDA-MB-231에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 처리 후에 수행되었다. 세포는 PI로 염색되고, 유세포 분석기를 사용하여, 상이한 세포 주기 단계의 세포의 백분율이 분석되었다. (a) 및 (b) 용량-의존 방식. (c) 및 (d) 시간-의존 방식.
도 5는 SW48 세포에서 G0/G1 단계에서 GNTbm-02 유도된 세포 주기 정지의 평가로부터의 결과를 도시한다: 평가는 용량-의존적 및 시간-의존 방식으로 SW48 세포에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트로 처리 후 수행되었다. 세포는 PI로 염색되고, 유세포 분석기를 사용하여, 상이한 세포 주기 단계의 세포의 백분율이 분석되었다. (a) 및 (b) 용량-의존 방식. (c) 및 (d) 시간-의존 방식.
도 6은 M10 세포에서 G2/M 단계에서 GNTbm-02 유도된 세포 주기 정지의 평가로부터의 결과를 도시한다: 평가는 용량-의존적 및 시간-의존 방식으로 M10 세포에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트로 처리 후 수행되었다. 세포는 PI로 염색되고, 유세포 분석기를 사용하여, 상이한 세포 주기 단계의 세포의 백분율이 분석되었다. (a) 및 (b) 용량-의존 방식. (c) 및 (d) 시간-의존 방식.
도 7은 MDA-MB-231 세포에서 GNTbm-02 유도된 세포 아폽토시스의 평가로부터의 결과를 도시한다: 평가는 용량-의존적 및 시간-의존 방식으로 MDA-MB-231 세포에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트로 처리 후 수행되었다. 세포는 PI로 염색되고, 유세포 분석기를 사용하여, 서브-G1 단계의 세포의 백분율이 분석되었다. (a) 및 (b) 용량-의존 방식. (c) 및 (d) 시간-의존 방식.
도 8은 SW48 세포에서 GNTbm-02 유도된 세포 아폽토시스의 평가로부터의 결과를 도시한다: 평가는 용량-의존 및 시간-의존 방식으로 SW48 세포에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트로 처리 후 수행되었다. 세포는 PI로 염색되고, 유세포 분석기를 사용하여, 서브-G1 단계의 세포의 백분율이 분석되었다. (a) 및 (b) 용량-의존 방식. (c) 및 (d) 시간-의존 방식.
도 9는 M10 세포에서 GNTbm-02 유도된 세포 아폽토시스의 평가로부터의 결과를 도시한다: 평가는 용량-의존 및 시간-의존 방식으로 M10 세포에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트의 처리 후 수행되었다. 세포는 PI로 염색되고, 유세포 분석기를 사용하여, 서브-G1 단계의 세포의 백분율이 분석되었다. (a) 및 (b) 용량-의존 방식. (c) 및 (d) 시간-의존 방식.
도 10은 GNTbm-02 및 엔티노스타트로 처리된 세포에서 히스톤 H3의 아세틸화 수준의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다: MDA-MB-231 또는 SW48 세포에서 아세틸 히스톤 H3, β-액틴의 대표적인 면역블롯 분석. 세포는 지시된 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로 24시간 동안 처리되었다. 대조군 세포는 비히클과 함께 인큐베이션되었다. (a) (c) 지시된 바와 같이 GNTbm-02 또는 엔티노스타트로 처리된 MDA-MB-231 또는 SW48 세포의 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분해된 후, 히스톤 H3 아세틸화(AcH3)에 대한 항체로 검출한 후 웨스턴 블롯팅 및 면역염색되었다. (b) (d) AcH3 단백질 발현 수준의 정량화는 배수 변화로 나타낸, β-액틴으로 정규화되었다.
도 11은 GNTbm-02 클래스 I HDAC 억제제에 의한 히스톤 H3 아세틸화의 유도의 시간 경과를 예시한다: MDA-MB-231 또는 SW48 세포는 2, 6, 24, 48, 72시간 동안 1 μM의 농도의 GNTbm-02로 처리되었다. (a) (c) 지시된 바와 같이 GNTbm-02로 처리된 MDA-MB-231 또는 SW48 세포의 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분해된 후, 히스톤 H3 아세틸화(AcH3)에 대한 항체로 검출한 후 웨스턴 블롯팅 및 면역염색되었다. (b) (d) AcH3 단백질 발현 수준의 정량화는 배수 변화로 나타낸, β-액틴으로 정규화되었다.
도 12는 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-06, GNTbm-11, GNTbm-38, GNTbm-39 및 키다미드(양성 대조군으로서)로 처리된 세포에서 히스톤 H3의 아세틸화 수준의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한다: SW48 세포에서 아세틸 히스톤 H3, β-액틴의 대표적인 면역블롯 분석. 세포는 지시된 농도의 화합물로 24시간 동안 처리되었다. 대조군 세포는 비히클과 함께 인큐베이션되었다. (a) 지시된 바와 같이 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-11 및 키다미드로 처리된 SW48 세포의 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분해된 후, 히스톤 H3 아세틸화에 대한 항체(AcH3)로 검출한 후 웨스턴 블롯팅 및 면역염색되었다. (b) 지시된 바와 같이 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-06 및 키다미드로 처리된 SW48 세포의 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분해된 후, 히스톤 H3 아세틸화에 대한 항체(AcH3)로 검출한 후 웨스턴 블롯팅 및 면역염색되었다. (c) 지시된 바와 같이 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-38, GNTbm-39 및 키다미드로 처리된 SW48 세포의 추출물은 SDS-PAGE에 의해 분해한 후, 히스톤 H3 아세틸화(AcH3)에 대한 항체로 검출한 후 웨스턴 블롯팅 및 면역염색하였다. 이러한 모든 데이터는 배수 변화로 나타낸, β-액틴으로 정규화된 AcH3 단백질 발현 수준의 정량화를 나타내었다.
도 13은 CT26 종양-보유 마우스에서 항-PD-1 항체와 조합된 다양한 용량의 GNTbm-02 + 셀레콕시브의 치료 반응의 평가로부터의 결과를 도시한다: CT26 종양을 갖는 BALB/c 마우스는 지시된 바와 같은 다양한 치료 방식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 mg/kg); 셀레콕시브(50 mg/kg); GNTbm-02(12.5, 25 mg/kg). 총 종양 부피(a) 및 (b), 개별 종양 부피(c), 마우스 체중(d), 및 생존율(e)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 지시된 바와 같이 처리되고, 종양 이식 후 종양 부피가 3000 ㎣에 도달했을 때 안락사되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제공되며; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 투키(Tukey)의 검정에 의한 일원 ANOVA. 게한-브레슬로우-윌콕손(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 시험(e). *, IgG 대조군과 비교. #, PD-1 그룹과 비교.
도 14는 CT26 종양-보유 마우스에서 GNTbm 화합물 시리즈의 조합 요법 반응의 평가를 도시한다. CT26 종양을 갖는 BALB/c 마우스는 지시된 바와 같이 다양한 치료 방식으로 치료되었다. IgG, 항-IgG 대조군(2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 mg/kg); 키다미드(50 mg/kg); 셀레콕시브(50 mg/kg); GNTbm-02(5, 10, 20, 25, 50 mg/kg); GNTbm-03(50 mg/kg); GNTbm-04(50 mg/kg); GNTbm-06(50 mg/kg); 레고라페닙(30 mg/kg). 총 종양 부피(a), (b), (f), (j), (n), (r), 개별 종양 부피(c), (g), (k), (o), (s), 마우스 체중(d), (h), (l), (p), (t), 및 생존율(e), (i), (m), (q), (u)이 기록되었다. CT26 종양 보유 마우스는 지시된 바와 같이 처리되고, 종양 이식 후 종양 부피가 3000 ㎣에 도달했을 때 안락사되었다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제공되며; 투키의 검정을 이용한 일원 ANOVA(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 대 항-IgG 대조군). 게한-브레슬로우-윌콕손 시험(e).
도 15는 다양한 치료 방식으로 치료된 CT26 종양을 갖는 BALB/c 누드 마우스로부터의 치료 결과를 도시한다: 항-IgG 대조군(2.5 mg/kg); 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 mg/kg); 셀레콕시브(50 mg/kg); GNTbm-02(10 mg/kg). (a) CT26 종양 및 상이한 치료 그룹의 피하 주사 도식(그룹당 n = 6마리 마우스). (b) 총 종양 부피. (c) 종양 부피 배수 변화. (d) 마우스 체중. (e) 개별 종양 부피. CT26 종양 보유 누드 마우스를 지시된 바와 같이 처리되고, 종양 이식 후 종양 부피가 3000 ㎣에 도달할 때 안락사되었다.
도 16은 HDAC3의 효소 활성을 억제하는 GNTbm-02의 효과를 도시한다: (a) 2 μM의 GNTbm-02, 키다미드 또는 엔티노스타트를 HDAC3 효소(검정 완충제 포함)와 함께 20분, 40분 및 60분 동안 인큐베이션한 후 평가가 수행되었다. GNTbm-02는 HDAC3과 결합하고 엔티노스타트보다 더 강하게 HDAC3을 억제하는 것으로 나타났다. (b) 2 μM의 GNTbm-02, GNTbm-03 또는 GNTbm-01을 HDAC3 효소(검정 완충제 포함)와 함께 20분, 40분 및 60분 동안 인큐베이션한 후 평가가 수행되었다. GNTbm-02는 HDAC3과 결합하고 GNTbm-03 및 GNTbm-01보다 더 강하게 HDAC3을 억제하는 것으로 나타났다.
도 17은 CT26-보유 모델에서 GNTbm-02(10 mg/kg) + 셀레콕시브(50 mg/kg)가 단핵 세포 및 T 세포 반응을 조절함을 도시한다: CT26 종양을 갖는 BALB/c 마우스는 지시된 치료 방식으로 처리된 후, FACS 분석으로 수행되어 순환 면역 세포를 평가하였다. 평균 및 SD가 표시되며, P 값이 표시된다. 혈액 샘플은 CT26-보유 마우스에서 처리 후 16일에 단리되었다. (a) 순환 림프구 세포에 대한 FACS 결과. (b) 순환 단핵구 세포에 대한 FACS 결과. (c) 순환 과립구 세포에 대한 FACS 결과. (d) 순환 CD3+ T 세포에 대한 FACS 결과. (e) 순환 CD4+ T 세포에 대한 FACS 결과. (f) 순환 CD8+ T 세포에 대한 FACS 결과. (g) 순환 Treg 세포에 대한 FACS 결과. (h) 순환 CD11b+ 세포에 대한 FACS 결과. (i) 순환 M-MDSC(CD11b+Ly6C+) 세포에 대한 FACS 결과. (j) 순환 CD11b+Ly6G+Ly6C+ 세포에 대한 FACS 결과. (k) 순환 PMN-MDSC(CD11b+Ly6G+ Ly6C-) 세포에 대한 FACS 결과. 평균 ± SD는 그룹당 n = 8 내지 12마리의 마우스에 대해 표시된다. 일원 ANOVA 및 던네트 다중 비교 시험(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 대 IgG 대조군).
정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지며, 용어는 본 개시를 기술함에 있어서 이들의 사용과 관련하여 적용된다. 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이고, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
값의 범위가 제공되는 경우, 하한 단위의 1/10에 대한 각 중간 값이, 문맥에서 명백히 달리 지시하지 않는 한(예를 들어, 범위 내에 속하는 각각의 탄소 원자 번호가 제공되는 수의 탄소 원자를 함유한 그룹의 경우에), 그러한 범위의 상한과 하한 사이에 있으며, 그러한 기술된 범위에서 임의의 다른 기술된 또는 중간 값이 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 기술된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 본 발명 내에 포함된다. 기술된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태("a" 및 "an")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는, 문법적 대상 중 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 사용된다. 일 예로서, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 그렇게 결합된 요소, 즉, 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소의 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 나열된 다수의 요소들은 동일한 방식으로, 즉, 그렇게 결합된 요소들 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든 상관없이, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "할로" 및 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 지칭한다.
용어 "알킬"은 1 내지 15개의 탄소 원자를 갖는, 탄소 및 수소 원자로만 구성되고, 불포화를 함유하지 않는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼(예를 들어, C1-C15 알킬)을 지칭한다. 특정 구현예에서, 알킬은 1 내지 13개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C1-C13 알킬). 특정 구현예에서, 알킬은 1 내지 8개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C1-C8 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 1 내지 5개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C1-C5 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C1-C4 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C1-C3 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 1 내지 2개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C1-C2 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 하나의 탄소 원자(예를 들어, C1 알킬)를 포함한다. 다른 구현예에서, 알킬은 5 내지 15개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C5-C15 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 5 내지 8개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C5-C8 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 2 내지 5개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C2-C5 알킬). 다른 구현예에서, 알킬은 3 내지 5개의 탄소 원자를 포함한다(예를 들어, C3-C5 알킬). 다른 구현예에서, 알킬 기는 메틸, 에틸, 1-프로필(n-프로필), 1-메틸에틸(이소-프로필), 1-부틸(n-부틸), 1-메틸프로필(2차-부틸), 2-메틸프로필(이소-부틸), 1,1-디메틸에틸(3차-부틸), 1-펜틸(n-펜틸)로부터 선택된다. 알킬은 단일 결합에 의해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬 기는 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환된다. 본원에서 사용되는 용어 "알케닐"은 특정 구현예에서, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 2 내지 6개, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소 모이어티로부터 유도된 1가 기를 나타낸다. 이중 결합은 다른 기에 대한 부착 지점일 수 있거나 아닐 수 있다. 알케닐 기는, 예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일, 헵테닐, 옥테닐 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "알콕시"는 화학식 -O-알킬의 산소 원자를 통해 결합된 라디칼을 지칭하며, 여기서 알킬은 상기 정의된 바와 같은 알킬 사슬이다.
용어 "알케닐"은 탄소 및 수소 원자로만 구성되고, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하고, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼 기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 알케닐은 2 내지 8개의 탄소 원자를 포함한다. 다른 구현예에서, 알케닐은 2 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 알케닐은 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되고, 예를 들어, 에테닐(즉, 비닐), 프로프-1-에닐(즉, 알릴), 부트-1-에닐, 펜트-1-에닐, 펜타-1,4-디에닐 등을 이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알케닐 기는 하나 이상의 치환체에 의해 선택적으로 치환된다.
본원에서 사용되는 용어 "사이클로알킬"은 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 포화 또는 부분 불포화 카보사이클릭 고리 화합물로부터 유도된 1가 기를 나타낸다. C3-C8-사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로펜틸 및 사이클로옥틸을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴"은 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 인데닐 등을 포함하는, 융합되거나 비-융합된, 하나 이상의 방향족 고리를 갖는 모노- 또는 폴리-사이클릭 카보사이클릭 고리 시스템을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 고리 원자 중 하나가 S, O 및 N으로부터 선택되고; 0, 1 또는 2개의 고리 원자가 S, O 및 N으로부터 독립적으로 선택된 추가적인 헤테로원자이고; 나머지 고리 원자가 탄소인 5 내지 10개의 고리 원자를 갖는 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 모노- 또는 폴리-사이클릭(예를 들어, 바이- 또는 트리-사이클릭 또는 그 이상) 융합된 또는 비-융합된, 라디칼 또는 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로아릴은 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클로알킬"은 비-방향족 3원, 4원, 5원, 6원 또는 7원 고리 또는 바이- 또는 트리-사이클릭 기 융합 또는 비-융합 시스템을 지칭하며, 여기서, (i) 적어도 하나의 고리는 산소, 황 및 질소로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하며, (ii) 각각의 5원 고리는 0 내지 1개의 이중 결합을 가지며, 각각의 6원 고리는 0 내지 2개의 이중 결합을 가지며, (iii) 질소 및 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있으며, (iv) 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화될 수 있으며, (iv) 상기 고리 중 임의의 고리는 벤젠 고리에 융합될 수 있다. 대표적인 헤테로사이클로알킬 기는 [1,3]디옥솔란, 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐 및 테트라하이드로푸릴을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 무기 염기 또는 유기 염기 및 무기 산 또는 유기 산을 포함하는 약학적으로 허용되는 비독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 지칭한다. 용어 "약학적으로 허용되는 염" 내에 포함되는 염기성 화합물의 염은 일반적으로 유리 염기를 적합한 유기 산 또는 무기 산과 반응시킴으로써 제조되는 본 발명의 화합물의 비-독성 염을 지칭한다. 본 개시의 염기성 화합물의 대표적인 염은 하기를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 아세테이트, 아스코르베이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스피레이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 바이설페이트, 바이타르트레이트, 보레이트, 브로마이드, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 클라불라네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄 프로피오네이트, 디에틸아세트산, 디글루코네이트, 디하이드로클로라이드, 도데실설파네이트, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코헵타노에이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리세로포스페이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 헥실레소르시네이트, 하이드라바메이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 하이드록시나프토에이트, 하이드로아이오다이드, 아이오다이드, 이소니코티네이트, 이소티오네이트, 락테이트, 락토비오네이트, 라우레이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸니트레이트, 메틸설페이트, 메틸설포네이트, 무케이트, 2-나프탈렌설포네이트, 납실레이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 파모에이트(엠보네이트), 팔미테이트, 판토테네이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 포스페이트/디포스페이트, 피멜레이트, 페닐프로파노에이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 설페이트, 서브아세테이트, 숙시네이트, 타네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 트리에티오다이드, 트리플루오로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 우테코네이트, 발레레이트, 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 화합물이 산성 모이어티를 갖는 경우, 이의 적합한 약학적으로 허용되는 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 구리, 제2철, 제1철, 리튬, 마그네슘, 망가닉(manganic), 망가모우스(mangamous), 칼륨, 나트륨, 아연 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 약학적으로 허용되는 유기 비-독성 염기로부터 유도된 염은 1차, 2차, 및 3차 아민, 사이클릭 아민, 디사이클로헥실 아민 및 염기성 이온-교환 수지, 예컨대, 아르기닌, 베타인, 카페인, 콜린, N,N-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 2-디에틸아미노에탄올, 2-디메틸아미노에탄올, 에탄올아민, 에틸아민, 에틸렌디아민, N-에틸모르폴린, N-에틸피페리딘, 글루카민, 글루코사민, 히스티딘, 하이드라바민, 이소프로필아민, 리신, 메틸글루카민, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 푸린, 테오브로민, 트리에틸아민, 트리메틸아민, 트리프로필아민, 트로메타민 등을 포함한다. 또한, 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드와 같은 저급 알킬 할라이드의 염; 디메틸, 디에틸, 디부틸과 같은 디알킬 설페이트; 및 디아밀 설페이트, 장쇄 할라이드, 예컨대, 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드, 벤질 및 펜에틸 브로마이드와 같은 아르알킬 할라이드 등을 포함한다.
용어 "대상체"는 인간, 원숭이, 소, 양, 말, 돼지, 소, 염소, 개, 고양이, 마우스, 래트, 배양된 세포, 및 이들의 트랜스제닉 종과 같은 살아있는 유기체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "투여하는"은 본 발명의 활성 성분이 이들의 의도된 기능을 수행하도록 하는 투여 경로를 포함한다.
용어 "치료하다" 또는 "치료"는 질환 또는 병태의 효과를 감소시키는 방법을 지칭한다. 치료는 또한 단지 증상보다는 질환 또는 병태 자체의 근본 원인을 감소시키는 방법을 지칭할 수 있다. 치료는 천연 수준으로부터의 임의의 감소일 수 있고, 질환, 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 완전한 절제일 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
용어 "예방하다", "예방" 또는 "예방하는"은 표적 질환과 관련된 증상의 억제 또는 회피를 의미한다.
어구 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로, 원하는 치료 효과를 발생시키는 데 효과적인 본 개시의 화합물, 물질, 또는 화합물을 포함하는 조성물의 양을 지칭한다.
클래스 I HDAC 억제제 화합물
히스톤 데아세틸라제 억제제와 같은 암에 대한 후성적 요법은 항원 프로세싱 및 제시 기구의 상향조절에 의해 항종양 면역을 자극할 수 있다. 후성적 변형은 종양의 개시 및 진행을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. 후성적 조절은 주로 유전자 발현에 영향을 미치는 두 가지 주요 메커니즘을 통해 달성된다: DNA에 대한 메틸 기의 첨가/제거에 의해 발생하는 DNA 메틸화/탈메틸화, 및 DNA에 의해 감싸진 히스톤 단백질에 대한 아세틸 기의 효소적 첨가/제거에 의해 발생하는 히스톤 아세틸화/탈아세틸화. 히스톤 데아세틸라제 억제제(HDACis)는 신약 개발을 위한 유망한 표적으로 여겨져 왔다. HDAC가 암에서 중요한 역할을 하는 기본적인 메커니즘은 세포 주기, 분화, 아폽토시스, DNA-손상 반응, 혈관형성, 전이 및 다른 세포 과정의 조절에 관여하는, 히스톤 또는 비-히스톤 단백질에서 아세틸화 정도의 제어에 의한 것이다.
클래스 I HDAC는 주로 핵에 위치하고, 인간 조직에서 편재적으로 발현되고, 세포 증식, 분화, 및 세포 주기 진행을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. 클래스 I HDAC는 특정 암에서 고도로 발현되었다. 예를 들어, HDAC1은 전립선암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 및 식도암에서 고도로 발현되며; HDAC2는 위, 자궁경부, 및 결장직장 악성종양에서 높게 발현되었으며; HDAC3은 결장암 및 유방암에서 고도로 발현되었다. HDAC의 제어되지 않은 발현은 세포 성장을 억제하는 많은 유전자의 침묵을 야기할 것이고, 따라서 세포 성장의 모니터링 손실 및 세포 분화의 제어, 세포 주기 정지 및 아폽토시스를 야기할 것이다. HDAC 과발현의 조절장애는 종양 악성종양 및 불량한 예후와 유의한 상관관계가 있었다. 많은 클래스 I HDAC 억제제는 후성적 면역조절 특성을 갖는다.
TME에서 HDAC 억제제에 의한 면역조절의 메커니즘은 가용성 인자 및 면역 세포 둘 모두의 성분을 포함하는 것으로 보고되었다. 특정 HDAC 아이소형을 억제함으로써 HDAC 억제제의 후성적 조절을 통한 다양한 유전자 및 단백질의 발현은 TME의 상태가 결과로서 암 세포의 사멸에 유리한 방식으로 전환되는 방식으로 변화된다. 이전에 공개된 연구로부터, 일부 HDAC 억제제는 사이토카인/케모카인, 항원-제시 세포의 분비를 제어하고, Treg의 수 또는 기능을 감소시키고, NK 세포의 활성화를 촉발할 면역조절 특성을 갖는다는 것이 입증되었다. 다른 연구는 암 항원의 발현을 향상시키고, MDSC와 같은 면역억제 세포의 활성을 조절하는 메커니즘을 보여주었다. 선택적 클래스 I HDAC 억제제는 암 세포에서 PD-L1 및 MHC I 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 클래스 I HDAC 억제제는 종양 미세환경을 침윤하는 골수-유래 억제자 세포(MDSC)를 하향조절한다.
일 양태에서, 본 개시는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00003
[상기 식에서, W 및 Y는 각각 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되며;
R1은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C3 알킬 및 할로겐화된 C1-C3 알킬로부터 선택되고, 일치환, 이치환, 삼치환 또는 사치환일 수 있으며;
C1 및 C2는 단일 결합 또는 이중 결합에 의해 연결된 C 원자이며;
Ar은 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택되며:
Figure pct00004
여기서, Ar은 실선을 통해 C2에 연결되며;
R2는 R1에 대해 기재된 것과 동일한 의미를 가지며;
R3은 수소 또는 C1-C3 알킬임].
일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (Ia), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물을 갖는다:
[화학식 Ia]
Figure pct00005
[상기 식에서, W, Y, R1, C1, C2 및 Ar은 기재된 것과 동일한 의미를 가짐].
일 구현예에서, Ar은 6원 고리로부터 선택된다. 일 구현예에서, R2 및 C2에 연결된 Ar의 원자는 파라-위치에 있다.
일 구현예에서, Ar은 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택된다:
Figure pct00006
일 구현예에서, W 및 Y는 하기 조합으로부터 선택된다: (1) W는 N이고 Y는 CH이며, (2) W는 CH이고 Y는 N이며, (3) W 및 Y는 CH임. 바람직한 구현예에서, W는 N 또는 CH이며, Y는 CH이다.
일 구현예에서, R1은 F 또는 플루오로화된 C1-C3 알킬이다. 일 구현예에서, 플루오로화된 C1-C3 알킬은 CF3이다.
일 구현예에서, R1은 수소이다.
일 구현예에서, C1 및 C2는 이중 결합에 의해 연결된 C 원자이다. 또 다른 구현예에서, C1 및 C2는 단일 결합에 의해 연결된 C 원자이다.
일 구현예에서, R2는 C1-C3 알킬 또는 플루오르화된 C1-C3 알킬이다. 일 구현예에서, C1-C3 알킬은 CH3이다. 일 구현예에서, 플루오로화된 C1-C3 알킬은 CF3이다.
일 구현예에서, R2는 수소이다.
일 구현예에서, Ar은
Figure pct00007
이며, R2 및 C2에 연결된 Ar의 원자는 파라-위치에 있으며, C1 및 C2는 이중 결합에 의해 연결된 C 원자이다.
일 구현예에서, Ar은
Figure pct00008
이며, R2 및 C2에 연결된 Ar의 원자는 파라-위치에 있으며, R1은 수소 또는 F이다.
일 구현예에서, Ar은
Figure pct00009
이며, R2 및 C2에 연결된 Ar의 원자는 파라-위치에 있으며, R2는 수소 또는 CH3이다.
일 구현예에서, R1은 수소 또는 F이며, R2는 수소 또는 CH3이다.
일 구현예에서, R1은 수소 또는 F이며, R2는 수소 또는 CH3이며, C1 및 C2는 이중 결합에 의해 연결된 C 원자이다.
일 구현예에서, Ar은
Figure pct00010
이며, R2 및 C2에 연결된 Ar의 원자는 파라-위치에 있으며, R1은 수소 또는 F이며, R2는 수소 또는 CH3이며, C1 및 C2는 이중 결합에 의해 연결된 C 원자이다.
일 구현예에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물일 수 있다:
Figure pct00011
Figure pct00012
본 개시는 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체이성질체 형태를 포함한다. 화학식 (I)의 화합물에 존재하는 비대칭 중심은 모두 서로 독립적으로 (R) 배위 또는 (S) 배위를 가질 수 있다. 키랄 탄소에 대한 결합이 본 발명의 구조식에서 직선으로 도시될 때, (R) 및 (S) 둘 모두는 키랄 탄소의 배위이며, 따라서 거울상이성질체 및 이들의 혼합물 둘 모두는 화학식 내에 포함되는 것으로 이해된다. 특정 배위가 도시될 때, 그러한 거울상이성질체(그러한 중심에서 (R) 또는 (S))가 의도된다. 유사하게, 화합물 명칭이 키랄 탄소에 대한 키랄 지정 없이 언급될 때, (R) 및 (S) 둘 모두는 키랄 탄소의 배위이며, 따라서 개별 거울상이성질체 및 이들의 혼합물은 상기 명칭에 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명은 모든 가능한 거울상이성질체, 위치이성질체, 및 부분입체이성질체 및 모든 비율의 2개 이상의 입체이성질체의 혼합물, 예를 들어, 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체의 혼합물을 포함한다. 따라서, 거울상이성질체는 라세미체의 형태 및 모든 비율의 두 거울상이성질체의 혼합물 형태의 좌선성 및 우선성 거울상체 둘 모두로서 거울상이성질체적으로 순수한 형태의 본 발명의 대상이다. 시스/트랜스 이성질체의 경우, 본 발명은 시스 형태 및 트랜스 형태 둘 모두뿐만 아니라 모든 비율의 이러한 형태의 혼합물을 포함한다. 개별 입체이성질체의 제조는, 요망되는 경우, 통상적인 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 또는 결정화에 의한 혼합물의 분리, 합성을 위한 입체화학적으로 균일한 출발 물질의 사용 또는 입체선택적 합성에 의해 수행될 수 있다. 선택적으로, 유도체화는 입체이성질체의 분리 전에 수행될 수 있다. 입체이성질체의 혼합물의 분리는 화학식 (I)의 화합물의 합성 동안 중간 단계에서 수행될 수 있거나, 최종 라세미 생성물에 대해 수행될 수 있다. 절대 입체화학은 필요한 경우 공지된 배위의 입체 중심을 함유하는 시약으로 유도체화된 결정질 생성물 또는 결정질 중간체의 X-선 결정학에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물이 호변이성질체화될 수 있는 경우, 모든 개별 호변이성질체 뿐만 아니라 이들의 혼합물이 본 발명의 범위에 포함된다. 본 개시는 이러한 모든 이성질체뿐만 아니라 이러한 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 호변이성질체 및 이들의 혼합물의 염, 용매화물(수화물 포함) 및 용매화된 염을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 이러한 공정, 반응식 및 실시예에서 사용되는 기호 및 관례는, 특정 약어가 구체적으로 정의되는 지의 여부와 상관없이, 예를 들어, 현대 과학 문헌, 예를 들어, Journal of the American Chemical Society 또는 Journal of Biological Chemistry에서 사용되는 것들과 일치한다. 구체적으로, 비제한적으로, 하기 약어가 실시예 및 명세서 전반에 걸쳐 사용될 수 있다: g(그램); mg(밀리그램); mL(밀리리터); ㎕(마이크로리터); mM(밀리몰); M(마이크로몰); Hz(헤르츠); MHz(메가 헤르츠); mmol(밀리몰); hr 또는 hrs(시); min(분); MS(질량 분석법); ESI(전자분무 이온화); TLC(박층 크로마토그래피); 및 HPLC(고압 액체 크로마토그래피). 하기 모든 실시예에 대해, 당업자에게 공지된 표준 후처리 및 정제 방법이 이용될 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 온도는 ℃(섭씨도)로 표현된다. 모든 반응은 달리 언급되지 않는 한 실온에서 수행된다. 본원에 예시된 합성 방법은 특정 예의 사용을 통해 적용 가능한 화학을 예시하기 위한 것이며, 본 개시의 범위를 나타내는 것은 아니다.
본 개시의 화학식 (I)의 화합물은 일반적인 화학적 합성 절차에 따라 제조된다. 예시적인 합성 경로는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00013
[상기 식에서, RA는
Figure pct00014
모이어티에 해당하며, RB는 화학식 (I)에서의 모이어티에 해당함].
이러한 경로에서, N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 및 디클로로메탄(DCM)은 조건 a에서 사용될 수 있으며, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC), 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF)는 조건 b에서 사용될 수 있다.
공정에 대한 다른 적절한 변형, 예를 들어, 합성 동안 특정 반응 조건에 민감한 기에 적합한 보호/탈보호제 사용, 후속 반응을 위한 중간체의 단리 및 정제, 적절한 용매 선택 등이 또한 필요를 기초로 하여 당업자에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 상기 도시된 경로에서 화합물(β)의 -OH 기는 화합물(α)와 반응하기 전에 보호될 수 있으며, 생성된 생성물은 탈보호되어 화합물(γ) 등을 제공할 수 있다.
약학적 조성물/조합물
또 다른 양태에서, 본 발명은 화학식 (I) 중 어느 하나의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물/조합물을 제공한다.
약학적 조성물/조합물은 하나 이상의 제2 작용제를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 제2 작용제는 면역 체크포인트 억제제, NSAID, 티로신 키나제 억제제(TKI) 또는 항암제이다. 추가 구현예에서, 약학적 조성물/조합물은 본원에 기재된 화합물 및 면역 체크포인트 억제제 및/또는 NSAID 또는 선택적으로 티로신 키나제 억제제(TKI)를 포함한다.
일 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 암 세포에 대한 면역 시스템을 자극하고 암을 치료하기 위해 본원에 기재된 약학적 조합물과 조합하여 사용될 수 있다. 면역 체크포인트 억제제는 항-세포독성 T-림프구 항원-4(CTLA-4) 항체 또는 작용제, 항-프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 항체 또는 작용제, 항-프로그램된 사멸-리간드 1(PD-L1) 항체 또는 작용제, 항-T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3(TIM-3) 항체 또는 작용제, 항-B- 및 T-림프구 약독화제(BTLA) 항체 또는 작용제, 항-V-도메인 Ig 함유 T-세포 활성화 억제제(VISTA) 항체 또는 작용제, 항-림프구 활성화 유전자-3(LAG-3) 항체 또는 작용제, KIR(살해-세포 면역글로불린-유사 수용체) 억제제 또는 항체, A2AR(아데노신 A2A 수용체) 억제제 또는 항체, CD276 억제제 또는 항체, 또는 VTCN1 억제제 또는 항체이다. 보다 바람직하게는, 면역 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙, 람브롤리주맙, 피딜리주맙, 니볼루맙, 더발루맙, 아벨루맙, 또는 아테졸리주맙이다. PD-1 또는 PD-L1 억제제의 예는 비제한적으로, 인간 PD-1을 차단하는 인간화 항체, 예컨대, 람브롤리주맙(항-PD-1 Ab, 상품명 keytruda) 또는 피딜리주맙(항-PD-1 Ab), 바벤시오(Bavencio)(항-PD-L1 Ab, 아벨루맙), 임핀지(항-PD-L1 Ab, 더발루맙), 및 티센트릭(항-PD-L1 Ab, 아테졸리주맙)뿐만 아니라 완전 인간 항체, 예컨대, 니볼루맙(항-PD-1 Ab, 상품명 Opdivo) 및 세미플리맙-rwlc(항-PD-1 Ab, 상품명 Libtayo)를 포함한다. 다른 PD-1 억제제는 B7-DC-Ig 또는 AMP-244로도 알려진 PD-L2 Fc 융합 단백질 및 치료에 사용하기 위해 현재 연구 및/또는 개발 중인 다른 PD-1 억제제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 가용성 PD-1 리간드의 제시를 포함할 수 있다. 또한, 면역 체크포인트 억제제는 PD-L1을 차단하는 인간화 또는 완전 인간 항체, 예컨대, 더발루맙 및 MIH1(항-CD274(PD-L1, B7-H1) 모노클로날 항체) 및 현재 조사 하에 있는 다른 PD-L1 억제제를 포함할 수 있다.
NSAID는 통증을 감소시키고, 열을 감소시키고, 고용량에서 염증을 감소시키는 약물 부류이다. 대부분의 NSAID는 사이클로옥시게나제-1(COX-1) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 활성, 및 이에 의해 트롬복산 및 프로스타글란딘의 합성을 억제한다. COX-2를 억제하면 항염증, 진통 및 해열 효과가 발생하는 반면, COX-1을 억제하는 NSAID, 특히 아스피린은 고용량에서 위장 출혈 및 궤양을 유발할 수 있는 것으로 생각된다. COX-2 억제제는 자가면역 및 염증성 질환을 치료하는데 널리 사용된다. 2개의 아이소형, COX-1 및 COX-2를 갖는 사이클로옥시게나제(COX)는 프로스타글란딘 D2(PGD2), PGE2, PGF2α, 프로스타사이클린 PGI2 및 트롬복산 TXA2로 구성된 프로스타노이드의 생물활성 지질의 합성에서 속도-결정 단계를 담당하는 효소이다. COX-1은 항상성 프로스타노이드를 유지하기 위해 신체 조직에서 구성적으로 발현되고, 혈관형성, 혈관확장, 및 조직 유지와 같은 여러 생물학적 기능에 관여한다. 그러나, COX-2는 정상 조건에서 낮은 수준으로 발현된다. COX-2는 감염, 손상 및 통증과 같은 자극에 의해 빠르게 유도되어 전염증성 과정을 개시한다. 선택적 COX-2 억제제는 비스테로이드 항염증 약물(NSAID)의 한 타입이다. 일부 구현예에서, NSAID는 아스피린, 이부프로펜, 인도메타신, 나프록센 및 COX-2 억제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 개시의 일부 구현예에서, NSAID는 COX2 억제제이다. 일부 구현예에서, COX2 억제제는 셀레브렉스(Celebrex)(일반명은 셀레콕시브), 로페콕십(Rofecoxib), 임레콕십(Imrecoxib) 및 에토리콕십(Etoricoxib)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, COX2 억제제는 셀레콕시브이다.
티로신 키나제 억제제(TKI)는 세포질 또는 수용체 티로신 키나제를 억제하는 활성을 갖는 소분자 패밀리이다. TKI는 다양한 메커니즘에 의해 이러한 성장 인자 신호전달 경로를 억제한다. 이들은 ATP, 기질과, 또는 다이머화 부위에 대해 경쟁하고, 또한 알로스테릭하게 작용할 수 있다. 세포질 또는 수용체 티로신 키나제의 억제는, 예컨대, 티로신 키나제에 대한 ATP 결합에 대한 직접적인 경쟁, 티로신 키나제의 알로스테릭 억제, 및 수용체 티로신 키나제에 대한 리간드 결합의 억제를 통해 여러 상이한 부류의 TKI에 의해 입증되었다. TKI는 특히 악시티닙, 렌바티닙, 카보잔티닙 및 레고라페닙과 같은 VEGFR 억제제는 암을 치료하는 데 점점 더 중요한 역할을 하고 있다. 본 개시의 일부 구현예에서, TKI는 수용체 티로신 키나제의 억제제이다. 바람직하게는, TKI는 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)의 억제제이다. 보다 바람직하게는, TKI는 카보잔티닙, 레고라페닙, 악시티닙, 아파티닙, 니네테다닙, 크리조티닙, 알렉티닙, 트라메티닙, 다브라페닙, 수니티닙, 룩소리티닙, 베무라페닙, 소라페닙, 포나티닙, 엔코라페닙, 브리가티닙, 파조파닙, 다사티닙, 이마티닙, 렌바티닙, 반데타닙, 수루파티닙 또는 시트라바티닙이다.
추가적인 항암제는 본원에 기술되거나 당 분야에 공지된 임의의 항암제이다. 일 구현예에서, 추가적인 항암제는 화학요법 또는 백금-기반 더블렛 화학요법이다. 특정 구현예에서, 추가적인 항암제는 티로신 키나제 억제제(TKI)이다. 일 구현예에서, 추가적인 항암제는 항-VEGF 또는 항-VEGFR 항체 또는 화합물이다. 다른 구현예에서, 항암제는 백금 작용제(예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴), 유사분열 억제제(예를 들어, 파클리탁셀, 알부민-결합 파클리탁셀, 도세탁셀, 탁소테레, 도세카드), 플루오르화된 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈플루닌, 자블로르), 비노렐빈, 빈블라스틴, 에토포시드, 또는 페메트렉세드 젬시타빈이다. 일 구현예에서, 추가적인 항암제는 5-플루오로우라실(5-FU)이다. 특정 구현예에서, 추가적인 항암제는 당 분야에 공지된 임의의 다른 항암제이다.
본 발명의 약학적 조성물/조합물을 제조하기 위해, 활성 성분으로서 본 개시의 하나 이상의 화합물은 통상적인 약학적 배합 기술에 따라 약학적 담체와 완전히 혼합되며, 상기 담체는 투여, 예를 들어, 경구 또는 비경구, 예컨대 근육내 투여에 요망되는 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 경구 투여 형태로 조성물을 제조함에 있어서, 임의의 통상적인 약학적 매질 중 임의의 매질이 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 현탁액, 엘릭시르 및 용액과 같은 액체 경구 제제의 경우, 적합한 담체 및 첨가제는 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향미제, 보존제, 착색제 등을 포함하며; 예를 들어, 분말, 캡슐, 캐플릿, 겔 캡 및 정제와 같은 고체 경구 제제의 경우, 적합한 담체 및 첨가제는 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 포함한다. 이들의 투여 용이성으로 인해, 정제 및 캡슐은 가장 유리한 경구 투여 단위 형태를 나타내며, 이러한 경우 고체 약학적 담체가 명백히 사용된다. 원하는 경우, 정제는 표준 기술에 의해 당-코팅되거나 장용-코팅될 수 있다. 비경구의 경우, 담체는 일반적으로 멸균수를 포함할 것이지만, 예를 들어, 용해도를 보조하거나 보존을 위한 목적으로 다른 구성성분들이 포함될 수 있다. 주사 가능한 현탁액이 또한 제조될 수 있으며, 이러한 경우, 적절한 액체 담체, 현탁제 등이 사용될 수 있다. 본원의 약학적 조성물은 투여 단위, 예를 들어, 정제, 캡슐, 분말, 주사제, 티스푼풀 등 당 상기 기재된 바와 같은 유효 용량을 전달하는 데 필요한 양의 활성 성분을 함유할 것이다.
경구 또는 주사에 의한 투여를 위해 본 개시의 신규한 조성물이 도입될 수 있는 액체 형태는 수용액, 적합하게 향미된 시럽, 수성 또는 오일 현탁액, 및 면실유, 참기름, 코코넛 오일 또는 땅콩 오일과 같은 식용 오일을 갖는 향미 에멀젼뿐만 아니라 엘릭시르 및 유사한 약학적 비히클을 포함한다. 수성 현탁액에 적합한 분산제 또는 현탁제는 합성 및 천연 검, 예컨대, 트래거캔스, 아카시아, 알기네이트, 덱스트란, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리비닐-피롤리돈 또는 젤라틴을 포함한다.
경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 일반적으로 단위 용량 형태로 제공되고, 결합제, 충전제(셀룰로스, 만니톨, 락토스 포함), 희석제, 정제화제, 윤활제(마그네슘 스테아레이트 포함), 세제, 붕해제(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 및 전분 유도체, 예컨대, 소듐 글리콜레이트 전분), 착색제, 착향제, 및 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트)와 같은 통상적인 부형제를 함유한다.
경구 고체 조성물은 통상적인 블렌딩, 충전 또는 타정 방법에 의해 제조될 수 있다. 배합 작업은 다량의 충전제를 함유하는 조성물 전체에 활성 성분을 분포시키기 위해 반복될 수 있다. 이러한 작업은 통상적이다.
비경구 투여를 위해, 화합물 및 멸균 비히클을 함유하는 유체 단위 투여량이 제조될 수 있다. 화합물은 비히클 및 농도에 따라 현탁되거나 용해될 수 있다. 비경구 용액은 일반적으로 비히클에 화합물을 용해시키고, 여과에 의해 멸균하고, 적합한 바이알을 채우고, 밀봉함으로써 제조된다. 유리하게는, 국소 마취제, 보존제 및 완충제와 같은 애주번트가 또한 비히클에 용해될 수 있다. 안정성을 증가시키기 위해, 조성물은 바이알을 채우고 진공 하에 물을 제거한 후 동결될 수 있다. 비경구 현탁액은 화합물이 용해되는 대신 비히클에 현탁되고, 멸균 비히클에 현탁되기 전에 에틸렌 옥사이드에 노출됨으로써 멸균될 수 있다는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 방식으로 제조된다. 유리하게는, 계면활성제 또는 습윤제는 적용의 화합물의 균일한 분포를 용이하게 하기 위해 조성물에 포함될 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위한 약학적 제제는 취입기 또는 분무기 가압 팩으로부터 전달될 수 있다.
치료적 적용
또 다른 양태에서, 본 개시는 유효량의 본원에 기재된 화합물 또는 약학적 조성물/조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, TME의 후성적 면역조절을 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 클래스 I HDAC와 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 본원에 기술된 화합물 또는 약학적 조성물/조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 방법은 하나 이상의 제2 작용제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 작용제는 면역 체크포인트 억제제, NSAID, TKI 또는 항암제이다. 추가 구현예에서, 약학적 조성물/조합물은 본원에 기재된 화합물 및 면역 체크포인트 억제제 및/또는 NSAID 또는 선택적으로 TKI를 포함한다. 면역 체크포인트 억제제, NSAID, TKI 또는 항암제의 구현예는 본원에 기재된 것들이다.
본 발명의 화합물은 클래스 I HDAC의 억제가 요망되는 임의의 질환 및/또는 병태를 치료 또는 예방하는 데 유용하다. 특히, 본 발명의 화합물은 TME의 후성적 면역조절을 보유하여, 이에 의해 면역요법을 개선시킨다. HDAC 효소 활성의 억제는 종양 성장의 약화를 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명은 종양 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공한다.
본 교시에 따라 치료될 수 있는 암의 예는 침습성 유방 암종, 선암, 폐암(비-소세포, 편평 세포 암종, 선암, 및 대세포 폐암), 간암, 결장직장암, 뇌, 두경부암(예를 들어, 신경/교모세포종), 유방암, 난소암, 방광의 이행 세포 암종, 전립선암, 구강 편평 세포 암종, 골육종, 부신피질암, 결장직장암을 포함하는 위장 종양, 담도암, 예컨대, 담낭 암종(GBC), 방광암, 식도암, 위암, 자궁경부암, 타액선암, 설사 양성 신생물, 유관 상피내암종(ductal carcinoma in situ), 손발톱 주위염, 담관암종, 신장암, 췌장암, 수모세포종, 교모세포종, 내강, HER2-양성 및 삼중 음성 유방 종양, 혈액 악성종양 및 백혈병(급성 골수성 백혈병(AML), B-전구 세포 급성 림프모구 백혈병(ALL), T-세포 ALL의 분획, 및 만성 골수성 백혈병(CML)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 경구, 비강, 경피, 폐, 흡입, 협측, 설하, 복강내, 피하, 근육내, 정맥내, 직장, 흉막내, 척추강내 및 비경구 투여된다. 일 구현예에서, 화합물은 경구 투여된다. 당업자는 특정 투여 경로의 이점을 인지할 것이다.
화합물을 이용하는 투여 요법은 환자의 타입, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료될 병태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용되는 특정 화합물 또는 이의 염을 포함하는 다양한 인자에 따라 선택된다. 통상적으로 숙련된 의사 또는 수의사는 병태를 예방하거나, 대응하거나, 이의 진행을 저지하는데 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명은 이제 서면 설명에 의해 설명되었지만, 당업자는 본 발명이 다양일 구현예로 실시될 수 있으며 상기 설명 및 하기 실시예가 예시의 목적으로서, 하기 청구범위를 제한하는 것이 아님을 인지할 것이다.
실시예
본 발명의 예시된 화합물을 제조하는 물질 및 방법은 하기에 기재되어 있다.
GNTbm-01, GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-06, GNTbm-08, GNTbm-11, GNTbm-12, GNTbm-19, GNTbm-25, GNTbm-33, GNTbm-37, GNTbm-38, GNTbm-39, 엔티노스타트-API(Active Pharmaceutical Ingredient), 및 키다미드-API는 GNTbm[GNT Biotech & Medicals Co. Ltd (Taiwan)]에 의해 제공되었다. 셀레콕시브 캡슐 제품(Celebrex®, 200 mg)은 (Pfizer, 대만)로부터 구입하였다. 레고라페닙(HY-1031, 30 mg/kg, po 매일, MedChemExpress USA). 하기 항체 및 시약을 동물 실험에 사용하였다: 마우스 항-PD-1(CD279) 모노클로날 항체(RMP1-14; Bio X Cell), 및 래트 항-IgG2a 아이소형 모노클로날 항체(2A3; Bio X Cell). 전기분무 이온화 질량을 Bruker microTOF에서 기록하고, 전기분무 질량 스펙트럼(ESMS)을 Waters 질량 분광계를 사용하여 m/z 값으로 기록하였다. 모든 상업적 화학물질 및 용매는 시약 등급이었고 달리 언급되지 않는 한 추가 정제 없이 사용되었다. Merck 60 F254 실리카 겔 유리 백킹 플레이트(20 × 20 cm)를 사용하여 박층 크로마토그래피에 의해 모든 반응의 완료를 모니터링하였다. 생성된 크로마토그램의 시각화는 UV 조사(254 nm) 하에 시각적으로 검출되었다. 1H NMR 및 13C NMR을 Bruker AVANCE 400 MHz PLUS 및 Bruker AVANCE III HD 600 MHz 분광계 및 기기에서 기록하고, 화학적 이동을 백만 분율(ppm, δ)로 기록하였다. 다중도는 s(단일선), brs(광역 단일선), d(이중선), t(삼중선), q(사중선), dd(이중선의 이중선), td(이중선의 삼중선), 및 m(다중선)으로 기록된다. 커플링 상수(J)는 헤르츠로 표현된다. 40℃에서 작동하는 C18 컬럼(Waters XSelect HSS T3 5 ㎛, 4.6 mm × 250 mm)을 사용하여 Waters ACQUITY Arc 시스템으로 최종 화합물의 순도를 결정하였다. 이동상 A로서 0.1% 트리플루오로아세트산 및 이동상 B로서 메탄올을 함유하는 물을 사용하여 용리를 수행하였다. 용리 조건: 0분에, 상 A 90% + 상 B 10%; 6분에, 상 A 70% + 상 B 30%; 12분에, 상 A 50% + 상 B 50%; 18분에, 상 A 10% + 상 B 90%; 23분에, 상 A 90% + 상 B 10%. 이동상의 유량은 1 mL/분이었고, 샘플의 주입 부피는 10 ㎕이었고, 실행 시간은 30분이었다. 피크는 254 nm에서 검출되었다. 최종 화합물의 순도는 >90%인 것으로 밝혀졌다.
제조예
실시예 1 GNTbm-01
합성 경로는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00015
6-아미노피리딘-3-카복실산(1).
메틸 6-아미노피리딘-3-카복실레이트(1.2 g)의 용액에 MeOH 중 LiOH(3.309 g)를 첨가하고, 혼합물을 40 내지 65℃에서 4 내지 8시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 10% HCl(aq)로 산성 조건으로 조정하고, 흡입에 의해 여과하고, 생성물을 대략 24시간 동안 오븐에서 건조시켜 고체 생성물 화합물 1을 수득하였다.
2-(트리메틸실릴)에틸 6-아미노피리딘-3-카복실레이트(2).
THF 중 화합물 1(1.5 g) 및 트리페닐포스핀(2.848 g)의 용액에 -5 내지 10℃에서 2-(트리메틸실릴)에탄올(1.84 mL mmol) 및 디이소프로필 아조디카복실레이트(DIAD, 2.56 mL)를 첨가하였다. 그리고 혼합물을 실온에서 대략 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 2를 제공하였다.
2-(트리메틸실릴)에틸 6-(( E )-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)피리딘-3-카복실레이트(3).
DCM 중 DCC(86.9 mg)의 용액에 DCM 중 화합물 2(50 mg) 및 (E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔산(67.2 mg)을 빙욕에서 첨가하였다. 그리고 혼합물을 실온에서 대략 8시간 동안 교반하였다. 생성물을 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하고 유기층을 물로 세척하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 3을 제공하였다.
6-(( E )-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)피리딘-3-카복실산(4).
THF(11 mL) 중 화합물 3(50 mg)의 용액에 12 N HCl(11 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4 내지 10시간 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 4를 제공하였다.
6-(( E )-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피리딘-3-카복사미드(5).
DMF 중 4-플루오로벤젠-1,2-디아민(72.9 mg), EDC(89.7 mg), HOBt(46.8 mg)의 용액에 -10 내지 10℃에서 20 내지 60분 동안 교반하였다. DMF 및 Et3N(161 ㎕) 중 화합물 4(85.9 mg)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 대략 72시간 동안 교반하였다. 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 5를 제조하였다. [0001] 1H NMR (400 MHz, 아세톤-d6): δ2.46(3H, s), 3.52(2H, d), 4.95(2H, br), 6.39(1H, td), 6.59(3H, m), 7.21(1H, t), 7.77(1H, dd), 8.38(3H, m), 9.08(1H, s), 9.75(1H, s). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ23.77, 40.47, 101.16, 101.41, 101.80, 102.03, 123.05, 124.73, 125.54, 128.76, 128.86, 129.21, 129.56, 132.84, 136.68, 138.02, 145.71, 147.16, 148.12, 156.82, 163.76, 170.27; ESI-MS m/z: 428.1496[M+Na+].
실시예 2 GNTbm-02
합성 경로는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00016
5-(( E )-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)피리딘-2-카복실산(6).
DCM 중 (E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔산(769 mg) 및 DCC(895 mg)의 용액을 -10 내지 10℃에서 20 내지 60분 동안 교반하였다. DCM 중 6-아미노피리딘-3-카복실산(500 mg)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 대략 48시간 동안 교반하였다. 고체 분말의 수집을 위해 혼합물을 여과하였다. 고체 분말을 MeOH에 용해시키고, 여과하고, 회전 증발기에 의해 농축시켜 미정제 화합물 6을 제공하였다.
5-(( E )-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피리딘-2-카복사미드(7).
DMF 중 4-플루오로벤젠-1,2-디아민(42.4 mg) 및 EDC(52.2 mg, HOBt(26 mg))의 용액을 -10 내지 10℃에서 20 내지 60분 동안 교반하였다. DMF 중 5-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)피리딘-2-카복실산(화합물 6)(50 mg)을 첨가하고, 혼합물을 약 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 7을 제공하였다. 1H NMR (400 MHz, 아세톤-d6): δ2.46(3H, s), 3.45(2H, d), 4.90(1H, br), 6.45(1H, m), 6.55(2H, m), 6.66(1H, dd), 7.19(1H, d), 7.53(1H, dd), 7.76(1H, dd), 8.15(1H, d), 8.31(1H, dd), 8.47(1H, d), 8.91(1H, s), 9.66(1H, s), 9.72(1H, s). 13C NMR (100 MHz, MeOD-d): δ41.93, 104.06, 104.32, 105.16, 105.39, 124.08, 125.12, 125.94, 128.14, 128.41, 128.65, 130.93, 132.17, 135.42, 139.91, 141.19, 146.07, 147.83, 158.38, 165.26, 168.08, 172.56. ESI-MS m/z: 428.1479[M+Na+].
실시예 3 GNTbm-03
합성 경로는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00017
4-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)벤조산(8).
DCM 중 (E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔산(671.9 mg) 및 DCC(782.4 mg)의 용액을 -10 내지 10℃에서 20 내지 60분 동안 교반하였다. DCM 중 4-아미노벤조산(400 mg)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 5 내지 10시간 동안 교반하였다. 고체 분말의 수집을 위해 혼합물을 여과하였다. 고체 분말을 MeOH에 용해시키고, 여과하고, 회전 증발기에 의해 농축시켜 미정제 화합물 8을 생성하였다.
4-(( E )-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)벤즈아미드(9).
DMF 중 4-플루오로벤젠-1,2-디아민(255.4 mg), EDC(314.4 mg) 및 HOBt(164 mg)의 용액을 -10 내지 10℃에서 20 내지 60분 동안 교반하였다. DMF 중 4-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)벤조산(화합물 8)(300 mg)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 대략 24시간 동안 교반하였다. 시간 혼합물을 물로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 9를 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, 아세톤-d6): δ2.46(3H, s), 3.39(2H, d), 4.90(1H, br), 6.39(1H, td), 6.56(3H, m), 7.20(2H,m), 7.77(3H, m), 8.00(2H, m), 8.46(1H, s), 8.95(1H, s), 9.46(1H, s).13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ23.75, 40.77, 101.48, 102.55, 118.23, 119.42, 123.07, 124.98, 128.51, 128.62, 128.76, 128.90, 129.05, 129.59, 132.85, 141.97, 145.51, 147.14, 156.79, 159.82, 162.19, 165.03, 169.36. ESI-MS m/z: 405.1731[M+H+].
실시예 4 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-11, GNTbm-33, GNTbm-37, GNTbm-38, 및 GNTbm-39
합성 경로는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00018
에틸 ( E )-4-(피리딘-3-일)부트-3-에노에이트(11). n-헥산올(50 mL) 중의 니코틴알데하이드(10)(10 g, 93 mmol), PPh3(36.7 g, 140 mmol), 에틸 아크릴레이트(15.3 mL, 140 mmol)의 용액을 120℃ 내지 160℃에서 12 내지 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EA로 희석하고, 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물(11)(6 g, 34%)을 황색 액체로서 제공하였다. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 8.58 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.46 (dd, J = 4.8, 1.5 Hz, 1H), 7.70 (dt, J = 7.9, 1.8 Hz, 1H), 7.24 (dd, J = 7.9, 4.9 Hz, 1H), 6.48 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.38 (dt, J = 15.9, 7.0 Hz, 1H), 4.18 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.27 (dd, J = 7.0, 1.3 Hz, 2H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
( E )-4-(피리딘-3-일)부트-3-엔산(12) THF (100 mL) 중 11(6 g, 31 mmol)의 용액에 LiOH(50 mL H2O 중 2.25 g, 94 mmol)를 첨가하고 RT(실온)에서 1 내지 4h 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시켜 THF를 제거하였다. 수용액을 1N HCl(aq.)로 산성화시켰다. 혼합물을 농축 건조시키고, 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 12(3.7 g, 72%)를 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.58 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.42 (dd, J = 4.7, 1.5 Hz, 1H), 7.87 (dt, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 8.0, 4.7 Hz, 1H), 6.52 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.45 (dt, J = 16.0, 6.5 Hz, 1H), 3.21 (d, J = 6.5 Hz, 2H).
GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-11, GNTbm-33, GNTbm-38, 및 GNTbm-39의 합성을 위한 절차. DMF 중 화합물 12(1 eq), 화합물 13(1.1 eq), 및 HATU(1.1 eq)의 용액에 DIPEA(1 내지 2.5 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 내지 4h 동안 교반하였다(LCMS로 모니터링함). 아닐린(1.1 eq), HATU(1.1 eq), 및 DIPEA(1 내지 2.5 eq)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 추가로 1 내지 4시간 동안 교반하였다(LCMS로 모니터링함). 혼합물을 EA로 희석하고, 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 요망되는 생성물을 제공하였다.
GNTbm-04, 수율: 45 mg, 40%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.60 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 8.92 (d, J =1.8 Hz, 1H), 8.63 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.44 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.25 (dd, J = 8.7, 2.1 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.38-7.32 (m, 2H), 6.62-6.55 (m, 3H), 6.39(td, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 3.42 (d, J = 6 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 40.48, 101.95, 102.12, 102.41, 102.56, 119.74, 122.81, 123.69, 125.78, 126.52, 126.73, 126.79, 129.29, 132.28, 132.57, 138.25, 138.95, 144.37, 144.41, 147.80, 148.40, 159.74, 161.33, 162.27, 169.76. LCMS (ESI) m/z 392.4 [M+H]+. HPLC 순도: 96.12%.
GNTbm-05, 수율: 88 mg, 53%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.60 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 8.92 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.63 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 8.44 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 8.26 (dd, J = 8.5, 2.0 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 7.9, 4.8 Hz, 1H), 6.94 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.65 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 6.61-6.57 (m, 2H), 4.88 (s, 2H), 3.42 (d, J = 6.0 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 40.49, 116.75, 117.01, 122.76, 123.68, 124.16, 124.29, 125.67, 125.78, 126.58, 129.29, 132.28, 132.56, 138.26, 138.97, 141.56, 144.44, 147.80, 148.39, 161.86, 169.76. LCMS (ESI) m/z 374.3 [M+H]+. HPLC 순도: 99.32%.
GNTbm-11, 수율: 48 mg, 22%.1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.62 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.94 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.63 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.44 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 8.26 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.36 (dd, J = 7.9, 4.7 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.62-6.55 (m, 2H), 5.63 (s, 2H), 3.42 (d, J = 6.0 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 40.49, 115.71, 121.95, 122.90, 122.94, 123.68, 125.76, 126.55, 129.30, 132.28, 132.57, 138.42, 138.97, 144.13, 145.75, 147.80, 162.50, 169.79. LCMS (ESI) m/z 442.4 [M+H]+. HPLC 순도: 93.63%.
GNTbm-33 수율: 63 mg, 16%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.32 (s, 1H), 9.60, (s, 1H), 8.63 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.44 (dd, J = 4.7, 1.5 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.91 (dt, J = 8.0, 1.8 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 7.9, 4.8 Hz, 1H), 7.27 (dd, J = 8.5, 1.7 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.62-6.55 (m, 2H), 5.65 (s, 2H), 3.38 (d, J = 5.5 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 40.70, 115.22, 115.42, 115.63, 118.21, 122.44, 123.33, 123.69, 123.79, 124.10, 125.89, 126.19, 128.71, 128.82, 129.06, 132.34, 132.54, 142.05, 146.76, 147.78, 148.35, 165.15, 169.21. LCMS (ESI) m/z 441.4 [M+H]+. HPLC 순도: 96.40%.
GNTbm-33, 수율: 108 mg, 47%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.30 (s, 1H), 9.56 (s, 1H), 8.63 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.44 (dd, J = 4.7, 1.4 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.91 (dt, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.9, 4.7 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.96 (dt, J = 7.9, 1.4 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 8.0, 1.2 Hz, 1H), 6.62-6.57 (m, 3H), 4.87 (s, 2H), 3.37 (d, J = 5.5 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 40.69, 116.10, 116.24, 118.23, 118.34, 123.46, 123.68, 126.20, 126.32, 126.60, 128.66, 129.0, 129.04, 132.33, 132.53, 141.87, 143.08, 147.78, 148.34, 164.67, 169.17. LCMS (ESI) m/z 373.4 [M+H]+. HPLC 순도: 94.41%.
GNTbm-39, 수율: 60 mg, 25%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.30 (s, 1H), 9.49 (s, 1H), 8.62 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.44 (dd, J = 4.7, 1.6 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.90 (dt, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.36 (dd, J = 7.9, 4.8 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 8.4, 6.6 Hz, 1H), 6.62-6.57 (m, 2H), 6.54 (dd, J = 11.2, 2.9 Hz, 1H), 6.35 (td, J = 8.5, 2.8 Hz, 1H), 5.20 (s, 2H), 3.37 (d, J = 5.5 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 40.69, 101.35, 101.52, 101.92, 102.07, 118.20, 118.32, 119.40, 123.68, 126.20, 128.42, 128.49, 128.68, 128.89, 129.05, 132.33, 132.53, 141.89, 145.38, 145.45, 147.78, 148.34, 160.14, 161.73, 164.95, 169.17. LCMS (ESI) m/z 391.4 [M+H]+. HPLC 순도: 94.66%.
GNTbm-37의 합성
MeOH(2 mL) 중 GNTbm-39(0.11 g, 0.3 mmol)의 용액에 Pd/C(22 mg)를 첨가하고, 실온에서 8 내지 16h 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여액을 농축 건조시켜 GNTbm-37(95 mg, 86%)을 백색 고체로서 제공하였다.
GNTbm-37, 수율: 110 mg, 49%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.20 (s, 1H), 9.52 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.41 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 7.3, 4.9 Hz, 1H), 7.10 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 11.1, 2.0 Hz, 1H), 6.35 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 5.21 (s, 2H), 2.66 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.93 (m, J = 7.4 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 26.20, 31.56, 35.63, 99.13, 101.36, 101.52, 101.91, 102.06, 118.07, 119.44, 123.45, 128.44, 128.64, 135.84, 136.95, 142.06, 145.39, 145.47, 147.22, 149.63, 160.13, 161.71, 164.98, 171.20. LCMS (ESI) m/z 393.4 [M+H]+. HPLC 순도: 95.87%.
GNTbm-06 및 GNTbm-12.
합성 경로는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00019
( E )-4-(6-메틸-3-피리딜)부트-3-엔산(15), 2-카복시에틸(트리페닐)포스포늄 브로마이드(37.7g, 90.8 mmol)를 갖는 건조된 둥근-바닥 플라스크에 무수 THF(200 ml)를 첨가하고 용액을 -20℃ 내지 40℃로 냉각시켰다. 백색 현탁액에 THF(82.6 ml) 중 2.00 M NaHMDS를 적가하였다. 생성된 오렌지색 용액을 -20 내지 40℃에서 1 내지 5h 동안 교반하였다. 6-메틸피리딘-3-카브알데하이드(10.0 g, 82.6 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 8 내지 20h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(10 mL)로 켄칭하고 농축 건조시켰다. 혼합물에 물(300 mL)을 첨가하고, EA(200 mL) 및 DCM(200 mL)으로 세척하였다. 유기층을 제거하고 수성 층을 6N HCl(aq.)로 산성화하고, EA(200 mL) 및 DCM(200 mL)으로 세척하였다. 유기층을 제거하고 수성 층을 4 N NaOH(aq.)로 pH를 조정하고 농축 건조시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (E)-4-(6-메틸-3-피리딜)부트-3-엔산(5.10 g, 35%)을 백색 고체로서 제공하였다.
GNTbm-06, 및 GNTbm-12의 합성을 위한 절차. DMF 중 화합물 15(1 eq), 화합물 13b(1.1 eq), 및 HATU(1.1 eq)의 용액에 DIPEA(1 내지 2.5 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 내지 4h 동안 교반하였다(LCMS로 모니터링함). 아닐린(1.1 eq), HATU(1.1 eq), 및 DIPEA(1 내지 2.5 eq)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 추가로 1 내지 4시간 동안 교반하였다(LCMS로 모니터링함). 혼합물을 EA로 희석하고, 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 요망되는 생성물을 제공하였다.
GNTbm-06, 수율: 95 mg, 43%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.59 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 8.26 (dd, J = 8.7, 2.0 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.94 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.65 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.50 (dt, J = 15.5, 7.0 Hz, 1H), 4.88 (s, 2H), 3.40 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 23.71, 40.49, 116.75, 117.01, 122.75, 122.98, 124.16, 124.29, 124.48, 125.66, 126.56, 129.25, 129.47, 132.80, 138.28, 138.96, 139.05, 141.55, 144.43, 147.12, 156.80, 161.86, 169.87. LCMS (ESI) m/z 388.4 [M+H]+. HPLC 순도: 94.56%.
GNTbm-12, 수율: 45 mg, 14%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.61 (s, 1H), 10.01 (s, 1H), 8.94 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.48 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.26 (dd, J = 8.6, 2.3 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.80 (dd, J = 8.1, 2.0 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 16.1 Hz, 1H), 6.50 (dt, J = 15.8, 6.9 Hz, 1H), 5.63 (s, 2H), 3.40 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 2.45 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 23.70, 40.49, 115.71, 121.92, 122.90, 122.94, 122.98, 124.46, 126.53, 129.26, 129.47, 132.80, 138.43, 138.96, 144.11, 145.74, 147.12, 156.81, 162.49, 169.89. LCMS (ESI) m/z 456.5 [M+H]+. HPLC 순도: 92.94%.
실시예 6 GNTbm-08, GNTbm-19, 및 GNTbm-25
합성 경로는 하기에 제시되어 있다:
Figure pct00020
4-(6-메틸피리딘-3-일)부탄산(17) MeOH(10 mL) 중의 15(1 g, 5.6 mmol)의 용액에 Pd/C(200 mg)를 첨가하고, 실온에서 1 내지 8h 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여액을 농축 건조시켜 화합물 17(1 g, 99%)을 백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 12.07 (s, 1H), 8.26 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 7.9, 2.3 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 2.55 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 2.41 (s, 1H), 2.20 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 1.77 (quint, J = 7.5 Hz, 1H).
GNTbm-08, GNTbm-19, 및 GNTbm-25의 합성을 위한 절차. DMF 중 화합물 17(1 eq), 화합물 13b(1.1 eq), 및 HATU(1.1 eq)의 용액에 DIPEA(1 내지 2.5 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 내지 4h 동안 교반하였다(LCMS로 모니터링함). 아닐린(1.1 eq), HATU(1.1 eq), 및 DIPEA(1 내지 2.5 eq)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 추가로 1 내지 4시간 동안 교반하였다(LCMS로 모니터링함). 혼합물을 EA로 희석하고, 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 혼합물을 여과하고 농축 건조시켰다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 설계 생성물을 제공하였다.
GNTbm-8, 수율: 35 mg, 25%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.41 (s, 1H), 9.85 (s, 1H), 8.86 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.31 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.23 (dd, J = 8.6, 2.4 Hz, 1H), 8.07 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.53 (dd, J = 7.9, 2.1 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 8.6, 6.4 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.58 (dd, J = 11.1, 2.9 Hz, 1H), 6.39 (td, J = 12.8, 2.8 Hz, 1H), 5.19 (s, 2H), 2.62 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.40 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.92 (quint, J = 7.5 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 23.54, 26.90, 31.10, 35.47, 101.97, 102.14, 102.42, 102.57, 119.78, 122.68, 126.31, 126.67, 126.74, 133.58, 136.13, 138.53, 138.83, 144.16, 144.33, 148.78, 155.29, 159.72, 161.31, 162.29, 171.76. LCMS (ESI) m/z 408.5 [M+H]+. HPLC 순도: 93.92%.
GNTbm-19, 수율: 43 mg, 20%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.42 (s, 1H), 9.92 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.94 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.65 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.88 (s, 2H), 2.62 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.92 (quint, J = 7.4 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 23.53, 26.09, 31.10, 35.47, 116.76, 117.02, 122.68, 124.20, 124.23, 125.63, 126.36, 133.25, 136.14, 138.36, 136.85, 141.51, 144.20, 148.77, 155.28, 161.87, 171.77. LCMS (ESI) m/z 390.4 [M+H]+. HPLC 순도: 99.12%.
GNTbm-25, 수율: 30 mg, 12%. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10.43 (s, 1H), 10.00 (s, 1H), 8.88 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.24 (dd, J = 8.7, 1.8 Hz, 1H), 8.09 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.53 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.17 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.62 (s, 2H), 2.62 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.42 (s, 3H), 2.40 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 1.92 (quint, J = 7.4 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 23.54, 26.09, 31.11, 35.48, 115.73, 116.07, 116.28, 131.89, 122.69, 122.89, 122.94, 124.06, 125.85, 126.34, 133.58, 136.14, 138.52, 138.86, 143.88, 145.71, 148.78, 155.30, 162.52, 171.80. LCMS (ESI) m/z 458.5 [M+H]+. HPLC 순도: 92.03%.
실시예 7 키다미드, GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, 및 GNTbm-06의 포화 용해도의 결정
5 mg의 화합물의 샘플을 ddH2O를 함유하는 5 ml 부피 플라스크에 첨가하고, 인큐베이터에서 25℃에서 90분 동안 100 rpm으로 진탕시켰다. 생성된 현탁액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 화합물의 농도를 256 nm에서 분광광도계로 결정하였다. 각 샘플의 포화 용해도를 3회 측정하고 평균 값 및 표준 편차를 보고하였다.
실시예 8 시험관내 세포독성 검정
인간 유방암 세포주 MDA-MB-231(6x103), MDA-MB-453(2.4x104), SK-BR-3(6x103), 인간 유방 상피 세포주 M10(6x103), 인간 위 암종 NCI-N87(2.4x104), 및 인간 결장직장 선암종 SW48(2.4x104)을 포함하는 6개의 상이한 세포주가 사용되었고, 96웰 플레이트에 시딩되었다. 세포주는 Bioresource Collection and Research Center(BCRC, 대만)에서 입수하였다. 모든 세포주를 50 μM 내지 0.39 μM 범위의 용량으로 GNTbm 화합물 시리즈, 키다미드(양성 대조군) 및 엔티노스타트(양성 대조군)를 포함하는 화합물로 처리한 다음, 37℃에서 5% CO2 하에 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간 후, MTT 검정(Cayman™)을 사용하여 세포 생존력을 결정하였다. MDA-MB-231, MDA-MB-453, SK-BR-3 세포주는 10% FBS, 0.2% 항생제(MycoZapTM, Pluse-CL)가 보충된 DMEM/F12에서 유지되었다. M10 세포주는 10% FBS, 0.2% 항생제(MycoZapTM, Pluse-CL)가 보충된 MEM Alpha(gibcoTM)에서 유지되었다. NCI-N87 세포주는 10% FBS, 0.2% 항생제(MycoZapTM, Pluse-CL)가 보충된 RPMI 1640(CORNINGTM)에서 유지되었다. SK-BR-3 세포주는 10% FBS, 0.2% 항생제(MycoZapTM, Pluse-CL)가 보충된 DMEM(CORNINGTM)에서 유지되었다.
실시예 9 HDAC 1, 2, 및 3 효소 억제에 대한 IC 50 의 측정이 결정되었다
HDAC 검정은 표준 프로토콜(Fluorgenic HDAC 1, 2, 및 3 검정 키트, BPS BioscienceTM)에 따라 수행되었다. 양성 대조군으로서 키다미드 및 엔티노스타트를 갖는 모든 화합물을 20 μM 내지 1.28 nM 범위의 용량으로 키트 완충제와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 검정 현상액을 샘플에 첨가하고 형광성 파장에서 흡광도를 판독하였다. 각 샘플에서 HDAC 1, 2, 및 3 활성에 대한 상대적 억제를 결정하였다.
실시예 10 GNTbm-02에 의한 HDAC3의 효소 억제 동역학을 결정하였다
HDAC3 효소 동역학 검정은 표준 프로토콜(Fluorgenic HDAC3 검정 키트, BPS BioscienceTM)에 따라 수행되었다. 일련의 GNTbm-01, GNTbm-02, 및 GNTbm-03 화합물, 2 μM의 용량의 키다미드 및 엔티노스타트를 키트 완충제와 혼합하고 37℃에서 20분, 40분 및 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 검정 현상액을 샘플에 첨가하고 흡광도를 형광성 파장에서 판독하였다. 각 샘플에서 HDAC3 활성에 대한 상대적 억제를 결정하였다.
실시예 11 HDAC 1-11 효소 억제에 대한 GNTbm-02 및 엔티노스타트(MS-275) 사이의 IC 50 의 비교를 결정하였다
완성된 검정 보고서는 BPS Bioscience Inc.(6042 Cornerstone Court West, Ste. B, San Diego, CA 92121, USA)로부터의 것이다. 연구의 목적은 시험관내 효소 검정을 이용하여 재조합 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, 및 HDAC11의 활성에 대한 GNTbm-02 및 양성 대조군 엔티노스타트(MS-275)의 2개의 화합물의 효과를 결정하는 것이다. HDAC 검정은 표준 프로토콜(Fluorgenic HDACs 1-11 검정 키트, BPS BioscienceTM)에 따라 수행되었다. 10 μM 내지 0.51 nM 범위의 용량의 GNTbm-02 및 엔티노스타트(양성 대조군)를 키트 완충제와 혼합하고 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 0.5시간 후, 검정 현상액을 샘플에 첨가하고 흡광도를 형광성 파장에서 판독하였다. HDAC 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 11 활성에 대한 상대적 억제를 각 샘플에서 결정하였다. 자세한 내용은 하기에 기술된다. 모든 화합물을 DMSO에 용해하였다. 화합물의 연속 희석을 먼저 1 mM의 최고 농도로 100% DMSO에서 수행하였다. 이어서, 각각의 중간 화합물 희석액(100% DMSO 중)은 HDAC 검정 완충제 중 10% DMSO의 중간 희석을 위해 검정 완충제로 10배 직접 희석될 것이고, 5 ㎕의 희석액을 50 ㎕ 반응에 첨가하여 최종 농도가 되도록 하였다. 모든 반응에서 DMSO의 1%이다. HDAC 효소에 대한 효소 반응을 HDAC 검정 완충제, 5 ㎍ BSA, HDAC 기질, HDAC 효소 및 시험 화합물을 함유하는 50 ㎕ 혼합물에서 37℃에서 30분 동안 이중으로 수행하였다. 효소 반응 후, 50 ㎕의 2 x HDAC 현상액을 HDAC 효소에 대해 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 추가로 15분 동안 인큐베이션하였다. Tecan Infinite M1000 마이크로플레이트 리더를 사용하여 360 nm의 여기 및 460 nm의 방출에서 형광 강도를 측정하였다. HDAC 활성 검정을 각 농도에서 이중으로 수행하였다. 형광 강도 데이터는 컴퓨터 소프트웨어 Graphpad Prism을 사용하여 분석되었다. 화합물의 부재하에서, 각 데이터 세트에서 형광 강도(Ft)는 100% 활성으로 정의되었다. HDAC의 부재 하에, 각 데이터 세트에서 형광 강도(Fb)는 0% 활성으로 정의되었다. 각 화합물의 존재 하에 퍼센트 활성은 하기 방정식에 따라 계산되었다: %활성 = (F-Fb)/(Ft-Fb), (여기서 F = 화합물의 존재 하에 형광 강도임). 이어서, % 활성 대 일련의 화합물 농도의 값을 방정식 Y=B+(TB)/1+10((LogEC50-X)×힐 기울기)로 생성된 S자형 용량-반응 곡선의 비선형 회귀 분석을 사용하여 플롯팅하였으며, 여기서 Y = 활성 백분율, B = 최소 활성 백분율, T = 최대 활성 백분율, X = 화합물의 로그 및 힐 기울기 = 기울기 인자 또는 힐 계수. IC50 값은 반-최대 퍼센트 활성을 야기하는 농도에 의해 결정되었다.
실시예 12 세포 아폽토시스 및 세포 주기 정지를 유세포 분석에 의해 분석하였다
PI/RNase 염색 검정(BD Bioscience™)을 수행하여 GNTbm 화합물, 키다미드 및 엔티노스타트로 처리한 후 세포 주기 정지 및 아폽토시스 세포의 존재를 나타내었다. 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231(1.5x105) 및 인간 유방 상피 세포주 M10(1.5x105)을 각각 GNTbm 화합물, 키다미드 및 엔티노스타트(1.625 내지 25 μM)로 72시간 동안 처리하거나 지시된 용량으로 3h 내지 72h 처리하였다. 인간 결장직장 선암종 SW48 세포(5x105)를 GNTbm 화합물 시리즈, 키다미드 및 엔티노스타트(표시된 용량)로 72h 동안 처리하거나 지시된 용량의 농도로 3h 내지 72h 처리하였다. 처리 후, 세포를 수확하고, 80% 에탄올로 24시간 동안 고정시키고, 1X PBS로 세척하고, 실온에서 15분 동안 PI/RNase로 염색하였다. 이후, 세포를 1h 이내에 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다.
실시예 13 웨스턴 블롯 검정
인간 유방암 MDA-MB-231 세포 및 인간 결장직장 선암종 SW48 세포를 분석하였다. MDA-MB-231 및 SW48은 Bioresource Collection and Research Center(BCRC, 대만)로부터 입수하였다. MDA-MB-231 및 SW48을 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(Thermo Scientific), 1X 농도의 MycoZap 항생제(cat.# VZA-2011, Lonza)를 함유한 Leibovitz's L-15(cat. #11415114, Thermo Fisher Scientific)에서 CO2가 보충되지 않은 습한 공기 하 37℃에서 성장시켰다. 세포를 상이한 기간 동안 또는 다양한 용량으로 GNTbm 화합물 시리즈, 키다미드 또는 엔티노스타트로 처리하였다. 세포를 24시간 동안 지시된 용량으로 처리하거나 상이한 기간 동안 지시된 용량으로 세포를 처리하였다. 세포 펠렛을 프로테아제를 갖는 RIPA 완충제(cat. #20-188, Merck) 및 포스파타제 억제제(cat. #K272, BioVision)로 용해시키고, 원심분리에 의해 정화되었다. 동일한 양의 총 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분해하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(cat. #1620177, BIO-RAD)으로 옮겼다. 블롯을 β-액틴에 대한 일차 항체(cat. #sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), 히스톤 3ac(cat. #61637, Active Motif), 및 HRP 이차 항체 항-토끼(ab6721, Abcam) 및 항-마우스(sc-2005, Santa Cruz)와 함께 인큐베이션하였다. 블롯은 ECL 웨스턴 블롯팅 기질(cat. #sc-2048, Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 현상하였다. 이미지 블롯은 iBright FL1000(Thermo Fisher Scientific) 이미징 시스템으로 분석되었다.
실시예 14 동물 모델에서 항암 활성
동물 연구는 타이베이 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(TMU IACUC, NO: LAC-2019-0286, LAC-2020-0306)에 의해 승인되고 감독되었다. 6주 내지 8주된 수컷 BALB/c 마우스(National Laboratory Animal Center, Taiwan)를 모든 동물 실험에 대해 각 처리 그룹에 사용하였다. 종양은 1×106 또는 5×106개의 CT26 세포[(CRL-2638; 뮤린 결장직장 선암종)의 s.c. 주사에 의해 확립되었다. CT26 세포주는 ATCC로부터 구입하였다. CT26 종양 세포를 37℃, 5% CO2에서 10%(vol/vol) FBS가 보충된 McCoy's 5A에서 성장시켰다. CT26 세포를 Matrigel(cat. #354248, Corning®)을 마우스의 왼쪽 옆구리에 접종하고, 2개의 수직 직경을 측정함으로써 종양 성장을 결정하였다. 무작위화 및 치료 전에 종양을 8 내지 11일 동안 성장시켰다(종양 크기 약 150 내지 250 ㎣). 종양이 직경이 3000 ㎣ 초과에 도달하면 동물을 안락사시켰다. CT26-보유 마우스에 종양 이식 후 8, 11, 14, 17, 20 및 23일에 i.p. 투여에 의해 2.5 mg/kg의 항-IgG(cat. #BE0089, Lot# 716719J3, Bio X Cell) 및 항-PD-1(cat. #BE0146, Lot# 735019J3, Bio X Cell) 항체를 제공하고, 모든 항체를 100 ㎕의 멸균 PBS(pH 7.4)(Invitrogen Life Technologies)에서 적절한 농도로 희석하였다. 레고라페닙(HY-1031, 30 mg/kg, po 매일, MedChemExpress USA), 셀레콕시브(50 mg/kg, po 일일 캡슐/Celebrex®), 키다미드-K30(50 mg/kg, po 매일, GNTbm, Taipei로부터 생산됨), 및 GNTbm-02/k30, GNTbm-03/k30, GNTbm-04/k30, GNTbm-05/k30, GNTbm-06/k30, GNTbm-11/k30, GNTbm-38/k30, GNTbm-39/ k30 화합물(50, 25 또는 12.5 mg/kg, 스톡 용액을 생성하기 위해 물에 용해됨, po 매일)을 8일부터 23일까지 16일 동안 매일 다양한 용량으로 종양 보유 마우스를 치료하기 위해 경구 투여하였다. 항암 활성을 치료 시작부터 종양 부피가 3,000 ㎣에 도달할 때까지 측정하였다. 종양 부피를 길이 × 폭2 × 0.5로 계산하였다.
실시예 15 동물 모델에서의 생존율
항체 또는 약물의 투여는 8일부터 23일까지 16일 동안 수행되었다. 종양은 종양-보유 마우스에서 계속 성장하였다. 마우스의 종양 부피를 3일 또는 4일마다 1회(2회/주) 측정하였다. 종양 부피가 3,000 ㎣에 도달하면 종양-보유 마우스를 죽은 것으로 간주하였다. 모든 치료 그룹을 기록하고 분석하였다.
실시예 16 종양-보유 마우스 동물 모델에서 종양 재접종 연구
치료 후 PR/CR 반응을 갖는 모든 마우스는 반대측에 CT26 세포로 재접종되었다(표 6 참조). CT26으로의 재접종은 각 마우스의 오른쪽 옆구리에 5×106개의 CT26 세포를 주사하여, 첫 번째 종양 평가(26일) 후 7일(33일)인 33일에 수행되었다. CT26 세포의 재접종 후, 종양을 추가 7일(40일) 동안 성장시켜 기준선을 1배로 결정하였다. 추가 10일 후(50일), 재접종에 대해 종양 성장을 평가하였다. 하기 기준 둘 모두가 충족되는 경우, 반응은 재발로 간주될 것이다: 첫째, 기준선의 크기와 비교할 때 2배 넘는 종양 크기; 둘째, 50일에 종양 부피는 300 ㎣ 넘었다. 재발은 면역 기억 활동이 충분히 활성화되지 않을 때 발생한다. 종양 성장이 억제되면 면역 기억이 활성화됨을 의미한다.
실시예 17 유세포 분석
하기 항체 및 시약을 유세포 분석에 사용하였다: CD8a PerCP-Cy5.5(53-6.7; BioLegend), CD4 PE(GK 1.5; BioLegend), CD25 PerCP-Cy5.5(PC61; BioLegend), Foxp3 PE(MF14 ; BioLegend), CD3 APC(17A2; BioLegend), CD11b APC(M1/70; BioLegend), Ly-6C PerCP-Cy5.5(HK 1.4; BioLegend), Ly-6G PE(1A8; BioLegend), MHC-II-PE(BM8; BioLegend), CD45 FITC(30-F11; BioLegend). FACS Calibre 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 유세포 분석을 수행하고, 데이터를 FACS Diva 소프트웨어(BD Biosciences)로 분석하였다. 순환 세포 집단의 수준을 평가하기 위해, GNTbm-02(12.5 내지 50 mg/kg) 또는 키다미드(50 mg/kg, 양성 대조군) + 셀레콕시브(50 mg/kg)와 함께 또는 이의 없는 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) 치료의 개시 후 8, 12, 16일에 마우스로부터 혈액 샘플을 채혈하였다. 150 마이크로리터의 혈액을 우측 또는 좌측 안면 정맥으로부터 K2EDTA BD Microtainer(BD Biosciences)에 수집하였다. 항응고된 혈액 샘플로부터의 RBC를 10분 동안 2 mL의 1 × RBC 용해 완충제(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 즉시 용해하고, 샘플을 빙냉 PBS(BD Biosciences)에서 2회 세척하였다. 샘플을 적절한 항체로 염색하였다. 분석을 위해, 본 발명자들은 CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C- (PMN-MDSC), CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C+ 세포(M-MDSC), CD45+CD3+CD25+Foxp3+ 세포(Treg), CD45+CD11b+ MHC-ll+Ly6C+ 세포(TAM), 및 CD45+CD3+CD4+/CD45+CD3+CD8+ 세포(CD4+ 또는 CD8+ T 세포)로서 이러한 세포들의 이미 확립된 표현형 기준을 사용하였다. 총 단핵 세포를 공통 분모로 사용하였다. 종양에서 종양-침윤 림프구의 수준을 평가하기 위해, 종양내 CD8+, CD4+, 조절 T-세포(Treg), PMN-MDSC, M-MDSC, 및 TAM 세포를 먼저 GNTbm-02 또는 키다미드 + 셀레콕시브의 존재 또는 부재 하의 항-PD-1 항체 치료의 개시 12일 후에 마우스로부터 절제된 종양 샘플로부터 정제하였다. 간략하게, 원발성 종양 조직을 수확하고, 칭량하고, 미세 단편으로 세절하였다. HBSS(Invitrogen Life Technologies) 중 1 mg/mL의 콜라게나제 IV(Sigma-Aldrich)를 200 mg의 종양 조직 당 1 mL의 비율로 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 150분 동안 엔드-오버-엔드(end-over-end) 진탕기에서 인큐베이션하였다. 생성된 조직 균질액을 0.4-㎛ 여과하고 PBS(BD Biosciences)에서 3회 세척하고, Percoll 구배를 통해 분리하여 단핵 세포를 단리하고, 샘플 당 1×106개의 세포를 항체 표지에 사용하였다. CD8+ T-세포 수준은 CD45+CD3+CD8+의 이전에 확립된 표현형 기준을 사용하여 평가되었다. Treg 세포 수준은 D45+CD3+CD25+Foxp3+의 이전에 확립된 표현형 기준을 사용하여 평가되었다. PMN-MDSC/M-MDSC 세포 수준은 CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C-/CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C+의 이전에 확립된 표현형 기준을 사용하여 평가되었다. TAM 세포 수준은 CD45+CD11b+MHC-11+Ly6C+의 이전에 확립된 표현형 기준을 사용하여 평가되었고, 총 단핵 세포를 공통 분모로 사용하였다.
실시예 18 누드 마우스 모델에서 항-암 활성
동물 연구는 Taipei Medical University Institutional Animal Care and Use Committee(TMU IACUC, NO: LAC-2019-0086)에 의해 승인되고 감독되었다. 6주령 내지 8주령의 수컷 BALB/C 누드 마우스(National Laboratory Animal Center, Taiwan)를 모든 동물 실험에 대해 각 치료 그룹에 사용하였다. 종양은 마우스의 왼쪽 옆구리에에 마트리겔(cat. #354248, Corning®)과 함께 5×106 CT26 세포의 s.c. 주사에 의해 확립되었으며, 성장을 2개의 수직 직경을 측정함으로써 결정하였다. 무작위화 및 치료 전에 종양을 8일 동안 성장시켰다(종양 크기 약 100 내지 150 ㎣). 종양 부피가 3000 ㎣에 도달했을 때 동물을 안락사시켰다. CT26-보유 마우스에 항체 이식 후 8, 11, 14, 17, 20 및 23일에 i.p.에 의해 2.5 mg/kg의 항-IgG(cat. #BE0089, Lot# 716719J3, Bio X Cell) 및 항-PD-1(cat. #BE0146, Lot# 735019J3, Bio X Cell) 항체를 제공하였으며, 모든 항체를 100 ㎕의 멸균 PBS(pH 7.4)(Invitrogen Life Technologies)에서 적절한 농도로 희석하였다. GNTbm 화합물 및 셀레콕시브(캡슐/Celebrex®, 200 mg)를 이식 후 8일에 경구 투여하였다. GNTbm 화합물(스톡을 생성하기 위해 DMSO에 용해됨)을 물로 희석하거나 현탁시키고, 8일로부터 23일까지 매일 다양한 용량으로 종양-보유 마우스를 치료하기 위해 경구 투여하였다. 캡슐로부터의 셀레콕시브는 종양-보유 마우스를 치료하기 위해 8일로부터 23일까지 50 mg/kg으로 경구 투여되었다. 항암 활성을 치료 시작부터 종양 부피가 3,000 ㎣에 도달할 때까지 측정하였다. 종양 부피를 길이 × 폭2 × 0.5로 계산하였다.
결과
강력하고 신규한 클래스 I HDAC 억제제의 합성 피콜린아미드 및 벤즈아미드 유도체의 시리즈(GNTbm 화합물 시리즈로 불림)
GNTbm은 HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성을 억제할 수 있는 강력한 후성적 면역조절 특성을 갖는 일련의 신규한 클래스 I HDAC 억제제를 개발하였다. 본 발명자들의 연구는 종양 미세환경(TME)에서 강력한 조절 능력을 보유하는 클래스 I HDAC 억제제가 종양 성장에 대한 면역 반응을 크게 향상시키는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 신규한 클래스 I HDAC 억제제를 설계하고 합성하는 것은 면역요법에서 치료 효과의 향상을 위한 흥미로운 과제였다. 벤즈아미드-기반 클래스 I HDAC 억제제는 엔티노스타트(MS-275), 투시디노스타트(키다미드/HBI-8000), 및 모세티노스타트 등과 같은 TME를 조절하는 분야에서 연구되었다. 피콜린아미드의 구조에 기반한 일련의 강력하고 신규한 클래스 I HDAC 억제제. GNTbm-01 [6-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피리딘-3-카복사미드]는 도 1 및 표 1에 제시된 바와 같은 카복사미드의 코어 구조를 기반으로 하는 최초의 합성 신규 화합물이었다. 화합물 GNTbm-01을 표 4에 제시된 바와 같이 HDAC 1, 2, 및 3의 효소적 억제에 대해 검정하였다. 결과는 GNTbm-01 화합물이 엔티노스타트 또는 키다미드와 비교할 때 더 약한 클래스 I HDAC 억제제임을 입증하였다. 본 발명자들은 도 1 및 표 1에 제시된 바와 같이 신규한 화합물 GNTbm-02 [5-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)피콜린아미드]를 생성한 구조를 최적화하고 N 원자위 위치를 변경하였다. GNTbm-02 화합물은 GNTbm-01 화합물과 동일한 분자식(C22H20FN5O2)을 갖지만 피콜린아미드의 코어에서 N 원자의 위치의 변화만 갖는다. 표 4에 제시된 바와 같이, GNTbm-02 화합물은 엔티노스타트 또는 키다미드와 비교할 때 HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성의 억제에서 매우 강력하였다. 결과는 또한 GNTbm-02가 GNTbm-01보다 HDAC 1, 2, 및 3 효소 활성의 억제에 더 강력하다는 것을 입증하였다. 다음으로, 본 발명자들은 N 원자가 제거된(즉, C 원자로 대체된) 벤즈아미드-기반 화합물 GNTbm-03을 설계하고, GNTbm-02와 비교하여 HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성의 억제에 대한 차이를 시험하였다. 합성 벤즈아미드-기반 클래스 I HDAC 억제제 GNTbm-03 [[4-((E)-4-(6-메틸피리딘-3-일)부트-3-엔아미도)-N-(2-아미노-4-플루오로페닐)벤즈아미드]]는 도 1 및 표 1에 제시되어 있다. 표 4에 제시된 바와 같이, GNTbm-03은 HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 결과는 GNTbm-03이 엔티노스타트 또는 키다미드와 비교할 때 클래스 I HDAC 1, 2, 및 3 효소 활성을 억제하는 데 강력하다는 것을 입증하였다. 또한, GNTbm-03은 GNTbm-02와 비교할 때 HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성의 유사한 억제를 갖는 것으로 나타났다. 종합하면, 피콜린아미드-기반 유도체 GNTbm-02는 클래스 I HDAC 억제제로서 이의 화학적 클래스에서 첫 번째였다. 본 발명자들은 강력하고 신규한 클래스 I HDAC 억제제의 피콜린아미드-기반 및 벤즈아미드-기반 유도체를 설계하는 데 매우 관심이 있었다. GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-06, GNTbm-08, GNTbm-11, GNTbm-12, GNTbm-19, GNTbm-25, GNTbm-33, GNTbm-37, GNTbm-38, 및 GNTbm-39와 같은 GNTbm 화합물의 신규 시리즈를 합성하고 검정하였다.
GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, 및 GNTbm-06의 포화 용해도를 분석하기 위해
용해도는 경구 생체이용률에 대한 매우 중요한 결정적인 파라미터였다. GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, 및 GNTbm-06의 포화 용해도의 분석은 표 2에 제시되어 있다. 결과는 키다미드가 GNTbm-02 및 GNTbm-04와 비교할 때 감소된 포화 용해도를 갖는다는 것을 보여주었다. GNTbm-02 및 GNTbm-04의 포화 용해도는 각각 33.6 및 7.2 ㎍/mL이었다. 이러한 결과는 GNTbm-02 및 GNTbm-04가 키다미드에 비해 더 나은 경구 생체이용률을 가질 수 있음을 시사하였다.
GNTbm 화합물 시리즈의 시험관내 세포독성 검정
본 발명자들은 3개의 인간 유방암 세포주(SK-BR-3, MDA-MB-453, 및 MDA-MB-231), 인간 결장직장 선암종 SW48, 인간 위암종 NCI-N87, 및 인간 유방 상피 세포주 M10(정상 세포주)을 포함하는 여러 암 세포주에서 GNTbm 화합물 시리즈의 세포독성 효과를 평가하였다. 결과는 양성 대조군으로서 키다미드 또는 엔티노스타트가 특히 SK-BR-3 및 MDA-MB-453 세포에서 세포독성 효과를 현저하게 유도하였음을 입증하였다. 전체적으로, 6개의 세포주가 표 3, 8, 및 9에 제시된 바와 같이 치료에 민감하였다. 화합물 GNTbm-01은 엔티노스타트와 비교할 때 세포독성 효과를 부분적으로 유도하였다. 표 3에 제시된 바와 같이, 결과는 GNTbm-02가 GNTbm-01과 비교하여 특히 SK-BR-3, MDA-MB-453, 및 SW48 세포에서 세포독성 효과를 유도하는 데 매우 강력하다는 것을 입증하였다. 이 결과는 GNTbm-02에서 피콜린아미드 코어를 함유하는 구조가 매우 중요하다는 것을 입증하였다. 피콜린아미드 코어 구조의 벤즈아미드로의 대체는 세포독성 효과를 방해할 것이다. 표 3에 제시된 바와 같이, 화합물 GNTbm-03은 SK-BR-3, MDA-MB-231, 및 SW48 세포에서 GNTbm-02보다 세포독성 효과를 유도하는 데 약하였다. 이러한 결과는 피콜린아미드 코어 구조를 갖는 GNTbm-02가 벤즈아미드 코어 구조를 갖는 GNTbm-03보다 세포독성을 유도하는 데 우수함을 시사하였다. 종합하면, 이러한 결과는 GNTbm-02가 강력하고 신규한 클래스 I HDAC 억제제이며 여러 인간 암 세포에서 세포독성을 유도하는 강력한 능력을 보유함을 시사하였다. 또한, 본 발명자들은 여러 신규 합성 피콜린아미드-기반 및 벤즈아미드-기반 유도체의 세포독성 효과를 평가하는 데 관심이 있었다. 표 8에 제시된 바와 같이, 피콜린아미드-기반 화합물의 세포독성 효과를 분석하였다. GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-06, 및 GNTbm-11은 키다미드 또는 엔티노스타트보다 6개의 세포주에서 세포독성 효과를 유도하는데 더 강력하였다. 벤즈아미드-기반 화합물에서, GNTbm-33, GNTbm-38, 및 GNTbm-39는 키다미드 또는 엔티노스타트보다 세포독성 효과를 유도하는데 더 강력하였다. 이러한 데이터는 이들 신규한 피콜린아미드-기반 및 벤즈아미드-기반 유도체가 잘 알려진 클래스 I HDAC 억제제 키다미드 또는 엔티노스타트보다 세포독성 효과를 유도하는데 강력하다는 것을 입증하였다.
HDAC 1, 2, 및 3의 억제를 위한 피콜리아미드-기반 GNTbm 화합물 시리즈
GNTbm 화합물 시리즈는 HDAC 1, 2, 및 3 효소 활성의 효소 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 표 4 및 10에 제시된 바와 같이, 양성 대조군으로서 엔티노스타트는 HDAC 1, 2, 및 3 효소 활성을 선택적으로 억제하는 강력한 클래스 I HDAC 억제제였다. 키다마이드(투시디노스타트)는 중국에서 NMPA에 의해 재발성 또는 불응성 말초 T 세포 림프종(PTCL) 및 진행성 ER+/Her-2- 유방암에 대해 승인된 또 다른 강력한 HDAC 억제제이다. 키다미드는 HDAC 1, 2, 3, 및 10의 효소 활성 억제를 위한 서브타입-선택적 억제제이다. 엔티노스타트 및 키다미드 둘 모두는 표 4에서 HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성의 강력한 억제를 나타내었다. 다음으로, GNTbm-01을 평가하고 표 4에 제시된 바와 같이 엔티노스타트와 비교하여 HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성의 억제에 대해 약한 역가를 갖는 것으로 입증되었다. 극적으로, GNTbm-02는 나노몰 수준에서 HDAC 1, 2, 및 3 효소 활성을 억제하는 매우 강력한 활성을 가졌다. HDAC 1, 2, 및 3의 효소 활성의 억제에서 GNTbm-02와 엔티노스타트 또는 키다미드의 비교는 유사한 억제 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 GNTbm-02가 강력하고 선택적 클래스 I HDAC 억제제임을 시사하였다. 표 4에 제시된 바와 같이, GNTbm-03은 GNTbm-02와 유사한 억제 효과를 갖는 강력한 HDAC 억제제였다. 다음으로, HDAC 3 효소 동역학의 억제를 조사하였다. 도 16a에 도시된 바와 같이, 키다미드 및 GNTbm-02는 엔티노스타트보다 HDAC 3 효소 활성의 더 강한 억제를 나타내었다. 도 16b에 도시된 바와 같이, GNTbm-02 및 GNTbm-03은 GNTbm-01보다 HDAC 3 효소 활성의 더 강한 억제를 나타내었다. 종합하면, 이러한 모든 결과는 피콜린아미드 코어 구조를 함유하는 GNTbm-02가 HDAC 1, 2, 및 3 효소 활성을 억제하는 더 강력한 능력을 가질 수 있음을 시사하였다. 또한, 본 발명자들은 표 10에 제시된 바와 같이 모든 신규한 합성 피콜린아미드-기반 GNTbm 화합물을 평가하는 데 관심이 있었다. GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-06, GNTbm-08, 및 GNTbm-11은 키다미드 또는 엔티노스타트보다 HDAC 3 효소 활성을 억제하는데 더 강력하였다. GNTbm-05 및 GNTbm-06은 키다미드 또는 엔티노스타트보다 HDAC 1 효소 활성을 억제하는 데 더 강력하였다. 그러나, 본 발명자들은 또한 표 11에 제시된 바와 같이 신규한 합성 벤즈아미드-기반 GNTbm 화합물을 평가하였다. GNTbm-38 및 GNTbm-39는 키다미드 또는 엔티노스타트보다 HDAC 1, 2, 및 3의 활성 억제와 관련하여 더 약한 것으로 보인다.
GNTbm-02는 피콜리아미드-기반 서브타입-선택적 클래스 I HDAC 억제제이다
HDAC 1-11 효소 활성의 서브타입-선택적 억제를 추가로 확인하기 위해, GNTbm-02를 BPS Bioscience Inc.(6042 Cornerstone Court West, Ste. B, San Diego, CA 92121, USA)에 의해 시험하였다. 표 5에 제시된 바와 같이, HDAC 1-11(HDAC 10 제외) 효소 활성의 억제를 양성 대조군으로서 엔티노스타트(MS-275)로 분석하였다. 이 결과는 GNTbm-02가 동일한 조건에서 엔티노스타트보다 HDAC 1, 2, 및 3을 억제하는데 더 강력하다는 것을 입증하였다. GNTbm-02는 각각 0.39, 0.91, 및 0.73 μM의 IC50으로 클래스 I HDAC1, HDAC2, 및 HDAC3을 억제하였다. 그러나, 엔티노스타트는 각각 0.95, 2.3, 및 4.6 μM의 IC50으로 클래스 I HDAC1, HDAC2, 및 HDAC3을 억제한다. HDAC 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 11을 포함하는 다른 HDAC는 최대 10 μM의 농도에서 GNTbm-02 또는 엔티노스타트에 의해 억제되지 않았다. 이러한 결과는 GNTbm-02가 강력하고 서브타입-선택적인 클래스 I HDAC 억제제임을 시사하였다. GNTbm-02는 피콜린아미드-기반 클래스 I HDAC 억제제이다. 그러나, 엔티노스타트는 벤즈아미드-기반 클래스 I HDAC 억제제이다. GNTbm-02는 엔티노스타트보다 HDACS 1, 2, 및 3 효소 활성을 억제하는데 더 강력하다.
GNTbm 화합물 시리즈는 인간 암 세포 증식 및 형태에 상당한 영향을 미친다.
인간 암 세포 증식에 대한 GNTbm-02의 억제 효과는 도 3에 도시되어 있다. 다양한 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트를 사용하여 MDA-MB-231 세포를 72h 동안 처리하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 억제 효과의 역가는 세포 증식을 유의하게 억제하는 12.5 μM의 농도에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트에 대해 유사하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 억제 효과의 역가는 72h 동안 3.125 μM의 농도로 GNTbm-02 또는 엔티노스타트로 처리될 때 SW48 세포에 대해 더 명백하였다. 다음으로, M10 세포를 12.5 μM의 농도의 GNTbm-02 또는 엔티노스타트로 처리하였고, 이는 도 3c에 도시된 바와 같이 세포 증식을 유의하게 억제하였다. 종합하면, 이러한 결과는 GNTbm-02가 세포 증식을 억제하는 강력한 능력을 보유함을 시사하였다.
인간 암 MDA-MB-231 및 SW48 세포에서 G0/G1 또는 G2/M 단계에서 GNTbm 화합물 시리즈는 세포 주기 정지를 유도하였다.
세포 증식의 억제 메커니즘을 조사하기 위해, 유세포분석을 사용하여 세포 주기 정지를 분석하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 1.625 내지 25 μM의 다양한 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트를 사용하여 MDA-MB-231 세포를 72시간 동안 처리하였다. 결과는 GNTbm-02 및 엔티노스타트가 도 4a 및 도 4b에 도시된 바와 같이 3.125 μM의 농도에서 G0/G1 단계에서 세포 주기 정지를 유의하게 유도하는 유사한 메커니즘을 보유함을 입증하였다. 도 4c 및 도 4d에 도시된 바와 같이, 세포 주기는 시간-의존 방식으로 12.5 μM의 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 치료에 의해 G0/G1 단계에서 정지되었다. 결과는 1일 동안의 GNTbm-02 또는 엔티노스타트로의 치료가 G0/G1 단계에서 세포 주기 정지를 유의하게 유도하였음을 나타내었다. SW48 세포에서, 유사한 메커니즘이 또한 나타났다. 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이, 0.39 내지 6.25 μM의 다양한 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트를 사용하여 SW48 세포를 72시간 동안 처리하였다. 결과는 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이 GNTbm-02 및 엔티노스타트가 3.125 μM의 농도에서 G0/G1 단계에서 세포 주기 정지를 유의하게 유도하였음을 입증하였다. 결과는 GNTbm-02(76.9%)가 3.125 μM의 동일한 농도에서 엔티노스타트(72.1%)보다 G0/G1 단계에서 세포 주기 정지를 유도하는데 더 강력한 것으로 보인다는 것을 보여주었다. 도 5c 및 도 5d에 도시된 바와 같이, 세포 주기는 시간-의존 방식으로 6.25 μM의 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 처리에 의해 G0/G1 단계에서 정지되었다. 결과는 2일 동안의 GNTbm-02 또는 엔티노스타트로의 치료가 G0/G1 단계에서 세포 주기 정지를 유의하게 유도하였음을 나타내었다. 종합하면, 이러한 모든 데이터는 GNTbm-02 및 엔티노스타트가 G0/G1 단계에서 유도된 세포 주기 정지를 통해 인간 암 세포 증식을 억제하는 유사한 메커니즘을 가졌다는 것을 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-38, 및 GNTbm-39와 같은 여러 강력한 피콜린아미드-기반 및 벤즈아미드-기반 신규 합성 유도체를 평가하는 데 관심이 있었다. 표 12에 제시된 바와 같이, GNTbm-04는 SW48 세포에서 G0/G1기에 세포 주기 정지를 유의하게 유도하였다. 이는 G0/G1 단계에서 키다미드 유도된 세포 주기 정지와 유사하였다. 그러나, GNTbm-05, GNTbm-38, 및 GNTbm-39의 유사한 화학 구조는 SW48 세포에서 G2/M 단계에서 세포 주기 정지를 유의하게 유도하였다. 따라서, 이러한 강력한 화합물의 화학 구조는 매우 유사했지만, 세포 주기 정지 메커니즘은 매우 상이하였다.
M10 세포에서 G2/M 단계에서 GNTbm-02는 세포 주기 정지를 유도하였다.
인간 유방 상피 세포주 M10을 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이 72h 동안 1.625 내지 25.0 μM의 GNTbm-02 또는 엔티노스타트의 상이한 용량으로 처리하였다. 결과는 12.5 μM 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트가 G2/M 단계에서 M10 세포의 세포 주기 정지를 유의하게 유도하였음을 입증하였다. 엔티노스타트(20.2%)는 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이 G2/M 단계에서 세포 주기 정지의 유도에서 GNTbm-02(16.2%)보다 더 강력하였다. 도 6c 및 도 6d에 도시된 바와 같이, 시간-의존 방식으로 12.5 μM의 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 치료에 의해 G2/M 단계에서 세포 주기가 정지되었다. 결과는 2일 동안의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 치료가 M10 세포에서 G2/M 단계에서 세포 주기 정지를 유의하게 유도하였음을 나타내었다. 이러한 결과는 인간 암 세포에 대한 GNTbm-02 및 엔티노스타트 치료가 G0/G1 단계에서 유도된 세포 주기 정지를 통해 암 세포 증식을 유의하게 억제하였고; 인간 정상 세포에 대한 GNTbm-02 및 엔티노스타트 치료는 G2/M 단계에서 유도된 세포 주기 정지를 통해 세포 증식을 유의하게 억제하였다.
GNTbm 화합물 시리즈는 여러 세포주에서 아폽토시스를 유도하였다
GNTbm-02가 암 세포에서 아폽토시스를 유도했는지 조사하기 위해, 72h 동안 1.625 내지 25.0 μM의 다양한 농도에서 MDA-MB-231 세포에 대한 GNTbm-02 및 엔티노스타트(양성 대조군으로서)로의 치료 후 결과가 도 7a 및 도 7b에 도시되어 있다. 결과는 도 7a 및 도 7b에 도시된 바와 같이 6.25 μM 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트가 아폽토시스를 유의하게 유도함(서브-G1 상의 백분율 증가)을 입증하였다. 도 7c 및 도 7d에 도시된 바와 같이, 세포 아폽토시스는 시간-의존 방식으로 MDA-MB-231 세포에 대해 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 치료에 의해 유도되었다. 결과는 72h(3일) 동안 12.5 μM의 농도에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트가 MDA-MB-231 세포에서 아폽토시스를 유의하게 유도하였음을 나타내었다. 엔티노스타트는 도 7에 도시된 바와 같이 GNTbm-02와 비교할 때 용량-의존적 또는 시간-의존 방식으로 아폽토시스를 유도하는 데 매우 강력하였다. 다음으로, SW48 세포에서 세포 아폽토시스를 또한 평가하였다. 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이, GNTbm-02 및 엔티노스타트는 용량-의존 방식으로 아폽토시스를 유도하였다. 결과는 72h 동안 0.39 내지 6.25 μM의 다양한 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 치료가 SW48 세포에서 세포 아폽토시스를 유도하였음을 나타내었다. GNTbm-02 및 엔티노스타트는 도 8a 및 도 8b에 도시된 바와 같이 72h 동안 6.25 μM의 농도에서 아폽토시스를 유의하게 유도하였다. 도 8c 및 도 8d에 도시된 바와 같이, 엔티노스타트 및 GNTbm-02로의 처리는 시간-의존 방식으로 6.25 μM의 고정된 농도에서 아폽토시스를 유도하는 것으로 입증되었다. 72h(3일) 동안 6.25 μM의 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트는 SW48 세포에서 아폽토시스를 유의하게 유도하였다. 엔티노스타트는 도 8에 도시된 바와 같이 GNTbm-02와 비교하여 용량-의존적 또는 시간-의존 방식으로 SW48 세포에서 아폽토시스를 유도하는 데 매우 강력하였다. 마지막으로, 정상 세포주 M10에서 GNTbm-02 및 엔티노스타트에 의한 세포 아폽토시스의 유도를 또한 조사하였다. 도 9a 및 도 9b에 도시된 바와 같이, 72h 동안 1.625 내지 25.0 μM의 다양한 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 치료는 세포 아폽토시스를 유도하였다. 72h 동안 12.5 μM의 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트는 M10 세포에서 아폽토시스를 유의하게 유도하였다. 도 9c 및 도 9d에 도시된 바와 같이, GNTbm-02 및 엔티노스타트 치료는 시간-의존 방식으로 12.5 μM의 농도에서 아폽토시스를 유도하였다. 결과는 72h(3일) 동안 M10 세포에서 12.5 μM의 고정된 농도에서의 GNTbm-02 및 엔티노스타트 치료가 도 9c 및 도 9d에 도시된 바와 같이 아폽토시스를 유의하게 유도하였음을 나타내었다. 엔티노스타트는 도 9에 도시된 바와 같이 GNTbm-02와 비교하여 용량-의존적 또는 시간-의존 방식으로 M10 세포에서 매우 강력한 유도된 아폽토시스를 나타내었다. 그러나, M10 세포는 도 7에 도시된 바와 같은 MDA-MB-231 세포의 결과와 비교하여, 72h 동안 25.0 μM의 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로 처리될 때 유도된 아폽토시스에 대해 더 내성인 것으로 보인다. 다음으로, 본 발명자들은 SW48 세포에서 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-38, 및 GNTbm-39에 의한 아폽토시스의 유도 활성을 조사하는 데 관심이 있었다. 이러한 화합물에 의해 유도된 아폽토시스는 지시된 용량으로 72h 동안 처리된 SW48 세포에서 평가되었다. 표 13에 제시된 바와 같이, GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-38, 및 GNTbm-39는 SW48 세포에서 아폽토시스를 유도하는데 강력하였다.
GNTbm 화합물 시리즈는 여러 인간 암 세포주에서 히스톤 H3 아세틸화를 유도하였다
GNTbm-02 및 엔티노스타트는 강력한 클래스 I HDAC 억제제인 것으로 입증되었다. MDA-MB-231 및 SW48 세포에서 용량-의존적 또는 시간-의존 방식으로 GNTbm-02 및 엔티노스타트에 의한 유도된 히스톤 H3 아세틸화를 조사하였다. 도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이, 24h 동안 0.1 내지 10.0 μM의 다양한 농도의 MDA-MB-231 세포에 대한 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 치료는 히스톤 H3 아세틸화를 유도하였다. 결과는 1.0 μM 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트가 히스톤 H3 아세틸화의 수준을 유의하게 증가시켰다는 것을 나타내었다. 도 10c 및 도 10d에 도시된 바와 같이, SW48 세포는 24h 동안 0.1 내지 10.0 μM의 다양한 농도의 GNTbm-02 및 엔티노스타트로의 처리에 의해 히스톤 H3 아세틸화를 유도하는 데 더 민감하였다. 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, 2, 6, 24, 48, 및 72h 동안 1.0 μM의 농도에서 GNTbm-02로의 치료는 시간-의존 방식으로 MDA-MB-231 세포에서 히스톤 H3 아세틸화를 유도하였다. 결과는 GNTbm-02가 6시간 처리 후 MDA-MB-231 세포에서 히스톤 H3 아세틸화를 강력하게 유도함을 나타내었다. 도 11c 및 도 11d에 도시된 바와 같이 SW48 세포에서 유사한 결과가 또한 입증되었다. 2, 6, 24, 48, 및 72h 동안 SW48 세포에서 1.0 μM의 농도의 GNTbm-02로의 처리는 시간-의존 방식으로 히스톤 H3 아세틸화를 나타내었다. GNTbm-02는 6h 처리 후 SW48 세포에서 히스톤 H3 아세틸화 수준을 강력하게 유도하였다. 종합하면, 이러한 모든 데이터는 GNTbm-02가 강력한 클래스 I HDAC 억제제이고 여러 인간 암 세포주에서 히스톤 H3 아세틸화를 유도함을 시사하였다. 또한, 본 발명자들은 신규 화합물이 도 12에 도시된 바와 같이 SW48 세포에서 히스톤 3 아세틸화 발현을 증가시키는 보다 강력한 활성을 갖는지 분석하는 데 관심이 있었다. 세포를 도 12a에 도시된 바와 같이 SW48 세포에서 24h 동안 양성 대조군으로서 동일한 용량의 GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-11, 및 키다미드로 처리하였다. 0.25 μM의 용량의 GNTbm-05 및 GNTbm-04는 SW48 세포에서 키다미드의 양성 대조군보다 히스톤 3 아세틸화를 유도하는 데 매우 강력하였다. 유사한 결과는 또한 0.25 μM의 용량의 GNTbm-04, GNTbm-05, 및 GNTbm-06이 도 12b에 도시된 바와 같이 SW48 세포에서 히스톤 3 아세틸화를 유도하는 데 매우 강력하다는 것을 입증하였다. 또한, 히스톤 3 아세틸화를 유도하는 4개의 강력한 화합물(GNTbm-04, GNTbm-05, GNTbm-38, GNTbm-39)을 도 12c에 도시된 바와 같이 평가하였다. 결과는 GNTbm-05, GNTbm-04, GNTbm-38, 및 GNTbm-39가 키다미드보다 SW48 세포에서 히스톤 3 아세틸화 발현을 유도하는데 더 강력하다는 것을 입증하였다.
GNTbm 화합물 시리즈는 CT26-보유 마우스 모델에서 후성적 면역조절 특성을 보유하였다
GNTbm-02가 후성적 면역조절 특성을 갖는 지의 여부를 조사하기 위해, BALB/c CT26 결장 종양-보유 마우스의 생체내 동물 모델을 평가에 사용하였다. 뮤린 CT26 결장 종양을 갖는 BALB/c 마우스를 지시된 바와 같이 다양한 치료 양식으로 치료하였다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 mg/kg); GNTbm-02 12.5 및 25.0 mg/kg; 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg(Celebrex®). CT26 종양-보유 마우스에서 종양 크기는 8일에 약 150 내지 200 ㎣로 성장하였다. 총 종양 부피 및 종양 크기의 배수 변화는 도 13a 및 도 13b에 도시되어 있다. 결과는 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) + GNTbm-02(12.5 mg/kg)의 요법이 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) + 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(25.0 mg/kg) 또는 항-PD-1 항체의 부재하에 GNTbm-02 25 mg/kg + 셀레콕시브 50 mg/kg의 요법보다 종양 성장에 대한 더욱 유의한 억제 효과를 지님을 나타내었다. 따라서, 종양 성장의 억제 효과는 셀레콕시브 요법과 조합된 항-PD-1 항체 + GNTbm-02(12.5 mg/kg) > 셀레콕시브 요법과 조합된 항-PD-1 항체 + GNTbm-02(25.0 mg/kg) > 셀레콕시브 요법과 조합된 GNTbm-02(25.0 mg/kg) > 항-PD-1 항체 > 항-IgG 요법이었다. 그러나, 결과는 또한 셀레콕시브와 조합된 GNTbm-02가 종양 성장을 억제하는 강력한 억제 효과를 갖는다는 것을 나타내었다. 이전에, 본 발명자들의 연구는 COX-2 억제제와 조합된 HDAC 억제제가 TME를 유의하게 조절하여 종양 성장의 억제 효과 및 면역 반응 속도를 개선시켰다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 GNTbm-02가 강력하고 신규한 후성적 면역조절제임을 입증하였다. 개별 종양 부피를 도 13c에 도시된 바와 같이 분석하였다. 이 연구에서, 본 발명자들은 완전 반응(CR, 치료 종료 3일 후에 종양 보유 마우스에서 ≤ 0.5 시간 종양 성장); 부분 반응(PR, 종양 크기 > 0.5배 종양 성장, 그러나 치료 종료 3일 후에 종양 보유 마우스에서 ≤ 2배 종양 성장); 안정한 질환(SD, 치료 종료 후 3일에 종양 보유 마우스에서 2 내지 5배의 종양 성장); 치료 효능의 평가를 위한 진행성 질환(PD, 치료 종료 3일 후 종양 보유 마우스에서 종양 성장의 5배 이상)으로 정의하였다. 결과는 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) 그룹이 5 CR, 1 PR, 3 SD 및 8 PD를 달성하였고, ORR(객관적 반응률)은 35.3%임을 나타내었다; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 항-PD-1 항체(2.5 mg /kg) + GNTbm-02(25 mg/kg) 그룹은 3 CR, 3 PR, 2 SD 및 1 PD, ORR 66.7%를 달성하였다; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) + GNTbm-02(12.5 mg/kg) 그룹은 5 CR, 2PR, 1 SD 및 0 PD, ORR 87.5%를 달성하였다; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(25 mg/kg) 그룹은 2 CR, 4 PR, 2 SD 및 1 PD, ORR 66.7%를 달성하였다. 이러한 결과는 12.5 mg/kg의 용량의 GNTbm-02가 최적 용량이고 GNTbm-02가 강력한 면역조절 활성을 갖는다는 것을 시사하였다. 도 13d에 도시된 바와 같은 CT26 종양-보유 마우스의 체중은 이러한 요법이 체중 감소를 야기하는 명백한 독성을 갖지 않았음을 나타내었다. 마지막으로, 도 13e에 도시된 바와 같이 생존율을 분석하였다. 종양 이식 후 종양 부피가 3000 ㎣에 도달했을 때 CT26 종양-보유 마우스를 안락사시켰다. 결과는 항-PD-1 항체 그룹이 30%의 생존율을 달성하였고; 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) + GNTbm-02(25 mg/kg)와 셀레콕시브(50 mg/kg) 그룹이 33%의 생존율을 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg) 그룹과 조합된 GNTbm-02(25 mg/kg) 그룹이 생존율 56%를 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) + GNTbm-02(12.5 mg/ kg) 그룹이 63%의 생존율을 달성하였음을 나타내었다. 종합하면, 이러한 데이터는 항-PD-1 항체와 조합된 GNTbm-02 + 셀레콕시브 또는 GNTbm-02 + 셀레콕시브가 항-PD-1 항체 단독과 비교하여 ORR 및 생존율을 유의하게 개선시켰다는 것을 시사하였다. 본 발명자들의 데이터는 또한 12.5 mg/kg의 용량의 GNTbm-02가 셀레콕시브와 조합된 항-PD-1 항체 + GNTbm-02의 조합 요법에서 25.0 mg/kg보다 우수한 효능을 나타내었음을 입증하였다. 다음으로, 본 발명자들은 GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, GNTbm-06 및 양성 대조군으로서 키다미드와 같은 신규한 합성 화합물을 사용하여 종양 미세환경 활성의 조절을 평가하는 데 관심이 있었다. PVP-K30 상의 코팅에 의해 제조된 키다미드의 고체 분산액을 사용하여 키다미드-API의 수용해도를 개선시켰고, 이는 궁극적으로 PK(약동학) 프로파일을 개선시킬 것이다. 따라서, 본 발명자들은 GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, GNTbm-06, 및 양성 대조군으로서 키다미드와 같은 시험 화합물의 고체 분산액을 제조하기 위해 당 분야의 통상적인 제조 기술을 사용하였다. 모든 시험 화합물을 PVP-K30 상에 코팅하여 GNTbm-02/k30, GNTbm-03/k30, GNTbm-04/k30, GNTbm-06/k30, 및 키다미드/k30으로 명명된 고체 분산액을 제조하였다. 이전 연구는 레고라페닙과 조합된 키다미드/k-30이 CT-26 종양-보유 마우스에서 면역조절 메커니즘을 통해 매우 강력한 항암 활성을 갖는 것으로 입증되었다. CT26 종양-보유 마우스에서 이의 역가를 확인하기 위해 레고라페닙과 조합된 GNTbm-02/k-30의 항암 활성을 추가로 연구하였다. 본 발명자들은 치료 효능의 평가를 위해 보다 엄격한 CR(치료 종료 후 3일에 종양 보유 마우스에서 ≤ 0.5배 종양 성장); PR(종양 크기 > 0.5배 종양 성장, 그러나 치료 종료 3일 후에 종양 보유 마우스에서 ≤ 1배 종양 성장); SD(치료 종료 3일 후에 종양 보유 마우스에서 1 내지 5배의 종양 성장); PD(치료 종료 3일 후 종양 보유 마우스에서 종양 성장의 5배 이상)의 기준을 정의하였다. 도 14(f) 내지 도 14(i)에 도시된 바와 같이, 레고라페닙과 조합된 GNTbm-02/k-30 대 레고라페닙과 조합된 키다미드/k-30을 평가하였다. 결과는 레고라페닙(30 mg/kg)과 조합된 GNTbm-02/k-30(50 mg/kg)이 종양 성장의 강력한 억제를 갖지만, 레고라페닙과 조합된 키다미드/k-30에 비해 약하였다(ORR: 10% 대 30%). 그러나, 도 14(i) 내지 도 14(m)은 레고라페닙과 조합된 GNTbm-03/k-30이 레고라페닙과 조합된 키다미드/k-30과 비교하여 유사한 항암 활성을 지님을 입증하였다(ORR: 40% 대 30%). 레고라페닙과 조합된 GNTbm-04/k-30은 도 14(n) 내지 도 14(q)에 도시된 바와 같이 레고라페닙과 조합된 키다미드/k-30보다 종양 성장을 억제하는데 더 강력하였다(ORR: 50% 대 30%). 레고라페닙과 조합된 GNTbm-06/k-30은 도 14(r) 내지 도 14(u)에 도시된 바와 같이 레고라페닙과 조합된 키다미드/k-30과 비교하여 유사한 항암 활성을 가졌다(ORR: 50% 대 30%). 16일의 치료 후, 본 발명자들은 60일까지 종양 크기를 계속 모니터링하였다. 첫 번째 종양 평가 후 CR 또는 PR 반응을 갖는 마우스에서 종양 성장이 다시 나타나고 종양 크기가 적어도 5배에 도달한 경우, 이를 재발/재발로 정의하였다. 표 14에 제시된 바와 같이, 레고라페닙과 조합된 키다미드/k-30은 0% 종양 재발을 나타내었고, 레고라페닙과 조합된 GNTbm-02/k-30은 100% 종양 재발을 나타내었고, 레고라페닙과 조합된 GNTbm-03/k-30은 25% 종양 재발을 나타내었고, 레고라페닙과 조합된 GNTbm-04/k-30은 20%의 종양 재발을 나타내었고, 레고라페닙과 조합된 GNTbm-06/k-30은 0%의 종양 재발을 나타내었다. 연구에서 PR을 갖는 1마리의 마우스만을 갖는 레고라페닙 그룹과 조합된 GNTbm-02/k-30을 제외하고, 결과는 레고라페닙과 조합된 GNTbm 화합물이 재발을 피하기 위해 면역 시스템을 활성화시키는 데 더 강력한 활성을 가질 수 있음을 시사하였다. 또한, 본 발명자들은 또한 GNTbm-05/k-30, GNTbm-11/k-30, GNTbm-38/k-30 및 GNTbm-39/k-30을 포함하는 일련의 GNTbm 화합물에서 후성적 면역조절 특성을 조사한다. 표 14에 제시된 바와 같이, 레고라페닙과 조합된 GNTbm-05/k-30, GNTbm-11/k-30, GNTbm-38/k-30, GNTbm-39/k-30 및 키다미드/k-30의 효능 비교는 평가했다. 결과는 레고라페닙(30 mg/kg)과 조합된 키다미드/k30(50 mg/kg 그룹이 60%의 ORR로 2 CR, 4 PR, 4 SD 및 0 PD를 달성하였고; 레고라페닙(30 mg/kg)과 조합된 GNTbm-05/k30(50 mg/kg) 그룹이 30%의 ORR로 3 CR, 0 PR, 4 SD 및 3 PD를 달성하였고; 레고라페닙(30 mg/kg)과 조합된 GNTbm-11/k30(50 mg/kg) 그룹이 ORR 20%로 1 CR, 1 PR, 4 SD 및 4 PD를 달성하였고; 레고라페닙(30 mg/kg)과 조합된 GNTbm-38/k30(50 mg/kg) 그룹이 ORR 80%로 8 CR, 0 PR, 2 SD 및 0 PD를 달성하였고; 레고라페닙(30 mg/kg)과 조합된 GNTbm-39/k30(50 mg/kg) 그룹이 ORR 30%로 2 CR, 1 PR, 5 SD 및 2 PD를 달성하였음을 나타내었다. 종합하면, 이들 생체내 동물 데이터는 모든 GNTbm 화합물을 양성 대조군 키다미드와 비교할 때, 레고라페닙과 조합하여, GNTbm-38/k-30이 조합 없이 80%의 ORR을 달성하는 우수한 후성적 면역조절 활성, 및 레고라페닙과의 조합 없이, GNTbm-38/k-30 단독으로 56%의 ORR을 달성을 입증하였다.
GNTbm 화합물 시리즈의 후성적 면역조절 특성을 확인하기 위해
셀레콕시브(선택적 COX-2 억제제)와 조합된 GNTbm-02의 최적 용량을 분석하고 확인하였다. IgG, 항-IgG 대조군(비히클, 2.5 mg/kg); PD-1, 항-PD-1 모노클로날 항체(2.5 mg/kg); GNTbm-02, 5, 10, 20, 및 25.0 mg/kg; 셀레콕시브-캡슐 50 mg/kg(Celebrex®). CT26 종양-보유 마우스에서 종양 크기는 8일에 약 150 내지 200 ㎣로 성장하였다. 도 14a 및 도 14b에 도시된 바와 같은 총 종양 부피 및 종양 크기의 배수 변화는 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(10 mg/kg) 그룹이 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(20 mg/kg) 그룹 또는 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(5 mg/kg)보다 종양 성장의 억제에 더 강력하다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 또한 최적의 비율로 셀레콕시브와 조합된 GNTbm-02가 TME를 조절하고 CT26 보유 마우스 모델에서 종양 성장의 억제 효과를 개선시키는 데 필수적임을 시사하였다. 도 14c에 제시된 바와 같은 개별 종양 부피 및 ORR은 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) 그룹이 35.3%의 ORR, 1 PR, 3 SD 및 8 PD를 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(5 mg/kg) 그룹이 33.3%의 ORR로 2 CR 및 1 PR, 1 SD 및 5 PD를 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(10 mg/kg) 그룹이 ORR 88.9%로 2 CR, 6 PR, 0 SD 및 1 PD를 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(20 mg/kg) 그룹은 ORR 55.6%로 2 CR, 3 PR, 1 SD 및 3 PD를 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(25 mg/kg) 그룹은 ORR 66.7%로 2 CR, 4 PR, 2 SD 및 1 PD를 달성하였음을 나타내었다. 이러한 데이터는 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(10 mg/kg) 그룹이 최상의 ORR을 달성하였고, 이는 TME의 제어를 위한 최적의 비로부터 발생함을 시사하였다. 이러한 결과는 또한 도 13에서 관찰되었으며, 여기서 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg) + GNTbm-02(12.5 mg/kg) 요법은 더 나은 ORR을 달성하였다. 이러한 데이터로부터, 셀레콕시브 50 mg/kg과 조합된 GNTbm-02 10 mg/kg은 TME의 조절에 대한 강력한 활성을 갖고 이에 따라 면역 반응 속도를 개선시키는 것으로 제안되었다. 도 14d에 도시된 바와 같은 CT26 종양-보유 마우스의 체중은 이러한 요법이 체중 감소를 야기할 현저한 독성을 갖지 않았음을 나타내었다. 마지막으로, 도 14e에 도시된 바와 같이 생존율을 분석하였다. 종양 이식 후 종양 부피가 3000 ㎣에 도달했을 때 CT26 종양-보유 마우스를 안락사시켰다. 결과는 항-PD-1 항체 그룹이 30%의 생존율을 달성하였고; 셀레코시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(5 mg/kg) 그룹이 22%의 생존율을 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(10 mg/kg) 그룹이 44%의 생존율을 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(20 mg/kg) 그룹이 33%의 생존율을 달성하였고; 셀레콕시브(50 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(25 mg/kg) 그룹이 56%의 생존율을 달성하였음을 나타내었다. 종합하면, 이러한 데이터는 GNTbm-02 + 셀레콕시브가 항-PD-1 항체 단독과 비교하여 ORR 및 생존율을 유의하게 개선시켰다는 것을 시사하였다. 본 발명자들의 데이터는 또한 10 mg/kg의 용량에서의 GNTbm-02가 GNTbm-02가 셀레콕시브와 조합될 때 다른 용량보다 우수함을 입증하였다.
항-PD-1의 존재 또는 부재 하의 GNTbm-02 + 셀레콕시브 또는 레고라페닙과 조합된 GNTbm 화합물 시리즈는 면역 기억을 현저하게 유도하였다
도 13 및 14에 제시된 바와 같은 상이한 요법으로의 치료 후 유도된 면역 기억을 표 6 및 7에 제시된 바와 같은 상태에 대해 조사하였다. 마우스를 16일 동안 상이한 요법으로 처리한 다음, 첫 번째 종양 평가를 수행하였다(26일). CR 또는 PR을 갖는 마우스는 임의의 추가 처리 없이 7일(33일까지)의 워시-아웃 단계에 들어갔다. 이후, 동일한 종류의 암 세포(CT26; 5x106)를 반대 측면에 대략 다른 7일(40일) 동안 접종하여 재접종을 수행한 다음, 종양 부피를 기준선(1배)으로 결정하였다. 재접종 종양을 10일 동안(50일) 성장시킨 후, 종양 크기를 측정하여 면역 기억을 양성 또는 음성으로 평가하였다. 평가가 음성인 경우, 이는 2개의 조건 둘 모두를 충족시켜야 한다: 기준선과 비교할 때 종양 부피는 300 ㎣ 초과이고 종양 크기는 2배 초과였다. 이전 치료 후 유도된 면역 기억이 활성이고 동일한 항원을 갖는 암 세포의 인식에 특이적인 경우, 재접종 동안 접종된 종양의 성장은 억제될 것이고, 따라서 면역 기억은 양성으로 정의되었다. 면역 기억이 유도되지 않았거나 완전히 활성화되지 않은 경우, 재접종 동안 접종된 종양의 성장은 억제되지 않을 것이다. 이러한 평가 과정에 의해, 항-PD-1 항체 요법과 함께 또는 없이 조합된 GNTbm-02 + 셀레콕시브를 조사하여 요법이 면역 기억을 유도하는 특성을 보유하는지 여부에 답하였다. 표 6에 제시된 바와 같이, 항-PD-1 항체 그룹은 CR을 달성한 2마리의 마우스만을 갖고, 이는 재접종 후 0% 종양 진행을 나타내었다. 결과는 이러한 CR 마우스가 100% 활성 면역 기억을 달성하였음을 입증하였다. 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(25 mg/kg) + 셀레콕시브(50 mg/kg)의 요법은 4마리의 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 또한 0%를 나타냈다. 종양 진행. 또한 활성 면역 기억을 100% 나타내었다. 항-PD-1 항체(2.5 mg/kg)와 조합된 GNTbm-02(12.5 mg/kg) + 셀레콕시브(50 mg/kg)의 요법은 7마리의 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 종양 진행과 함께 29%를 나타내었다. 활성 면역 기억으로 71%를 나타내었다. 셀레콕시브(50 mg/kg) 그룹과 조합된 GNTbm-02(25 mg/kg)의 요법은 6마리 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 종양 진행과 함께 17%를 나타내었다. 또한 활성 면역 기억으로 83%를 나타내었다. 그러나, 표 7에 제시된 바와 같이, 셀레콕시브(50 mg/kg) 그룹과 조합된 GNTbm-02(10 mg/kg)의 요법은 7마리의 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 종양 진행과 함께 14%를 나타내었다. 활성 면역 기억으로 86%를 나타내었다. CR을 갖는 마우스는 이러한 데이터로부터 PR을 갖는 마우스보다 더 강한 면역 기억 활성을 가졌다. 종합하면, ICI와 함께 또는 없이 조합된 GNTbm-02 + 셀레콕시브는 강력한 면역 기억 활성을 유도하였다. 레고라페닙과 조합된 다른 GNTbm 화합물에서도 동일한 현상이 반영되었다. 표 14에 제시된 바와 같이, 레고라페닙(30 mg/kg) 그룹과 조합된 GNTbm-02/k-30(50 mg/kg)은 1마리의 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 또한 0% 종양 진행을 나타내었고; 레고라페닙(30 mg/kg) 그룹과 조합된 GNTbm-03/k-30(50 mg/kg)은 4마리의 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 또한 0% 종양 진행을 나타내었고; 레고라페닙(30 mg/kg) 그룹과 조합된 GNTbm-04/k-30(50 mg/kg)은 5마리의 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 또한 0% 종양 진행을 나타내었고; 레고라페닙(30 mg/kg) 그룹과 조합된 GNTbm-06/k-30(50 mg/kg)은 5마리의 마우스의 CR/PR을 달성하였고, 이는 재접종 후 또한 0% 종양 진행을 나타내었다. 이러한 결과는 레고라페닙과 조합된 GNTbm 화합물이 면역 기억을 유도하는데 유의하다는 것을 나타내었다.
GNTbm-02 + 셀레콕시브로 치료한 후 항종양 활성은 면역조절 효과를 통해 이루어졌으며, 이는 CTL의 활성화를 초래하였다
도 13 및 14에 도시된 바와 같이 처리된 마우스는 완전한 면역 시스템을 갖는 정상 마우스였다. 항-PD-1 항체와 조합되거나 조합되지 않은 GNTbm-02 + 셀레콕시브의 요법은 야생형 정상 마우스에서 높은 전체 반응률(ORR)을 유의하게 달성하였다. 다음으로, BALB/C 누드 마우스 모델(결핍 T-세포 기능을 가짐)에서 항-PD-1 항체와 조합되거나 조합되지 않은 GNTbm-02 + 셀레콕시브의 요법으로의 치료를 조사하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 누드 마우스에 CT26 세포를 s.c. 주사로 접종하였다. 8일 후, 평균 종양 부피가 약 123.8 ㎣일 때, 마우스를 4개의 그룹으로 무작위화하고, 15일 동안 항-IgG 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-1 항체와 조합한 GNTbm-02 + 셀레콕시브, 및 GNTbm-02 + 셀레콕시브로 치료하였다. 도 15b 및 도 15c에 도시된 바와 같이, 이러한 모든 치료 그룹은 T-세포 기능이 결핍된 누드 마우스에서 종양 성장을 유의하게 억제하지 않았다. 이러한 결과는 GNTbm-02 + 셀레콕시브가 TME에서 CTL(세포독성 T 림프구)의 활성화를 조절함으로써 종양 성장을 억제하는데 강력한 활성을 보유함을 보여주었다. 도 15d에 도시된 바와 같이, 모든 처리 그룹은 유의한 체중 감소를 나타내지 않았다. 도 15e에 도시된 바와 같이, 치료 그룹의 모든 마우스는 누드 마우스에서 낮은 항암 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 이들 중 어느 것도 ORR을 달성하지 못했다. 이러한 결과는 항-PD-1 항체와 조합되거나 조합되지 않은 GNTbm-02 + 셀레콕시브의 조합 요법에 의해 종양 성장의 유의한 억제를 달성하기 위해, 기능성 T 세포를 갖는 면역 시스템이 필수적임을 입증하였다(도 13, 14, 및 15). 이는 또한 GNTbm-02 + 셀레콕시브가 암 세포의 사멸을 위해 TME에서 T 세포(CTL)의 활성화를 조절함으로써 종양 성장을 억제한다는 것을 입증하였다. 이러한 항암 활성은 세포독성 효과보다는 면역조절 효과를 통한 것이었다. 종합하면, 본 발명자들은 GNTbm-02가 강력한 후성적 면역조절 활성을 가지며, 셀레콕시브와 조합될 때 GNTbm-02 단독과 비교하여 TME를 조절하는데 더 강력하다는 것을 확인하였다.
GNTbm-02 + 셀레콕시브의 항종양 활성은 면역억제 세포의 감소와 관련이 있다
HDACi 처리는 Treg 세포 활성을 감소시키고 CD8 T 세포 침윤을 향상시킴으로써 TME를 변경시키는 것으로 나타났다. GNTbm-02 + 셀레콕시브로의 치료로부터 초래된 종양 성장의 억제가 증진된 면역 반응과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해, 순환하는 백혈구 집단을 조사하였다. 치료 마지막 날(즉, 치료 기간의 16일)에, CT26 종양-보유 마우스로부터 혈액 샘플을 수집하고 FACS 분석에 의해 연구하였다. 본 발명자들은 GNTbm-02 + 셀레콕시브로 치료한 후 순환 혈액에서 림프구 세포의 유의한 증가 및 과립구의 감소를 관찰하였다(도 17a 및 도 17c). 그러나, 순환하는 단핵구 세포에는 유의한 차이가 없다(도 17b). 본 발명자들은 또한 GNTbm-02 + 셀레콕시브로 치료한 후 순환 혈액에서 CD3+ T 세포의 유의한 증가를 관찰하였다(도 17d). CD8+ T 세포의 중간 증가는 항-PD-1 또는 GNTbm-02 + 셀레콕시브로 치료한 후 관찰되었다(도 17f). 그러나, 순환하는 CD4+ T 세포 및 Treg에는 유의한 차이가 없다(도 17e 및 도 17g). FoxP3+ Treg 이외에, 종양 관련 대식세포(TAM) 및 골수 유래 억제 세포(MDSC)를 포함하는 TME에 모집된 다른 면역억제성 골수 세포가 있다. 미성숙 골수 세포가 종양으로 이동하면, 이러한 세포는 종종 암 세포로부터 방출된 케모카인 및 사이토카인에 반응하여 TAM이 되도록 프라이밍된다. MDSC는 미성숙 골수 세포로부터 발달하고 항암 T 세포 활성을 억제함으로써 TME에서 면역 억제에 기여한다. MDSC는 2개의 표현형으로 정의된 하위-집단에 존재한다: 과립구 Ly6G+Ly6C-(PMN-MDSC) 및 단핵구 Ly6C+Ly6G- MDSC(M-MDSC). GNTbm-02 + 셀레콕시브로의 치료는 순환에서 표현형으로 정의된 CD11b+Ly6G+ Ly6C+ 및 M-MDSC의 약간의 감소를 야기한 반면, 항-PD-1 단독의 치료는 CD11b+ 집단의 감소를 야기하였다(도 17h, 도 17i 및 도 17j). GNTbm-02 + 셀레콕시브로 치료한 후 PMN-MDSC의 감소는 없었다(도 17k).
요약하면, 면역요법은 항암 요법, 특히 진행성 암의 치료를 위한 중요한 유망한 분야이기 때문에, 청구된 발명은 면역요법에서의 잠재적 적용에 대해 평가되었다. 셀레콕시브와 조합하여, GNTbm-02는 GNTbm-02와 비교할 때 종양 미세환경(TME)에서 종양 성장의 억제에 대해 더 강력한 면역조절 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, GNTbm-02 + 셀레콕시브가 면역 체크포인트 억제제, 예컨대, 항-PD-1/항-PD-L1/항-CTLA-4 항체와 조합하여 사용될 때, TME에서 항-PD-1/항-PD-L1/항-CTLA-4 항체에 의한 CTL(세포독성 T 림프구)에 대한 억제 신호의 차단 및 GNTbm-02 + 셀레콕시브의 면역조절 활성에 기인한 상승적 효과를 통해 반응률을 유의하게 상승시키는 더욱 강력한 항암 활성을 갖는 것으로 나타났다. 연구에 기초하여, GNTbm-02는 암 치료에 대한 큰 잠재력을 갖는 신규한 후성적 면역조절제이다. 또한, 본 발명자들은 GNTbm 화합물 시리즈의 면역조절 활성에 관심이 있었다. 본 발명자들의 데이터는 GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, GNTbm-06 및 GNTbm-38이 셀레콕시브 또는 레고라페닙과 조합될 때 TME를 제어하는 후성적 면역조절 활성을 갖는 데 매우 강력하다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 GNTbm 화합물 시리즈가 신규하고 강력한 후성적 면역조절제임을 시사하였다.
상기 언급된 표는 하기에 제공된다:
표 1 화합물 GNTbm-01, GNTbm-02 및 GNTbm-03에 대한 1 H-NMR 및 13 C-NMR 분광학적 연구(400 MHz, d 6 -아세톤).
Figure pct00021
표 2 GNTbm-02, GNTbm-03, GNTbm-04, 및 GNTbm-06의 포화 용해도 분석
Figure pct00022
표 3 상이한 암 및 정상 세포주에 대한 엔티노스타트, GNTbm-01, GNTbm-02 및 GNTbm-03의 IC 50 값.
Figure pct00023
표 4. 개별 HDAC1-3 아이소형에 대한 키다미드, 엔티노스타트, GNTbm-01, GNTbm-02 및 GNTbm-03의 억제 효과.
Figure pct00024
표 5. 개별 HDAC1-11 아이소형에 대한 엔티노스타트 및 GNTbm-02의 억제 효과(HDAC10을 포함하지 않음)
Figure pct00025
표 6. GNTbm-02 + 항-PD-1 항체를 갖는 셀레콕시브의 치료는 면역 기억을 현저하게 유도하였다
Figure pct00026
표 7. 셀레콕시브와 조합된 GNTbm-02의 처리는 면역 기억을 현저하게 유도하였다.
Figure pct00027
표 8. 상이한 암 세포주에 대한 피콜린아미드-기반 HDAC 억제제의 IC 50 값.
Figure pct00028
표 9. 상이한 암 세포주에 대한 벤즈아미드-기반 HDAC 억제제의 IC 50 값.
Figure pct00029
표 10. 개별 HDAC1-3 아이소형에 대한 피콜린아미드-기반 화합물의 억제 효과.
Figure pct00030
표 11. 개별 HDAC1-3 아이소형에 대한 벤즈아미드-기반 화합물의 억제 효과.
Figure pct00031
표 12. GNTbm 화합물 시리즈는 SW48 세포에서 G0/G1 또는 G2/M 단계에서 세포 주기 정지를 유도하였다.
Figure pct00032
표 13. GNTbm 화합물 시리즈는 SW48 세포에서 세포 아폽토시스를 유도하였다.
Figure pct00033
표 14. CT26 종양-보유 마우스 모델에서 티로신 키나제 억제제 레고라페닙과 조합된 GNTbm 화합물 시리즈의 효능.
Figure pct00034
본 발명의 당업자는 본 출원의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명의 교시 및 개시에 대해 변형 및 수정이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 상기 내용에 기초하여, 본 출원은 변형 또는 변경이 첨부된 청구범위 또는 이들의 등가물에 정의된 바와 같은 범위 내에 속하는 것을 조건으로 이의 임의의 변형 및 변경을 포함하고자 한다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물:
    [화학식 I]
    Figure pct00035

    [상기 식에서, W 및 Y는 각각 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되며;
    R1은 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C3 알킬 및 할로겐화된 C1-C3 알킬로부터 선택되고, 일치환, 이치환, 삼치환 또는 사치환일 수 있으며;
    C1 및 C2는 단일 결합 또는 이중 결합에 의해 연결된 C 원자이며;
    Ar은 하기 화학식으로 구성된 군으로부터 선택되며:
    Figure pct00036

    여기서, Ar은 실선을 통해 C2에 연결되며;
    R2는 R1에 대해 기재된 것과 동일한 의미를 가지며;
    R3은 수소 또는 C1-C3 알킬임].
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 (Ia)를 갖는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00037

    [상기 식에서, W, Y, R1, C1, C2 및 Ar은 화학식 (I)에 기재된 것과 동일한 의미를 가짐].
  3. 제1항에 있어서, Ar이 6원 고리로부터 선택되며, R2 및 C2에 연결된 Ar의 원자가 파라-위치에 있는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  4. 제1항에 있어서, W 및 Y가
    (1) W가 N이며, Y가 CH이며,
    (2) W가 CH이며, Y이며,
    (3) W 및 Y는 CH인, 조합으로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  5. 제1항에 있어서, W가 N이며, Y가 CH인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  6. 제1항에 있어서, R1이 F 또는 플루오로화된 C1-C3 알킬인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  7. 제1항에 있어서, C1 및 C2가 이중 결합에 의해 연결된 C 원자인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  8. 제1항에 있어서, C1 및 C2가 단일 결합에 의해 연결된 C 원자인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  9. 제1항에 있어서, R2가 C1-C3 알킬 또는 플루오르화된 C1-C3 알킬인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  10. 제1항에 있어서, 화합물이
    Figure pct00038

    Figure pct00039
    인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 입체이성질체, 용매화물 또는 전구약물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물 또는 조합물.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 제2 작용제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물 또는 조합물.
  13. 제12항에 있어서, 제2 작용제가 면역 체크포인트 억제제, NSAID, TKI 또는 항암제 또는 이들의 조합인, 약학적 조성물 또는 조합물.
  14. 종양 미세환경(TME)의 후성적 면역조절 및/또는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양 미세환경(TME)의 후성적 면역조절 및/또는 암의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 제11항의 약학적 조성물 또는 조합물의 용도.
  15. 제14항에 있어서, 약학적 조성물 또는 조합물이 하나 이상의 제2 작용제를 추가로 포함하는 용도.
  16. 제15항에 있어서, 제2 작용제가 면역 체크포인트 억제제, NSAID, TKI 또는 항암제 또는 이들의 조합인 용도.
  17. 제14항에 있어서, 의약이 종양 세포의 세포 주기 정지를 유도하고, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하고, 히스톤 H3 아세틸화를 유도하고, 면역 기억을 유도하고, CTL을 활성화하고, 면역억제 세포를 감소시키기 위한 용도.
  18. 클래스 I HDAC와 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 클래스 I HDAC와 관련된 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의, 제11항의 약학적 조성물 또는 조합물의 용도.
  19. 제18항에 있어서, 약학적 조성물 또는 조합물이 하나 이상의 제2 작용제를 추가로 포함하는 용도.
  20. 제19항에 있어서, 제2 작용제가 면역 체크포인트 억제제, NSAID, TKI 또는 항암제 또는 이들의 조합인 용도.
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